骨強度低下抑制剤
【課題】骨強度の低下を効果的に抑制可能な、骨強度低下抑制剤を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明にかかる骨強度低下抑制剤は、ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）と植物油とを混合させたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分とし、前記ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）が、ニンニクから抽出されたものであることを特徴としている。
【解決手段】本発明にかかる骨強度低下抑制剤は、ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）と植物油とを混合させたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分とし、前記ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）が、ニンニクから抽出されたものであることを特徴としている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨強度低下抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、増加傾向にある高齢者の骨折は、骨の強度低下が原因で発症する脆弱性骨折が原因とされている。骨の強度低下は、骨量の減少等に起因し、人の骨量は、２０歳〜４０歳半ばに最大骨量を形成した後、加齢と共に減り続ける。したがって、高齢者の骨折を防止するためには、骨量の減少に起因する骨の強度低下を抑制することが重要となる。
【０００３】
また、適度な運動は、骨量を増加させ、骨粗鬆症の予防や改善にも適しているということが良く知られている。適度な運動の継続により、骨に機械的刺激が加わること、および運動による血液循環促進によって骨への血液供給が増加することなどの効果で、骨密度は増加するとされている。上述したように、人の骨量は、加齢と共に減り続けるため、最大骨量をいかに残すかが、骨粗鬆症予防の最大の鍵となる。つまり、高齢者の骨折を防止するためには、各人の有する最大骨量を効率的に残して、骨強度の低下抑制を行うことが必要となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−２３１３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、上記従来技術の問題を解決するためになされたものであって、骨強度の低下を効果的に抑制可能な、骨強度低下抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にかかる骨強度低下抑制剤は、上記課題を解決するためになされたものであり、ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）と植物油とを混合させたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分とすることを特徴としている。
【０００７】
また、本発明にかかる骨強度低下抑制剤は、前記ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）が、ニンニクから抽出されたものである構成が好ましい。
【０００８】
さらに、本発明にかかる骨強度低下抑制剤を構成する前記植物油としては、コーン胚芽油、椿油、オリーブオイル、種々の食用植物油の使用が可能である。本発明にかかる骨強度低下抑制剤を構成する前記植物油は、水蒸気処理や圧搾などの抽出による過度の加熱処理をしない精度の高いものを使用することが好ましい。
【０００９】
本発明にかかる骨強度低下抑制方法は、上記課題を解決するためになされたものであり、上述したＤＡＳ含有植物油溶液を摂取する摂取工程と、持久的運動を行う運動工程とを備えたことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、骨強度の低下を効果的に抑制可能な、骨強度低下抑制剤を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態にかかる実験時に使用した飼料（対照食）の実験食飼料組成を示した表である。
【図２】本発明の実施形態にかかる骨強度低下抑制剤を構成するＤＡＳの化学構造を示す図である。
【図３】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの週齢とその時期のトレッドミル走行運動の速度・時間とを示した表である。
【図４】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットのグループ分けを示した表である。
【図５】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの成長曲線グラフを示したものであって、このグラフは、ＤＡＳ添加食と持久的運動負荷が成長に及ぼす影響を示している。
【図６】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの各群の初体重、終体重と１日あたり平均摂食量を示した表である。
【図７】本発明の実施形態にかかる実験時における運動群（ＣＤ群・ＤＥ群）の総走行距離を示した表である。
【図８】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの心臓重量のグラフを示したものである。
【図９】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの肝臓重量のグラフを示したものである。
【図１０】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの脾臓重量のグラフを示したものである。
【図１１】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの腎臓重量を示したものであって、上図は左腎臓重量、下図は右腎臓重量のグラフを示したものである。
【図１２】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの腎臓重量のグラフを示したものである。
【図１３】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの副腎重量のグラフを示したものである。
【図１４】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの胸腺重量のグラフを示したものである。
【図１５】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットのひらめ筋重量を示したものであって、上図は左ひらめ筋重量、下図は右ひらめ筋重量のグラフを示したものである。
【図１６】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの腓腹筋重量を示したものであって、上図は左腓腹筋重量、下図は右腓腹筋重量のグラフを示したものである。
【図１７】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの２４時間尿量のグラフを示したものである。
【図１８】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの尿中カルシウム排泄量のグラフを示したものである。
【図１９】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの尿中クレアチニン排泄量のグラフを示したものである。
【図２０】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの尿素窒素排泄量のグラフを示したものである。
【図２１】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの糞中カルシウム排泄量のグラフを示したものである。
【図２２】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの左大腿骨湿重量のグラフを示したものである。
【図２３】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの右大腿骨湿重量のグラフを示したものである。
【図２４】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの左大腿骨ＥＮＥＲＧＹのグラフを示したものである。
【図２５】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの右大腿骨ＥＮＥＲＧＹのグラフを示したものである。
【図２６】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの左大腿骨ＳＴＩＦＦＮＥＳＳのグラフを示したものである。
【図２７】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの右大腿骨ＳＴＩＦＦＮＥＳＳのグラフを示したものである。
【図２８】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの骨中リンのグラフを示したものである。
【図２９】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの骨中カルシウムのグラフを示したものである。
【図３０】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットのカルシウム吸収率のグラフを示したものである。
【図３１】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットのカルシウム保持率のグラフを示したものである。
【図３２】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの血漿総たんぱく質のグラフを示したものである。
【図３３】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの血漿アルブミンのグラフを示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１３】
ニンニクには、０．２％〜０．５％揮発油が含まれており、ニンニクの薬効成分の大半は、この揮発油中の有機硫黄化合物に起因するといわれている。この有機硫黄化合物の一つで、ニンニクの主な香気成分であるＡｌｌｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅ類の一つに、ジアリルスルフィド（ＤＡＳ：Ｄｉａｌｌｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅ）がある。
【００１４】
本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤は、このジアリルスルフィド（ＤＡＳ）（以下、単に「ＤＡＳ」ともいう。）と植物油とを混合させたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分として構成されることを特徴としている。
【００１５】
本実施形態にかかるＤＡＳ含有植物油溶液を構成する植物油としては、コーン胚芽油、椿油、オリーブオイル、種々の食用植物油の使用が可能である。ただし、本実施形態にて用いられる植物油は、水蒸気処理や圧搾などの抽出による過度の加熱処理を行わない精度の高いものを使用することが好ましい。これは、熱や不純物によるＤＡＳの分解を防ぐためである。つまり、本実施形態においては、ＤＡＳと、精度の高い植物油（本実施形態においてはコーン胚芽油）とを混合させたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分として、骨強度低下抑制剤が構成されている。
【００１６】
また、ＤＡＳおよび植物油は、いずれも遮光のために容器にて密閉し、低温下（冷蔵庫）にて保存することが好ましい。さらに、本実施形態にかかるＤＡＳ含有植物油溶液を調製する際には、例えば、ガラス容器内に植物油を入れ、その中にＤＡＳを滴下し、迅速に攪拌する。このようにして調製されたＤＡＳ含有植物油溶液は、揮発性を有するため、調整後は速やかに使用することが好ましいが、必要に応じて、カプセル等に封入した状態で使用してもよい。
【００１７】
上述したようにして構成されたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分とする本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤は、継続した摂取（例えば、毎日一定時間に摂取）することによって、効果的な骨強度低下抑制が期待できる。また、本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤の使用と、低強度の持久的運動負荷とを行うことによって、より効果的な骨強度低下抑制が期待できる。
【００１８】
以下、本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤の効果を確認するための実験等について、具体的に説明する。
【００１９】
＜実験動物および飼育方法＞
【００２０】
本実施形態においては、実験動物として、５週齢の体重１４０ｇ〜１６０ｇのＪｃｌ：ＳＤ（ＳＤ）系雄ラット（日本クレア株式会社）を２１匹用意した。ラットには、１〜２１まで無作為に番号を付し、ステンレスケージで一匹ずつ飼育した。14日間の予備飼育中は、固形飼料（オリエンタル酵母工業株式会社：ＭＦ）を自由摂食で与え、水分は蒸留水を自由に与えた。その後、本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤の効果を確認するための実験飼料を与えて、本実験を行った。
【００２１】
飼育は、室温約２２±１℃、相対湿度約５５±３％、明暗サイクルが１２時間ずつになるように照明時間午前８時〜午後８時、消灯時間午後８時〜午前８時の人口灯の環境下で行った。床替えは、毎日行った。
【００２２】
体重および食餌摂取量は、毎日午後のほぼ一定した時刻に電子天秤を用いて測定した。餌は、毎日新しいものを使用した。
【００２３】
＜飼料＞
【００２４】
飼育期間中の対照食の実験食飼料組成を図１の表に示す。本実験では、餌は自由摂食、水は蒸留水を自由摂水とした。飼料は、ＡＩＮ−９３Ｇの純化食を使用した。また、使用する飼料は、給餌のとき以外は、４℃の冷蔵庫で保管した。
【００２５】
ＤＡＳとは、チオスルフィネート類の分解によって生じる硫黄化合物で、ニンニクの主な香気成分であるＤｉａｌｌｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅである。本実施形態においては、上述した対照食にＤＡＳを添加したものをＤＡＳ添加食とした。飼料への添加量は、２００ｐｐｍとした。ＤＡＳは、揮発を防止するために、コーン油（本発明の「植物油」に相当）と混合した後（つまり、本実施形態にかかるＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分とする骨強度低下抑制剤を構成した後）、他の飼料成分と混ぜ合わせた（骨強度低下抑制剤と他の飼料成分とを混ぜ合わせた）。ＤＡＳの化学構造を、図２に示す。
【００２６】
＜走行訓練＞
【００２７】
予備実験の段階では、すべてのラットに対して、はじめはベルトを動かさずトレッドミル（株式会社夏目製作所製：ＫＮ７３、Ｒ５型トレッドミル）の空間に慣れさせることから始め、徐々に速度３．０ｍ／ｍｉｎ〜５．０ｍ／ｍｉｎ、５分間の歩行から段階的に時間と速度を上げてトレッドミル走行訓練を行えるようにした。この装置は、ベルトコンベア式のもので無段変速器が装着され、可変電圧器を操作することによって、水平位ベルトの走行速度の調節が可能になっている。また、このトレッドミルは、ベルト上にラットを載せると、ラットが前進しなければ後方に送られ、ラットが後端の電極に触れると、電流刺激されるような構成となっている。
【００２８】
本実験においては、運動群のラットのみ毎日一回ほぼ一定の時間、低強度のトレッドミル運動を行わせた。このトレッドミル運動に関する週齢数とその時の速度を図３に示す。
【００２９】
＜動物のグループ分け＞
【００３０】
本実験に入る前に、平均体重がほぼ等しくなること、走行が可能なもの、不可能なものを考慮して、対照食群、ＤＡＳ添加食群（本発明にかかる「骨強度低下抑制剤」を添加した群）ともそれぞれ非運動群と運動群とに分け、具体的には、図４の表に示すように４群に分けた。この図４の表に示すように、本実験においては、それぞれを、対照食・非運動群を「Ｃ」（個体数ｎ＝５）、対照食・運動群を「ＣＥ」（個体数ｎ＝５）、ＤＡＳ添加食・非運動群を「Ｄ」（個体数ｎ＝５）、ＤＡＳ添加食・運動群を「ＤＥ」（個体数ｎ＝５）とした。
【００３１】
＜剖検・試料採取＞
【００３２】
ラットの屠殺前日は、屠殺１５時間前より絶食させた。屠殺は、ジエチルエーテル麻酔下で、腹部大動脈より採血屠殺した。採血に使用した注射器中には、抗血液凝固剤としてヘパリンを使用した。
採血後、臓器（心臓・肺・肝臓・腎臓・脾臓・副腎・精巣・精巣上体・胸腺・褐色脂肪細胞・後腹壁脂肪・副腎周囲脂肪・精巣周囲脂肪）、骨（大腿骨・脛骨・腓骨）、筋肉（ひらめ筋・腓腹筋）を摘出した。
臓器・筋肉は、重量測定後、１０％ホルマリン緩衝液に浸漬し、固定した。血液は、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）にて血漿を分離した。骨は、生理食塩水中で保存した。
【００３３】
尿の採取については、屠殺２日前にラットを代謝ケージに移し、尿採取１日目に１２：３０〜翌１２：３０までの２４時間尿を採取した。採取した尿は、１５ｍｌのプラスチックチューブに移し、尿量を計り記録した。
【００３４】
糞の採取については、屠殺２日前に代謝ケージに移し、糞を採取した。経過後、１日そのまま放置し、その後の処理をしやすくするため自然乾燥させた。その後、糞を１５ｍｌのプラスチックチューブに移し変え、重量を測定して記録した。
【００３５】
カルシウム・リンを測定する試料として、大腿骨を灰化した。るつぼの恒量手順は、まず、るつぼを電気マッフル炉（ＡＤＶＡＮＴＥＣ：ＫＬ−４２０）にて５５０℃で２時間加熱した。そして、マッフル炉中で２時間放冷した後、デシケーター内で１０分間放冷し、電子天秤で秤量した。このとき、前回との重量差が０．３ｍｇ以内となったものを恒量と見なし試料の灰化時に使用した。
【００３６】
試料調整のための骨の灰化の手順は、まず、大腿骨骨幹部を生理食塩水中でパスツールピペットを用いて骨髄を吸引除去した。そして、骨切りはさみで細かく切断し、１０５℃の乾燥機で１６時間乾燥後、デシケーター内で２時間放冷し、乾燥重量を測定した。その後、濃硝酸（有害金属測定用）１ｍｌを加え、るつぼ内で混和し、５０℃で１０分間、１００℃で２時間、６００℃で１６時間の順に温度を上昇させ加熱した。加熱後、マッフル炉内で２時間放冷、デシケーター内で１０分間放冷し、電子天秤で計測した。その後は、５５０℃で２時間加熱、マッフル炉内で２時間放冷、デシケーター内で１０分間放冷後に秤量というサイクルで、るつぼの時と同じく、前回との重量差が０．３ｍｇ以下になるまで秤量を続けた。恒量に達した骨試料の入ったるつぼに、４ｍｌの濃硝酸を加えて溶解し、１００ｍｌのメスフラスコ中で、蒸留水を用いてメスアップした。
【００３７】
カルシウムを測定する試料として、糞を灰化した。るつぼの恒量手順は骨のときと同様に行った。
【００３８】
糞の試料調整の手順は、糞を乳鉢・乳棒を用いてすりつぶして均質化し、それから糞を０．５ｇ量りとり、濃硝酸（有害金属測定用）１ｍｌを加え、るつぼ内で混和した。その後、５０℃１０分間、１００℃２時間、６００℃１６時間の順に温度を上昇させ加熱し、マッフル炉中で２時間放冷、デシケーター内で１０分間放冷し、電子天秤で計測した。その後、５５０℃で２時間加熱、マッフル炉中で２時間放冷、デシケーター内で１０分間放冷後に秤量というサイクルで、るつぼの時と同じく、前回との重量差が０．３ｍｇ以下になるまで秤量を続けた。
【００３９】
＜生理学的および生化学的測定法＞
【００４０】
カルシウム・リンに関する測定器具は、すべて１Ｎ塩酸に浸漬後蒸留水で洗浄し、水道水中のミネラルの影響を受けないようにした。
【００４１】
（骨湿重量の測定法）
骨湿重量に関しては、左右大腿骨の湿重量を電子天秤にて測定し、記録した。
【００４２】
（骨強度の測定法）
骨強度の測定は、骨強度試験装置（室町機械株式会社製：ＴＫ−２５２Ｃ）を用いて、三点曲げ試験法によってＥＮＥＲＧＹとＳＴＩＦＦＮＥＳＳを測定した。
三点曲げ試験法は、骨を下側から二点で支え、上側から骨の中央に負荷を加えて、骨が折れたときの値、すなわち破断力を測定する方法である。この三点曲げ試験法においては、大腿骨・脛骨を１２ｍｍ間隔で支持し、最も安定する角度で置いて測定した。
ＥＮＥＲＧＹ（破断エネルギー）は、骨が破断されるまでの仕事量、すなわち荷重が加わってその方法に動いた仕事量を表す。ＳＴＩＦＦＮＥＳＳは、骨の弾性率であり、骨の硬さの目安を表す。
【００４３】
（骨中カルシウムの測定法）
骨中カルシウムの測定は、カルシウム測定用カルシウムＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて、オクトクレゾールフタレインコンプレキソン（ＯＣＰＣ）法で行った。
５倍希釈した試料０．０５ｍｌにモノエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１２．０）を２．０ｍｌ加え、よく振り混ぜた。これにメチルキシレノールブルーと８−キノリノールを含有した発色試薬を１．０ｍｌ加え、よく振り混ぜた。そして、３時間以内にブランクを対照として、分光光度計で６１０ｎｍの波長で検体および標準液（１０ｍｇ／ｄｌ）の吸光度を測定した。
【００４４】
（骨中リンの測定法）
骨中リンの測定は、モリブデンブルー法で行った。このリン測定にあたっては、以下の要領で試薬等を調整した。
まず、蒸留水３３６ｍｌに塩酸１４ｍｌを加え、１．４％塩酸とした。次に、燐酸カリウムをろ紙にとり、乾燥機中（１０５℃）で２時間乾燥させた。それをデシケーター内で放冷した後、０．２２０ｇを量りとり、１．４％塩酸で５０ｍｌにメスアップし、リン標準液とした。
次に、モリブデン酸アンモニウム５．０ｇを約８０ｍｌの温水（６０℃）中で溶解させた。それを蒸留水で１００ｍｌにメスアップし、モリブデン酸アンモニウム溶液とした。
次に、メタバナジン酸アンモニウム０．２５ｇを温水約５０ｍｌで溶かし、冷却後、濃硝酸を４ｍｌ加え、蒸留水で１００ｍｌにメスアップし、メタバナジン酸アンモニウム溶液とした。
試料としては、原液：蒸留水＝１：１で、２倍希釈したものを用いた。
そして、試料５ｍｌ（ブランクは１．４％塩酸５ｍｌ）、蒸留水１５ｍｌ、メタバナジン酸アンモニウム溶液２．５ｍｌ、モリブデン酸アンモニウム溶液２．５ｍｌを加えてよく混合し、蒸留水で５０ｍｌメスアップした。それを１０分間室温に放置した後、分光光度計で４６０ｎｍの波長で検体および標準液の吸光度を測定した。
【００４５】
（糞中カルシウムの測定法）
恒量に達した糞入りのるつぼは、骨と同様の方法で１００ｍｌにメスアップし、糞試料とした。
カルシウム測定は、カルシウム測定用カルシウムＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて、オクトクレゾールフタレインコンプレキソン（ＯＣＰＣ）法で行った。
５倍希釈した試料０．０５ｍｌにモノエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１２．０）を２．０ｍｌ加え、よく振り混ぜた。これにメチルキシレノールブルーと８−キノリノールを含有した発色試薬を１．０ｍｌ加え、よく振り混ぜた。そして、３時間以内にブランクを対照として、分光光度計で６１０ｎｍの波長で検体および標準液（１０ｍｇ／ｄｌ）の吸光度を測定した。
【００４６】
（尿中カルシウムの測定法）
原尿を４℃、３０００ｒｐｍ、１５分間で遠心分離し、上清をデカンテーションにて別のプラスチックチューブに採取した。これを尿試料とした。
尿中カルシウムの測定は、カルシウム測定用カルシウムＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて、オクトクレゾールフタレインコンプレキソン（ＯＣＰＣ）法で行った。
５倍希釈した試料０．０５ｍｌにモノエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１２．０）を２．０ｍｌ加え、よく振り混ぜた。これにメチルキシレノールブルーと８−キノリノールを含有した発色試薬を１．０ｍｌ加え、よく振り混ぜた。そして、３時間以内にブランクを対照として、分光光度計で６１０ｎｍの波長で検体および標準液（１０ｍｇ／ｄｌ）の吸光度を測定した。
【００４７】
＜統計処理＞
【００４８】
上述した測定結果から得られたデータは、平均±標準誤差で表した。ＤＡＳの食餌添加と、トレッドミル走行運動の二つの因子とし、二元配置の分散分析を行った。群間での有意差検定には、Ｔｕｋｅｙの多重比較法を用いた。その際、ｐ＜０．０５を統計学的に有意差ありと判定した。
【００４９】
＜実験結果１：体重、摂食量、および走行距離＞
【００５０】
実験開始時の８週齢ラットの体重は、Ｃ群２８９±５ｇ、ＣＥ群２９０±４ｇ、Ｄ群３００±３ｇ、ＤＥ群３０１±５ｇであり、終体重は、Ｃ群４００±７ｇ、ＣＥ群３８５±７ｇ、Ｄ群３９１±６ｇ、ＤＥ群３９４±５ｇであった。図５に示すように、実験期間中、体重はいずれの群においても緩やかに増加した。また、この実験時においては、図６に示すように、１日あたりの食餌摂取量は各群で差はなかった。
実験期間中のトレッドミル走行訓練の週齢とその時期の速度については、先に説明した図３に示した。また、運動群（ＣＤ群・ＤＥ群）の総走行距離を図７に示した。この図７の表に示すように、総走行距離に関しては、運動群の２群間に差はなかった。
【００５１】
＜実験結果２：臓器・腺・筋肉重量＞
【００５２】
ラットの体重１００ｇあたりの主要臓器、腺、筋肉重量については、図８〜図１６に示している。これらの図に示すように、心臓、左腎臓、右副腎、副腎合計、胸腺、ひらめ筋、腓腹筋に関して、各群間に有意差はみられなかった。
肝臓については、ＣＥ群がＣ群に対して有意に低値を示し、ＤＥ群がＤ群に対して有意に低値を示した。すなわち、運動群が非運動群に比べ、有意に低値を示した。（ｐ＜０．０５）（図９参照）
脾臓については、Ｄ群がＤＥ群に対して有意に高値を示した。（ｐ＜０．０５）（図１０参照）
右腎臓については、ＣＥ群がＣ群に対して有意に高値を示し、ＣＥ群がＤＥ群に対して有意に高値を示した。（ｐ＜０．０５）（図１１参照）
左副腎については、ＣＥ群がＣ群に対して有意に高値を示し、ＣＥ群がＤＥ群に対して有意に高値を示し、Ｄ群がＣ群に対して有意に高値を示した。（ｐ＜０．０５）（図１３参照）
【００５３】
＜実験結果３：尿・糞成分＞
【００５４】
屠殺２日前の２４時間尿量に関するグラフを図１７に示す。
また、図１８に尿中カルシウム排泄量に関するグラフを示し、図１９に尿中クレアチン排泄量に関するグラフを示している。これらの図１８および図１９に示すグラフによれば、尿中カルシウム排泄量、尿中クレアチン排泄量は、いずれの群間においても、有意な差はみられなかった。
さらに、図２０は、尿素窒素排出量に関するグラフを示している。この図２０に示すように、尿素窒素排出量については、Ｄ群がＣ群に比べ有意に低値を示し、ＤＡＳ添加食群が対照食群と比較して有意に低値を示す傾向がみられた。（ｐ＜０．０５）
また、図２１は、糞中カルシウム排泄量に関するグラフを示している。この図２１に示すように、糞中カルシウム排泄量は、いずれの群間においても有意な差はみられなかった。
【００５５】
＜実験結果４：骨重量および骨成分＞
【００５６】
図２２および図２３に示すように、骨湿重量については、いずれの群間においても有意な差はみられなかった。ここで、図２２は左大腿骨湿重量に関するグラフを示し、図２３は右大腿骨湿重量に関するグラフを示している。
【００５７】
また、先にも説明したとおり、骨破断試験によりＥＮＥＲＧＹとＳＴＩＦＦＮＥＳＳを測定した。ここで、図２４は左大腿骨ＥＮＥＲＧＹに関するグラフを示し、図２５は右大腿骨ＥＮＥＲＧＹに関するグラフを示し、図２６は左大腿骨ＳＴＩＦＦＮＥＳＳに関するグラフを示し、図２７は右大腿骨ＳＴＩＦＦＮＥＳＳに関するグラフを示している。
【００５８】
これらの図２４および図２５のグラフに示すように、ＥＮＥＲＧＹについては、左右大腿骨のいずれの群間においても、有意な差はみられなかった。
【００５９】
図２７は、本実施形態にかかる実験時におけるラットの右大腿骨ＳＴＩＦＦＮＥＳＳに関するグラフを示したものである。この図２７に示すように、ＳＴＩＦＦＮＥＳＳについては、右大腿骨においてＤ群がＣ群に比べ有意に高値を示した。（ｐ＜０．０５）
【００６０】
骨中リンについては、図２８に示すように、ＣＥ群がＣ群に比べ有意に高値を示し、ＤＥ群がＣ群に比べ有意に高値を示した。（ｐ＜０．０５）
【００６１】
また、図２９は骨中カルシウムに関するグラフを示し、図３０はカルシウム吸収率に関するグラフを示し、図３１はカルシウム保持率に関するグラフを示している。この図３０および図３１に示すように、カルシウム吸収率、カルシウム保持率については、いずれの群間においても差はみられなかった。
【００６２】
＜本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤の作用効果等について＞
【００６３】
上述した実験結果に示すように、ラットの体重増加曲線はいずれの群もほぼ同様の緩やかな増加を示し（図５参照）、飼料摂食量もほぼ同様に直線的な増加がみられた。
【００６４】
また、尿中カルシウム量（図１８参照）および糞中カルシウム量（図２１参照）については、群間の差はみられなかった。
【００６５】
さらに、大腿骨の骨長・骨径に差はみられなかったが、大腿骨湿重量（図２２、図２３参照）ではＣＥ群がＣ群と比べて有意に高値を示した。骨強度については、ＣＥ群、Ｄ群、ＤＥ群が、Ｃ群と比べて高い傾向を示した。大腿骨骨幹部におけるカルシウム含有量においては、Ｄ群が、Ｃ群、ＣＥ群、ＤＥ群と比べて有意に高値を示し、ＤＥ群も、Ｃ群、ＣＥ群と比べて有意に高値を示した。
【００６６】
より具体的には、三点曲げ試験法の骨破断におけるＳＴＩＦＦＮＥＳＳについては、図２７に示すように、右大腿骨において、Ｄ群がＣ群に比べ有意に高値を示した。これは、以下の理由によると考えられる。
ここで、図３２は血漿総たんぱく質濃度に関するグラフを示し、図３３は血漿アルブミン濃度に関するグラフを示している。
これらの図に示すように、血漿総たんぱく質濃度については、各群間で有意な差はみられなかったが（図３２参照）、血漿アルブミン濃度においては、ＣＥ群がＣ群と比較して有意に高値を示し、ＤＥ群がＤ群と比較して有意に高値を示し、運動群が非運動群と比較して高値を示し、Ｄ群がＣ群と比較して有意に高値を示した。
つまり、血漿アルブミン濃度は、ＤＡＳ添加食群が対照食群に比べ有意に高値を示した。しかしながら、その一方では、尿素窒素排泄量（図２０参照）においては、ＤＡＳ添加食群が対照食群に比べ、低い傾向がみられた。このことから、本実施形態にかかるＤＡＳ添加食群の方が、「骨の形成材料」をより多く体内に留めていることが明らかである。すなわち、本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤を構成するＤＡＳが、骨吸収促進因子の産生を抑制したことによって、骨密度を高め、骨破断におけるＳＴＩＦＦＮＥＳＳを高めたためであると考えられる。
【００６７】
また、骨は、カルシウム、リンなどのミネラル貯蔵庫としても重要な役割を担っている。骨中成分については、図２８に示すように、骨中リン含有量が、ＣＥ群がＣ群に比べ有意に高値を示し、さらにＤＥ群がＣ群に比べ有意に高値を示し、非運動群に比べ運動群で高値を示す傾向がみられた。
【００６８】
以上のことから、本実施形態においては、骨強度低下抑制剤と運動とにより、大腿骨骨幹部骨塩量が増加し、骨中のリン含有量が増加したと考えられる。すなわち、本実施形態によれば、骨強度の低下を効果的に抑制可能な骨強度低下抑制剤を得ることができる。また、本実施形態によれば、骨強度の低下を効果的に抑制可能な骨強度低下抑制方法を得ることができる。
【００６９】
＜その他の実施形態＞
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨に適合し得る範囲で必要に応じて種々の変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
近年、増加傾向にある高齢者の骨折は、骨の強度低下が原因で発症する脆弱性骨折が原因とされている。そこで、骨強度低下抑制作用を有する薬剤の開発が求められている。
【００７１】
本件発明者は、ガーリックオイル成分の一つであり、ニンニクの特有の香気成分であるジアリルスルフィド（ＤＡＳ：Ｄｉａｌｌｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅ）の生体に及ぼす影響をテーマに、動物実験（ラットに摂取）を重ねてきた。そこで、本件発明者は、ＤＡＳを食餌添加させて摂取したラットにおいて、これらの骨（骨重量、骨強度、骨成分）に及ぼす影響を確認した。そして、食品成分であるニンニクの成分（ＤＡＳ）を摂取することにより、骨強度低下抑制剤としての有用性があることに想到した。
【００７２】
すなわち、本件発明者は、このたび、ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）と植物油とを混合させたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分とする骨強度低下抑制剤を開発するに至った。なお、この骨強度低下抑制剤の摂取形態としては、ＤＡＳ含有コーンオイル溶液をサプリメントとして（例えば、カプセルに封入して）摂取し、骨折予防に利用することも可能である。
【符号の説明】
【００７３】
Ｃ …対照食群（非運動群）
ＣＥ…対照食群（運動群）
Ｄ …ＤＡＳ添加食群（非運動群）
ＤＥ…ＤＡＳ添加食群（運動群）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨強度低下抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、増加傾向にある高齢者の骨折は、骨の強度低下が原因で発症する脆弱性骨折が原因とされている。骨の強度低下は、骨量の減少等に起因し、人の骨量は、２０歳〜４０歳半ばに最大骨量を形成した後、加齢と共に減り続ける。したがって、高齢者の骨折を防止するためには、骨量の減少に起因する骨の強度低下を抑制することが重要となる。
【０００３】
また、適度な運動は、骨量を増加させ、骨粗鬆症の予防や改善にも適しているということが良く知られている。適度な運動の継続により、骨に機械的刺激が加わること、および運動による血液循環促進によって骨への血液供給が増加することなどの効果で、骨密度は増加するとされている。上述したように、人の骨量は、加齢と共に減り続けるため、最大骨量をいかに残すかが、骨粗鬆症予防の最大の鍵となる。つまり、高齢者の骨折を防止するためには、各人の有する最大骨量を効率的に残して、骨強度の低下抑制を行うことが必要となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−２３１３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、上記従来技術の問題を解決するためになされたものであって、骨強度の低下を効果的に抑制可能な、骨強度低下抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にかかる骨強度低下抑制剤は、上記課題を解決するためになされたものであり、ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）と植物油とを混合させたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分とすることを特徴としている。
【０００７】
また、本発明にかかる骨強度低下抑制剤は、前記ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）が、ニンニクから抽出されたものである構成が好ましい。
【０００８】
さらに、本発明にかかる骨強度低下抑制剤を構成する前記植物油としては、コーン胚芽油、椿油、オリーブオイル、種々の食用植物油の使用が可能である。本発明にかかる骨強度低下抑制剤を構成する前記植物油は、水蒸気処理や圧搾などの抽出による過度の加熱処理をしない精度の高いものを使用することが好ましい。
【０００９】
本発明にかかる骨強度低下抑制方法は、上記課題を解決するためになされたものであり、上述したＤＡＳ含有植物油溶液を摂取する摂取工程と、持久的運動を行う運動工程とを備えたことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、骨強度の低下を効果的に抑制可能な、骨強度低下抑制剤を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態にかかる実験時に使用した飼料（対照食）の実験食飼料組成を示した表である。
【図２】本発明の実施形態にかかる骨強度低下抑制剤を構成するＤＡＳの化学構造を示す図である。
【図３】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの週齢とその時期のトレッドミル走行運動の速度・時間とを示した表である。
【図４】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットのグループ分けを示した表である。
【図５】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの成長曲線グラフを示したものであって、このグラフは、ＤＡＳ添加食と持久的運動負荷が成長に及ぼす影響を示している。
【図６】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの各群の初体重、終体重と１日あたり平均摂食量を示した表である。
【図７】本発明の実施形態にかかる実験時における運動群（ＣＤ群・ＤＥ群）の総走行距離を示した表である。
【図８】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの心臓重量のグラフを示したものである。
【図９】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの肝臓重量のグラフを示したものである。
【図１０】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの脾臓重量のグラフを示したものである。
【図１１】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの腎臓重量を示したものであって、上図は左腎臓重量、下図は右腎臓重量のグラフを示したものである。
【図１２】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの腎臓重量のグラフを示したものである。
【図１３】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの副腎重量のグラフを示したものである。
【図１４】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの胸腺重量のグラフを示したものである。
【図１５】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットのひらめ筋重量を示したものであって、上図は左ひらめ筋重量、下図は右ひらめ筋重量のグラフを示したものである。
【図１６】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの腓腹筋重量を示したものであって、上図は左腓腹筋重量、下図は右腓腹筋重量のグラフを示したものである。
【図１７】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの２４時間尿量のグラフを示したものである。
【図１８】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの尿中カルシウム排泄量のグラフを示したものである。
【図１９】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの尿中クレアチニン排泄量のグラフを示したものである。
【図２０】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの尿素窒素排泄量のグラフを示したものである。
【図２１】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの糞中カルシウム排泄量のグラフを示したものである。
【図２２】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの左大腿骨湿重量のグラフを示したものである。
【図２３】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの右大腿骨湿重量のグラフを示したものである。
【図２４】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの左大腿骨ＥＮＥＲＧＹのグラフを示したものである。
【図２５】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの右大腿骨ＥＮＥＲＧＹのグラフを示したものである。
【図２６】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの左大腿骨ＳＴＩＦＦＮＥＳＳのグラフを示したものである。
【図２７】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの右大腿骨ＳＴＩＦＦＮＥＳＳのグラフを示したものである。
【図２８】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの骨中リンのグラフを示したものである。
【図２９】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの骨中カルシウムのグラフを示したものである。
【図３０】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットのカルシウム吸収率のグラフを示したものである。
【図３１】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットのカルシウム保持率のグラフを示したものである。
【図３２】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの血漿総たんぱく質のグラフを示したものである。
【図３３】本発明の実施形態にかかる実験時におけるラットの血漿アルブミンのグラフを示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１３】
ニンニクには、０．２％〜０．５％揮発油が含まれており、ニンニクの薬効成分の大半は、この揮発油中の有機硫黄化合物に起因するといわれている。この有機硫黄化合物の一つで、ニンニクの主な香気成分であるＡｌｌｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅ類の一つに、ジアリルスルフィド（ＤＡＳ：Ｄｉａｌｌｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅ）がある。
【００１４】
本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤は、このジアリルスルフィド（ＤＡＳ）（以下、単に「ＤＡＳ」ともいう。）と植物油とを混合させたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分として構成されることを特徴としている。
【００１５】
本実施形態にかかるＤＡＳ含有植物油溶液を構成する植物油としては、コーン胚芽油、椿油、オリーブオイル、種々の食用植物油の使用が可能である。ただし、本実施形態にて用いられる植物油は、水蒸気処理や圧搾などの抽出による過度の加熱処理を行わない精度の高いものを使用することが好ましい。これは、熱や不純物によるＤＡＳの分解を防ぐためである。つまり、本実施形態においては、ＤＡＳと、精度の高い植物油（本実施形態においてはコーン胚芽油）とを混合させたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分として、骨強度低下抑制剤が構成されている。
【００１６】
また、ＤＡＳおよび植物油は、いずれも遮光のために容器にて密閉し、低温下（冷蔵庫）にて保存することが好ましい。さらに、本実施形態にかかるＤＡＳ含有植物油溶液を調製する際には、例えば、ガラス容器内に植物油を入れ、その中にＤＡＳを滴下し、迅速に攪拌する。このようにして調製されたＤＡＳ含有植物油溶液は、揮発性を有するため、調整後は速やかに使用することが好ましいが、必要に応じて、カプセル等に封入した状態で使用してもよい。
【００１７】
上述したようにして構成されたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分とする本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤は、継続した摂取（例えば、毎日一定時間に摂取）することによって、効果的な骨強度低下抑制が期待できる。また、本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤の使用と、低強度の持久的運動負荷とを行うことによって、より効果的な骨強度低下抑制が期待できる。
【００１８】
以下、本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤の効果を確認するための実験等について、具体的に説明する。
【００１９】
＜実験動物および飼育方法＞
【００２０】
本実施形態においては、実験動物として、５週齢の体重１４０ｇ〜１６０ｇのＪｃｌ：ＳＤ（ＳＤ）系雄ラット（日本クレア株式会社）を２１匹用意した。ラットには、１〜２１まで無作為に番号を付し、ステンレスケージで一匹ずつ飼育した。14日間の予備飼育中は、固形飼料（オリエンタル酵母工業株式会社：ＭＦ）を自由摂食で与え、水分は蒸留水を自由に与えた。その後、本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤の効果を確認するための実験飼料を与えて、本実験を行った。
【００２１】
飼育は、室温約２２±１℃、相対湿度約５５±３％、明暗サイクルが１２時間ずつになるように照明時間午前８時〜午後８時、消灯時間午後８時〜午前８時の人口灯の環境下で行った。床替えは、毎日行った。
【００２２】
体重および食餌摂取量は、毎日午後のほぼ一定した時刻に電子天秤を用いて測定した。餌は、毎日新しいものを使用した。
【００２３】
＜飼料＞
【００２４】
飼育期間中の対照食の実験食飼料組成を図１の表に示す。本実験では、餌は自由摂食、水は蒸留水を自由摂水とした。飼料は、ＡＩＮ−９３Ｇの純化食を使用した。また、使用する飼料は、給餌のとき以外は、４℃の冷蔵庫で保管した。
【００２５】
ＤＡＳとは、チオスルフィネート類の分解によって生じる硫黄化合物で、ニンニクの主な香気成分であるＤｉａｌｌｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅである。本実施形態においては、上述した対照食にＤＡＳを添加したものをＤＡＳ添加食とした。飼料への添加量は、２００ｐｐｍとした。ＤＡＳは、揮発を防止するために、コーン油（本発明の「植物油」に相当）と混合した後（つまり、本実施形態にかかるＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分とする骨強度低下抑制剤を構成した後）、他の飼料成分と混ぜ合わせた（骨強度低下抑制剤と他の飼料成分とを混ぜ合わせた）。ＤＡＳの化学構造を、図２に示す。
【００２６】
＜走行訓練＞
【００２７】
予備実験の段階では、すべてのラットに対して、はじめはベルトを動かさずトレッドミル（株式会社夏目製作所製：ＫＮ７３、Ｒ５型トレッドミル）の空間に慣れさせることから始め、徐々に速度３．０ｍ／ｍｉｎ〜５．０ｍ／ｍｉｎ、５分間の歩行から段階的に時間と速度を上げてトレッドミル走行訓練を行えるようにした。この装置は、ベルトコンベア式のもので無段変速器が装着され、可変電圧器を操作することによって、水平位ベルトの走行速度の調節が可能になっている。また、このトレッドミルは、ベルト上にラットを載せると、ラットが前進しなければ後方に送られ、ラットが後端の電極に触れると、電流刺激されるような構成となっている。
【００２８】
本実験においては、運動群のラットのみ毎日一回ほぼ一定の時間、低強度のトレッドミル運動を行わせた。このトレッドミル運動に関する週齢数とその時の速度を図３に示す。
【００２９】
＜動物のグループ分け＞
【００３０】
本実験に入る前に、平均体重がほぼ等しくなること、走行が可能なもの、不可能なものを考慮して、対照食群、ＤＡＳ添加食群（本発明にかかる「骨強度低下抑制剤」を添加した群）ともそれぞれ非運動群と運動群とに分け、具体的には、図４の表に示すように４群に分けた。この図４の表に示すように、本実験においては、それぞれを、対照食・非運動群を「Ｃ」（個体数ｎ＝５）、対照食・運動群を「ＣＥ」（個体数ｎ＝５）、ＤＡＳ添加食・非運動群を「Ｄ」（個体数ｎ＝５）、ＤＡＳ添加食・運動群を「ＤＥ」（個体数ｎ＝５）とした。
【００３１】
＜剖検・試料採取＞
【００３２】
ラットの屠殺前日は、屠殺１５時間前より絶食させた。屠殺は、ジエチルエーテル麻酔下で、腹部大動脈より採血屠殺した。採血に使用した注射器中には、抗血液凝固剤としてヘパリンを使用した。
採血後、臓器（心臓・肺・肝臓・腎臓・脾臓・副腎・精巣・精巣上体・胸腺・褐色脂肪細胞・後腹壁脂肪・副腎周囲脂肪・精巣周囲脂肪）、骨（大腿骨・脛骨・腓骨）、筋肉（ひらめ筋・腓腹筋）を摘出した。
臓器・筋肉は、重量測定後、１０％ホルマリン緩衝液に浸漬し、固定した。血液は、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）にて血漿を分離した。骨は、生理食塩水中で保存した。
【００３３】
尿の採取については、屠殺２日前にラットを代謝ケージに移し、尿採取１日目に１２：３０〜翌１２：３０までの２４時間尿を採取した。採取した尿は、１５ｍｌのプラスチックチューブに移し、尿量を計り記録した。
【００３４】
糞の採取については、屠殺２日前に代謝ケージに移し、糞を採取した。経過後、１日そのまま放置し、その後の処理をしやすくするため自然乾燥させた。その後、糞を１５ｍｌのプラスチックチューブに移し変え、重量を測定して記録した。
【００３５】
カルシウム・リンを測定する試料として、大腿骨を灰化した。るつぼの恒量手順は、まず、るつぼを電気マッフル炉（ＡＤＶＡＮＴＥＣ：ＫＬ−４２０）にて５５０℃で２時間加熱した。そして、マッフル炉中で２時間放冷した後、デシケーター内で１０分間放冷し、電子天秤で秤量した。このとき、前回との重量差が０．３ｍｇ以内となったものを恒量と見なし試料の灰化時に使用した。
【００３６】
試料調整のための骨の灰化の手順は、まず、大腿骨骨幹部を生理食塩水中でパスツールピペットを用いて骨髄を吸引除去した。そして、骨切りはさみで細かく切断し、１０５℃の乾燥機で１６時間乾燥後、デシケーター内で２時間放冷し、乾燥重量を測定した。その後、濃硝酸（有害金属測定用）１ｍｌを加え、るつぼ内で混和し、５０℃で１０分間、１００℃で２時間、６００℃で１６時間の順に温度を上昇させ加熱した。加熱後、マッフル炉内で２時間放冷、デシケーター内で１０分間放冷し、電子天秤で計測した。その後は、５５０℃で２時間加熱、マッフル炉内で２時間放冷、デシケーター内で１０分間放冷後に秤量というサイクルで、るつぼの時と同じく、前回との重量差が０．３ｍｇ以下になるまで秤量を続けた。恒量に達した骨試料の入ったるつぼに、４ｍｌの濃硝酸を加えて溶解し、１００ｍｌのメスフラスコ中で、蒸留水を用いてメスアップした。
【００３７】
カルシウムを測定する試料として、糞を灰化した。るつぼの恒量手順は骨のときと同様に行った。
【００３８】
糞の試料調整の手順は、糞を乳鉢・乳棒を用いてすりつぶして均質化し、それから糞を０．５ｇ量りとり、濃硝酸（有害金属測定用）１ｍｌを加え、るつぼ内で混和した。その後、５０℃１０分間、１００℃２時間、６００℃１６時間の順に温度を上昇させ加熱し、マッフル炉中で２時間放冷、デシケーター内で１０分間放冷し、電子天秤で計測した。その後、５５０℃で２時間加熱、マッフル炉中で２時間放冷、デシケーター内で１０分間放冷後に秤量というサイクルで、るつぼの時と同じく、前回との重量差が０．３ｍｇ以下になるまで秤量を続けた。
【００３９】
＜生理学的および生化学的測定法＞
【００４０】
カルシウム・リンに関する測定器具は、すべて１Ｎ塩酸に浸漬後蒸留水で洗浄し、水道水中のミネラルの影響を受けないようにした。
【００４１】
（骨湿重量の測定法）
骨湿重量に関しては、左右大腿骨の湿重量を電子天秤にて測定し、記録した。
【００４２】
（骨強度の測定法）
骨強度の測定は、骨強度試験装置（室町機械株式会社製：ＴＫ−２５２Ｃ）を用いて、三点曲げ試験法によってＥＮＥＲＧＹとＳＴＩＦＦＮＥＳＳを測定した。
三点曲げ試験法は、骨を下側から二点で支え、上側から骨の中央に負荷を加えて、骨が折れたときの値、すなわち破断力を測定する方法である。この三点曲げ試験法においては、大腿骨・脛骨を１２ｍｍ間隔で支持し、最も安定する角度で置いて測定した。
ＥＮＥＲＧＹ（破断エネルギー）は、骨が破断されるまでの仕事量、すなわち荷重が加わってその方法に動いた仕事量を表す。ＳＴＩＦＦＮＥＳＳは、骨の弾性率であり、骨の硬さの目安を表す。
【００４３】
（骨中カルシウムの測定法）
骨中カルシウムの測定は、カルシウム測定用カルシウムＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて、オクトクレゾールフタレインコンプレキソン（ＯＣＰＣ）法で行った。
５倍希釈した試料０．０５ｍｌにモノエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１２．０）を２．０ｍｌ加え、よく振り混ぜた。これにメチルキシレノールブルーと８−キノリノールを含有した発色試薬を１．０ｍｌ加え、よく振り混ぜた。そして、３時間以内にブランクを対照として、分光光度計で６１０ｎｍの波長で検体および標準液（１０ｍｇ／ｄｌ）の吸光度を測定した。
【００４４】
（骨中リンの測定法）
骨中リンの測定は、モリブデンブルー法で行った。このリン測定にあたっては、以下の要領で試薬等を調整した。
まず、蒸留水３３６ｍｌに塩酸１４ｍｌを加え、１．４％塩酸とした。次に、燐酸カリウムをろ紙にとり、乾燥機中（１０５℃）で２時間乾燥させた。それをデシケーター内で放冷した後、０．２２０ｇを量りとり、１．４％塩酸で５０ｍｌにメスアップし、リン標準液とした。
次に、モリブデン酸アンモニウム５．０ｇを約８０ｍｌの温水（６０℃）中で溶解させた。それを蒸留水で１００ｍｌにメスアップし、モリブデン酸アンモニウム溶液とした。
次に、メタバナジン酸アンモニウム０．２５ｇを温水約５０ｍｌで溶かし、冷却後、濃硝酸を４ｍｌ加え、蒸留水で１００ｍｌにメスアップし、メタバナジン酸アンモニウム溶液とした。
試料としては、原液：蒸留水＝１：１で、２倍希釈したものを用いた。
そして、試料５ｍｌ（ブランクは１．４％塩酸５ｍｌ）、蒸留水１５ｍｌ、メタバナジン酸アンモニウム溶液２．５ｍｌ、モリブデン酸アンモニウム溶液２．５ｍｌを加えてよく混合し、蒸留水で５０ｍｌメスアップした。それを１０分間室温に放置した後、分光光度計で４６０ｎｍの波長で検体および標準液の吸光度を測定した。
【００４５】
（糞中カルシウムの測定法）
恒量に達した糞入りのるつぼは、骨と同様の方法で１００ｍｌにメスアップし、糞試料とした。
カルシウム測定は、カルシウム測定用カルシウムＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて、オクトクレゾールフタレインコンプレキソン（ＯＣＰＣ）法で行った。
５倍希釈した試料０．０５ｍｌにモノエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１２．０）を２．０ｍｌ加え、よく振り混ぜた。これにメチルキシレノールブルーと８−キノリノールを含有した発色試薬を１．０ｍｌ加え、よく振り混ぜた。そして、３時間以内にブランクを対照として、分光光度計で６１０ｎｍの波長で検体および標準液（１０ｍｇ／ｄｌ）の吸光度を測定した。
【００４６】
（尿中カルシウムの測定法）
原尿を４℃、３０００ｒｐｍ、１５分間で遠心分離し、上清をデカンテーションにて別のプラスチックチューブに採取した。これを尿試料とした。
尿中カルシウムの測定は、カルシウム測定用カルシウムＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて、オクトクレゾールフタレインコンプレキソン（ＯＣＰＣ）法で行った。
５倍希釈した試料０．０５ｍｌにモノエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１２．０）を２．０ｍｌ加え、よく振り混ぜた。これにメチルキシレノールブルーと８−キノリノールを含有した発色試薬を１．０ｍｌ加え、よく振り混ぜた。そして、３時間以内にブランクを対照として、分光光度計で６１０ｎｍの波長で検体および標準液（１０ｍｇ／ｄｌ）の吸光度を測定した。
【００４７】
＜統計処理＞
【００４８】
上述した測定結果から得られたデータは、平均±標準誤差で表した。ＤＡＳの食餌添加と、トレッドミル走行運動の二つの因子とし、二元配置の分散分析を行った。群間での有意差検定には、Ｔｕｋｅｙの多重比較法を用いた。その際、ｐ＜０．０５を統計学的に有意差ありと判定した。
【００４９】
＜実験結果１：体重、摂食量、および走行距離＞
【００５０】
実験開始時の８週齢ラットの体重は、Ｃ群２８９±５ｇ、ＣＥ群２９０±４ｇ、Ｄ群３００±３ｇ、ＤＥ群３０１±５ｇであり、終体重は、Ｃ群４００±７ｇ、ＣＥ群３８５±７ｇ、Ｄ群３９１±６ｇ、ＤＥ群３９４±５ｇであった。図５に示すように、実験期間中、体重はいずれの群においても緩やかに増加した。また、この実験時においては、図６に示すように、１日あたりの食餌摂取量は各群で差はなかった。
実験期間中のトレッドミル走行訓練の週齢とその時期の速度については、先に説明した図３に示した。また、運動群（ＣＤ群・ＤＥ群）の総走行距離を図７に示した。この図７の表に示すように、総走行距離に関しては、運動群の２群間に差はなかった。
【００５１】
＜実験結果２：臓器・腺・筋肉重量＞
【００５２】
ラットの体重１００ｇあたりの主要臓器、腺、筋肉重量については、図８〜図１６に示している。これらの図に示すように、心臓、左腎臓、右副腎、副腎合計、胸腺、ひらめ筋、腓腹筋に関して、各群間に有意差はみられなかった。
肝臓については、ＣＥ群がＣ群に対して有意に低値を示し、ＤＥ群がＤ群に対して有意に低値を示した。すなわち、運動群が非運動群に比べ、有意に低値を示した。（ｐ＜０．０５）（図９参照）
脾臓については、Ｄ群がＤＥ群に対して有意に高値を示した。（ｐ＜０．０５）（図１０参照）
右腎臓については、ＣＥ群がＣ群に対して有意に高値を示し、ＣＥ群がＤＥ群に対して有意に高値を示した。（ｐ＜０．０５）（図１１参照）
左副腎については、ＣＥ群がＣ群に対して有意に高値を示し、ＣＥ群がＤＥ群に対して有意に高値を示し、Ｄ群がＣ群に対して有意に高値を示した。（ｐ＜０．０５）（図１３参照）
【００５３】
＜実験結果３：尿・糞成分＞
【００５４】
屠殺２日前の２４時間尿量に関するグラフを図１７に示す。
また、図１８に尿中カルシウム排泄量に関するグラフを示し、図１９に尿中クレアチン排泄量に関するグラフを示している。これらの図１８および図１９に示すグラフによれば、尿中カルシウム排泄量、尿中クレアチン排泄量は、いずれの群間においても、有意な差はみられなかった。
さらに、図２０は、尿素窒素排出量に関するグラフを示している。この図２０に示すように、尿素窒素排出量については、Ｄ群がＣ群に比べ有意に低値を示し、ＤＡＳ添加食群が対照食群と比較して有意に低値を示す傾向がみられた。（ｐ＜０．０５）
また、図２１は、糞中カルシウム排泄量に関するグラフを示している。この図２１に示すように、糞中カルシウム排泄量は、いずれの群間においても有意な差はみられなかった。
【００５５】
＜実験結果４：骨重量および骨成分＞
【００５６】
図２２および図２３に示すように、骨湿重量については、いずれの群間においても有意な差はみられなかった。ここで、図２２は左大腿骨湿重量に関するグラフを示し、図２３は右大腿骨湿重量に関するグラフを示している。
【００５７】
また、先にも説明したとおり、骨破断試験によりＥＮＥＲＧＹとＳＴＩＦＦＮＥＳＳを測定した。ここで、図２４は左大腿骨ＥＮＥＲＧＹに関するグラフを示し、図２５は右大腿骨ＥＮＥＲＧＹに関するグラフを示し、図２６は左大腿骨ＳＴＩＦＦＮＥＳＳに関するグラフを示し、図２７は右大腿骨ＳＴＩＦＦＮＥＳＳに関するグラフを示している。
【００５８】
これらの図２４および図２５のグラフに示すように、ＥＮＥＲＧＹについては、左右大腿骨のいずれの群間においても、有意な差はみられなかった。
【００５９】
図２７は、本実施形態にかかる実験時におけるラットの右大腿骨ＳＴＩＦＦＮＥＳＳに関するグラフを示したものである。この図２７に示すように、ＳＴＩＦＦＮＥＳＳについては、右大腿骨においてＤ群がＣ群に比べ有意に高値を示した。（ｐ＜０．０５）
【００６０】
骨中リンについては、図２８に示すように、ＣＥ群がＣ群に比べ有意に高値を示し、ＤＥ群がＣ群に比べ有意に高値を示した。（ｐ＜０．０５）
【００６１】
また、図２９は骨中カルシウムに関するグラフを示し、図３０はカルシウム吸収率に関するグラフを示し、図３１はカルシウム保持率に関するグラフを示している。この図３０および図３１に示すように、カルシウム吸収率、カルシウム保持率については、いずれの群間においても差はみられなかった。
【００６２】
＜本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤の作用効果等について＞
【００６３】
上述した実験結果に示すように、ラットの体重増加曲線はいずれの群もほぼ同様の緩やかな増加を示し（図５参照）、飼料摂食量もほぼ同様に直線的な増加がみられた。
【００６４】
また、尿中カルシウム量（図１８参照）および糞中カルシウム量（図２１参照）については、群間の差はみられなかった。
【００６５】
さらに、大腿骨の骨長・骨径に差はみられなかったが、大腿骨湿重量（図２２、図２３参照）ではＣＥ群がＣ群と比べて有意に高値を示した。骨強度については、ＣＥ群、Ｄ群、ＤＥ群が、Ｃ群と比べて高い傾向を示した。大腿骨骨幹部におけるカルシウム含有量においては、Ｄ群が、Ｃ群、ＣＥ群、ＤＥ群と比べて有意に高値を示し、ＤＥ群も、Ｃ群、ＣＥ群と比べて有意に高値を示した。
【００６６】
より具体的には、三点曲げ試験法の骨破断におけるＳＴＩＦＦＮＥＳＳについては、図２７に示すように、右大腿骨において、Ｄ群がＣ群に比べ有意に高値を示した。これは、以下の理由によると考えられる。
ここで、図３２は血漿総たんぱく質濃度に関するグラフを示し、図３３は血漿アルブミン濃度に関するグラフを示している。
これらの図に示すように、血漿総たんぱく質濃度については、各群間で有意な差はみられなかったが（図３２参照）、血漿アルブミン濃度においては、ＣＥ群がＣ群と比較して有意に高値を示し、ＤＥ群がＤ群と比較して有意に高値を示し、運動群が非運動群と比較して高値を示し、Ｄ群がＣ群と比較して有意に高値を示した。
つまり、血漿アルブミン濃度は、ＤＡＳ添加食群が対照食群に比べ有意に高値を示した。しかしながら、その一方では、尿素窒素排泄量（図２０参照）においては、ＤＡＳ添加食群が対照食群に比べ、低い傾向がみられた。このことから、本実施形態にかかるＤＡＳ添加食群の方が、「骨の形成材料」をより多く体内に留めていることが明らかである。すなわち、本実施形態にかかる骨強度低下抑制剤を構成するＤＡＳが、骨吸収促進因子の産生を抑制したことによって、骨密度を高め、骨破断におけるＳＴＩＦＦＮＥＳＳを高めたためであると考えられる。
【００６７】
また、骨は、カルシウム、リンなどのミネラル貯蔵庫としても重要な役割を担っている。骨中成分については、図２８に示すように、骨中リン含有量が、ＣＥ群がＣ群に比べ有意に高値を示し、さらにＤＥ群がＣ群に比べ有意に高値を示し、非運動群に比べ運動群で高値を示す傾向がみられた。
【００６８】
以上のことから、本実施形態においては、骨強度低下抑制剤と運動とにより、大腿骨骨幹部骨塩量が増加し、骨中のリン含有量が増加したと考えられる。すなわち、本実施形態によれば、骨強度の低下を効果的に抑制可能な骨強度低下抑制剤を得ることができる。また、本実施形態によれば、骨強度の低下を効果的に抑制可能な骨強度低下抑制方法を得ることができる。
【００６９】
＜その他の実施形態＞
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨に適合し得る範囲で必要に応じて種々の変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
近年、増加傾向にある高齢者の骨折は、骨の強度低下が原因で発症する脆弱性骨折が原因とされている。そこで、骨強度低下抑制作用を有する薬剤の開発が求められている。
【００７１】
本件発明者は、ガーリックオイル成分の一つであり、ニンニクの特有の香気成分であるジアリルスルフィド（ＤＡＳ：Ｄｉａｌｌｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅ）の生体に及ぼす影響をテーマに、動物実験（ラットに摂取）を重ねてきた。そこで、本件発明者は、ＤＡＳを食餌添加させて摂取したラットにおいて、これらの骨（骨重量、骨強度、骨成分）に及ぼす影響を確認した。そして、食品成分であるニンニクの成分（ＤＡＳ）を摂取することにより、骨強度低下抑制剤としての有用性があることに想到した。
【００７２】
すなわち、本件発明者は、このたび、ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）と植物油とを混合させたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分とする骨強度低下抑制剤を開発するに至った。なお、この骨強度低下抑制剤の摂取形態としては、ＤＡＳ含有コーンオイル溶液をサプリメントとして（例えば、カプセルに封入して）摂取し、骨折予防に利用することも可能である。
【符号の説明】
【００７３】
Ｃ …対照食群（非運動群）
ＣＥ…対照食群（運動群）
Ｄ …ＤＡＳ添加食群（非運動群）
ＤＥ…ＤＡＳ添加食群（運動群）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）と植物油とを混合させたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分とすることを特徴とする骨強度低下抑制剤。
【請求項２】
前記ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）が、ニンニクから抽出されたものである
請求項１に記載の骨強度低下抑制剤。
【請求項１】
ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）と植物油とを混合させたＤＡＳ含有植物油溶液を有効成分とすることを特徴とする骨強度低下抑制剤。
【請求項２】
前記ジアリルスルフィド（ＤＡＳ）が、ニンニクから抽出されたものである
請求項１に記載の骨強度低下抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【公開番号】特開２０１１−９３８６２（Ｐ２０１１−９３８６２Ａ）
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５１５３７（Ｐ２００９−２５１５３７）
【出願日】平成２１年１０月３１日（２００９．１０．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年５月１日 社団法人 日本栄養・食糧学会発行の「第６３回日本栄養・食糧学会大会 講演要旨集」に発表
【出願人】（５０５２２５１９７）長崎県公立大学法人 (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月３１日（２００９．１０．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年５月１日 社団法人 日本栄養・食糧学会発行の「第６３回日本栄養・食糧学会大会 講演要旨集」に発表
【出願人】（５０５２２５１９７）長崎県公立大学法人 (31)
【Ｆターム（参考）】
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