黄色ブドウ球菌バクテリア用の反応培地
本発明は、α−グルコシダーゼのための２つの酵素基質の組合せを含む黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）バクテリアを検出および／または同定するための反応培地に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）バクテリアを検出するための培地に関する。本発明は、この培地の使用と黄色ブドウ球菌バクテリアを同定する方法に関する。
【０００２】
２００８年では、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）は４１種２４亜種を含んでおり、そのうちの少なくとも１７種はヒトで見つかっている。これらの種の大部分は、外傷又は医薬関連品の直接移植による皮膚損傷の場合にハイリスクを呈するヒトの日和見病原体である。さらには、黄色ブドウ球菌は、注射器またはカテーテルのような器具を含む病院介護を受けなければならない患者で、しばしば見いだされる細菌である。この病原性バクテリアは院内疾患に関連していることがますます示されており、この病原性バクテリアの存在を検出することは、非常に役に立つことである。
【０００３】
ブドウ球菌の中で、黄色ブドウ球菌は疑いなく最も強毒性の種である。これは、多数の毒素と細胞外酵素を産生するためである。それは、単純なひょう疽から、敗血症、心内膜炎、肺炎または関節感染症のような最も重篤な感染症であって予後があまり楽観的でないような感染症に及ぶ、多数の様々な病的状態の原因となることがある。加えて、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス及びスタヒロコッカス・ホミニスの５種のみが、臨床施設で単離される病原性菌株の少なくとも１％を示し、これらの５種は最も一般的に遭遇するブドウ球菌菌株の９８％以上を示す。その他の種はめったに遭遇することがなく、あまり病原性でない。
【０００４】
細菌学において、黄色ブドウ球菌種はコアグラーゼの生産によって特徴付けられ、従来「コアグラーゼ陰性」と称される他の種と対比される。黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）とアウレウスでないブドウ球菌を区別するための従来法は、遊離コアグラーゼ及びＤＮａｓｅについての調査及びフィブリノーゲン親和性因子、プロテインＡと莢膜抗原の存在を証明することを目的とするラテックス上の凝集反応を得ることに基づく。他の潜在的病原性のブドウ球菌種は、コアグラーゼを発現することができることに注意すべきである。
コアグラーゼ陽性の種は、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・インターメディウス、スタフィロコッカス・ヒイカス、スタフィロコッカス・デルフィニス、スタフィロコッカス・ルトラエ及びスタフィロコッカス・シュライフェリである。
黄色ブドウ球菌の存在を評価することができる選択培地の培養技術が存在する。関係する培地は、以下である：
＊チャップマン高塩濃度培地（７５％ＮａＣｌを含む）は、通常は黄色ブドウ球菌とマンニトールを加水分解するブドウ球菌について選択性である。これらのバクテリアは、培地を赤色から黄色に変化させる。特定の微生物とＤ群腸球菌は、特に、培地上で同じ反応を産生できる；従って、次に（連鎖球菌が陰性の）カタラーゼを確認する必要である。
＊ベアードパーカー卵黄培地（選択剤として亜テルル酸カリウムと塩化リチウムを含有）が、食品のコアグラーゼ陽性のブドウ球菌を分離して計数するために使用され、レシチナーゼ活性を示すことを可能にする。この培地上で、黄色ブドウ球菌と他のコアグラーゼ陽性の種のコロニーは、不透明なハロによって囲まれた黒い中心と共に現れる。その他の微生物がこの培地上で生育することができる。これらは、主に以下のグループである：
・グラム＋球菌：エンテロコッカス属及びリステリア属のもの。
・グラム−細菌：プロテウス属及びシュードモナス属のもの。
＊ベアードパーカー培地＋ＲＰＦ（ウサギ血漿＋ウシ・フィブリノーゲン）が、食品中のコアグラーゼ陽性のブドウ球菌を分離して計数するために使用され（ＩＳＯ標準６８８８−１と６８８８−２による対照標準培地）、コアグラーゼ活性を示すことを可能にする。この培地上で、黄色ブドウ球菌及びその他のコアグラーゼ陽性の種は、不透明なハロによって囲まれる黒い中心と共に現れる。実際には、チャップマン高塩濃度培地技術を使用する黄色ブドウ球菌の確認は、感受性（後者が生物学的試験試料の少量に存在する場合に捜している種を明らかにする能力）と特に特異性（他の種を含む生物学的試験試料において捜している種を検出する能力）を欠いている。
【０００５】
同様に、ベアードパーカー卵黄培地技術を使用した場合の黄色ブドウ球菌の出現は、感受性と特異性を欠いている。例えば、種の黄色ブドウ球菌に属さないいくつかの菌株、特にスタフィロコッカス・シュライフェリ及びスタフィロコッカス・サプロフィティカスは、明るいハロによって囲まれたコロニーを示すことができる。また、黄色ブドウ球菌の特定の菌株は、酵素活性を発現しないか又は培地上で生育しないが、それは生物学的試料中にあまりにも少量しか存在しない可能性があり、及び／又はあまりに選択的である培地の成分によって抑制される可能性があるためである。
【０００６】
ベアードパーカー＋ＲＰＦ培地の場合、いくつかの欠点が一般的に観察される。第１に、読みとりと感受性に関する難点がある：偽陰性は、黄色ブドウ球菌の特定の菌株がこの培地上で生育しないか、又はコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の存在の推測につながるとても弱く遅延したコアグラーゼを呈するために、潜在的に現われる可能性がある。さらにまた、偽陰性の結果は、また、マトリックス干渉のために観察される可能性がある；具体的には、黄色ブドウ球菌の低レベルの混入を計数するために、試料の最小希釈率で実施され（１／１０）、それによりマトリックス化合物の存在のためにハロの読みとりに困難を生じる（例えば、牛乳および／または乳製品の試料：コアグラーゼを示すハロをマスキングする白色のカゼイン）。ベアードパーカー＋ＲＰＦ培地は、トロンビンの供与源とプラスミノーゲンの供与源の組合せを必要とする。これらは動物血液から得られるが、それは供給（品質、量など）の信頼性に問題を有する。加えて、培養液（液体培地）ではハロを読みとることは可能でなく、ハロと培地のコントラストは低いかもしれない。最後に、集密的なコロニーの場合、ハロを生じないものと比較して、ハロを生じるものを決定することは難しい。
【０００７】
第２に、特異性の問題も存在する可能性がある：大量の第２の細菌叢（例えばバシラス種）が存在する場合には、偽陽性の結果がこのタイプの培地に現れることがある。これは、たとえば、スタフィロコッカス・キシローサスが発酵体として使われる乳製品（マンステール・タイプのチーズ）及び特定の食肉加工品（乾燥したソーセージ）の黄色ブドウ球菌を計数する場合である。例えば、ベアードパーカー＋ＲＰＦ培地に出現するハロによって囲まれた黒いコロニーは、通常は黄色ブドウ球菌の特徴であるコロニーであるが、実際は、（ハロのない黒いコロニーを形成する）スタフィロコッカス・キシローサス菌株及び（ハロを作り出す）コアグラーゼを有するバシラス属の特定の菌株の、寒天上での連続的な増殖の影響である。
従って、ベアードパーカー、ベアードパーカー＋ＲＰＦ及びチャップマン培地での検出は、推定的な診断でしかなく、他の確認テストを必要とすると理解される。しかしながら、黄色ブドウ球菌を同定するために必要な追加的な処理は、解析の時間とコストを増大させる。それらは、資格を有するスタッフの参加と多数の試薬を必要とする。
【０００８】
また、酵素基質に基づく培地を使用することもある。
O.Gaillot et al. 2000(J. Clin. Microbiol. 38, 4, 1587-1591)の論文「Evaluation of CHROMagar Staph. aureus, a new chromogenic medium, for isolation and presumptive identification of S.aureus from human clinical specimens」は、ブドウ球菌の分離と黄色ブドウ球菌の同定のための発色性培地のＣＨＲＯＭａｇａｒ（登録商標）Staph. aureusを記載し、評価しており、それは後者の種に藤色の呈色を与える発色性基質を使用している。そして、同属の他種は、理論的には、青色か無色によって検出される。β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ及びホスファターゼ活性は、インヒビターであるデフェロキサミンと共に本質的に使用され、黄色ブドウ球菌とスタフィロコッカス・エピデルミディスとを区別することができる。しかしながら、黄色ブドウ球菌とスタフィロコッカス・エピデルミディスとを区別することは難しく、２種はＣＨＲＯＭａｇａｒ（登録された商標）培地上に同色のコロニーを産生するためである。これは、黄色ブドウ球菌とスタフィロコッカス・エピデルミディスについて陽性であるホスファターゼ基質の特異性の欠如のためであり、デフェロキサミンによる後者の阻害が部分的であるという事実のためでる。
更に、さまざまなブドウ球菌種を同定するためのα-グルコシド基質の使用を記載する出願ＷＯ０２０７９４８６を挙げることができ、別の酵素活性のための基質と組合わせてもよい。しかしながら、特定の条件下で、例えば、弱いα-グルコシダーゼ活性を有しており、少量（２〜５０コロニー形成単位）に存在する菌株については、活性の検出は遅い可能性があり、２４時間以上のインキュベーションを必要とする。
本発明は、黄色ぶどう球菌を分離して同定するために、感受性が高く、特異的であり、迅速な新規の検出培地を提供することによって、従来技術の隙間を埋めることを目的とする。
【０００９】
更に続ける前に、以下に示す定義は、より明確に本発明を理解することを可能にするものであり、限定するものではない。
本発明のために、反応培地なる用語は、微生物（例えば黄色ブドウ球菌）の生存及び／又は増殖のために必要な成分の全てを含む培地を意味することを目的とする。この反応培地は、検出（revealing)培地のみとしても、あるいは培養且つ検出培地としても用いられる。前者の場合は、微生物は接種前に培養され、後者の場合は反応培地は更に培養培地を構成する。反応培地は、固体、半固体または液体であってもよい。
「固形培地」なる用語は、例えばゲル化培地を意味することを目的とする。本発明に係る培地はゲル化培地であることが望ましい。寒天は微生物を培養するための微生物学の従来のゲル化剤であるが、ゼラチンまたはアガロースを使用することも可能である。いくつかの数の製品が市販されており、コロンビア寒天、トリプチカーゼ大豆寒天、マッコンキー寒天、サブロー寒天またはさらに一般的にはthe Handbook of Microbiological Media (CRC Press)に記載されているものである。
本発明による反応培地は、その他の可能な添加物、例えばペプトン、一つ以上の増殖因子、糖質、一つ以上の選択剤、緩衝液、一つ以上のゲル化剤等を含んでもよい。この反応培地は、すぐに使用できる、すなわちチューブ中またはフラスコ中にまたはシャーレ上において、接種する準備ができている液体またはゲルの形態であってもよい。この培地はフラスコ中でゲルの形態で提供され、培地はシャーレに注入される前に（１００℃に供して）再生させることが好ましい。好ましくは、本発明の培地は、選択培地、すなわち黄色ブドウ球菌バクテリアの成長を助けるインヒビターを含んでなる培地である。特に塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、アンフォテリシン、アズトレオナム、コリマイシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、デフェロキサミン及びビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９を挙げることができる。
【００１０】
さらに、この培地はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の検出に適していてもよく、１又は複数の抗生物質を含んでもよく、前記抗生物質はＭＲＳＡが耐性化しているものであり、例えばセファロスポリンまたはカルバペネム、好ましくは以下から選択されるものである：
＊第一世代のセファロスポリン、例えばセファレキシン、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セファドロキシル、セファゼドン、セファトリジン、セファピリン、セフラジン、セファセトリル、セフロダキシネ（Cefrodaxine）、セフテゾール；
＊第二世代のセファロスポリン、例えばセフォキシチン、セフロキシム、セファマンドール、セファクロル、セフォテタン、セフォニシド（Cefonicide）、セフォチアム、ロラカルベフ（Loracarbef）、セフメタゾール、セフプロジル、セホラニド；
＊第三世代のセファロスポリン、例えばセフォタキシム、セフタジジム、セフスロジン（Cefsulodine）、セフトリアキソン、セフメノキシム、ラタモキセフ、セフチゾキシム、セフィキシム、セフォジジム、セフェタメト（Cefetamet）、セフピラミド、セフォペラゾン、セフポドキシム、セフチブテン、セフジニル、セフジトレン、セフトリアキソン、セフォペラゾン；
＊第四世代のセファロスポリン、例えばセフェピム、セフピロム；
＊メロペネム、エルタペネム、イミペネム
【００１１】
本発明では、酵素活性用の基質（または酵素基質）は、α−グルコシダーゼ酵素活性の直接的または間接的な検出を可能にする生成物を与えるために加水分解されることができる任意の基質から選択される。
天然基質でも合成基質であってもよい。基質の代謝によって、反応培地の又は生物の細胞の生理化学的性質に変化が生じる。この変化は、物理化学的方法、特に光学的方法、オペーレーターの視覚により、または分光計、電気、磁気等の計測器を使用して検出することができる。それは、吸収、蛍光または発光の変化のような光学的性質の変異であることが望ましい。
発色性基質として、インドキシル、フラボン、アリザリン、ナフトールベンゼイン、ニトロフェノール、ナフトール、カテコール、ヒドロキシキノリンまたはクマリン系の基質を挙げることができる。本発明で使用する基質は、インドキシル系であることが好ましい。
蛍光性の基質として、ウンベリフェロン系またはクマリン系基質、レゾルフィン系、フェノキサジン系、ナフトール系、ナフチルアミン系、2'-ヒドロキシフェニル-ヘテロ環系基質、あるいは他にフルオレセイン系を挙げることができる。
α-グルコシダーゼ酵素活性のための基質として、特に基質5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド；ジヒドロキシフラボン-α-グルコシド; 3,4-シクロヘキセノエスクレチン-α-グルコシド; 8-ヒドロキシキノリン-α-グルコシド; 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド; 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド; 6-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド; 5-ブロモ-3-インドキシル-α-グルコシド; 5-ヨード-3-インドキシル-α-グルコシド; 6-フルオロ-3-インドキシル-α-グルコシド;アリザリン-α-グルコシド;ニトロフェニル-α-グルコシド; 4-メチルウンベリフェリル-α-グルコシド;ナフトールベンゼイン-α-グルコシド;インドキシル-Ｎメチル-α-グルコシド;ナフチル-α-グルコシド;アミノフェニル-α-グルコシド;ジクロロ・アミノフェニル-α-グルコシド；レゾルフィン-α-グルコシドを挙げることができる。
本発明において使用する基質は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドと組合わせた5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドが好ましい。
【００１２】
本発明の基質は、広いｐＨ範囲において、特にｐＨ５．５〜１０、好ましくは特に６．５〜１０で使用することができる。基質の濃度は、好ましくは０．０１〜２ｇ／ｌであり、より好ましくは０．０２〜０．２ｇ／ｌであり、有利には０．１ｇ／ｌである。この基質濃度では、より良好な呈色反応コントラストが得られるためである。
【００１３】
生物学的試料なる用語は、気管支、気管又は肺吸引試料または胸膜液試料からの、気管支肺胞洗浄からの、喀痰からの、血液からのまたは肺生検からの、関節滑液または囲心腔液からの臨床試料；体液又は任意の種類の食物に由来する食物試料を意味することを目的とする。従って、この試料は液体であっても固体であってもよく、非限定的に、血液、血漿、尿または糞便由来の臨床試料、または鼻から、会陰部から、のどから、皮膚から、損傷からまたは脳脊髄液から得られた試料、または食物試料を挙げることができる。この点で、本発明は、黄色ぶどう球菌バクテリアを検出および／または同定するための反応培地に関する。
【００１４】
これに関して、本発明は、α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の組合せを含む黄色ブドウ球菌バクテリアの検出および／または同定をするための反応培地に関する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの基質のうちの１つは、インドキシル-α-グルコシド基質、好ましくは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド（X-N-メチル-α-グルコシド）または5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド（X-α-グルコシド）である。
前記インドキシル-α-グルコシド基質は０．０１〜２ｇ／ｌ、好ましくは０．０５〜０．３ｇ／ｌの濃度で培地に存在することが好ましい。
α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の前記組合せは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドを含むことが好ましい。
【００１５】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記培地は、黄色ブドウ球菌バクテリアの増殖を助けるインヒビターの混合物を更に含み、好ましくは塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナム、アンフォテリシン、コリマイシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びデフェロキサミンである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、培地は、ブドウ球菌属のバクテリアの増殖を助ける４つのインヒビターのインヒビター混合物を更に含んでおり、前記インヒビターはＬｉＣｌ、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナム及びアンフォテリシンである。
【００１６】
更に、本発明は、黄色ぶどう球菌バクテリアを分離して同定するための、上記の反応培地のインビトロ使用にも関する。
最後に、本発明は、生物学的試料において、黄色ぶどう球菌バクテリアを検出および／または同定する方法であって、
ａ）上記の反応培地に、黄色ブドウ球菌バクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること；
ｂ）インキュベートすること；
ｃ）黄色ブドウ球菌コロニーを同定すること；
ｄ）ＭＲＳＡコロニーを同定することを含む方法に関する。
【００１７】
インキュベーションは、３０℃から４２℃で実施されることが好ましい。黄色ブドウ球菌は、有色の又は蛍光のコロニーを得ることを可能にする特異的なグルコシダーゼ活性によって検出されることが好ましい。他の黄色ブドウ球菌の種は、無色に見えるかまたは黄色ブドウ球菌コロニーのものとは異なる色または蛍光を有する。
本発明は、ＭＲＳＡバクテリアを検出および／または同定するための反応培地であって、α−グルコシダーゼのための２つの酵素基質の組合せと、ＭＲＳＡが耐性化している抗生物質、好ましくはセファロスポリン、例えばセホキシチンを含む反応培地にも関する。この抗生物質が、他の抗生物質と組合わせてもよい。上記の組合せは、好ましくは、セホキシチン/セフォタキシムまたはセホキシチン/エルタペネムから選択される。上記の培地は、特にＭＲＳＡの検出に適している。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの基質のうちの１つは、インドキシル-α-グルコシド基質、好ましくは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド（X-N-メチル-α-グルコシド）または5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド（X-α-グルコシド）である。
前記インドキシル−α−グルコシド基質は０．０１〜２ｇ／ｌ、好ましくは０．０５〜０．３ｇ／ｌの濃度で培地に存在することが好ましい。
α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の前記組合せは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドを含むことが好ましい。
【００１８】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記培地は、黄色ブドウ球菌バクテリアの増殖を助けるインヒビターの混合物を更に含み、好ましくは塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナム、アンフォテリシン、コリマイシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びデフェロキサミンである。
更に、本発明は、黄色ぶどう球菌バクテリアを分離して同定するための、上記の通り反応培地のインビトロ使用にも関する。
最後に、本発明は、生物学的試料中のＭＲＳＡバクテリアを検出および／または同定する方法であって、
ａ） 上記の反応培地に、ＭＲＳＡバクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること；
ｂ） インキュベートすること；
ｃ） ＭＲＳＡコロニーを同定することを含む方法に関する。
【００１９】
インキュベーションは、３０℃から４２℃で実施されることが好ましい。
ＭＲＳＡは、有色の又は蛍光のコロニーを得ることを可能にする特異的なグルコシダーゼ活性によって検出されることが好ましい。他の種は、無色に見えるかまたはＭＲＳＡコロニーのものとは異なる色または蛍光を有する。
【００２０】
以下の実施例は、説明のために示すものであり、事実上限定するものでない。それらは、本発明をより明らかに理解することを可能にする。
【実施例】
【００２１】
１．本発明の培地の調製
以下に実験において試験される培地は、基本培地としてchromID MRSA培地（ビオメリューref. 43 451）を含み、以下の成分を含んでなる培地である：
培地Ｔ：chromID MRSAコントロール培地（ref. 43 451)に、特にＸ−Ｎ−メチル−α−グルコシド基質を濃度０．１ｇ／ｌで、セフォキシチンを４ｍｇ／ｌで含む。
培地Ｓ：培地Ｔに、２５、３７、４５又は５０ｍｇ／ｌの濃度の、Ｘ−α−グルコシド基質を更に含む。
培地Ｆ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン／セフォタキシムの組合せと置換されている：
培地Ｇ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン／セフトリアキソンの組合せと置換されている：
培地Ｈ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン／エルタペネムの組合せと置換されている：
培地Ｉ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン／セフポドキシムの組合せと置換されている：
培地Ｊ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン／セフォペラゾンの組合せと置換されている：
培地Ｋ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン／セフォタキシムの組合せと置換され、更にブドウ球菌属に属さない微生物のインヒビターの混合物であって、黄色ブドウ球菌の成長を助けるものを含む。
【００２２】
２． 培地の接種と読取り
菌株（全て出願人のコレクションに由来するもの）のさまざまなセットは、生理食塩液に懸濁されて、分離したコロニーを得るために、培地上に接種された。皿は、４８時間、３７℃でインキュベートされた。形成されたコロニーは、インキュベーションの１８時間または２４時間後に、視覚的に調べられた。更に、呈色強度は、０〜４のスケールに従って観察された（０：呈色反応なし、４：非常に強度の呈色）。
検出された菌株は、培地の上に有色のコロニーを形成している菌株に対応する。
【００２３】
３． 結果：
３．１ − ２つのα−グルコシダーゼ基質を含むＭＲＳＡを検出するための培地
１又は２つのα−グルコシダーゼ基質の使用で得られた結果を表１に示す。
表１ − ２つのα−グルコシダーゼ基質の使用によるコロニーの呈色反応の強度
第２のα-グルコシダーゼ基質の添加は、コロニーの呈色反応を強力に増大することを可能にし、従ってMRSAコロニーをよりよく正確に指摘することを可能にする。
【００２４】
３．２ − ２つのα−グルコシダーゼ基質と、セホキシチン／セフトリアキソン、セホキシチン／セフォタキシム、セホキシチン／エルタペネム、セホキシチン／セホペラゾンまたはセホキシチン／セフポドキシムの対から選択される抗生物質の組合せを含む、ＭＲＳＡを検出するための培地
抗生物質の組合せが使われた場合に得られた結果を表２に示す。
表２−抗生物質の組合せを使用した場合のＭＲＳＡコロニーの検出（全菌種の数につき検出された菌種数として表示された検出）
上記の抗生物質の組合せは、４ｍｇ／ｌのセホキシチンを単独で有する培地よりも、良いパフォーマンス・レベルを得ることができた。
【００２５】
３．３ − 黄色ブドウ球菌の増殖を助けるインヒビターの混合物と、セホキシチン／セフォタキシムの抗生物質の組合せを含む、ＭＲＳＡを検出するための培地
抗生物質の組合せが使われた場合に得られた結果を表３に示す。
表３ − インヒビター混合物と、セホキシチン／セフォタキシム抗生物質の組合せが使われた場合のＭＲＳＡコロニーの検出（全菌種の数につき検出された菌種の数として表示された検出）
黄色ブドウ球菌の増殖を促進するインヒビター混合物と組合わせた、セホキシチン／セフォタキシム抗生物質の組合せは、特に濃度０．７５ｍｇ／ｌのセホキシチンとセフォタキシムを使用した場合に、優れた特異性と感受性を得ることができた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）バクテリアを検出するための培地に関する。本発明は、この培地の使用と黄色ブドウ球菌バクテリアを同定する方法に関する。
【０００２】
２００８年では、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）は４１種２４亜種を含んでおり、そのうちの少なくとも１７種はヒトで見つかっている。これらの種の大部分は、外傷又は医薬関連品の直接移植による皮膚損傷の場合にハイリスクを呈するヒトの日和見病原体である。さらには、黄色ブドウ球菌は、注射器またはカテーテルのような器具を含む病院介護を受けなければならない患者で、しばしば見いだされる細菌である。この病原性バクテリアは院内疾患に関連していることがますます示されており、この病原性バクテリアの存在を検出することは、非常に役に立つことである。
【０００３】
ブドウ球菌の中で、黄色ブドウ球菌は疑いなく最も強毒性の種である。これは、多数の毒素と細胞外酵素を産生するためである。それは、単純なひょう疽から、敗血症、心内膜炎、肺炎または関節感染症のような最も重篤な感染症であって予後があまり楽観的でないような感染症に及ぶ、多数の様々な病的状態の原因となることがある。加えて、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス及びスタヒロコッカス・ホミニスの５種のみが、臨床施設で単離される病原性菌株の少なくとも１％を示し、これらの５種は最も一般的に遭遇するブドウ球菌菌株の９８％以上を示す。その他の種はめったに遭遇することがなく、あまり病原性でない。
【０００４】
細菌学において、黄色ブドウ球菌種はコアグラーゼの生産によって特徴付けられ、従来「コアグラーゼ陰性」と称される他の種と対比される。黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）とアウレウスでないブドウ球菌を区別するための従来法は、遊離コアグラーゼ及びＤＮａｓｅについての調査及びフィブリノーゲン親和性因子、プロテインＡと莢膜抗原の存在を証明することを目的とするラテックス上の凝集反応を得ることに基づく。他の潜在的病原性のブドウ球菌種は、コアグラーゼを発現することができることに注意すべきである。
コアグラーゼ陽性の種は、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・インターメディウス、スタフィロコッカス・ヒイカス、スタフィロコッカス・デルフィニス、スタフィロコッカス・ルトラエ及びスタフィロコッカス・シュライフェリである。
黄色ブドウ球菌の存在を評価することができる選択培地の培養技術が存在する。関係する培地は、以下である：
＊チャップマン高塩濃度培地（７５％ＮａＣｌを含む）は、通常は黄色ブドウ球菌とマンニトールを加水分解するブドウ球菌について選択性である。これらのバクテリアは、培地を赤色から黄色に変化させる。特定の微生物とＤ群腸球菌は、特に、培地上で同じ反応を産生できる；従って、次に（連鎖球菌が陰性の）カタラーゼを確認する必要である。
＊ベアードパーカー卵黄培地（選択剤として亜テルル酸カリウムと塩化リチウムを含有）が、食品のコアグラーゼ陽性のブドウ球菌を分離して計数するために使用され、レシチナーゼ活性を示すことを可能にする。この培地上で、黄色ブドウ球菌と他のコアグラーゼ陽性の種のコロニーは、不透明なハロによって囲まれた黒い中心と共に現れる。その他の微生物がこの培地上で生育することができる。これらは、主に以下のグループである：
・グラム＋球菌：エンテロコッカス属及びリステリア属のもの。
・グラム−細菌：プロテウス属及びシュードモナス属のもの。
＊ベアードパーカー培地＋ＲＰＦ（ウサギ血漿＋ウシ・フィブリノーゲン）が、食品中のコアグラーゼ陽性のブドウ球菌を分離して計数するために使用され（ＩＳＯ標準６８８８−１と６８８８−２による対照標準培地）、コアグラーゼ活性を示すことを可能にする。この培地上で、黄色ブドウ球菌及びその他のコアグラーゼ陽性の種は、不透明なハロによって囲まれる黒い中心と共に現れる。実際には、チャップマン高塩濃度培地技術を使用する黄色ブドウ球菌の確認は、感受性（後者が生物学的試験試料の少量に存在する場合に捜している種を明らかにする能力）と特に特異性（他の種を含む生物学的試験試料において捜している種を検出する能力）を欠いている。
【０００５】
同様に、ベアードパーカー卵黄培地技術を使用した場合の黄色ブドウ球菌の出現は、感受性と特異性を欠いている。例えば、種の黄色ブドウ球菌に属さないいくつかの菌株、特にスタフィロコッカス・シュライフェリ及びスタフィロコッカス・サプロフィティカスは、明るいハロによって囲まれたコロニーを示すことができる。また、黄色ブドウ球菌の特定の菌株は、酵素活性を発現しないか又は培地上で生育しないが、それは生物学的試料中にあまりにも少量しか存在しない可能性があり、及び／又はあまりに選択的である培地の成分によって抑制される可能性があるためである。
【０００６】
ベアードパーカー＋ＲＰＦ培地の場合、いくつかの欠点が一般的に観察される。第１に、読みとりと感受性に関する難点がある：偽陰性は、黄色ブドウ球菌の特定の菌株がこの培地上で生育しないか、又はコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の存在の推測につながるとても弱く遅延したコアグラーゼを呈するために、潜在的に現われる可能性がある。さらにまた、偽陰性の結果は、また、マトリックス干渉のために観察される可能性がある；具体的には、黄色ブドウ球菌の低レベルの混入を計数するために、試料の最小希釈率で実施され（１／１０）、それによりマトリックス化合物の存在のためにハロの読みとりに困難を生じる（例えば、牛乳および／または乳製品の試料：コアグラーゼを示すハロをマスキングする白色のカゼイン）。ベアードパーカー＋ＲＰＦ培地は、トロンビンの供与源とプラスミノーゲンの供与源の組合せを必要とする。これらは動物血液から得られるが、それは供給（品質、量など）の信頼性に問題を有する。加えて、培養液（液体培地）ではハロを読みとることは可能でなく、ハロと培地のコントラストは低いかもしれない。最後に、集密的なコロニーの場合、ハロを生じないものと比較して、ハロを生じるものを決定することは難しい。
【０００７】
第２に、特異性の問題も存在する可能性がある：大量の第２の細菌叢（例えばバシラス種）が存在する場合には、偽陽性の結果がこのタイプの培地に現れることがある。これは、たとえば、スタフィロコッカス・キシローサスが発酵体として使われる乳製品（マンステール・タイプのチーズ）及び特定の食肉加工品（乾燥したソーセージ）の黄色ブドウ球菌を計数する場合である。例えば、ベアードパーカー＋ＲＰＦ培地に出現するハロによって囲まれた黒いコロニーは、通常は黄色ブドウ球菌の特徴であるコロニーであるが、実際は、（ハロのない黒いコロニーを形成する）スタフィロコッカス・キシローサス菌株及び（ハロを作り出す）コアグラーゼを有するバシラス属の特定の菌株の、寒天上での連続的な増殖の影響である。
従って、ベアードパーカー、ベアードパーカー＋ＲＰＦ及びチャップマン培地での検出は、推定的な診断でしかなく、他の確認テストを必要とすると理解される。しかしながら、黄色ブドウ球菌を同定するために必要な追加的な処理は、解析の時間とコストを増大させる。それらは、資格を有するスタッフの参加と多数の試薬を必要とする。
【０００８】
また、酵素基質に基づく培地を使用することもある。
O.Gaillot et al. 2000(J. Clin. Microbiol. 38, 4, 1587-1591)の論文「Evaluation of CHROMagar Staph. aureus, a new chromogenic medium, for isolation and presumptive identification of S.aureus from human clinical specimens」は、ブドウ球菌の分離と黄色ブドウ球菌の同定のための発色性培地のＣＨＲＯＭａｇａｒ（登録商標）Staph. aureusを記載し、評価しており、それは後者の種に藤色の呈色を与える発色性基質を使用している。そして、同属の他種は、理論的には、青色か無色によって検出される。β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ及びホスファターゼ活性は、インヒビターであるデフェロキサミンと共に本質的に使用され、黄色ブドウ球菌とスタフィロコッカス・エピデルミディスとを区別することができる。しかしながら、黄色ブドウ球菌とスタフィロコッカス・エピデルミディスとを区別することは難しく、２種はＣＨＲＯＭａｇａｒ（登録された商標）培地上に同色のコロニーを産生するためである。これは、黄色ブドウ球菌とスタフィロコッカス・エピデルミディスについて陽性であるホスファターゼ基質の特異性の欠如のためであり、デフェロキサミンによる後者の阻害が部分的であるという事実のためでる。
更に、さまざまなブドウ球菌種を同定するためのα-グルコシド基質の使用を記載する出願ＷＯ０２０７９４８６を挙げることができ、別の酵素活性のための基質と組合わせてもよい。しかしながら、特定の条件下で、例えば、弱いα-グルコシダーゼ活性を有しており、少量（２〜５０コロニー形成単位）に存在する菌株については、活性の検出は遅い可能性があり、２４時間以上のインキュベーションを必要とする。
本発明は、黄色ぶどう球菌を分離して同定するために、感受性が高く、特異的であり、迅速な新規の検出培地を提供することによって、従来技術の隙間を埋めることを目的とする。
【０００９】
更に続ける前に、以下に示す定義は、より明確に本発明を理解することを可能にするものであり、限定するものではない。
本発明のために、反応培地なる用語は、微生物（例えば黄色ブドウ球菌）の生存及び／又は増殖のために必要な成分の全てを含む培地を意味することを目的とする。この反応培地は、検出（revealing)培地のみとしても、あるいは培養且つ検出培地としても用いられる。前者の場合は、微生物は接種前に培養され、後者の場合は反応培地は更に培養培地を構成する。反応培地は、固体、半固体または液体であってもよい。
「固形培地」なる用語は、例えばゲル化培地を意味することを目的とする。本発明に係る培地はゲル化培地であることが望ましい。寒天は微生物を培養するための微生物学の従来のゲル化剤であるが、ゼラチンまたはアガロースを使用することも可能である。いくつかの数の製品が市販されており、コロンビア寒天、トリプチカーゼ大豆寒天、マッコンキー寒天、サブロー寒天またはさらに一般的にはthe Handbook of Microbiological Media (CRC Press)に記載されているものである。
本発明による反応培地は、その他の可能な添加物、例えばペプトン、一つ以上の増殖因子、糖質、一つ以上の選択剤、緩衝液、一つ以上のゲル化剤等を含んでもよい。この反応培地は、すぐに使用できる、すなわちチューブ中またはフラスコ中にまたはシャーレ上において、接種する準備ができている液体またはゲルの形態であってもよい。この培地はフラスコ中でゲルの形態で提供され、培地はシャーレに注入される前に（１００℃に供して）再生させることが好ましい。好ましくは、本発明の培地は、選択培地、すなわち黄色ブドウ球菌バクテリアの成長を助けるインヒビターを含んでなる培地である。特に塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、アンフォテリシン、アズトレオナム、コリマイシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、デフェロキサミン及びビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９を挙げることができる。
【００１０】
さらに、この培地はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の検出に適していてもよく、１又は複数の抗生物質を含んでもよく、前記抗生物質はＭＲＳＡが耐性化しているものであり、例えばセファロスポリンまたはカルバペネム、好ましくは以下から選択されるものである：
＊第一世代のセファロスポリン、例えばセファレキシン、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セファドロキシル、セファゼドン、セファトリジン、セファピリン、セフラジン、セファセトリル、セフロダキシネ（Cefrodaxine）、セフテゾール；
＊第二世代のセファロスポリン、例えばセフォキシチン、セフロキシム、セファマンドール、セファクロル、セフォテタン、セフォニシド（Cefonicide）、セフォチアム、ロラカルベフ（Loracarbef）、セフメタゾール、セフプロジル、セホラニド；
＊第三世代のセファロスポリン、例えばセフォタキシム、セフタジジム、セフスロジン（Cefsulodine）、セフトリアキソン、セフメノキシム、ラタモキセフ、セフチゾキシム、セフィキシム、セフォジジム、セフェタメト（Cefetamet）、セフピラミド、セフォペラゾン、セフポドキシム、セフチブテン、セフジニル、セフジトレン、セフトリアキソン、セフォペラゾン；
＊第四世代のセファロスポリン、例えばセフェピム、セフピロム；
＊メロペネム、エルタペネム、イミペネム
【００１１】
本発明では、酵素活性用の基質（または酵素基質）は、α−グルコシダーゼ酵素活性の直接的または間接的な検出を可能にする生成物を与えるために加水分解されることができる任意の基質から選択される。
天然基質でも合成基質であってもよい。基質の代謝によって、反応培地の又は生物の細胞の生理化学的性質に変化が生じる。この変化は、物理化学的方法、特に光学的方法、オペーレーターの視覚により、または分光計、電気、磁気等の計測器を使用して検出することができる。それは、吸収、蛍光または発光の変化のような光学的性質の変異であることが望ましい。
発色性基質として、インドキシル、フラボン、アリザリン、ナフトールベンゼイン、ニトロフェノール、ナフトール、カテコール、ヒドロキシキノリンまたはクマリン系の基質を挙げることができる。本発明で使用する基質は、インドキシル系であることが好ましい。
蛍光性の基質として、ウンベリフェロン系またはクマリン系基質、レゾルフィン系、フェノキサジン系、ナフトール系、ナフチルアミン系、2'-ヒドロキシフェニル-ヘテロ環系基質、あるいは他にフルオレセイン系を挙げることができる。
α-グルコシダーゼ酵素活性のための基質として、特に基質5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド；ジヒドロキシフラボン-α-グルコシド; 3,4-シクロヘキセノエスクレチン-α-グルコシド; 8-ヒドロキシキノリン-α-グルコシド; 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド; 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド; 6-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド; 5-ブロモ-3-インドキシル-α-グルコシド; 5-ヨード-3-インドキシル-α-グルコシド; 6-フルオロ-3-インドキシル-α-グルコシド;アリザリン-α-グルコシド;ニトロフェニル-α-グルコシド; 4-メチルウンベリフェリル-α-グルコシド;ナフトールベンゼイン-α-グルコシド;インドキシル-Ｎメチル-α-グルコシド;ナフチル-α-グルコシド;アミノフェニル-α-グルコシド;ジクロロ・アミノフェニル-α-グルコシド；レゾルフィン-α-グルコシドを挙げることができる。
本発明において使用する基質は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドと組合わせた5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドが好ましい。
【００１２】
本発明の基質は、広いｐＨ範囲において、特にｐＨ５．５〜１０、好ましくは特に６．５〜１０で使用することができる。基質の濃度は、好ましくは０．０１〜２ｇ／ｌであり、より好ましくは０．０２〜０．２ｇ／ｌであり、有利には０．１ｇ／ｌである。この基質濃度では、より良好な呈色反応コントラストが得られるためである。
【００１３】
生物学的試料なる用語は、気管支、気管又は肺吸引試料または胸膜液試料からの、気管支肺胞洗浄からの、喀痰からの、血液からのまたは肺生検からの、関節滑液または囲心腔液からの臨床試料；体液又は任意の種類の食物に由来する食物試料を意味することを目的とする。従って、この試料は液体であっても固体であってもよく、非限定的に、血液、血漿、尿または糞便由来の臨床試料、または鼻から、会陰部から、のどから、皮膚から、損傷からまたは脳脊髄液から得られた試料、または食物試料を挙げることができる。この点で、本発明は、黄色ぶどう球菌バクテリアを検出および／または同定するための反応培地に関する。
【００１４】
これに関して、本発明は、α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の組合せを含む黄色ブドウ球菌バクテリアの検出および／または同定をするための反応培地に関する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの基質のうちの１つは、インドキシル-α-グルコシド基質、好ましくは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド（X-N-メチル-α-グルコシド）または5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド（X-α-グルコシド）である。
前記インドキシル-α-グルコシド基質は０．０１〜２ｇ／ｌ、好ましくは０．０５〜０．３ｇ／ｌの濃度で培地に存在することが好ましい。
α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の前記組合せは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドを含むことが好ましい。
【００１５】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記培地は、黄色ブドウ球菌バクテリアの増殖を助けるインヒビターの混合物を更に含み、好ましくは塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナム、アンフォテリシン、コリマイシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びデフェロキサミンである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、培地は、ブドウ球菌属のバクテリアの増殖を助ける４つのインヒビターのインヒビター混合物を更に含んでおり、前記インヒビターはＬｉＣｌ、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナム及びアンフォテリシンである。
【００１６】
更に、本発明は、黄色ぶどう球菌バクテリアを分離して同定するための、上記の反応培地のインビトロ使用にも関する。
最後に、本発明は、生物学的試料において、黄色ぶどう球菌バクテリアを検出および／または同定する方法であって、
ａ）上記の反応培地に、黄色ブドウ球菌バクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること；
ｂ）インキュベートすること；
ｃ）黄色ブドウ球菌コロニーを同定すること；
ｄ）ＭＲＳＡコロニーを同定することを含む方法に関する。
【００１７】
インキュベーションは、３０℃から４２℃で実施されることが好ましい。黄色ブドウ球菌は、有色の又は蛍光のコロニーを得ることを可能にする特異的なグルコシダーゼ活性によって検出されることが好ましい。他の黄色ブドウ球菌の種は、無色に見えるかまたは黄色ブドウ球菌コロニーのものとは異なる色または蛍光を有する。
本発明は、ＭＲＳＡバクテリアを検出および／または同定するための反応培地であって、α−グルコシダーゼのための２つの酵素基質の組合せと、ＭＲＳＡが耐性化している抗生物質、好ましくはセファロスポリン、例えばセホキシチンを含む反応培地にも関する。この抗生物質が、他の抗生物質と組合わせてもよい。上記の組合せは、好ましくは、セホキシチン/セフォタキシムまたはセホキシチン/エルタペネムから選択される。上記の培地は、特にＭＲＳＡの検出に適している。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの基質のうちの１つは、インドキシル-α-グルコシド基質、好ましくは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド（X-N-メチル-α-グルコシド）または5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシド（X-α-グルコシド）である。
前記インドキシル−α−グルコシド基質は０．０１〜２ｇ／ｌ、好ましくは０．０５〜０．３ｇ／ｌの濃度で培地に存在することが好ましい。
α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の前記組合せは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドを含むことが好ましい。
【００１８】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記培地は、黄色ブドウ球菌バクテリアの増殖を助けるインヒビターの混合物を更に含み、好ましくは塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナム、アンフォテリシン、コリマイシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びデフェロキサミンである。
更に、本発明は、黄色ぶどう球菌バクテリアを分離して同定するための、上記の通り反応培地のインビトロ使用にも関する。
最後に、本発明は、生物学的試料中のＭＲＳＡバクテリアを検出および／または同定する方法であって、
ａ） 上記の反応培地に、ＭＲＳＡバクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること；
ｂ） インキュベートすること；
ｃ） ＭＲＳＡコロニーを同定することを含む方法に関する。
【００１９】
インキュベーションは、３０℃から４２℃で実施されることが好ましい。
ＭＲＳＡは、有色の又は蛍光のコロニーを得ることを可能にする特異的なグルコシダーゼ活性によって検出されることが好ましい。他の種は、無色に見えるかまたはＭＲＳＡコロニーのものとは異なる色または蛍光を有する。
【００２０】
以下の実施例は、説明のために示すものであり、事実上限定するものでない。それらは、本発明をより明らかに理解することを可能にする。
【実施例】
【００２１】
１．本発明の培地の調製
以下に実験において試験される培地は、基本培地としてchromID MRSA培地（ビオメリューref. 43 451）を含み、以下の成分を含んでなる培地である：
培地Ｔ：chromID MRSAコントロール培地（ref. 43 451)に、特にＸ−Ｎ−メチル−α−グルコシド基質を濃度０．１ｇ／ｌで、セフォキシチンを４ｍｇ／ｌで含む。
培地Ｓ：培地Ｔに、２５、３７、４５又は５０ｍｇ／ｌの濃度の、Ｘ−α−グルコシド基質を更に含む。
培地Ｆ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン／セフォタキシムの組合せと置換されている：
培地Ｇ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン／セフトリアキソンの組合せと置換されている：
培地Ｈ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン／エルタペネムの組合せと置換されている：
培地Ｉ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン／セフポドキシムの組合せと置換されている：
培地Ｊ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン／セフォペラゾンの組合せと置換されている：
培地Ｋ：培地Ｓ（Ｘ−α−グルコシド濃度：４５ｍｇ／ｌ）で、セフォキシチンが、下記の濃度のセフォキシチン／セフォタキシムの組合せと置換され、更にブドウ球菌属に属さない微生物のインヒビターの混合物であって、黄色ブドウ球菌の成長を助けるものを含む。
【００２２】
２． 培地の接種と読取り
菌株（全て出願人のコレクションに由来するもの）のさまざまなセットは、生理食塩液に懸濁されて、分離したコロニーを得るために、培地上に接種された。皿は、４８時間、３７℃でインキュベートされた。形成されたコロニーは、インキュベーションの１８時間または２４時間後に、視覚的に調べられた。更に、呈色強度は、０〜４のスケールに従って観察された（０：呈色反応なし、４：非常に強度の呈色）。
検出された菌株は、培地の上に有色のコロニーを形成している菌株に対応する。
【００２３】
３． 結果：
３．１ − ２つのα−グルコシダーゼ基質を含むＭＲＳＡを検出するための培地
１又は２つのα−グルコシダーゼ基質の使用で得られた結果を表１に示す。
表１ − ２つのα−グルコシダーゼ基質の使用によるコロニーの呈色反応の強度
第２のα-グルコシダーゼ基質の添加は、コロニーの呈色反応を強力に増大することを可能にし、従ってMRSAコロニーをよりよく正確に指摘することを可能にする。
【００２４】
３．２ − ２つのα−グルコシダーゼ基質と、セホキシチン／セフトリアキソン、セホキシチン／セフォタキシム、セホキシチン／エルタペネム、セホキシチン／セホペラゾンまたはセホキシチン／セフポドキシムの対から選択される抗生物質の組合せを含む、ＭＲＳＡを検出するための培地
抗生物質の組合せが使われた場合に得られた結果を表２に示す。
表２−抗生物質の組合せを使用した場合のＭＲＳＡコロニーの検出（全菌種の数につき検出された菌種数として表示された検出）
上記の抗生物質の組合せは、４ｍｇ／ｌのセホキシチンを単独で有する培地よりも、良いパフォーマンス・レベルを得ることができた。
【００２５】
３．３ − 黄色ブドウ球菌の増殖を助けるインヒビターの混合物と、セホキシチン／セフォタキシムの抗生物質の組合せを含む、ＭＲＳＡを検出するための培地
抗生物質の組合せが使われた場合に得られた結果を表３に示す。
表３ − インヒビター混合物と、セホキシチン／セフォタキシム抗生物質の組合せが使われた場合のＭＲＳＡコロニーの検出（全菌種の数につき検出された菌種の数として表示された検出）
黄色ブドウ球菌の増殖を促進するインヒビター混合物と組合わせた、セホキシチン／セフォタキシム抗生物質の組合せは、特に濃度０．７５ｍｇ／ｌのセホキシチンとセフォタキシムを使用した場合に、優れた特異性と感受性を得ることができた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の組合せを含む、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）バクテリアを検出および／または同定するための反応培地。
【請求項２】
２つの基質のうちの１つがインドキシル-α-グルコシド基質、好ましくは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドまたは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドであることを特徴とする、請求項１に記載の反応培地。
【請求項３】
前記インドキシル-α-グルコシド基質が０．０１〜２ｇ／ｌ、好ましくは０．０５〜０．３ｇ／ｌの濃度で培地に存在するということを特徴とする、請求項２に記載の反応培地。
【請求項４】
α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の前記組合せが5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドを含むことを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の反応培地。
【請求項５】
黄色ブドウ球菌バクテリアの増殖を促進するインヒビターの混合物を更に含む、請求項１から４の何れか一項に記載の反応培地。
【請求項６】
黄色ブドウ球菌バクテリアを分離して同定するための請求項１から５の何れか一項に記載の反応培地のインビトロ使用。
【請求項７】
生物学的試料において、黄色ぶどう球菌バクテリアを検出および／または同定する方法であって、
ａ）請求項１から６の何れか一項に記載の反応培地に、黄色ぶどう球菌バクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること；
ｂ）インキュベートすること；
ｃ）黄色ブドウ球菌コロニーを同定することを含む方法。
【請求項８】
α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の組合せ及びＭＲＳＡが耐性化している抗生物質を含む、ＭＲＳＡバクテリアを検出および／または同定するための反応培地であって、前記抗生物質が好ましくはセファロスポリン、例えばセホキシチンである、反応培地。
【請求項９】
ＭＲＳＡが耐性化している第２の抗生物質を含むことを特徴とする、請求項８に記載の反応培地。
【請求項１０】
２つの基質のうち１つがインドキシル-α-グルコシド基質、好ましくは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドまたは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドであることを特徴とする、請求項８または９に記載の反応培地。
【請求項１１】
前記インドキシル-α-グルコシド基質が０．０１〜２ｇ／ｌ、好ましくは０．０２から０．３g／lの濃度で培地に存在することを特徴とする、請求項１０に記載の反応培地。
【請求項１２】
α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の前記組合せが5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドと5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドを含むことを特徴とする、請求項８から１１の何れか一項に記載の反応培地。
【請求項１３】
黄色ブドウ球菌バクテリアの増殖を促進するインヒビターの混合物、好ましくはＬｉＣｌ、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナム及びアンフォテリシンを更に含む、請求項８から１２の何れか一項に記載の反応培地。
【請求項１４】
ＭＲＳＡバクテリアを分離して同定するための請求項８から１３の何れか一項に記載の反応培地のインビトロ使用。
【請求項１５】
生物学的試料中のＭＲＳＡバクテリアを検出および／または同定する方法であって、
ａ）請求項８から１３の何れか一項に記載の反応培地に、ＭＲＳＡバクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること；
ｂ）インキュベートすること；
ｃ）ＭＲＳＡコロニーを同定することを含む方法。
【請求項１】
α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の組合せを含む、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）バクテリアを検出および／または同定するための反応培地。
【請求項２】
２つの基質のうちの１つがインドキシル-α-グルコシド基質、好ましくは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドまたは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドであることを特徴とする、請求項１に記載の反応培地。
【請求項３】
前記インドキシル-α-グルコシド基質が０．０１〜２ｇ／ｌ、好ましくは０．０５〜０．３ｇ／ｌの濃度で培地に存在するということを特徴とする、請求項２に記載の反応培地。
【請求項４】
α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の前記組合せが5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドを含むことを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の反応培地。
【請求項５】
黄色ブドウ球菌バクテリアの増殖を促進するインヒビターの混合物を更に含む、請求項１から４の何れか一項に記載の反応培地。
【請求項６】
黄色ブドウ球菌バクテリアを分離して同定するための請求項１から５の何れか一項に記載の反応培地のインビトロ使用。
【請求項７】
生物学的試料において、黄色ぶどう球菌バクテリアを検出および／または同定する方法であって、
ａ）請求項１から６の何れか一項に記載の反応培地に、黄色ぶどう球菌バクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること；
ｂ）インキュベートすること；
ｃ）黄色ブドウ球菌コロニーを同定することを含む方法。
【請求項８】
α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の組合せ及びＭＲＳＡが耐性化している抗生物質を含む、ＭＲＳＡバクテリアを検出および／または同定するための反応培地であって、前記抗生物質が好ましくはセファロスポリン、例えばセホキシチンである、反応培地。
【請求項９】
ＭＲＳＡが耐性化している第２の抗生物質を含むことを特徴とする、請求項８に記載の反応培地。
【請求項１０】
２つの基質のうち１つがインドキシル-α-グルコシド基質、好ましくは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドまたは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドであることを特徴とする、請求項８または９に記載の反応培地。
【請求項１１】
前記インドキシル-α-グルコシド基質が０．０１〜２ｇ／ｌ、好ましくは０．０２から０．３g／lの濃度で培地に存在することを特徴とする、請求項１０に記載の反応培地。
【請求項１２】
α-グルコシダーゼのための２つの酵素基質の前記組合せが5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-N-メチル-α-グルコシドと5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-グルコシドを含むことを特徴とする、請求項８から１１の何れか一項に記載の反応培地。
【請求項１３】
黄色ブドウ球菌バクテリアの増殖を促進するインヒビターの混合物、好ましくはＬｉＣｌ、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナム及びアンフォテリシンを更に含む、請求項８から１２の何れか一項に記載の反応培地。
【請求項１４】
ＭＲＳＡバクテリアを分離して同定するための請求項８から１３の何れか一項に記載の反応培地のインビトロ使用。
【請求項１５】
生物学的試料中のＭＲＳＡバクテリアを検出および／または同定する方法であって、
ａ）請求項８から１３の何れか一項に記載の反応培地に、ＭＲＳＡバクテリアを含む可能性がある生物学的試料を接種すること；
ｂ）インキュベートすること；
ｃ）ＭＲＳＡコロニーを同定することを含む方法。
【公表番号】特表２０１２−５０４９５１（Ｐ２０１２−５０４９５１Ａ）
【公表日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３０５２９（Ｐ２０１１−５３０５２９）
【出願日】平成２１年１０月７日（２００９．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５１９０９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４０９５２
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月７日（２００９．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５１９０９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４０９５２
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
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