【課題】Ａｐｏ-２リガンドに結合可能なＡｐｏ-２ＤｃＲと命名された新規なポリペプチドの提供。
【解決手段】ＴＮＦＲファミリーとの類似性を示す、新規ポリペプチド、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコード化したｃＤＮＡクローンを同定し、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ-２Ｌ)に結合することを見出した。異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドを含んでなるキメラ分子、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードしている核酸、及びＡｐｏ-２ＤｃＲに対する抗体を含む組成物。

【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、ここに「Ａｐｏ-２ＤｃＲ」と命名する新規ポリペプチドの同定、単離、及び組換え生産、及び抗Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体に関する。
【０００２】
発明の背景
アポトーシス又は「プログラムされた細胞死」
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死のバランスにより部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特性付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば、Barrら, Bio/Technology, 12：487-493(1994)；Stellerら, Science, 267：1445-1449(1995)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itohら, Cell, 66：233-243(1991)］。アポトーシス性細胞死のレベルの減少は、癌、狼瘡、ヘルペスウイスル感染を含む種々の病理的条件に関連している［Thompson, Science, 267：1456-1462(1995)］。アポトーシス性細胞死のレベルの増加は、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、無形成性貧血、心筋梗塞、脳卒中、再灌流傷害、及び毒素誘発性肝疾患を含む様々な他の病理状態に関連している［上掲のThompsonを参照］。
【０００３】
典型的には、アポトーシス性細胞死には、細胞内における一又は複数の特徴的な形態学的及び生化学的変化、例えば細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失が伴う。様々な外因的及び内因的シグナルが、このような形態学的及び生化学的な細胞変化を惹起又は誘発すると考えられている［Raff, Nature, 356：397-400(1992)；Steller, 上掲；Sachsら, Blood, 82：15(1993)］。例えば、ホルモンの刺激、例えば未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン、並びにある種の成長因子の退薬により惹起され得る［Watanabe-Fukunagaら, Nature, 356：314-317(1992)］。また、幾つかの同定された発癌遺伝子、例えばｍｙｃ、ｒｅｌ、及びＥ１Ａ、及び腫瘍サプレッサー、例えばｐ５３が、アポトーシスの誘発においてある役割を有していることも報告されている。ある種の化学療法薬及びある種の放射線も同様にアポトーシス誘発活性を有していることも見出されている［Thompson, 上掲］。
サイトカインのＴＮＦファミリー
【０００４】
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」すなわち「リンホトキシン」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、及びＡｐｏ-２リガンド［トレイル(TRAIL)とも称される］が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定された［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Wileyら, Immunity, 3：673-682(1995)；Pittiら, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、及びＡｐｏ-２リガンド(TRAIL)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。ＴＮＦ-αとＴＮＦ-βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性死を誘発することが報告されている［Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83：1881(1986)；Dealtryら, Eur. J. Immunol., 17：689(1987)］。ゼングらは、ＴＮＦ-αがＣＤ８ポジティブＴ細胞のポスト刺激性アポトーシスに関与していることを報告している［Zhengら, Nature, 377：348-351(1995)］。他の研究者は、ＣＤ３０リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に関与していることを報告している［Amakawaら, プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)］。
【０００５】
マウスのＦａｓ／Ａｐｏ-１レセプター又はリガンド遺伝子(それぞれ１ｐｒ及びｇｌｄと呼称される)における変異が幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Ａｐｏ-１リガンドが末梢の自己反応性リンパ球のクローン除去の調節においてある役割を担っていることを示している［Krammerら, Curr. Op. Immunol., 6：279-289(1994)；Nagataら, Science, 267：1449-1456(1995)］。また、Ａｐｏ-１リガンドは、ＣＤ４ポジティブＴリンパ球及びＢリンパ球においてポスト刺激性アポトーシスを誘発することが報告されており、それらの機能がもはや必要でなくなった際の活性化リンパ球の除去に関与している［Krammerら, 上掲；Nagataら, 上掲］。Ａｐｏ-１レセプターと特異的に結合するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、ＴＮＦ-αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている［Yoneharaら, J. Exp. Med., 169：1747-1756(1989)］。
レセプターのＴＮＦファミリー
【０００６】
このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。約５５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されており［Hohmanら, J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhausら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；1991年3月20日に公開されたＥＰ４１７５６３］、双方のレセプター型に対応するヒト及びマウスｃＤＮＡが単離され、特徴付けされている［Loetscherら, Cell, 61：351(1990)；Schallら, Cell, 61：361(1990)；Smithら, Science, 248：1019-1023(1990)；Lewisら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwinら, Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。広範な多型性が、双方のＴＮＦレセプター遺伝子に関連している［例えば、Takaoら, Immunogenetics, 37：199-203(1993)を参照］。双方のＴＮＦＲは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Nophar, Yら, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, Tら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)］。更に最近になって、組換え体可溶性ＴＮＦレセプターのクローニングがヘイル(Hale)らにより報告されている［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］。
【０００７】
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２末端から出発して、１〜４とされる４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各ＣＲＤは約４０のアミノ酸長のものであり、良好に保存された位置に４〜６のシステイン残基を含んでいる［Schallら, 上掲；Loetscherら, 上掲；Smithら, 上掲；Nopharら, 上掲；Kohnoら, 上掲］。ＴＮＦＲ１において、４つのＣＲＤのおおよその境界は次の通りである：ＣＲＤ１−１４から約５３までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５４から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１３８までのアミノ酸；ＣＲＤ４−約１３９から約１６７までのアミノ酸。ＴＮＦＲ２において、ＣＲＤ１は、１７〜約５４までのアミノ酸を、ＣＲＤ２は約５５から約９７までのアミノ酸を；ＣＲＤ３は約９８から約１４０までのアミノ酸を；ＣＲＤ４は約１４１から約１７９までのアミノ酸を含む［Bannerら, Cell, 73：431-435(1993)］。また、リガンド結合におけるＣＲＤの潜在的な役割は前掲のバナー(Banner)らにより記載されている。
【０００８】
ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnsonら, Cell, 47：545(1986)；Radekeら, Nature, 325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovicら, EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Malletら, EMBO J., 9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yoneharaら, 上掲、及びItohら, 上掲］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Uptonら, Virology, 160：20-29(1987)；Smithら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Uptonら, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。ｐ７５ＮＧＦＲに関する最近の研究では、ＣＲＤ１の欠失［Welcher, A.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88：159-163(1991)］又はこのドメインにおける５-アミノ酸の挿入［Yan. H及びChao, M.V., J. Biol. Chem., 266：12099-12104(1991)］は、ＮＧＦ結合にはほとんど又は全く影響を持たないことが示されている［Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。ｐ７５ＮＧＦＲはＮＧＦ結合に関与せず、そのＣＲＤ４と膜貫通領域の間に約６０のアミノ酸のプロリンに富んだ伸展を含む［Peetre, Cら, Eur. J. Hematol.,41：414-419(1988)；Seckinger, Pら, J. Biol. Chem., 264：11966-11973(1989)；Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。同様のプロリンに富んだ領域はＴＮＦＲ２に見出されているが、ＴＮＦＲ１にはない。
【０００９】
イトーらは、Ａｐｏ-１レセプターが５５-ｋＤａのＴＮＦＲ１によりシグナル化されるものと同様のアポトーシス性細胞死をシグナル化し得ることを開示している［Itohら, 上掲］。また、Ａｐｏ-１抗原の発現は、細胞をＴＮＦ-α又は抗Ａｐｏ-１のマウスモノクローナル抗体で処理した場合に、ＴＮＦＲ１のものと共にダウンレギュレーションされることが報告されている［Krammerら, 上掲；Nagataら, 上掲］。従って、Ａｐｏ-１及びＴＮＦＲ１レセプターの双方を同時発現する株化細胞が、共通のシグナル伝達経路を通して細胞死滅を媒介しているとの仮説を唱える研究者もいた［同］。
【００１０】
リンホトキシン-αを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのレセプター類はＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；各場合に得られたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
【００１１】
最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定されている。マースターズ(Marsters)ら、Curr. Biol., 6：750(1996)において、研究者は、細胞外のシステインに富んだ反復についてＴＮＦＲファミリーに対して類似性を示し、細胞質死亡ドメイン配列を含む点でＴＮＦＲ１及びＣＤ９５に似ており、Ａｐｏ-３と称される、ヒトのポリペプチド天然配列の全長を開示している［Marstersら,Curr. Biol., 6：1669(1996)もまた参照されたい］。他の研究者に依れば、Ａｐｏ-３はＤＲ３、ｗｓｌ-１及びＴＲＡＭＰとも称されている［Chinnaiyanら, Science, 274：990(1996)；Kitsonら, Nature, 384：372(1996)；Bodmerら, Immunity, 6：79(1997)］。
【００１２】
パンらは、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Panら, Science, 276：111-113(1997)］。ＤＲ４は細胞自殺器を活動させる細胞質死亡ドメインを含むと報告されている。パンらは、ＤＲ４がＡｐｏ-２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
【００１３】
アポトーシス誘発性シグナル伝達複合体
現在理解されているように、細胞死プログラムは、少なくとも３つの重要な成分−活性化因子、阻害剤及びエフェクターを含む；線虫(C. elegans)において、これらの成分はそれぞれ３つの遺伝子、Ｃｅｄ-４、Ｃｅｄ-９及びＣｅｄ-３によりコード化されている［Steller, Science, 267：1445(1995)；Chinnaiyanら, Science, 275：1122-1126(1997)］。ＴＮＦＲファミリーのメンバーの２つ、ＴＮＦＲ１及びＦａｓ／Ａｐｏｌ(ＣＤ９５)は、アポトーシス性細胞死を活性化し得る［Chinnaiyan及びDixit, Current Biology, 6：555-562(1996)；Fraser及びEvan, Cell, 85：781-784(1996)］。また、ＴＮＦＲ１は転写因子、ＮＦ-κＢの活性化を媒介することも知られている［Tartagliaら, Cell, 74：845-853(1993)；Hsuら, Cell, 84：299-308(1996)］。ある程度のＥＣＤ相同性に加えて、これら２つのレセプターは、死亡ドメインとして知られているオリゴマー形成界面の細胞内ドメイン(ＩＣＤ)での相同性を共有する［Tartagliaら, 上掲；Nagata, Cell, 88：355(1997)］。また、死亡ドメインはアポトーシスを調節する幾つかの後生動物タンパク質、すなわちＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１、ＴＲＡＤＤ及びＲＩＰと称されるショウジョウバエタンパク質、リーパー(Reaper)及び哺乳動物タンパク質中においても見出されている［Cleaveland及びIhle, Cell, 81：479-482(1995)］。ラベンらは、酵母-二重ハイブリッド系を使用して、ＴＮＦＲ１死亡ドメインに結合するタンパク質ｗｓｌ-１の同定を報告している［Ravenら, Programmed Cell Death Meeting, 9月20-24日,1995年,127頁の要約；Ravenら, European Cytokine Network, 7：210頁の要約82(1996年4-6月)］。ｗｓｌ-１タンパク質はＴＮＦＲ１に相同で(４８％の同一性)、制限された組織分布を有すると記載されている。ラベン(Raven)らに依れば、ｗｓｌ-１の組織分布は、ＴＮＦＲ１結合タンパク質、ＴＲＡＤＤとは顕著に異なる。
【００１４】
リガンド結合及びレセプターのクラスター形成の際に、ＴＮＦＲ１とＣＤ９５は死亡誘発性シグナル伝達複合体にＦＡＤＤを補充するものと考えられている。言われるところによれば、ＣＤ９５はＦＡＤＤに直接結合する一方、ＴＮＦＲ１はＴＲＡＤＤを介して間接的にＦＡＤＤに結合する［Chinnaiyanら, Cell, 81：505-512(1995)；Boldinら, J. Biol. Chem., 270：387-391(1995)；Hsuら, 上掲；Chinnaiyanら, J. Biol. Chem., 271：4961-4965(1996)］。ＦＡＤＤは、Ｃｅｄ-３-関連プロテアーゼ、ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥ(カスパーゼ８)を、死亡シグナル伝達複合体に補充するアダプタータンパク質となることが報告されている［Boldinら, Cell, 85：803-815(1996)；Muzioら, Cell, 85：817-827(1996)］。ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥは、細胞死プログラムの幾つかの重要な側面を実施し得る、インターロイキン-１β変換酵素(ＩＣＥ)及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａを含むアポトーシス性プロテアーゼのカスケードを引き起こすトリガーであると思われる［Fraser及びEvan, 上掲］。
【００１５】
プログラム細胞死が、線虫の細胞死遺伝子、ｃｅｄ-３、及び哺乳動物のＩＬ-１-変換酵素、ＩＣＥに関連したシステインプロテアーゼファミリーのメンバーの活性に関与していることが最近開示された。ＩＣＥ及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａプロテアーゼの活性は、牛痘ウイルス遺伝子、ｃｒｍＡの産物により阻害され得る［Rayら, Cell, 69：597-604(1992)；Tewariら, Cell, 81：801-809(1995)］。最近の研究では、ＣｒｍＡがＴＮＦＲ１-及びＣＤ９５-誘発細胞死を阻害し得ることが示されている［Enariら, Nature, 375：78-81(1995)；Tewariら, J. Biol. Chem., 270：3255-3260(1995)］。
【００１６】
テワリ(Tewari)らにより最近レビューされているように、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２及びＣＤ４０は、転写因子、ＮＦ-κＢの活性化により、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する［Tewariら, Curr. Op. Genet. Develop., 6：39-44(1996)］。ＮＦ-κＢは、そのサブユニットが保存Ｒｅｌ領域を含む二量体転写因子のファミリーの原型である［Vermaら, Genes Develop., 9：2723-2735(1996)；Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14：649-681(1996)］。その潜伏形態において、ＮＦ-κＢはＩκＢ阻害剤ファミリーのメンバーと複合化しており；ある刺激に反応してのＩκＢの不活性化の際に、放出されたＮＦ-κＢが、特異的ＤＮＡ配列と結合する核に転座して遺伝子転写を活性化する。
【００１７】
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプターのレビューについては、上掲のグラス(Gruss)及びダゥアー(Dower)を参照されたい。
【００１８】
発明の概要
本出願人は、本出願において「Ａｐｏ-２ＤｃＲ」と命名される新規ポリペプチドをコード化したｃＤＮＡクローンを同定した。Ａｐｏ-２ＤｃＲはＴＮＦＲファミリーのメンバーであると信じられる；全長の天然配列ヒトＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドは、細胞外のシステインに富んだ反復部についてＴＮＦＲファミリーとの類似性を示す。本出願人は、Ａｐｏ-２ＤｃＲがＡｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ-２Ｌ)に結合することを見出した。
一実施態様において、本発明は、単離されたＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドを提供する。特に、本発明は、一実施態様においては図１Ａの残基１〜２５９を含んでなるアミノ酸配列(配列番号：１)を含む、単離された天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドを提供する。他の実施態様においては、単離されたＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドは、図１Ａの残基１〜２５９(配列番号：１)を含んでなる天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。場合によっては、単離されたＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドは、−４０〜２５９として図１Ｂにおいて同定された残基を含んでなるアミノ酸配列(配列番号：３)を含む。場合によっては、Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドは、ＡＴＣＣ ２０９０８７として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコード化されたポリペプチドを発現することにより得られた又は得られうるものである。
【００１９】
他の実施態様において、本発明はＡｐｏ-２ＤｃＲの単離された細胞外ドメイン(ＥＣＤ)配列を提供する。場合によっては、単離された細胞外ドメイン配列は図１Ａのアミノ酸残基１〜２３６(配列番号：１)又は図１Ａの残基１〜１６１(配列番号：１)を含んでなる。場合によっては、単離された細胞外ドメイン配列は、ここにおいて同定されたＡｐｏ-２ＤｃＲ擬似反復の任意のものにおいて一又は複数のアミノ酸(図２参照)が欠失させられたアミノ酸配列を含んでなる。このような単離された細胞外ドメイン配列は、アミノ酸残基１〜Ｘ(ここで、Ｘは図１Ａのアミノ酸残基１６１〜２３６(配列番号：１)の任意のものである)の配列を含んでなるポリペプチドを含んでもよい。
【００２０】
他の実施態様において、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。このようなキメラ分子の例には、免疫グロブリン配列と融合したＡｐｏ-２ＤｃＲが含まれる。他の例には、例えば免疫グロブリン配列のような、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したＡｐｏ-２ＤｃＲの細胞外ドメインが含まれる。
【００２１】
他の実施態様において、本発明はＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドをコードしている単離核酸分子を提供する。一面において、該核酸分子は、Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド又はＡｐｏ-２ＤｃＲの特定のドメインをコード化するＲＮＡ又はＤＮＡであるか、又はこのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度、場合によっては高いストリンジェント条件下でそれに安定して結合したままである。一実施態様において、核酸配列は：
(ａ)残基１〜残基２５９をコードする図１Ａの核酸配列(配列番号：２)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド１９３−１９５〜９６７−９６９)；
(ｂ)残基１〜残基２３６をコードする図１Ａの核酸配列(配列番号：２)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド１９３−１９５〜８９８−９００)；
(ｃ)残基−４０〜残基２５９をコードする図１Ｂの核酸配列(配列番号：４)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド７３−７５〜９６７−９６９)；
(ｄ)遺伝コードの縮退の範囲内において(ａ)、(ｂ)又は(ｃ)配列に相当する配列；
から選択される。
【００２２】
さらなる実施態様において、本発明はＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド又はＡｐｏ-２ＤｃＲの特定のドメインをコード化した核酸分子を含んでなるベクターを提供する。また、ベクター又は核酸分子を含有する宿主細胞も提供する。Ａｐｏ-２ＤｃＲの生産方法もさらに提供する。
【００２３】
他の実施態様において、本発明はＡｐｏ-２ＤｃＲに結合する抗体を提供する。抗体はアゴニスト、阻止又は中和抗体であってよい。
【００２４】
他の実施態様において、本発明は非ヒト、トランスジェニック又はノックアウト動物を提供する。
【００２５】
本発明のさらなる実施態様では、Ａｐｏ-２ＤｃＲ又はＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体を含む製造品及びキットが提供される。
【００２６】
好適な実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
ここで使用される際の「Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド」及び「Ａｐｏ-２ＤｃＲ」という用語には、天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲ及びＡｐｏ-２ＤｃＲ変異体(ここでさらに定義される)が含まれる。これらの用語には、ヒトを含む種々の哺乳動物由来のＡｐｏ-２ＤｃＲが含まれる。Ａｐｏ-２ＤｃＲは種々の供給源、例えばヒト組織型又は他の供給源から単離されたもの、あるいは組換え又は合成法により調製されたものであってよい。
【００２７】
「天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲ」には、天然由来のＡｐｏ-２ＤｃＲと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。しかして、天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲは、任意の哺乳動物から自然に生じるＡｐｏ-２ＤｃＲのアミノ酸配列を有し得る。このような天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲ」という用語には、特に、Ａｐｏ-２ＤｃＲの自然に生じる切断、分泌又は可溶型(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異体型(例えば、選択的にスプライシングされた型)及びＡｐｏ-２ＤｃＲの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲは、図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸１〜２５９又は図１Ｂ(配列番号：３)のアミノ酸−４０〜２５９を含有する成熟又は全長天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲである。場合によっては、Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドは、ＡＴＣＣ ２０９０８７として寄託されているベクターのｃＤＮＡ挿入物によりコードされたポリペプチドを発現させることにより得られた又は得られ得るものである。
【００２８】
「Ａｐｏ-２ＤｃＲ細胞外ドメイン」すなわち「Ａｐｏ-２ＤｃＲＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に有しないＡｐｏ-２ＤｃＲの型を意味する。通常、Ａｐｏ-２ＤｃＲＥＣＤは、膜貫通及び細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満だけ有する。場合によっては、Ａｐｏ-２ＤｃＲＥＣＤは、図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜２３６又は図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１６１を含むであろう。場合によっては、単離された細胞外ドメイン配列は、ここにおいて同定されたＡｐｏ-２ＤｃＲ擬似反復の任意のものにおいて同定される一又は複数のアミノ酸(図２参照)が欠失させられたアミノ酸配列を含んでなる。このような単離された細胞外ドメイン配列は、アミノ酸残基１〜Ｘ(ここで、Ｘは図１Ａのアミノ酸残基１６１〜２３６(配列番号：１)の任意のものである)の配列を含んでなるポリペプチドを含んでもよい。
【００２９】
「Ａｐｏ-２ＤｃＲ変異体」とは、全長天然配列ヒトＡｐｏ-２ＤｃＲに対して図１Ａに示されている推定アミノ酸配列(配列番号：１)又はここでＡｐｏ-２ＤｃＲＥＣＤに対して同定された配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義する生物学的に活性なＡｐｏ-２ＤｃＲを意味する。このようなＡｐｏ-２ＤｃＲ変異体には、例えば、図１Ａの配列(配列番号：１)あるいはＡｐｏ-２ＤｃＲＥＣＤに対してここで同定された配列のＮ又はＣ末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加され、もしくは欠失されたＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドが含まれる。通常、Ａｐｏ-２ＤｃＲ変異体は、図１Ａのアミノ酸配列(配列番号：１)と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有している。
【００３０】
ここで同定されているＡｐｏ-２ＤｃＲ配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、Ａｐｏ-２ＤｃＲ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００３１】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＡｐｏ-２ＤｃＲ、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さはＡｐｏ-２ＤｃＲの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００３２】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、ポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど精製される。Ａｐｏ-２ＤｃＲの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインシトゥーのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３３】
「単離された」Ａｐｏ-２ＤｃＲ核酸分子は、同定され、Ａｐｏ-２ＤｃＲ核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＡｐｏ-２ＤｃＲ核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＡｐｏ-２ＤｃＲ核酸分子は、天然の細胞中に存在するＡｐｏ-２ＤｃＲ核酸細胞とは区別される。しかし、単離されたＡｐｏ-２ＤｃＲ核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるＡｐｏ-２ＤｃＲを通常発現する細胞に含まれるＡｐｏ-２ＤｃＲ核酸分子を含む。
【００３４】
「対照配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に関連付けられたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適な対照配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３５】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に関連付けられ」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に関連付けられている；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に関連付けられている；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に関連付けられている。一般的に、「作用可能に関連付けられる」とは、関連付けられたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３６】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に抗Ａｐｏ-２ＤｃＲモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、及び多エピトープ特異性抗Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体組成物を包含している。
【００３７】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対応する。更に、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む通常の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対応する。
【００３８】
ここで、モノクローナル抗体は、起源の種又は免疫グロブリンクラス又はサブクラスの命名に拘わらず、定常ドメインを有する抗Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体の可変(高頻度可変を含む)ドメイン、又は重鎖を有する軽鎖、又は他の種由来の鎖を有するある種由来の鎖、あるいは異種タンパク質との融合体をスプライシングすることによって得られるハイブリッド及び組換え抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限り抗体断片(例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ)を特に含む。例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びMageら, Monoclonal Antibody Productuon Techniques and Applications, pp.79-97(Marcel Dekker, Inc.:ニューヨーク, 1987)を参照。
【００３９】
従って、「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler及びMilsteinによって、Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは例えば米国特許第４８１６５６７号に記載された組換えＤＮＡ法によって作ることができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、McCaffertyら, Nature, 348：552-554(1990)に記載された技術を用いてファージライブラリから単離することができる。
【００４０】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいはそれらの断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域又はドメインの少なくとも一部を含んでなる。
【００４１】
ここで意図している「生物学的に活性な」及び「所望の生物学的活性」とは、(１)インビボ又はエキソビボで少なくとも一種類の哺乳動物細胞において(作用的又は刺激する形あるいは拮抗的すなわち阻止する形で)アポトーシスを変調する能力を有しているか；(２)Ａｐｏ-２リガンドに結合する能力を有しているか；又は(３)Ａｐｏ-２リガンドのシグナル伝達及びＡｐｏ-２リガンド活性を変調する能力を有していることを意味する。
【００４２】
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この活性は、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動法等、全て従来から知られている方法により決定し測定することができる。
【００４３】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、神経芽腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００４４】
ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」とは、治癒的療法、予防的療法及び防護的療法を称する。
【００４５】
ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。本発明の好ましい実施態様においては、哺乳動物はヒトである。
【００４６】
ＩＩ. 本発明の組成物と方法
本発明は、新規に同定され、単離されたＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドを提供する。特に本出願人は、種々のヒトＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドを同定し、分離した。これらＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドの幾つかのものの性質と特徴は、以下の実施例においてさらに詳細に記載する。ここで開示されるＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドの性質と特徴に基づき、Ａｐｏ-２ＤｃＲはＴＮＦＲファミリーのメンバーであるというのが本出願人の信ずるところである。
【００４７】
Ａｐｏ-２ＤｃＲ、並びにＡｐｏ-２ＤｃＲキメラ分子及び抗Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体を如何に調製するかにつき、以下に説明する。
【００４８】
Ａ． Ａｐｏ-２ＤｃＲの調製
以下の説明は、主として、Ａｐｏ-２ＤｃＲ核酸を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞を培養してＡｐｏ-２ＤｃＲを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＡｐｏ-２ＤｃＲを調製することはできると考えられる。
【００４９】
１． Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡの単離
Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡは、Ａｐｏ-２ＤｃＲｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＡｐｏ-２ＤｃＲＤＮＡは、実施例１に記載されたヒトのｃＤＮＡのライブラリのように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＡｐｏ-２ＤｃＲコード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
【００５０】
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された(Ａｐｏ-２ＤｃＲに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら,PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００５１】
スクリーニングの好ましい方法は、種々のヒト組織からｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために選別したオリゴヌクレオチド配列を用いることである。以下の実施例１には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド化時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は、当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高厳密性を含むハイブリッド化条件は、Sambrookら,上掲に提供されている。
【００５２】
全てのタンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらにより記述されている従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００５３】
Ａｐｏ-２ＤｃＲ変異体はＡｐｏ-２ＤｃＲＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、所望のＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドを合成することにより、調製することができる。アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、膜係留特性の変更のように、Ａｐｏ-２ＤｃＲの翻訳後過程を改変し得ることは当業者であれば理解されることである。
【００５４】
ここで記載されている天然全長配列Ａｐｏ-２ＤｃＲ又はＡｐｏ-２ＤｃＲの種々のドメインにおける変異は、例えば米国特許第５３６４９３４号に記載された保存的あるいは非保存的突然変異に関する技術とガイドラインの任意のものを使用して発生させることができる。変異は、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードしている一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であり、天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲに対してＡｐｏ-２ＤｃＲのアミノ酸配列に変化が生じている。場合によっては、変異は、Ａｐｏ-２ＤｃＲ分子の一又は複数のドメインにおいて、少なくとも１つのアミノ酸を任意の他のアミノ酸に置換することによりなされる。変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発のような、当該分野において既知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids. Res., 13：4331(1986)；Zollerら, Nucl. Acids. Res., 10：6487(1987)］、カセット突然変異［Wellsら, Gene, 34：315(1985)］、制限選択的突然変異誘発［Wellら, Philos. Trans. R. Soc. London. SerA, 317：415(1986)］又は他の既知の技術をクローンＤＮＡに実施してＡｐｏ-２ＤｃＲ変異体のＤＮＡを生産することができる。
【００５５】
また、特定のリガンド又はレセプターとの相互作用に関与する、近接配列に沿った一又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析法を使用することもできる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。変異体の主鎖構造をあまり改変することなく、ベータ炭素を越えた側鎖が除去されるため、アラニンがこの群のなかで好ましいスキャニングアミノ酸である。またアラニンは最も一般的なアミノ酸であることも好ましい。さらに、アラニンは埋設及び露出位置の双方に頻繁に見出される［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.)；Chothia, J. Mol. Biol., 150：１(1976)］。アラニン置換により適切な量の変異体を生じない場合には、アイソテリックアミノ酸を使用することができる。
【００５６】
一度選択されたＡｐｏ-２ＤｃＲ変異体が生産されると、それらを、例えばＡｐｏ-２Ｌと接触させることができ、相互作用があれば測定することができる。Ａｐｏ-２ＤｃＲ変異体とＡｐｏ-２Ｌとの相互作用は、例えば以下の実施例に記載したようなインビトロアッセイにより測定することができる。天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲとＡｐｏ-２ＤｃＲ変異体の活性と性質を比較するため任意の数の分析的測定法を使用することができ、結合性に対して簡便なものは、天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲの解離定数Ｋｄと比較したＡｐｏ-２ＤｃＲ変異体とＡｐｏ-２Ｌとの間に形成された複合体の解離定数Ｋｄである。一般に置換残基当り≧３倍Ｋｄが増加又は減少すると、置換残基がＡｐｏ-２Ｌとの天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲの相互作用において活性であることになる。
【００５７】
場合によっては、突然変異(例えば一又は複数のアミノ酸の欠失)に好適なＡｐｏ-２ＤｃＲ配列中の代表的な部位には、細胞外ドメイン、特に一又は複数のシステインリッチドメイン、又は一又は複数の擬似反復内の部位が含まれる。このような変異は上述の方法を使用することにより達成される。
【００５８】
２． 複製可能なベクターへの核酸の挿入
Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードした核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列であり、それぞれを以下に説明する。
【００５９】
(ｉ) シグナル配列成分
Ａｐｏ-２ＤｃＲは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＡｐｏ-２ＤｃＲＤＮＡの一部である。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５０１０１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２１７９)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際特許出願第ＷＯ９０／１３６４６号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、単純ヘルペスグリコタンパク質Ｄシグナルのようなウイルス分泌リーダーのような他の哺乳動物のシグナル配列をタンパク質の直接分泌に使用してもよいが、インビボにおけるヒト細胞の細胞膜へのＡｐｏ-２ＤｃＲの挿入を通常指示する天然Ａｐｏ-２ＤｃＲプレ配列が十分である。
【００６０】
このような前駆体領域のＤＮＡは、好ましくは、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡにリーディングフレームが結合される。
【００６１】
(ｉｉ)複製開始点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニングベクターにおいて、宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用いられる)。
【００６２】
多くの発現ベクターは「シャトル」ベクターである、すなわち、それらは少なくとも一つのクラスの生物において複製可能であるが、発現のために他の生物に形質移入され得る。例えば、大腸菌においてベクターがクローン化され、そのベクターが酵母あるいは哺乳動物細胞に形質移入され、宿主細胞染色体と独立して複製することはできないとしても、発現する。
【００６３】
ＤＮＡは宿主ゲノムに挿入することによって増幅され得る。これは、例えばベクターにバシラス(Bacillus)ゲノムＤＮＡに見られる配列と相補的なＤＮＡ配列を含めることにより、宿主としてバシラス種を用いて容易に達成される。このベクターを用いたバシラスの形質移入は、ゲノムとの相同的組換え及びＡｐｏ-２ＤｃＲＤＮＡの挿入をもたらす。しかし、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするゲノムＤＮＡの回収は、Ａｐｏ-２ＤｃＲＤＮＡを切除するのに制限酵素による消化を必要とするために、外来的に複製したベクターの場合よりも複雑である。
【００６４】
(ｉｉｉ)選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択的培地で成長させた形質転換宿主細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターと共に形質転換されていない宿主細胞は培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
【００６５】
選択技術の一例においては、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、抗薬物性を付与し、選択工程を生存するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン［Southernら, J. Molec. Appl. Genet., 1：327(1982)］、ミコフェノール酸［Mulliganら, Science, 209：1422(1980)］又はハイグロマイシン［Sugdenら, Mol. Cell. Biol., 5：410-413(1985)］が使用される。上述した３つの例は、真核生物のコントロール下で細菌遺伝子を用いて、適切な薬物Ｇ４１８又はネオマイシン(ジェネテシン)、ｘｇｐｔ(ミコフェノール酸)、又はハイグロマイシンにそれぞれ耐性を付与する。
【００６６】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、Ａｐｏ-２ＤｃＲ核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるものである。哺乳動物細胞の形質転換細胞は、マーカーを捕捉することによって当該形質転換細胞のみが生存できるように独特に適応化された淘汰圧下に置かれる。淘汰圧は、培地中の選択剤の濃度が次第に変化する条件下で形質転換細胞を培養することにより課し、選択遺伝子とＡｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡの双方を増幅させる。増幅は、成長に重要なタンパク質の生産に対する要求度が高い遺伝子が、組換え細胞の後の世代の染色体内に直列に反復されるプロセスである。増幅されたＤＮＡから増大したＡｐｏ-２ＤｃＲ量が合成される。増幅可能な遺伝子のほかの例には、メタロチオネインＩ及びＩＩ、アデノシンデアミナーゼ、及びオルニチンデカルボキシラーゼが含まれる。
【００６７】
ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub ほかにより, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。形質転換した細胞は次に濃度の高いメトトレキセートに接触させる。これによりＤＨＦＲ遺伝子の複数コピーが合成され、同時に、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡのような発現ベクターを含む他のＤＮＡの複数コピーが作られる。この増幅方法は、もしＭｔｘに高度に耐性である変異体ＤＨＦＲ遺伝子が使用されたような場合には内在性ＤＨＦＲの存在にかかわらず、任意の他の適切な宿主、例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１ＣＨＯ−Ｋ１を使用することができる(EP117,060)。
【００６８】
あるいは、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選べるマーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照。
【００６９】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282：39(1979)；Kingmanら, Gene, 7：141(1979)；Tschemperら, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ATCC 20,622あるいは 38,626)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【００７０】
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる［Bianchi ほか., Curr. Genet., 12:185(1987)］。より最近では、組換え子ウシのキモシンの大量生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている［Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)］。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている［Fleer ほか, Bio/Technology,9:968-975 (1991)］。
【００７１】
(ｉｖ)プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Ａｐｏ-２ＤｃＲ核酸配列に作用可能に結びついているプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合しているＡｐｏ-２ＤｃＲ核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造的な遺伝子(一般的に約１００ないし１０００塩基対)の開始コドンの上流側(５')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘発的なクラス及び構成的なクラスの２つのクラスに属する。誘発的なプロモーターは、養分の存在あるいは不存在、温度変化等の培養条件のある変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを排除し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡに作用的に結合している。天然のＡｐｏ-２ＤｃＲプロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれもＡｐｏ-２ＤｃＲＤＮＡの直接増幅及び／又は発現に用いることができる。
【００７２】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng ほか, Nature, 275:615 (1978), Goeddel ほか, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer ほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されており、よって当業者は、任意の所望の制限部位を提供するためにリンカーあるいはアダプターを使用することでＡｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡ［Siebenlist ほか, Cell, 20:269 (1980)］にそれらを作用可能に結合させることが可能である。細菌系で使用するプロモータもまたＡｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【００７３】
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｘが任意のヌクレオチドであるＣＸＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【００７４】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman ほか, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess ほか, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００７５】
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【００７６】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＡｐｏ-２ＤｃＲ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱衝撃プロモーター、そしてＡｐｏ-２ＤｃＲ配列に通常付随するプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
【００７７】
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をさらに含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる［Fiersほか, Nature, 273:113 (1978);Mulligan及びBerg, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakisほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)］。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる［Greenawayほか, Gene, 18:355-360 (1982)］。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の修飾は米国特許第４６０１９７８号に開示されている［また、サル細胞での免疫インターフェロンをコードしているｃＤＮＡの発現について、Grayら, Nature, 295：503-508(1982)を；単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyesら, Nature, 297：598-601(1982)を；培養されたマウス及びウサギの細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現について、Canaani及びBerg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79：5166-5170(1982)を；プロモーターとしてラウス肉腫ウィルスの長い末端反復を用いたＣＶ-１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、及びマウスＮＩＨ-３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現について、Gormanほか, Proc. Natl. Acas. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982)を参照のこと］。
【００７８】
(ｖ)エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明のＡｐｏ-２ＤｃＲをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。エンハンサーは、相対的に配向及び位置が独立しており、転写ユニットの５'［Laiminsほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 (1981)］及び ３'［Luskyほか, Mol. Cell Bio., 3:1108 (1983)］、イントロン内部［Banerjiほか, Cell, 33:729 (1983)］並びにコード配列自身の内部［Osbornほか, Mol. Cell Bio., 4:1293 (1984)］に見出されている。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、Ａｐｏ-２ＤｃＲコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００７９】
(ｖｉ)転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【００８０】
(ｖｉｉ)ベクターの作成と分析
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの作成には標準的なライゲーション技術を用いる。分離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。
【００８１】
作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ATCC 31446)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又はMessingほか, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)の方法又はMaximほか, Methods in Enzymology, 65:499 (1980)の方法によって配列決定する。
【００８２】
(ｖｉｉｉ)一過性発現ベクター
Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードしているＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む［Sambrookほか,上掲］。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、Ａｐｏ-２ＤｃＲ変異体を同定する目的のために特に有用である。
【００８３】
(ｉｘ)適切な例示的脊椎動物細胞ベクター
組換え脊椎動物細胞培養でのＡｐｏ-２ＤｃＲの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingほか, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiほか, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号; 及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【００８４】
３． 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、1989年4月12日に公開された DD 266,710に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。
【００８５】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能で有用である。
【００８６】
グリコシル化Ａｐｏ-２ＤｃＲの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。このような宿主細胞は、複雑なプロセシング及びグリコシル化活動が可能である。原則的には、脊椎動物であろうと無脊椎動物培養であろうと、任意のより高等の真核生物細胞培養が使用できる。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている［例えば、Luckowほか, Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Millerほか, Genetic Engineering, Setlowほか, eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp.277-279; 及びMaedaほか, Nature, 315:592-594 (1985)を参照のこと］。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用できる。
【００８７】
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。典型的には、植物細胞は、細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスのある菌株と共にインキュベートすることによってトランスフェクトされる。A. トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードしているＤＮＡが、植物細胞宿主がトランスフェクトされるようにその植物細胞宿主に移され、そして適切な条件下でＡｐｏ-２ＤｃＲをコードしているＤＮＡを発現させる。加えて、例えば、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列のような、植物細胞と適合しうる調節及びシグナル配列が利用できる［Depickerほか, J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)］。また、Ｔ-ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から分離されるＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡを含む植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化又は増強しうる［1989年6月21日公開のEP 321,196］。
【００８８】
培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は、当該分野おいてよく知られている［例えば、Tissue Culture,Academic Press,編者Kruse及びPatterson(1973)を参照のこと］。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株［293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamほか, J. Gen Virol., 36:59 (1977)］;ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞［TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)］;サルの腎細胞 (CVI ATCC CCL 70); アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587); ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34); バッファローラット肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51);ＴＲＩ細胞［Motherほか, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)］;ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞である。
【００８９】
宿主細胞をトランスフェクトし、好ましくは上述のＡｐｏ-２ＤｃＲ生成のための発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適当に修飾された常套的栄養培地で培養する。
【００９０】
トランスフェクションは、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り上げを意味する。多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られている。例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功したトランスフェクションが一般に認められる。
【００９１】
形質転換は、染色体外のエレメントとしてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように、生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookほかにより記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawほか, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際特許出願第ＷＯ８９／０５８５９号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、１９９１年１月１０日に公開された国際特許出願第ＷＯ９１／００３５８号に記載されているように、超音波処理を用いて植物をトランスフェクトすることもできる。
【００９２】
このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van solingenほか, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownほか, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourほか, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００９３】
４．宿主細胞の培養
本発明のＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドを生成るために用いられる原核細胞は、前掲のSambrookほかにより記載されているような適切な培地で培養される。
【００９４】
Ａｐｏ-２ＤｃＲの生産に用いられる哺乳動物の宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」,シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」,シグマ)が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン^TM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００９５】
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
【００９６】
この明細書において言及される宿主細胞は培養中の細胞並びに宿主動物内にある細胞を包含する。
【００９７】
５． 遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインシトゥハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドもまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性ヌクレオチド、蛍光剤又は酵素のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位として作用する。また、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【００９８】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、又はルミネサンス標識である。
【００９９】
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＡｐｏ-２ＤｃＲＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１００】
６． Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドの精製
Ａｐｏ-２ＤｃＲの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。Ａｐｏ-２ＤｃＲが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用いて膜から引き離すか、又はその細胞外ドメインを酵素的に切断する。Ａｐｏ-２ＤｃＲはまた糖リン脂質膜アンカーの酵素的切断により細胞表面から引き離すことができる。
【０１０１】
Ａｐｏ-２ＤｃＲがヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられるときは、Ａｐｏ-２ＤｃＲはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含んでいない。しかしながら、Ａｐｏ-２ＤｃＲに関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク又はポリペプチドからＡｐｏ-２ＤｃＲを精製することが望ましい。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Ａｐｏ-２ＤｃＲを、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;及びＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
【０１０２】
残基が欠失され、挿入され、又は置換されたＡｐｏ-２ＤｃＲ変異体は、その変異によってしばしば惹起された実質的な性質変化を考慮に入れて、天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲと同じようにして回収することができる。例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原、免疫グロブリン配列、又はレセプター配列とＡｐｏ-２ＤｃＲとの融合体の調製は精製を容易にする；配列に対する抗体を含む免疫アフィニティーカラムを、融合ポリペプチドを吸着するために使用することができる。他の種類のアフィニティーマトリックスもまた使用することもできる。
【０１０３】
例えばフェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲに適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際におけるＡｐｏ-２ＤｃＲ又はその変異体の特性の変化の起因となる改変が必要となることは、当業者であれば分かるであろう。
【０１０４】
７． Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドの共有結合的修飾
Ａｐｏ-２ＤｃＲの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。Ａｐｏ-２ＤｃＲの共有結合的修飾の一つの型は、Ａｐｏ-２ＤｃＲの標的アミノ酸残基を、Ａｐｏ-２ＤｃＲのＮ末端又はＣ末端残基、又は選択された側鎖と反応できる有機誘導体化剤と反応させることによって分子内に導入することができる。
【０１０５】
二官能性試薬による誘導体形成は、抗Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体を精製する方法に使用する水不溶性支持体マトリックス又は表面へのＡｐｏ-２ＤｃＲの架橋に有用であり、またその逆も同様である。二官能性試薬による誘導体形成は、Ａｐｏ-２ＤｃＲ分子を架橋させてＡｐｏ-２ＤｃＲ二量体を産生するのにも有用である。このような二量体により結合アビディティーが増大させられ、インビボにおける分子の半減期が延びる。通常使用される架橋剤には、例えば、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４-アジドサリチル酸とのエステル、３,３'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを包含するホモ二官能性イミドエステル、及びビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタンのような二官能性マレイミドが含まれる。メチル-３-［(ｐ-アジドフェニル)ジチオ］プロピオイミダートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生じる。また、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性の水不溶性マトリックス及び米国特許第３９６９２８７号；３６９１０１６号；４１９５１２８号；４２４７６４２号；４２２９５３７号及び４３３０４４０号に記載されている反応性基質がタンパク固定に用いられる。
【０１０６】
その他の修飾は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化［T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, PP.79-86 (1983)］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。残基の修飾型も本発明の範囲に入る。
【０１０７】
本発明の範囲内に含まれるＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲに見出される一又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又は天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲに存在しない一又は複数のグリコシル化部位を付加することを意味することをここでは意図している。
【０１０８】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)というトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、可能性の有るグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシルアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン(５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられるが)に、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味する。
【０１０９】
Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって達成される。この変化は、天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲへの一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。場合によっては、Ａｐｏ-２ＤｃＲアミノ酸はＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳するコドンが産生されるように予め選んだ塩基でＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドをコードしているＤＮＡを突然変異することによって変更される。このＤＮＡ突然変異は、上記に記載され前掲の米国特許第５３６４９３４号に記載された方法を用いてなされる。
【０１１０】
Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、該ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。用いられる結合形態に応じて、糖(類)は、(ａ)アルギニンとヒスチジンに、(ｂ)遊離のカルボキシル基に、(ｃ)遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのものに、(ｄ)セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基に、(ｅ)フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、又は(ｆ)グルタミンのアミノ基に結合される。これらの方法は１９８７年９月１１日公開の国際特許出願第ＷＯ８７／０５３３０号及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp259-306 (1981)に記載されている。
【０１１１】
Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的あるいはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異的置換によりなされる。例えば、化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価な化合物へ該ポリペプチドを曝露し、該ポリペプチドを無傷のまま残しながら、結合糖(Ｎ-アセチルグルコサミン又はＮ-アセチルガラクトサミン)を除く殆ど又は全ての糖を開裂させる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddinほか, Arch. Biochem Biophys., 259:52 (1987)及びEdgeほか, Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakuraほか, Meth. Enzymol., 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを使用して達成することができる。
【０１１２】
潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Duskinほか, J. Biol. Chem., 257:3105 (1982)によって記載されているように、化合物ツニカマイシンを使用して防ぐことができる。ツニカマイシンはタンパク質-Ｎ-グルコシド結合の形成を阻害する。
【０１１３】
Ａｐｏ-２ＤｃＲの共有結合的修飾の他のタイプは、米国特許番第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載されているように、Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドを、種々の非タンパク性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンに結合させることを含む。
【０１１４】
８． Ａｐｏ-２ＤｃＲキメラ
また本発明は、他の異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したＡｐｏ-２ＤｃＲを含むキメラ分子を提供する。
【０１１５】
一実施態様では、キメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合するエピトープを提供するタグポリペプチドとのＡｐｏ-２ＤｃＲの融合体を含む。エピトープタグは一般にＡｐｏ-２ＤｃＲのアミノ又はカルボキシル末端に位置させられる。Ａｐｏ-２ＤｃＲのこのようなエピトープタグが付けられた形は、その存在をタグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグを供給すると、Ａｐｏ-２ＤｃＲを抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の種類のアフィニティーマトリックスを用いたアフィニティー精製によって直ぐに精製することができる。
【０１１６】
様々なタグポリペプチドとその各抗体は従来から良く知られている。例には、ｆｌｕＨＡタグポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５［Fieldほか, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；ｃ-ｍｙｃタグとそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evanほか, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウィルス糖タンパクＤ(ｇＤ)タグとその抗体［Paborskyほか, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］が含まれる。他のタグポリペプチドには、フラッグ-ペプチド(Flag-peptide)［Hoppほか, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martinほか, Science, 255:192-194 (1992)］；αチューブリンエピトープペプチド［Skinnerほか, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパクペプチドタグ［Lutz-Freyermuthほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］が含まれる。ひとたびタグポリペプチドが選択されれば、それに対する抗体を、ここに開示した方法を用いて産生することができる。
【０１１７】
一般的に、エピトープタグＡｐｏ-２ＤｃＲは、上述した方法に従い作成され生産される。Ａｐｏ-２ＤｃＲタグポリペプチド融合体は、Ａｐｏ-２ＤｃＲタンパク質をインフレームでコードしているｃＤＮＡ配列をタグポリペプチドＤＮＡ配列に融合させ、得られたＤＮＡ融合作成物を適当な宿主細胞に発現させることによって好ましく作成される。通常は、本発明のＡｐｏ-２ＤｃＲタグポリペプチドキメラを調製するときは、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードしている核酸を、タグポリペプチドのＮ末端をコードしている核酸にその３'末端で融合させるが、５'融合もまた可能である。例えば、約５〜約１０のヒスチジン残基を有するポリヒスチジン配列はＮ末端又はＣ末端で融合され、アフィニティークロマトグラフィーにおける精製ハンドルとして使用される。
【０１１８】
エピトープタグＡｐｏ-２ＤｃＲは、抗タグ抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。アフィニティー抗体が付着されるマトリックスには、例えばアガロース、調整穴明きガラス又はポリ(スチレンジビニル)ベンゼンが含まれる。ついで、エピトープタグＡｐｏ-２ＤｃＲは、当該分野において知られた技術を使用して、アフィニティーカラムから溶出することができる。
【０１１９】
他の実施態様において、キメラ分子は免疫グロブリン配列と融合したＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドを含む。キメラ分子は、また特定のＡｐｏ-２ＤｃＲドメイン配列、例えば免疫グロブリン配列と融合したＡｐｏ-２ＤｃＲの細胞外ドメイン配列も含む。これには、モノマー、又はホモ-又はヘテロマルチマー、そして特にはホモ-又はヘテロダイマー又は-テトラマー型のものが含まれ；場合によっては、キメラはダイマー型又はホモダイマー重鎖型であり得る。一般的に、これらの構築免疫グロブリンは以下の図に示されるような既知の単位構造を有している。






【０１２０】
基本的な４鎖の構造単位はＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する型である。４鎖の単位がより大なる高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭが一般にジスルフィド結合によって一緒になった基本的な４鎖単位のペンタマーとして存在する。ＩｇＡグロブリン、そして時折ＩｇＧグロブリンはまた血清中にマルチマー型で存在する。マルチマーの場合は、各４鎖単位は同一であるか異なっている。
【０１２１】
次の図は、幾つかの例示的なモノマー、ホモ-及びヘテロダイマー及びホモ-及びヘテロマルチマー構造を示している。これらの図は単に例証するためのものであって、マルチマーの鎖は、天然免疫グロブリンと同様にジスルフィド結合していると考えられる。
モノマー：


ホモダイマー：

ヘテロダイマー：

ホモテトラマー：

ヘテロテトラマー：

及び

【０１２２】
上図において、「Ａ」はＡｐｏ-２ＤｃＲ配列又は異種性配列に融合したＡｐｏ-２ＤｃＲ配列を意味する；Ｘは、Ａと同一でも異なっていてもよい付加的な薬剤、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの一部で、例えば天然又はキメラ免疫グロブリン可変領域を含む可変領域又は可変領域様ドメイン、例えばシュードモナス外毒素又はリシンのような毒素、又は他のサイトカイン(すなわち、IL-1、インターフェロン-γ)又は細胞表面分子(すなわち、NGFR、CD40、OX40、Fas抗原、ショープ及び粘液腫ポックスウィルスのT2タンパク質)のような他のタンパク質に機能的に結合している配列、又は定常ドメインと通常は結合していないポリペプチド治療剤である；Ｙはリンカー又は他のレセプター配列である；ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨは免疫グロブリンの軽又は重鎖の可変又は定常ドメインを表す。「Ａ」として少なくとも１つのＡｐｏ-２ＤｃＲ配列のＣＲＤと、「Ｘ」としてＣＲＤの反復性パターンを有する他の細胞表面タンパク質とを含む構造体が特に含まれる。
【０１２３】
上図は、単に本発明の可能性のあるキメラ構造を例証したものであって、全ての可能性を包括するものではない。例えば、これらの作成物のいずれにおいても、望ましくは幾つかの異なった「Ａ」、「Ｘ」又は「Ｙ」があるかもしれない。また、重又は軽鎖定常ドメインは、同一又は異なる免疫グロブリンから由来したものであってもよい。図示された類似の構造のあらゆる可能な組合わせは全て本発明の範囲に入る。
【０１２４】
一般的にキメラ分子は、ある種の抗体からの可変ドメインが他の種の可変ドメインで置換されたキメラ抗体と同様にして作成することができる。例えば、ＥＰ０１２５０２３；ＥＰ１７３４９４；Munro, Nature, 312：597(1984年12月13日)；Neubergerら, Nature, 312：604-608(1984年12月13日)；Sharonら, Nature, 309：364-367(1984年5月24日)；Morrisonら, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 81：6851-6855(1984)；Morrisonら, Science, 229：1202-1207(1985)；Boulianneら, Nature, 312：643-646(1984年12月13日)；Caponら, Nature, 337：525-531(1989)；Trauneckerら, Nature, 339：68-70(1989)を参照のこと。
【０１２５】
あるいは、キメラ分子は以下のようにして作成することができる。所望の配列、例えばＡｐｏ-２ＤｃＲ及び／又はＴＮＦＲ配列をコードする領域を含むＤＮＡを、免疫グロブリン様ドメインをコードするドメインの３'末端又はその近傍で、及びＡｐｏ-２ＤｃＲ又はＴＮＦＲポリペプチドのＮ末端をコードするＤＮＡもしくはその近傍の点(異なるリーダーの使用が想定される)で、又はＴＮＦＲのＮ末端コード領域もしくはその近傍(そこでは天然シグナルが使用される)で、制限酵素により開裂させる。ついで、このＤＮＡ断片を免疫グロブリン軽又は重鎖定常ドメインをコードするＤＮＡの近傍に直ちに挿入し、必要ならば、得られた作成物を欠失変異誘導により整える。好ましくは、キメラ分子がヒトに対するインビボ治療法を意図したものである場合、Ｉｇはヒト免疫グロブリンである。免疫グロブリン軽又は重鎖定常領域をコードするＤＮＡは既知であるか、ｃＤＮＡライブラリから直ぐに入手できるか合成される。例えば、Adamsら, Biochemistry, 19：2711-2719(1980)；Goughら, Biochemistry, 19：2702-2710(1980)；Dolbyら, Proc. Natl. Acad. Sci.. USA, 77：6027-6031(1980)；Riceら, Proc. Natl. Acad. Sci., 79：7862-7865(1982)；Falknerら, Nature, 298：286-288(1982)；及びMorrisonら, Ann. Rev. Immunol., 2：239-256(1984)を参照のこと。
【０１２６】
このような融合体の調製方法のさらなる詳細は、イムノアドヘシンの調製に関する刊行物に見出される。イムノアドヘシン一般、及び特にＣＤ４-Ｉｇ融合分子は、１９８９年４月６日に公開された国際特許出願第ＷＯ８９／０２９２２号に開示されている。ＩｇＧ重鎖定常領域に結合している、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)のレセプター、ＣＤ４の細胞外部分を含む分子は当該分野において知られており、ＣＤ４の可溶性細胞外部分よりも著しく長い半減期とより低いクリアランスを有することが見出された［Caponら, 上掲；Byrnら, Nature, 344：667(1990)］。また、特異的キメラＴＮＦＲ-ＩｇＧ分子の作成が、Ashkenaziら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：10535-10539(1991),；Lesslauerら, ［J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 1991, p.115(P432)］；及びPeppelとBeutler, J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 1991, p.118(P439)］に記載されている。
【０１２７】
Ｂ． Ａｐｏ-２ＤｃＲの治療的及び非治療的用途
本明細書に開示されているように、Ａｐｏ-２ＤｃＲは、治療的に用いられて、哺乳動物細胞において、Ａｐｏ-２ＬによるかＡｐｏ-２ＤｃＲが結合する他のリガンドによるアポトーシス及び／又はＮＦ-κＢ活性化を誘発する。この治療法は、例えばインビボ又はエキソビボの遺伝子療法を使用することによりなすことができ、ここで開示している死亡ドメイン配列の使用を含む。また、免疫グロブリン配列を含むＡｐｏ-２ＤｃＲキメラ分子(Ａｐｏ-２ＤｃＲの細胞外ドメイン配列を含むキメラ分子又は以下の実施例に記載されるＡｐｏ-２ＤｃＲイムノアドヘシンを含む)も治療的に使用することができ、Ａｐｏ-２Ｌの活性、例えばアポトーシス又はＮＦ-κＢ誘導又はＡｐｏ-２ＤｃＲが結合する他のリガンドの活性を阻害する。
【０１２８】
好適な担体とそれらの製剤は、Osloらにより編集されたRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co.,に記載されている。典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液のようなバッファーが含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、さらに好ましくは約７．４〜約７．８である。例えば投与経路よっては、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。
【０１２９】
哺乳動物への投与は、注射(例えば、静脈、腹腔内、皮下、筋内)、又は点滴のように、有効な形態で血流への送達を確実にする他の方法によりなすことができる。
【０１３０】
投与の有効な用量とスケジュールは経験的に決定することができ、このような決定は当業者の技量の範囲に含まれる。
【０１３１】
また、他の更なる治療法を哺乳動物に施してもよく、そのようなものには、限定されるものではないが、化学療法及び放射線療法、イムノアジュバント、サイトカイン、及び抗体ベース療法が含まれる。例としては、インターロイキン(例えば、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-６)、白血病阻害因子、インターフェロン、ＴＧＦ-β、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、及びＨＥＲ-２抗体が含まれる。哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発することが知られている他の薬剤を用いてもよく、そのような薬剤にはＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β(リンホトキシン-α)、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、及びＡｐｏ-１リガンドが含まれる。
【０１３２】
本発明において考慮される化学療法には、当該分野において既知であって市販されている化学物質又は薬物、例えばドキソルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン及びカルボプラチンが含まれる。このような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務家により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまた化学療法サービス,M.C.Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学療法剤は、上述されたもののような、製薬的に許容可能な担体で好ましく投与される。
【０１３３】
また、本発明のＡｐｏ-２ＤｃＲは非治療的用途においても有用性を有している。Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードしている核酸配列を、組織特異性の分類のための診断に使用することもできる。例えば、インシトゥハイブリッド形成、ノーザン及びサザンブロット法、及びＰＣＲ分析のような手順を、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡが評価されている細胞型中に存在しているか否かを決定するために使用することができる。Ａｐｏ-２ＤｃＲ核酸は、ここに記載されている組換え技術によるＡｐｏ-２ＤｃＲの調製にもまた有用である。
【０１３４】
単離されたＡｐｏ-２ＤｃＲは、未知量のＡｐｏ-２ＤｃＲを含有するサンプルが調製された対照として、定量的診断アッセイに使用され得る。またＡｐｏ-２ＤｃＲ調製物は、抗体を産生する際、Ａｐｏ-２ＤｃＲに対するアッセイにおける標準として(例えば、ラジオイムノアッセイ、ラジオレセプターアッセイ又は酵素結合免疫測定法における標準としての使用のためにＡｐｏ-２ＤｃＲを標識することにより)、アフィニティー精製法において、及び例えば放射性ヨウ素、酵素又はフルオロフォアで標識された場合、競合型レセプター結合アッセイにおいて有用である。
【０１３５】
実施例に記載されたような、Ａｐｏ-２ＤｃＲの単離された天然型を使用して、Ａｐｏ-２ＤｃＲの交互型；例えばシグナル伝達経路に関与しうる細胞質ドメインを保有する型を同定してもよい。Ａｐｏ-２ＤｃＲの修飾型、例えば前述のＡｐｏ-２ＤｃＲ-ＩｇＧキメラ分子(イムノアドヘシン)は、抗Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体の生産における免疫原として使用することができる。
【０１３６】
また、Ａｐｏ-２ＤｃＲ又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物か「ノックアウト」動物を産生するのに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするｃＤＮＡ又はその適当な配列(例えば、Ａｐｏ-２ＤｃＲ-ＩｇＧ)を、確立された技術によりＡｐｏ-２ＤｃＲをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。特にマウス又はラット等のトランスジェニック動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４７３６８６６号や第４８７０００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＡｐｏ-２ＤｃＲ導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＡｐｏ-２ＤｃＲをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＡｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えば過度のアポトーシスを伴う病理的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。発明のこの側面においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病状の発病率が低ければ、疾患に対する治療的処置の可能性が示される。他の実施態様において、可溶性型のＡｐｏ-２ＤｃＲ、例えばＡｐｏ-２ＤｃＲＥＣＤ又はこのような型の免疫グロブリンキメラを有するトランスジェニック動物を作成して、Ａｐｏ-２ＤｃＲＬ、Ａｐｏ-２ＤｃＲのリガンドの慢性的中和の効果をテストすることができる。
【０１３７】
あるいは、Ａｐｏ-２ＤｃＲの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＡｐｏ-２ＤｃＲをコードする変更ゲノムＤＮＡと、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするＤＮＡは、確立された技術に従い、Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。Ａｐｏ-２ＤｃＲをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えば電気穿孔法等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Liほか, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば腫瘍の発達を含む、Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の発達に対する防御能力によって特徴付けられる。
【０１３８】
Ｃ． 抗Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体の調製
本発明は、さらに抗Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体を提供するものである。Ａｐｏ-２ＤｃＲに対する抗体は以下のようにして調製することができる。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
【０１３９】
１． ポリクローナル抗体
Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。適切な免疫化剤の例は、Ａｐｏ-２ＤｃＲ-ＩｇＧ融合タンパク質、又はキメラ分子(Ａｐｏ-２ＤｃＲＥＤＣ-ＩｇＧ融合タンパク質を含む)である。また、その表面にＡｐｏ-２ＤｃＲを発現する細胞を使用してもよい。免疫化されている哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫化剤を抱合させることが有用である。使用され得るそのような免疫原性タンパク質の例は、限定するものではないが、スカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。また、哺乳動物の免疫反応を増強するために、ミョウバンのような凝集剤を使用してもよい。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。哺乳動物から採血し、血清を検定して抗体価を求める。望まれるならば、抗体価が増加又はプラトーするまで哺乳動物に追加免疫を施す。
【０１４０】
２． モノクローナル抗体
あるいは、Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein,上掲に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化する(上述したようにして)ことで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【０１４１】
免疫化剤は、典型的にはＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。適切な免疫化剤の例は、Ａｐｏ-２ＤｃＲ-ＩｇＧ融合タンパク質又はキメラ分子である。Ａｐｏ-２ＤｃＲＥＤＣ-ＩｇＧ免疫原の特定の例は、以下の実施例１３に記載している。表面でＡｐｏ-２ＤｃＲを発現する細胞もまた使用することができる。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット及びマウスの骨髄腫細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親の形質転換細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジン(「ＨＡＴ培地」)を含み、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１４２】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものが望ましい。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これはカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurほか, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
【０１４３】
ハイブリドーマ細胞を培養する培地を、Ａｐｏ-２ＤｃＲに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１４４】
所望のハイブリドーマ細胞が同定されたら、クローンを制限希釈工程を経てサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。更に、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
【０１４５】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培地又は腹水液から分離又は精製される。
【０１４６】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載された方法により作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法によって(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US. Patent No.4816567；Morrisonほか, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。
【０１４７】
以下の実施例に記載するようにして、抗Ａｐｏ-２ＤｃＲモノクローナル抗体を調製した。これらの抗体のいくらかは、４Ｇ３.９.９、６Ｄ１０．９．７、及び１Ｃ５．２４．１としてＡＴＣＣに寄託され、寄託受入番号 、 、及び がそれぞれ付与された。一実施態様において、本発明のモノクローナル抗体は、受入番号 、 、及び で寄託されたハイブリドーマ株化細胞により分泌される抗体の一又は複数と同じ生物学的特徴を有する。「生物学的特徴」という用語は、モノクローナル抗体のインビトロ及び／又はインビボの活性又は性質、例えばＡｐｏ-２ＤｃＲに特異的に結合する能力又はＡｐｏ-２ＤｃＲ活性を実質的に阻止、誘導又は高める能力を指すために使用される。場合によっては、モノクローナル抗体はここで特に言及された３種の抗体の少なくとも１つと同じエピトープに結合する。そのようなエピトープ結合は、例えばここや実施例において記載したように、種々のアッセイを行うことにより測定することができる。
【０１４８】
本発明の抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連したシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
【０１４９】
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の調製は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。例えば、消化はパパインの使用により行うことができる。パパイン消化の例は、９４／１２／２２に公開された国際特許出願第ＷＯ９４／２９３４８号、及び米国特許第４３４２５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、Ｆａｂ断片と呼ばれ、各々が単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片と、残りのＦｃ断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、抗原の架橋が尚も可能なＦ(ａｂ')２断片が得られる。
【０１５０】
また、抗体の消化により生産されたＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン(ＣＨ１)を含む。Ｆａｂ'断片は、抗体のヒンジ領域から一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ_１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されているということで、Ｆａｂ断片とは異なっている。Ｆａｂ'-ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでも命名である。Ｆ(ａｂ’)２抗体断片は、本来は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
【０１５１】
３． ヒト化抗体
本発明のＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones ほか, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann ほか, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１５２】
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター及び共同研究者［Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法を使用して行える。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(U.S. 4,816,567)である。実際には、ヒト化抗体は典型的にはある程度のＣＤＲ残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
【０１５３】
抗原性を軽減するには、ヒト化抗体を生成するために使用するヒトの軽及び重可変ドメインの両方の選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列ライブラリ全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトの配列を次にヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる［Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia及びLesk, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)］。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる［Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623 (1993)］。
【０１５４】
更に、抗体は、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性を高めるといった、望ましい抗体特徴が得られるように、ＦＲ残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている［1994年、3月3日に公開されたWO 94/04679を参照］。
【０１５５】
免疫化することで、内在性免疫グロブリンが生成されない状態でもヒト抗体の完全リパートリを生成することができるトランスジェニック動物(例えばマウス)を使用することが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異マウスにおいて抗体重鎖結合領域(Ｊ_Ｈ)遺伝子をホモ接合的に欠失させると内在性抗体生産の完全な阻害が生じることが記述されている。このような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列を移すと、抗原投与時にヒト抗体の生成が生じる［例えば、Jakobovitsほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993)；Jakobovitsほか, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggermanほか, Year in Immuno., 7:33 (1993)を参照］。また、ヒト抗体はファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marksほか, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］において産生することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。
【０１５６】
４． 二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＡｐｏ-２ＤｃＲに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
【０１５７】
二重特異性抗体を生成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生成方法は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えたため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成でき、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開の国際特許出願第９３／０８８２９号、及びTrauneckerほか, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
【０１５８】
別のより好ましいアプローチによれば、所望の結合特異性(抗体-抗原組合せ部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これは、作成に使用する三つのポリペプチド鎖が不等の比であるときに最高の収率が得られる実施態様において、三つのポリペプチド断片の相互比率の調節に大なるフレキシビリティをもたらす。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖が同比率で発現すると高収率が得られる場合や比率が特に重要ではない場合には、一つの発現ベクターに二つ又は三つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することができる。このアプローチの好適な形態では、二重特異性抗体は、一方のアームの第一結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖／軽鎖対(第二の結合特異性をもたらす)からなる。このような非対称的構造は、二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在すると容易な方法で分解できるので、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組合わせから分解し易くすることが見出された。このアプローチは１９９４年３月３日公開の国際特許出願第９４／０４６９０号によって開示されている。二重特異性抗体を生成するための更なる詳細については、例えばSureshほか,Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０１５９】
５． ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有的に結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療のために(ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)提案された。本抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されているものが含まれる。
【０１６０】
Ｄ． Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体の治療的及び非治療的用途
本発明のＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体は治療的な有用性を有している。例えば、Ａｐｏ-２リガンドに対する他のレセプターと交差反応するＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体は過剰なアポトーシス(例えば神経変性疾患において)をブロックするか、潜在的な自己免疫／炎症効果をブロックするために使用することができる。場合によっては、Ａｐｏ-２ＤｃＲ阻止抗体は、Ａｐｏ-２リガンド治療法と組合わせて使用することができる。Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体はＡｐｏ-２ＤｃＲレセプターを阻止することができ、投与されたＡｐｏ-２リガンドの生物利用能を増大させることができる。(Ａｐｏ-２ＤｃＲに対しての上述のような)治療組成物と投与形態を用いることができる。
【０１６１】
さらに、Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体は、免疫組織化学染色検定法又はＡｐｏ-２ＤｃＲの診断検定法、例えば特異的細胞、組織又は血清における発現を検出する検定法に使用することができる。当該分野において知られている様々な診断検定技術、例えば、競合的結合検定、直接的又は間接的サンドイッチ検定及び不均一又は均一相の何れにおいても実施される免疫沈降検定を使用することができる［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,CRC Press,Inc.,(1987) pp.147-158］。診断検定法に使用される抗体は、検出可能部分で標識することができる。検出可能成分は、直接的に又は間接的に検出可能なシグナルをつくりだすことができなければならない。例えば検出可能成分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、蛍光イソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、もしくはアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素であってもよい。Hunterほか,Nature,144:945 (1962)、Davidほか, Biochemistry,13:1014(1974)、Painほか,J. Immunol. Meth.,40:219 (1981)及びNygrenほか,J. Histochem. and Cytochem.,30:407 (1982)等に記載されている方法を含み、検出可能部分に抗体を抱合させるための当該分野において知られている任意の方法を使用することができる。
【０１６２】
また、Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体は天然供給源又は組換え細胞培養からのＡｐｏ-２ＤｃＲのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、Ａｐｏ-２ＤｃＲに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾過紙のような適当な支持体に固定する。次に、固定された抗体を、精製するＡｐｏ-２ＤｃＲを含む試料と接触させ、ついで、固定された抗体に結合したＡｐｏ-２ＤｃＲ以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、Ａｐｏ-２ＤｃＲを抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【０１６３】
Ｅ． Ａｐｏ-２ＤｃＲ又はＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体を含むキット
本発明の更なる実施態様においては、例えば上述の治療的又は非治療的用途に使用可能なＡｐｏ-２ＤｃＲ又はＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体を含むキット及び製造品が提供される。製造品にはラベルが付された容器が含まれる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、上述の治療的又は非治療的用途に有効な活性剤を含む組成物を収容する。組成物中の活性剤は、Ａｐｏ-２ＤｃＲ又はＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体である。容器のラベルには、組成物が特定の治療的又は非治療的用途に使用されることが示され、また上述のもののような、インビボ又はインビトロのいずれかの使用の指示が示されている。
【０１６４】
本発明のキットは、典型的には、上述の容器と、商業上及び使用者の観点から望まれる、バッファー、希釈液、フィルター、針、注入器及び使用説明が記されたパッケージ挿入物を含む、材料を含む一又は複数の他の容器を含んでいる。
【０１６５】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
【０１６６】
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１６７】
実施例
実施例において言及されている全ての制限酵素は、ニューイングランドバイオラボ社(New England Biolabs)から購入し、製造者の使用説明に従い使用した。実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示していない限りは、製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受入番号により次の実施例及び明細書全体を通して特定している細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Mannasas,Virginia)である。
【０１６８】
実施例１
ヒトＡｐｏ-２ＤｃＲをコードしているｃＤＮＡクローンの単離
【０１６９】
１．オリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリ(「ＬＩＢ１１１」)の調製
インビトロゲン、サンディエゴ、ＣＡの試薬とプロトコールを使用してｍＲＮＡをヒト乳癌組織から単離した(高速トラック２)。ライフ・テクノロジーズ、ゲイザースバーグ、ＭＤの試薬とプロトコール(スーパースクリプトプラスミド系)を使用し、ベクターｐＲＫ５Ｄ中にオリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリ(「ＬＩＢ１１１」)を産生するためにこのＲＮＡを用いた。この手順において、二本鎖ｃＤＮＡを１０００塩基対よりも大きいサイズにし、Ｓａ１Ｉ／ＮｏｔＩリンカーｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ベクター内にクローニングした。ｐＲＫ５Ｄはｓｐ６転写開始部位にＳｆｉＩ制限酵素部位が続き、その次にＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位があるクローニングベクターである。
【０１７０】
２．ランダムプライムｃＤＮＡライブラリ(「ＬＩＢ１１８」)の調製
一次ｃＤＮＡクローンの５'末端を優先的に提示するために二次ｃＤＮＡライブラリを産生した。ｓｐ６ＲＮＡを一次ライブラリ(上述のＬＩＢ１１１)から産生し、このＲＮＡを用いて、ライフ・テクノロジーズの試薬とプロトコール(上述のスーパースクリプトプラスミド系)を使用してベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ.０中にランダムプライムｃＤＮＡライブラリ(「ＬＩＢ１１８」)を産生した。この手順において二本鎖ｃＤＮＡを５００−１０００塩基対のサイズにし、ＮｏｔＩアダプターに平滑末端化してリンカーし、ＳｆｉＩで切断し、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ切断ベクター中にクローニングした。ｐＳＳＴ-ＡＭＹ.０は、酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータの後にｃＤＮＡクローニング部位とマウスアミラーゼ配列(分泌シグナルを持たない成熟配列)が続き、それに、酵母アルコールデヒドロゲナーゼターミネーターがクローニング部位後に続くクローニングベクターである。しかして、アミラーゼ配列とインフレームで融合されたこのベクター中にクローニングされたｃＤＮＡは、適切に形質移入された酵母コロニーからアミラーゼを分泌せしめる。
【０１７１】
３．形質転換と検出
ＬＩＢ１１８からのＤＮＡを氷上で冷却し、エレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌 (Life Technologies,２０ｍｌ)を添加した。ついで、細菌ベクター混合物を、製造者の推奨に従って電気穿孔法にかけた。続いてＳＯＣ培地(Life Technologies, １ｍｌ)を添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ついで、形質転換体を、アンピシリンを含有する２０の標準的な１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間(３７℃)の間インキュベートした。陽性コロニーを擦り取り、ＣｓＣｌ勾配のような標準的なプロトコールを使用して、細菌ペレットからＤＮＡを単離した。次に、精製したＤＮＡについて以下の酵母プロトコールを進めた。
【０１７２】
本発明において使用される酵母方法は、３つの範疇に分けられた：(１)プラスミド／ｃＤＮＡ併用ベクターでの酵母の形質転換；(２)アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出と単離；及び(３)酵母コロニーから直接の挿入断片のＰＣＲ増幅と配列決定及び更なる分析のためのＤＮＡの精製である。
【０１７３】
安定な突然変異体ｕｒａ３を含む任意の酵母株を本発明において使用することができるが、本発明の実施のために使用される好ましい酵母株はＨＤ５６-５Ａ(ＡＴＣＣ-９０７８５)であった。この株は次の遺伝子型：ＭＡＴα、ｕｒａ３-５２、ｌｅｕ２-３、ｌｅｕ２-１１２、ｈｉｓ３-１１、ｈｉｓ３-１５、ＭＡＬ^＋、ＳＵＣ^＋、ＧＡＬ^＋を有していた。
【０１７４】
形質転換を、Gietzら, Nucl. Acid. Res.,20:1425(1992) により概説されたプロトコールに基づいて実施した。この手順では、ＤＮＡマイクログラム当りおよそ１ｘ１０^５形質転換体の形質転換効率を得た。形質転換された細胞をついで寒天からＹＥＰＤ複合培地ブロス(１００ｍｌ)中に播種し、３０℃で一晩増殖させた。ＹＥＰＤブロスは、Kaiserら, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold SpringHarbor, N.Y. USA, p207 (1994)に記載されているようにして調製した。ついで一晩の培養を約２ｘ１０^６細胞／ｍｌ(およそＯＤ_６００＝０．１)に希釈して新鮮なＹＥＰＤブロス(５００ｍｌ)中に入れ、１ｘ１０^７細胞／ｍｌ(およそＯＤ_６００＝０．４−０．５)に再増殖させた。これには完了まで通常約３時間かかった。
【０１７５】
ついで、細胞を収集し、ＧＳ３ロータボトルに移しソーバル(Sorval)ＧＳ３ロータを５０００ｒｐｍで５分間作動させて形質転換用に調製し、上清を捨て、ついで滅菌水に再懸濁させ、ベックマンＧＳ-６ＫＲ遠心分離機で３５００ｒｐｍにて５０ｍｌのファルコン管中で再び遠心分離した。上清を捨て、続いて細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ(１０ｍｌ、１０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＬｉ_２ＯＯＣＣＨ_３)で洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ(２．５ｍｌ)中に再懸濁した。
【０１７６】
調製した細胞(１００μｌ)を新鮮に変性した一本鎖サケ精巣ＤＮＡ(Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD, USA)と混合し微量遠心管中でＤＮＡ(１μｇ,容量＜１０μｌ)を形質転換することにより形質転換を行った。混合物をボルテックスすることにより簡単に混合し、ついで４０％ＰＥＧ／ＴＥ(６００μｌ、４０％ポリエチレングリコール-４０００、１０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＬｉ_２ＯＯＣＣＨ_３、ｐＨ７．５)を添加した。この混合物を穏やかに混合し、３０分間攪拌しながら３０℃でインキュベートした。ついで細胞に４２℃で１５分間熱ショックをかけ、反応容器を微量遠心管中で５−１０秒の間に１２０００ｒｐｍで遠心分離し、デカントし、ＴＥ(５００μｌ、１０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５)に再懸濁させ、再び遠心分離した。ついで、細胞をＴＥ(１ｍｌ)中に希釈し、一定分量(２００μｌ)を、１５０ｍｍ成長板(ＶＷＲ)に前もって調製していた選択培地上に広げた。
【０１７７】
あるいは、複数の小さな反応の代わりに、単一の大きな規模の反応で試薬量を多くしたものを使用して形質転換を行った。
【０１７８】
使用された選択培地は、Kaiserら,Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, p208-210 (1994)に記載されたようにして調製されたウラシルを欠く合成完全ブドウ糖寒天(ＳＣＤ-Ｕｒａ)であった。形質転換体は３０℃で２−３日増殖させた。
【０１７９】
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は選択増殖培地に赤色のデンプンを含めることにより実施した。Bielyら, Anal.Biochem.,172:176-179(1988) により記載された手順に従って、デンプンは赤色染料(リアクティブレッド-１２０、シグマ)に結合させた。結合されたデンプンは０．１５％(ｗ／ｖ)の最終の濃度でＳＣＤ-Ｕｒａ寒天プレート中に導入し、リン酸カルシウムで７．０のｐＨまで緩衝させた(５０−１００ｍＭの最終濃度)。
【０１８０】
陽性のコロニーを取上げ、よく分離された同定可能なシングルコロニーを得るために新鮮選択培地(１５０ｍｍプレート上)上に画線した。この工程はまた形質転換体の中でもプラスミドの維持を確実にした。アミラーゼ分泌に対して陽性のよく分離されたシングルコロニーを、緩衝化ＳＣＤ-Ｕｒａ寒天中への赤色デンプンの直接の導入により測定した。陽性のコロニーは直接可視化された陽性のコロニーの周りに明確なハローを生じるデンプンを破壊する能力により測定した。
【０１８１】
４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離
陽性コロニーを単離したとき、その一部を爪楊枝により取上げ、滅菌水(３０μｌ)中に希釈し、９６ウェルプレート中に入れた。このとき、陽性コロニーは凍結して次の分析に対して保存するか、直ぐに増幅させた。一定分量の細胞(５μｌ)を、０．５μｌのクレンタク(Klentaq)(クローンテック, Palo Alto, CA)；４．０μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ's(パーキンエルマー-セタス)；２．５μｌのケンタク(Kentaq)バッファー(クローンテック)；０．２５μｌのフォワードオリゴ１；０．２５μｌのリバースオリゴ２；１２．５μｌの蒸留水を含む２５μｌ容量中でＰＣＲ反応に対する鋳型として使用した。フォワードオリゴヌクレオチド１の配列は：
TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT (配列番号：５)
であった。リバースオリゴヌクレオチド２の配列は：
CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT(配列番号：６)
であった。
ついで、次のようにしてＰＣＲを実施した：
ａ． 変性 ９２℃、５分
ｂ． ３サイクルの変性 ９２℃、３０秒
アニーリング ５９℃、３０秒
伸展 ７２℃、６０秒
ｃ． ３サイクルの変性 ９２℃、３０秒
アニーリング ５７℃、３０秒
伸展 ７２℃、６０秒
ｄ． ２５サイクルの変性 ９２℃、３０秒
アニーリング ５５℃、３０秒
伸展 ７２℃、６０秒
ｅ． 保持 ４℃
【０１８２】
オリゴヌクレオチドの下線領域はＡＤＨプロモータ領域とアミラーゼ領域にそれぞれアニーリングされ、挿入物が存在しないとき、ベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ.０からの３０７塩基対領域を増幅した。典型的にはこれらのオリゴヌクレオチドの５'末端の最初の１８ヌクレオチドはシーケンシングプライマーに対するアニーリング部位を含んでいた。従って、空のベクターからのＰＣＲ反応の総生成物は３４３塩基対であった。しかしながら、シグナル配列融合ｃＤＮＡはかなり長い核酸配列を生じた。
【０１８３】
ＰＣＲに続いて、反応物の一定分量(５μｌ)を上掲のSambrookらにより記述されたようなトリス-ホウ酸塩-ＥＤＴＡ(ＴＢＥ)緩衝系を使用する１％アガロース中でのアガロースゲル電気泳動により検査した。４００塩基対よりも大きい単一の強いＰＣＲ生成物を生じるクローンを、９６キアクイック(Qiaquick)ＰＣＲ洗浄カラム(Qiagen Inc., Chatsworth, CA)での精製後にＤＮＡ配列決定により更に分析した。
【０１８４】
５．全長クローンの同定
上記スクリーニングにおいて分離されたｃＤＮＡ配列(「ＤＮＡ２１７０５」)はヒトＴＮＦＲ１とあるアミノ酸配列類似性又は相同性を有していることが分かった：
TNFR1 81 CRECESG-SFTASENHLRHCLSCSKCRKEMG
* * * .* . *. *. *. *. .
DNA21705 164 CNPCTEGVDYTNASNNEPSCFPCTVCKSD--

QVEISSCTVDRDTVCGCRK (配列番号：７)
* ****. ***** *..
QKHKSSCTMTRDTVCQCKE (配列番号：８)
類似性に基づいて、ＤＮＡ２１７０５の配列からプローブを産生し、上述の第１節に記載したようにして調製したヒト胎児肺ライブラリ(「ＬＩＢ２５」)をスクリーニングするために使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂ(ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの先駆体である)であり、切断されたｃＤＮＡサイズは２８００塩基対未満であった。ヌクレオチド位置１９３−１９５に明らかな翻訳開始部位を持つ単一のオープンリーディングフレームを含み[Kozakら,上掲]、ヌクレオチド位置９７０−９７２に見出されるストップコドンで終端する(図１Ａ；配列番号：２)全長クローンを同定した(ＤＮＡ３３０８５)(ｐＲＫ-ｈＡｐｏ-２ＤｃＲ)(以下に示されるように、ＡＴＣＣ２０９０８７として寄託されたＡｐｏ２-ＤｃＲとも呼ばれる)。予想されたポリペプチド先駆体は２５９アミノ酸長であり、およそ２７．４ｋＤａの計算分子量を有している。配列解析では、Ｎ末端シグナルペプチド、２つのシステインリッチドメイン、４のほぼ同一の１５アミノ酸直列反復を含む配列、及び疎水性Ｃ末端領域が示された(図２及び図３)。Ｃ末端の疎水性配列には一対の小さいアミノ酸(Ａｌａ２２３及びＡｌａ２２４)が先行し；この構造と明白な細胞質ドメインがないことにより、Ａｐｏ-２ＤｃＲがグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカータンパク質でありうることが示唆される[Moran, J. Biol. Chem., 266: 1250- 1257(1991)を参照のこと]。Ａｐｏ-２ＤｃＲは５つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位を含んでいる(図２)。
【０１８５】
ＴＮＦレセプターファミリータンパク質は、典型的には、その細胞外領域に複数の(通常は４つの)システインに富んだドメインが存在していることを特徴としており、各システインリッチドメインは約４５アミノ酸長であり、規則的に間隔を開けた約６つのシステイン残基を有している。１型ＴＮＦレセプターの結晶構造に基づき、各ドメインにおけるシステインは、典型的には３つのジスルフィド結合を形成し、通常システイン１と２、３と５、及び４と６が互いに対になっている。ＤＲ４及びＡｐｏ-２(更に以下に記載)のように、Ａｐｏ-２ＤｃＲは２つの細胞外のシステインに富んだ擬性反復部を含む(図２)が、これに対し他の同定されている哺乳動物ＴＮＦＲファミリーのメンバーは３又はそれ以上のこのようなドメインを含む［Smithら, Cell, 76：959(1994)］。
【０１８６】
図１Ａ(配列番号：１)に示す全長配列のアラインメント解析に基づいて、Ａｐｏ-２ＤｃＲは、Ａｐｏ-３、ＴＮＦＲ１、又はＦａｓ／Ａｐｏ-１のような他のアポトーシス関連レセプターに対してよりも、ＤＲ４(６０％)とＡｐｏ-２(５０％)に対してより高い配列同一性を示す。
【０１８７】
図１Ｂにおいて、出願人は、明らかな翻訳開始部位がヌクレオチド位置９３−９５(図１Ｂにアミノ酸残基−４０として特定；配列番号：４)に交互にあてがわれうることを示した。図１Ｂに示すＡｐｏ-２ＤｃＲはアミノ酸残基−４０〜２５９を含む。
【０１８８】
実施例２
Ａｐｏ-２Ｌに対するＡｐｏ-２ＤｃＲの結合性とＡｐｏ-２ＤｃＲ活性に対するＰＩ-ＰＬＣの影響
【０１８９】
Ａｐｏ-２ＤｃＲがＡｐｏ-２Ｌに結合するかどうかを試験するため、またＡｐｏ-２ＤｃＲがＧＰＩ結合しているかどうかを評価するために、Ａｐｏ-２ＤｃＲトランスフェクト２９３細胞への放射ヨウ素標識Ａｐｏ-２Ｌの結合性を分析した。ホスファチジルイノシトール特異性ホスホリパーゼＣ(ＰＩ-ＰＬＣ)での細胞の前処理の結合性に対する影響もまた分析した。
【０１９０】
ヒト２９３細胞(ATCC CRL 1573)を１００ｍｍプレートに蒔き(１ｘ１０^６細胞／プレート)、リン酸カルシウム沈殿法を使用して２０μｇ／プレートのｐＲＫ５又は全長Ａｐｏ-２ＤｃＲ(実施例１に記載；ATCC寄託209087)をコードしているｐＲＫ５でトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＰＢＳ／１０ｍＭのＥＤＴＡ中に収集し、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)中で洗浄し、元のプレート当り２ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、トランスフェクション当り２組の１ｍｌの一定分量に分けた。ＰＩ-ＰＬＣ[Treanorら,Nature,382:80-83(1996)](１μｇ／ｍｌ)を、各トランスフェクションから取り出された２組の一定分量の１組に添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、１％のＢＳＡ(シグマ)を含む１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、０．０４ｍｌの一定分量を３組のチューブに入れた。非特異的結合性の測定のために、０．００５ｍｌのおよそ２００００ｃｐｍ^１２５Ｉ-Ａｐｏ-２Ｌ(Ａｐｏ-２Ｌは上掲のPittiらに記載され、通常のラクトペルオキシダーゼ法により放射ヨウ素標識した)を、０．００５ｍｌのＰＢＳ、又はＰＢＳに入った０．００５μｌの非標識Ａｐｏ-２Ｌ(最終濃度０．５μｇ／ｍｌ)と共にこれらのチューブに加えた。室温での１時間のインキュベーションの後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、ペレット化し、放射能を計数した。
【０１９１】
Ａｐｏ-２ＤｃＲによるトランスフェクションにより、特異的なＡｐｏ-２Ｌの結合量が顕著に増大したが、これは、Ａｐｏ-２ＤｃＲがＡｐｏ-２Ｌに結合することを示している(図４)。ＰＩ-ＰＬＣでの処理により、Ａｐｏ-２Ｌの結合が顕著に減少したが、これは、Ａｐｏ-２ＤｃＲがＧＰＩアンカーレセプターであることを示している(図４)。
【０１９２】
実施例３
全長Ａｐｏ-２ＤｃＲによるＡｐｏ-２Ｌ機能の阻害
【０１９３】
Ａｐｏ-２ＤｃＲにおいて細胞質領域が無いことは、このレセプターが、Ａｐｏ-２Ｌのシグナル伝達の伝達よりもむしろ変調に関与していることを示唆している。従って、Ａｐｏ-２Ｌに対する細胞応答性に対するＡｐｏ-２ＤｃＲトランスフェクションの影響を調べた。
【０１９４】
ＤＲ４とＡｐｏ-２ｍＲＮＡの両方を発現する(データは示さず)ヒト２９３細胞を、１００ｍｍプレートに蒔き(１ｘ１０^６細胞／プレート)、リン酸カルシウム沈殿法を使用して２０μｇ／プレートのｐＲＫ５又はｐＲＫ５-ｈＡｐｏ-２ＤｃＲ(実施例２参照)と共にプレート当り３μｇのｐＲＫをコードしているグリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ；クローンテックから購入)でトランスフェクトした。１８時間後、細胞をＰＢＳ又はＡｐｏ-２Ｌ(Pittiら,上掲,０．５μｇ／ｍｌ)で処理し、(プラスチック上の非固定細胞の明確な視覚化を可能にする)ホフマン光学系を備えた蛍光顕微鏡で６時間にわたって調べた。グリーン蛍光によりＧＦＰ陽性細胞を同定し、膜小疱形成(blebbing)及び細胞質凝結のような形態学基準によりアポトーシスを計数した。
【０１９５】
Ａｐｏ-２ＤｃＲによるトランスフェクションにより、アポトーシス誘発により測定したＡｐｏ-２Ｌに対する応答性が顕著に低減させられた(図５)。
【０１９６】
同様な実験において、ｐＲＫ５又はｐＲＫ５-ｈＡｐｏ-２ＤｃＲ(２０μｇ／プレート)により２９３細胞をトランスフェクトし、以下の実施例１０におけるように、Ａｐｏ-２Ｌ(０．５μｇ／ｍｌ)によるＮＦ-κＢの活性化を１８時間後に分析した。その結果、Ａｐｏ-２ＤｃＲは、アポトーシス誘発並びにＮＦ-κＢ活性化により測定したＡｐｏ-２Ｌ機能を阻害することが示された。
【０１９７】
実施例４
ノーザンブロット分析
【０１９８】
ヒト組織におけるＡｐｏ-２ＤｃＲｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロット分析によって検査した。ヒトＲＮＡブロットを、全長Ａｐｏ-２ＤｃＲｃＤＮＡをベースにした１．２キロベースの３２Ｐ標識ＤＮＡプローブにハイブリダイズした；プローブはＥｃｏＲＩでｐＲＫ５-Ａｐｏ-２ＤｃＲプラスミドを消化させ、Ａｐｏ-２ＤｃＲｃＤＮＡ挿入断片を精製することにより産生した。ヒト胎児ＲＮＡブロットＭＴＮ(クローンテック)、ヒト成人ＲＮＡブロットＭＴＮ-II(クローンテック)及びヒト癌株化細胞ＲＮＡブロット(クローンテック)をＤＮＡプローブと共にインキュベートした。ブロットをハイブリダイゼーション用バッファー(５Ｘ ＳＳＰＥ；２Ｘ デンハード溶液；１００ｍｇ／ｍＬの変性剪断されたサケ精子ＤＮＡ；５０％のホルムアミド；２％のＳＤＳ)に入ったプローブと共に、４２℃で６０時間インキュベートした。ブロットを２Ｘ ＳＳＣ；０．０５％のＳＤＳを用い、室温で１時間、数回洗浄し、ついで０．１Ｘ ＳＳＣ；０．１％のＳＤＳを用い、５０℃で３０分間洗浄した。ブロットを一晩さらした後、リン光体イメージャー分析(Fuji)により展開させた。
【０１９９】
図７Ａに示すように、幾つかのＡｐｏ-２ＤｃＲｍＲＮＡ転写物が検出された。相対的に高い発現が、成人の末梢血白血球(ＰＢＬ)、脾臓、肺、肝臓及び胎盤において見られた。例えばＰＢＬ及び脾臓のようなＡｐｏ-２ＤｃＲを発現する幾つかの成人組織は、Ａｐｏ-２(以下の実施例１１)及びＤＲ４[Panら,上掲]を発現することが示された。
【０２００】
図７Ｂに示されるように、Ａｐｏ-２ＤｃＲメッセージは検査したヒト腫瘍株化細胞(すなわち、ＨＬ６０前骨髄球性白血病、ＨｅＬａＳ３子宮頚癌、Ｋ５６２慢性骨髄性白血病、ＭＯＬＴ４急性リンパ芽球性白血病、ＳＷ４８０結腸直腸腺癌、Ａ５４９肺癌、及びＧ３６１黒色腫)及び、特にＡｐｏ-２ＤｃＲｃＤＮＡにサイズが対応するおよそ１．５ｋＢの転写物の殆どにおいて存在しない。特定された腫瘍細胞タイプ以外の上述の正常なヒト組織におけるＡｐｏ-２ＤｃＲの明らかな発現は、Ａｐｏ-２ＤｃＲレセプターがＡｐｏ-２リガンドにより癌細胞を(おそらくは癌細胞ではなく正常な細胞を保護することにより)優先的に死滅させることを示唆している。
【０２０１】
実施例５
ヒトＡｐｏ-２をコードしているｃＤＮＡクローンの単離
【０２０２】
発現された配列タグ(ＥＳＴ)ＤＮＡデータベース(LIFESEQＴＭ, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)を検索し、Ａｐｏ-３レセプター［Marstersら, Curr. Biol., 6：750(1996)］の死亡ドメインに対して相同であったあるＥＳＴを同定した。ヒト膵臓(「ＬＩＢ５５」)及びヒト腎臓(「ＬＩＢ２８」)のｃＤＮＡライブラリ(ｐＲＫ５ベクター中で上記の実施例１に記載されているようにして調製)を、ＥＳＴに基づく合成オリゴヌクレオチドプローブ：
GGGAGCCGCTCATGAGGAAGTTGGGCCTCATGGACAATGAGATAAAGGTGGCTAAAGCTG AGGCAGCGGG (配列番号：９)
でのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
【０２０３】
３つのｃＤＮＡクローンの全体を配列決定した。ｃＤＮＡの重なるコード領域はコドン４１０を除いて同一であった(図８の番号付け系を使用)；おそらくは多型性のために、この位置が両方の膵臓ｃＤＮＡにおけるロイシン残基(ＴＴＧ)、そして腎臓ｃＤＮＡにおけるメチオニン残基(ＡＴＧ)をコード化した。
【０２０４】
Ａｐｏ-２の全体核酸配列を図８に示す(配列番号：１０)。(以下に示すようにＡＴＣＣ２０９０２１として寄託されたｐＲＫ５-Ａｐｏ-２とも呼ばれる)クローン２７８６８は、ヌクレオチド位置１４０-１４２に明らかな翻訳開始部位を有する単一のオープンリーディングフレームを含み［Kozakら,上掲］、ヌクレオチド部位１３７３-１３７５に見出される終止コドンで終了する(図８；配列番号１０)。予想されるポリペプチド先駆体は４１１アミノ酸長で、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、約４５ｋＤａの算定分子量を有する。ヒドロパシー分析(図示せず)により、シグナル配列(残基１-５３)、続いて細胞外ドメイン(残基５４-１８２)、膜貫通ドメイン(残基１８３-２０８)、及び細胞内ドメイン(残基２０９-４１１)の存在が示唆された(図９；配列番号：１１)。２９３細胞に発現したＡｐｏ-２-ＩｇＧのＮ末端アミノ酸配列分析により、成熟ポリペプチドがアミノ酸残基５４で始まることが示され、これは、実際のシグナル配列が残基１-５３を含むことが示している。
【０２０５】
ＤＲ４とＡｐｏ-２ＤｃＲと同様に、Ａｐｏ-２は２つの細胞外システインリッチ擬似反復を含む一方(図９)、他の同定された哺乳動物ＴＮＦＲファミリーメンバーは３又はそれより多いそのようなドメインを含む[Smithら,Cell, 76:959(1994)]。
Ａｐｏ-２の細胞質領域は、ＴＮＦＲ１(３０％)；ＣＤ９５(１９％)；又はＡｐｏ-３／ＤＲ３(２９％)の死亡ドメインに対するよりもＤＲ４(６４％)の死亡ドメインに対して顕著により高いアミノ酸配列同一性を示す死亡ドメイン(図８に示すアミノ酸残基３２４−３９１；図２もまた参照のこと)を含む。ＴＮＦＲ１によるシグナル伝達に対して必要とされる６つの死亡ドメインアミノ酸のうち４つ[Tartagliaら,上掲]がＡｐｏ-２に保存される一方、他の２つの残基は半保存される(図２参照)。
【０２０６】
全長配列の(ＡＬＩＧＮコンピュータプログラムを使用する)アラインメント解析に基づき、Ａｐｏ-２は、例えばＴＮＦＲ１(１９％)；ＣＤ９５(１７％)；又はＡｐｏ-３(ＤＲ３、ＷＳＬ-１又はＴＲＡＭＰとも呼ばれる)(２９％)のような他のアポトーシス関連レセプターに対するよりもＤＲ４(５５％)に対してより高い配列同一性を示す。
【０２０７】
実施例６
Ａ． Ａｐｏ-２ ＥＣＤの発現
【０２０８】
可溶性の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)融合作成物を調製した。Ａｐｏ-２ＥＣＤ(図８に示すアミノ酸残基１-１８４)をＰＣＲ法により得て、Ｃ末端フラッグエピトープタグ(シグマ)に融合させた。(残基１８３及び１８４は膜貫通領域にあることが予想されていても、Ａｐｏ-２ＥＣＤ作成物は図８に示す残基１８３及び１８４を含んでいた)。ついで、フラッグエピトープタグ分子をｐＲＫ５に挿入し、ヒト２９３細胞(ATCC CRL 1573)に一過性トランスフェクションして発現させた。
【０２０９】
４８時間インキュベートした後、細胞上清を収集し、共沈試験(実施例７を参照)に直接使用するか、製造者(シグマ)の説明に従い、抗フラッグアガロースビーズでのアフィニティークロマトグラフィーによるＡｐｏ-２ＥＣＤ-フラッグの精製にかけた。
【０２１０】
Ｂ． イムノアドヘシンとしてのＡｐｏ-２ＥＣＤの発現
可溶性のＡｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシン作成物を調製した。Ａｐｏ-２ＥＣＤ(図８に示すアミノ酸１-１８４)を、以前に記載されているようにして［Ashkenaziら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：10535-10539(1991)］、ｐＲＫ５のヒト免疫グロブリンＧ１重鎖のヒンジ及びＦｃ領域に融合した。イムノアドヘシンは、ヒト２９３細胞に一過性トランスフェクションして発現させ、前掲のAshkenaziらにより記載されたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより細胞上清から精製した。
【０２１１】
実施例７
Ａｐｏ-２とＡｐｏ-２リガンド間の結合相互作用を示す免疫沈降アッセイ
【０２１２】
Ａｐｏ-２とＡｐｏ-２Ｌが相互作用するか又は互いに結合するかを測定するために、擬似トランスフェクト２９３細胞又はＡｐｏ-２ＥＣＤ-フラッグ(上記の実施例６に記載されたもの)がトランスフェクトした２９３細胞からの上清(５ｍｌ)を、５μｇのポリ-ヒスチジンタグ可溶性Ａｐｏ-２Ｌ［Pittiら, 上掲］と室温で３０分間インキュベートし、ついで共沈アッセイにより複合体形成について分析した。
【０２１３】
試料を２５μｌの抗フラッグ抱合アガロースビーズ(シグマ)又はニッケル抱合アガロースビーズ(Qiagen)を使用し、免疫沈降にかけた。４℃で１．５時間インキュベートした後、ビーズを遠心沈殿させ、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)で４回洗浄した。抗フラッグアガロースを使用することにより、Ａｐｏ-２ＬをフラッグタグＡｐｏ-２ＥＣＤを通して沈殿させ；ニッケルアガロースを使用することにより、Ａｐｏ-２ＥＣＤをＨｉｓタグＡｐｏ-２Ｌを通して沈殿させた。沈殿したタンパク質を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥバッファー中でビーズを５分間沸騰させることで放出させ、１２％のポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離し、ついでMarstersら, J. Biol. Chem.,272:14029-14032(1997)に記載されたようにして、抗Ａｐｏ-２Ｌ又は抗フラッグ抗体(２μｇ／ｍｌ)での免疫ブロットにより検出した。
【０２１４】
図１０に示した結果は、Ａｐｏ-２ＥＣＤとＡｐｏ-２Ｌが互いに結合可能であることを示している。
【０２１５】
さらに、結合相互作用を、抗フラッグビーズ(実施例６を参照)を用い、トランスフェクションした２９３細胞上清からＡｐｏ-２ＥＣＤを精製し、ついでBIACORE^TM装置で試料を分析することにより、分析した。BIACORE^TM分析により、約１ｎＭの解離定数(Ｋ_ｄ)が示された。また、BIACORE^TM分析により、Ａｐｏ-２ＥＣＤが他のアポトーシス誘発性ＴＮＦファミリーのメンバー、すなわちＴＮＦ-α(ジェネンテク・インク, Pennicaら, Nature, 312：712(1984))、リンホトキシン-α(ジェネンテク・インク), 又はFas/Ａｐｏ-１リガンド(Alexis Biochemicals)と結合不可能であることが示された。よって、これらのデータは、Ａｐｏ-２がＡｐｏ-２Ｌに対する特異的なレセプターであることを示している。
【０２１６】
実施例８
Ａｐｏ-２によるアポトーシスの誘発
【０２１７】
死亡ドメインはオリゴマー化界面として機能し得るため、死亡ドメインを含むレセプターの過剰発現により、リガンドの不在下におけるシグナル伝達が活性化する［Frazerら,上掲, Nagataら,上掲］。Ａｐｏ-２が細胞死を誘発可能であるか否かを測定するために、ヒト２９３細胞又はＨｅＬａ細胞(ATCC CCL 2.2)をリン酸カルシウム沈殿法(２９３細胞)又は電気穿孔法(ＨｅＬａ細胞)により、Ａｐｏ-２及び／又はＣｒｍＡをコードしているｐＲＫ５ベクター又はｐＲＫ５系プラスミドで一過性トランスフェクションした。適用できる場合には、プラスミドＤＮＡの全体量を、ベクターＤＮＡを添加することにより調節した。アポトーシスを、形態学的(図１１Ａ)、ＤＮＡ断片化(図１１Ｂ)、又はMarstersら, Curr.Biol.,6：1669(1996)に記載されているようなホスファチジルセリン暴露のＦＡＣＳ分析(図１１Ｃ)により、トランスフェクション２４時間後に評価した。図１１Ａ及び１１Ｂに示すように、Ａｐｏ-２トランスフェクション２９３細胞には、顕著なアポトーシスが発生した。
【０２１８】
ＦＡＣＳにより分析される試料に対して、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクション用のマーカーとしてｐＲＫ５-ＣＤ４を同時形質移入させ、ＣＤ４発現細胞におけるアポトーシスを測定した；ＦＡＤＤをＡｐｏ-２プラスミドで同時形質移入した；データは、Marstersら, Curr. Biol., 6：1669(1996)に記載されているように、少なくとも３回の実験の平均値±ＳＥＭである。カスパーゼ阻害剤、ＤＥＶＤ-ｆｍｋ(Enzyme Systems)又はｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ(Research Biochemicals Intl.)を、トランスフェクション時に２００μＭで添加した。図１１Ｃに示すように、カスパーゼ阻害剤ＣｒｍＡ、ＤＥＶＤ-ｆｍｋ及びｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋが、Ａｐｏ-２によるアポトーシスの誘発を阻害し、この反応におけるＣｅｄ-３様プロテアーゼの関与が示された。
【０２１９】
ＦＡＤＤは、ＣＤ９５、ＴＮＦＲ１及びＡｐｏ-３／ＤＲ３によるアポトーシスの活性化を媒介するアダプタータンパク質である［Nagataら, 上掲］が、Ａｐｏ-２Ｌ［Marstersら, 上掲］又はＤＲ４［Panら, 上掲］によるアポトーシス誘導には必要であるとは思われない。ＣＤ９５、ＴＮＦＲ１、又はＡｐｏ-３／ＤＲ３によるアポトーシス誘発を阻害するＦＡＤＤのドミナントネガティブ変異体型［Frazerら,上掲；Nagataら,上掲；Chinnayianら,上掲］は、ＨｅＬａ細胞にＡｐｏ-２を同時形質移入させた場合(図１１Ｃ)に、Ａｐｏ-２によるアポトーシス誘発を阻害しなかった。これらの結果より、Ａｐｏ-２は、ＦＡＤＤとは独立して、アポトーシスのシグナル伝達をしていることが示唆される。この結論と一致して、Ａｐｏ-２細胞質領域を含むグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ融合タンパク質は、インビトロで転写され翻訳されたＦＡＤＤに結合しなかった(データは示さず)。
【０２２０】
実施例９
可溶性Ａｐｏ-２ＥＣＤによるＡｐｏ-２Ｌ活性の阻害
【０２２１】
可溶性Ａｐｏ-２Ｌ(０．５μｇ／ｍｌ、Pittiら,上掲に記載されたようにして調製)を、抗フラッグ抗体(シグマ)(１μｇ／ｍｌ)と共に、ＰＢＳバッファー又はアフニティー精製されたＡｐｏ-２ＥＣＤ(５μｇ／ｍｌ)と室温で１時間、プレインキュベートし、ＨｅＬａ細胞に添加した。インキュベート５時間後、細胞をＦＡＣＳ(上述)によりアポトーシスについて分析した(図１１Ｄ)。
【０２２２】
Ａｐｏ-２ＬはＨｅＬａ細胞において顕著なアポトーシスを誘発し、可溶性Ａｐｏ-２ＥＣＤはＡｐｏ-２Ｌの作用を阻止でき(図１１Ｄ)、Ａｐｏ-２ＬとＡｐｏ-２との間に特異的な相互作用があることが確認された。同様の結果がＡｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンでも得られた(図４１１Ｅ)。用量-反応分析では、約０．３ｎＭのＡｐｏ-２イムノアドヘシンで最大半減阻害が示されている(図１１Ｅ)。
【０２２３】
実施例１０
Ａｐｏ-２によるＮＦ-κＢの活性化
【０２２４】
Ａｐｏ-２がＮＦ-κＢを活性化させるか否かを測定するためのアッセイを行った。
ＨｅＬａ細胞を、全長天然配列Ａｐｏ-２、ＤＲ４又はＡｐｏ-３をコードするｐＲＫ５発現プラスミドでトランスフェクションし、トランスフェクション２４時間後に収集した。核抽出物を調製し、１μｇの核タンパク質を、３２Ｐ標識ＮＦ-κＢ特異性合成オリゴヌクレオチドプローブＡＴＣＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧ(配列番号：１２)［MacKayら, J. Immunol., 153：5274-5284(1994)も参照のこと］と、単独又は５０倍過剰の非標識プローブと共に、又は関連のない３２Ｐ標識合成オリゴヌクレオチドＡＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＴＧＴＧＡＴＡＴＡＴＣＣＴＴＧＡＴ(配列番号：１３)と反応させた。幾つかの試料に、ＮＦ-κＢのｐ６５／Ｒｅ１Ａサブユニットに対する抗体(１μｇ／ｍｌ；Santa Cruz Biotechnology)を添加した。ＤＮＡ結合性を、Hsuら,上掲；Marstersら,上掲、及びMacKayら,上掲に記載されたようにして、電気泳動易動度シフトアッセイにより分析した。
【０２２５】
結果を図１２に示す。図１２Ａに示すように、電気泳動移動度シフトアッセイにより測定した場合、Ａｐｏ-２とＤＲ４の両方が、ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションの際に、有意なＮＦ-κβの活性化を誘発した；活性化レベルはＡｐｏ-３／ＤＲ３で観察される活性化に匹敵するものであった。ＮＦ-κＢのｐ６５／Ｒｅ１Ａサブユニットに対する抗体は、ＮＦ-κＢプローブの移動を阻害し、３つ全てのレセプターに対する反応においてｐ６５を結び付けていた。
【０２２６】
また、Ａｐｏ-２Ｌ自体がＮＦ-κＢ活性を調節可能であるか否かを測定するアッセイを行った。ＨｅＬａ細胞又はＭＣＦ７細胞(ヒト胸腺癌株化細胞、ATCC HTB 22)を、ＰＢＳバッファー、可溶性Ａｐｏ-２Ｌ(Pittiら,上掲)又はＴＮＦ-α(ジェネンテク・インク, Pennicaら, Nature, 312：724(1984)を参照)(１μｇ／ｍｌ)で処理し、上述のようにしてＮＦ-κＢ活性をアッセイした。結果を図１２Ｂに示す。Ａｐｏ-２Ｌは、処理されたＨｅＬａ細胞においては有意なＮＦ-κＢ活性化を誘発したが、処理されたＭＣＦ７細胞においては誘発しなかった；ＴＮＦ-αは両方の株化細胞においてより著しい活性化を誘発した。幾つかの研究において、ＴＮＦによるＮＦ-κＢの活性化により、ＴＮＦ誘発性アポトーシスから細胞を保護できることが開示されている［Nagataら,上掲］。
【０２２７】
また、ＮＦ-κＢインヒビターであるＡＬＬＮ(N-アセチル-ロイシン-ロイシン-ノルロイシン)及び転写インヒビターであるシクロヘキサミドの影響を試験した。ＨｅＬａ細胞(６-ウェル皿に蒔いた)を、Ａｐｏ-２Ｌ(１μｇ／ｍｌ)の添加前に、ＰＢＳバッファー、ＡＬＬＮ(Calbiochem)(４０μｇ／ｍｌ)又はシクロヘキサミド(シグマ)(５０μｇ／ｍｌ)と共に、１時間プレインキュベートした。インキュベート５時間後、ＦＡＣＳによりアポトーシスについて分析した(図１２Ｃを参照)。
【０２２８】
結果を図１２Ｃに示す。ＡＬＬＮ及びシクロヘキサミドの両方とも、ＨｅＬａ細胞におけるＡｐｏ-２Ｌ誘発性アポトーシスのレベルを増加させた。データは、Ａｐｏ-２Ｌが保護性ＮＦ-κＢ依存性遺伝子を誘発可能であることを示している。また、データは、Ａｐｏ-２Ｌがある種の株化細胞においてＮＦ-κβを活性化することができ、Ａｐｏ-２とＤＲ４の両方がその機能を媒介し得ることを示している。
【０２２９】
実施例１１
ノーザンブロット分析
【０２３０】
ヒト組織におけるＡｐｏ-２ｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロット分析によって検査した。ヒトＲＮＡブロットを、全長Ａｐｏ-２ｃＤＮＡをベースにした４．６キロベースの３２Ｐ標識ＤＮＡプローブにハイブリダイズした；プローブはＥｃｏＲＩでｐＲＫ５-Ａｐｏ-２プラスミドを消化することにより産生した。ヒト胎児ＲＮＡブロットＭＴＮ(クローンテック)及びヒト成人ＲＮＡブロットＭＴＮ-II(クローンテック)をＤＮＡプローブと共にインキュベートした。ブロットをハイブリダイゼーション用バッファー(５Ｘ ＳＳＰＥ；２Ｘデンハード溶液；１００ｍｇ／ｍＬの変性された剪断サケ精子ＤＮＡ；５０％のホルムアミド；２％のＳＤＳ)に入ったプローブと共に、４２℃で６０時間インキュベートした。ブロットを２Ｘ ＳＳＣ；０．０５％のＳＤＳを用い、室温で１時間、数回洗浄し、ついで０．１Ｘ ＳＳＣ；０．１％のＳＤＳを用い、５０℃で３０分間洗浄した。ブロットを一晩さらした後、展開した。
【０２３１】
図１３に示すように、約４．６キロベースの優性ｍＲＮＡの転写物が複数の組織において検出された。発現は、胎児及び成人の肝臓及び肺、及び成人の卵巣及び末梢血白血球(ＰＢＬ)において比較的高かったが、胎児及び成人の脳においてはｍＲＮＡの発現は検出されなかった。中レベルの発現は、成人の大腸、小腸、精巣、前立腺、胸腺、膵臓、腎臓、骨格筋、胎盤、及び心臓において見出された。Ａｐｏ-２が発現した幾つかの成人組織、例えばＰＢＬ、卵巣及び脾臓は、ＤＲ４を発現することが以前に見出されているが［Panら,上掲］、各レセプターｍＲＮＡの発現の相対レベルは異なっているようである。
【０２３２】
実施例１２
Ａｐｏ-２、ＤＲ４及びＡｐｏ-２ＤｃＲ遺伝子の染色体局在化
【０２３３】
ヒトＡｐｏ-２遺伝子の染色体局在化を、放射線ハイブリッド(ＲＨ)パネル分析により検査した。ＲＨマッピングを、ヒト-マウス細胞の放射線ハイブリッドパネル(Research Genetics)とＡｐｏ-２ｃＤＮＡのコード領域に基づくプライマーを使用するＰＣＲにより、実施した［Gelbら,Hum. Genet., 98：141(1996)］。スタンフォードヒトゲノムセンターデータベースを使用したＰＣＲデータの解析では、Ａｐｏ-２は１１．０５ＬＯＤを有するマーカーＤ８Ｓ４８１に結合しており；Ｄ８Ｓ４８１はＤ８Ｓ２０５５と今度は結合しており、これがヒト染色体８ｐ２１に位置する。ＤＲ４の類似した分析においては、ＤＲ４が、ヒト染色体８ｐ２１にまた位置するマーカーＤ８Ｓ２１２７(１３.００のＬＯＤを持つ)に結合していることが示された。Ａｐｏ-２ＤｃＲの放射線ハイブリッドパネルを使用した解析では、Ａｐｏ-２ＤｃＲ遺伝子はマーカーＷＩ-６５３６に結合し、これがＤ８Ｓ２９８についで結合しており、これがまたヒト染色体８ｐ２１に位置し、Ｄ８Ｓ２００５とＤ８Ｓ２１２７の間に巣を形成している。従って、３つのＡｐｏ-２Ｌレセプター、Ａｐｏ-２、Ａｐｏ-２ＤｃＲ及びＤＲ４に対するヒト遺伝子は、全て染色体８ｐ２１に位置している。
【０２３４】
本出願人の知る限りでは、今日まで、ＴＮＦＲ遺伝子ファミリーのメンバーで染色体８ｐに位置しているものはなかった。
【０２３５】
実施例１３
Ａｐｏ-２ＤｃＲに特異的なモノクローナル抗体の調製
【０２３６】
０．５μｇ／５０μｌのＡｐｏ-２ＤｃＲイムノアドヘシンタンパク質(Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MTから購入したＭＰＬ-ＴＤＭアジュバントで希釈)を、各々の後足の裏の柔らかい部分に、３日の間隔で１１回注射することで、Ｂａｌｂ／ｃマウス(チャールズリヴァー研究所から得たもの)を免疫した。過去に開示されたように［Ashkenaziら、Proc. Natl. Acad. Sci., 88：10535-10539(1991)］、ｐＲＫ５においてヒト免疫グロブリンＧ１重鎖のヒンジ及びＦｃ領域に、Ａｐｏ-２ＤｃＲのＮ末端領域を融合させることにより、Ａｐｏ-２ＤｃＲイムノアドヘシンタンパク質を産生した。イムノアドヘシンタンパク質を、ヒト２９３細胞に一過性トランスフェクションして発現させ、前掲のAshkenaziらにより記載されたようにして、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより細胞上清から精製した。
【０２３７】
最終の追加免疫から３日後に、膝窩リンパ節をマウスから取り除き、単細胞懸濁液を、１％のペニシリン-ストレプトマイシンが補填されたＤＭＥＭ培地(Biowhitakker Corp.から得たもの)中で調製した。ついで、リンパ節細胞を３５％のポリエチレングリコールを使用し、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ.１(ATCC CRL 1597)と融合させ、９６-ウェル培養プレートで培養した。融合の結果得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地において選択した。融合から１０日後に、ハイブリドーマ培養の上清をＥＬＩＳＡでスクリーニングし、Ａｐｏ-２ＤｃＲイムノアドヘシンタンパク質に結合するモノクローナル抗体の有無を試験した。
【０２３８】
ＥＬＩＳＡにおいて、各々のウェルに、ＰＢＳに２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ(Cappel Laboratories社から購入)が入ったものを５０μｌ添加して、９６-ウェルマイクロタイタープレート(Maxisorb；Nunc, Kamstrup, Denmark)をコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ついでプレートを洗浄バッファー(０．０５％のトゥイーン２０を含有するＰＢＳ)で３回洗浄した。ついで、マイクロタイタープレートのウェルを、ＰＢＳに２．０％のウシ血清アルブミンが入ったもの２００μｌでブロックし、室温で１時間インキュベートした。ついでプレートを、洗浄バッファーで、再度３回洗浄した。
【０２３９】
洗浄工程後、アッセイ用バッファー(０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ)に０．４μｇ／ｍｌのＡｐｏ-２ＤｃＲイムノアドヘシンタンパク質(上述のもの)が入ったもの５０μｌを各々のウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄バッファーで３回洗浄した。
【０２４０】
洗浄工程に続き、１００μｌのハイブリドーマ上清又は精製した抗体(プロテインＧ-セファロースカラムを使用)(１μｇ／ｍｌ)を、アッセイ用バッファーの指定ウェルに添加した。１００μｌのＰ３Ｘ６３ＡｇＵ.１骨髄腫細胞の条件培地を、対照として他の指定ウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄バッファーで３回洗浄した。
【０２４１】
次に、アッセイ用バッファーで１：１０００に希釈されたＨＲＰ-抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ(Cappel Laboratories社から購入)を５０μｌ、各々のウェルに添加し、プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、ついで各々のウェルに５０μｌの基質(ＴＭＢマイクロウェル・ペルオキシダーゼ基質、Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD)を添加し、室温で１０分間インキュベートした。５０μｌのＴＭＢ１-成分終止溶液(ジエチレングリコール, Kirkegaard & Perry)を各々のウェルに添加して反応を終了させ、４５０ｎｍでの吸光度を自動マイクロタイタープレート読取装置で読取った。
【０２４２】
ＥＬＩＳＡによりスクリーニングされたハイブリドーマ上清の内、４７の上清が陽性であると判断された(バックグラウンドのおよそ４倍高いと算出)。ＥＬＩＳＡで陽性であると判断された上清を、さらにＨＵＭＥＣ細胞(Ａｐｏ-２ＤｃＲを発現するヒト微小血管内皮株化細胞；Cell Syatems, Kirkland, WA)及びＰＥ-抱合ヤギ抗マウスＩｇＧを使用してＦＡＣＳ分析により分析した。この分析のため、細胞選別用バッファー(１％のＦＣＳと０．０２％のＮａＮ_３を含有するＰＢＳ)に懸濁させた２５μｌの細胞(４×１０６細胞／ｍｌ)をＵ字底のマイクロタイターウェルに添加し、１００μｌの培養上清又は精製した抗体(プロテインＧ-セファロースカラムで精製)(１０μｇ／ｍｌ)が細胞選別用バッファーに入ったものと混合し、氷上で３０分間インキュベートした。ついで、細胞を洗浄し、１００μｌのＰＥ-抱合ヤギ抗マウスＩｇＧと共に４℃で３０分間インキュベートした。ついで細胞を２回洗浄し、２００μｌの細胞選別用バッファーに再懸濁させ、ＦＡＣＳｃａｎ(Becton Dickinson, Mountain View, CA)により分析した。ＦＡＣＳ分析により、１２／３５の上清が抗Ａｐｏ-２抗体に対して陽性であることが示された。
【０２４３】
図１４は、４Ｇ３.９.９；６Ｄ１０.９.７；及び１Ｃ５.２４.１と呼ばれるＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体とインキュベートしたＨＵＭＥＣ細胞のＦＡＣＳ染色を示す。図１４に示すように、各抗体は、ＨＵＭＥＣ細胞において発現されるＡｐｏ-２ＤｃＲレセプターを認識する。
【０２４４】
実施例１４
他のＡｐｏ-２リガンドレセプターへのＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体の結合性をテストするためのＥＬＩＳＡアッセイ
【０２４５】
実施例１３に記載したモノクローナル抗体が、Ａｐｏ-２ＤｃＲ以外の他の既知のＡｐｏ-２Ｌレセプターに結合することができたか否かを測定するためにＥＬＩＳＡを実施した。特に、４Ｇ３.９.９；６Ｄ１０.９.７；及び１Ｃ５.２４.１抗体について、それぞれ、ＤＲ４［Panら,上掲］、Ａｐｏ-２［上記の実施例に記載］、及びＤｃＲ２［Marstersら, Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)］に対する結合性を調べた。ＥＬＩＳＡは、本質的に上述の実施例１３に記載したようにして実施した。
【０２４６】
結果を図１５に示す。Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体４Ｇ３.９.９はＡｐｏ-２ＤｃＲに結合した。また４Ｇ３.９.９抗体は、ＤＲ４とＡｐｏ-２に対してはいくらかの交差反応性とＤｃＲ２に対してある限られた交差反応性を示した。６Ｄ１０.９.７抗体はＡｐｏ-２ＤｃＲに結合し、ＤＲ４、Ａｐｏ-２及びＤｃＲ２に対してある限られた交差反応性を示した。最後に、１Ｃ５.２４.１抗体はＡｐｏ-２ＤｃＲに結合し、ＤＲ４に対して幾らかの交差反応性を示した。１Ｃ５.２４.１抗体はＡｐｏ-２とＤｃＲ２に対して些かより少ない交差反応性を示した。交差反応性のまとめをまた図１６に示す。
【０２４７】
実施例１５
抗体のアイソタイピング
【０２４８】
Ａｐｏ-２ＤｃＲ抗体(実施例１３と１４において上述したもの)のアイソタイプを、アイソタイプ特異的ヤギ抗マウスＩｇ(Fisher Biotech, Pittsburgh, PA)で、マイクロタイタープレートを４℃で一晩かけてコーティングすることにより決定した。ついでプレートを洗浄バッファー(上述の実施例１３に記載したもの)で洗浄した。ついで、マイクロタイタープレートのウェルを２００μｌの２％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)でブロックし、室温で１時間インキュベートした。プレートを、再度洗浄バッファーで３回洗浄した。次に、１００μｌのハイブリドーマ培養上清又は５μｇ／ｍｌの精製抗体を指定ウェルに加えた。プレートを室温で３０分インキュベートし、ついで５０μｌのＨＲＰ-抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ(実施例１３において上述したもの)を各々のウェルに添加した。プレートを室温で３０分インキュベートした。プレートに結合したＨＲＰのレベルを、上述のＨＲＰ基質を使用して検出した。
【０２４９】
アイソタイピング分析により、４Ｇ３.９.９及び１Ｃ５.２４.１抗体はＩｇＧ１抗体であることが示された。またこの分析により、６Ｄ１０.９.７抗体がＩｇＧ２ｂ抗体であることが示された。これらの結果を図１６にまた示す。
【０２５０】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Blvd., Manassas, Virginia, USA(ATCC)に寄託した：
材料 ATCC寄託番号 寄託日
pRK-Apo-2 209021 1997年5月8日
Apo2-DcR 209087 1997年5月30日
4G3.9.9 ＿＿＿ _____________
6D10.9.7 ______ _____________
1C5.24.1 ______ _____________
【０２５１】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
【０２５２】
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のもの即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【０２５３】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１Ａ】図１Ａは、天然配列ヒトＡｐｏ-２ＤｃＲｃＤＮＡの核酸配列及びその誘導アミノ酸配列(開始部位は残基１にあてがわれる(ヌクレオチド１９３−１９５))を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、天然配列ヒトＡｐｏ-２ＤｃＲｃＤＮＡの核酸配列及びその誘導アミノ酸配列(開始部位は残基−４０にあてがわれる(ヌクレオチド７３−７５))を示す。
【図２】図２は、Ａｐｏ-２及びＡｐｏ-２ＤｃＲの一次構造とｍＲＮＡ発現を示す。この図は、全長ＤＲ４と整列化させたヒトＡｐｏ-２及びＡｐｏ-２ＤｃＲの推論アミノ酸配列を示す。Ａｐｏ-２の死亡ドメインはＤＲ４、Ａｐｏ-３／ＤＲ３、ＴＮＦＲ１、及びＣＤ９５のものと整列化され；星印はＴＮＦＲ１による死亡シグナル伝達に必須である残基を示す［Tartagliaら,上掲］。示されているのは、予想されたシグナルペプチド開裂部位(矢印)、２つのシステインリッチドメイン(ＣＲＤ１、２)及びApo-２及びＤＲ４の膜貫通ドメイン又はＡｐｏ-２ＤｃＲの疎水性Ｃ末端(下線)である。また示されているのは、５つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位(黒い箱)及びＡｐｏ-２ＤｃＲの５つの配列擬似反復(括弧)である。
【図３】図３は、Ａｐｏ-２とＡｐｏ-２ＤｃＲのヒドロパシープロットを示す。上部の数はアミノ酸の位置を示している。
【図４】図４は、Ａｐｏ-２ＤｃＲトランスフェクト細胞に対する放射ヨウ素標識Ａｐｏ-２Ｌの結合と、ＰＩ-ＰＬＣでの細胞の前処理によるその阻害を示す。
【図５】図５はＡｐｏ-２ＤｃＲによるアポトーシスのＡｐｏ-２Ｌ誘発の阻害を示す。
【図６】図６はＡｐｏ-２ＤｃＲによるＮＦ-κＢのＡｐｏ-２Ｌ活性化の阻害を示す。
【図７】図７Ａは、ヒト組織のポリＡ ＲＮＡブロットのノーザンハイブリダイゼーションにより分析されたヒト組織中でのＡｐｏ-２ＤｃＲｍＲＮＡの発現を示す。図７Ｂは、ヒト癌株化細胞のポリＡ ＲＮＡブロットのノーザンハイブリダイゼーションにより分析されたヒト癌株化細胞中でのＡｐｏ-２ＤｃＲｍＲＮＡの発現(の欠如)を示す。
【図８】図８は、天然配列ヒトＡｐｏ-２ｃＤＮＡの核酸配列とその誘導アミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、天然配列ヒトＡｐｏ-２の誘導アミノ酸配列を示し、推定シグナル配列には下線を引き、推定膜貫通ドメインは囲み、推定死亡ドメイン配列には破線の下線を付している。２つのシステインリッチドメインのシステインには個々に下線を引いている。
【図１０】図１０は、Ａｐｏ-２ＬとのＡｐｏ-２ＥＣＤの相互作用を示す。フラッグエピトープタグＡｐｏ-２ＥＣＤでトランスフェクトされた２９３細胞又は擬似トランスフェクトされた２９３細胞の上清をポリ-Ｈｉｓ-タグＡｐｏ-２Ｌと共にインキュベートし、抗フラッグ抱合又はニッケル抱合アガロースビーズで免疫沈降させた。沈殿したタンパク質をポリアクリルアミドゲルによる電気泳動法で分離し、抗Ａｐｏ-２Ｌ又は抗フラッグ抗体を用いた免疫ブロットにより検出した。
【図１１Ａ】図１１は、Ａｐｏ-２によるアポトーシスの誘発と、可溶性Ａｐｏ-２ＥＣＤによるＡｐｏ-２Ｌ活性の阻害を示す。ヒト２９３細胞(Ａ、Ｂ)又はＨｅＬａ細胞(Ｃ)を、Ａｐｏ-２及び／又はＣｒｍＡをコードしたｐＲＫ５ベクター又はｐＲＫ５ベースプラスミドによりトランスフェクトした。アポトーシスを、形態学的(Ａ)、ＤＮＡ断片化(Ｂ)、又はＦＡＣＳ(Ｃ-Ｅ)により評価した。可溶性Ａｐｏ-２Ｌを、バッファーあるいは抗フラッグ抗体又はＡｐｏ-２ＤｃＲＥＣＤイムノアドヘシン又はＤＲ４又はＴＮＦＲ１イムノアドヘシンと共にアフィニティー精製されたＡｐｏ-２ＥＣＤでプレインキュベートし、ＨｅＬａ細胞に添加した。後で細胞のアポトーシスを分析した(Ｄ)。また、Ａｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンを備えたＡｐｏ-２Ｌを使用して用量反応分析を行った(Ｅ)。
【図１１Ｂ】図１１は、Ａｐｏ-２によるアポトーシスの誘発と、可溶性Ａｐｏ-２ＥＣＤによるＡｐｏ-２Ｌ活性の阻害を示す。ヒト２９３細胞(Ａ、Ｂ)又はＨｅＬａ細胞(Ｃ)を、Ａｐｏ-２及び／又はＣｒｍＡをコードしたｐＲＫ５ベクター又はｐＲＫ５ベースプラスミドによりトランスフェクトした。アポトーシスを、形態学的(Ａ)、ＤＮＡ断片化(Ｂ)、又はＦＡＣＳ(Ｃ-Ｅ)により評価した。可溶性Ａｐｏ-２Ｌを、バッファーあるいは抗フラッグ抗体又はＡｐｏ-２ＤｃＲＥＣＤイムノアドヘシン又はＤＲ４又はＴＮＦＲ１イムノアドヘシンと共にアフィニティー精製されたＡｐｏ-２ＥＣＤでプレインキュベートし、ＨｅＬａ細胞に添加した。後で細胞のアポトーシスを分析した(Ｄ)。また、Ａｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンを備えたＡｐｏ-２Ｌを使用して用量反応分析を行った(Ｅ)。
【図１１Ｃ】図１１は、Ａｐｏ-２によるアポトーシスの誘発と、可溶性Ａｐｏ-２ＥＣＤによるＡｐｏ-２Ｌ活性の阻害を示す。ヒト２９３細胞(Ａ、Ｂ)又はＨｅＬａ細胞(Ｃ)を、Ａｐｏ-２及び／又はＣｒｍＡをコードしたｐＲＫ５ベクター又はｐＲＫ５ベースプラスミドによりトランスフェクトした。アポトーシスを、形態学的(Ａ)、ＤＮＡ断片化(Ｂ)、又はＦＡＣＳ(Ｃ-Ｅ)により評価した。可溶性Ａｐｏ-２Ｌを、バッファーあるいは抗フラッグ抗体又はＡｐｏ-２ＤｃＲＥＣＤイムノアドヘシン又はＤＲ４又はＴＮＦＲ１イムノアドヘシンと共にアフィニティー精製されたＡｐｏ-２ＥＣＤでプレインキュベートし、ＨｅＬａ細胞に添加した。後で細胞のアポトーシスを分析した(Ｄ)。また、Ａｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンを備えたＡｐｏ-２Ｌを使用して用量反応分析を行った(Ｅ)。
【図１１Ｄ】図１１は、Ａｐｏ-２によるアポトーシスの誘発と、可溶性Ａｐｏ-２ＥＣＤによるＡｐｏ-２Ｌ活性の阻害を示す。ヒト２９３細胞(Ａ、Ｂ)又はＨｅＬａ細胞(Ｃ)を、Ａｐｏ-２及び／又はＣｒｍＡをコードしたｐＲＫ５ベクター又はｐＲＫ５ベースプラスミドによりトランスフェクトした。アポトーシスを、形態学的(Ａ)、ＤＮＡ断片化(Ｂ)、又はＦＡＣＳ(Ｃ-Ｅ)により評価した。可溶性Ａｐｏ-２Ｌを、バッファーあるいは抗フラッグ抗体又はＡｐｏ-２ＤｃＲＥＣＤイムノアドヘシン又はＤＲ４又はＴＮＦＲ１イムノアドヘシンと共にアフィニティー精製されたＡｐｏ-２ＥＣＤでプレインキュベートし、ＨｅＬａ細胞に添加した。後で細胞のアポトーシスを分析した(Ｄ)。また、Ａｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンを備えたＡｐｏ-２Ｌを使用して用量反応分析を行った(Ｅ)。
【図１１Ｅ】図１１は、Ａｐｏ-２によるアポトーシスの誘発と、可溶性Ａｐｏ-２ＥＣＤによるＡｐｏ-２Ｌ活性の阻害を示す。ヒト２９３細胞(Ａ、Ｂ)又はＨｅＬａ細胞(Ｃ)を、Ａｐｏ-２及び／又はＣｒｍＡをコードしたｐＲＫ５ベクター又はｐＲＫ５ベースプラスミドによりトランスフェクトした。アポトーシスを、形態学的(Ａ)、ＤＮＡ断片化(Ｂ)、又はＦＡＣＳ(Ｃ-Ｅ)により評価した。可溶性Ａｐｏ-２Ｌを、バッファーあるいは抗フラッグ抗体又はＡｐｏ-２ＤｃＲＥＣＤイムノアドヘシン又はＤＲ４又はＴＮＦＲ１イムノアドヘシンと共にアフィニティー精製されたＡｐｏ-２ＥＣＤでプレインキュベートし、ＨｅＬａ細胞に添加した。後で細胞のアポトーシスを分析した(Ｄ)。また、Ａｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンを備えたＡｐｏ-２Ｌを使用して用量反応分析を行った(Ｅ)。
【図１２Ａ】図１２は、Ａｐｏ-２、ＤＲ４及びＡｐｏ-２ＬによるＮＦ-κＢの活性化を示す。(Ａ)ＨｅＬａ細胞を、示したタンパク質をコードする発現プラスミドでトランスフェクトした。核抽出物を調製し、電気泳動易動度シフトアッセイにより分析した。
【図１２Ｂ】図１２は、Ａｐｏ-２、ＤＲ４及びＡｐｏ-２ＬによるＮＦ-κＢの活性化を示す。(Ｂ)ＨｅＬａ細胞又はＭＣＦ７細胞をバッファー、Ａｐｏ-２Ｌ又はＴＮＦ-αで処理し、ＮＦ-κＢ活性をアッセイした。
【図１２Ｃ】図１２は、Ａｐｏ-２、ＤＲ４及びＡｐｏ-２ＬによるＮＦ-κＢの活性化を示す。(Ｃ)ＨｅＬａ細胞をＡｐｏ-２Ｌの添加前に、バッファー、ＡＬＬＮ又はシクロヘキサミドと共にプレインキュベートした。後にＦＡＣＳによりアポトーシスを分析した。
【図１３】図１３は、ヒト組織のポリＡ ＲＮＡブロットのノーザンハイブリッド形成により分析した、ヒト組織におけるＡｐｏ-２ｍＲＮＡの発現を示す。
【図１４Ａ】図１４は、ＩｇＧ対照(点線)と比較したＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体(太線で示す)のＦＡＳＣ分析を示す。抗体(１Ｃ５.２４.１)は、ＨＵＭＥＣ細胞において発現されたＡｐｏ-２ＤｃＲレセプターを認識した。
【図１４Ｂ】図１４は、ＩｇＧ対照(点線)と比較したＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体(太線で示す)のＦＡＳＣ分析を示す。抗体(４Ｇ３.９.９)は、ＨＵＭＥＣ細胞において発現されたＡｐｏ-２ＤｃＲレセプターを認識した。
【図１４Ｃ】図１４は、ＩｇＧ対照(点線)と比較したＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体(太線で示す)のＦＡＳＣ分析を示す。抗体(６Ｄ１０.９.７)は、ＨＵＭＥＣ細胞において発現されたＡｐｏ-２ＤｃＲレセプターを認識した。
【図１５Ａ】図１５は、Ａｐｏ-２ＤｃＲ、及びＤＲ４、Ａｐｏ-２及びＤｃＲ２と称される他の既知のＡｐｏ-２Ｌレセプターに対するＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体１Ｃ５.２４.の結合性をテストする酵素結合免疫吸着検定(ELISA)の結果を示すグラフを含む。
【図１５Ｂ】図１５は、Ａｐｏ-２ＤｃＲ、及びＤＲ４、Ａｐｏ-２及びＤｃＲ２と称される他の既知のＡｐｏ-２Ｌレセプターに対するＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体４Ｇ３.９.９の結合性をテストする酵素結合免疫吸着検定(ELISA)の結果を示すグラフを含む。
【図１５Ｃ】図１５は、Ａｐｏ-２ＤｃＲ、及びＤＲ４、Ａｐｏ-２及びＤｃＲ２と称される他の既知のＡｐｏ-２Ｌレセプターに対するＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体６Ｄ１０.９.７の結合性をテストする酵素結合免疫吸着検定(ELISA)の結果を示すグラフを含む。
【図１６】図１６は、抗体１Ｃ５.２４.１；４Ｇ３.９.９；及び６Ｄ１０.９.７の交差反応性及びアイソタイプのまとめを提供する表である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜２５９を含んでなる天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド。
【請求項２】
前記Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドが少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項１に記載のＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド。
【請求項３】
前記Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドが少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する請求項２に記載のＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド。
【請求項４】
図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜２５９を含んでなる単離された天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド。
【請求項５】
図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１６１を含んでなるＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドの単離された細胞外ドメイン配列。
【請求項６】
図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１６５を含んでなる請求項５に記載の細胞外ドメイン配列。
【請求項７】
図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜２３６を含んでなる請求項５に記載の細胞外ドメイン配列。
【請求項８】
Ｘが図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基１６１〜２３６の何れか一つであるアミノ酸残基１〜Ｘを含んでなるＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドの単離された細胞外ドメイン配列。
【請求項９】
図１Ｂ(配列番号：３)のアミノ酸残基−４０〜２５９を含んでなる単離された天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド。
【請求項１０】
異種性アミノ酸配列に融合した請求項５に記載の細胞外ドメイン配列又は請求項１に記載のＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項１１】
前記異種性アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項１０に記載のキメラ分子。
【請求項１２】
前記異種性アミノ酸配列が免疫グロブリン配列である請求項１０に記載のキメラ分子。
【請求項１３】
前記免疫グロブリン配列がＩｇＧである請求項１２に記載のキメラ分子。
【請求項１４】
前記細胞外ドメイン配列が図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１６５を含んでなる請求項１２に記載のキメラ分子。
【請求項１５】
請求項１に記載のＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド又は請求項５に記載の細胞外ドメイン配列に結合する抗体。
【請求項１６】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
阻止抗体を含んでなる請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドへの結合に加えて、他のＡｐｏ-２リガンドレセプターに結合する抗体を含んでなる請求項１５に記載の抗体。
【請求項１９】
キメラ抗体を含んでなる請求項１５に記載の抗体。
【請求項２０】
ヒト抗体を含んでなる請求項１５に記載の抗体。
【請求項２１】
ＩｇＧ抗体を含んでなる請求項１５に記載の抗体。
【請求項２２】
ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿として寄託されたハイブリドーマ株化細胞により産生された４Ｇ３.９.９モノクローナル抗体の生物学的性質を有する請求項１６に記載の抗体。
【請求項２３】
ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿として寄託されたハイブリドーマ株化細胞により産生された６Ｄ１０.９.７モノクローナル抗体の生物学的性質を有する請求項１６に記載の抗体。
【請求項２４】
ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿として寄託されたハイブリドーマ株化細胞により産生された１Ｃ５.２４.１モノクローナル抗体の生物学的性質を有する請求項１６に記載の抗体。
【請求項２５】
ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿として寄託されたハイブリドーマ株化細胞により産生された４Ｇ３.９.９モノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに抗体が結合する請求項１６に記載の抗体。
【請求項２６】
ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿として寄託されたハイブリドーマ株化細胞により産生された６Ｄ１０.９.７モノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに抗体が結合する請求項１６に記載の抗体。
【請求項２７】
ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿として寄託されたハイブリドーマ株化細胞により産生された１Ｃ５.２４.１モノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに抗体が結合する請求項１６に記載の抗体。
【請求項２８】
請求項１６に記載の抗体を産生するハイブリドーマ株化細胞。
【請求項２９】
ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿として寄託されたハイブリドーマ株化細胞。
【請求項３０】
ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿として寄託されたハイブリドーマ株化細胞。
【請求項３１】
ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿として寄託されたハイブリドーマ株化細胞。
【請求項３２】
ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿として寄託されたハイブリドーマ株化細胞により産生された４Ｇ３.９.９モノクローナル抗体。
【請求項３３】
ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿として寄託されたハイブリドーマ株化細胞により産生された６Ｄ１０.９.７モノクローナル抗体。
【請求項３４】
ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿として寄託されたハイブリドーマ株化細胞により産生された１Ｃ５.２４.１モノクローナル抗体。
【請求項３５】
請求項５に記載の細胞外ドメイン配列又は請求項１に記載のＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドをコード化している核酸配列を含んでなる単離された核酸。
【請求項３６】
前記核酸配列が図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基を含んでなる天然配列Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドをコード化する請求項３５に記載の核酸。
【請求項３７】
前記核酸配列が図１Ａ(配列番号：２)のヌクレオチド１９３〜９６９を含んでなる請求項３６に記載の核酸。
【請求項３８】
請求項３５に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項３９】
ベクターで形質転換した宿主細胞により認識される対照配列に作用可能に結合した請求項３８に記載のベクター。
【請求項４０】
請求項３８に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項４１】
ＣＨＯ細胞を含んでなる請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
酵母細胞を含んでなる請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
大腸菌を含んでなる請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドをコードしている核酸分子を使用してＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドの生産を行う方法において、請求項４０に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる方法。
【請求項４５】
Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を含む非ヒト、トランスジェニック動物。
【請求項４６】
マウス又はラットである請求項４５に記載の動物。
【請求項４７】
Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドをコードする変更遺伝子を有する細胞を含む、非ヒト、ノックアウト動物。
【請求項４８】
マウス又はラットである請求項４７に記載の動物。
【請求項４９】
請求項１又は５に記載のＡｐｏ-２ＤｃＲと担体を含んでなる組成物。
【請求項５０】
請求項１５に記載のＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体と担体を含んでなる組成物。
【請求項５１】
容器と該容器に入れられる組成物を含んでなり、組成物がＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド又はＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体を含む製造品。
【請求項５２】
インビボ又はエキソビボにおいてＡｐｏ-２ＤｃＲポリペプチド又はＡｐｏ-２ＤｃＲ抗体を使用するための使用説明書をさらに含んでなる請求項５１に記載の製造品。
【請求項５３】
哺乳動物細胞におけるアポトーシスを変調する方法において、Ａｐｏ-２ＤｃＲポリペプチドに前記細胞を暴露させることを含んでなる方法。
【請求項５４】
前記細胞が更にＡｐｏ-２リガンドに暴露される請求項５３に記載の方法。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１１Ｃ】

【図１１Ｄ】

【図１１Ｅ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１５Ｃ】

【図１６】

【公開番号】特開２０１０−１３４５１（Ｐ２０１０−１３４５１Ａ）
【公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−１７１１６１（Ｐ２００９−１７１１６１）
【出願日】平成２１年７月２２日（２００９．７．２２）
【分割の表示】特願２００８−９５７３６（Ｐ２００８−９５７３６）の分割
【原出願日】平成１０年６月１２日（１９９８．６．１２）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】