Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に特異的に結合するヒト抗体
Ｂ型肝炎の予防や治療に効果的なＨＢＶの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に特異的に結合する抗体が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｓＡｇ）に特異的に結合する抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのメンバーであり、急性および慢性肝炎を引き起こす。世界の人口のうち、約３．５億人、特に韓国および中国では人口の５％〜８％が慢性ＨＢＶ感染者であり、ＨＢＶは肝疾患や肝臓がんの主な原因である。ＨＢＶに対するワクチンの開発でＢ型肝炎を予防することが可能になったが、未だ多くの人々がＨＢＶ感染による慢性肝炎に苦しんでいる。ＨＢＶ感染は、肝炎、肝硬変だけでなく、肝臓がんを誘発し、慢性感染症の患者における肝臓がんの発生頻度が健常者よりも３００倍高い。ＷＨＯ（世界保健機構）は、肝臓がんの約８０％がＨＢＶ感染による慢性Ｂ型肝炎から始まると報告した。
【０００３】
現在利用可能なＢ型肝炎の治療薬は、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）とアデフォビル・ジピボキシル（ａｄｅｆｏｖｉｒ ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ）などのヌクレオシド類似体（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）を含んでおり、これらはＨＢＶポリメラーゼを阻害することが知られている。しかし、３年間投与後、７５％の患者において耐性ウイルスが発生して治療効果を低減させるので、これらは垂直感染や肝移植後の感染症を予防するために、Ｂ型肝炎の抗体製剤と組み合わせて使用されている。
【０００４】
現在使用されているＢ型肝炎の抗体製剤は、抗ＨＢＶ抗体を持つヒト血液源から高度の精製法およびウイルス不活性化法を用いて製造されているが、高い抗ＨＢＶ抗体を持つ高価なヒト血漿の利用可能性が低いだけではなく、ヒト血漿−由来のウイルスを不活性化するコストが高いので、上記の方法は、増加する需要に対処することができない。
【０００５】
ケーラーとミルシュタイン（１９７５）によってモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｍＡｂ）の製造技術が確立されてから、マウス由来のモノクローナル抗体は、診断用や一部の治療のために主に使われてきた。しかし、マウス抗体は、治療目的のために人体に適用する際のヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を生成する可能性があるため、投与することができない。ＨＡＭＡの問題を解決するために、キメリク抗体とヒト化抗体が開発されてきた。キメリク抗体は、抗体分子全体の〜３０％を構成するマウスｍＡｂの可変領域（Ｆｖフラグメント）を含有する。これに対し、ヒト化抗体は、抗体分子全体の〜１０％を構成するマウスｍＡｂのＣＤＲ（相補性決定領域）を含有する。上記キメリクおよびヒト化抗体は、ＨＡＭＡ反応を大幅に減少させてはいるが、長期間および継続的な投与を要する慢性肝炎のような慢性疾患の治療にはヒト抗体を使用する方がよいと思われる。
【０００６】
本願発明者らは、新規で改良された抗体を開発しようと努力しており、上記の抗体がＨＢＶ表面抗原に結合してＨＢＶを不活性化するのに使用できることを確認した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原に特異的に結合する新規の抗体を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、上記抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれコードするＤＮＡおよびそれを含む発現ベクターを提供することである。
【０００９】
本発明のまた他の目的は、上記発現ベクターに形質転換された細胞株を提供することである。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、上記抗体を含むＢ型肝炎の予防または治療用薬学組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一つの態様により、ａ）配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、ｂ）配列番号２、３、および４のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域、ｃ）重鎖定常領域、およびｄ）軽鎖定常領域を含んでいる、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に特異的に結合する抗体が提供される。
【００１２】
本発明の他の態様により、配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域をコードするＤＮＡまたは配列番号２、３、および４のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡおよびそれを含む発現ベクターが提供される。
【００１３】
本発明の別の態様により、上記発現ベクターに形質転換された細胞株が提供される。
【００１４】
本発明のまた別の態様により、上記抗体を含むＢ型肝炎の予防または治療用組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明の上記及びその他の目的と特徴は、添付の図面とともに考慮されるときに下記説明により明確になるもので、以下の通りである。
【図１】図１は、ＰＣＲによって合成された本発明の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）をそれぞれコードするＤＮＡを示す電気泳動（１％アガロースゲル）の分析の写真結果である。
【図２】図２は、本発明の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、ファージディスプレイベクターｐＫＳ４Ｈの地図である。
【図３】図３は、パンニング法を利用して、抗体ライブラリから抗体を選別する工程を示した図である。
【図４】図４は、抗体ライブラリから選別された本発明の抗体の一本鎖可変断片（ＳｃＦＶ）のアミノ酸配列である。
【図５】図５は、本発明のヒト抗体の重鎖を発現するための発現ベクター、ＨＢ４８−３３−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３、ＨＢ４８−３５−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３またはＨＢ４８−５９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３の地図である。
【図６】図６は、本発明のヒト抗体の軽鎖を発現するための発現ベクター、ＨＢ４８−３３−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２の地図である。
【図７】図７は、本発明のヒト抗体の軽鎖を発現するための発現ベクター、ＨＢ４８−３５−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２の地図である。
【図８】図８は、本発明のヒト抗体の軽鎖を発現するための発現ベクター、ＨＢ４８−５９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２の地図である。
【図９】図９は、形質転換体から発現された重鎖および軽鎖のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図１０】図１０は、ヒト抗体（ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９）のＨＢＶ表面抗原に対する相対的親和性である。
【図１１】図１１は、急性Ｂ型肝炎のマウスモデルの製造に使用された、ｐｃＤＮＡ３．１にＨＢＶ ＤＮＡ配列を挿入して製造されたベクターｐＨＢＶ１．３−ＭＢＲＩの地図である。
【図１２】図１２は、急性Ｂ型肝炎のマウスモデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏの効果試験によって選別された本発明のヒト抗体ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５とＨＢ４８−５９の中和能を示すグラフである。図１１のプラスミドを注入して２４時間後、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が発現したことを確認し、本発明の抗体の投与により、表面抗原が減少したことを確認した。表面抗原は、Ｇｅｎｅｄｉａ ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡ ３．０（緑十字社 ＭＳ、韓国）で測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、ａ）配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、ｂ）配列番号２、３、および４のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域、ｃ）重鎖定常領域、およびｄ）軽鎖定常領域を含んでいる、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に特異的に結合してＨＢＶを不活性化させることによってＢ型肝炎の予防または治療に効果を有することを特徴とする。
【００１８】
上記ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合する抗体は、好ましくは、ファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８、１３１５−１３１７、１９８５およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｃｈａｍｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、２１、３７１−３７８、２０００）を応用して選別することができる。上記のファージディスプレイ法では、フィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）ファージ（例えば、Ｍ１３、Ｆｄ、またはＦ１）の表面タンパク質をコードする遺伝子（ｇｅｎｅ ＩＩＩ）が、目的の抗体をコードする遺伝子と融合され、表面に露出した融合抗体を持つ抗体−ファージ型のウイルス粒子を生成させる。その後、抗体の高い特異性および親和性、並びにファージの高い感染性を利用してバイオパンニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）技術によってファージライブラリから目的とする抗体が選別できる（Ｂｕｒｔｏｎ＆Ｂａｒｂａｓ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５７、１９１−２８０、１９９４、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２、４３３−４５５、１９９４、およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４、１−２０、１９９８、 Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ、２１、 ３８５−３９２、２００２）。上記ファージディスプレイベクターは、ｐＫＳ４Ｈ（韓国特許第０６３５３７０号を参照）またはｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、好ましくはｐＫＳ４Ｈである場合もある。
【００１９】
本発明者らは、ファージライブラリから３つのヒト抗体（ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９）を選別した後、ＨＢＶ表面抗原に対する抗体の親和性と中和能を調べた（図１０および１１）。また、重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を分析した結果、すべての重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を持ち、軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号２，３、および４のアミノ酸配列を持つことを確認した。
【００２０】
本発明の抗体の重鎖および軽鎖の不変領域はヒト抗体のものと同一であってもよい。
【００２１】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を持つ抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、上記ＤＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号５のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００２２】
本発明は、配列番号２、３および４のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、上記ＤＮＡは、それぞれ配列番号２，３、および４のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする配列番号６、７および８のいずれか１つのヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００２３】
本発明は、上記抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含んでいる、ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を発現するための発現ベクターを提供する。好ましくは、上記発現ベクターは、図５に地図で示した“ＨＢ４８−３３−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３”、“ＨＢ４８−３５−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３”または“ＨＢ４８−５９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３”であってもよい。
【００２４】
具体的に、上記ベクターは、パンニング過程によって選別された抗体のＶＨ断片（ＨＢ４８ＶＨ）を適切なベクター、例えば、ｐＲＣ１３ベクター（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００５４、大韓民国特許第５２３７３２号を参照）に挿入して製造されることができる。
【００２５】
本発明は、上記抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含んでいる、ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現するための発現ベクターを提供する。好ましくは、上記ベクターは、図６に地図で示した“ＨＢ４８−３３−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１３”、図７に地図で示した“ＨＢ４８−３５−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１３”または図８に地図で示した“ＨＢ４８−５９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１３”であってよい。
【００２６】
具体的に、上記ベクターは、パンニング過程によって選別された抗体のＶＬ断片（ＨＢ４８−３３ＶＬ、ＨＢ４８−３５ＶＬまたはＨＢ４８−５９ＶＬ）を適切なベクター、例えば、ｐＫＣ１２ベクター（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００５４、大韓民国特許第５２３７３２号を参照）に挿入して製造することができる。
【００２７】
本発明は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を発現するための発現ベクターに形質転換された動物細胞株を提供する。上記動物細胞株は、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）、ＨＥＫ ２９３、またはＮＳＯ細胞株、好ましくはＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞株でもよい。
【００２８】
本発明に係る抗体は、上記重鎖および軽鎖の可変領域が互に結合することで製造することができる。
【００２９】
抗原に対する本発明の抗体の親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）は、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２０、２６５−２７２、２００１）によって測定することができる。図１０に示すように、本発明のヒト抗体の中でＨＢ４８−３５の親和性が最も高かったのに対し、ＨＢ４８−５９およびＨＢ４８−３３の親和性は、ＨＢ４８−３５に比べてそれぞれ約１．３倍と４．０倍低かった。また、Ｂ型肝炎と類似の兆候を誘導するために、Ｃ５７ＢＬ６マウス内にＨＢＶ ＤＮＡを流体力学注入（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、６、１２５８−１２６６、１９９９）して製造したＨＢＶマウスモデルにおいて、ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９抗体は、マウスの血液から、上記抗体によりＨＢＶの表面抗原が基底レベルまで減少したＨＢＶの中和能を示した（図１２）。したがって、本発明の抗体は、ＨＢＶの表面抗原に結合してＨＢＶを不活性化させることによって、Ｂ型肝炎を予防または治療するために使用することができる。
【００３０】
上記の結果から本発明は、前記抗体を含むＢ型肝炎の予防または治療用薬学組成物を提供する。本発明の組成物は、通常の方法に応じて、薬学製剤に製造することができる。剤型の製造において、上記抗体は、好ましくは、担体と混合したり、担体で希釈されたり、容器の形態でもよい担体内に組み込まれる。担体が希釈剤として使用される場合、これは抗体に対する小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）、賦形剤または媒質（ｍｅｄｉｕｍ）として作用する固形、半固形または液状であってもよい。したがって、剤型は錠剤、丸剤、粉剤、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、カシェ（ｃａｃｈｅｔ）、エリクシール（ｅｌｉｘｉｒ）、懸濁剤、乳剤、溶液剤、シロップ剤、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル剤、滅菌注射溶液、滅菌粉剤などの形を取ることができる。適切な担体、賦形剤および希釈剤の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエイト、プロフィールヒドロキシベンゾエイト、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を挙げることができる。剤型は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。本発明の抗体組成物は、上記抗体とともに、抗ウイルス剤として、インターフェロン、抗ＨＢＶモノクローナル抗体、抗ＨＢＶポリクローナル抗体、ヌクレオシド類似体、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ製剤または治療用ワクチンをさらに含むことができる。
【００３１】
ＨＢＶ感染およびＨＢＶ関連の疾病は、本発明の組成物を、人間を含む哺乳動物に投与することで、予防または治療することができる。上記組成物内の抗体の投与量は、対象、疾病状態の重症度、投与速度、および医師の判断に左右され得る。有効成分として、上記抗体は、単一容量または分割用量で、一日に約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重範囲の有効量で経口以外の経路を介して哺乳動物に投与することができる。場合によっては、上記の投与量に比べて少ないかまたは多い量が投与量として適切であり、多量の投与量は、一日あたりに分割された少ない投与量で投与することができる。
【００３２】
以下の実施例は、単に例示の目的で提供され、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００３３】
実施例１：ＲＮＡの分離
ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合する抗体を選別するために、ヒト抗体ライブラリを構築した。ヒト骨髄、ヒト胸腺、ヒト脾臓およびヒトＢ細胞から得られたＲＮＡの混合物を使用した。ヒトＢ細胞ＲＮＡを除くすべてのＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ社（米国）から購入し、ヒトＢ細胞ＲＮＡは下記のように分離した。
【００３４】
健康な成人から採血した５０ｍＬの血液を５０ｍＬのＰＢＳと混合し希釈した。３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）を１５ｍＬチューブに入れ、ここに上記の希釈血液４ｍＬを添加した。上記混合物を３，０００ｒｐｍで遠心分離して白血球を分離した。上記分離した白血球２ｍＬを６ｍＬのＰＢＳと混合し、１００ｘｇで１０分間遠心分離した。上記の白血球１００μＬを１ｍＬのトリゾール（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国）と混合してＲＮＡを分離した。
【００３５】
一方、上記分離されたＲＮＡを蒸留水で希釈した後、２６０ｎｍで吸光度を測定し、その量を計算した（１．８μｇ／μＬ、フルスペクトル２０００ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計、ＧＥ、米国）。詳細な手順は次のとおりである。
【００３６】
１ｍＬのトリゾールを１００μＬの白血球に添加してよく混ぜた後、常温（１５℃〜３０℃）で５分間放置した。そして、クロロホルム２００μＬを添加して１５秒間よくかき混ぜてから、常温で３分間放置した。その後、上記混合物を２℃〜８℃、１５分および１５，０００ｒｐｍの条件の下で遠心分離し、上清液を新しいチューブに移した。イソプロピルアルコール５００μＬを加えてよく混合した後、室温で１０分間放置した。そして、上記混合物を２℃〜８℃および１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去した。これに７５％エタノール１ｍＬを添加し、上記混合物を２℃〜８℃、５分間、１５，０００ｒｐｍの条件下で遠心分離しエタノールを除去した後、ＲＮＡペレットを常温で５分間乾燥させた。これに蒸留水１５０μＬを添加してＲＮＡを溶解させた後、２６０ｎｍにて上記懸濁液の吸光度を測定した。残りは−２０℃で保管した。
【００３７】
実施例２：抗体遺伝子の増幅
実施例１で分離したＲＮＡ１μｇおよびｐｄ（Ｔ）１２〜１８（０．５μｇ／μＬ）１μＬを蒸留水と混合して最終体積を１２．５μＬに合わせた。上記混合物を７０℃で２分間反応させ氷で冷却させた。その後、これに５Ｘ反応緩衝液、１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、組換えＲＮａｓｅ阻害剤およびＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）を添加して最終体積を２０μＬに合わせた後、４２℃で１時間、９５℃で５分間反応させてｃＤＮＡを合成した。ＬｉｑｕｉＭｉｘ ＱＭ Ｐｒｅｍｉｘ、Ｍａｇｅｎｔａ（Ｎｅｕｒｏｔｉｃｓ Ｉｎｃ、韓国）、鋳型として４μＬのｃＤＮＡ、１９μＬの蒸留水並びにそれぞれｓｃＦｖ領域（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）、重鎖可変領域、および軽鎖可変領域（ｋａｐｐａおよびｌａｍｂｄａ）のために考案された１μＬ（２５ｐｍｏｌ／μＬ）のプライマー［ＳｃＦｖ：配列番号９（Ｆｏｒｗａｒｄ）、１０（Ｒｅｖｅｒｓｅ−κ）および１１（Ｒｅｖｅｒｓｅ−λ）；重鎖可変領域：配列番号１２（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ１）、１３（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ２）、１４（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ３）、１５（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ４）、１６（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ５）、１７（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ６）、１８（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ７）および１９（Ｒｅｖｅｒｓｅ）；軽鎖可変領域κ鎖：配列番号２０（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＫ１／３Ａ）、２１（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＫ１／３Ｂ）、２２（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＫ２）、２３（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＫ４）、２４（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＫ５）、２５（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＫ６）、２６（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＪＫ−Ａ）、２７（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＪＫ−Ｂ）および２８（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＪＫ−Ｃ）；軽鎖可変領域λ鎖：配列番号２９（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ１〜３−Ａ）、３０（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ１〜３−Ｂ）、３１（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ４）、３２（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ５）、３３（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ６）、３４（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ７）、３５（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ８）、３６（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ９）、３７（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ１０）、３８（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＪＬ−Ａ）および３９（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＪＬ−Ｂ）］を使用してＰＣＲ反応を行った。
【００３８】
ＰＣＲ反応は、９５℃で５分、９５℃で１分、５５℃で２分、７２℃で２分間を３０回反応させた後、最後に７２℃で１５分間反応させて行われた。
【００３９】
上記増幅された抗体ＤＮＡを１．２％アガロースゲルにおいて電気泳動によって確認し（図１参照）、キアゲンキット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を用いて精製した。図１に示すように、重鎖および軽鎖（ｋａｐｐａおよびｌａｍｂｄａ）の可変領域に対応する１，３５０ｂｐのＤＮＡバンドが得られた。図１においてＭは、サイズマーカー、ＶＨは重鎖可変領域（レーン１：重鎖可変領域タイプＩ、レーン２：重鎖可変領域タイプＩＩ、レーン３：重鎖可変領域タイプＩＩＩ、レーン４：重鎖可変領域タイプＩＶ；レーン５：重鎖可変領域タイプＶ、レーン６：重鎖可変領域タイプＶＩ、およびレーン７：重鎖可変領域タイプＶＩＩ）、およびＶＬは、軽鎖可変領域（レーン９：軽鎖可変領域１／３κ、レーン１０：軽鎖可変領域２κ、レーン１１：軽鎖可変領域４κ、レーン１２：軽鎖可変領域５κ、およびレーン１３：軽鎖可変領域６κ、レーン１５：軽鎖可変領域１λ〜３λ、レーン１６：軽鎖可変領域４λ、レーン１７：軽鎖可変領域５λ、レーン１８：軽鎖可変領域６λ、レーン１９：軽鎖可変領域７λ、レーン２０：軽鎖可変領域８λ、レーン２１：軽鎖可変領域９λおよびレーン２２：軽鎖可変領域１０λ）を指す。
【００４０】
実施例３：抗体ＤＮＡの制限酵素切断
実施例２で準備したＶＨおよびＶＬをそれぞれ制限酵素ＳｆｉＩ／ＢｓｐＥＩおよびＢｓｐＥＩ／ＮｏｔＩで切断し、上記切断した断片を１．２％のアガロースゲル電気泳動で分離した後、キアゲンキットを用いて精製した。
【００４１】
実施例４：抗体ＤＮＡのライゲーションおよびライブラリの製造
ファージディスプレイベクターｐＫＳ４Ｈ（緑十字社、韓国、韓国特許第６３５３７０号参照）を制限酵素ＳｆｉＩ／ＢｓｐＥＩを使用して切断し、１．２％アガロースゲル電気泳動を利用して分離した後、キアゲンキットを利用して精製した。４０μｇのｐＫＳ４Ｈを実施例３で用意された１０μｇのＶＨと混合し、これにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、米国）を添加した後、２５℃で一晩中反応させた。上記リガーゼ反応混合物を、キアゲンキットを用いて精製し、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により形質転換させた。上記形質転換体を、１００ｍＬの培地で一晩培養し、プラスミドを分離した。上記のプラスミドを“ｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−△ＶＬ”と命名した。
【００４２】
上記プラスミドｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−△ＶＬを制限酵素ＢｓｐＥＩ／ＮｏｔＩで切断し、上記記載のように精製した。その後、４０μｇのｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−△ＶＬプラスミドを実施例３で用意された１０μｇのＶＬ ＰＣＲ ＤＮＡおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、米国）と混合し、２５℃で一晩反応させた。上記リガーゼ反応混合物を、キアゲンキットを用いて精製し、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅに電気穿孔法により形質転換させた。上記形質転換体をカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）およびテトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ）を含有する１００ｍＬの培地において３７℃で２時間培養した。そして、上記培地にＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）を接種し、１６時間培養してエンベルグ等（Ｅｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６、２８７−３１０、１９９６）で報告されたように、ファージライブラリを作製した。一方、上記大腸菌からプラスミドを分離して、“ｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−ＶＬ”と命名した。上記プラスミドの地図を図２に示している。
【００４３】
実施例５：ＨＢＶ表面抗原に結合する抗体の選別
ＨＢＶ表面抗原に結合する抗体をパンニング法（Ｅｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６、２８７−３１０、１９９６およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ、２４１、１９−２５、２０００； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ、２１、３８５−３９２、２００２）を応用して選別した。具体的に、ＨＢＶの表面抗原（緑十字社、韓国）をＰＢＳバッファーで希釈し、それぞれのイムノチューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ＮＵＮＣ社、デンマーク）を、上記希釈された抗原でコーティングした。そして、上記のコーティングされたイムノチューブに実施例４で製造したファージライブラリを添加し、３７℃で２時間培養した。ＨＢＶに結合するファージを、０．１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ２．０）を使用して溶出させた。以降、上記ファージで大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞を感染させヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）を添加した。上記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を一晩培養し、これにＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００および１５％ＮａＣｌ）を添加した。そして、沈殿したファージを回収して（ファージレスキュー）、上記ファージを再度ＨＢＶの表面抗原がコーティングされたイムノチューブと反応させて、上記過程を４回繰り返した。上記過程からＨＢＶの表面抗原に結合する３つのヒト抗体を選別し、これをＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９と命名した。ファージディスプレイライブラリを用いてヒト抗体を選別する過程を図３に示した。
【００４４】
４回のパンニングから得られた各コロニーを公知の方法（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、２４１、１９−２５、２０００）によって２ｍＬの培地で成長させ、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｂＤ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を処理して抗体発現を誘導した。抗体の発現をＨＢＶの表面抗原がコーティングされた９６−ウェルプレートを使用してＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により測定した。
【００４５】
実施例６：選別された抗体の配列分析
実施例５で選別されたヒト抗体ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５とＨＢ４８−５９を分泌するコロニーを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する１０ ｍＬのＬＢ培地で一晩培養した後、キアゲンプラスミドミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、米国）を使用して、プラスミドを分離した。上記のプラスミドをＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで切断した後、抗体の断片の挿入を確認するためにアガロースゲルで電気泳動を行った。プラスミドに挿入されたｓｃＦｖのＤＮＡ配列を分析した。ｓｃＦｖのヌクレオチド配列をＧｅｎｏｔｅｃｈ社（大田、韓国）にてシーケンスプライマである配列番号４０のｐ０３３で分析した。
【００４６】
ヒト抗体ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９のｓｃＦｖのＤＮＡ配列を、Ｗｅｂベースのプログラム（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ：ＤＮＡ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｅ ｔｏｏｌ）を使用して、アミノ酸に翻訳し、上記翻訳アミノ酸配列を図４に示した。図４に示すように、ヒト抗体ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９は、同一のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域および異なるアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域を持っていた。
【００４７】
実施例７：発現ベクターの製造
上記の抗体断片を完全な免疫グロブリンに転換させるために、抗体発現ベクターｐＲＣ１３およびｐＫＣ１２を使用した（韓国特許第５２３７３２号参照、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００５４）。
【００４８】
重鎖発現ベクターｐＲＣ１３は、抗体のＶＨ断片がＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩ部位内に簡単に挿入できるベクターである。図５に例示のように、本発明では、ヒト抗体ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５またはＨＢ４８−５９の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを配列番号４１（Ｆｏｒｗａｒｄ）および４２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）のプライマーを使用して、９５℃で１分、５５℃で２分、７２℃で２分の条件下で増幅させた後、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩで切断して、同じ制限酵素で切断されたｐＲＣ１３に挿入した。上記組換えベクターを、“ＨＢ４８−３３−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３”、“ＨＢ４８−３５−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３”または“ＨＢ４８−５９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３”と命名した（図５参照）。
【００４９】
一方、軽鎖発現ベクターｐＫＣ１２ベクターは抗体のＶＬ断片がＮｈｅＩおよびＡｐａＩ部位内に簡単に挿入できるベクターである。図６、図７および図８に示したように、ヒト抗体ＨＢ４８−３５とＨＢ４８−５９とのｋ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを配列番号４３（Ｆｏｒｗａｒｄ）および４４（Ｒｅｖｅｒｓｅ）のプライマーを使用して、９５℃で１分、５５℃で２分、７２℃で２分の条件下で増幅させ、ヒト抗体ＨＢ４８−３３のλ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを配列番号４３（Ｆｏｒｗａｒｄ）および４５（Ｒｅｖｅｒｓｅ）のプライマーを使用して９５℃で１分、５５℃で２分、７２℃で２分の条件下で増幅させた。上記増幅されたＤＮＡをＮｈｅＩ／ＡｐａＩで切断し、同じ制限酵素で切断されたＰＫＣ１２内に挿入した。上記組換えベクターを、それぞれ“ＨＢ４８−３３−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２”、“ＨＢ４８−３５−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２”および“ＨＢ４８−５９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２”と命名した（図６、図７および図８を参照）。
【００５０】
実施例８：抗体分泌動物細胞株の製造
形質感染２４時間前に、２×１０５個のＣＨＯ（ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞を１０％のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を含有するα−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）が入ったＴ−２５フラスコ（ＮＵＮＣ社、デンマーク）で、培養密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が５０％に到達する直前まで、５％ＣＯ２の存在下で、３７℃のインキュベーターで培養した。その後、３０μｇのリポペクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）に入れて常温で９０分間放置した。同時に、８μｇのＨＢ４８−３３−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３および７μｇのＨＢ４８−３３−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２、８μｇのＨＢ４８−３５−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３および７μｇのＨＢ４８−３５−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２、８μｇのＨＢ４８−５９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３および７μｇのＨＢ４８−５９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２をそれぞれ混合し、１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに入れてから、常温で９０分間放置した。９０分後、リポペクチンを含有する培地をＨＢ４８−３３−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３＆ＨＢ４８−３３−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２、ＨＢ４８−３５−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３＆ＨＢ４８−３５−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２、およびＨＢ４８−５９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３＆ＨＢ４８−５９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２を含有する培地と混合した後、１５分間室温で反応させた。反応させる間に、上記細胞から培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。上記洗浄された細胞に上記の反応混合物を入れて６時間培養した。６時間後、上記反応混合物を除去し、α−ＭＥＭ培地を入れて４８時間培養した。そして、上記細胞をトリプシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）で処理してフラスコから外した後、α−ＭＥＭ培地で希釈し、９６−ウェルプレート（ＮＵＮＣ社、デンマーク）に継代した。このとき、α−ＭＥＭ培地はリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含有していないのに対し、１０％の透析されたＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）および５５０μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ社、米国）を含有する。２日ごとに上記培地を新しい培地に交換した。ＥＬＩＳＡ分析のために、コロニーを形成した培養上清を回収し、選別された細胞を１２−ウェルプレートに移した。細胞が１２−ウェルプレートでよく育てば、細胞を６−ウェルプレートに移して、細胞が６−ウェルプレートでもよく育つと、これにメトトレキサート（ＭＴＸ、中外製薬、韓国）を処理した。ＭＴＸの初期濃度は２０ｎＭであり、細胞の適応に応じて、８０ｎＭ、３２０ｎＭおよび１μＭで増加した。１μＭの濃度で生存して高い量の抗体分泌を持つ細胞株を選別した。上記選別された細胞株を、スピナーフラスコと無血清培地とを使用して６５ｒｐｍ、５％ＣＯ２および３７℃のインキュベーターで大量に培養した。１００ｍＬの無血清培地が入った２５０ｍＬフラスコで１０８細胞を培養した。細胞数が初期濃度の２倍になると、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収した。上記回収した細胞を再び２００ｍＬの培地が入った５００ｍＬフラスコで培養した。細胞数が初期濃度の２倍になると、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収し、１Ｌの培地が入った３Ｌスピナーフラスコに移した。ブチル酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）を最終濃度２ｍＭになるように添加し、上記細胞を５日間培養した後、培地から上清を回収した。スピナーフラスコから回収した上清から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−アガロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、米国）を使用して抗体を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００５１】
図９に示すように、約５０ｋＤａの重鎖と２５ｋＤａの軽鎖とのバンドが観察され、これは抗体が正確に合成されたことを示す。
【００５２】
実施例９：抗体の親和性の測定
実施例８で得られた抗体のＨＢＶ表面抗原に対する親和性を競合ＥＬＩＳＡ法（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２０、２６５−２７２、２００１）により決定し、上記の結果を図１０に示した。簡略な手順は次のとおりである。
【００５３】
（１）適正抗体濃度の決定
Ａ．プレートの準備
ＰＢＳ中で２μｇ／ｍＬで希釈された、１００μＬのＨＢＶ表面抗原（緑十字社、韓国）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れ、４℃で一晩培養した。プレートの各ウェルをＰＢＳＴで１回洗浄し、各ウェルに３００μＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加えた後、室温で１時間培養した。
【００５４】
Ｂ．１次反応
１００μＬのそれぞれ精製された抗体（０．５μｇ／ｍＬ）をプレートの各ウェルに入れ、室温で２時間反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００５５】
Ｃ．２次反応
１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：５，０００に希釈された１００μＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）−パーオキシダーゼ接合体（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、室温で１時間培養した後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００５６】
Ｄ．基質反応
１００μＬのＴＭＢ（３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、マイクロウェル パーオキシダーゼ サブストレート システム（ＫＰＬ、ＭＤ、米国））を各ウェルに添加した後、４０５ｎｍでＯ．Ｄ値を測定した。抗体の適正濃度を半分−最大結合値（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す抗体濃度として決定した。
【００５７】
（２）競合ＥＬＩＳＡ
Ａ．プレートの準備
ＰＢＳ中で２μｇ／ｍＬで希釈された、１００μＬのＨＢＶ表面抗原（緑十字社、韓国）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れ、４℃で一晩培養した。各ウェルをＰＢＳＴで１回洗浄し、各ウェルに３００μＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加えた後、室温で１時間培養した。
【００５８】
Ｂ．１次反応
２μｇのＨＢＶ表面抗原を２の倍数で連続希釈し、プレートの各ウェルに１０μＬの上記希釈されたＨＢｓＡｇを添加した。それから、（１）で決定された適正濃度に希釈した９０μＬの抗体を各ウェルに添加し、室温で２時間反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００５９】
Ｃ．２次反応
ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）−パーオキシダーゼ接合体（Ｓｉｇｍａ）１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で５，０００倍に希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加し、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００６０】
１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：５，０００に希釈された、１００μＬのヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）−パーオキシダーゼ接合体（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、室温で１時間培養した後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００６１】
Ｄ．基質反応
ＴＭＢ（３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、マイクロウェルパーオキシダーゼサブストレートシステム（ＫＰＬ、ＭＤ、米国））溶液を１００μＬずつ各ウェルに添加した後、４０５ｎｍでＯ．Ｄ値を測定した。最大結合値（競合する上皮成長因子受容体がない状態のＥＬＩＳＡ Ｏ．Ｄ値）の５０％を阻害するＨＢＶ表面抗原の濃度を親和性（Ｋｄ）で算定した。
【００６２】
１００μＬのＴＭＢ（３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、マイクロウェルパーオキシダーゼサブストレートシステム（ＫＰＬ、ＭＤ、米国））を各ウェルに添加した後、４０５ｎｍでＯ．Ｄ値を測定した。最大結合値（競合するＥＧＦＲが存在しないＯ．Ｄ値）の５０％を阻害するＨＢｓＡＧの濃度をＫｄに決定した。
【００６３】
図１０に示すように、ＨＢ４８−３５の親和性が、本発明のヒト抗体の中で最も高く、これに対してＨＢ４８−５９とＨＢ４８−３３の親和性は、ＨＢ４８−３５に比べてそれぞれ約１．３倍および４．０倍低かった。
【００６４】
実施例１０：急性Ｂ型肝炎のマウスモデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏの効果テスト
急性Ｂ型肝炎の類似兆候を示すように流体力学注入法（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によってＨＢＶ ＤＮＡを注入して製造したＣ５７ＢＬ６マウスモデルにおいて、ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９のＨＢｓＡｇに対する中和能を比較した。
【００６５】
４週齢の約２０ｇの体重の２０匹のＣ５７ＢＬ６マウスをチャールズリバー研究所（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入して、表１に示すように５匹ずつ４群に分けた。
【００６６】
【表１】
【００６７】
ＨＢＶ ＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）内に挿入して製造した２０μｇのベクターｐＨＢＶ−ＭＢＲＩ（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１９、１４６−１５３、２００６；図１１を参照）をすべてのマウスにマウスの尾静脈を介して体重の９．５％の体積で、０．３ｍＬ／ｍｉｎの速度で注射して急性Ｂ型肝炎を誘発した。２４時間後、表１に列挙された試験物質０．２ｍＬをマウスの尾静脈を介して注射した。注射前（０時間）、注射後２４時間および注射後４８時間で血清を分離した。上記の分離された血清をヤギ血清（ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）で１０倍希釈した後、Ｇｅｎｅｄｉａ ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡ３．０（緑十字社 ＭＳ、韓国）を使用して、ＨＢｓＡｇの血中濃度を測定し、上記の結果を図１２に示した。図１２に示すように、ＰＢＳを静脈注射した対照群において、４８時間ＨＢｓＡｇの血中濃度がピークに保持された。これに対し、０．１ｍｇ ＨＢ４８−３３（実験群Ｉ）、０．１ｍｇ ＨＢ４８−３５（実験群ＩＩ）および０．１ｍｇ ＨＢ４８−５９（実験群ＩＩＩ）で処理された郡で、２４時間〜４８時間の間ＨＢｓＡｇの血中濃度が検出されなかった。したがって、本発明の抗体は、ＨＢＶの表面抗原を中和させるのに非常に有効であることが確認された。
【００６８】
本発明は、上記特定の実施例と関連して説明されたにもかかわらず、本技術分野の熟練者により、本発明の様々な変形および変化が行えることと認識されるべきであり、これはまた添付の請求項によって定義されるような本発明の範囲に属する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｓＡｇ）に特異的に結合する抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのメンバーであり、急性および慢性肝炎を引き起こす。世界の人口のうち、約３．５億人、特に韓国および中国では人口の５％〜８％が慢性ＨＢＶ感染者であり、ＨＢＶは肝疾患や肝臓がんの主な原因である。ＨＢＶに対するワクチンの開発でＢ型肝炎を予防することが可能になったが、未だ多くの人々がＨＢＶ感染による慢性肝炎に苦しんでいる。ＨＢＶ感染は、肝炎、肝硬変だけでなく、肝臓がんを誘発し、慢性感染症の患者における肝臓がんの発生頻度が健常者よりも３００倍高い。ＷＨＯ（世界保健機構）は、肝臓がんの約８０％がＨＢＶ感染による慢性Ｂ型肝炎から始まると報告した。
【０００３】
現在利用可能なＢ型肝炎の治療薬は、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）とアデフォビル・ジピボキシル（ａｄｅｆｏｖｉｒ ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ）などのヌクレオシド類似体（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）を含んでおり、これらはＨＢＶポリメラーゼを阻害することが知られている。しかし、３年間投与後、７５％の患者において耐性ウイルスが発生して治療効果を低減させるので、これらは垂直感染や肝移植後の感染症を予防するために、Ｂ型肝炎の抗体製剤と組み合わせて使用されている。
【０００４】
現在使用されているＢ型肝炎の抗体製剤は、抗ＨＢＶ抗体を持つヒト血液源から高度の精製法およびウイルス不活性化法を用いて製造されているが、高い抗ＨＢＶ抗体を持つ高価なヒト血漿の利用可能性が低いだけではなく、ヒト血漿−由来のウイルスを不活性化するコストが高いので、上記の方法は、増加する需要に対処することができない。
【０００５】
ケーラーとミルシュタイン（１９７５）によってモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｍＡｂ）の製造技術が確立されてから、マウス由来のモノクローナル抗体は、診断用や一部の治療のために主に使われてきた。しかし、マウス抗体は、治療目的のために人体に適用する際のヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を生成する可能性があるため、投与することができない。ＨＡＭＡの問題を解決するために、キメリク抗体とヒト化抗体が開発されてきた。キメリク抗体は、抗体分子全体の〜３０％を構成するマウスｍＡｂの可変領域（Ｆｖフラグメント）を含有する。これに対し、ヒト化抗体は、抗体分子全体の〜１０％を構成するマウスｍＡｂのＣＤＲ（相補性決定領域）を含有する。上記キメリクおよびヒト化抗体は、ＨＡＭＡ反応を大幅に減少させてはいるが、長期間および継続的な投与を要する慢性肝炎のような慢性疾患の治療にはヒト抗体を使用する方がよいと思われる。
【０００６】
本願発明者らは、新規で改良された抗体を開発しようと努力しており、上記の抗体がＨＢＶ表面抗原に結合してＨＢＶを不活性化するのに使用できることを確認した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原に特異的に結合する新規の抗体を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、上記抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれコードするＤＮＡおよびそれを含む発現ベクターを提供することである。
【０００９】
本発明のまた他の目的は、上記発現ベクターに形質転換された細胞株を提供することである。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、上記抗体を含むＢ型肝炎の予防または治療用薬学組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一つの態様により、ａ）配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、ｂ）配列番号２、３、および４のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域、ｃ）重鎖定常領域、およびｄ）軽鎖定常領域を含んでいる、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に特異的に結合する抗体が提供される。
【００１２】
本発明の他の態様により、配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域をコードするＤＮＡまたは配列番号２、３、および４のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡおよびそれを含む発現ベクターが提供される。
【００１３】
本発明の別の態様により、上記発現ベクターに形質転換された細胞株が提供される。
【００１４】
本発明のまた別の態様により、上記抗体を含むＢ型肝炎の予防または治療用組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明の上記及びその他の目的と特徴は、添付の図面とともに考慮されるときに下記説明により明確になるもので、以下の通りである。
【図１】図１は、ＰＣＲによって合成された本発明の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）をそれぞれコードするＤＮＡを示す電気泳動（１％アガロースゲル）の分析の写真結果である。
【図２】図２は、本発明の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、ファージディスプレイベクターｐＫＳ４Ｈの地図である。
【図３】図３は、パンニング法を利用して、抗体ライブラリから抗体を選別する工程を示した図である。
【図４】図４は、抗体ライブラリから選別された本発明の抗体の一本鎖可変断片（ＳｃＦＶ）のアミノ酸配列である。
【図５】図５は、本発明のヒト抗体の重鎖を発現するための発現ベクター、ＨＢ４８−３３−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３、ＨＢ４８−３５−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３またはＨＢ４８−５９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３の地図である。
【図６】図６は、本発明のヒト抗体の軽鎖を発現するための発現ベクター、ＨＢ４８−３３−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２の地図である。
【図７】図７は、本発明のヒト抗体の軽鎖を発現するための発現ベクター、ＨＢ４８−３５−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２の地図である。
【図８】図８は、本発明のヒト抗体の軽鎖を発現するための発現ベクター、ＨＢ４８−５９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２の地図である。
【図９】図９は、形質転換体から発現された重鎖および軽鎖のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図１０】図１０は、ヒト抗体（ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９）のＨＢＶ表面抗原に対する相対的親和性である。
【図１１】図１１は、急性Ｂ型肝炎のマウスモデルの製造に使用された、ｐｃＤＮＡ３．１にＨＢＶ ＤＮＡ配列を挿入して製造されたベクターｐＨＢＶ１．３−ＭＢＲＩの地図である。
【図１２】図１２は、急性Ｂ型肝炎のマウスモデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏの効果試験によって選別された本発明のヒト抗体ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５とＨＢ４８−５９の中和能を示すグラフである。図１１のプラスミドを注入して２４時間後、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が発現したことを確認し、本発明の抗体の投与により、表面抗原が減少したことを確認した。表面抗原は、Ｇｅｎｅｄｉａ ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡ ３．０（緑十字社 ＭＳ、韓国）で測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、ａ）配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、ｂ）配列番号２、３、および４のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域、ｃ）重鎖定常領域、およびｄ）軽鎖定常領域を含んでいる、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に特異的に結合してＨＢＶを不活性化させることによってＢ型肝炎の予防または治療に効果を有することを特徴とする。
【００１８】
上記ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合する抗体は、好ましくは、ファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８、１３１５−１３１７、１９８５およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｃｈａｍｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、２１、３７１−３７８、２０００）を応用して選別することができる。上記のファージディスプレイ法では、フィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）ファージ（例えば、Ｍ１３、Ｆｄ、またはＦ１）の表面タンパク質をコードする遺伝子（ｇｅｎｅ ＩＩＩ）が、目的の抗体をコードする遺伝子と融合され、表面に露出した融合抗体を持つ抗体−ファージ型のウイルス粒子を生成させる。その後、抗体の高い特異性および親和性、並びにファージの高い感染性を利用してバイオパンニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）技術によってファージライブラリから目的とする抗体が選別できる（Ｂｕｒｔｏｎ＆Ｂａｒｂａｓ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５７、１９１−２８０、１９９４、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２、４３３−４５５、１９９４、およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４、１−２０、１９９８、 Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ、２１、 ３８５−３９２、２００２）。上記ファージディスプレイベクターは、ｐＫＳ４Ｈ（韓国特許第０６３５３７０号を参照）またはｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、好ましくはｐＫＳ４Ｈである場合もある。
【００１９】
本発明者らは、ファージライブラリから３つのヒト抗体（ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９）を選別した後、ＨＢＶ表面抗原に対する抗体の親和性と中和能を調べた（図１０および１１）。また、重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を分析した結果、すべての重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を持ち、軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号２，３、および４のアミノ酸配列を持つことを確認した。
【００２０】
本発明の抗体の重鎖および軽鎖の不変領域はヒト抗体のものと同一であってもよい。
【００２１】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を持つ抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、上記ＤＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号５のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００２２】
本発明は、配列番号２、３および４のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、上記ＤＮＡは、それぞれ配列番号２，３、および４のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする配列番号６、７および８のいずれか１つのヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００２３】
本発明は、上記抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含んでいる、ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を発現するための発現ベクターを提供する。好ましくは、上記発現ベクターは、図５に地図で示した“ＨＢ４８−３３−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３”、“ＨＢ４８−３５−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３”または“ＨＢ４８−５９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３”であってもよい。
【００２４】
具体的に、上記ベクターは、パンニング過程によって選別された抗体のＶＨ断片（ＨＢ４８ＶＨ）を適切なベクター、例えば、ｐＲＣ１３ベクター（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００５４、大韓民国特許第５２３７３２号を参照）に挿入して製造されることができる。
【００２５】
本発明は、上記抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含んでいる、ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現するための発現ベクターを提供する。好ましくは、上記ベクターは、図６に地図で示した“ＨＢ４８−３３−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１３”、図７に地図で示した“ＨＢ４８−３５−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１３”または図８に地図で示した“ＨＢ４８−５９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１３”であってよい。
【００２６】
具体的に、上記ベクターは、パンニング過程によって選別された抗体のＶＬ断片（ＨＢ４８−３３ＶＬ、ＨＢ４８−３５ＶＬまたはＨＢ４８−５９ＶＬ）を適切なベクター、例えば、ｐＫＣ１２ベクター（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００５４、大韓民国特許第５２３７３２号を参照）に挿入して製造することができる。
【００２７】
本発明は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を発現するための発現ベクターに形質転換された動物細胞株を提供する。上記動物細胞株は、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）、ＨＥＫ ２９３、またはＮＳＯ細胞株、好ましくはＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞株でもよい。
【００２８】
本発明に係る抗体は、上記重鎖および軽鎖の可変領域が互に結合することで製造することができる。
【００２９】
抗原に対する本発明の抗体の親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）は、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２０、２６５−２７２、２００１）によって測定することができる。図１０に示すように、本発明のヒト抗体の中でＨＢ４８−３５の親和性が最も高かったのに対し、ＨＢ４８−５９およびＨＢ４８−３３の親和性は、ＨＢ４８−３５に比べてそれぞれ約１．３倍と４．０倍低かった。また、Ｂ型肝炎と類似の兆候を誘導するために、Ｃ５７ＢＬ６マウス内にＨＢＶ ＤＮＡを流体力学注入（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、６、１２５８−１２６６、１９９９）して製造したＨＢＶマウスモデルにおいて、ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９抗体は、マウスの血液から、上記抗体によりＨＢＶの表面抗原が基底レベルまで減少したＨＢＶの中和能を示した（図１２）。したがって、本発明の抗体は、ＨＢＶの表面抗原に結合してＨＢＶを不活性化させることによって、Ｂ型肝炎を予防または治療するために使用することができる。
【００３０】
上記の結果から本発明は、前記抗体を含むＢ型肝炎の予防または治療用薬学組成物を提供する。本発明の組成物は、通常の方法に応じて、薬学製剤に製造することができる。剤型の製造において、上記抗体は、好ましくは、担体と混合したり、担体で希釈されたり、容器の形態でもよい担体内に組み込まれる。担体が希釈剤として使用される場合、これは抗体に対する小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）、賦形剤または媒質（ｍｅｄｉｕｍ）として作用する固形、半固形または液状であってもよい。したがって、剤型は錠剤、丸剤、粉剤、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、カシェ（ｃａｃｈｅｔ）、エリクシール（ｅｌｉｘｉｒ）、懸濁剤、乳剤、溶液剤、シロップ剤、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル剤、滅菌注射溶液、滅菌粉剤などの形を取ることができる。適切な担体、賦形剤および希釈剤の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエイト、プロフィールヒドロキシベンゾエイト、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を挙げることができる。剤型は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。本発明の抗体組成物は、上記抗体とともに、抗ウイルス剤として、インターフェロン、抗ＨＢＶモノクローナル抗体、抗ＨＢＶポリクローナル抗体、ヌクレオシド類似体、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ製剤または治療用ワクチンをさらに含むことができる。
【００３１】
ＨＢＶ感染およびＨＢＶ関連の疾病は、本発明の組成物を、人間を含む哺乳動物に投与することで、予防または治療することができる。上記組成物内の抗体の投与量は、対象、疾病状態の重症度、投与速度、および医師の判断に左右され得る。有効成分として、上記抗体は、単一容量または分割用量で、一日に約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重範囲の有効量で経口以外の経路を介して哺乳動物に投与することができる。場合によっては、上記の投与量に比べて少ないかまたは多い量が投与量として適切であり、多量の投与量は、一日あたりに分割された少ない投与量で投与することができる。
【００３２】
以下の実施例は、単に例示の目的で提供され、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００３３】
実施例１：ＲＮＡの分離
ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合する抗体を選別するために、ヒト抗体ライブラリを構築した。ヒト骨髄、ヒト胸腺、ヒト脾臓およびヒトＢ細胞から得られたＲＮＡの混合物を使用した。ヒトＢ細胞ＲＮＡを除くすべてのＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ社（米国）から購入し、ヒトＢ細胞ＲＮＡは下記のように分離した。
【００３４】
健康な成人から採血した５０ｍＬの血液を５０ｍＬのＰＢＳと混合し希釈した。３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）を１５ｍＬチューブに入れ、ここに上記の希釈血液４ｍＬを添加した。上記混合物を３，０００ｒｐｍで遠心分離して白血球を分離した。上記分離した白血球２ｍＬを６ｍＬのＰＢＳと混合し、１００ｘｇで１０分間遠心分離した。上記の白血球１００μＬを１ｍＬのトリゾール（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国）と混合してＲＮＡを分離した。
【００３５】
一方、上記分離されたＲＮＡを蒸留水で希釈した後、２６０ｎｍで吸光度を測定し、その量を計算した（１．８μｇ／μＬ、フルスペクトル２０００ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計、ＧＥ、米国）。詳細な手順は次のとおりである。
【００３６】
１ｍＬのトリゾールを１００μＬの白血球に添加してよく混ぜた後、常温（１５℃〜３０℃）で５分間放置した。そして、クロロホルム２００μＬを添加して１５秒間よくかき混ぜてから、常温で３分間放置した。その後、上記混合物を２℃〜８℃、１５分および１５，０００ｒｐｍの条件の下で遠心分離し、上清液を新しいチューブに移した。イソプロピルアルコール５００μＬを加えてよく混合した後、室温で１０分間放置した。そして、上記混合物を２℃〜８℃および１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去した。これに７５％エタノール１ｍＬを添加し、上記混合物を２℃〜８℃、５分間、１５，０００ｒｐｍの条件下で遠心分離しエタノールを除去した後、ＲＮＡペレットを常温で５分間乾燥させた。これに蒸留水１５０μＬを添加してＲＮＡを溶解させた後、２６０ｎｍにて上記懸濁液の吸光度を測定した。残りは−２０℃で保管した。
【００３７】
実施例２：抗体遺伝子の増幅
実施例１で分離したＲＮＡ１μｇおよびｐｄ（Ｔ）１２〜１８（０．５μｇ／μＬ）１μＬを蒸留水と混合して最終体積を１２．５μＬに合わせた。上記混合物を７０℃で２分間反応させ氷で冷却させた。その後、これに５Ｘ反応緩衝液、１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、組換えＲＮａｓｅ阻害剤およびＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）を添加して最終体積を２０μＬに合わせた後、４２℃で１時間、９５℃で５分間反応させてｃＤＮＡを合成した。ＬｉｑｕｉＭｉｘ ＱＭ Ｐｒｅｍｉｘ、Ｍａｇｅｎｔａ（Ｎｅｕｒｏｔｉｃｓ Ｉｎｃ、韓国）、鋳型として４μＬのｃＤＮＡ、１９μＬの蒸留水並びにそれぞれｓｃＦｖ領域（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）、重鎖可変領域、および軽鎖可変領域（ｋａｐｐａおよびｌａｍｂｄａ）のために考案された１μＬ（２５ｐｍｏｌ／μＬ）のプライマー［ＳｃＦｖ：配列番号９（Ｆｏｒｗａｒｄ）、１０（Ｒｅｖｅｒｓｅ−κ）および１１（Ｒｅｖｅｒｓｅ−λ）；重鎖可変領域：配列番号１２（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ１）、１３（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ２）、１４（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ３）、１５（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ４）、１６（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ５）、１７（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ６）、１８（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＨ７）および１９（Ｒｅｖｅｒｓｅ）；軽鎖可変領域κ鎖：配列番号２０（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＫ１／３Ａ）、２１（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＫ１／３Ｂ）、２２（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＫ２）、２３（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＫ４）、２４（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＫ５）、２５（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＫ６）、２６（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＪＫ−Ａ）、２７（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＪＫ−Ｂ）および２８（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＪＫ−Ｃ）；軽鎖可変領域λ鎖：配列番号２９（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ１〜３−Ａ）、３０（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ１〜３−Ｂ）、３１（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ４）、３２（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ５）、３３（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ６）、３４（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ７）、３５（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ８）、３６（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ９）、３７（Ｆｏｒｗａｒｄ−ＶＬ１０）、３８（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＪＬ−Ａ）および３９（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＪＬ−Ｂ）］を使用してＰＣＲ反応を行った。
【００３８】
ＰＣＲ反応は、９５℃で５分、９５℃で１分、５５℃で２分、７２℃で２分間を３０回反応させた後、最後に７２℃で１５分間反応させて行われた。
【００３９】
上記増幅された抗体ＤＮＡを１．２％アガロースゲルにおいて電気泳動によって確認し（図１参照）、キアゲンキット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を用いて精製した。図１に示すように、重鎖および軽鎖（ｋａｐｐａおよびｌａｍｂｄａ）の可変領域に対応する１，３５０ｂｐのＤＮＡバンドが得られた。図１においてＭは、サイズマーカー、ＶＨは重鎖可変領域（レーン１：重鎖可変領域タイプＩ、レーン２：重鎖可変領域タイプＩＩ、レーン３：重鎖可変領域タイプＩＩＩ、レーン４：重鎖可変領域タイプＩＶ；レーン５：重鎖可変領域タイプＶ、レーン６：重鎖可変領域タイプＶＩ、およびレーン７：重鎖可変領域タイプＶＩＩ）、およびＶＬは、軽鎖可変領域（レーン９：軽鎖可変領域１／３κ、レーン１０：軽鎖可変領域２κ、レーン１１：軽鎖可変領域４κ、レーン１２：軽鎖可変領域５κ、およびレーン１３：軽鎖可変領域６κ、レーン１５：軽鎖可変領域１λ〜３λ、レーン１６：軽鎖可変領域４λ、レーン１７：軽鎖可変領域５λ、レーン１８：軽鎖可変領域６λ、レーン１９：軽鎖可変領域７λ、レーン２０：軽鎖可変領域８λ、レーン２１：軽鎖可変領域９λおよびレーン２２：軽鎖可変領域１０λ）を指す。
【００４０】
実施例３：抗体ＤＮＡの制限酵素切断
実施例２で準備したＶＨおよびＶＬをそれぞれ制限酵素ＳｆｉＩ／ＢｓｐＥＩおよびＢｓｐＥＩ／ＮｏｔＩで切断し、上記切断した断片を１．２％のアガロースゲル電気泳動で分離した後、キアゲンキットを用いて精製した。
【００４１】
実施例４：抗体ＤＮＡのライゲーションおよびライブラリの製造
ファージディスプレイベクターｐＫＳ４Ｈ（緑十字社、韓国、韓国特許第６３５３７０号参照）を制限酵素ＳｆｉＩ／ＢｓｐＥＩを使用して切断し、１．２％アガロースゲル電気泳動を利用して分離した後、キアゲンキットを利用して精製した。４０μｇのｐＫＳ４Ｈを実施例３で用意された１０μｇのＶＨと混合し、これにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、米国）を添加した後、２５℃で一晩中反応させた。上記リガーゼ反応混合物を、キアゲンキットを用いて精製し、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により形質転換させた。上記形質転換体を、１００ｍＬの培地で一晩培養し、プラスミドを分離した。上記のプラスミドを“ｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−△ＶＬ”と命名した。
【００４２】
上記プラスミドｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−△ＶＬを制限酵素ＢｓｐＥＩ／ＮｏｔＩで切断し、上記記載のように精製した。その後、４０μｇのｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−△ＶＬプラスミドを実施例３で用意された１０μｇのＶＬ ＰＣＲ ＤＮＡおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、米国）と混合し、２５℃で一晩反応させた。上記リガーゼ反応混合物を、キアゲンキットを用いて精製し、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅに電気穿孔法により形質転換させた。上記形質転換体をカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）およびテトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ）を含有する１００ｍＬの培地において３７℃で２時間培養した。そして、上記培地にＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）を接種し、１６時間培養してエンベルグ等（Ｅｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６、２８７−３１０、１９９６）で報告されたように、ファージライブラリを作製した。一方、上記大腸菌からプラスミドを分離して、“ｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−ＶＬ”と命名した。上記プラスミドの地図を図２に示している。
【００４３】
実施例５：ＨＢＶ表面抗原に結合する抗体の選別
ＨＢＶ表面抗原に結合する抗体をパンニング法（Ｅｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６、２８７−３１０、１９９６およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ、２４１、１９−２５、２０００； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ、２１、３８５−３９２、２００２）を応用して選別した。具体的に、ＨＢＶの表面抗原（緑十字社、韓国）をＰＢＳバッファーで希釈し、それぞれのイムノチューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ＮＵＮＣ社、デンマーク）を、上記希釈された抗原でコーティングした。そして、上記のコーティングされたイムノチューブに実施例４で製造したファージライブラリを添加し、３７℃で２時間培養した。ＨＢＶに結合するファージを、０．１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ２．０）を使用して溶出させた。以降、上記ファージで大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞を感染させヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）を添加した。上記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を一晩培養し、これにＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００および１５％ＮａＣｌ）を添加した。そして、沈殿したファージを回収して（ファージレスキュー）、上記ファージを再度ＨＢＶの表面抗原がコーティングされたイムノチューブと反応させて、上記過程を４回繰り返した。上記過程からＨＢＶの表面抗原に結合する３つのヒト抗体を選別し、これをＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９と命名した。ファージディスプレイライブラリを用いてヒト抗体を選別する過程を図３に示した。
【００４４】
４回のパンニングから得られた各コロニーを公知の方法（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、２４１、１９−２５、２０００）によって２ｍＬの培地で成長させ、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｂＤ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を処理して抗体発現を誘導した。抗体の発現をＨＢＶの表面抗原がコーティングされた９６−ウェルプレートを使用してＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により測定した。
【００４５】
実施例６：選別された抗体の配列分析
実施例５で選別されたヒト抗体ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５とＨＢ４８−５９を分泌するコロニーを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する１０ ｍＬのＬＢ培地で一晩培養した後、キアゲンプラスミドミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、米国）を使用して、プラスミドを分離した。上記のプラスミドをＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで切断した後、抗体の断片の挿入を確認するためにアガロースゲルで電気泳動を行った。プラスミドに挿入されたｓｃＦｖのＤＮＡ配列を分析した。ｓｃＦｖのヌクレオチド配列をＧｅｎｏｔｅｃｈ社（大田、韓国）にてシーケンスプライマである配列番号４０のｐ０３３で分析した。
【００４６】
ヒト抗体ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９のｓｃＦｖのＤＮＡ配列を、Ｗｅｂベースのプログラム（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ：ＤＮＡ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｅ ｔｏｏｌ）を使用して、アミノ酸に翻訳し、上記翻訳アミノ酸配列を図４に示した。図４に示すように、ヒト抗体ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９は、同一のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域および異なるアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域を持っていた。
【００４７】
実施例７：発現ベクターの製造
上記の抗体断片を完全な免疫グロブリンに転換させるために、抗体発現ベクターｐＲＣ１３およびｐＫＣ１２を使用した（韓国特許第５２３７３２号参照、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００５４）。
【００４８】
重鎖発現ベクターｐＲＣ１３は、抗体のＶＨ断片がＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩ部位内に簡単に挿入できるベクターである。図５に例示のように、本発明では、ヒト抗体ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５またはＨＢ４８−５９の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを配列番号４１（Ｆｏｒｗａｒｄ）および４２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）のプライマーを使用して、９５℃で１分、５５℃で２分、７２℃で２分の条件下で増幅させた後、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩで切断して、同じ制限酵素で切断されたｐＲＣ１３に挿入した。上記組換えベクターを、“ＨＢ４８−３３−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３”、“ＨＢ４８−３５−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３”または“ＨＢ４８−５９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３”と命名した（図５参照）。
【００４９】
一方、軽鎖発現ベクターｐＫＣ１２ベクターは抗体のＶＬ断片がＮｈｅＩおよびＡｐａＩ部位内に簡単に挿入できるベクターである。図６、図７および図８に示したように、ヒト抗体ＨＢ４８−３５とＨＢ４８−５９とのｋ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを配列番号４３（Ｆｏｒｗａｒｄ）および４４（Ｒｅｖｅｒｓｅ）のプライマーを使用して、９５℃で１分、５５℃で２分、７２℃で２分の条件下で増幅させ、ヒト抗体ＨＢ４８−３３のλ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを配列番号４３（Ｆｏｒｗａｒｄ）および４５（Ｒｅｖｅｒｓｅ）のプライマーを使用して９５℃で１分、５５℃で２分、７２℃で２分の条件下で増幅させた。上記増幅されたＤＮＡをＮｈｅＩ／ＡｐａＩで切断し、同じ制限酵素で切断されたＰＫＣ１２内に挿入した。上記組換えベクターを、それぞれ“ＨＢ４８−３３−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２”、“ＨＢ４８−３５−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２”および“ＨＢ４８−５９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２”と命名した（図６、図７および図８を参照）。
【００５０】
実施例８：抗体分泌動物細胞株の製造
形質感染２４時間前に、２×１０５個のＣＨＯ（ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞を１０％のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を含有するα−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）が入ったＴ−２５フラスコ（ＮＵＮＣ社、デンマーク）で、培養密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が５０％に到達する直前まで、５％ＣＯ２の存在下で、３７℃のインキュベーターで培養した。その後、３０μｇのリポペクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）に入れて常温で９０分間放置した。同時に、８μｇのＨＢ４８−３３−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３および７μｇのＨＢ４８−３３−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２、８μｇのＨＢ４８−３５−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３および７μｇのＨＢ４８−３５−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２、８μｇのＨＢ４８−５９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３および７μｇのＨＢ４８−５９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２をそれぞれ混合し、１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに入れてから、常温で９０分間放置した。９０分後、リポペクチンを含有する培地をＨＢ４８−３３−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３＆ＨＢ４８−３３−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２、ＨＢ４８−３５−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３＆ＨＢ４８−３５−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２、およびＨＢ４８−５９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３＆ＨＢ４８−５９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２を含有する培地と混合した後、１５分間室温で反応させた。反応させる間に、上記細胞から培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。上記洗浄された細胞に上記の反応混合物を入れて６時間培養した。６時間後、上記反応混合物を除去し、α−ＭＥＭ培地を入れて４８時間培養した。そして、上記細胞をトリプシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）で処理してフラスコから外した後、α−ＭＥＭ培地で希釈し、９６−ウェルプレート（ＮＵＮＣ社、デンマーク）に継代した。このとき、α−ＭＥＭ培地はリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含有していないのに対し、１０％の透析されたＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）および５５０μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ社、米国）を含有する。２日ごとに上記培地を新しい培地に交換した。ＥＬＩＳＡ分析のために、コロニーを形成した培養上清を回収し、選別された細胞を１２−ウェルプレートに移した。細胞が１２−ウェルプレートでよく育てば、細胞を６−ウェルプレートに移して、細胞が６−ウェルプレートでもよく育つと、これにメトトレキサート（ＭＴＸ、中外製薬、韓国）を処理した。ＭＴＸの初期濃度は２０ｎＭであり、細胞の適応に応じて、８０ｎＭ、３２０ｎＭおよび１μＭで増加した。１μＭの濃度で生存して高い量の抗体分泌を持つ細胞株を選別した。上記選別された細胞株を、スピナーフラスコと無血清培地とを使用して６５ｒｐｍ、５％ＣＯ２および３７℃のインキュベーターで大量に培養した。１００ｍＬの無血清培地が入った２５０ｍＬフラスコで１０８細胞を培養した。細胞数が初期濃度の２倍になると、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収した。上記回収した細胞を再び２００ｍＬの培地が入った５００ｍＬフラスコで培養した。細胞数が初期濃度の２倍になると、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収し、１Ｌの培地が入った３Ｌスピナーフラスコに移した。ブチル酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）を最終濃度２ｍＭになるように添加し、上記細胞を５日間培養した後、培地から上清を回収した。スピナーフラスコから回収した上清から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−アガロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、米国）を使用して抗体を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００５１】
図９に示すように、約５０ｋＤａの重鎖と２５ｋＤａの軽鎖とのバンドが観察され、これは抗体が正確に合成されたことを示す。
【００５２】
実施例９：抗体の親和性の測定
実施例８で得られた抗体のＨＢＶ表面抗原に対する親和性を競合ＥＬＩＳＡ法（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２０、２６５−２７２、２００１）により決定し、上記の結果を図１０に示した。簡略な手順は次のとおりである。
【００５３】
（１）適正抗体濃度の決定
Ａ．プレートの準備
ＰＢＳ中で２μｇ／ｍＬで希釈された、１００μＬのＨＢＶ表面抗原（緑十字社、韓国）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れ、４℃で一晩培養した。プレートの各ウェルをＰＢＳＴで１回洗浄し、各ウェルに３００μＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加えた後、室温で１時間培養した。
【００５４】
Ｂ．１次反応
１００μＬのそれぞれ精製された抗体（０．５μｇ／ｍＬ）をプレートの各ウェルに入れ、室温で２時間反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００５５】
Ｃ．２次反応
１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：５，０００に希釈された１００μＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）−パーオキシダーゼ接合体（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、室温で１時間培養した後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００５６】
Ｄ．基質反応
１００μＬのＴＭＢ（３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、マイクロウェル パーオキシダーゼ サブストレート システム（ＫＰＬ、ＭＤ、米国））を各ウェルに添加した後、４０５ｎｍでＯ．Ｄ値を測定した。抗体の適正濃度を半分−最大結合値（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す抗体濃度として決定した。
【００５７】
（２）競合ＥＬＩＳＡ
Ａ．プレートの準備
ＰＢＳ中で２μｇ／ｍＬで希釈された、１００μＬのＨＢＶ表面抗原（緑十字社、韓国）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れ、４℃で一晩培養した。各ウェルをＰＢＳＴで１回洗浄し、各ウェルに３００μＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加えた後、室温で１時間培養した。
【００５８】
Ｂ．１次反応
２μｇのＨＢＶ表面抗原を２の倍数で連続希釈し、プレートの各ウェルに１０μＬの上記希釈されたＨＢｓＡｇを添加した。それから、（１）で決定された適正濃度に希釈した９０μＬの抗体を各ウェルに添加し、室温で２時間反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００５９】
Ｃ．２次反応
ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）−パーオキシダーゼ接合体（Ｓｉｇｍａ）１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で５，０００倍に希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加し、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００６０】
１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：５，０００に希釈された、１００μＬのヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）−パーオキシダーゼ接合体（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、室温で１時間培養した後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００６１】
Ｄ．基質反応
ＴＭＢ（３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、マイクロウェルパーオキシダーゼサブストレートシステム（ＫＰＬ、ＭＤ、米国））溶液を１００μＬずつ各ウェルに添加した後、４０５ｎｍでＯ．Ｄ値を測定した。最大結合値（競合する上皮成長因子受容体がない状態のＥＬＩＳＡ Ｏ．Ｄ値）の５０％を阻害するＨＢＶ表面抗原の濃度を親和性（Ｋｄ）で算定した。
【００６２】
１００μＬのＴＭＢ（３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、マイクロウェルパーオキシダーゼサブストレートシステム（ＫＰＬ、ＭＤ、米国））を各ウェルに添加した後、４０５ｎｍでＯ．Ｄ値を測定した。最大結合値（競合するＥＧＦＲが存在しないＯ．Ｄ値）の５０％を阻害するＨＢｓＡＧの濃度をＫｄに決定した。
【００６３】
図１０に示すように、ＨＢ４８−３５の親和性が、本発明のヒト抗体の中で最も高く、これに対してＨＢ４８−５９とＨＢ４８−３３の親和性は、ＨＢ４８−３５に比べてそれぞれ約１．３倍および４．０倍低かった。
【００６４】
実施例１０：急性Ｂ型肝炎のマウスモデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏの効果テスト
急性Ｂ型肝炎の類似兆候を示すように流体力学注入法（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によってＨＢＶ ＤＮＡを注入して製造したＣ５７ＢＬ６マウスモデルにおいて、ＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５およびＨＢ４８−５９のＨＢｓＡｇに対する中和能を比較した。
【００６５】
４週齢の約２０ｇの体重の２０匹のＣ５７ＢＬ６マウスをチャールズリバー研究所（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入して、表１に示すように５匹ずつ４群に分けた。
【００６６】
【表１】
【００６７】
ＨＢＶ ＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）内に挿入して製造した２０μｇのベクターｐＨＢＶ−ＭＢＲＩ（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１９、１４６−１５３、２００６；図１１を参照）をすべてのマウスにマウスの尾静脈を介して体重の９．５％の体積で、０．３ｍＬ／ｍｉｎの速度で注射して急性Ｂ型肝炎を誘発した。２４時間後、表１に列挙された試験物質０．２ｍＬをマウスの尾静脈を介して注射した。注射前（０時間）、注射後２４時間および注射後４８時間で血清を分離した。上記の分離された血清をヤギ血清（ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）で１０倍希釈した後、Ｇｅｎｅｄｉａ ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡ３．０（緑十字社 ＭＳ、韓国）を使用して、ＨＢｓＡｇの血中濃度を測定し、上記の結果を図１２に示した。図１２に示すように、ＰＢＳを静脈注射した対照群において、４８時間ＨＢｓＡｇの血中濃度がピークに保持された。これに対し、０．１ｍｇ ＨＢ４８−３３（実験群Ｉ）、０．１ｍｇ ＨＢ４８−３５（実験群ＩＩ）および０．１ｍｇ ＨＢ４８−５９（実験群ＩＩＩ）で処理された郡で、２４時間〜４８時間の間ＨＢｓＡｇの血中濃度が検出されなかった。したがって、本発明の抗体は、ＨＢＶの表面抗原を中和させるのに非常に有効であることが確認された。
【００６８】
本発明は、上記特定の実施例と関連して説明されたにもかかわらず、本技術分野の熟練者により、本発明の様々な変形および変化が行えることと認識されるべきであり、これはまた添付の請求項によって定義されるような本発明の範囲に属する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号２、３、および４のいずれかのアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域と、
ｃ）重鎖定常領域と、
ｄ）軽鎖定常領域とを含む、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に特異的に結合するヒト抗体。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列を持つ抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
上記ＤＮＡが配列番号５のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２、３、および４のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
上記ＤＮＡが配列番号６、７、および８のいずれか１つのヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項２のＤＮＡを含む、ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を発現するための発現ベクター。
【請求項７】
上記ベクターは、図５に地図で示す、ＨＢ４８−３３−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３、ＨＢ４８−３５−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３、またはＨＢ４８−５９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３である、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項４のＤＮＡを含む、ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現するための発現ベクター。
【請求項９】
上記ベクターは、図６に地図で示すＨＢ４８−３３−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１３、図７に地図で示すＨＢ４８−３５−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１３、または図８に地図で示すＨＢ４８−５９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１３である、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項６の発現ベクター及び請求項８の発現ベクターに形質転換された動物細胞株。
【請求項１１】
上記動物細胞株が、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）、ＨＥＫ ２９３、またはＮＳＯ細胞株である、請求項１０に記載の動物細胞株。
【請求項１２】
請求項１の抗体を含むＢ型肝炎の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１】
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号２、３、および４のいずれかのアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域と、
ｃ）重鎖定常領域と、
ｄ）軽鎖定常領域とを含む、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に特異的に結合するヒト抗体。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列を持つ抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
上記ＤＮＡが配列番号５のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２、３、および４のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
上記ＤＮＡが配列番号６、７、および８のいずれか１つのヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項２のＤＮＡを含む、ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を発現するための発現ベクター。
【請求項７】
上記ベクターは、図５に地図で示す、ＨＢ４８−３３−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３、ＨＢ４８−３５−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３、またはＨＢ４８−５９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３である、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項４のＤＮＡを含む、ＨＢＶ表面抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現するための発現ベクター。
【請求項９】
上記ベクターは、図６に地図で示すＨＢ４８−３３−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１３、図７に地図で示すＨＢ４８−３５−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１３、または図８に地図で示すＨＢ４８−５９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１３である、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項６の発現ベクター及び請求項８の発現ベクターに形質転換された動物細胞株。
【請求項１１】
上記動物細胞株が、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）、ＨＥＫ ２９３、またはＮＳＯ細胞株である、請求項１０に記載の動物細胞株。
【請求項１２】
請求項１の抗体を含むＢ型肝炎の予防または治療用薬学組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１３−５１５４７７（Ｐ２０１３−５１５４７７Ａ）
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４５８３２（Ｐ２０１２−５４５８３２）
【出願日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００４４４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７８４５６
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５１２１６５３９６）グリーン クロス コーポレーション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮ ＣＲＯＳＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００４４４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７８４５６
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５１２１６５３９６）グリーン クロス コーポレーション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮ ＣＲＯＳＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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