Ｄ−アミノアシラーゼによるＤ−アミノ酸の製造方法
【課題】本発明は、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を工業的に有利に製造する方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明の方法は、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させてＤ−アミノ酸を製造するに当たり、反応系内に第３級アミンと亜鉛塩とを存在させる。
【解決手段】本発明の方法は、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させてＤ−アミノ酸を製造するに当たり、反応系内に第３級アミンと亜鉛塩とを存在させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−アミノアシラーゼによるＤ−アミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−アミノ酸は、医農薬中間体として注目されており、Ｄ−アミノ酸の製造法、生理活性、代謝作用等について様々な研究がなされている。
【０００３】
Ｄ−アミノ酸は、通常、Ｄ，Ｌ−アミノ酸を物理化学法、化学法、酵素法等により光学分割されて製造されている。これらの中でもＤ−アミノ酸を安価で安全に製造する方法としては、酵素法、特にＤ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸を選択的に加水分解する方法（非特許文献１及び非特許文献２）が有効である。この方法では、安価で入手容易なＬ−アミノ酸を出発物質として無水酢酸でＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸を合成し、Ｄ−アミノアシラーゼによる酵素分割によりＤ−アミノ酸を製造する。
【０００４】
しかしながら、Ｄ−アミノアシラーゼは、アミノ酸の種類により活性が大きく異なり、またその活性は、基質濃度や酵素濃度に大きく依存する。また、Ｄ−アミノアシラーゼは、温和な条件下での使用が必須であり、至適温度及び至適ｐＨでの使用が要求されている。
【０００５】
そのため、Ｄ−アミノアシラーゼを存在させる反応系内のｐＨを至適ｐＨに保持するため、反応系内に緩衝剤を存在させることが通常行われている。このような緩衝剤としては、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、リン酸塩等が繁用されている。しかしながら、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ又はリン酸塩を緩衝剤として用いる場合、反応を完結させるためにＤ−アミノアシラーゼを多量に使用する必要がある。
【０００６】
Ｄ−アミノアシラーゼは高価であるため、Ｄ−アミノアシラーゼの少量使用でＤ−アミノ酸を効率良く製造できることが工業的見地から重要である。Ｄ−アミノアシラーゼは、銅、鉄、亜鉛、又はニッケルの添加によって活性が阻害されることが知られている（非特許文献３）が、Ｄ−アミノアシラーゼの活性を向上させる方法は、未だ知られていない。
【非特許文献１】M.Sugie,H.Suzuki,Agric.Biol.Chem.,44,1089 (1980)
【非特許文献２】M.Moriguchi,K.Ideta,Appl.Environ.Microbiol.,54,2267 (1988)
【非特許文献３】バイオサイエンスとインダストリー., 61, 4(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を工業的に有利に製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねて来た。その結果、本発明者らは、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を製造するに際し、反応系内に第３級アミンを存在させることにより、至適ｐＨの保持が容易になり、しかも、他の添加剤を使用することなく第３級アミンだけでＤ−アミノアシラーゼの活性を向上できることを見い出した。本発明者らは、更に研究を重ねるうち、反応系内に第３級アミンと亜鉛塩とを共存させることにより、至適ｐＨの保持が容易になり、Ｄ−アミノアシラーゼの活性が一段と向上することを見い出した。本発明は、このような知見に基づき完成されたものである。
【０００９】
本発明は、下記項１〜５に係るＤ−アミノ酸の製造方法及びＤ−アミノアシラーゼの酵素活性向上方法を提供する。
項１．Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させてＤ−アミノ酸を製造するに当たり、反応系内に第３級アミンと亜鉛塩とを存在させる、Ｄ−アミノ酸の製造方法。
項２．第３級アミンが、一般式（１）
【００１０】
【化１】
【００１１】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、Ｃ1-6アルキル基を示す。
Ｒ3は、基
【００１２】
【化２】
【００１３】
又は基
【００１４】
【化３】
【００１５】
を示す。
ここで、Ｒ4はＣ1-6アルキル基、ｎ及びｍは各々１〜６の整数を示す。Ｒ1及びＲ2は前記に同じ。
或いは、Ｒ1及びＲ3は、窒素原子を介し互いに結合して６員の飽和環を形成してもよい。Ｒ1及びＲ3が窒素原子を介し互いに結合して６員の飽和環を形成する場合、該窒素原子上にはＣ1-6アルキル基が置換しているものとする。］
で表される第３級アミンである、項１に記載の製造方法。
項３．亜鉛塩が、酢酸亜鉛、酢酸亜鉛二水和物、アセチルアセトナト亜鉛一水和物、安息香酸亜鉛、蟻酸亜鉛、蟻酸亜鉛二水和物、硼酸亜鉛３．５水和物、ｐ−ｔ−ブチル安息香酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、炭酸亜鉛、硫酸亜鉛、リン酸亜鉛四水和物、硝酸亜鉛六水和物、サリチル酸亜鉛三水和物、チオシアン酸亜鉛、ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛、ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛一水和物、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛及びトリフルオロメタンスルホン酸亜鉛一水和物からなる群から選ばれた少なくとも１種である項１に記載の製造方法。
項４．Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸が、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシン又はＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−セリンである、項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
項５．Ｄ−アミノアシラーゼに第３級アミン及び亜鉛塩を接触させてＤ−アミノアシラーゼの酵素活性を向上させる方法。
【００１６】
本発明のＤ−アミノ酸の製造方法においては、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させてＤ−アミノ酸を製造するに当たり、反応系内に第３級アミンと亜鉛塩とを共存させる。
【００１７】
本発明で製造原料として用いられるＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸は、公知であり、市販品又は公知の方法で製造されたものを広く使用することができる。公知の方法で製造されたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸としては、例えば、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ法（実験化学講座．，１６，１７６）、Ｂｕｃｈｅｒｅｒ−Ｂｕｒｇｓ法（実験化学講座．，１６，１７８〜１７９）等の一般的なアミノ酸の合成法に従って合成されたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸を無水酢酸中又はアルカリ性、酸性ないし中性の水溶液中で１５０〜２５０℃に加熱し、ラセミ化することにより製造されたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸等を挙げることができる。
【００１８】
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸としては、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−セリン等が挙げられる。
【００１９】
本発明の方法では、先ず、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸及び第３級アミンを無機アルカリ水溶液に加えて、溶解し、必要に応じて酸又はアルカリを加えて、溶液のｐＨを７〜９に調整する（Ａ工程）。無機アルカリ水溶液におけるＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸の濃度は、通常１〜５０重量％程度、好ましくは５〜２０重量％程度である。
【００２０】
本発明で使用される第３級アミンとしては、公知のものを広く使用でき、例えば、一般式（１）
【００２１】
【化４】
【００２２】
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は前記に同じ。］
で表される第３級アミンを挙げることができる。
【００２３】
本明細書において、Ｃ1-6アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基，イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基等の炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状アルキル基等を挙げることができる。
【００２４】
窒素原子を介し互いに結合して形成される６員の飽和環としては、例えば、ピペラジン環等が挙げられる。
【００２５】
一般式（１）で表される第３級アミンの具体例としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルジアミノメタン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルプロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルプロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルブタンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルヘキサンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタメチルジプロピレントリアミン、１，４−ジメチルピペラジン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．０］オクタン等が包含される。
【００２６】
第３級アミンは、無機アルカリ水溶液中に、通常１〜２００ｍＭ程度、好ましくは５０〜１００ｍＭ程度になるように配合される。
【００２７】
亜鉛塩としては、水溶性である限り、公知の亜鉛塩を広く使用することができる。このような亜鉛塩としては、例えば、酢酸亜鉛、酢酸亜鉛二水和物、アセチルアセトナト亜鉛一水和物、安息香酸亜鉛、蟻酸亜鉛、蟻酸亜鉛二水和物、硼酸亜鉛３．５水和物、ｐ−ｔ−ブチル安息香酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、炭酸亜鉛、硫酸亜鉛、リン酸亜鉛四水和物、硝酸亜鉛六水和物、サリチル酸亜鉛三水和物、チオシアン酸亜鉛、ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛、ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛一水和物、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛一水和物等を挙げることができる。本発明では、これら亜鉛塩は、１種単独又は２種以上混合して使用される。
【００２８】
亜鉛塩は、無機アルカリ水溶液中に、通常０．１〜２ｍＭ程度、好ましくは０．５〜１ｍＭ程度になるように配合される。
【００２９】
無機アルカリとしては、公知のものを広く使用でき、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等の水酸化アルカリ、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシム、炭酸バリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素アンモニウム等の炭酸塩、アンモニア水等が挙げられる。これらは、１種単独で又は２種以上混合して使用される。
【００３０】
無機アルカリの使用量は、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸が溶解する最低必要量でよく、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸に対し、通常０．１〜２当量程度、好ましくは０．５〜１当量程度である。
【００３１】
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸及び第３級アミンを無機アルカリ水溶液に溶解するに当たっては、室温付近で行うことができるが、溶解速度を上げるために５０℃付近まで加温するのが望ましい。
【００３２】
ｐＨ調整する際に用いられる酸としては、公知の無機酸及び有機酸を広く使用することができる。無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、硼酸等が挙げられ、有機酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、プロパンスルホン酸、トルエンスルホン酸等が挙げられる。アルカリとしては、上述した無機アルカリをいずれも使用できる。
【００３３】
本発明において、第３級アミンは、緩衝剤として作用するので、一度上記ｐＨ値への調整を行うだけで、そのｐＨ値を容易に維持することができる。
【００３４】
本発明では、次にＡ工程で得られる溶液にＤ−アミノアシラーゼを加え、Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に加水分解する（Ｂ工程）。この工程では、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸はＬ−アミノ酸に加水分解されない。
【００３５】
第３級アミン及び亜鉛塩は、Ｄ−アミノアシラーゼに接触すると、Ｄ−アミノアシラーゼを一段と活性化させることができる。それ故、本発明の方法では、Ｄ−アミノアシラーゼの使用量を大幅に軽減することができる。
【００３６】
Ｄ−アミノアシラーゼの使用量は、通常１０〜１００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１０〜７０Ｕ／ｍｌ程度である。
【００３７】
Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に加水分解する際の温度は、２５〜５０℃程度が適当であり、上記加水分解は一般に１〜３日程度で終了する。この加水分解は、撹拌下で行ってもよいし、無撹拌下で行ってもよい。
【００３８】
上記加水分解反応終了後、目的とするＤ−アミノ酸は、通常行われている単離及び精製手段により、反応混合物から単離され、精製される。
【００３９】
目的とするＤ−アミノ酸を単離した後の反応混合物には、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸の他、少量のＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸が含まれている。この単離後の反応混合物に、後記実施例９に示すように、Ｌ−アミノ酸を加え、公知の方法によりＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸を製造し、更に本発明の方法を適用することにより、再び目的とするＤ−アミノ酸を製造することができる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明によれば、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を工業的に有利に製造し得る。
【００４１】
Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を製造するに際し、反応系内に第３級アミンと亜鉛塩を共存させることにより、至適ｐＨの保持が容易になり、しかもＤ−アミノアシラーゼの活性を格段に向上できる。Ｄ−アミノアシラーゼの活性を格段に向上できることに伴い、Ｄ−アミノアシラーゼの使用量を大幅に削減できる。
【００４２】
また、第３級アミンの使用量の多少に拘わらず、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を効率的に製造できる。
【００４３】
そのため、本発明の方法を採用すれば、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸を経由してＤ−アミノ酸を簡易に且つ安価に高収率で製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下に実施例を掲げて、本発明をより一層明らかにする。
【００４５】
なお、各実施例における反応液の評価は、下記に示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用し、反応率及び純度を測定した。
カラム：住化分析センター製のＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００、φ４．６×１５０ｍｍ、カラム充填剤の粒子径：５μｍ
溶離液：２ｍＭ硫酸銅水溶液：イソプロパノール＝８５：１５
カラム温度：４０℃
ＵＶ検出器：２５４ｎｍ。
【００４６】
Ｄ−フェニルアラニンの製造例
実施例１
１０ｇ（４８．３ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンを１０６ｇ（４８ｍｍｏｌ）の５．６％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。これに１．１６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）（ＴＭＥＤＡの添加量：１００ｍＭ）及び１１．０ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）の酢酸亜鉛（酢酸亜鉛の添加量：０．５ｍＭ）を加え、少量の酸を加えてｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを２０００Ｕ加えて、酵素濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９５％進行しているのを確認した。
【００４７】
実施例２
Ｄ−アミノアシラーゼを１５００Ｕ加えて、酵素濃度を１５Ｕ／ｍｌとする以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９１％進行しているのを確認した。
【００４８】
実施例３
ＴＭＥＤＡの代わりに１．７３ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルヘキサンジアミン（ＴＭＨＤＡ）を使用（ＴＭＨＤＡの添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９４％進行しているのを確認した。
【００４９】
実施例４
酢酸亜鉛の代わりに１８．２ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）のトリフルオロメタンスルホン酸亜鉛を使用（トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛の添加量：０．５ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９４％進行しているのを確認した
比較例１
ＴＭＥＤＡの代わり１．５７ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が４０％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５０】
比較例２
ＴＭＥＤＡの代わりに３．５８ｇ（１０ｍｍｏｌ）のリン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が１１％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５１】
Ｄ−トリプトファンの製造例
実施例５
５ｇ（２０．３ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンを１０２．５ｇ（２０ｍｍｏｌ）の２．４％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。これに１．１７ｇ（１０ｍｍｏｌ）の１，４−ジメチルピペラジン（１，４−ジメチルピペラジンの添加量：１００ｍＭ）及び１３．６ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）の塩化亜鉛（塩化亜鉛の添加量：１ｍＭ）を加え、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを５０００Ｕ加えて、酵素濃度を５０Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９２％進行しているのを確認した。
【００５２】
比較例３
１，４−ジメチルピペラジンの代わりに１．５７ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例５と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が３２％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５３】
比較例４
１，４−ジメチルピペラジンの代わりに３．５８ｇ（１０ｍｍｏｌ）のリン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例５と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が２４％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５４】
Ｄ−メチオニンの製造例
実施例６
２０ｇ（１０５ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニンを１１３．１ｇ（１０５ｍｍｏｌ）の１１．５％水酸化ナトリウム水溶液に１．１２ｇ（１０ｍｍｏｌ）の１，４−ジアザビシクロ［２．２．０］オクタン（ＤＡＢＵＣＯ）（ＤＡＢＵＣＯの添加量：１００ｍＭ）及び１８．２ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のチオシアン酸亜鉛（チオシアン酸亜鉛の添加量：１ｍＭ）を加え、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを２５００Ｕ加えて、酵素濃度を２５Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９５％進行しているのを確認した。
【００５５】
比較例５
ＤＡＢＵＣＯの代わりに１．５８ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例６と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が５６％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５６】
比較例６
ＤＡＢＵＣＯの代わりに３．５６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のリン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例６と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が４６％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５７】
Ｄ−バリンの製造例
実施例７
１０ｇ（６２．８ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリンを１０７．８ｇ（６２．８ｍｍｏｌ）の７．１％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。これに１．１４ｇ（１ｍｍｏｌ）の１，４−ジメチルピペラジン（１，４−ジメチルピペラジンの添加量：１００ｍＭ）及び４０．８ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のトルエンスルホン酸亜鉛（トルエンスルホン酸亜鉛の添加量：１ｍＭ）を加え、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを７０００Ｕ加え、酵素濃度を７０Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９４％進行しているのを確認した。
【００５８】
比較例７
１，４−ジメチルピペラジンの代わりに１．５８ｇ（１０ｍｍｏｌ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例７と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析すると、加水分解反応が６０％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５９】
比較例８
１，４−ジメチルピペラジンの代わりに３．５８ｇ（１０ｍｍｏｌ）リン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例７と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析すると、加水分解反応が５８％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００６０】
Ｄ−チロシンの製造例
実施例８
５ｇ（２２．４ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシンを１０２．８ｇ（２２．４ｍｍｏｌ）の２．７％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。０．８６５ｇ（５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ペンタメチルジエチレンテトラアミン（ＰＭＤＥＴＡ）（ＰＭＤＥＴＡの添加量：５０ｍＭ）及び１６．１ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）の硫酸亜鉛（硫酸亜鉛の添加量：１ｍＭ）を加え、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを３０００Ｕ加えて、酵素濃度を３０Ｕ／ｍｌとし、３３℃で２４時間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９４％進行しているのを確認した。
【００６１】
比較例１０
ＰＭＤＥＴＡの代わりに０．７９ｇ（５ｍｍｏｌ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：５０ｍＭ）する以外は実施例８と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が７％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００６２】
比較例１１
ＰＭＤＥＴＡの代わりに１．７９ｇ（５ｍｍｏｌ）のリン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：５０ｍＭ）する以外は実施例８と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が３１％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００６３】
Ｄ−トリプトファンの製造
実施例９
実施例５にて得られた反応液から水を９５ｇ回収し、３５％塩酸でｐＨ＝６．５に中和し、２５℃で析出物を濾取、水洗、乾燥し、Ｄ−トリプトファンを１．６６ｇ（収率８０．２％）で得た。得られたＤ−トリプトファンをＨＰＬＣで分析するとＬ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンは、全く含まれず純度１００％であった。
【００６４】
一方、濾液には、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンと、少量のＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファン及びＤ−トリプトファンが含まれており、これを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン、Ｄ−トリプトファンの合成に用いた。
【００６５】
上記の濾液に水４０ｇ、Ｌ−トリプトファン４．０８ｇ（２０ｍｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム５ｇ（４０ｍｍｏｌ）を加え、これを３０℃に加熱し、溶解した。この溶液に３．７ｇ（３６．２ｍｍｏｌ）の無水酢酸を滴下し、３０℃で１時間撹拌した後、８０℃に加熱し、無水酢酸９．２ｇ（９０ｍｍｏｌ）を滴下し、１時間撹拌した。この段階で完全にラセミ化していることをＨＰＬＣで確認し、３０℃に冷却した。５０°Ｂｅ硫酸でｐＨ＝２．３に酸析し、析出物を濾過、水洗、乾燥し、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン６．２２ｇ（収率９５．１％）を得た。得られたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンをＨＰＬＣで分析するとＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンのみであった。
【００６６】
更に実施例５と同様にして加水分解反応を行い、反応後ＨＰＬＣにて分析すると９３％反応が進行していることを確認した。この反応液からＤ−トリプトファン１．６４ｇ（収率７９．１％）を得た。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−アミノアシラーゼによるＤ−アミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−アミノ酸は、医農薬中間体として注目されており、Ｄ−アミノ酸の製造法、生理活性、代謝作用等について様々な研究がなされている。
【０００３】
Ｄ−アミノ酸は、通常、Ｄ，Ｌ−アミノ酸を物理化学法、化学法、酵素法等により光学分割されて製造されている。これらの中でもＤ−アミノ酸を安価で安全に製造する方法としては、酵素法、特にＤ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸を選択的に加水分解する方法（非特許文献１及び非特許文献２）が有効である。この方法では、安価で入手容易なＬ−アミノ酸を出発物質として無水酢酸でＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸を合成し、Ｄ−アミノアシラーゼによる酵素分割によりＤ−アミノ酸を製造する。
【０００４】
しかしながら、Ｄ−アミノアシラーゼは、アミノ酸の種類により活性が大きく異なり、またその活性は、基質濃度や酵素濃度に大きく依存する。また、Ｄ−アミノアシラーゼは、温和な条件下での使用が必須であり、至適温度及び至適ｐＨでの使用が要求されている。
【０００５】
そのため、Ｄ−アミノアシラーゼを存在させる反応系内のｐＨを至適ｐＨに保持するため、反応系内に緩衝剤を存在させることが通常行われている。このような緩衝剤としては、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、リン酸塩等が繁用されている。しかしながら、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ又はリン酸塩を緩衝剤として用いる場合、反応を完結させるためにＤ−アミノアシラーゼを多量に使用する必要がある。
【０００６】
Ｄ−アミノアシラーゼは高価であるため、Ｄ−アミノアシラーゼの少量使用でＤ−アミノ酸を効率良く製造できることが工業的見地から重要である。Ｄ−アミノアシラーゼは、銅、鉄、亜鉛、又はニッケルの添加によって活性が阻害されることが知られている（非特許文献３）が、Ｄ−アミノアシラーゼの活性を向上させる方法は、未だ知られていない。
【非特許文献１】M.Sugie,H.Suzuki,Agric.Biol.Chem.,44,1089 (1980)
【非特許文献２】M.Moriguchi,K.Ideta,Appl.Environ.Microbiol.,54,2267 (1988)
【非特許文献３】バイオサイエンスとインダストリー., 61, 4(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を工業的に有利に製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねて来た。その結果、本発明者らは、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を製造するに際し、反応系内に第３級アミンを存在させることにより、至適ｐＨの保持が容易になり、しかも、他の添加剤を使用することなく第３級アミンだけでＤ−アミノアシラーゼの活性を向上できることを見い出した。本発明者らは、更に研究を重ねるうち、反応系内に第３級アミンと亜鉛塩とを共存させることにより、至適ｐＨの保持が容易になり、Ｄ−アミノアシラーゼの活性が一段と向上することを見い出した。本発明は、このような知見に基づき完成されたものである。
【０００９】
本発明は、下記項１〜５に係るＤ−アミノ酸の製造方法及びＤ−アミノアシラーゼの酵素活性向上方法を提供する。
項１．Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させてＤ−アミノ酸を製造するに当たり、反応系内に第３級アミンと亜鉛塩とを存在させる、Ｄ−アミノ酸の製造方法。
項２．第３級アミンが、一般式（１）
【００１０】
【化１】
【００１１】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、Ｃ1-6アルキル基を示す。
Ｒ3は、基
【００１２】
【化２】
【００１３】
又は基
【００１４】
【化３】
【００１５】
を示す。
ここで、Ｒ4はＣ1-6アルキル基、ｎ及びｍは各々１〜６の整数を示す。Ｒ1及びＲ2は前記に同じ。
或いは、Ｒ1及びＲ3は、窒素原子を介し互いに結合して６員の飽和環を形成してもよい。Ｒ1及びＲ3が窒素原子を介し互いに結合して６員の飽和環を形成する場合、該窒素原子上にはＣ1-6アルキル基が置換しているものとする。］
で表される第３級アミンである、項１に記載の製造方法。
項３．亜鉛塩が、酢酸亜鉛、酢酸亜鉛二水和物、アセチルアセトナト亜鉛一水和物、安息香酸亜鉛、蟻酸亜鉛、蟻酸亜鉛二水和物、硼酸亜鉛３．５水和物、ｐ−ｔ−ブチル安息香酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、炭酸亜鉛、硫酸亜鉛、リン酸亜鉛四水和物、硝酸亜鉛六水和物、サリチル酸亜鉛三水和物、チオシアン酸亜鉛、ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛、ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛一水和物、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛及びトリフルオロメタンスルホン酸亜鉛一水和物からなる群から選ばれた少なくとも１種である項１に記載の製造方法。
項４．Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸が、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシン又はＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−セリンである、項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
項５．Ｄ−アミノアシラーゼに第３級アミン及び亜鉛塩を接触させてＤ−アミノアシラーゼの酵素活性を向上させる方法。
【００１６】
本発明のＤ−アミノ酸の製造方法においては、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させてＤ−アミノ酸を製造するに当たり、反応系内に第３級アミンと亜鉛塩とを共存させる。
【００１７】
本発明で製造原料として用いられるＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸は、公知であり、市販品又は公知の方法で製造されたものを広く使用することができる。公知の方法で製造されたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸としては、例えば、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ法（実験化学講座．，１６，１７６）、Ｂｕｃｈｅｒｅｒ−Ｂｕｒｇｓ法（実験化学講座．，１６，１７８〜１７９）等の一般的なアミノ酸の合成法に従って合成されたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸を無水酢酸中又はアルカリ性、酸性ないし中性の水溶液中で１５０〜２５０℃に加熱し、ラセミ化することにより製造されたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸等を挙げることができる。
【００１８】
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸としては、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−セリン等が挙げられる。
【００１９】
本発明の方法では、先ず、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸及び第３級アミンを無機アルカリ水溶液に加えて、溶解し、必要に応じて酸又はアルカリを加えて、溶液のｐＨを７〜９に調整する（Ａ工程）。無機アルカリ水溶液におけるＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸の濃度は、通常１〜５０重量％程度、好ましくは５〜２０重量％程度である。
【００２０】
本発明で使用される第３級アミンとしては、公知のものを広く使用でき、例えば、一般式（１）
【００２１】
【化４】
【００２２】
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は前記に同じ。］
で表される第３級アミンを挙げることができる。
【００２３】
本明細書において、Ｃ1-6アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基，イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基等の炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状アルキル基等を挙げることができる。
【００２４】
窒素原子を介し互いに結合して形成される６員の飽和環としては、例えば、ピペラジン環等が挙げられる。
【００２５】
一般式（１）で表される第３級アミンの具体例としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルジアミノメタン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルプロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルプロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルブタンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルヘキサンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタメチルジプロピレントリアミン、１，４−ジメチルピペラジン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．０］オクタン等が包含される。
【００２６】
第３級アミンは、無機アルカリ水溶液中に、通常１〜２００ｍＭ程度、好ましくは５０〜１００ｍＭ程度になるように配合される。
【００２７】
亜鉛塩としては、水溶性である限り、公知の亜鉛塩を広く使用することができる。このような亜鉛塩としては、例えば、酢酸亜鉛、酢酸亜鉛二水和物、アセチルアセトナト亜鉛一水和物、安息香酸亜鉛、蟻酸亜鉛、蟻酸亜鉛二水和物、硼酸亜鉛３．５水和物、ｐ−ｔ−ブチル安息香酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、炭酸亜鉛、硫酸亜鉛、リン酸亜鉛四水和物、硝酸亜鉛六水和物、サリチル酸亜鉛三水和物、チオシアン酸亜鉛、ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛、ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛一水和物、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛一水和物等を挙げることができる。本発明では、これら亜鉛塩は、１種単独又は２種以上混合して使用される。
【００２８】
亜鉛塩は、無機アルカリ水溶液中に、通常０．１〜２ｍＭ程度、好ましくは０．５〜１ｍＭ程度になるように配合される。
【００２９】
無機アルカリとしては、公知のものを広く使用でき、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等の水酸化アルカリ、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシム、炭酸バリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素アンモニウム等の炭酸塩、アンモニア水等が挙げられる。これらは、１種単独で又は２種以上混合して使用される。
【００３０】
無機アルカリの使用量は、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸が溶解する最低必要量でよく、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸に対し、通常０．１〜２当量程度、好ましくは０．５〜１当量程度である。
【００３１】
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸及び第３級アミンを無機アルカリ水溶液に溶解するに当たっては、室温付近で行うことができるが、溶解速度を上げるために５０℃付近まで加温するのが望ましい。
【００３２】
ｐＨ調整する際に用いられる酸としては、公知の無機酸及び有機酸を広く使用することができる。無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、硼酸等が挙げられ、有機酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、プロパンスルホン酸、トルエンスルホン酸等が挙げられる。アルカリとしては、上述した無機アルカリをいずれも使用できる。
【００３３】
本発明において、第３級アミンは、緩衝剤として作用するので、一度上記ｐＨ値への調整を行うだけで、そのｐＨ値を容易に維持することができる。
【００３４】
本発明では、次にＡ工程で得られる溶液にＤ−アミノアシラーゼを加え、Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に加水分解する（Ｂ工程）。この工程では、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸はＬ−アミノ酸に加水分解されない。
【００３５】
第３級アミン及び亜鉛塩は、Ｄ−アミノアシラーゼに接触すると、Ｄ−アミノアシラーゼを一段と活性化させることができる。それ故、本発明の方法では、Ｄ−アミノアシラーゼの使用量を大幅に軽減することができる。
【００３６】
Ｄ−アミノアシラーゼの使用量は、通常１０〜１００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１０〜７０Ｕ／ｍｌ程度である。
【００３７】
Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に加水分解する際の温度は、２５〜５０℃程度が適当であり、上記加水分解は一般に１〜３日程度で終了する。この加水分解は、撹拌下で行ってもよいし、無撹拌下で行ってもよい。
【００３８】
上記加水分解反応終了後、目的とするＤ−アミノ酸は、通常行われている単離及び精製手段により、反応混合物から単離され、精製される。
【００３９】
目的とするＤ−アミノ酸を単離した後の反応混合物には、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸の他、少量のＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸が含まれている。この単離後の反応混合物に、後記実施例９に示すように、Ｌ−アミノ酸を加え、公知の方法によりＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸を製造し、更に本発明の方法を適用することにより、再び目的とするＤ−アミノ酸を製造することができる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明によれば、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を工業的に有利に製造し得る。
【００４１】
Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を製造するに際し、反応系内に第３級アミンと亜鉛塩を共存させることにより、至適ｐＨの保持が容易になり、しかもＤ−アミノアシラーゼの活性を格段に向上できる。Ｄ−アミノアシラーゼの活性を格段に向上できることに伴い、Ｄ−アミノアシラーゼの使用量を大幅に削減できる。
【００４２】
また、第３級アミンの使用量の多少に拘わらず、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を効率的に製造できる。
【００４３】
そのため、本発明の方法を採用すれば、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸を経由してＤ−アミノ酸を簡易に且つ安価に高収率で製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下に実施例を掲げて、本発明をより一層明らかにする。
【００４５】
なお、各実施例における反応液の評価は、下記に示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用し、反応率及び純度を測定した。
カラム：住化分析センター製のＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００、φ４．６×１５０ｍｍ、カラム充填剤の粒子径：５μｍ
溶離液：２ｍＭ硫酸銅水溶液：イソプロパノール＝８５：１５
カラム温度：４０℃
ＵＶ検出器：２５４ｎｍ。
【００４６】
Ｄ−フェニルアラニンの製造例
実施例１
１０ｇ（４８．３ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンを１０６ｇ（４８ｍｍｏｌ）の５．６％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。これに１．１６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）（ＴＭＥＤＡの添加量：１００ｍＭ）及び１１．０ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）の酢酸亜鉛（酢酸亜鉛の添加量：０．５ｍＭ）を加え、少量の酸を加えてｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを２０００Ｕ加えて、酵素濃度を２０Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９５％進行しているのを確認した。
【００４７】
実施例２
Ｄ−アミノアシラーゼを１５００Ｕ加えて、酵素濃度を１５Ｕ／ｍｌとする以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９１％進行しているのを確認した。
【００４８】
実施例３
ＴＭＥＤＡの代わりに１．７３ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルヘキサンジアミン（ＴＭＨＤＡ）を使用（ＴＭＨＤＡの添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９４％進行しているのを確認した。
【００４９】
実施例４
酢酸亜鉛の代わりに１８．２ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）のトリフルオロメタンスルホン酸亜鉛を使用（トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛の添加量：０．５ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９４％進行しているのを確認した
比較例１
ＴＭＥＤＡの代わり１．５７ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が４０％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５０】
比較例２
ＴＭＥＤＡの代わりに３．５８ｇ（１０ｍｍｏｌ）のリン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例１と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が１１％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５１】
Ｄ−トリプトファンの製造例
実施例５
５ｇ（２０．３ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンを１０２．５ｇ（２０ｍｍｏｌ）の２．４％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。これに１．１７ｇ（１０ｍｍｏｌ）の１，４−ジメチルピペラジン（１，４−ジメチルピペラジンの添加量：１００ｍＭ）及び１３．６ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）の塩化亜鉛（塩化亜鉛の添加量：１ｍＭ）を加え、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを５０００Ｕ加えて、酵素濃度を５０Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９２％進行しているのを確認した。
【００５２】
比較例３
１，４−ジメチルピペラジンの代わりに１．５７ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例５と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が３２％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５３】
比較例４
１，４−ジメチルピペラジンの代わりに３．５８ｇ（１０ｍｍｏｌ）のリン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例５と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が２４％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５４】
Ｄ−メチオニンの製造例
実施例６
２０ｇ（１０５ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニンを１１３．１ｇ（１０５ｍｍｏｌ）の１１．５％水酸化ナトリウム水溶液に１．１２ｇ（１０ｍｍｏｌ）の１，４−ジアザビシクロ［２．２．０］オクタン（ＤＡＢＵＣＯ）（ＤＡＢＵＣＯの添加量：１００ｍＭ）及び１８．２ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のチオシアン酸亜鉛（チオシアン酸亜鉛の添加量：１ｍＭ）を加え、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを２５００Ｕ加えて、酵素濃度を２５Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９５％進行しているのを確認した。
【００５５】
比較例５
ＤＡＢＵＣＯの代わりに１．５８ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例６と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が５６％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５６】
比較例６
ＤＡＢＵＣＯの代わりに３．５６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のリン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例６と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が４６％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５７】
Ｄ−バリンの製造例
実施例７
１０ｇ（６２．８ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリンを１０７．８ｇ（６２．８ｍｍｏｌ）の７．１％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。これに１．１４ｇ（１ｍｍｏｌ）の１，４−ジメチルピペラジン（１，４−ジメチルピペラジンの添加量：１００ｍＭ）及び４０．８ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のトルエンスルホン酸亜鉛（トルエンスルホン酸亜鉛の添加量：１ｍＭ）を加え、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを７０００Ｕ加え、酵素濃度を７０Ｕ／ｍｌとし、３３℃で３日間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９４％進行しているのを確認した。
【００５８】
比較例７
１，４−ジメチルピペラジンの代わりに１．５８ｇ（１０ｍｍｏｌ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例７と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析すると、加水分解反応が６０％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００５９】
比較例８
１，４−ジメチルピペラジンの代わりに３．５８ｇ（１０ｍｍｏｌ）リン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：１００ｍＭ）する以外は実施例７と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析すると、加水分解反応が５８％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００６０】
Ｄ−チロシンの製造例
実施例８
５ｇ（２２．４ｍｍｏｌ）のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシンを１０２．８ｇ（２２．４ｍｍｏｌ）の２．７％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。０．８６５ｇ（５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ペンタメチルジエチレンテトラアミン（ＰＭＤＥＴＡ）（ＰＭＤＥＴＡの添加量：５０ｍＭ）及び１６．１ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）の硫酸亜鉛（硫酸亜鉛の添加量：１ｍＭ）を加え、少量の酸を加えて、ｐＨ＝８に調整した。これにＤ−アミノアシラーゼを３０００Ｕ加えて、酵素濃度を３０Ｕ／ｍｌとし、３３℃で２４時間撹拌した。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が９４％進行しているのを確認した。
【００６１】
比較例１０
ＰＭＤＥＴＡの代わりに０．７９ｇ（５ｍｍｏｌ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加量：５０ｍＭ）する以外は実施例８と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が７％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００６２】
比較例１１
ＰＭＤＥＴＡの代わりに１．７９ｇ（５ｍｍｏｌ）のリン酸水素二ソーダ１２水和物を使用（リン酸水素二ソーダ１２水和物の添加量：５０ｍＭ）する以外は実施例８と同様にして、加水分解反応を行った。ＨＰＬＣにて反応液を分析し、加水分解反応が３１％進行しているのを確認した。この反応液をさらに２４時間撹拌したが、反応はそれ以上進行しなかった。
【００６３】
Ｄ−トリプトファンの製造
実施例９
実施例５にて得られた反応液から水を９５ｇ回収し、３５％塩酸でｐＨ＝６．５に中和し、２５℃で析出物を濾取、水洗、乾燥し、Ｄ−トリプトファンを１．６６ｇ（収率８０．２％）で得た。得られたＤ−トリプトファンをＨＰＬＣで分析するとＬ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンは、全く含まれず純度１００％であった。
【００６４】
一方、濾液には、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンと、少量のＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファン及びＤ−トリプトファンが含まれており、これを用いてＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン、Ｄ−トリプトファンの合成に用いた。
【００６５】
上記の濾液に水４０ｇ、Ｌ−トリプトファン４．０８ｇ（２０ｍｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム５ｇ（４０ｍｍｏｌ）を加え、これを３０℃に加熱し、溶解した。この溶液に３．７ｇ（３６．２ｍｍｏｌ）の無水酢酸を滴下し、３０℃で１時間撹拌した後、８０℃に加熱し、無水酢酸９．２ｇ（９０ｍｍｏｌ）を滴下し、１時間撹拌した。この段階で完全にラセミ化していることをＨＰＬＣで確認し、３０℃に冷却した。５０°Ｂｅ硫酸でｐＨ＝２．３に酸析し、析出物を濾過、水洗、乾燥し、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン６．２２ｇ（収率９５．１％）を得た。得られたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンをＨＰＬＣで分析するとＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンのみであった。
【００６６】
更に実施例５と同様にして加水分解反応を行い、反応後ＨＰＬＣにて分析すると９３％反応が進行していることを確認した。この反応液からＤ−トリプトファン１．６４ｇ（収率７９．１％）を得た。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させてＤ−アミノ酸を製造するに当たり、反応系内に第３級アミンと亜鉛塩とを存在させる、Ｄ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
第３級アミンが、一般式（１）
【化１】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、Ｃ1-6アルキル基を示す。
Ｒ3は、基
【化２】
又は基
【化３】
を示す。
ここで、Ｒ4はＣ1-6アルキル基、ｎ及びｍは各々１〜６の整数を示す。Ｒ1及びＲ2は前記に同じ。
或いは、Ｒ1及びＲ3は、窒素原子を介し互いに結合して６員の飽和環を形成してもよい。Ｒ1及びＲ3が窒素原子を介し互いに結合して６員の飽和環を形成する場合、該窒素原子上にはＣ1-6アルキル基が置換しているものとする。］
で表される第３級アミンである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
亜鉛塩が、酢酸亜鉛、酢酸亜鉛二水和物、アセチルアセトナト亜鉛一水和物、安息香酸亜鉛、蟻酸亜鉛、蟻酸亜鉛二水和物、硼酸亜鉛３．５水和物、ｐ−ｔ−ブチル安息香酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、炭酸亜鉛、硫酸亜鉛、リン酸亜鉛四水和物、硝酸亜鉛六水和物、サリチル酸亜鉛三水和物、チオシアン酸亜鉛、ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛、ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛一水和物、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛及びトリフルオロメタンスルホン酸亜鉛一水和物からなる群から選ばれた少なくとも１種である請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸が、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシン又はＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−セリンである、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
Ｄ−アミノアシラーゼに第３級アミン及び亜鉛塩を接触させてＤ−アミノアシラーゼの酵素活性を向上させる方法。
【請求項１】
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させてＤ−アミノ酸を製造するに当たり、反応系内に第３級アミンと亜鉛塩とを存在させる、Ｄ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
第３級アミンが、一般式（１）
【化１】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、Ｃ1-6アルキル基を示す。
Ｒ3は、基
【化２】
又は基
【化３】
を示す。
ここで、Ｒ4はＣ1-6アルキル基、ｎ及びｍは各々１〜６の整数を示す。Ｒ1及びＲ2は前記に同じ。
或いは、Ｒ1及びＲ3は、窒素原子を介し互いに結合して６員の飽和環を形成してもよい。Ｒ1及びＲ3が窒素原子を介し互いに結合して６員の飽和環を形成する場合、該窒素原子上にはＣ1-6アルキル基が置換しているものとする。］
で表される第３級アミンである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
亜鉛塩が、酢酸亜鉛、酢酸亜鉛二水和物、アセチルアセトナト亜鉛一水和物、安息香酸亜鉛、蟻酸亜鉛、蟻酸亜鉛二水和物、硼酸亜鉛３．５水和物、ｐ−ｔ−ブチル安息香酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、炭酸亜鉛、硫酸亜鉛、リン酸亜鉛四水和物、硝酸亜鉛六水和物、サリチル酸亜鉛三水和物、チオシアン酸亜鉛、ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛、ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛一水和物、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛及びトリフルオロメタンスルホン酸亜鉛一水和物からなる群から選ばれた少なくとも１種である請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸が、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシン又はＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−セリンである、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
Ｄ−アミノアシラーゼに第３級アミン及び亜鉛塩を接触させてＤ−アミノアシラーゼの酵素活性を向上させる方法。
【公開番号】特開２００９−１４２２２３（Ｐ２００９−１４２２２３Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２４４４０（Ｐ２００７−３２４４４０）
【出願日】平成１９年１２月１７日（２００７．１２．１７）
【出願人】（０００１１６８１７）旭化学工業株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１７日（２００７．１２．１７）
【出願人】（０００１１６８１７）旭化学工業株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]