【課題】腫瘍の進行診断及び治療／防止の方法を提供すること。
【解決手段】本発明は細胞生物学、免疫学及び腫瘍学の分野にある。本発明は腫瘍サプレッサ遺伝子ｓｍａｄ４（ｄｐｃ４としても知られる）及びインテグリンα_ｖβ_６の発現レベルとα_ｖβ_６活性化合物及び組成物（例えばα_ｖβ_６に結合する抗体及び他のリガンド）に対する患者集団の応答性との関係が、特にそのような患者集団由来の癌細胞に、より特定すれば膵臓癌のような癌腫上に存在するという発見に関連する。即ち、腫瘍細胞によるα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現を調べてそのようなα_ｖβ_６活性化合物及び組成物に対する腫瘍細胞（特に膵臓腫瘍由来のもの）の応答性を調べる方法、並びに腫瘍細胞の表面上のインテグリンα_ｖβ_６に結合する、及び／又はＴＧＦ−β経路の成分１つ以上をブロックするリガンド、例えば抗体及び小分子薬物を用いた腫瘍の進行の診断及び治療／防止の方法を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞生物学、免疫学及び腫瘍学の分野にある。本発明は腫瘍サプレッサ遺伝子ｓｍａｄ４（ｄｐｃ４としても知られている）及びインテグリンα_ｖβ_６の発現レベルとα_ｖβ_６活性化合物及び組成物（例えばα_ｖβ_６に結合する抗体及び他のリガンド）に対する患者集団の応答性との間の関係が、特にそのような患者集団由来の癌細胞において、より特定すれば膵臓癌のような癌腫上において存在するという発見に関連している。即ち、本発明は腫瘍細胞によるα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現を調べることによりそのようなα_ｖβ_６活性化合物及び組成物に対する腫瘍細胞（特に膵臓腫瘍由来のもの）の応答性を調べるための方法、並びに、腫瘍細胞の表面上のインテグリンα_ｖβ_６に結合する、及び／又はＴＧＦ−β経路の成分１つ以上をブロックする、リガンド、例えば抗体及び小分子薬物を用いた、特にｓｍａｄ４欠損腫瘍細胞における、腫瘍の進行の診断及び治療／防止の方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
インテグリンは細胞外マトリックス蛋白に結合し、そして細胞−細胞、及び細胞−細胞外マトリックスの相互作用（一般的に細胞接着事象と称される）を媒介する細胞表面糖蛋白受容体である（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１−５（１９９１）；Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｃｅｌｌ ６９：１１−２５（１９９２））。これらの受容体は非共有結合的に会合したアルファ（α）及びベータ（β）鎖よりなり、これらは組み合わさって異なる細胞及び接着特異性を有する種々のヘテロ２量体蛋白を与える（Ａｌｂｅｄａ，Ｓ．Ｍ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６８：４−１４（１９９３））。最近の研究によれば種々の細胞プロセス、例えば細胞接着、遊走、侵襲、分化、増殖、アポトーシス、及び遺伝子発現の調節における特定のインテグリンの関与を示唆している（Ａｌｂｅｄａ，Ｓ．Ｍ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６８：４−１４（１９９３）；Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｒ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔ．Ｒｅｖ．１３：２５−３０（１９９４）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．ａｎｄ Ｒｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｅｌｌ ７７：４７７−４７８（１９９４）；ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．ａｎｄ Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ，Ｆ．Ｇ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ １：１１９−１２６（１９８９）；Ｐｌｏｗ，Ｈａａｓ等、２０００；ｖａｎ ｄｅｒ Ｆｌｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ ２００１）。
【０００３】
α_ｖβ_６受容体は細胞表面ヘテロ２量体蛋白として発現されるインテグリンのファミリーの１メンバーである（Ｂｕｓｋ，Ｍ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（９）：５７９０−５７９６（１９９２））。α_ｖサブユニットは種々のβサブユニット（β_１、β_３、β_５、β_６及びβ_８）とヘテロ２量体を形成できるが、β_６サブユニットはα_ｖサブユニットのヘテロ２量体として発現されるのみである。α_ｖβ_６インテグリンはフィブロネクチン−、潜伏性関連ペプチド（ＬＡＰ）−、及びテナシンＣ−結合細胞表面受容体であることも知られており、細胞外マトリックスとその上のＲＧＤトリペプチド結合部位を介して相互作用する（Ｂｕｓｋ，Ｍ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５７９０−５７９６（１９９２）；Ｗｅｉｎａｃｋｅｒ，Ａ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６９４０−６９４８（１９９４）；Ｐｒｉｅｔｏ，Ａ．Ｌ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０１５４−１０１５８（１９９３））。こともα_ｖβ_６インテグリンは１０年以上も前に最初に発見され配列決定されているが、α_ｖβ_６の特に疾患における生物学的意味はなお調査中である。α_ｖβ_６の発現は上皮細胞に限定され、そこにおいてはそれは健常組織では比較的低いレベルで発現され、そして発生、傷害、及び創傷治癒の間は顕著にアップレギュレートされる（Ｂｒｅｕｓｓ，Ｊ．Ｍ．等、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４１：１５２１−１５２７（１９９３）；Ｂｒｅｕｓｓ，Ｊ．Ｍ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０８：２２４１−２２５１（１９９５）；Ｋｏｉｖｉｓｔｏ，Ｌ．等、Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃ．７：２４５−２５７（１９９９）；Ｚａｍｂｒｕｎｏ，Ｇ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２９（３）：８５３−８６５（１９９５）；Ｈａｋｋｉｎｅｎ，Ｌ．等、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４８（６）：９８５−９９８（２０００））。増加中の最近の報告ではα_ｖβ_６は結腸癌（Ｎｉｕ，Ｊ．等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９２：４０−４８（２００１）；Ｂａｔｅｓ，Ｒ．Ｃ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：３３９−３４７（２００５））、卵巣癌（Ａｈｍｅｄ，Ｎ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８４：６７５−６８６（２００２）；Ａｈｍｅｄ，Ｎ．等、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５０：１３７１−１３７９（２００２）；Ａｈｍｅｄ，Ｎ．等、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．２３：２３７−２４４（２００２））、扁平上皮癌（Ｋｏｉｖｉｓｔｏ，Ｌ．等、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５５：１０−１７（２０００）；Ｘｕｅ，Ｈ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２８８：６１０−６１８（２００１）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．Ｊ．等、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１７：６７−７３（２００１）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．Ｊ．等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９２：６４１−６５０（２００１）；Ｒａｍｏｓ，Ｄ．Ｍ．等、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．２１：２９７−３０７（２００２）；（Ａｇｒｅｚ，Ｍ．等、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８１：９０−９７（１９９９）；Ｈａｍｉｄｉ，Ｓ．等、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８２（８）：１４３３−１４４０（２０００）；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ａ．等、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．９９（２）：５７−６４（２００３））、及び乳癌（Ａｒｉｈｉｒｏ，Ｋ．等、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ７：１９−２６（２０００）を包含する上皮起源の癌ではアップレギュレートされることが明らかにされている。更に、α_ｖサブユニットは腫瘍の転移に関与している可能性があり、そしてこのサブユニットをブロックすることが結果的には転移を防止する可能性があることも報告されている（例えばＩｍｈｏｆ，Ｂ．Ａ．等、ｉｎ： 「Ａｔｔｅｍｐｔｓ ｔｏ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉ，」 Ｕ．Ｇｕｅｎｔｈｅｒｔ ａｎｄ Ｗ．Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，ｅｄｓ．，Ｂｅｒｌｉｎ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ｐｐ．１９５−２０３（１９９６）参照）。
【０００４】
α_ｖβ_６インテグリンは腫瘍細胞の生物学において多重の調節機能を有する場合がある。最近の研究ではβ_６サブユニットの細胞外及び細胞質のドメインが異なる細胞活性を媒介することが明らかにされている。細胞外及び膜貫通ドメインはＴＧＦ−βの活性化及び接着を媒介することが分かっている（Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｄ．，Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２４：３９５−４０２（２００５）；Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｓ．等、Ｃｅｌｌ ９６：３１９−３２８（１９９９））。β_６サブユニットの細胞質ドメインはα_ｖβ_６調節細胞増殖、ＭＭＰ生産、遊走、及びプロ生存の媒介において重要であるユニークな１１アミノ酸配列を含有する（Ｌｉ，Ｘ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８ （４３）：４１６４６−４１６５３（２００３）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．Ｊ．等、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．１１７（１）：６７−７３（２００１）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．Ｊ．等、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８７（８）：８５９−８６７（２００２）；Ｊａｎｅｓ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｗａｔｔ，Ｆ．Ｍ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６６（３）：４１９−４３１（２００４））。β_６サブユニットはクローニングされ、発現され、そして精製されており（Ｓｈｅｐｐａｒｄ等、米国特許６，７８７，３２２ Ｂ２、参照により全体が本明細書に組み込まれる）、そしてα_ｖβ_６インテグリンに選択的に結合する機能ブロッキング抗体が報告されている（Ｗｅｉｎｒｅｂ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１７８７５−１７８７７（２００４）、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。α_ｖβ_６の拮抗剤（特定のモノクローナル抗体を包含）もまた、急性の肺傷害及び線維症の特定の形態の考えられる治療法として示唆されている（米国特許６，６９２，７４１ Ｂ２及びＷＯ ９９／０７４０５参照、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０００５】
α_ｖβ_６は幾つかのリガンド、例えばフィブロネクチン、テナシン、及び潜伏性関連ペプチド−１及び−３（ＬＡＰ１及びＬＡＰ３）、ＴＧＦ−β１の潜伏前駆体型のＮ末端２７８アミノ酸に、アルギニン−グリシン−アスパルテート（「ＲＧＤ」）モチーフとの直接の相互作用を介して結合することができる（Ｂｕｓｋ，Ｍ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（９）：５７９０−５７９６（１９９２）；Ｙｏｋｏｓａｋｉ，Ｙ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３９）：２４１４４−２４１５０（１９９６）；Ｈｕａｎｇ，Ｘ．Ｚ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１：２１８９−２１９５（１９９８）；Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｓ．等、Ｃｅｌｌ ９６：３１９−３２８（１９９９））。ＴＧＦ−βサイトカインは成熟活性Ｃ末端ＴＧＦ−βサイトカインに非共有結合的に会合したＮ末端ＬＡＰを有する潜伏性複合体として合成される。潜伏性ＴＧＦ−β複合体はその同族体受容体に結合することができず、そのため、活性型に変換されるまでは生物学的に活性ではない（Ｂａｒｃｅｌｌｏｓ−Ｈｏｆｆ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ．Ｍａｍｍ．Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ．１（４）：３５３−３６３（１９９６）；Ｇｌｅｉｚｅｓ，Ｐ．Ｅ．等、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １５（３）：１９０−１９７（１９９７）；Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｓ．等、Ｋｉｄ．Ｉｎｔ．５１：１３７６−１３８２（１９９７）；Ｋｈａｌｉｌ，Ｎ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．１（１５）：１２５５−１２６３（１９９９））。ＬＡＰ１又はＬＡＰ３へのα_ｖβ_６の結合はＴＧＦ−βをその受容体に結合可能とする潜伏性複合体におけるコンホーメーションの変化の結果として提案されているＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３の潜伏性前駆体型（Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｓ．等、Ｃｅｌｌ ９６：３１９−３２８（１９９９））の活性化をたらす。即ち、α_ｖβ_６のアップレギュレートされた発現はＴＧＦ−βの局所的活性化をもたらす場合があり、次にこれが下流の事象のカスケードを活性化する場合がある。
【０００６】
ＴＧＦ−β１サイトカインは細胞の増殖、分化、及び免疫応答を調節する多面性成長因子である（Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：１５８７−１５９０（１９９４）；Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：７５３−７９１（１９９８）；Ｃｈｅｎ，Ｗ．ａｎｄ Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．，ＴＧＦ−β： Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｂａｓｅｌ： Ｋａｒｇｅｒ，ｐｐ．６２−９１（２００２）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ８：３６９−３８０（２００５））。癌においてＴＧＦ−β１が果たす役割は２面性を有する。ＴＧＦ−βは腫瘍サプレッサー及び生育抑制活性と認識されているがなお、多くの腫瘍がＴＧＦ−β１の生育抑制活性に対して抵抗性を発生させる（Ｙｉｎｇｌｉｎｇ，Ｊ．Ｍ．等、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．３（１２）：１０１１−１０２２（２００４）；Ａｋｈｕｒｓｔ，Ｒ．Ｊ．等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１（１１）：Ｓ４４−Ｓ５１（２００１）；Ｂａｌｍａｉｎ，Ａ．ａｎｄ Ａｋｈｕｒｓｔ，Ｒ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２８（６９８０）：２７１−２７２（２００４））。樹立された腫瘍においては、ＴＧＦ−β１の発現及び活性は、腫瘍の生存、進行、及び転移の増進への関与を示唆されている（Ａｋｈｕｒｓｔ，Ｒ．Ｊ．等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１（１１）：Ｓ４４−Ｓ５１（２００１）；Ｍｕｒａｏｋａ，Ｒ．Ｓ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１２）：１５５１（２００２）；Ｙａｎｇ，Ｙ．Ａ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１２）：１６０７−１６１５（２００２））。これは免疫サーベイランス、血管形成、及び増大した腫瘍の間質圧力に対するＴＧＦ−βの作用を包含する局所的腫瘍支質環境におけるオートクリン及びパラクリンの両方の作用により媒介されるとされている。幾つかの研究は現在ＴＧＦ−β１を抑制することの抗腫瘍及び抗転移作用を明らかにしている（Ａｋｈｕｒｓｔ，Ｒ．Ｊ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１２）：１５３３−１５３６（２００２）；Ｍｕｒａｏｋａ，Ｒ．Ｓ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１２）：１５５１（２００２）；Ｙｉｎｇｌｉｎｇ，Ｊ．Ｍ．等、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．３（１２）：１０１１−１０２２（２００４）；Ｙａｎｇ，Ｙ．Ａ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１２）：１６０７−１６１５（２００２）；Ｈａｌｄｅｒ，Ｓ．Ｋ．等、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ７（５）：５０９−５２１（２００５）；Ｉｙｅｒ，Ｓ．等、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４（３）：２６１−２６６（２００５））。
【０００７】
腫瘍上、特に腫瘍支質界面におけるα_ｖβ_６の増大した発現は、ＴＧＦ−β１の局所的活性化のユニークな機序及び腫瘍の生存、侵襲、及び転移を増進する能力を反映している場合がある。ヒト転移における高いレベルの発現は、転移を樹立する場合のα_ｖβ_６に潜在的役割を暗示するものであり、これは上皮から間葉への遷移、インビトロの腫瘍細胞侵襲、及びマウスモデルにおける転移に相関した発現をα_ｖβ_６が媒介できるという以前の報告と合致している（Ｂａｔｅｓ，Ｒ．Ｃ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５（２）：３３９−３４７（２００５）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．Ｊ．等、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８７（８）：８５９−８６７（２００２）；Ｍｏｒｇａｎ，Ｍ．Ｒ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２５）：２６５３３−２６５３９（２００４））。本発明者等は以前にα_ｖβ_６のヒト及びマウスの形態の両方に結合し、そしてα_ｖβ_６のそのリガンドへの結合及びα_ｖβ_６媒介ＴＧＦ−β１活性化をブロックする強力で選択的な抗α_ｖβ_６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の形成を報告している（Ｗｅｉｎｒｅｂ，Ｐ．Ｈ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１７）：１７８７５−１７８８７（２００４））。
【０００８】
α_ｖβ_６のヒト及びマウスの形態の両方に結合し、そしてα_ｖβ_６のそのリガンドへの結合及びα_ｖβ_６媒介ＴＧＦ−β１活性化をブロックする強力で選択的な抗α_ｖβ_６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の形成は以前に報告されている（Ｗｅｉｎｒｅｂ，Ｐ．Ｈ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１７）：１７８７５−１７８８７（２００４）；更に、「Ａｎｔｉ−α_ｖβ_６ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題され、２００６年７月１０日に出願されたＶｉｏｌｅｔｔｅ等による米国特許出願１１／４８３，１９０も参照でき、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ０３／１０００３３にも説明されているとおり、α_ｖβ_６に対する高親和性抗体が、そのような抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）における重要なアミノ酸残基の識別及び分析も含めて発見され、特性化されている。特にこのような高親和性抗体は（ａ）α_ｖβ_６に特異的に結合し；（ｂ）α_ｖβ_６のそのリガンド、例えばＬＡＰ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、及びテナシンへの結合を１０Ｄ５未満のＩＣ_５０値で抑制し（国際特許出願公開ＷＯ９９／０７４０５）；（ｃ）ＴＧＦ−βの活性化をブロックし；（ｄ）α_ｖβ_６への結合特異性を与えるＣＤＲにおける特定のアミノ酸配列を含有し；（ｅ）β_６サブユニットに特異的に結合し；及び／又は（ｆ）免疫染色の操作法、例えばパラフィン包埋組織の免疫染色においてα_ｖβ_６を認識する。
【０００９】
ＷＯ０３／１０００３３はまたα_ｖβ_６に結合する抗体が生物物理学的に異なるクラス及びサブクラスに分類できることを発見したと報告している。抗体の１つのクラスはα_ｖβ_６へのリガンド（例えばＬＡＰ）の結合をブロックする能力を示す（ブロッカー）。このクラスの抗体は更にカチオン依存性ブロッカー及びカチオン非依存性ブロッカーのサブクラスに分類できる。カチオン依存性ブロッカーの一部はアルギニン−グリシン−アスパルテート（ＲＧＤ）ペプチド配列を含有するのに対し、カチオン非依存性ブロッカーはＲＧＤ配列を含有しない。抗体の別のクラスはα_ｖβ_６に結合する能力を示すが、リガンドへのα_ｖβ_６の結合をブロックしない（ノンブロッカー）。
【００１０】
更に、ＷＯ０３／１０００３３は自身の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３がα_ｖβ_６に対する結合特異性を与える特定のアミノ酸配列よりなる重鎖及び軽鎖を含む抗体を開示している。ＷＯ０３／１０００３３はまたα_ｖβ_６に特異的に結合するが潜伏性関連ペプチド（ＬＡＰ）へのα_ｖβ_６の結合を抑制しない抗体、並びに同じエピトープに結合する抗体を提供している。
【００１１】
ＷＯ０３／１０００３３は更に、ハイブリドーマ６．１Ａ８、６．２Ｂ１０、６．３Ｇ９，６．８Ｇ６、６．２Ｂ１、６．２Ａ１、６．２Ｅ５、７．１Ｇ１０、７．７Ｇ５、及び７．１Ｃ５の細胞、コーディング配列を含む単離された核酸、及び抗α_ｖβ_６抗体のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを開示している。特にＷＯ０３／１０００３３はハイブリドーマ６．１Ａ８、６．３Ｇ９，６．８Ｇ６、６．２Ｂ１、６．２Ｂ１０、６．２Ａ１、６．２Ｅ５、７．１Ｇ１０、７．７Ｇ５、及び７．１Ｃ５により生産される抗体として重鎖及び軽鎖のポリペプチド配列を含む抗α_ｖβ_６抗体を開示している。ハイブリドーマの数種はブタペスト条約の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，ＰＯ Ｂｏｘ１５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１０８，ＵＳＡ）に寄託されている。特に、ハイブリドーマクローン６．３Ｇ９及び６．８Ｇ６は２００１年８月１６日に寄託され、そしてそれぞれアクセッション番号ＡＴＣＣＰＴＡ−３６４９及びＰＴＡ−３６４５を有している。ハイブリドーマ６．３Ｇ９及び６．８Ｇ６により生産されるマウス抗体は本出願において更に、それらのヒト化抗体としての潜在的開発のために探求中である。 マウスモノクローナル抗体３Ｇ９はヒト可溶性α_ｖβ_６で免疫化されたβ_６インテグリン−／−マウス（Ｈｕａｎｇ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３３：９２１−９２８（１９９６））から単離されたマウスＩｇＧ１、カッパ抗体である。３Ｇ９抗体は傷害、線維症及び癌の間にアップレギュレートされたレベルで発現されるα_ｖβ_６インテグリンエピトープを特異的に認識する（例えばＴｈｏｍａｓ等、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １１７：６７−７３（２００１）；Ｂｒｕｎｔｏｎ等、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３：２１５−２２６（２００１）；Ａｇｒｅｚ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８１：９０−９７（１９９９）；Ｂｒｅｕｓｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８：２２４１−２２５１（１９９５）参照）。これは他のα_ｖインテグリンには結合せず、そしてヒト及びマウスの分子の両方に対して交差反応性である。マウスモノクローナル抗体３Ｇ９は精製されたヒト可溶性α_ｖβ_６に、又はβ６発現細胞の何れかに結合するリガンドのブロッキングにより測定した場合にＬＡＰへのα_ｖβ_６の結合をブロックし、これによりＴＧＦ−β受容体活性化のプロ線維症活性を抑制すると記載されている（ＷＯ０３／１０００３３参照）。これはまた、既知のα_ｖβ_６抗体である１０Ｄ５のものよりも低値のＩＣ_５０でＴＧＦ−βのα_ｖβ_６媒介活性化を抑制することが分かっている（Ｈｕａｎｇ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１１：２１８９−２１９５（１９９８））。
【００１２】
マウスモノクローナル抗体８Ｇ６はＷＯ０３／１０００３３に記載される通り、α_ｖβ_６インテグリンエピトープをやはり認識するマウスＩｇＧ１カッパ抗体である。マウスモノクローナル抗体８Ｇ６は１０Ｄ５より低値のＩＣ_５０でＴＧＦ−βのα_ｖβ_６媒介活性化を抑制する能力を呈するα_ｖβ_６のカチオン依存性高親和性のブロッカーである（ＷＯ０３／１０００３３参照）。
【００１３】
３Ｇ９及び８Ｇ６のマウス抗体の両方ともＷＯ０３／１０００３３に記載の通り、腎臓及び肺の線維症の防止において有効であった。更に、マウス抗体３Ｇ９はヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて腫瘍の増殖を効果的に防止することができ、癌の病理におけるα_ｖβ_６の潜在的役割、及びα_ｖβ_６に指向された抗体を使用したこのような遮断の有効性を示唆している。
【００１４】
ｓｍａｄ４はＴＧＦ−β経路におけるシグナリングトランスダクションに関与するｓｍａｄ経路の成分である（非特許文献１；非特許文献２）。ｄｐｃ４（「膵臓癌で低下」の意味）としても知られているこの遺伝子は腫瘍サプレッサ遺伝子であると考えられ、そしてｓｍａｄ４発現の低下は膵臓癌（非特許文献３；非特許文献４），食道癌（非特許文献２），子宮頸癌（非特許文献５）及び他の原発のヒトの癌（非特許文献６）を含む種々の原発癌において、並びに膵臓癌のもの（非特許文献７；非特許文献８），及び結腸癌のもの（非特許文献１）を含む細胞株の癌のモデルにおいて観察されている。腫瘍におけるｓｍａｄ４の低減された発現は特にｓｍａｄ４欠損性の膵臓の腺癌を有する患者において、患者の生存に関する不良な予後に関連していた（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。ｓｍａｄ４の遺伝子産物の腫瘍抑制活性の機序の理解は乏しいが、それはＴＧＦ−βシグナリング経路の特定の成分の生育抑制型及び生育活性化型の活性を調節する「スイッチ」として作用している可能性があると考えられる（考察については、Ａｋｈｕｒｓｔ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：１５３３−１５３６（２００２）；Ｂａｃｈｍａｎ，Ｋ．Ｅ．，ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｂ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：４９−５４（２００４）；Ｂｉｅｒｉｅ，Ｂ．，ａｎｄ Ｍｏｓｅｓ，Ｈ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ６：５０６−５２０（２００６）参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｌｅｖｙ，Ｌ．およびＨｉｌｌ，Ｃ．Ｓ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２００５）２５：８１０８−８１２５
【非特許文献２】Ｆｕｋｕｃｈｉ，Ｍ．等、Ｃａｎｃｅｒ（２００２）９５：７３７−７４３
【非特許文献３】Ｌｕｔｔｇｅｓ，Ｊ．等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００１）１５８：１６７７−１６８３
【非特許文献４】Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｇ．等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００４）６４：５２００−５２１１
【非特許文献５】Ｍａｌｉｅｋａｌ，Ｔ．Ｔ．等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００３）２２：４８８９−４８９７
【非特許文献６】Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｃ．Ａ．等、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．（２００４）１０：１５９７−１６０４
【非特許文献７】Ｌｏｈｒ，Ｍ．等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１）６１：５５０−５５５
【非特許文献８】Ｙａｓｕｔｏｍｅ，Ｍ．等、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（２００５）２２：４６１−４７３
【非特許文献９】Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１）７：３８５３−３８５６
【非特許文献１０】Ｔａｓｃｉｌａｒ，Ｍ．等、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１）７：４１１５−４１２１
【非特許文献１１】Ｔｏｇａ，Ｔ．等、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００４）２４：１１７３−１１７８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
要旨
本発明はα_ｖβ_６結合抗体のようなα_ｖβ_６結合リガンドを用いた癌の診断、治療及び防止の方法に関する。特に本発明は腫瘍におけるｓｍａｄ４の低減された発現及びインテグリンα_ｖβ_６の増大した発現とそのような発現パターンを有する腫瘍細胞がα_ｖβ_６活性化合物に対し、そしてＴＧＦ−β抑制リガンドに対して応答し易いという傾向との間の相関の発見に関する。
【００１７】
即ち、１つの実施形態において、本発明は（ａ）腫瘍又はその一部分を含む癌性の組織試料、及び場合により非癌性の組織試料を患者から得る工程；（ｂ）上記癌性組織試料由来、及び場合により上記非癌性の組織試料由来の細胞におけるｓｍａｄ４の発現のレベルを測定する工程；（ｃ）上記組織試料由来の細胞を、インテグリンα_ｖβ_６のサブユニット１つ以上に結合するリガンド１つ以上に接触させる工程；及び（ｄ）上記癌性組織試料由来の上記細胞中の、及び場合により上記非癌性の組織試料由来の上記細胞からのインテグリンα_ｖβ_６の発現のレベルを測定する工程、及び上記癌性の組織試料中における発現のレベルをレファレンス試料、例えば上記非癌性の組織試料中の発現のレベルと比較する工程により、腫瘍を特性化することを含む、腫瘍を特性化する、例えば転移性、又は侵襲性の腫瘍に進行する可能性が高い腫瘍を発見する、又はあらかじめ選択された薬剤、例えば本明細書に記載した抗α_ｖβ_６剤を用いた治療のための腫瘍を発見する方法を提供する。レファレンス値と合致するかそれを超過する癌性の試料中の発現のレベルは、転移性又は侵襲性の腫瘍に進行する可能性がより高い腫瘍の存在を示す。例えば上記非癌性の組織試料中のｓｍａｄ４及びインテグリンα_ｖβ_６の発現のレベルと相対比較した場合の、上記癌性組織試料由来の細胞におけるｓｍａｄ４発現の低下及びそれに併発したインテグリンα_ｖβ_６の発現のレベルの上昇は、転移性又は侵襲性の腫瘍に進行する可能性がより高い腫瘍が上記患者において存在することを示す。本発明の特定のそのような実施形態において、腫瘍細胞は癌腫、例えば腺癌である。より特定される実施形態においては、癌腫は膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、扁平上皮細胞癌（例えば食道癌）、頭部頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、及び肺癌である。より特定すれば癌腫は膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、又は頭部頸部癌である。本発明の特徴に従った適当な実施形態はα_ｖβ_６結合抗体又はそのα_ｖβ_６エピトープ結合フラグメントであるα_ｖβ_６インテグリン結合リガンドを使用する。特定の本発明そのような実施形態によれば、抗体はモノクローナル抗体（キメラ、霊長類化、ヒト又はヒト化のものであってよい）、例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願２００５／０２５５１０２ Ａ１に開示されているものである。適当なそのような抗体は、これらに限定されないが、１Ａ８、３Ｇ９、８Ｇ６、２Ｂ１、２Ｂ１０、２Ａ１、２Ｅ５、１Ｇ１０、７Ｇ５、１Ｃ５、１０Ｄ５（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３８２）及びＣＳβ_６と命名されたα_ｖβ_６結合モノクローナル抗体、並びにそれらのフラグメント、キメラ及びハイブリッドを包含する。本発明のそのような実施形態における使用のために特に適するものはモノクローナル抗体３Ｇ９及び８Ｇ６である。本発明のそのような実施形態における使用のためにやはり特に適するものはヒト化モノクローナル抗体、例えばｈｕ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）と命名されたヒト化３Ｇ９抗及びｈｕ８Ｇ６と命名されたヒト化８Ｇ６抗体である。本発明の特定のそのような特徴において、リガンドは少なくとも１つの検出可能な標識、例えば発色性標識（例えばジアミノベンジジン及び４−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）、酵素標識（マレエートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、コウボアルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼ）、放射性同位体標識（例えば^３Ｈ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^５１Ｃｒ、^５７Ｔｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^１５２Ｅｕ、^９０Ｙ、^６７Ｃｕ、^２１７Ｃｉ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^４７Ｓｃ及び^１０９Ｐｄ）、非放射性同位体標識（例えば^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^１６２Ｄｙ、^５２Ｔｒ、^５６Ｆｅ、^９９ｍＴｃ及び^１１２Ｉｎ）、蛍光標識（例えば^１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）標識、ｏ−フタルデヒド標識、及びフルオレスカミン標識）、毒素標識（例えばジフテリア毒素標識、リシン標識、及びコレラ毒素標識）、化学発光標識（例えばルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、オキサレートエステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、及びエクオリン標識）、Ｘ線撮影用標識（例えばバリウム又はセシウム）、スピン標識（例えば重水素）、又は核磁気共鳴造影剤標識（例えばＧｄ、Ｍｎ及び鉄）にコンジュゲートされる。
【００１８】
関連する実施形態において、本発明は、例えば腫瘍が転移性又は侵襲性になる増大した潜在性を有する場合の、患者から腫瘍を排除するための治療方法を提供する。そのような方法は、例えば本明細書に記載した組織試料を特性化すること、例えば（ａ）上記したそのような腫瘍を発見するための方法に従って、転移性又は侵襲性の腫瘍に進行する可能性がより高い腫瘍を患者の組織試料において発見する工程；及び（ｂ）そのような腫瘍が発見されている患者に、α_ｖβ_６陽性転移性腫瘍細胞１つ以上上のインテグリンα_ｖβ_６のサブユニット１つ以上に結合するリガンド１つ以上の治療有効量を投与することを含み、ここでインテグリンへのリガンドの結合は上記転移性腫瘍細胞の死滅、化学療法剤感受性化（ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅ）、又は低下した侵襲性をもたらす。好ましい実施形態においては、同じ薬剤、例えば同じ抗体を用いて腫瘍を特性化し、そして患者を治療する。別の実施形態においては、異なる薬剤又は抗体を使用する。例えば特性化は第１の標識を有する抗体を用いて実施でき、そして治療は第２の標識、例えば治療薬を有する抗体を用いて実施できる。
【００１９】
関連する実施形態において、本発明は（ａ）本明細書に記載した組織試料を特性化すること、例えば上記したそのような腫瘍を発見するための方法に従って、転移性又は侵襲性の腫瘍に進行する可能性がより高い腫瘍を患者の組織試料において発見する工程；及び（ｂ）前転移性又は前侵襲性の腫瘍における細胞１つ以上の上のインテグリンα_ｖβ_６のサブユニット１つ以上に結合するリガンド１つ以上の治療有効量を患者に投与することを含む、患者における前転移性の腫瘍の転移性の腫瘍への進行を低減又は防止する方法を提供し、ここでインテグリンへのリガンドの結合は原発腫瘍を包囲する組織領域内への前転移性の癌の細胞の侵襲の低減又は防止をもたらす。本発明のこの特徴による治療実施形態においては、α_ｖβ_６結合リガンド（例えばα_ｖβ_６結合抗体）は細胞又は組織上のα_ｖβ_６インテグリン１つ以上へのα_ｖβ_６結合リガンド毒性化合物コンジュゲートの結合時に細胞又は組織の死滅をもたらすか誘導する細胞毒性の化合物又は薬剤１つ以上にコンジュゲート又は結合することができる。一部の実施形態においては、腫瘍を特性化するために使用する抗体は細胞毒性の化合物又は薬剤を欠いていることになる。本発明の別の治療実施形態においては、α_ｖβ_６結合リガンド（例えばα_ｖβ_６結合抗体）はそのような細胞毒性の化合物又は薬剤１つ以上と組み合わせて患者に投与される。本発明のこれらの特徴に従って使用する場合に適当であることができる細胞毒性の化合物又は薬剤は、これらに限定されないが細胞毒性剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、トリコテン、ＣＣ１０６５、ジフテリアＡ鎖、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉ蛋白、ダイアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）蛋白、Ｐｙｈｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白、モモルジカ・チャランチア阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしても知られており、本明細書においては互換的に使用）、ゲムシタビン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、リボヌクレアーゼ、及びデオキシリボヌクレアーゼ）、放射性同位体（例えば^２１１Ａｔ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^２１２Ｂｉ、^３２Ｐ、及びＬｕの放射性同位体）及びプロドラッグ活性化酵素（例えばアルカリホスファターゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミナーゼ、プロテアーゼ、Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ、炭水化物切断酵素、Ｐ−ラクタマーゼ及びペニシリンアミダーゼ）を包含する。細胞毒性剤はまた、特定の細胞をリクルートする、又は一般的に腫瘍に対する免疫応答を増大させる薬剤でもある。特定の実施形態においては、α_ｖβ_６インテグリン結合リガンド１つ以上はα_ｖβ_６インテグリン結合リガンド１つ以上の有効量及び製薬上許容しうる担体又は賦形剤１つ以上を含む医薬組成物の形態で患者に投与される。α_ｖβ_６インテグリン結合リガンド１つ以上及び／又はα_ｖβ_６インテグリン結合リガンド１つ以上を含む１つ以上の医薬組成物は、医薬組成物を投与する何れかの適当な様式、例えばこれらに限定されないが経口投与、非経腸投与（例えば筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下経路の注射）、頭蓋内投与、経皮投与、肺内投与、及び鼻内投与により患者に投与できる。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は侵襲性の癌腫に進行する可能性がより高い、及び／又はインテグリンα_ｖβ_６のサブユニット１つ以上に結合するリガンドによる治療により応答し易い、腫瘍、例えば癌腫（例えば腺癌）を診断又は発見する方法を提供する。適当なそのような方法は、例えば（ａ）腫瘍又はその一部分を含む癌性の上皮組織試料、及び非癌性の上皮組織試料を患者から得る工程；（ｂ）上記組織試料由来の細胞におけるｓｍａｄ４の発現のレベルを測定する工程；（ｃ）組織試料をインテグリンα_ｖβ_６のサブユニット１つ以上に結合するリガンド１つ以上に接触させる工程；及び（ｄ）組織試料中のインテグリンα_ｖβ_６の発現のレベルを測定することを含んでよく、ここで非癌性の組織試料中のｓｍａｄ４及びインテグリンα_ｖβ_６の発現のレベルと相対比較した場合の、癌性の組織試料中におけるｓｍａｄ４の発現のレベルの低下、及びそれに併発したインテグリンα_ｖβ_６の発現のレベルの上昇は、（ａ）上皮内又は非侵襲性の形態から侵襲性の転移性の形態への進行の可能性が増大している；及び／又は（ｂ）α_ｖβ_６結合リガンド、特に上記したもののような細胞毒性の化合物又は薬剤１つ以上とコンジュゲートされた、又はそれと組み合わせて投与されるα_ｖβ_６結合リガンドの結合に依存している上記参照した治療方法１つ以上による治療に応答する可能性がより高い腫瘍の患者における存在を示している。そのような方法は、例えばこれらに限定されないが上記下上皮組織の関与するものを包含する種々の腫瘍を診断又は発見するために適している。特定のそのような実施形態においては、インテグリンα_ｖβ_６のサブユニット１つ以上に結合するリガンドは、α_ｖβ_６インテグリン結合抗体（上記したもののようなモノクローナル抗体であってよい）又はそのα_ｖβ_６エピトープ結合フラグメントである。本発明のそのような診断方法における使用のために特に適するものは、検出可能に標識された、即ち少なくとも１つの検出可能な標識、例えば発色性標識（例えばジアミノベンジジン及び４−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）、酵素標識（マレエートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、コウボアルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼ）、放射性同位体標識（例えば^３Ｈ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^５１Ｃｒ、^５７Ｔｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^１５２Ｅｕ、^９０Ｙ、^６７Ｃｕ、^２１７Ｃｉ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^４７Ｓｃ及び^１０９Ｐｄ）、非放射性同位体標識（例えば^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^１６２Ｄｙ、^５２Ｔｒ、^５６Ｆｅ、^９９ｍＴｃ及び^１１２Ｉｎ）、蛍光標識（例えば^１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）標識、ｏ−フタルデヒド標識、及びフルオレスカミン標識）、毒素標識（例えばジフテリア毒素標識、リシン標識、及びコレラ毒素標識）、化学発光標識（例えばルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、オキサレートエステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、及びエクオリン標識）、Ｘ線撮影用標識（例えばバリウム又はセシウム）、スピン標識（例えば重水素）、又は核磁気共鳴造影剤標識（例えばＧｄ、Ｍｎ及び鉄）を含むか、これらにコンジュゲートされるか、又はこれらと結合したα_ｖβ_６結合リガンド（例えば抗体）である。
【００２１】
１つの特徴において、本発明はｓｍａｄ４欠損性の腫瘍に由来する細胞の増殖を抑制する方法を特徴とする。方法は例えば腫瘍由来の細胞中のｓｍａｄ４の発現のレベルを測定すること、及び腫瘍細胞の増殖抑制又は死滅を誘発する薬剤１つ以上をｓｍａｄ４発現において欠損性の腫瘍細胞に投与することを包含する。薬剤１つ以上は、例えばインテグリンα_ｖβ_６のサブユニット１つ以上に結合するリガンド、例えば抗α_ｖβ_６抗体、又はそのα_ｖβ_６エピトープ結合フラグメントであることができる。別の実施形態においては、薬剤１つ以上は細胞におけるＴＧＦ−βシグナリング経路を抑制する。そのような薬剤は、例えばプロテインキナーゼ分子、小分子治療薬化合物、又は可溶性ＴＧＦ−β受容体ポリペプチドを包含する。
【００２２】
別の特徴において、本発明は生育抑制性の化学療法剤化合物を用いた治療に対してｓｍａｄ４欠損腫瘍細胞を化学療法剤感受性化する方法を特徴とする。方法は例えば、腫瘍由来の細胞におけるｓｍａｄ４の発現のレベルを測定すること、及び、治療が生育抑制性の化学療法剤化合物１つ以上に対する増大した応答性をもたらすように薬剤１つ以上でｓｍａｄ４発現に関して欠損性の腫瘍細胞を治療することを包含する。薬剤１つ以上は例えば、インテグリンα_ｖβ_６のサブユニット１つ以上に結合するリガンド、又はＴＧＦ−βシグナリング経路を抑制する薬剤であることができる。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施形態は、以下に示す図面及び発明の説明、及び特許請求の範囲を参照すれば、当業者にとって明らかであろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ｓｍａｄ４欠損である腫瘍由来の細胞の増殖を抑制する方法であって、下記工程：
（ａ）該腫瘍由来の細胞におけるｓｍａｄ４の発現のレベルを測定する工程；及び、
（ｂ）腫瘍細胞におけるインテグリンα_ｖβ_６のサブユニット１つ以上に結合するリガンド１つ以上でｓｍａｄ４発現が欠損している該腫瘍細胞を処理する工程；
を含み、
ここで該処理は該腫瘍細胞の増殖抑制又は死滅をもたらす、方法。
（項目２）
ｓｍａｄ４欠損である腫瘍由来の細胞の増殖を抑制する方法であって、下記工程：
（ａ）該腫瘍由来の細胞におけるｓｍａｄ４の発現のレベルを測定する工程；及び、
（ｂ）腫瘍細胞におけるＴＧＦ−βシグナリング経路を抑制する薬剤１つ以上でｓｍａｄ４発現が欠損している腫瘍細胞を処理する工程；
を含み、
ここで該処理は該腫瘍細胞の増殖抑制又は死滅をもたらす、方法。
（項目３）
上記腫瘍が癌腫である、項目１又は２記載の方法。
（項目４）
上記癌腫が腺癌である、項目３記載の方法。
（項目５）
上記癌腫が膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、扁平上皮細胞癌、頭部頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、及び肺癌よりなる群から選択される、項目３記載の方法。
（項目６）
上記癌腫が膵臓癌である、項目３記載の方法。
（項目７）
上記扁平上皮癌が食道癌である、項目５記載の方法。
（項目８）
上記癌腫が結腸直腸癌である、項目３記載の方法。
（項目９）
上記癌腫が子宮頸癌である、項目３記載の方法。
（項目１０）
上記癌腫が頭部頸部癌である、項目３記載の方法。
（項目１１）
α_ｖβ_６インテグリンに結合する上記リガンドが抗体又はそのα_ｖβ_６エピトープ結合フラグメントである、項目１記載の方法。
（項目１２）
上記抗体がモノクローナル抗体である、項目１１記載の方法。
（項目１３）
上記モノクローナル抗体がキメラモノクローナル抗体、霊長類化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体である、項目１２記載の方法。
（項目１４）
上記モノクローナル抗体が２Ａ１、２Ｅ５、１Ａ８、２Ｂ１０、２Ｂ１、１Ｇ１０、７Ｇ５、１Ｃ５、８Ｇ６、３Ｇ９、１０Ｄ５及びＣＳβ６よりなる群から選択される、項目１２記載の方法。
（項目１５）
上記モノクローナル抗体が３Ｇ９である、項目１２記載の方法。
（項目１６）
上記モノクローナル抗体が８Ｇ６である、項目１２記載の方法。
（項目１７）
上記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、項目１２記載の方法。
（項目１８）
上記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）である、項目１７記載の方法。
（項目１９）
上記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ８Ｇ６である、項目１７記載の方法。
（項目２０）
上記リガンドが検出可能な標識少なくとも１つにコンジュゲートされている、項目１記載の方法。
（項目２１）
上記検出可能な標識が発色性標識、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性同位体標識、蛍光標識、毒素標識、化学発光標識、Ｘ線撮影用標識、スピン標識、及び核磁気共鳴造影剤標識よりなる群から選択される、項目２０記載の方法。
（項目２２）
上記発色性標識がジアミノベンジジン及び４−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸よりなる群から選択される、項目２１記載の方法。
（項目２３）
上記酵素標識がマレエートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、コウボアルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼよりなる群から選択される、項目２１記載の方法。
（項目２４）
上記放射性同位体標識が^３Ｈ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^５１Ｃｒ、^５７Ｔｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^１５２Ｅｕ、^９０Ｙ、^６７Ｃｕ、^２１７Ｃｉ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^４７Ｓｃ及び^１０９Ｐｄよりなる群から選択される、項目２１記載の方法。
（項目２５）
上記非放射性同位体標識が^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^１６２Ｄｙ、^５２Ｔｒ、^５６Ｆｅ、^９９ｍＴｃ及び^１１２Ｉｎよりなる群から選択される、項目２１記載の方法。
（項目２６）
上記蛍光標識が^１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）標識、ｏ−フタルデヒド標識、及びフルオレスカミン標識よりなる群から選択される、項目２１記載の方法。
（項目２７）
上記毒性標識がジフテリア毒素標識、リシン標識、及びコレラ毒素標識よりなる群から選択される、項目２１記載の方法。
（項目２８）
上記化学発光標識がルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、オキサレートエステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、及びエクオリン標識よりなる群から選択される、項目２１記載の方法。
（項目２９）
上記Ｘ線撮影用標識がバリウム又はセシウムである、項目２１記載の方法。
（項目３０）
上記スピン標識が重水素である、項目２１記載の方法。
（項目３１）
上記核磁気共鳴造影剤標識がＧｄ、Ｍｎ、及び鉄よりなる群から選択される、項目２１記載の方法。
（項目３２）
上記腫瘍細胞においてＴＧＦ−βシグナリング経路を抑制する上記薬剤が下記：
（ａ）プロテインキナーゼ分子；
（ｂ）小分子治療薬化合物；及び、
（ｃ）可溶性ＴＧＦ−β受容体ペプチド；
よりなる群から選択される、項目２記載の方法。
（項目３３）
生育抑制性の化学療法剤化合物を用いた治療に対してｓｍａｄ４欠損腫瘍細胞を化学療法剤感受性化する方法であって、下記工程：
（ａ）該腫瘍由来の細胞におけるｓｍａｄ４の発現のレベルを測定する工程；及び、
（ｂ）該腫瘍細胞におけるインテグリンα_ｖβ_６のサブユニット１つ以上に結合するリガンド１つ以上でｓｍａｄ４発現が欠損している腫瘍細胞を処理する工程；
を含み、
ここで該処理は生育抑制性の化学療法剤化合物１つ以上に対する該腫瘍細胞の増大した応答性をもたらす、方法。
（項目３４）
生育抑制性の化学療法剤化合物を用いた治療に対してｓｍａｄ４欠損腫瘍細胞を化学療法剤感受性化する方法であって、下記工程：
（ａ）該腫瘍由来の細胞におけるｓｍａｄ４の発現のレベルを測定する工程；及び、
（ｂ）該腫瘍細胞におけるＴＧＦ−βシグナリング経路を抑制する薬剤１つ以上でｓｍａｄ４発現が欠損している腫瘍細胞を処理する工程；
を含み、
ここで該処理は生育抑制性の化学療法剤化合物１つ以上に対する該腫瘍細胞の増大した応答性をもたらす、方法。
（項目３５）
上記腫瘍が癌腫である、項目３３又は３４記載の方法。
（項目３６）
上記癌腫が腺癌である、項目３５記載の方法。
（項目３７）
上記癌腫が膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、扁平上皮細胞癌、頭部頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、及び肺癌よりなる群から選択される、項目３５記載の方法。
（項目３８）
上記癌腫が膵臓癌である、項目３５記載の方法。
（項目３９）
上記扁平上皮癌が食道癌である、項目３７記載の方法。
（項目４０）
上記癌腫が結腸直腸癌である、項目３５記載の方法。
（項目４１）
上記癌腫が子宮頸癌である、項目３５記載の方法。
（項目４２）
上記癌腫が頭部頸部癌である、項目３５記載の方法。
（項目４３）
α_ｖβ_６インテグリンに結合する上記リガンドが抗体又はそのα_ｖβ_６エピトープ結合フラグメントである、項目３３記載の方法。
（項目４４）
上記抗体がモノクローナル抗体である、項目３３記載の方法。
（項目４５）
上記モノクローナル抗体がキメラ、霊長類化、又はヒト化モノクローナル抗体である、項目４４記載の方法。
（項目４６）
上記モノクローナル抗体が２Ａ１、２Ｅ５、１Ａ８、２Ｂ１０、２Ｂ１、１Ｇ１０、７Ｇ５、１Ｃ５、８Ｇ６、３Ｇ９、１０Ｄ５及びＣＳβ６よりなる群から選択される、項目４４記載の方法。
（項目４７）
上記モノクローナル抗体が３Ｇ９である、項目４４記載の方法。
（項目４８）
上記モノクローナル抗体が８Ｇ６である、項目４４記載の方法。
（項目４９）
上記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、項目４４記載の方法。
（項目５０）
上記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）である、項目４９記載の方法。
（項目５１）
上記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ８Ｇ６である、項目４９記載の方法。
（項目５２）
上記リガンドが検出可能な標識少なくとも１つにコンジュゲートされている、項目３３記載の方法。
（項目５３）
上記検出可能な標識が発色性標識、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性同位体標識、蛍光標識、毒素標識、化学発光標識、Ｘ線撮影用標識、スピン標識、及び核磁気共鳴造影剤標識よりなる群から選択される、項目５２記載の方法。
（項目５４）
上記発色性標識がジアミノベンジジン及び４−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸よりなる群から選択される、項目５３記載の方法。
（項目５５）
上記酵素標識がマレエートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、コウボアルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼよりなる群から選択される、項目５３記載の方法。
（項目５６）
上記放射性同位体標識が^３Ｈ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^５１Ｃｒ、^５７Ｔｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^１５２Ｅｕ、^９０Ｙ、^６７Ｃｕ、^２１７Ｃｉ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^４７Ｓｃ及び^１０９Ｐｄよりなる群から選択される、項目５３記載の方法。
（項目５７）
上記非放射性同位体標識が^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^１６２Ｄｙ、^５２Ｔｒ、^５６Ｆｅ、^９９ｍＴｃ及び^１１２Ｉｎよりなる群から選択される、項目５３記載の方法。
（項目５８）
上記蛍光標識が^１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）標識、ｏ−フタルデヒド標識、及びフルオレスカミン標識よりなる群から選択される、項目５３記載の方法。
（項目５９）
上記毒性標識がジフテリア毒素標識、リシン標識、及びコレラ毒素標識よりなる群から選択される、項目５３記載の方法。
（項目６０）
上記化学発光標識がルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、オキサレートエステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、及びエクオリン標識よりなる群から選択される、項目５３記載の方法。
（項目６１）
上記Ｘ線撮影用標識がバリウム又はセシウムである、項目５３記載の方法。
（項目６２）
上記スピン標識が重水素である、項目５３記載の方法。
（項目６３）
上記核磁気共鳴造影剤標識がＧｄ、Ｍｎ、及び鉄よりなる群から選択される、項目５３記載の方法。
（項目６４）
上記腫瘍細胞においてＴＧＦ−βシグナリング経路を抑制する上記薬剤が下記：
（ａ）プロテインキナーゼ分子；
（ｂ）小分子治療薬化合物；及び、
（ｃ）可溶性ＴＧＦ−β受容体ペプチド；
よりなる群から選択される、項目３４記載の方法。
（項目６５）
上記生育抑制性の化学療法剤化合物がシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、アドリアマイシン、メルファラン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、トリコテン、ＣＣ１０６５、ジフテリアＡ鎖、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉ蛋白、ダイアンシン蛋白、Ｐｙｈｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白、モモルジカ・チャランチア阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、リボヌクレアーゼ、及びデオキシリボヌクレアーゼよりなる群から選択される、項目３３又は項目３４記載の方法。
（項目６６）
上記生育抑制性の化学療法剤化合物がゲムシタビン、アドリアマイシン、又はパクリタキセルである、項目６５記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は記載した原発腫瘍部位からリンパ節（図１Ａ〜１Ｄ）又は肺（図１Ｅ〜１Ｆ）の何れかに転移した特定のヒト癌腫におけるα_ｖβ_６発現（暗色域）のレベルを示す顕微鏡写真の複合物である。
【図２】図２は記載した原発腫瘍部位から記載した転移腫瘍部位に転移している特定のヒト癌腫におけるα_ｖβ_６発現（暗色域）のレベルを示す顕微鏡写真の複合物である。
【図３】図３は異なる５患者に由来する原発及び転移の膵臓腺癌腫瘍のマッチした試料において観察されたα_ｖβ_６発現（暗色域）のレベルを示す顕微鏡写真の複合物である。図３Ａ〜３Ｅ：異なる５患者由来の原発腫瘍試料における発現であって、３つは腺扁平上皮として特性化された腫瘍を有するもの（図３Ａ〜３Ｃ）であり、そして２つは分化の乏しいものとして特性化された腫瘍を有するもの（図３Ｄ〜３Ｅ）である。図３Ｆ〜３Ｊ：これらの同じ５患者に由来するマッチしたリンパ節転移における発現。図３Ｋ〜３Ｌ：５患者のうち２患者から得た正常膵臓組織における発現。
【図４】図４は上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ；ＢｒＣａ１９）（図４Ａ）及び侵襲性の乳癌（ＢｒＣａ２３）（図４Ｂ）の組織切片において観察されたα_ｖβ_６発現（暗色域）のレベルを示す２つの顕微鏡写真の複合物である。
【図５】図５は異なる３患者由来の原発及び転移の膵臓の腺管腺癌腫瘍のマッチした試料において観察されたα_ｖβ_６発現（暗色域）のレベルを示す顕微鏡写真の複合物である。図５Ａ〜５Ｃ：異なる３患者に由来する原発腫瘍試料における発現。図５Ｄ〜５Ｆ：これらの同じ３患者に由来するマッチしたリンパ節転移における発現。図５Ｇ〜５Ｈ：３患者のうち２患者からから得た正常膵臓組織における発現。
【図６】図６は異なる５患者に由来する原発及び転移の膵臓腺癌腫瘍のマッチした試料において観察されたα_ｖβ_６発現（暗色域）のレベルを示す顕微鏡写真の複合物である。図６Ａ〜６Ｅ：異なる５患者由来の原発腫瘍試料における発現であって、３つは腺扁平上皮として特性化された腫瘍を有するもの（図６Ａ〜６Ｃ）であり、そして２つは分化の乏しいものとして特性化された腫瘍を有するもの（図６Ｄ〜６Ｅ）である。図６Ｆ〜６Ｊ：これらの同じ５患者に由来するマッチしたリンパ節転移における発現。図６Ｋ〜６Ｌ：５患者のうち２患者から得た正常膵臓組織における発現。
【図７】図７はヒト膵臓癌のＢｘＰＣ−３マウス異種移植片モデルにおける腫瘍の増殖を抑制する抗α_ｖβ_６モノクローナル抗体（３Ｇ９）の能力を示す。図７Ａ：抗α_ｖβ_６モノクローナル抗体（３Ｇ９）を用いた免疫組織化学的手法を介して染色した異種移植片中の切片の顕微鏡写真。図７Ｂ：α_ｖβ_６ｍＡｂ３Ｇ９（黒色の三角形）、可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合蛋白（黒色の逆三角形）、又はビヒクルＰＢＳ（黒色の四角形）を用いた処理の間のＢｘＰＣ−３異種移植片腫瘍の生育曲線。図７Ｃ：試験終了時（第６６日）における個々の腫瘍の大きさの散布図。
【図８】図８はインテグリンα_ｖβ_６（上側３パネル）又はｓｍａｄ４（下側３パネル）の発現に関してプローブした異なる３患者試料由来の膵臓組織／腫瘍切片の一連の顕微鏡写真である。
【図９】図９はインテグリンα_ｖβ_６（上側３パネル）又はｓｍａｄ４（下側３パネル）の発現に関してプローブした異なる３患者試料由来の（そして図８のものとは異なる）膵臓組織／腫瘍切片の一連の顕微鏡写真である。
【図１０】図１０はインテグリンα_ｖβ_６（上側３パネル）又はｓｍａｄ４（下側３パネル）の発現に関してプローブした異なる３患者試料由来の（そして図８及び図９のものとは異なる）膵臓組織／腫瘍切片の一連の顕微鏡写真である。
【図１１】図１１はインテグリンα_ｖβ_６（上側２パネル）又はｓｍａｄ４（下側２パネル）の発現に関してプローブした異なる２患者試料由来の（そして図８〜図１０のものとは異なる）膵臓組織／腫瘍切片の一連の顕微鏡写真である。
【図１２】図１２はインテグリンα_ｖβ_６（上側２パネル）又はｓｍａｄ４（下側２パネル）の発現に関してプローブした、インテグリンα_ｖβ_６の発現に関しては異種（「＋／−」）である異なる２患者試料由来の（そして図８〜図１１のものとは異なる）膵臓組織／腫瘍切片の一連の顕微鏡写真である。
【図１３】図１３はインテグリンα_ｖβ_６又はｓｍａｄ４の発現に関してプローブした、インテグリンα_ｖβ_６の発現に関しては異種（「＋／−」）である単一の患者試料由来の（そして図１２のものとは異なる）膵臓組織／腫瘍切片の一連の顕微鏡写真である。
【図１４】図１４は図８〜図１３に示した結果を総括した表である。
【図１５】図１５は膵臓癌細胞株のパネルにおけるα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現レベルの総括である。
【図１６】図１６はＦｏｌｉｏアレイにより試験した場合の膵臓癌におけるα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現レベルを示す顕微鏡写真の複合物である。
【図１７】図１７は異なる２３膵臓腫瘍組織試料におけるα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現レベルを総括する模式図である。
【図１８】図１８はＢｉｏｍａｘ組織マイクロアレイ上で試験した異なる７０膵臓腺管腺癌（ＰＤＡＣ）試料におけるα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現レベルを総括する模式図である。
【図１９】図１９はＬｅｉｄｅｎアレイ上で試験した異なる５０ＰＤＡＣ試料におけるα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現レベルを総括する模式図である。
【図２０】図２０はＬｅｉｄｅｎアレイ上で試験した異なる９ＰＤＡＣ転移試料におけるα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現レベルを総括する模式図である。
【図２１】図２１Ａ及び図２１ＢはそれぞれＢｉｏｍａｘアレイ及びＬｅｉｄｅｎアレイにより測定した場合のＰＤＡＣにおけるα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現レベルの結果を総括する棒グラフである。
【図２２】図２２は単剤としての、又は組み合わせてとしての、ｍＡｂ３Ｇ９及びゲムシタビンに対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフである。
【図２３】図２３は単剤としての、又は組み合わせてとしての、ｍＡｂ３Ｇ９及びゲムシタビンに対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフであり、被験動物の結果は対照（ビヒクル）の結果のパーセントとして表示する。
【図２４】図２４は治療計画の第４５日における、単剤としての、又は組み合わせてとしての、ｍＡｂ３Ｇ９及びゲムシタビンに対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す散布図である。
【図２５】図２５はｍＡｂ３Ｇ９又はゲムシタビンを用いた治療に応答した宿主動物の体重の変化を示す直線グラフである。
【図２６】図２６は単剤としての、又は組み合わせてとしての、ｍＡｂ３Ｇ９及びドキソルビシンに対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフである。
【図２７】図２７は単剤としての、又は組み合わせてとしての、ｍＡｂ３Ｇ９及びドキソルビシンに対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフであり、被験動物の結果は対照（ビヒクル）の結果のパーセントとして表示する。
【図２８】図２８は治療計画の第４５日における、単剤としての、又は組み合わせてとしての、ｍＡｂ３Ｇ９及びドキソルビシンに対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す散布図である。
【図２９】図２９はｍＡｂ３Ｇ９又はドキソルビシンを用いた治療に応答した宿主動物の体重の変化を示す直線グラフである。
【図３０】図３０Ａは単剤としての、又は組み合わせてとしての、ｍＡｂ３Ｇ９及びゲムシタビンに対する、そして可溶性ＴＧＦ−β受容体ＩＩ／Ｆｃ融合蛋白（ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ）に対する、無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＳｕ８６．８６ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフである。図３０Ｂは単剤としての、又は組み合わせてとしての、ｍＡｂ３Ｇ９及びゲムシタビンに対する、そしてＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃに対する、無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＳｕ８６．８６ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフであり、被験動物の結果は対照（ビヒクル）の結果のパーセントとして表示する。
【図３１】図３１ＡはｍＡｂ３Ｇ９及びＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃに対する、そして何れかの薬剤のゲムシタビンとの組み合わせに対する、無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＰａｎｃ０４ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフである。図３１ＢはｍＡｂ３Ｇ９及びＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃに対する、そして何れかの薬剤のゲムシタビンとの組み合わせに対する、無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＰａｎｃ０４ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフであり、被験動物の結果は対照（ビヒクル）の結果のパーセントとして表示する。
【図３２】図３２ＡはｍＡｂ３Ｇ９、ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ、及びゲムシタビンに対する、そしてゲムシタビンと組み合わせたｍＡｂ３Ｇ９及びＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃの各々に対する、無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＣａｐａｎ−２ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフである。図３２ＢはｍＡｂ３Ｇ９、ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ、及びゲムシタビンに対する、そしてゲムシタビンと組み合わせたｍＡｂ３Ｇ９及びＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃの各々に対する、無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＣａｐａｎ−２ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフであり、被験動物の結果は対照（ビヒクル）の結果のパーセントとして表示する。
【図３３】図３３Ａ〜図３３Ｃは単剤としての、又は組み合わせてとしての、ｍＡｂ３Ｇ９及びゲムシタビンに対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＳＷ１９９０ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフであり、被験動物の結果は対照（ビヒクル）の結果のパーセントとして表示する。
【図３４】図３４ＡはｍＡｂ３Ｇ９、ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ、及びゲムシタビンに対する、そしてゲムシタビンと組み合わせたｍＡｂ３Ｇ９及びＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃの各々に対する、無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＣａｐａｎ−１ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフである。図３４ＢはｍＡｂ３Ｇ９、ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ、及びゲムシタビンに対する、そしてゲムシタビンと組み合わせたｍＡｂ３Ｇ９及びＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃの各々に対する、無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＣａｐａｎ−１ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフであり、被験動物の結果は対照（ビヒクル）の結果のパーセントとして表示する。
【図３５】図３５はｍＡｂ３Ｇ９、ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ、及びゲムシタビンに対する、そしてゲムシタビンと組み合わせたｍＡｂ３Ｇ９及びＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃの各々に対する、無胸腺ヌードマウス内に正常位移植したＡＳＰＣ−１ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す棒グラフである。
【図３６】図３６は図３０図〜３５に示した結果を総括した表である。
【図３７】図３７Ａ〜図３７Ｄはα_ｖβ_６の保持又はα_ｖβ_６発現の欠損、又はｓｍａｄ４の保持又はｓｍａｄ４発現の欠損、及びこれらの表現型の組み合わせの機能における膵臓腺管腺癌を有するＬｅｉｄｅｎ大学メディカルセンターの２６患者の累積生存を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。原発腫瘍由来のデータのみを分析した。
【図３８】図３８はｓｍａｄ４の保持又はｓｍａｄ４発現の欠損の機能における膵臓腺管腺癌を有する患者の累積生存を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。原発腫瘍由来のデータのみを分析した。Ｌｏｇ Ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）。
【図３９】図３９はｍＡｂ３Ｇ９及び可溶性ＴＧＦ−β受容体ＩＩ／Ｆｃ融合蛋白（ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ）に対する無胸腺ヌードマウス（転移部位：脾臓）内に皮下移植したＳＷ１９９０ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフである。
【図４０】図４０はｍＡｂ３Ｇ９及び可溶性ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃに対する無胸腺ヌードマウス（転移部位：脾臓）内に皮下移植したＳＷ１９９０ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す直線グラフであり、被験動物の結果は対照（ビヒクル）の結果のパーセントとして表示する。
【図４１】図４１は治療計画の第４２日における、ｍＡｂ３Ｇ９及び可溶性ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃに対する無胸腺ヌードマウス（転移部位：脾臓）内に皮下移植したＳＷ１９９０ヒト膵臓腺癌細胞の応答を示す散布図である。
【図４２】図４２は複合図であり、Ａ：α_ｖβ_６発現に基づいて分類したＳＷ１９９０細胞サブ集団におけるｓｍａｄ４発現を示すウエスタンブロットのオートラジオグラフ；Ｂ：移植されたＳＷ１９９０腫瘍のα_ｖβ_６発現の免疫組織化学的特徴；及び、Ｃ〜Ｅ：ｓｍａｄ４及びα_ｖβ_６発現によるＳＷ１９９０細胞集団のＦＡＣＳ媒介細胞分類を示す。
【図４３】図４３はマウスｍＡｂ３Ｇ９及び可溶性ＴＧＦ−β受容体ＩＩ／Ｆｃ融合蛋白（ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ）に対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌細胞の応答を示す直線グラフである。
【図４４】図４４は治療計画の第３９日における、マウスｍＡｂ３Ｇ９、ｍＡｂ４Ｂ４、及び可溶性ＴＧＦ−β受容体ＩＩ／Ｆｃ融合蛋白（ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ）に対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌細胞の応答を示す散布図である。
【図４５】図４５はマウスｍＡｂ３Ｇ９、ｍＡｂ４Ｂ４、及び可溶性ＴＧＦ−β受容体ＩＩ／Ｆｃ融合蛋白（ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ）に対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌細胞の応答を示す直線グラフである。
【図４６】図４６はマウスｍＡｂ３Ｇ９、ｍＡｂ４Ｂ４、ｍＡｂ８Ｇ６、及び可溶性ＴＧＦ−β受容体ＩＩ／Ｆｃ融合蛋白（ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ）に対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌細胞の応答を示す直線グラフである。
【図４７】図４７は治療計画の第３４日における、マウスｍＡｂ３Ｇ９、ｍＡｂ４Ｂ４、ｍＡｂ８Ｇ６、及び可溶性ＴＧＦ−β受容体ＩＩ／Ｆｃ融合蛋白（ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ）に対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌細胞の応答を示す散布図である。
【図４８】図４８はマウスｍＡｂ３Ｇ９（上）に対する、そしてヒト化ｍＡｂ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）（下）に対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌細胞の応答を示す直線グラフ対である。
【図４９】図４９はマウスｍＡｂ３Ｇ９（上）に対する、そしてヒト化ｍＡｂ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）（下）に対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌細胞の応答を示す散布図である。
【図５０】図５０はマウスｍＡｂ３Ｇ９に対する、そしてヒト化ｍＡｂ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）に対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌細胞の応答を示す直線グラフであり、被験動物の結果は対照（陰性としてビヒクル；陽性としてＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ）の結果のパーセントとして表示する。
【図５１】図５１は野生型マウスｍＡｂ３Ｇ９に対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌細胞の応答を示す直線グラフである。
【図５２】図５２はアグリコシルマウスｍＡｂ３Ｇ９に対する無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌細胞の応答を示す直線グラフである。
【図５３】図５３は野生型マウスｍＡｂ３Ｇ９に対する、そしてアグリコシルマウスｍＡｂ３Ｇ９に対する、無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌細胞の応答を示す散布図である。
【図５４】図５４は野生型マウスｍＡｂ３Ｇ９に対する、そしてアグリコシルマウスｍＡｂ３Ｇ９に対する、無胸腺ヌードマウス内に皮下移植したＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌細胞の応答を示す直線グラフであり、被験動物の結果は対照（ビヒクル）の結果のパーセントとして表示する。
【図５５】図５５は図４３〜図５３の結果を総括した表である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
特段の記載が無い限り、本明細書に記載した全ての技術的及び専門的用語は本発明が属する分野の当業者が共通して理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと同様又は等価である如何なる方法及び材料も本発明を実施又は試験する場合に使用できるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
【００２６】
定義
約：本明細書においては、何れかの数的値に言及する場合、「約」という用語は記載した値の±１０％の値を意味する（例えば「約５０℃」は４５℃〜５５℃（両端の値を含む）の温度範囲を包含し；同様に、「約１００ｍＭ」とは、９０ｍＭ〜１１０ｍＭ（両端の値を含む）の濃度範囲を包含する）。
【００２７】
拮抗剤：本明細書においては、「拮抗剤」という用語は細胞、組織又は生物中のα_ｖβ_６インテグリンの生物学的及び／又は生理学的作用を低減、実質的に低減、又は完全に抑制する化合物、分子、部分、又は複合体を指す。拮抗剤は、α_ｖβ_６に対するリガンドであってよく、細胞表面上のα_ｖβ_６への結合に関して他のリガンドと競合すること；他のリガンドに結合するインテグリンの能力を低減、実質的に低減、又は抑制するようにα_ｖβ_６と相互作用すること；細胞表面α_ｖβ_６に結合し、そして他のリガンドがもはや結合できない（又は低減、又は実質的に低減された親和性及び／又は効率でのみ結合できる）構造をインテグリンが取るように、そのコンホーメーション変化を誘導すること；他のリガンドの結合、又は細胞上のα_ｖβ_６への結合時にそのようなリガンドにより誘導される生理学的シグナルを、低減、実質的に低減、又は完全に抑制するように、細胞、組織、又は生物における生理学的変化（例えば細胞内シグナリング複合体の増大；転写抑制剤の増大；細胞表面α_ｖβ_６発現の低減等）を誘導すること；及び当業者の知る通り拮抗剤が自身の活性を実施する別の機序、を包含するがこれらに限定されない種々の態様においてそのような作用を実施してよい。当業者に理解されるように、拮抗剤はそれが拮抗する別のα_ｖβ_６結合部分（例えばα_ｖβ_６結合リガンド）と同様の構造を有してよく（例えば拮抗剤はアゴニストのムテイン、変異体、フラグメント又は誘導体であってよく）、或いは、完全に無関連の構造を有してよい。
【００２８】
結合した：本明細書においては、「結合した」という用語は共有結合的、例えば化学的カップリングによるか、又は非共有結合的、例えばイオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであってよい結合又は連結を指す。共有結合は例えばエステル、エーテル、ホスホエステル、チオエステル、チオエーテル、ウレタン、アミド、アミン、ペプチド、イミド、ヒドラゾン、ヒドラジド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合等であることができる。「結合した」という用語は例えば「カップリングした」、「コンジュゲートした」及び「連結した」等の用途よりも広範であり、そしてこれらを包含する。
【００２９】
コンジュゲート／コンジュゲーション：本明細書においては、α_ｖβ_６に結合するリガンド、例えばα_ｖβ_６結合抗体又はそのフラグメントへのある部分、例えば化学物質又は放射性同位体の共有結合的連結の産物を指す。「コンジュゲーション」とは、前文において定義したコンジュゲートの形成を指す。生物学的に活性な物質、例えば蛋白又はポリペプチド（抗体を包含する）への化学物質又は放射性同位体のコンジュゲーションの分野の当業者により通常使用されている何れかの方法を本発明において使用できる。
【００３０】
疾患、障害、状態：本明細書においては、「疾患」又は「障害」という用語はヒト又は動物の何れかの有害な状態、例えば腫瘍、癌、アレルギー、嗜癖、自己免疫、感染、中毒、又は最適な精神又は身体の機能の減損を指す。「状態」とは本明細書においては、疾患及び障害を包含するが、生理学的な状況も指す。例えば、繁殖性は生理学的状況であるが、疾患又は障害ではない。従って、繁殖性を低下させることによる妊娠の防止に適する本発明の組成物は、状態（繁殖性）の治療と記載されることになるが、疾患又は障害の治療とは記載されない。他の状態は当業者に理解されるところである。
【００３１】
有効量：本明細書においては、「有効量」という用語は所望の生物学的作用を実現するために必要又は十分な、ある化合物、コンジュゲート又は組成物の量を指す。ある化合物、コンジュゲート又は組成物の有効量は、本発明の方法によれば、この選択された結果を達成する量となり、そしてそのような量は予定外の実験を必要とすることなく、当該分野で知られた、及び／又は本明細書に記載した試験を用いながら当業者により定形的に決定され得るものである。例えば癌の転移を治療又は防止するための有効量は、基底膜を通過する、又は内皮層を通過するインビボの腫瘍細胞の遊走及び侵襲を防止するために必要な量である。用語はまた「十分量」とも同義である。何れかの特定の適用例に対する有効量は、治療すべき疾患、障害又は状態、投与すべき特定の組成物、投与経路、対象の体格、及び／又は疾患又は状態の重症度のような要因に応じて変動する場合がある。当業者であれば、予定外の実験を必要とすることなく本明細書に記載した指針に従って本発明の特定の化合物、コンジュゲート又は組成物の有効量を実験的に決定することができる。
【００３２】
１つの、ある：「１つの」、「ある」等の用語を本開示において使用する場合、それらは特段の記載が無い限り「少なくとも１つの」又は「１つ以上の」という意味を有する。即ち「ある」、「１つ以上の」、及び「少なくとも１つの」という用語は本明細書においては互換的に使用する。
【００３３】
ペプチド、ポリペプチド、蛋白：本明細書においては、「ポリペプチド」という用語は単数の「ポリペプチド」並びに複数の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、そして、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）により直鎖に連結された単量体（アミノ酸）よりなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語はまたアミノ酸２つ以上の何れかの鎖を指し、そして特定の長さの産物を指さない。即ち、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「蛋白」、「アミノ酸鎖」、又はアミノ酸２つ以上の鎖を指すために使用される何れかの他の用語は、「ポリペプチド」の定義に包含され、そして「ポリペプチド」という用語はこれらの用語の何れかの代わりに、又はそれと互換的に使用してよい。「ポリペプチド」という用語はまた、ポリペプチドの発現後の修飾、例えば限定しないが、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、蛋白分解性の切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾の産物を指すことも意図している。ポリペプチドは天然の生物学的原料から誘導するか、又は組み換え技術により製造してよいが、必ずしも所定の核酸配列から翻訳されなくてもよい。それは化学合成を包含する何れかの態様において形成してよい。この定義に従えば、本発明において使用されるポリペプチドは約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上のアミノ酸の大きさであってよい。ポリペプチドは所定の三次元構造を有してよいが、そのような構造を必ずしも有さなくてよい。所定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると称され、そして所定の三次元構造を有さないが多数の異なるコンホーメーションを採用できるポリペプチドは折り畳まれていないと称される。本明細書においては、糖蛋白とはアミノ酸残基、例えばセリン残基、又はアスパラギン残基の酸素含有又は窒素含有側鎖を介して蛋白に連結している炭水化物部分少なくとも１つにカップリングした蛋白と称される。本発明により使用される好ましいポリペプチドはリガンドであるか細胞表面上のα_ｖβ_６インテグリンに結合するポリペプチド、例えばこれらに限定されないが、α_ｖβ_６上のエピトープ１つ以上を認識して結合する抗体（特にモノクローナル抗体）を包含する。
【００３４】
「単離された」ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体又は誘導体はその天然のミリューにはないポリペプチドを意図している。特定のレベルの精製を必要としない。例えば単離されたポリペプチドはそのネイティブ又は天然の環境から除去されることができる。宿主細胞上に発現された組み換えにより製造されたポリペプチド及び蛋白は本発明の目的のためには、何れかの適当な手法により分離、分画、又は部分的又は実質的に精製されているネイティブ又は組み換えのポリペプチドのように、単離されているとみなされる。

【００３５】
本発明のポリペプチドに同様に包含されるものは上記したポリペプチドのフラグメント、誘導体、類縁体又は変異体、及びこれらの何れかの組み合わせである。「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」及び「類縁体」という用語は、抗α_ｖβ_６抗体又は抗体ポリペプチドに言及する場合は、相当するネイティブの抗体又はポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持している何れかのポリペプチド、即ちα_ｖβ_６インテグリン上のエピトープ１つ以上に結合する能力を保持しているポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドのフラグメントは本明細書の他の部分において考察する特定の抗体フラグメント以外に、蛋白分解性フラグメント、並びに欠失フラグメントを包含する。本発明により有用とされる抗α_ｖβ_６抗体及び抗体ポリペプチドの変異体は、上記したフラグメント、及びアミノ酸の置換、欠失又は挿入により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。変異体は天然に存在する又は天然に存在しないものであってよい。天然に存在しない変異体は当該分野で既知の突然変異誘発手法を用いて製造してよい。変異体ポリペプチドは保存的又は非保存的なアミノ酸置換、欠失又は付加を含んでよい。本発明により有用とされる抗α_ｖβ_６抗体及び抗体ポリペプチドの誘導体はネイティブのポリペプチド上には存在しない追加的な特徴を呈するように改変されているポリペプチドである。例としては融合蛋白が包含される。変異体ポリペプチドはまた本明細書においては「ポリペプチド類縁体」とも称される。本明細書においては、抗α_ｖβ_６抗体又は抗体ポリペプチドの「誘導体」とは官能性側鎖基の反応により化学的に誘導体化された残基１つ以上を有する要件ポリペプチドを指す。「誘導体」として同様に包含されるものは、２０標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体１つ以上を含有するものである。例えば４−ヒドロキシプロリンはプロリンと置換されてよく；５−ヒドロキシリジンはリジンと置換されてよく；３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換されてよく；ホモセリンはセリンと置換されてよく；そしてオルニチンはリジンと置換されてよい。
【００３６】
ｓｍａｄ４：本明細書においては、腫瘍サプレッサ遺伝子ｓｍａｄ４は当該分野で知られた同じ腫瘍サプレッサ遺伝子に関する他の表記法、例えばこれらに限定されないが、ｍａｄｈ４及びｄｐｃ４と同義である。簡便のために、本遺伝子の発現の産物は本明細書においてはＳＭＡＤ４と表記し、これは当該分野で知られた本遺伝子の発現産物に関する相当する他の表記法、例えばこれらに限定されないが、ＭＡＤＨ４及びＤＰＣ４と同義である。
【００３７】
実質的に、実質的な：本明細書においては、蛋白のコンジュゲーションは、受容体に対するコンジュゲートした蛋白の結合の比率及び／又は量が、コンジュゲートしていない相当するサイトカイン、ケモカイン、成長因子又はポリペプチドホルモンの結合の比率及び／又は量の約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％以上、又はそれより高値である場合にその受容体に結合する蛋白の能力を「実質的に」妨害しないといえる。
【００３８】
治療：本明細書においては、「治療」、「治療する」、「治療された」又は「治療している」という用語は、特に目的が望ましくない生理学的変化又は障害、例えば多発性硬化症の進行を防止又は緩徐化（低下）することであるような、予防及び／又は施療を指す。有利又は望ましい臨床結果は、これらに限定されないが、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（即ち悪化しない）状況、疾患進行の遅延又は緩徐化、疾患状況の緩解又は緩和、及び軽快（部分的又は全体的）を包含し、検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらない。「治療」はまた治療を受けない場合に予測される生存と比較して生存を長期化することも意味することができる。治療を要するものは、状態又は障害を既に有する者、並びに状態又は障害に罹患し易い者、又は状態又は障害が防止されるべき者を包含する。「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳類」とは、診断、予後、又は施療が望まれる何れかの対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象はヒト及び他の霊長類、家畜動物、牧場動物、及び動物園、競技用、又は愛玩動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、雄ウシ、雌ウシ等を包含する。
【００３９】
概論
本発明は少なくとも部分的には、特定の腫瘍細胞における腫瘍サプレッサ遺伝子ｓｍａｄ４の発現のレベルとインテグリンα_ｖβ_６の間には逆の関係が存在すること、そして、これらの２マーカーの発現のレベルはそのような腫瘍細胞の抗インテグリンリガンドを用いた、及びＴＧＦ−βシグナリング経路に拮抗する薬剤を用いた治療への感受性を測定又は予測するために使用できることを発見したことに基づいている。具体的には、ｓｍａｄ４の発現の低下したレベルを呈する腫瘍細胞は同時にインテグリンα_ｖβ_６の増大した量を発現することがわかっており；従って、ｓｍａｄ４欠損性の腫瘍細胞はより高値のｓｍａｄ４発現レベル（そして結果的に表面インテグリンα_ｖβ_６のより低値のレベル）を呈する腫瘍細胞と比較して、インテグリンα_ｖβ_６に結合するリガンドに応答する傾向が高値である。関連する実施形態においては、ｓｍａｄ４欠損性腫瘍細胞はまた、より高値のｓｍａｄ４発現レベルを呈する腫瘍細胞と比較してＴＧＦ−βシグナリング経路の成分１つ以上を拮抗するリガンドに対してより応答性である可能性が高値であることも本発明者等によって発見されている。本明細書においては、インテグリンα_ｖβ_６に結合するリガンド、又はＴＧＦ−β経路の成分１つ以上に拮抗するリガンドに「応答性」である腫瘍細胞とは、細胞が生育又は分裂を抑制される、及び／又はアポトーシス又は他の形態の細胞死を起こすように、生育、分裂、及び／又は他の代謝経路が悪影響を受けている腫瘍細胞を指す。
【００４０】
別の実施形態においては、本発明はまた、腫瘍細胞の侵襲及び／又は転移の潜在性を測定する場合、及び急速に進行する可能性がより高く、そして患者において積極的に治療すべきである特定の腺癌（膵臓癌を包含する）のような癌腫を発見する場合にこの異なる発現の発見を使用する方法を提供する。本発明は又腫瘍を構成している細胞がインテグリンα_ｖβ_６に結合するリガンド１つ以上を用いた治療に応答する可能性がより高いと考えられる腫瘍を発見する方法を提供する。本発明は又腫瘍の転移の診断及び治療／防止の方法を提供する。
【００４１】
ｓｍａｄ４及びインテグリンα_ｖβ_６の発現の測定
１つの実施形態において、本発明はインテグリンα_ｖβ_６に結合するリガンドに対し、及び／又はＴＧＦ−βシグナリング経路の成分１つ以上に拮抗するリガンドに対して応答する可能性がより高い、腫瘍及び腫瘍細胞、特に癌細胞、例えば膵臓癌細胞を発見するための方法に関する。そのような方法は例えば、腫瘍細胞による腫瘍サプレッサ遺伝子ｓｍａｄ４の発現のレベルを測定することを包含し、ここでｓｍａｄ４の低減した発現は、腫瘍細胞がインテグリンα_ｖβ_６に結合するリガンドに対し、及び／又はＴＧＦ−βシグナリング経路の成分１つ以上に拮抗するリガンドに対して応答する可能性がより高いことを示す。特定のそのような実施形態において、腫瘍、例えば癌腫中の細胞におけるｓｍａｄ４の発現のレベルはそのような腫瘍に罹患した患者から得られる組織切片において測定され、その場合、腫瘍細胞中のｓｍａｄ４の発現が非腫瘍組織試料（理想的には同じ患者の同じ臓器に由来）中のものと相対比較して低下していることは、腫瘍がインテグリンα_ｖβ_６に結合するリガンドに対し、及び／又はＴＧＦ−βシグナリング経路の成分１つ以上に拮抗するリガンドに対して応答する可能性がより高いことを示す。このようにして、患者におけるそのような腫瘍を治療するための適切で積極的なプロトコルを迅速に発見して実施することができ、これにより癌患者に対する望ましい治療結果の可能性が増大する。
【００４２】
各々のそのような実施形態において、本発明は特定の腫瘍細胞におけるｓｍａｄ４の発現の低下及び同時に起こるα_ｖβ_６の発現の増大の発見又は利用に基づいている。ｓｍａｄ４の発現のレベルは遺伝子発現を計測するための当該分野で周知の方法、例えば、ｓｍａｄ４遺伝子に対して特異的な既知の遺伝子プローブ又はプライマーを用いたハイブリダイゼーション又はＰＣＲ／ＲＴ−ＰＣＲ（例えばＭａｌｉｅｋａｌ，Ｔ．Ｔ．等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：４８８９−４８９７（２００３）； Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｃ．Ａ．等、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：１５９７−１６０４（２００４）参照）、ノーザンブロッティング（例えばＹａｓｕｔｏｍｅ，Ｍ．等、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｔａｓｔ．２２：４６１−４７３（２００５）参照）、及び抗ＳＭＡＤ４抗体を用いた免疫組織化学的分析（例えばＬｕｅｉｔｔｇｅｓ，Ｊ．等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：１６７７−１６８３（２００１）； Ｆｕｋｕｃｈｉ，Ｍ．等、Ｃａｎｃｅｒ ９５：７３７−７４３（２００２）； Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｇ．等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：５２００−５２１１（２００４）； Ｌｅｖｙ，Ｌ．ａｎｄ Ｈｉｌｌ，Ｃ．Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：８１０８−８１２５（２００５）； Ｔｏｇａ，Ｔ．等、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２４：１１７３−１１７８（２００４）参照）を用いて容易に測定できる。所定の細胞、組織、臓器又は生物学的試料におけるｓｍａｄ４遺伝子発現のレベルを検出するために適する他の方法は当該分野で良く知られている。同様に、α_ｖβ_６の発現のレベルはインテグリンの発現を計測するための当該分野で良く知られている方法を用いて容易に測定できる。特定のそのような実施形態においては、そのような測定は組織、腫瘍又は腫瘍細胞におけるインテグリンα_ｖβ_６に結合するリガンド１つ以上に組織、腫瘍又は腫瘍細胞を接触させることにより達成される。
【００４３】
特定のそのような実施形態において、組織、腫瘍又は腫瘍細胞は癌性の組織、腫瘍又は腫瘍細胞、例えば腺癌のような癌腫に由来するものである。より特定される実施形態において、癌腫は膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、扁平上皮細胞癌（例えば食道癌）、頭部頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、及び肺癌である。より特定すれば癌腫は膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、又は頭部頸部癌である。
【００４４】
本発明の特定の実施形態においては、α_ｖβ_６に結合するリガンドはα_ｖβ_６の拮抗剤である。そのような拮抗剤は例えばこれらに限定されないがα_ｖβ_６に特異的に結合する抗体；β_６に特異的に結合する抗体；α_ｖに結合する抗体；α_ｖβ_６に対するリガンドに結合する抗体；α_ｖβ_６に対するリガンド；アンチセンス核酸；及びそのようなリガンドのペプチド、非ペプチド、及びペプチドミメティックの類縁体を包含する。
【００４５】
本発明の特定の実施形態においては、インテグリンα_ｖβ_６に結合するリガンドはインテグリンα_ｖβ_６に結合する抗体、又はそのインテグリンα_ｖβ_６結合フラグメント、変異体、又は誘導体である。そのような抗体はインテグリンの１つのサブユニットに結合する（例えばα_ｖサブユニット上に位置するエピトープに、又は、β_６サブユニット上に位置するエピトープに結合する抗体）か、又は両方のサブユニットに結合してよい（例えばα_ｖ及びβ_６サブユニットの両方を架橋するインテグリンヘテロ２量体の領域に位置するエピトープに結合する抗体）。天然に存在する抗体のような完全な大きさの抗体に特に言及しない限り、「α_ｖβ_６抗体」という用語は完全な大きさの抗体、並びにそのような抗体のα_ｖβ_６結合フラグメント、変異体、類縁体、又は誘導体、例えば、天然に存在する抗体又は免疫グロブリン分子、又は操作された抗体分子、又は抗体分子と同様の態様で抗原に結合するフラグメントを包含する。抗体は合成、モノクローナル、又はポリクローナルであることができ、そして当該分野で周知の手法により製造できる。治療用途のためには、ヒト定常及び可変領域を有する「ヒト」モノクローナル抗体が抗体に対する患者の免疫応答を最低限とするために好ましい場合が多い。そのような抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニック動物を免疫化することにより形成できる（例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５−５３５（１９９５）参照）。合成及び半合成の抗体に関しては、そのような用語はこれらに限定されないが、抗体フラグメント、アイソタイプ切り替え抗体、ヒト化抗体（例えばマウス−ヒト、ヒト−マウス等）、ハイブリッド、複数の特異性を有する抗体、完全合成の抗体様分子などを包含することを意図している。
【００４６】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は本明細書においては互換的に使用する。抗体又は免疫グロブリンは少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、そして通常は少なくとも重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は比較的よく理解されている。例えばＨａｒｌｏｗ等、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）を参照されたい。当業者に理解されるように、「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は生物化学的に区別できる種々の広範なクラスのポリペプチドを含んでいる。当然ながら、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）及びその一部サブクラス（例えばγ１−γ４）に分類される。抗体の「クラス」をＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＥにそれぞれ決定するものはこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１等は十分特性化されており、そして機能的な特殊性を付与するものとして知られている。これらのクラス及びアイソタイプの各々の修飾された型は、本明細書の開示を鑑みれば当業者は容易に識別できるものであり、従って、本発明の範囲に包含される。
【００４７】
本発明における使用に適するα_ｖβ_６に結合する抗体、そのα_ｖβ_６結合フラグメント、変異体、又は誘導体は例えばこれらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト型、ヒト化、霊長類化、又はキメラの抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｖ_Ｌ又はＶ_Ｈドメインの何れかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリから形成されるフラグメント、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば本明細書に記載した抗α_ｖβ_６抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を包含する。ｓｃＦｖ分子は当該分野で知られており、そして例えば米国特許５，８９２，０１９に記載されている。本発明の免疫グロブリン又は抗体の分子は、免疫グロブリン分子の何れかの型（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１及びＩｇＡ_２）又はサブクラスのものであることができる。
【００４８】
単鎖抗体を包含する抗体フラグメントは、可変領域を単独で、又は以下、即ち：ヒンジ領域、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３ドメインの全体又は一部分と組み合わせて含んでよい。本発明に同様に包含されるものは、ヒンジ領域、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３ドメインとの可変領域の何れかの組み合わせも含んでいる抗原結合フラグメントである。本明細書に記載した診断及び治療方法において使用するための抗体又はその免疫特異的フラグメントはトリ及び哺乳類を包含する何れかの動物起源のものであってよい。好ましくは、抗体はヒト、マウス、ラット、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、ウシ、又はニワトリの抗体である。最も好ましくは抗体はヒト型、ヒト化、又は霊長類化された抗体、又はキメラ抗体、特にモノクローナル抗体である。本明細書においては、「ヒト型」の抗体とはヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、そして、後に説明する通り、そして例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ等への米国特許５，９３９，５９８に記載の通り、ヒト免疫グロブリンライブラリから、又はヒト免疫グロブリン１つ以上に関してトランスジェニックな動物から単離され、内因性の免疫グロブリンを発現しない抗体を包含する。本明細書においては、「キメラ抗体」という用語は免疫反応性の領域又は部位が第１の種から得られるか誘導され、そして定常領域（これは未損傷、部分的であるか、又は本発明により修飾されていてよい）が第２の種から得られた何れかの抗体を意味するものとする。好ましい実施形態においては、標的結合領域又は部位が非ヒト原料（例えばマウス又は霊長類）に由来することになり、そして定常領域はヒト型である。
【００４９】
本発明による使用のために特に好ましい抗体は、Ｗｅｉｎｒｅｂ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１７）：１７８７５−１７８７７（２００４）（その開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているもののような抗α_ｖβ_６モノクローナル抗体、例えばそこに開示されているモノクローナル抗体６．８Ｇ６（「８Ｇ６」）及び６．３Ｇ９（「３Ｇ９」）である。α_ｖβ_６に結合し、従って本発明による使用のために適する別の抗体は、インテグリンα_ｖβ_６のβ_６サブユニットに結合する（そしてそのため「抗β_６抗体」とみなされる）抗体（又はそのフラグメント、変異体又は誘導体）、例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＷｅｉｎａｃｋｅｒ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．２６９：１−９（１９９４）及び参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，６９２，７４１ Ｂ２の特にコラム２〜３及び７〜８に開示されているもの、例えば１０Ｄ５と命名されたモノクローナル抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３８２、寄託日１９９７年８月６日、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８）（又、米国特許６，６９２，７４１のコラム３、７〜１３行目、及びコラム７〜８参照）及びＣＳβ６（米国特許６，６９２，７４１のコラム７〜８参照）を包含する。本発明のこの特徴による適当な実施形態は、α_ｖβ_６結合抗体、又はそのα_ｖβ_６エピトープ結合フラグメントであるα_ｖβ_６インテグリン結合リガンドを使用する。本発明のこの特徴による使用に適する追加的な抗体は、例えばこれらに限定されないが、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願２００５／０２５５１０２ Ａ１に開示されているα_ｖβ_６結合モノクローナル抗体、例えばそこにおいて３Ｇ９、８Ｇ６、１Ａ８、２Ｂ１、２Ｂ１０、２Ａ１、２Ｅ５、１Ｇ１０、７Ｇ５、１Ｃ５と命名されているもの、並びにそのフラグメント、キメラ及びハイブリッドを包含する。本発明による使用に特に適する抗体はモノクローナル抗体２Ｂ１，３Ｇ９、及び８Ｇ６である。
【００５０】
一部の実施形態においては、抗体はハイブリドーマ６．１Ａ８、６．３Ｇ９、６．８Ｇ６、６．２Ｂ１、６．２Ｂ１０、６．２Ａ１、６．２Ｅ５、７．１Ｇ１０、７．７Ｇ５又は７．１Ｃ５により生産される抗体と同じ重鎖及び軽鎖のポリペプチド配列を含む。本発明による使用のために特に適する抗体は、ハイブリドーマ６．２Ｂ１により生産される２Ｂ１抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６４６，寄託日２００１年８月１６日、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１０８）、ハイブリドーマ６．８Ｇ６により生産される８Ｇ６抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６４５，寄託日２００１年８月１６日、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８）、及びハイブリドーマ６．３Ｇ９により生産される３Ｇ９抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６４９，寄託日２００１年８月１６日、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８）（参照により全体が本明細書に組み込まれる公開された米国特許出願２００５／０２５５１０２ Ａ１、特に１ページのパラグラフ０００８；２ページのパラグラフ００３２及び００３６；及び６〜１４ページの実施例参照）、 及び１０Ｄ５と命名された抗体（この抗体を分泌するハイブリドーマは１９９７年８月６日にＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３８２としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８に寄託された）（参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，６９２，７４１、特にコラム３の７〜１３行目、及びコラム７〜８参照）とおなじ重鎖及び軽鎖のポリペプチド配列を含むモノクローナル抗体である。
【００５１】
一部の実施形態においては、抗体は、自身の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３が以下の表１に示す配列より本質的になる（即ち一部の保存的変異は例外とする）重鎖を含んでいる。特定のそのような実施形態において、抗体は、自身のＣＤＲ１が配列番号１〜５の何れか１つより本質的なる；自身のＣＤＲ２が配列番号６〜１１の何れか１つより本質的なる；そして自身のＣＤＲ３が配列番号１２〜１７の何れか１つより本質的なる重鎖；及び／又は、自身のＣＤＲ１、２及び３がそれぞれ配列番号１８〜２３、２４〜２７、及び２８〜３３の配列の何れか１つより本質的なる軽鎖を含んでいる。
【００５２】
【表１−１】

【００５３】
【表１−２】

他の関連する実施形態において、本発明により使用されるモノクローナル抗体はキメラ抗体、即ち１つの種（例えばマウス、ラット又はウサギ）に由来する同族体抗体が、ヒンジ及び／又は重鎖及び／又は軽鎖の定常領域の一部又は全てが別の種（例えばヒト）に由来する抗体の相当する成分で置き換えられるように、組み換えＤＮＡ技術により改変されているものである。一般的に操作された抗体の可変ドメインは同族体抗体の可変ドメインと同一のままであるか、実質的にそのようになる。そのような操作された抗体はキメラ抗体と称され、そしてヒンジ及び／又は定常領域の誘導元である種（例えばヒト）の個体に投与した場合に同族体抗体よりも低抗原性である。キメラ抗体の製造方法は当該分野で周知である。
【００５４】
別の関連の実施形態においては、本発明により使用されるモノクローナル抗体は完全にヒト型の抗体である。そのような完全ヒト型のモノクローナル抗体を製造するための方法は当該分野で周知である（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願２００５／０２５５１０２ Ａ１の４ページのパラグラフ００６９−００７０を参照）。
【００５５】
別の関連する実施形態において、本発明により使用されるモノクローナル抗体は他の種から誘導された同族体抗α_ｖβ_６抗体のヒト化された型である。ヒト化抗体は組み換えＤＮＡ技術により製造される抗体であり、この場合、抗原結合に必要とならないヒト免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖のアミノ酸の一部又は全て（例えば定常領域及び可変ドメインのフレームワーク領域）が同族体の非ヒト抗体の軽鎖又は重鎖に由来する相当するアミノ酸を置換するために使用される。一例として、所定の抗原に対するマウス抗体のヒト化された型は、その重鎖及び軽鎖の両方において、（ａ）ヒト抗体の定常領域；（ｂ）ヒト抗体の可変ドメイン由来のフレームワーク領域；及び（ｃ）マウス抗体由来のＣＤＲを有する。必要に応じて、ヒトフレームワーク領域内の残基１つ以上を、抗原に対するヒト化抗体の結合親和性が温存されるように、マウス抗体における相当する位置の残基に変更できる。この変更は「復帰突然変異」と称される場合がある。ヒト化抗体は一般的にはキメラヒト抗体と比較して、前者はかなり少ない非ヒト成分を含有しているため、ヒトにおける免疫応答を誘発する可能性が小さい。そのようなヒト化モノクローナル抗体を製造するための方法は当該分野で周知である（例えば参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願２００５／０２５５１０２ Ａ１の４〜５ページのパラグラフ００７２−００７７を参照）。
【００５６】
更にそのような実施形態においては、ヒト化抗体は異なる抗体の重鎖及び／又は軽鎖の相当するＣＤＲから誘導された重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ１つ以上を含む。そのような抗体の１つの適当な非限定的な例は寄託された３Ｇ９抗体の軽鎖ＣＤＲ１の配列（配列番号２１）の代わりに２Ｂ１抗体から誘導された軽鎖ＣＤＲ１の配列（配列番号２０）を有する軽鎖ＣＤＲ１を含むヒト化３Ｇ９抗体である。配列番号２０に示す軽鎖ＣＤＲ１配列を有するそのようなヒト化３Ｇ９抗体は本明細書においてはｈｕ３Ｇ９（又はＢＧ０００１１）と表記する。そのような抗体の別の適当な非限定的な例は寄託された８Ｇ６抗体の軽鎖ＣＤＲ１の配列（配列番号１８）の代わりに２Ｂ１抗体から誘導された軽鎖ＣＤＲ１の配列（配列番号２０）を有する軽鎖ＣＤＲ１を含むヒト化８Ｇ６抗体である。配列番号２０に示す軽鎖ＣＤＲ１配列を有するそのようなヒト化８Ｇ６抗体は本明細書においてはｈｕ８Ｇ９と表記する。１つ以上の重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲが別の抗体の１つ以上の相当する重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲで置き換えられており、そして、本発明による使用に適するそのような誘導体抗体の別の例は、表１に示す配列及び本明細書に記載する指針を鑑みれば、当業者が容易に想到できるものである。そのようなヒト化抗体、例えばそのような誘導されたヒト化抗体を製造するための適当な方法は、当業者の知る通りであり、そして例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開出願２００５／０２５５１０２Ａ１に記載されている。
【００５７】
特定の実施形態においては、α_ｖβ_６に結合するリガンド、例えば抗体は未コンジュゲートの形態で使用できる。そのような実施形態において、細胞表面上のα_ｖβ_６へのリガンドの結合に好都合である条件下に、α_ｖβ_６に結合しているリガンドに腫瘍細胞を接触させる。適当なそのような条件は当該分野で周知であり、そして後述する実施例において詳細に説明する。特定のそのような実施形態において、リガンドの結合は、毒性の化合物１つ以上の作用に対し、リガンドが結合している腫瘍細胞を感受性化し、即ち、腫瘍細胞表面上のα_ｖβ_６へのリガンドの結合は毒素１つ以上の生育抑制及び／又は死滅誘導の作用に対し腫瘍細胞がより感受性となるように誘導する。即ち、別の実施形態において、本発明は（ａ）細胞表面上のα_ｖβ_６へのリガンドの結合に好都合である条件下に、細胞表面上のα_ｖβ_６に結合しているリガンド１つ以上（例えば抗体又はそのフラグメント１つ以上）に腫瘍細胞を接触させる工程；そして次に（ｂ）腫瘍細胞を生育抑制する、及び／又は殺傷する毒性化合物１つ以上に腫瘍細胞を接触させる工程を含む、腫瘍細胞の増殖を抑制する、又は腫瘍細胞を殺傷する方法を提供する。本発明のこの特徴による使用のための適当な毒性化合物、及びそれに関わる適切な用量及び投与計画は、当該分野で知られており、そして本明細書に別途詳述する通りである。
【００５８】
関連の実施形態において、本発明はＴＧＦ−βシグナリング経路の成分１つ以上をモジュレート（例えば抑制又は活性化）する薬剤１つ以上で腫瘍細胞を治療することにより毒性化合物１つ以上に対して腫瘍細胞を感受性化する方法を提供する。適当なそのような薬剤は例えば、ＴＧＦ−β又はそのフラグメント、可溶性ＴＧＦ−β受容体又はそのフラグメント、又は可溶性ＴＧＦ−β受容体又はそのフラグメントを含む融合蛋白（例えば可溶性「ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ」ポリペプチドを製造するために抗体のＦｃ領域に融合されたＴＧＦ−βＩＩ型受容体フラグメント）を包含する。使用においては、ＴＧＦ−βモジュレート剤の結合又は内在化は、薬剤を結合又は内在化していた腫瘍細胞を毒性化合物１つ以上の作用に対して感受性とする、即ち、毒素１つ以上の生育抑制及び／又は死滅誘導の作用に対し腫瘍細胞がより感受性となるように誘導する。即ち、別の実施形態においては、本発明は（ａ）腫瘍細胞による薬剤の結合又は内在化に好都合な条件下で、ＴＧＦ−βシグナリング経路の成分１つ以上をモジュレート（例えば抑制又は活性化）する薬剤１つ以上に腫瘍細胞を接触させる工程；そして次に（ｂ）腫瘍細胞を生育抑制する、及び／又は殺傷する毒性化合物１つ以上に腫瘍細胞を接触させる工程を含む、腫瘍細胞の増殖を抑制する、又は腫瘍細胞を殺傷する方法を提供する。本発明のこの特徴による使用のための適当な毒性化合物、及びそれに関わる適切な用量及び投与計画は、当該分野で知られており、そして本明細書に別途詳述する通りである。
【００５９】
α_ｖβ_６結合リガンドのコンジュゲート及び他の修飾
上記した通り、特定の実施形態においては、α_ｖβ_６に結合するリガンド、例えば抗体を未コンジュゲート型で使用できる。別の実施形態においては、α_ｖβ_６に結合するリガンド、例えば抗体を例えば検出可能な標識、薬物、プロドラッグ又は同位体にコンジュゲートできる。
【００６０】
後により詳細に説明する本発明の特定の方法、例えばα_ｖβ_６結合リガンド及び／又はＴＧＦ−βブロッキング剤に対して応答性である腫瘍細胞の潜在能力の尺度としてのｓｍａｄ４発現の検出に関連して細胞又は組織中のα_ｖβ_６発現を検出する方法においては、α_ｖβ_６結合リガンド（例えば抗体）を検出可能な標識１つ以上にコンジュゲートする。そのような使用において、α_ｖβ_６結合リガンド、例えばα_ｖβ_６結合抗体は、発色性、酵素、放射性同位体、同位体、蛍光、毒素、化学発光、核磁気共鳴造影剤又は他の標識の共有結合または非共有結合で検出可能に標識してよい。
【００６１】
適当な発色性標識としては、ジアミノベンジジン及び４−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸が挙げられる。
【００６２】
適当な酵素標識としては、マレエートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、コウボアルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
【００６３】
適当な放射性同位体標識としては、^３Ｈ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^５１Ｃｒ、^５７Ｔｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^１５２Ｅｕ、^９０Ｙ、^６７Ｃｕ、^２１７Ｃｉ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^４７Ｓｃ及び^１０９Ｐｄが挙げられる。^１１１Ｉｎは、それが肝臓による^１２５Ｉ又は^１３１Ｉ標識α_ｖβ_６結合リガンドの脱ハロゲン化の問題を回避できるので、インビボの画像化が使用される場合に好ましいものとなる。更に、この放射性核種は画像化のためのより好都合なガンマ線放射エネルギーを有している（Ｐｅｒｋｉｎｓ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１０：２９６−３０１（１９８５）； Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏ等、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８１−２８７（１９８７））。例えば１−（Ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ＤＰＴＡを用いてモノクローナル抗体にカップリングした^１１１Ｉｎは非腫瘍組織、特に肝臓中での取り込みが僅かであることがわかっており、そのため、腫瘍の局在化の特異性を増強する（Ｅｓｔｅｂａｎ等、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１−８７０（１９８７））。
【００６４】
適当な非放射性同位体標識としては、^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^１６２Ｄｙ、^５２Ｔｒ、^５６Ｆｅが挙げられる。
【００６５】
適当な蛍光標識としては、^１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）標識、ｏ−フタルデヒド標識、及びフルオレスカミン標識が挙げられる。
【００６６】
適当な毒性標識としては、ジフテリア毒素、リシン、及びコレラ毒素が挙げられる。
【００６７】
化学発光標識としては、ルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、オキサレートエステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、及びエクオリン標識が挙げられる。
【００６８】
核磁気共鳴造影剤としては、重金属核種、例えばＧｄ、Ｍｎ、及び鉄が挙げられる。
【００６９】
α_ｖβ_６結合リガンド、例えばα_ｖβ_６結合抗体への上記標識の結合のための典型的な手法は、Ｋｅｎｎｅｄｙ等、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ７０：１−３１（１９７６）及びＳｃｈｕｒｓ等、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ８１：１−４０（１９７７）に記載されている。後者において言及されているカップリングの手法は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンにミドエステル法であり、これらの方法すべては参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００７０】
腫瘍細胞の剥離、又は腫瘍細胞の増殖、侵襲又は転移の防止のような本発明の特定の治療方策において使用するためには、α_ｖβ_６結合リガンドは薬物、プロドラッグ又は同位体１つ以上にコンジュゲートできる。好ましいそのようなコンジュゲートは、細胞毒性剤１つ以上にコンジュゲートしたα_ｖβ_６に結合する１つ以上のリガンド、例えば１つ以上の抗体又はそのフラグメント、誘導体又は変異体を含み；そのようなコンジュゲートは本発明により提供される腫瘍の転移の治療及び防止の方法において有用である。本発明の特定のそのような実施形態によれば、α_ｖβ_６結合リガンド、例えば抗体は細胞毒性剤にコンジュゲートされる。α_ｖβ_６結合リガンド−細胞毒性剤コンジュゲートの形成において有用である細胞毒性剤、例えば化学療法剤は当該分野で周知であり、そして例えばこれらに限定されないがシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、メルファラン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、トリコテンを包含する。本発明のこの特徴による使用に特に適するものはパクリタキセル、ゲムシタビン、及びアドリアマイシン（ドキソルビシン）である。本発明のこの特徴による使用のために適する他の化学療法剤は当該分野で周知であり、そして当業者の知る通りである。
【００７１】
即ち、１つ以上のα_ｖβ_６結合リガンド、例えば１つ以上のα_ｖβ_６結合抗体、及び１つ以上の小分子毒素、例えばパクリタキセル、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ゲムシタビン、カリケアマイシン、マイタンシン（米国特許５，２０８，０２０）、トリコテン、及びＣＣ１０６５のコンジュゲートの使用もまた、本発明において意図される。本発明の１つの実施形態において、α_ｖβ_６結合リガンドはマイタンシン分子１つ以上にコンジュゲートされる（例えばα_ｖβ_６結合リガンド当たり約１〜約１０マイタンシン分子）。マイタンシンは例えばＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換してよく、そしてこれは還元されてＭａｙ−ＳＨ３となり、そして修飾されたα_ｖβ_６結合リガンドに反応させる（Ｃｈａｒｉ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２））ことにより、マイタンシノイド−α_ｖβ_６結合リガンドコンジュゲートを形成してよい。
【００７２】
或いは、α_ｖβ_６結合リガンドはカリケアマイシン分子１つ以上にコンジュゲートできる。抗体のカリケアマイシンファミリーはピコモル未満の濃度において２本鎖ＤＮＡ切断をもたらすことができる。使用してよいカリケアマイシンの構造的類縁体は例えばこれらに限定されないが、γ_１^Ｉ、α_２^Ｉ、α_３^Ｉ、Ｎ−アセチル−γ_１^Ｉ、ＰＳＡＧ及びΦ_１^Ｉ（Ｈｉｎｍａｎ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：３３３６−３３４２（１９９３）及びＬｏｄｅ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５−２９２８（１９９８））を包含する。
【００７３】
α_ｖβ_６結合リガンド１つ以上、例えばα_ｖβ_６結合抗体１つ以上とのコンジュゲートを形成するために使用できる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉ蛋白、ダイアンシン蛋白、Ｐｙｈｔｏｌａｃａ
ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカ・チャランチア阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを包含する。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる１９９３年１０月２８日に英語で公開されたＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。マイタンシノイドは又、α_ｖβ_６結合リガンド１つ以上、例えばα_ｖβ_６結合抗体１つ以上にコンジュゲートしてよい。本発明は更に核分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）にコンジュゲートしたα_ｖβ_６結合リガンドを意図する。
【００７４】
本発明の治療方法における使用のための放射コンジュゲートされたα_ｖβ_６結合リガンドの製造のためには種々の放射性同位体も使用される。例としては、^２１１Ａｔ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^２１２Ｂｉ、^３２Ｐ、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。
【００７５】
α_ｖβ_６結合リガンドと細胞毒性剤のコンジュゲートは種々の２官能性蛋白カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル（例えば塩酸ジメチルアジピミデート ＨＣＩ）の２官能性誘導体、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ヒス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトリエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて製造してよい。例えば、リシン免疫毒素はＶｉｔｅｔｔａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載の通り製造できる。^１４炭素標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）はα_ｖβ_６結合リガンドへの放射性核種のコンジュゲーションのための例示されるキレート形成剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは細胞内の細胞毒性剤の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってよい。例えば酸不安定性のリンカー、ペプチダーゼ感受性のリンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２））を使用してよい。
【００７６】
或いは、α_ｖβ_６結合リガンド及び細胞毒性剤を含む融合蛋白を、例えば組み換え手法又はペプチド合成により製造してよい。
【００７７】
更に別の実施形態においては。α_ｖβ_６結合リガンドは「予備ターゲティング」における利用のために「受容体」（例えばストレプトアビジン）にコンジュゲートしてよく、その場合、α_ｖβ_６結合リガンド−受容体コンジュゲートはまず患者に投与され、その後、浄化剤を用いた循環系からの未結合のコンジュゲートの除去、そして次に細胞毒性剤（例えば放射性核種）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えばアビジン）の投与を行う。
【００７８】
本発明のα_ｖβ_６結合リガンドは又、活性薬物にプロドラッグを変換するプロドラッグ活性化酵素（例えばペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５参照）とコンジュゲートしてよい。例えばＷＯ８８／０７３７８及び米国特許４，９７５，２７８を参照されたい。そのようなコンジュゲートの酵素成分はプロドラッグに対しそれをそのより活性な細胞毒性型に変換するような態様において作用することができる何れかの酵素を包含する。
【００７９】
本発明の方法において有用である酵素は、例えばこれらに限定されないが、ホスフェート含有プロドラッグを遊離の薬物に変換する場合に有用であるアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離の薬物に変換する場合に有用であるアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物である５−フルオロウラシルに変換する場合に有用であるシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬物に変換する場合に有用であるプロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、テルモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン（例えばカテプシンＢ及びＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換する場合に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離の薬物に変換する場合に有用なＯ−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼのような炭水化物切断酵素；Ｐ−ラクタムを用いて誘導された薬物を遊離の薬物に変換する場合に有用なＰ−ラクタマーゼ；及び、それぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で自身のアミン窒素において誘導体化された薬物を遊離の薬物に変換する場合に有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼのようなペニシリンアミダーゼを包含する。
【００８０】
酵素はヘテロ２官能性の交差結合試薬の使用のような当該分野で周知の手法によりα_ｖβ_６結合リガンドに共有結合することができる。或いは、酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結した本発明のα_ｖβ_６結合リガンドの少なくとも抗原結合領域を含む融合蛋白を当該分野で周知の組み換えＤＮＡ手法を用いて構築できる（例えばＮｅｕｂｅｒｇｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）参照）。
【００８１】
疾患の診断及び予後
上記した通り、有意に低下したレベルのｓｍａｄ４遺伝子発現及び有意に増強されたレベルのインテグリンα_ｖβ_６を呈する特定の腫瘍に由来する細胞は、高値のレベルのｓｍａｄ４遺伝子発現を呈する細胞と比較して、α_ｖβ_６に結合するリガンドに対し、そしてＴＧＦ−βシグナリング経路の成分１つ以上をブロックする薬剤に対し、より応答性となることが今回判明した。即ち、１つの特徴において、本発明は腺癌のような癌腫に由来する腫瘍も含めて、腫瘍細胞が、抗α_ｖβ_６リガンド（例えば抗体）を用いた、又はＴＧＦ−βブロッキング剤を用いた治療に応答するか、又はそれにより化学療法剤感受性化される可能性を調べる場合に有用な方法を提供する。より特定の実施形態においては癌腫は膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、扁平上皮細胞癌（例えば食道癌）、頭部頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、及び肺癌である。より特定すれば癌腫は膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、又は頭部頸部癌である。
【００８２】
本発明のこの特徴による方法では、腫瘍細胞中又は腫瘍の組織試料中のｓｍａｄ４の発現のレベルを試験し、そしてこれらの発現レベルを標準的な（例えば好ましくは同じ動物、例えばヒト患者から得られた、正常な細胞又は組織における）ｓｍａｄ４発現レベルと比較し、ここで腫瘍における、又はその細胞におけるｓｍａｄ４の発現の低下は腫瘍が抗α_ｖβ_６リガンド（例えば抗体）の、又はＴＧＦ−βブロッキング剤による生育抑制作用に対して応答性であるという、又はそのようなリガンド及び薬剤によって化学療法剤又は組成物１つ以上を用いた後の（又は同時の）併用療法に対して化学療法感受性化されるという可能性がより高いことを示す。上記した通り、腫瘍におけるｓｍａｄ４の低下した発現は患者の不良な予後に関連する場合が多く、そのため、本発明の方法は特にターゲティングされた治療方策を与える可能性が最も高い化合物及び組成物を用いてそのような腫瘍を迅速に診断して積極的に治療するための方法を提供するものであり、これにより、患者のより良好な臨床結果を与えるのである。
【００８３】
「ｓｍａｄ４の発現のレベルを試験する」とは、第１の生物学的試料（例えば腫瘍試料、組織生検材料又は吸引物等）におけるｓｍａｄ４のレベルを、直接的に（例えば試料中のα_ｖβ_６の発現の絶対的レベルを測定又は推定することにより）、又は相対的に（例えば第１の生物学的試料中のｓｍａｄ４の発現のレベルを第２の生物学的試料中のものと比較することにより）、定性的又は定量的に計測又は推定することを意図している。好ましくは、第１の生物学的試料中のｓｍａｄ４のレベルを計測又は推定し、そして、癌又は前癌製の患部を有さない個体から得られた第２の生物学的試料から得られた標準物におけるものと比較する。ｓｍａｄ４のレベルは所定の細胞、組織、臓器又は生物学的試料において、遺伝子発現を計測する当該分野で知られた方法、例えば既知の遺伝子プローブ又はプライマーを用いたｓｍａｄ４遺伝子のハイブリダイゼーション又はＰＣＲ／ＲＴ−ＰＣＲ検出（例えばＭａｌｉｅｋａｌ，Ｔ．Ｔ．等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：４８８９−４８９７（２００３）； Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｃ．Ａ．等、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：１５９７−１６０４（２００４）参照）、ノーザンブロッティング（例えばＹａｓｕｔｏｍｅ，Ｍ．等、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｔａｓｔ．２２：４６１−４７３（２００５）参照）、及び抗ＳＭＡＤ４抗体を用いた免疫組織化学的分析（例えばＬｕｅｉｔｔｇｅｓ，Ｊ．等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：１６７７−１６８３（２００１）； Ｆｕｋｕｃｈｉ，Ｍ．等、Ｃａｎｃｅｒ ９５：７３７−７４３（２００２）； Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｇ．等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：５２００−５２１１（２００４）； Ｌｅｖｙ，Ｌ．ａｎｄ Ｈｉｌｌ，Ｃ．Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：８１０８−８１２５（２００５）参照）により計測することができる。当業者に理解されるように、標準的なｓｍａｄ４発現レベルを所定の非癌性組織に関して知りえた後は、それを比較のための標準として反復して使用できる。
【００８４】
同様に、「α_ｖβ_６の発現のレベルを試験する」とは、第１の生物学的試料（例えば腫瘍試料、組織生検材料又は吸引物等）におけるα_ｖβ_６のレベルを、直接的に（例えば試料中のα_ｖβ_６の絶対的な量を測定又は推定することにより）、又は相対的に（例えば第１の生物学的試料中のα_ｖβ_６の発現のレベルを第２の生物学的試料中のものと比較することにより）、定性的又は定量的に計測又は推定することを意図している。好ましくは、第１の生物学的試料中のα_ｖβ_６のレベルを計測又は推定し、そして、癌又は前癌製の患部を有さない個体から得られた第２の生物学的試料から得られた標準物におけるものと比較する。当業者に理解されるように、標準的なα_ｖβ_６発現レベルを所定の非癌性組織に関して知りえた後は、それを比較のための標準として反復して使用できる。
【００８５】
「生物学的試料」とは、個体（例えば患者）、細胞株、組織培養物、又は細胞又は細胞性の生成物を含有する場合がある他の原料、例えば細胞外マトリックスから得られた何れかの生物学的試料を意図する。そのような生物学的試料はα_ｖβ_６を発現する場合がある哺乳類の身体組織及び細胞、例えば白血球、卵巣、前立腺、心臓、胎盤、膵臓、肝臓、脾臓、肺、乳房、頭部及び頸部の組織（例えば口腔、咽頭、舌部及び喉頭の組織）、扁平上皮細胞（例えば食道）、子宮内膜、結腸（又は結腸直腸）、子宮頸部、胃及び臍帯組織を包含する。組織生検試料及び体液を哺乳類から得るための方法は当該分野で良く知られている。好ましい哺乳類はサル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、及びヒトを包含する。特に好ましくはヒトである。
【００８６】
生物学的試料中のα_ｖβ_６発現レベルの試験は何れかの知られた方法を用いて行うことができる。生物学的試料中のα_ｖβ_６発現レベルを試験するための好ましい方法は免疫学的手法である。例えば組織中のα_ｖβ_６発現は古典的な免疫組織学的な方法を用いて検討することができる。このような場合、特異的な認識はα_ｖβ_６に結合する一次リガンド、例えば抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）により行われる。この一次リガンドは例えば蛍光、化学発光、ホスホレセント、酵素又は放射性同位体の標識により標識することができる。或いは、本発明のこれらの方法は二次的な検出系を使用することができ、その場合、α_ｖβ_６結合リガンドを認識して結合する第２のリガンド、例えば第１のα_ｖβ_６結合抗体を認識して結合するいわゆる「二次」抗体を上記した通り検出可能に標識する。その結果、病理学的検査のための組織切片の免疫組織学的染色が行われる。或いは、組織及び細胞の試料を、例えば尿素及び中性洗剤を用いて抽出することによりα_ｖβ_６蛋白を遊離させ、これをウエスタンブロット又はドット／スロット分析（Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）； Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））に付し、これによりα_ｖβ_６の発現がより低いレベルであることが分かっている標準の組織又は細胞の組織と相対比較しながら直接の定量を行う。
【００８７】
上記した通り、本発明の方法は、哺乳類において癌を検出するため、抗α_ｖβ_６リガンドによる、及び／又はＴＧＦ−βによる治療及び／又は化学療法剤感受性化に対してある腫瘍細胞が応答性となる可能性を調べるため、そして種々の型の癌腫を治療するために有用である。特に本発明の方法は上皮組織の癌（即ち癌腫）、例えば膵臓、結腸／直腸、子宮頸部、食道（及び他の扁平上皮組織）、頭部及び頸部、肝臓、卵巣及び肺のものを診断及び／又は治療する場合に有用である。本発明の方法による検出に特に適合するものは、侵襲性及び／又は転移性の腺癌、例えばこれらに限定されないが、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、及び頭部頸部の癌である。このような癌腫の早期の発見及び治療が患者のより良好な長期の予後に関連する。例えば未治療のまま放置すれば非侵襲性の乳癌のかなりの比率が侵襲性となり、そして遙かに予後不良である転移癌となる場合があることが報告されている（ Ｓａｋｏｒａｆａｓ，Ｇ．Ｈ．，ａｎｄ Ｔｓｉｏｔｏｕ，Ａ．Ｇ．Ｈ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｖ．２６：１０３−１２５（２０００）参照）。更に又、上記した通り、原発の膵臓腺癌におけるｓｍａｄ４の低減した発現はそのような腫瘍を有する患者に関する予後不良に関連している（Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７：３８５３−３８５６（２００１）； Ｔａｓｃｉｌａｒ，Ｍ．等、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７：４１１５−４１２１（２００１）； Ｔｏｇａ，Ｔ．等、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２４：１１７３−１１７８（２００４））。即ち、好ましくは本明細書に記載する方法による早期診断及び治療開始は、ｓｍａｄ４欠損性の癌を有する患者の長期の生存のために重要である。
【００８８】
従って、本発明は患者におけるｓｍａｄ４欠損性の前癌性の患部又は癌腫を発見すること、及び、それがより進行した形態の癌に発展する機会を得る前に患者を治療して前癌性の患部を排除することによる、癌を治療又は防止する方法を意図している。そのような方法は、例えば（ａ）癌又は前癌性の患部を含有することが疑われる組織試料、及び癌又は前癌性の患部を含有しない組織試料（好ましくは癌又は前癌性の患部を含有することが疑われるものと同じ組織又は臓器に由来）を得る工程；及び（ｂ）腫瘍、又は組織試料、又はそれに由来する細胞におけるｓｍａｄ４発現のレベルを測定することを含み、ここで非癌性組織試料（又はその細胞）におけるｓｍａｄ４発現レベルと相対比較して癌又は前癌性の患部を含有する組織試料中のｓｍａｄ４発現のレベルが低下していることは癌のより侵襲性又は攻撃的な形態に進行する可能性がより高い癌又は前癌性の患部を示す。他の関連する実施形態においては、本発明は、ｓｍａｄ４発現の低減したレベルを有する患者の腫瘍（又はその細胞）を（好ましくは上記した方法を用いて）発見すること、及び前癌性の細胞１つ以上の上のインテグリンα_ｖβ_６のサブユニット１つ以上に結合するリガンド１つ以上の治療有効量を患者に投与することを含む患者における前癌性の患部の腫瘍への進行を低減又は防止する方法を意図しており、ここで、インテグリンへのリガンドの結合は前癌性の患部の死滅又は生育抑制、又は化学療法剤化合物１つ以上の死滅誘導又は生育抑制の活性に対する前癌性患部の化学療法剤感受性化をもたらす。
【００８９】
本発明のこれらの方法による使用のために試料を得ることができる原料となる適当な組織及び臓器は、例えばこれらに限定されないが本明細書に別途説明する上皮組織を包含する。本発明のそのような方法により好都合に治療又は防止してよい癌及び腫瘍は例えば必ずしもこれらに限定されないが癌腫、特に腺癌、例えば本明細書に別途説明する癌腫及び腺癌を包含する。そのような癌腫が本発明の方法により検出された後、それは次に当該分野で周知であり、そしてそのため当業者がよく知るものである癌治療の外科的、化学療法的、放射線的、又は他の方法を介して患者から除去することができる。或いはそのような癌腫はα_ｖβ_６結合リガンド１つ以上、例えばα_ｖβ_６結合抗体又はそのフラグメント１つ以上を患者に、又は患者の臓器又は組織に投与することにより本発明の治療方法を用いながら除去できる。そのような実施形態の特定の非限定的な例においては、α_ｖβ_６結合リガンド１つ以上は上記において詳述した通り細胞毒性の化合物又は薬剤１つ以上にコンジュゲートされている。そのような実施形態の別の非限定的な例においては、α_ｖβ_６結合リガンド１つ以上、例えばα_ｖβ_６結合抗体又はそのフラグメント１つ以上を、上記において詳述した通り細胞毒性の化合物又は薬剤１つ以上と組み合わせて対象、例えば患者に投与する。他の関連する実施形態においては、本発明のそのような方法は、腫瘍細胞の増殖を抑制する、及び／又は毒性の化学療法剤化合物１つ以上の作用に対して腫瘍細胞を化学療法剤感受性化する本明細書に記載したもののようなＴＧＦ−βブロッキング剤１つ以上を投与することを含む。
【００９０】
関連する実施形態において、本発明は腫瘍又は癌細胞によるｓｍａｄ４及びα_ｖβ_６の発現のレベルを計測することによる腫瘍又は癌細胞の転移の潜在性を測定することを意図している。そのような実施形態において、腫瘍又は細胞の試料を上記の患者から入手し、そして腫瘍又は癌細胞によるｓｍａｄ４及びα_ｖβ_６の発現のレベルに関して本明細書に記載する方法により試験する。本発明のこれらの方法によれば、腫瘍又は癌細胞によるｓｍａｄ４の発現のレベルと腫瘍又は癌細胞によるα_ｖβ_６の発現のレベルとの間には、逆の相関が存在し、それは腫瘍又は癌細胞の転移の潜在性を測定するために使用できる有用な臨床像をもたらす。特に腫瘍又は癌細胞によるｓｍａｄ４の発現の低下と、それに併発する腫瘍又は癌細胞によるα_ｖβ_６の発現の増大、腫瘍又は癌細胞によるα_ｖβ_６の発現のレベルとの間の直接の相関は、腫瘍又は癌細胞が原発腫瘍部位から二次的場所に転移する可能性がより高いことを示す。従って、腫瘍又は癌細胞によるｓｍａｄ４及びα_ｖβ_６の発現のレベルは腫瘍又は癌細胞の転移の潜在性の予後インジケーターとして使用することができ、これは癌の現在又は予測される将来の攻撃性又は侵襲性に基づいて適切に治療決定を行う場合に癌患者及びその医師を支援することができる。
【００９１】
組織又は腫瘍細胞の試料のような個体から得られた生物学的試料中のｓｍａｄ４及びα_ｖβ_６の発現レベルを試験することに加え、α_ｖβ_６の発現のレベル及びパターンはまた、画像化によりインビボで検出できる。本発明のそのような方法において、１つ以上のｓｍａｄＭＡＤ４結合リガンド及びα_ｖβ_６結合リガンド、例えば１つ以上のｓｍａｄＭＡＤ４結合抗体及び１つ以上のα_ｖβ_６結合抗体はインビボの画像化に適する標識１つ以上で検出可能に標識される。インビボの画像化のための適当な標識又はマーカーはＸ線撮影、ＮＭＲ又はＥＳＲにより検出可能なものを包含する。Ｘ線撮影のためには、適当な標識は放射性同位体、例えばバリウム又はセシウムを包含し、これらは検出可能な放射線を発射するが対象に対して明らかに有害とはならないものである。ＮＭＲ及びＥＳＲのための適当なマーカーは検出可能な特徴的スピンを有するもの、例えば重水素を包含する。
【００９２】
適切な検出可能な画像化部分、例えば放射性同位体（例えば^１３１Ｉ、^１１２Ｉｎ、^９９ｍＴｃ）、放射線不透明物質、又は核磁気共鳴により検出可能な物質で標識されているｓｍａｄＭＡＤ４又はα_ｖβ_６に結合するリガンド、例えばｓｍａｄＭＡＤ４−又はα_ｖβ_６結合抗体又は抗体フラグメントを癌又は上皮内癌に関して調べるべき哺乳類内に導入する（例えば非経腸、皮下又は腹腔内）。対象の体格及び使用する画像化システムが診断用の画像を作成するために必要な画像化部分の量を決定することは当該技術分野において理解されている。放射性同位体の部分の場合は、ヒト対象に対しては、注入される放射能の量は通常は約５〜２０マイクロキューリーの範囲の^９９ｍＴｃとなる。次に標識されたリガンド、例えばｓｍａｄＭＡＤ４−又はα_ｖβ_６結合抗体又は抗体フラグメントがｓｍａｄＭＡＤ４又はα_ｖβ_６インテグリンを含有するか発現する細胞又は組織の位置に優先的に蓄積することになる。次にインビボの腫瘍画像化をＳ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ等、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」 （第１３章、Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ及びＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載の通り実施する。
【００９３】
治療方法
本発明の別の実施形態においては、本発明の方法は本明細書に別途記載するもののような特定の疾患、特に特定の癌腫に罹患した哺乳類を治療するための治療計画において使用できる。本発明のこのような方法は癌及び関連の事象、例えば腫瘍の生育、転移及び血管形成を治療する場合に有用である。そのような方策において特に適合するものは、疾患に罹患した哺乳類の組織又は細胞における低下したレベルのｓｍａｄ４発現、及び併発する上昇したレベルのα_ｖβ_６発現を特徴とし、そして上昇したレベルのα_ｖβ_６を発現する組織又は細胞をターゲティングし、そしてそのような組織又は細胞を排除する治療に応答性である疾患又は癌である。本発明のこの特徴による方法は、例えば（ａ）患者における低下したｓｍａｄ４発現を有する腫瘍又は腫瘍細胞を発見する工程；及び（ｂ）患者をα_ｖβ_６結合リガンド１つ以上、例えばα_ｖβ_６結合抗体又はそのフラグメント１つ以上を用いて、又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメント１つ以上を用いて治療することを含む。或いはそのような方法は、例えば（ａ）患者における低下したｓｍａｄ４発現を有する腫瘍又は腫瘍細胞を発見する工程；（ｂ）患者をα_ｖβ_６結合リガンド１つ以上、例えばα_ｖβ_６結合抗体又はそのフラグメント１つ以上を用いて、又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメント１つ以上を用いて治療する工程、ここでα_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤を腫瘍細胞に結合することにより、化学療法剤化合物１つ以上の生育抑制及び／又は死滅誘導の作用に対し腫瘍細胞を感受性にする；及び（ｃ）腫瘍細胞を生育抑制するか、殺傷する化学療法剤化合物１つ以上で患者を治療する工程を含む。
【００９４】
これらの方法により特に治療可能である疾患は上皮組織の転移癌（即ち転移性の癌腫及び／又は腺癌）、例えば膵臓、結腸／直腸、子宮頸部、食道（及び他の扁平上皮組織及び臓器）、頭部及び頸部、肝臓、卵巣、肺のものを包含する。本発明のこれらの方法による治療に特に適するものは膵臓、結腸／直腸、子宮頸部、頭部頸部及び食道の癌腫である。治療に対する好ましい哺乳類はサル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、及びヒトを包含する。特に好ましくはヒトである。
【００９５】
関連の実施形態において、上記した通り、本発明は前転移性の腫瘍における細胞１つ以上の上のインテグリンα_ｖβ_６のサブユニット１つ以上に結合するリガンド１つ以上の治療有効量を患者に投与することを含む、患者における転移性の腫瘍への前転移性の腫瘍の進行を低減又は防止する方法を提供し、それにおいては、インテグリンへのリガンドの結合は原発腫瘍の周囲の組織区域内への前転移性の癌の細胞の侵襲の低減又は防止をもたらす。
【００９６】
本発明のこれらの治療方法を実施する場合、α_ｖβ_６結合リガンド、例えばα_ｖβ_６結合抗体又はそのフラグメント又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントは治療用製剤（本明細書においては互換的及び等価に医薬組成物をも指すものとする）の形態において患者に投与してよい。本発明により使用されるα_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントの治療用製剤は、所望の純度を有するα_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントを任意の製薬上許容しうる担体、賦形剤又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合することにより、例えば凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態において、保存用に製造される。α_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントのような薬学的に活性な化合物に加え、本発明の治療方法において使用される組成物は薬学的に使用できる調製品中への活性化合物のプロセシングを容易にする賦形剤及び補助剤を含む適当な製薬上許容しうる担体１つ以上を含有できる。本発明の薬学的調製品は自体公知の態様において、例えば従来の混合、顆粒化、糖衣錠製造、溶解、又は凍結乾燥のプロセスの手段により製造される。即ち、服薬による使用のための薬学的調製品は活性化合物を固体賦形剤と混合すること、及び、場合により、得られた混合物を、所望であるか必要であれば適当な補助剤を添加した後に、粉砕すること及び顆粒混合物をプロセシングすることにより得ることができ、これにより錠剤又は糖衣錠のコア部が形成される。
【００９７】
適当な賦形剤は、特に、充填剤、例えば糖類、例えば乳糖又はスクロース、マンニトール又はソルビトール、セルロース調製品及び／又はリン酸カルシウム、例えばリン酸３カルシウム、又はリン酸水素カルシウム、並びに結合剤、例えば澱粉ペースト、例えばトウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、バレイショ澱粉、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドンである。所望により、錠剤崩壊剤、例えば上記した澱粉、及びカルボキシメチル澱粉、交差結合ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加することができる。補助剤は特に、流動調節剤及び潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸又はその塩、例えばステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウム、及び／又はポリエチレングリコールである。糖衣錠コア部には適当なコーティングが施され、これは所望により胃液に対して抵抗性である。この目的のためには濃縮された糖の溶液を使用することができ、これは場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適当な有機溶媒又は溶媒混合物を含有してよい。胃液に対し抵抗性のコーティングを製造するためには、適当なセルロースの調製品、例えばアセチルセルロースフタレート又はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートの溶液を使用する。例えば識別のため、又は活性化合物の用量の組み合わせを特性化するために、染料又は顔料を錠剤又は糖衣錠コーティングに添加することができる。
【００９８】
経口使用できる他の薬学的調製品はゼラチンから製造されたプッシュフィットカプセル、並びに、ゼラチン及び可塑剤、例えばグリセロール又はソルビトールから製造されたソフトシールカプセルを包含する。プッシュフィットカプセルは充填剤、例えば乳糖、結合剤、例えば澱粉、及び／又は潤滑剤、例えばタルク又はステアリン酸マグネシウム、及び場合により安定化剤と混合してよい顆粒形態の活性化合物を含有できる。ソフトカプセルにおいては、活性化合物は好ましくは適当な液体、例えば油脂又は流動パラフィン中に溶解又は懸濁される。更に、安定化剤も添加してよい。
【００９９】
非経腸投与のための適当な製剤は水溶性の形態、例えば水溶性の塩及びアルカリ性の溶液における活性化合物の水溶液を包含する。アルカリ性の塩は例えばトリス、水酸化コリン、ビストリスプロパン、Ｎ−メチルグルカミン、又はアルギニンを用いて製造されたアンモニウム塩を包含できる。更に、活性化合物の懸濁液、例えば適切な油性の注射用懸濁液を投与することもできる。適当な親油性溶媒又はビヒクルは油脂、例えばゴマ油、又は合成の脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル又はトリグリセリド又はポリエチレングリコール−４００（化合物はＰＥＧ−４００中に可溶である）を包含する。水性の注射用懸濁液は懸濁液の粘度を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランを含有できる。場合により、懸濁液は又、安定化剤も含有してよい。
【０１００】
本発明の化合物は動物及びヒトの眼に点眼液として、又は、軟膏、ゲル、リポソーム、又は生体適合性の重合体のディスク、ペレット内において、又はコンタクトレンズ内に担持される状態で投与してよい。眼用組成物はまた、当業者が従来の基準を用いて選択できる生理学的に適合性のある眼用ビヒクルを含有してよい。ビヒクルは例えばこれらに限定されないが水、ポリエーテル、例えばポリエチレングリコール４００、ポリビニル、例えばポリビニルアルコール、ポビドン、セルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース、石油誘導物、例えば鉱物油及び白色ワセリン、動物性脂肪、例えばラノリン、植物性脂肪、例えばピーナツ油、アクリル酸の重合体、例えばカルボキシポリメチレンゲル、多糖類、例えばデキストラン、及びグリコサミノグリカン、例えば塩化ナトリウム及び塩化カリウム、塩化亜鉛、及び緩衝物質、例えば重炭酸ナトリウム又は乳酸ナトリウムを包含する既知の眼用ビヒクルから選択してよい。高分子量の分子も又使用できる。組成物中の本発明の化合物を不活性化しない生理学的に適合性のある保存料はアルコール、例えばクロロブタノール、塩化ベンザルコニウム及びＥＤＴＡ、又は当業者に知られた何れかの他の適切な保存料を包含する。
【０１０１】
皮下投与に適合された抗体の凍結乾燥製剤は参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，２６７，９５８に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は適当な希釈剤で再建することにより高蛋白濃度としてよく、そして再建された製剤は本明細書において治療されるべき患者に皮下投与してよい。
【０１０２】
α_ｖβ_６結合リガンドは又、例えばコアセルベーション手法により、又は界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンのマイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）のマイクロカプセル内に、コロイド状の薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、又は、マイクロエマルジョン中に封入してよい。そのような手法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０１０３】
α_ｖβ_６結合リガンドの除放性製剤を製造してよい。除放性製剤の適当な例はα_ｖβ_６結合リガンドを含有する固体疎水性重合体の半透性マトリックスを包含し、このマトリックスは形状付与された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。除放性マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒコロキシエチルメタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性のエチレン酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体と酢酸ロイプロリドよりなる注射可能な微小球）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１０４】
インビボの投与のために使用される製剤は滅菌されていなければならない。これは滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１０５】
α_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントは何れかの適当な手段により、例えば非経腸、肺内、頭蓋内、経皮及び鼻内投与により、対象又は患者に投与してよい。非経腸の注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を包含する。更に、α_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントはパルス注入により、例えばα_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントの漸減量を用いながら、適宜投与してよい。好ましくは、投薬は、部分的には投与が短期であるか長期であるかにもよるが、注射、最も好ましくは静脈内又は皮下注射により行う。
【０１０６】
本発明の特定の例示される実施形態においては、α_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントは約１ｍｇ／ｍ^２〜約５００ｍｇ／ｍ^２の用量において患者に投与される（例えば静脈内）。例えばα_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントは約１ｍｇ／ｍ^２、２ｍｇ／ｍ^２、３ｍｇ／ｍ^２、４ｍｇ／ｍ^２、５ｍｇ／ｍ^２、１０ｍｇ／ｍ^２、１５ｍｇ／ｍ^２、２０ｍｇ／ｍ^２、２５ｍｇ／ｍ^２、３０ｍｇ／ｍ^２、３５ｍｇ／ｍ^２、４０ｍｇ／ｍ^２、４５ｍｇ／ｍ^２、５０ｍｇ／ｍ^２、５５ｍｇ／ｍ^２、６０ｍｇ／ｍ^２、６５ｍｇ／ｍ^２、７０ｍｇ／ｍ^２、７５ｍｇ／ｍ^２、８０ｍｇ／ｍ^２、８５ｍｇ／ｍ^２、９０ｍｇ／ｍ^２、９５ｍｇ／ｍ^２、１００ｍｇ／ｍ^２、１０５ｍｇ／ｍ^２、１１０ｍｇ／ｍ^２、１１５ｍｇ／ｍ^２、１２０ｍｇ／ｍ^２、１２５ｍｇ／ｍ^２、１３０ｍｇ／ｍ^２、１３５ｍｇ／ｍ^２、１４０ｍｇ／ｍ^２、１４５ｍｇ／ｍ^２、１５０ｍｇ／ｍ^２、１５５ｍｇ／ｍ^２、１６０ｍｇ／ｍ^２、１６５ｍｇ／ｍ^２、１７０ｍｇ／ｍ^２、１７５ｍｇ／ｍ^２、１８０ｍｇ／ｍ^２、１８５ｍｇ／ｍ^２、１９０ｍｇ／ｍ^２、１９５ｍｇ／ｍ^２、２００ｍｇ／ｍ^２、２０５ｍｇ／ｍ^２、２１０ｍｇ／ｍ^２、２１５ｍｇ／ｍ^２、２２０ｍｇ／ｍ^２、２２５ｍｇ／ｍ^２、２３０ｍｇ／ｍ^２、２３５ｍｇ／ｍ^２、２４０ｍｇ／ｍ^２、２４５ｍｇ／ｍ^２、２５０ｍｇ／ｍ^２、２５５ｍｇ／ｍ^２、２６０ｍｇ／ｍ^２、２６５ｍｇ／ｍ^２、２７０ｍｇ／ｍ^２、２７５ｍｇ／ｍ^２、２８０ｍｇ／ｍ^２、２８５ｍｇ／ｍ^２、２９０ｍｇ／ｍ^２、２９５ｍｇ／ｍ^２、３００ｍｇ／ｍ^２、３０５ｍｇ／ｍ^２、３１０ｍｇ／ｍ^２、３１５ｍｇ／ｍ^２、３２０ｍｇ／ｍ^２、３２５ｍｇ／ｍ^２、３３０ｍｇ／ｍ^２、３３５ｍｇ／ｍ^２、３４０ｍｇ／ｍ^２、３４５ｍｇ／ｍ^２、３５０ｍｇ／ｍ^２、３５５ｍｇ／ｍ^２、３６０ｍｇ／ｍ^２、３６５ｍｇ／ｍ^２、３７０ｍｇ／ｍ^２、３７５ｍｇ／ｍ^２、３８０ｍｇ／ｍ^２、３８５ｍｇ／ｍ^２、３９０ｍｇ／ｍ^２、３９５ｍｇ／ｍ^２、又は４００ｍｇ／ｍ^２の用量において投与してよい。
【０１０７】
α_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントは広範な種類の投薬スケジュールに従って投与できる。例えばα_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントは所定の時間（例えば４〜８週間、又はそれより長期）に渡って毎日１回、又は毎週のスケジュールに従って（例えば週当たり１日、週当たり２日、週当たり３日、週当たり４日、週当たり５日、週当たり６日、又は週当たり７日）所定の時間（例えば４〜８週間、又はそれより長期）に渡って投与できる。「週１回」投薬スケジュールの特定の例は、治療期間の第１、８、１５及び２２日におけるα_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントの投与である。代替の実施形態においては、α_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントは数カ月の期間に渡って間欠的に投与してよい。例えばα_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントは半年毎に連続３週間毎週投与してよい（即ち、毎週投薬スケジュールを６カ月ごとに反復する）。当然ながらそのような投与計画を延長された期間（数年間のオーダー）継続することにより初期治療により得られる有益な治療効果を維持してよい。更に別の実施形態においては、そのような維持療法は、癌性、転移性、又は上皮内癌の状態の即時的症状を低減するために設計された急性期の投薬計画の後に行ってよい。
【０１０８】
治療期間中を通して各時点において投与されるα_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントの量は同じであることができ；或いは、治療期間中の各時点において投与される量は変動することができる（例えば、ある時点に投与する量は以前に投与された量より増減できる）。例えば、維持療法の間に与えられる用量は治療の急性期の間に投与されるものよりも低値であってよい。特定の状況に応じた適切な投薬スケジュールは当業者には明白である。
【０１０９】
本発明の特定の実施形態においては、多数の型又は種のα_ｖβ_６結合リガンドを相互に組み合わせ、そして患者に投与することにより、１つ以上の癌性、転移性、又は上皮内の癌腫の状態を治療する。例えば、本発明は２つ以上の異なるα_ｖβ_６結合抗体及び／又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントを本明細書に記載した物のような患者に投与することを意図する。多数のα_ｖβ_６結合リガンド及び／又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントを患者に投与する場合、異なるα_ｖβ_６結合リガンド及び／又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントを単一の医薬組成物において共に投与することができ、或いはより好ましくは別個の投薬において逐次的に投与できる。そのような他剤の有効量は、製材中に存在するα_ｖβ_６結合リガンド及び／又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントの量、疾患又は障害又は治療の型、及び他の要因に応じたものとなる。
【０１１０】
本発明はまた、第１の薬剤はα_ｖβ_６結合リガンドであり、そして第２の薬剤は１つ以上の癌性、転移性又は上皮内の癌腫の状態を治療するために有用であるが必ずしもα_ｖβ_６結合リガンドではない薬剤であって、第１の薬剤を第２の薬剤と組み合わせて患者に投与することを含む癌性又は転移性の状態を治療するための方法を包含する。他の特徴においては、本発明は、第１の薬剤はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントであり、そして第２の薬剤は１つ以上の癌性、転移性又は上皮内の癌腫の状態を治療するために有用であるが必ずしもＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントではない薬剤であって、第１の薬剤を第２の薬剤と組み合わせて投与することを含む癌性又は転移性の状態を治療するための方法を提供する。第１の薬剤を第２の薬剤と「組み合わせて」投与するとは、両方の薬剤が治療計画中に患者に投与されるように患者への第２の薬剤の投与の前、同時、又は後に第１の薬剤を患者に投与できることを意味する。例えば本発明の特定のそのような実施形態によれば、α_ｖβ_６結合リガンドは患者への他のインテグリン受容体（例えば、α_１β_１、α_４β_１、α_ｖβ_８、α_ｖβ_５、α_５β_１等）１つ以上の拮抗剤、例えば当該分野で知られた１つ以上のインテグリン受容体（例えば、α_１β_１、α_４β_１、α_ｖβ_８、α_ｖβ_５、α_５β_１等）に対して特異的な抗体、ポリペプチド拮抗剤及び／又は小分子拮抗剤の投与と組み合わせて（即ち、前、同時、又は後に）患者に投与される。
【０１１１】
本発明のこの特徴の特定の実施形態においては、α_ｖβ_６結合リガンド又はＴＧＦ−βブロッキング剤又はそのフラグメントと組み合わせて投与される第２の薬剤は、例えばステロイド、細胞毒性化合物（例えば本明細書に別途記載するもの、そして特記すればパクリタキセル、ゲムシタビン又はアドリアマイシン（ドキソルビシン）、放射性同位体（例えば本明細書に別途記載するもの）、プロドラッグ活性化酵素（例えば本明細書に別途記載するもの）、コルヒチン、酸素、抗酸化剤（例えばＮ−アセチルシステイン）、金属キレート形成剤（例えばテトラチオモリブデート）、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、アルファ−抗トリプシン等である。本発明のこの特徴による治療目的のためのα_ｖβ_６結合リガンド１つ以上のような第１の薬剤１つ以上と組み合わせて患者に投与できる追加的な第２の薬剤又は化合物は、当業者の知る通りであり；従って、そのような追加的な第２の薬剤又は化合物の使用は本発明に包含されるとみなす。
【０１１２】
診断キット
別の実施形態において、本発明はキット、特に癌のような疾患又は障害の診断及び／又は予後において有用なキットを提供する。本発明のこの特徴によるキットは、インテグリンα_ｖβ_６に結合するかこれを認識する抗体のような上記リガンド１つ以上を含有する容器少なくとも１つを含んでよい。本発明のこれらのキットは場合により更に少なくとも１つの追加的容器を含んでよく、これは例えば患者由来の臓器、組織又は細胞の試料のような被験試料にリガンド（例えば抗体）を送達するための試薬（例えば緩衝塩溶液）；例えば生物学的試料中のｓｍａｄ４の発現を測定するために適している試薬（例えばこれに限定されないが上記した核酸試薬を含む）を含有する少なくとも１つの追加的容器；ＴＧＦ−β；１つ以上の洗剤、溶解液、又は試験のための生物学的試料の製造に適する他の溶液；等を含有してよい。本発明のそのようなキットの他の適当な追加的成分は当業者の知る通りである。
【０１１３】
本明細書に記載する方法及び使用に対する他の適当な変更及び適合は自明であり、本発明又は何れかのその実施形態の範囲を逸脱することなく実施されることを当業者は容易に理解するであろう。本発明を詳述したが、それは説明のために本明細書に包含され本発明を限定する意図のない以下の実施例を参照すればより明快に理解される。
【実施例】
【０１１４】
実施例１：α_ｖβ_６は原発腫瘍と相対比較して転移において高度に発現される。
【０１１５】
本実験においては、本発明者等は上皮起源及び転移患部上の種々の癌におけるα_ｖβ_６の発現を試験すること、及びα_ｖβ_６ｍＡｂをブロックする機能がインビボのα_ｖβ_６発現腫瘍の生育を抑制できるか調べることを試みた。本発明者等はヒト咽頭癌腫、Ｄｅｔｒｏｉｔ６２上の本発明者等の抗ヒトα_ｖβ_６ｍＡｂのインビトロ及びインビボの抗腫瘍活性を評価し、そしてこれをＴＧＦ−βＲＩＩ：Ｆｃのインビボの抗腫瘍活性と比較した。本発明者等のデータはα_ｖβ_６に関するヒト癌における役割及び機能ブロッキングα_ｖβ_６ｍＡｂを用いた治療介入の潜在性を裏付けている。
【０１１６】
Ａ．材料及び方法
免疫組織化学的検討のために、組織切片をキシレン及びエタノール中で脱パラフィン化し、蒸留水中に再水和し、そして次に０．４５％Ｈ_２Ｏ含有メタノール中に浸漬した。組織をペプシン（００−３００９，Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）とともにインキュベートし、そしてアビジン及びビオチン（ＳＰ−２００１；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）でブロックした。一次抗体を０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に希釈し、そして組織を４℃で一夜インキュベートした。マウス異種移植片組織上のβ６を免疫染色するために、切片を抗α_ｖβ_６ｍＡｂのヒト／マウスキメラ型２Ａ１（Ｗｅｉｎｒｅｂ，Ｐ．Ｈ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１７）：１７８７５−１７８８７（２００４））及び抗ヒトビオチニル化二次抗体（ＰＫ−６１０３，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共にインキュベートした。ヒト組織上のβ_６を免疫染色するために、切片をマウス２Ａ１及び抗マウスビオチニル化二次抗体（ＰＫ−６１０２，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートした。アビジン−ビオチン複合体−セイヨウワサビパーオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ，ＰＫ−６１０２）を切片に適用し、室温で３０分間インキュベートし、そして３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質を指示通り（ＳＫ−４１００，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）作成し、そして室温で５分間切片に適用した。組織切片をＭａｙｅｒのヘマトキシリンで１分間染色し、そして水及びＰＢＳ中ですすいだ。
【０１１７】
Ｂ．結果：
１．転移におけるα_ｖβ_６発現
α_ｖβ_６の免疫染色を種々の腫瘍の転移に対して評価した。転移の７８％（４３）が陽性に染色され、転移の大多数に渡って強い染色を示していた（図１Ａ−Ｆ；図２Ａ−Ｉ）。この結果は、頭部頸部、子宮頸部及び膵臓の腫瘍のみが等しいレベルの発現を有していたことが観察されたという点においてパーセント陽性免疫染色の増大であることがわかった（表２）。
【０１１８】
【表２−１】

２．ヒト膵臓腫瘍試料、患者マッチ転移及び侵襲性膵臓腫瘍のマウス異種移植片モデルにおけるα_ｖβ_６発現
表２に示す通り、α_ｖβ_６免疫染色は検査した膵臓腫瘍の８０％において陽性であった。８人の異なる患者に由来する原発膵臓腫瘍由来の試料を免疫組織化学的分析により検査したところ、喉頭級の腫瘍の侵襲性の領域において染色が顕著であった（図５Ａ〜図５Ｃ；図６Ａ〜図６Ｅ）。原発腫瘍試料はまたマッチしたリンパ節転移も有しており（図５Ｄ〜図５Ｆ；図６Ｆ〜図６Ｊ）、これも強力なα_ｖβ_６染色を呈しており、α_ｖβ_６陽性細胞が原発腫瘍部位から播種してきたという見解を裏付けていた。正常膵臓（図５Ｇ〜図５Ｈ；図６Ｋ〜図６Ｌ）においては染色は表面層の散発的な細胞に限局されていた。
【０１１９】
腫瘍細胞侵襲に対するα_ｖβ_６発現の影響をさらに検査するために、本発明者等は侵襲性ヒト膵臓腺癌のモデルとしてＢｘＰＣ−３マウス腫瘍を使用した。動物には０．１ｍｌ／匹の注射を用いながら滅菌食塩水中に懸濁した５ｘ１０^６細胞／匹を側腹上に皮下移植（第０日）した。第３０日において、樹立された腫瘍（〜６０〜１００ｍｍ^３）を有するマウスを全試験につき３つの投与群（ＰＢＳ；ｍＡｂ３Ｇ９；可溶性ＴＧＦ−β受容体ＩＩ−Ｉｇ融合蛋白（ｓｏｌＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ））の各々にペアマッチさせた。被験薬剤は投与スケジュールの週当たり３回マウスに腹腔内投与した。マウスには３Ｇ９を１０ｍｇ／ｋｇ、ｓｏｌＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃを２ｍｇ／ｋｇにおいて、又はＰＢＳ（陰性対照）を注射した。腫瘍の増殖は週２回計測し、そして腫瘍の体積は式［（幅）^２ｘ長さ］／２により推定した。投与群由来の腫瘍を摘出し、１０％パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン包埋し、そして非ブロッキングｖ６キメラｍＡｂ６．２Ａ１を用いた免疫組織化学的分析のために切片化した。
【０１２０】
抗α_ｖβ_６ｍＡｂ３Ｇ９を用いた治療は腫瘍の増殖に対して直接の作用を有しており（図７Ｂ、図７Ｃ）、抗体を用いた治療の約４８日の後には有意に低減した腫瘍の増殖が観察された。ｓｏｌＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃで観察された生育抑制のレベルは３Ｇ９で観察されたものよりも幾分低値であった。これらの結果は抗α_ｖβ_６ｍＡｂ３Ｇ９がヒト膵臓癌の異種移植片モデルにおいて腫瘍の増殖を抑制することを示しており、そしてそのようなブロッキング抗体は原発ヒト膵臓腺癌において腫瘍の増殖及びその延長として腫瘍の侵襲を抑制する場合に有用であることを示唆している。
【０１２１】
実施例２：原発ヒト膵臓腫瘍におけるｓｍａｄ４遺伝子発現とインテグリン発現の間の反比例関係
原発腫瘍細胞におけるｓｍａｄ４発現とα_ｖβ_６発現の間の関係を検査するために、ヒト原発膵臓腫瘍の選択例を入手し、ＳＭＡＤ４蛋白及びα_ｖβ_６に関して免疫組織化学的分析により染色した。異なる患者由来の１４腫瘍試料を検査した。結果を図８〜図１４に示す。
【０１２２】
１４腫瘍試料中、７（５０％）検体が明確にα_ｖβ_６＋の腫瘍区域を有していることがわかり、これらのうち３検体は発現において不均一さ（即ちα_ｖβ_６＋である腫瘍の一部の切片とα_ｖβ_６−である同じ腫瘍内の別の切片；図９〜図１０）を呈していた。１４腫瘍のうち７検体はα_ｖβ_６陰性であることがわかった。
【０１２３】
１１腫瘍（α_ｖβ_６発現において不均一であった３検体を除く）において、以下の結果が図８〜図１１、図１４に示す通り観察された。
【０１２４】
（Ａ）４検体はα_ｖβ_６＋であり、これらのうち３検体はｓｍａｄ４−であり１検体はｓｍａｄ４＋であり；そして、
（Ｂ）７検体はα_ｖβ_６−であり、そしてこれら７検体全てがｓｍａｄ４＋であった。
【０１２５】
α_ｖβ_６発現が不均一であった３腫瘍では以下の結果が観察された（図１２〜図１４）。
【０１２６】
（Ａ）α_ｖβ_６＋であった腫瘍の区域はｓｍａｄ４−であり；
（Ｂ）α_ｖβ_６−であった腫瘍の区域はｓｍａｄ４＋であった。
【０１２７】
これらの結果は原発膵臓腫瘍細胞によるｓｍａｄ４とインテグリンα_ｖβ_６の発現の間には反比例関係があることを裏付けている。
【０１２８】
実施例３：膵臓癌細胞株上のα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現
α_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現は膵臓癌細胞株のパネルに対し測定された。その結果を図１５に総括する。
【０１２９】
原発膵臓腺管腺癌（ＰＤＡＣ）上のα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現の予備的分析において、３試料のセットを検査した。第１のセットにおいては、１０ＰＤＡＣ試料をＢｉｏＣａｔアレイにより試験し、そして１０検体全て（１００％）がα_ｖβ_６を発現することがわかった。第２のセットにおいては、１４膵臓腺癌試料をＣｙｔｏｍｉｘ試験により試験し、これらのうち７検体（５０％）がα_ｖβ_６陽性であった。第３のセットにおいては、１１ＰＤＡＣ試料をＦｏｌｉｏアレイにより試験し（図１６）、そのうち１０検体（９１％）がα_ｖβ_６陽性であった。
【０１３０】
第２及び第３の試料セットについては、ｓｍａｄ４発現も試験した。１４系統がα_ｖβ_６陽性であることがわかり、１１系統はｓｍａｄ４陽性であった。１２系統はα_ｖβ_６＋／ｓｍａｄ４−であり；８系統はα_ｖβ_６−／ｓｍａｄ４＋であり；そして３系統はα_ｖβ_６＋／ｓｍａｄ４＋であった。２系統は不均一であり、α_ｖβ_６＋／ｓｍａｄ４−及びα_ｖβ_６−／ｓｍａｄ４＋に染色された区域を有していた（図１７）。
【０１３１】
７０ＰＤＡＣ検体をＢｉｏｍａｘＴｉｓｓｕｅＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ上の免疫組織化学により検査した（図１８）。これらの試料の８９％はα_ｖβ_６陽性であると判定され、その９７％はｓｍａｄ４がダウンレギュレートされていた。全体として８６％がα_ｖβ_６＋／ｓｍａｄ４−の表現型を有していた。
【０１３２】
Ｌｅｉｄｅｎ大学メディカルセンター（ＬＵＭＣ）で製造された組織アレイ（以降「Ｌｅｉｄｅｎアレイ」と称する）上の免疫組織化学的分析により検査された５０ＰＤＡＣ検体の別個の試験においては、８８％がα_ｖβ_６陽性であると判定され、その５９％はｓｍａｄ４がダウンレギュレートされていた（図１９）。全体として５２％がα_ｖβ_６＋／ｓｍａｄ４−の表現型を有していた。
【０１３３】
Ｌｅｉｄｅｎアレイを用いて検査した９ＰＤＡＣ転移検体の試験においては、全てがα_ｖβ_６陽性（大部分は強力に陽性）であることがわかり、そして７８％がα_ｖβ_６＋／ｓｍａｄ４−の表現型を有していた（図２０）。
【０１３４】
上記結果はα_ｖβ_６＋／ｓｍａｄ４−の表現型が原発ヒト膵臓癌における優勢な表現型であることを示している。
【０１３５】
Ｌｅｉｄｅｎ及びＢｉｏｍａｘアレイにより採点した場合のＰＤＡＣ上のα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４の発現の分析の結果をグラフ表示したものを図２１に示す。２つの異なる方法の間で観察された結果の相違はＢｉｏｍａｘアレイを用いた場合に観察されたｓｍａｄ４発現の強度がより低かったことに起因すると考えられる。
【０１３６】
実施例４：単剤及び組み合わせた場合の両方におけるα_ｖβ_６ｍＡｂ３Ｇ９及び化学療法剤、アドリアマイシン（ドキソルビシン）及びゲムシタビンに対する皮下移植されたＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腺癌の応答
ヒト腫瘍治療のモデルとして、単剤又は複合化学療法をヒト膵臓腫瘍のＢｘＰＣ−３異種移植片マウスモデルにおいて実施した。ＢｘＰＣ−３はこれらの細胞におけるｓｍａｄ４遺伝子の見かけ上のホモ接合欠失に起因してｓｍａｄ４欠損性であることが分かっている（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｇ．等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：５２００−５２１１（２００４）；Ｙａｓｕｔｏｍｅ，Ｍ．等、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
２２：４６１−４７３（２００５））。
【０１３７】
材料及び方法
１．動物。２２０匹の無胸腺ヌード雌性マウスはＨａｒｌａｎＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）よりＲｅｃ．０３／１３／２００６，ＤＯＢ０１／３０／２００６のものを入手した。マウスが６〜７週齢となった時点で試験を開始する。動物は腫瘍の移植前少なくとも５日間は実験室に対して馴化させる。動物には個体別にＢｉｏＭｅｄｉｃの移植可能なＩＤチップでマーキングする。データの収集はＯｎｃｏ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＯＰＩ）を用いて実施する。
【０１３８】
２．腫瘍。ＢＸＰＣ−３はアリゾナ大学（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）より元来入手された細胞株である。細胞株はヒト膵臓腺癌である。ドナー系統は本試験において移植するよりも前に無胸腺ヌード雌性マウスにおいて５世代継代した。動物の右側腹部内にトロカールを用いて組織の３ｍｍ^３の断片を皮下移植した。最低１００ミリグラムの大きさ及び３進行性生育があった時点で樹立された腫瘍に対し治療を開始した。
【０１３９】
【表２−２】

３．試験スケジュール
第−１日：左側腹にＩＤ応答機を皮下移植する。
【０１４０】
第０日：上記した通り腫瘍を移植する。マウスに移植した腫瘍に対し細菌培養を行う。動物の初期体重を記録する。
【０１４１】
第２日：腫瘍の大きさの記録及び体重測定を開始し、病期分類の日まで１日おきに継続する。
【０１４２】
病気分類日（治療第１日）（移植後約第１１〜１３日）：副尺カリパスを用いて測定した場合に最低の大きさが１００ミリグラムを計測された腫瘍を有するマウスを選択する。マウスを対照及び投与群に無作為に割りつけ、体重を記録する。上記スケジュールに基づいてｉｐ投薬する。各投薬計画内で用量は盲検とする。
【０１４３】
週２回のマウスの腫瘍の大きさと体重の記録を継続する。試験は毎日モニタリングし、そして如何なる通常ではない動物の観察事例も記録する。試験は試験終了時まで盲検とする。
【０１４４】
中間採血：（移植後第３４／３５日）：３Ｇ９の初回処置前、その週に関して全群から５匹／群由来の血清を採取する。投与後２４時間は全群から残余５匹／群由来の血清を採取する。２４時間前に平衡時血清採取に使用されなかった残余５動物／群を使用する。
【０１４５】
投薬の最終週（移植後第４４／４５日）：３Ｇ９の最終投与の前に、全群から５匹／群由来の血清を採取する。投与後２４時間は全群から残余５匹／群由来の血清を採取する。２４時間前に平衡時血清採取に使用されなかった残余５動物／群を使用する。
【０１４６】
終点：
（ａ）初期体重
（ｂ）腫瘍の大きさ及び体重の計測を週２回
（ｃ）投薬の中間時点及び最終週に血清中３Ｇ９レベル。
【０１４７】
屠殺時：
下記の群の各々から７腫瘍を採取し；各腫瘍の１／２を１０％ＮＢＦ中に保存し、残り１／２をＯＣＴ中に凍結する
第１群：ビヒクル；第２群：３Ｇ９；第４群：ゲムシタビン（Ｇｅｍ）１４０ｍｇ／ｋｇ；第６群：ドキソルビシン（Ｄｏｘ）６ｍｇ／ｋｇ；第８群：３Ｇ９＋Ｄｏｘ６ｍｇ／ｋｇ；及び第１０群：３Ｇ９＋Ｇｅｍ１４０ｍｇ／ｋｇ。
【０１４８】
結果
これらの実験の結果を図２２〜図２９に示す。これらの結果はゲムシタビンと組み合わせた３Ｇ９が有意に増大した生育抑制をもたらし、これは相乗作用的であると考えられる。複合作用は３Ｇ９をドキソルビシン（アドリアマイシン）と組み合わせた場合になお高値となり、約６０％の生育抑制となっている。この複合化学療法は腫瘍薬理学によるこの異種移植片モデルを用いて以前に得られたデータ（図示せず）においてＢｘＰＣ−３がゲムシタビンに対して耐性であることが示されていたことから選択した。総括すれば、これらの結果はｓｍａｄ４欠損性の細胞株ＢｘＰＣ−３が（ａ）単剤としての抗α_ｖβ_６ｍＡｂを用いた治療に応答性であり（生育抑制として計測）；そして（ｂ）ゲムシタビン及びドキソルビシンのような小分子薬剤を用いたその後の（又は同時）治療に対して抗α_ｖβ_６ｍＡｂを用いた治療により化学療法剤感受性化されることを示している。
【０１４９】
同様の相乗作用が３Ｇ９とゲムシタビン（１４０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせにより治療された場合の膵臓癌細胞株Ｓｕ８６．６（図３０）、Ｐａｎｃ０４（図３１）及びＣａｐａｎ−２（図３２）を移植したマウスにおいても観察されている。しかしながら、すい臓細胞株ＳＷ１９９０を移植したマウスに同じ複合療法を行ったところ、ゲムシタビン単独による治療と比較して治療効果に有意差はなかった（図３３Ｃ参照）。ゲムシタビン濃度を１００ｍｇ／ｋｇまで低下させたところ、ゲムシタビン単独治療は複合療法の場合よりも有意に良好となった（図３３Ｂ）。ゲムシタビン濃度を８０ｍｇ／ｋｇまで更に低下させたところ、複合療法による治療は、１４０ｍｇ／ｋｇの高値のゲムシタビン濃度において他の細胞株で観察されたように、ゲムシタビン又は３Ｇ９単独の何れかによる治療よりも有意に良好となった（図３３Ａ）。Ｃａｐａｎ−１異種移植片の様式においては、抗体３Ｇ９とゲムシタビンの複合療法はゲムシタビン単独、及びＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ及びゲムシタビンの複合療法と同様に有効であったのみであった（図３４）。
【０１５０】
ゲムシタビン及び３Ｇ９は細胞株ＡＳＰＣ−１由来の細胞を用いた膵臓癌の同所モデルにおける腫瘍の体積を有意に低下させた。ゲムシタビン単独又は３Ｇ９単独による治療は腫瘍の体積に対する有意な作用を有していなかった（図３５）。
【０１５１】
シグナリング試験をＢｘＰＣ−３、Ｐａｎｃ０４及びＣａｐａｎ−２の治療異種移植片腫瘍に対して実施した。３Ｇ９及ぶゲムシタビンの投与後の種々の時点において腫瘍を採取して以下の分析に付した。
【０１５２】
【表３】

上記試験の結果を図３６に総括する。
【０１５３】
実施例５：Ｌｅｉｄｅｎ大学メディカルセンターの２６患者のコホートの生存表現型
膵臓癌と診断された患者の生存データを図３７及び図３８に示す。図３７及び図３８における４パネルはα_ｖβ_６及びｓｍａｄ４発現に関するデータを表している。
【０１５４】
一般的に、ｓｍａｄ４を発現する腫瘍を有する患者はｓｍａｄ４を発現しない腫瘍を有する患者よりも長期生存となっている。更に、α_ｖβ_６＋／ｓｍａｄ４−の表現型を有する患者は有意に低減した生存となっている。
【０１５５】
実施例６：抗α_ｖβ_６リガンドによるｓｍａｄ４＋／α_ｖβ_６＋腫瘍細胞の増殖抑制の逆行
ヒト膵臓細胞株ＳＷ１９９０を実施例４に記載したものと同じ異種移植片マウス系において試験した。結果を図３９〜図４２に示す。
【０１５６】
ＳＷ１９９０細胞株はα_ｖβ_６発現の不均一性を示した。細胞株を分類し、α_ｖβ_６陽性とα_ｖβ_６陰性の細胞に関してリッチ化した（図４２Ｃ〜図４２Ｅ）。得られた変異体のウエスタンブロット分析はα_ｖβ_６陽性集団はｓｍａｄ４＋であり、α_ｖβ_６陰性集団はｓｍａｄ４−であることを示している（図４２Ａ）。即ち、α_ｖβ_６陽性ＳＷ１９９０細胞株は特に化学療法剤投与と組み合わせた場合にα_ｖβ_６ブロッキングｍＡｂ３Ｇ９による腫瘍の増殖の抑制を本発明者等が観察しているＢｘＰＣ−３系統のプロファイルにフィットしていなかった（実施例４）。ＳＷ１９９０異種移植片の組織切片がα_ｖβ_６発現を示していたことから（図４２Ｂ）、インビボのこれらの細胞は実際にはｓｍａｄ４＋であることが予測される。
【０１５７】
ＳＷ１９９０を移植したマウスは次に、実施例４に記載する通りマウスｍＡｂ３Ｇ９を用いた、又は可溶性ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃを用いたインビボにおける治療に付し、そして経時的に腫瘍の増殖を評価した。結果は図３９〜図４１に示す通りであり、これは膵臓腫瘍系統ＢｘＰＣ−３とは対照的にＳＷ１９９０腫瘍は抗α_ｖβ_６３Ｇ９ｍＡｂを用いた治療では生育を抑制されず、むしろ細胞生育において僅かな増大が観察されたことを示している。ＳＷ１９９０における生育に対する３Ｇ９又はｓｏｌＴＧＦ−βＲＩＩを用いた治療の逆の作用は、ｓｍａｄ４の存在下ではＴＧＦ−βは生育抑制シグナルを誘導でき、これはＴＧＦ−β（活性化）が可溶性ＴＧＦ−βＲＩＩ及び／又は３Ｇ９によりブロックされれば消滅するという理由により説明することができる。
【０１５８】
これらの結果は、α_ｖβ_６リガンドに応答性となるためには腫瘍細胞は、ｓｍａｄ４＋細胞株ＳＷ１９９０は抗α_ｖβ_６ｍＡｂにより生育抑制されなかったがｓｍａｄ４−細胞株ＢｘＰＣ−３は抑制されたことから、ｓｍａｄ４発現において欠損性でなければならないことを示唆する。即ちこれらの結果はα_ｖβ_６／ｓｍａｄ４仮説と合致し、選択されたセットの膵臓癌患者（ｓｍａｄ４−／α_ｖβ_６＋）における応答を裏付けており、α_ｖβ_６活性リガンド又はそれによる化学療法剤感受性化に対する腫瘍細胞、特に膵臓腫瘍細胞の感受性又は応答性を予測するための有用な臨床マーカーは、これらの腫瘍細胞におけるｓｍａｄ４の発現のレベルを測定することであることを示している。
【０１５９】
実施例７： α_ｖβ_６ｍＡｂによるＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌腫細胞の増殖抑制
異種移植片試験において、デトロイト５６２ヒト咽頭癌腫の細胞を実施例４に記載したプロトコルに従ってマウスに皮下移植した。次に腫瘍の生育を実施例４に記載する通り経時的に評価した。結果は図４３〜図５５に示す。
【０１６０】
これらの結果はＤｅｔｒｏｉｔ５６２モデルにおいてはマウス及びヒト化３Ｇ９抗α_ｖβ_６ｍＡｂは腫瘍の生育を有意に抑制できたのに対し、他の抗α_ｖβ_６ｍＡｂ（特にマウス４Ｂ４）は低有効性であることを示している。
【０１６１】
実施例８：膵臓癌におけるα_ｖβ_６ブロックの妥当性
ｓｍａｄ４は膵臓腺癌の約５５％において不活性化される（Ｔａｓｃｉｌａｒ等、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４：４１１５−４１２１，２００１）。Ｌｏｅｈｒ等（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：５５０−５５５，２００１）はＴＧＦ−βが膵臓癌に腺維形成の潜在性を付与し、これが線維症を誘発することを報告している。しかしながらこの腺維形成の潜在性はｓｍａｄ４発現と相関していた。本発明者等はｓｍａｄ４ヌルであるヒト膵臓癌系統（ＡｓＰＣ−２、ＢｘＰＣ−３、Ｃａｐａｎ−１、及びＣａｐａｎ−２）がマウスに移植されれば線維形成を誘導したのに対し、野生型のｓｍａｄ４を担持する細胞株（ＰａＣａ−２、ＰａＣａ−３、ＰａＣａ−４４、及びＰＡＮＣ−１）は腺維形成を誘導しなかったことを観察している（Ｌｏｅｈｒ等の表１参照）。
【０１６２】
結果の総括：本発明者等はα_ｖβ_６が膵臓癌において高度にアップレギュレートされることを発見した。本発明者等は又、インビボにおけるα_ｖβ_６ｍＡｂ（３Ｇ９）の薬効データを得ており、これは咽頭癌モデルにおいて、そして２種の膵臓癌モデルにおいて。単剤薬効を明らかにするものであった。本発明者等は又、３Ｇ９とゲムシタビンの組み合わせによる治療が７膵臓異種移植片モデル中５つにおいてゲムシタビン単独より高値の薬効を示したことを観察している（図３６）。
【０１６３】
以上の通り理解の明確化のために説明及び例示により一部詳細に本発明を全て記載したが、当業者の知る通り、これは本発明又はその何れかの特定の実施形態の範囲に影響することなく、条件、製剤及び他のパラメーターの広範で等しい範囲内において本発明を変更又は改変することにより実施でき、そしてそのような変更又は改変は添付の特許請求項の範囲内に包含されることを意図している。
【０１６４】
本明細書中で言及したすべての公開物、特許及び特許出願は本発明が属する技術の当業者のレベルを示しており、そして、各々個々の公開物、特許及び特許出願は特定的及び個別に参照により本明細書に組み込まれることを示されるがごとく同様の範囲まで参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
【化１】

（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法施行規則第３．２５（３）号規規則）。

（カナダ）
出願人は、本出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは本出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。

（クロアチア）
出願人はここにおいて、本願において言及された寄託された生物学的材料のサンプルが、無関係の専門家に対して、本願の公開と特許査定との間に入手可能とされる旨を、請求する。サンプルは、本特許の権利存続中に、本特許の出願人または適用可能な場合にはその権利者がはっきりと以下のような保証を放棄しない限りは、サンプルの請求人が、このようなサンプルまたはこれらに由来するあらゆる材料を第三者に対して入手可能としないこと、ならびに、実験または研究の目的を除いて、このようなサンプルまたはこれらに由来するあらゆる材料を使用しないことに同意する場合にのみ、入手可能とされる。

（デンマーク）
出願人はここにおいて、本出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。

（フィンランド）
出願人はここにおいて、本出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、特許および統制委員会により作成された公認専門家のリストに記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。

（ドイツ）
出願人は、ここにおいて、生物学的試料は、特許の付与、またはこの出願が拒絶され、取り下げられる場合は、出願日から２０年間、出願人により指名された独立の専門家にのみ試料が分譲されることを請求する。

（アイスランド）
出願人はここにおいて、特許が付与されるか、または特許が付与されない、この出願に関するアイスランド特許庁による最終的な決定がなされるまでは、この出願で言及される寄託された生物学的材料の試料の供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。

（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリストに記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。

（シンガポール）
出願人はここにおいて、微生物の試料の供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。

（スペイン）
出願人は、ここにおいて、生物学的材料は、スペイン特許を付与する旨の告示が公表されるまで、または特許出願が拒絶され、取り下げられる場合は、出願日から２０年間、Ａｒｔｉｃｌｅ ４５ ＳＰＬで示されるように独立の専門家にこの出願で言及される寄託された生物学的材料の試料を分譲することによってのみ入手可能となされることを請求する。

（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、出願日から２０年以内に拒絶または取り下げられた出願に対しても適用される。

（スイス）
出願人はここにおいて、第三者に対するサンプルの供与は、その第三者が、寄託者への通知のために氏名および住所を寄託機関に知らせ、そして、（ａ）寄託された培養物またはこれに由来する培養物を第三者に対して入手可能としないこと；（ｂ）法律の権限外でこの培養物を使用しないこと；ならびに、（ｃ）係争中の場合には、項目（ａ）および（ｂ）の下の義務違反がない旨の証書を発行することに同意する、という条件でなされ得る旨を、請求する。

（マケドニア共和国（旧ユーゴスラビア連邦））
出願人はここにおいて、第三者に対するサンプルの供与は、その第三者が、（ａ）生存可能な生物学的材料または微生物材料のサンプルが入手可能とされることを要求する権利を有し；そして（ｂ）特許の効力の存続期間の満了前に、出願人は、その寄託された生存可能な生物学的材料または微生物材料のサンプルを任意の第三者に対して入手可能とする権限を与えられていないことに同意している、という条件でなされ得る旨を、請求する。

（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。

（欧州特許庁）
出願人はここにおいて、欧州特許を付与する旨の告示が公表されるまで、または特許出願が拒絶され、取り下げられる場合は、出願日から２０年間、生物学的材料は、ＥＰＣ施行規則の規則２８（３）に定められるように、サンプルの請求人により指名された専門家にサンプルを分譲することによってのみ入手可能となされる旨を、請求する（ＥＰＣ規則２８（４））。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５】

【公開番号】特開２０１３−３９１４０（Ｐ２０１３−３９１４０Ａ）
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２５１２２０（Ｐ２０１２−２５１２２０）
【出願日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【分割の表示】特願２００９−５１９４８３（Ｐ２００９−５１９４８３）の分割
【原出願日】平成１９年７月１０日（２００７．７．１０）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】