ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法
【課題】迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣを測定する方法の提供。
【解決手段】ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法であって、内部標準、及び、１００ｎｇ以下のＤＮＡ断片あるいは細胞１００〜１０００個から調製されたＤＮＡ断片を含むサンプルを、液体クロマトグラフィー−質量分析に供し、液体クロマトグラフィーの移動相は、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液に対してｌｏｇＰ値−０．７〜−０．３の有機溶媒を１０〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲内とし、デオキシリボースの開裂に基づいて測定するｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法。
【解決手段】ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法であって、内部標準、及び、１００ｎｇ以下のＤＮＡ断片あるいは細胞１００〜１０００個から調製されたＤＮＡ断片を含むサンプルを、液体クロマトグラフィー−質量分析に供し、液体クロマトグラフィーの移動相は、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液に対してｌｏｇＰ値−０．７〜−０．３の有機溶媒を１０〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲内とし、デオキシリボースの開裂に基づいて測定するｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法に関する。更に詳しくは、ｄＣ、ｍｄＣ及びｈｍｄＣを一斉測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡのデオキシシトシンのメチル化やヒドロキシメチル化は、動物の初期発生、インプリンティング、細胞分化、がん化および老化等によって変化し（いわゆるエピジェネティック変化）、遺伝子発現と深い関わりがある。
【０００３】
一方で、遺伝子の発現順序や細胞の分化の過程を研究し再生医療に活用しようという試みが、近年一層活発化している。胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞とも称する。）や誘導多能性幹細胞（以下、ｉＰＳ細胞とも称する）分野においては、エピジェネティック変化に着目し、多能性の獲得メカニズムや分化のメカニズムが研究されている。
【０００４】
以上のような背景に鑑み、下記特許文献１においては、定量的ＰＣＲ法を利用してゲノム中の特定の遺伝子のメチル化の程度を決定する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００９−５０８４７５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｌｏｂｉｓｃｈ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（１２），ｅ１５３６７（２０１０）．
【非特許文献２】Ｋｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４６８，８３９−８４３（２０１０）.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願明細書において、デオキシシトシンはｄＣとも称する。５−メチルデオキシシトシンはｍｄＣとも称する。５−ヒドロキシメチルデオキシシトシンはｈｍｄＣとも称する。
ゲノムＤＮＡ中のｄＣのメチル化やヒドロキシメチル化の程度は、動物の初期発生、インプリンティング、細胞分化、がん化および老化等によって変化し、遺伝子発現と深い関わりがある。ｄＣのメチル化／ヒドロキシメチル化は遺伝子配列が関与しない遺伝情報の発現制御模様を示すと考えられる。従って、ｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣを迅速かつ超高感度に測定する方法の開発が望まれている。更には、その測定結果を利用して、ｄＣのメチル化、ヒドロキシメチル化の割合を知ることが重要であると考えられる。
【０００８】
感度良く、そして短い時間での分析が可能になれば、生命現象・病態のより深い理解、新規薬物の探索が可能となる。また、量が少ない極めて貴重なサンプル（例えば、卵子・受精卵等の初期胚発生段階のサンプル、ＥＳ細胞および病理生検）の研究においては超高感度の分析が要求される。
【０００９】
上記特許文献１においては、特定の遺伝子のメチル化の程度を知る方法の開示があるが、ゲノム全体におけるＤＮＡのメチル化の把握が困難であったばかりでなく、ヒドロキシメチル化を測定できないという問題があった。その上、ＰＣＲ法を利用するがゆえに解析には時間がかかってしまうという問題があった。
【００１０】
非特許文献１に記載の分析方法は溶媒濃度の変化を利用するため１サンプルの分析に９５分も要し、産業応用を考えると極めて非効率的であった。また、１回の分析時間が非常に長いので、破壊分析を積極的に利用する契機の提供がないばかりでなく、産業応用の面で上記ＰＣＲ法に対して有利な側面が提供されていなかった。
【００１１】
本願発明者らは鋭意研究し、受精卵及びサル／マウス胚性幹細胞及びその分化段階における量的なエピジェネティック変化について解析した結果、迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣを測定する方法を確立するに至った。更には、ｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣを一斉測定する方法を確立するに至った。
【００１２】
よって、迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣを測定する方法を提供することを、本発明が解決すべき課題とする。更に、ｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣを一斉測定する方法を提供することを本発明が解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、
ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法であって、
内部標準、及び、１００ｎｇ以下のＤＮＡ断片あるいは細胞１００〜１０００個から調製されたＤＮＡ断片を含むサンプルを、
液体クロマトグラフィー−質量分析に供し、
液体クロマトグラフィーの移動相は、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液に対してｌｏｇＰ値−０．７〜−０．３の有機溶媒を１０〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲内とし、
デオキシリボースの開裂に基づいて測定することを特徴とするｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法である。
【００１４】
本願第１発明はｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法であるので、ＤＮＡ断片の量が０となることはない。１回の測定に供されるＤＮＡ断片の量の下限は本来的には限定されるものではないが、現実の測定においては、使用する分析機器の定量限界の影響を受けうる。
【００１５】
（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、
前記ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法であって、
液体クロマトグラフィーの移動相の溶媒濃度を一定にする第１発明に記載のｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、破壊分析の利点を生かし、迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣを測定する方法が提供される。好ましくは、迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣを一斉測定する方法が提供される。従来の測定方法に比べて測定時間の著しい短縮に成功し、かつ、量が少ない極めて貴重なサンプルの有効な解析が可能となった。
【００１７】
特に、溶媒濃度を一定にして測定を行う場合、第１に、より好ましいｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣの分離状態を実現できる。第２に、各回の分析前のカラム平衡化を省略することができ、単位時間当たりより多くのサンプルを解析可能である。
【００１８】
本発明の測定は定量的に行うことができるので、ＤＮＡ断片の由来の解析に役立つ。例えば、特定のＤＮＡをプローブなどにより吊り上げてＤＮＡ断片を調製した場合、当該特定のＤＮＡについてのｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣの測定が可能である。エピジェネティック変化をより広い視点から解析できる。また、例えば、細胞のゲノムＤＮＡからＤＮＡ断片を調製すれば、特定の遺伝子についてのエピジェネティック変化を捉えるのではなく、細胞のゲノムＤＮＡ全体のｄＣのメチル化やヒドロキシメチル化の程度を知ることができる。
【００１９】
特定の遺伝子のエピジェネティック変化のみならず、例えばゲノムＤＮＡ全体のｄＣのメチル化やヒドロキシメチル化の程度を知ることは、ＥＳ／ｉＰＳ細胞のクオリティーコントロール、がんの悪性度・進行度合いの評価、神経変性疾患およびその他の老化関連疾患のリスク評価において重要であると推測される。実際、臨床調査において白血病患者から採取した白血球ゲノムＤＮＡの多くでｄＣのメチル化／ヒドロキシメチル化に異常が見られることが報告されている（非特許文献２）。
【００２０】
また、タンパク質の機能解析において、そのタンパク質を大量に合成する必要がある場合、宿主としてはハエ由来細胞などのＤＮＡメチル化が起こらない、あるいは起こりにくい細胞系を用いることがある。これらは研究者の経験によるところが大きいが、本測定法を用いれば、プラスミドＤＮＡのメチル化レベルを測定することにより、最適な宿主、あるいは最適なプラスミドベクターを定量的に選定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】マウスＥＳ細胞１００個又は１０００個からゲノムＤＮＡ抽出をした場合でも、ｍｄＣが定量可能であることを示す図である。
【図２】本実施例（サル大脳皮質）に係る測定での、ｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣの保持時間を示す図である。
【図３】本実施例に係る、サルの各組織のゲノムＤＮＡ中のｄＣのメチル化の程度を示す。
【図４】本実施例に係る、サルの各組織のゲノムＤＮＡ中のｄＣのヒドロキシメチル化の程度を示す。
【図５】本実施例に係る、マウスの各組織のゲノムＤＮＡ中のｄＣのメチル化の程度を示す。
【図６】本実施例に係る、マウスの各組織のゲノムＤＮＡ中のｄＣのヒドロキシメチル化の程度を示す。
【図７】移動相の体積比条件を変化させた場合のｄＣピーク、ｍｄＣピーク、ｈｍｄＣピークの分離状態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に、本発明を実施するための形態を、最良の形態を含めて説明する。
【００２３】
〔ＤＮＡ抽出・断片化〕
本発明は迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣを測定可能であり、ｄＣのメチル化／ヒドロキシメチル化の割合を解析するのに適している。また、デオキシリボースの開裂を捉えてｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣを測定するため、抽出したＤＮＡをデオキシアデニン（以下、ｄＡとも称する。）、デオキシグアニン（以下、ｄＧとも称する。）、デオキシシトシン、チミン（以下、Ｔとも称する。）等の１残基単位に断片化することが好ましい。
【００２４】
よって、本発明のＤＮＡ断片とは、例えばｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣ等、１残基単位に調製されたＤＮＡ残基をいう。ＤＮＡ断片を含むサンプルには、夾雑物が含まれていても構わない。
【００２５】
ＤＮＡの断片化の方法は特に限定されない。トータルｄＣに対するメチル化、ヒドロキシメチル化の割合を維持できるＤＮＡの断片化の方法が好ましく、後述の実施例におけるような酵素法を好ましく例示できる。
【００２６】
本発明に用いるＤＮＡ断片の由来は特に限定されず、動物、植物、微生物等に由来するＤＮＡ断片を限定なく用いることができる。例えば、生殖・内分泌に関与する細胞（乳腺細胞、卵原細胞、子宮上皮細胞、セルトリ細胞等）、皮膚に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（脳や脊髄などの中枢神経系や末梢神経系の神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯根膜細胞及び骨芽細胞等）、血液に関与する細胞（白血球及び赤血球等）、及び幹細胞｛例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞（ｏｖａｌ ｃｅｌｌ、ｓｍａｌｌ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ等）、脂肪組織幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、精子幹細胞、胚生殖幹（ＥＧ）細胞、膵臓幹細胞（膵管上皮幹細胞等）、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞、前駆細胞（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞等）等｝等が挙げられる。また、昆虫細胞として、カイコ細胞（ＢｍＮ細胞及びＢｏＭｏ細胞等）、クワコ細胞、サクサン細胞、シンジュサン細胞、ヨトウガ細胞（Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等）、クワゴマダラヒトリ細胞、ハマキムシ細胞、ショウジョウバエ細胞、センチニクバエ細胞、ヒトスジシマカ細胞、アゲハチョウ細胞、ワモンゴキブリ細胞及びイラクサキンウワバ細胞（Ｔｎ−５細胞、ＨＩＧＨ
ＦＩＶＥ細胞及びＭＧ１細胞等）等が挙げられる。また、植物は、細胞やカルスなどのほか、表皮組織、柔組織、師管・師部繊維等の師部組織、道管・仮道管・木部繊維等の木部組織、茎、塊茎、葉、根、塊根、穂木、蕾、花、花弁、雌ずい、雄ずい、葯、花粉、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維、胚珠等が挙げられる。その他、上述した組織パラフィン切片に由来するＤＮＡ断片を用いることも可能である。また、酵母、線虫およびハエのようなＤＮＡのメチル化が起こらない、あるいは起こりにくいと考えられている生物についても分析対象となり得る。
【００２７】
抽出操作を適宜工夫することにより、特定の遺伝子をコードするＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等から調製したＤＮＡ断片を測定対象とすることができる。測定対象としては、ゲノムＤＮＡ、特定の遺伝子をコードするＤＮＡから調製したＤＮＡ断片が好ましく、ゲノムＤＮＡから調製したＤＮＡ断片が特に好ましい。
【００２８】
ＤＮＡの抽出方法は特に限定されず、一般に用いられている手法を採用することができる。例えば、フェノール−クロロホルム法やスピンカラム法、アルカリ法等を採用することができる。特定遺伝子のプロモーター領域を組み込んだプラスミドＤＮＡを用いれば、遺伝子導入した細胞内での特定プロモーター領域のメチル化動態を定量するモデル実験系を構築することができる。ＤＮＡ抽出の対象の量が微量である場合、市販されている微量サンプルＤＮＡ抽出用キットを用いることができる。
【００２９】
抽出、必要により断片化の工程を経て調製されたＤＮＡ断片を含むサンプルは、すぐに液体クロマトグラフィー−質量分析に供しても良いし、サンプルを安定に保存できる条件で保存してもよい。即ち、所定期間サンプルを保存した後に液体クロマトグラフィー−質量分析を行っても良い。好ましいサンプルの保存方法としては、乾燥状態あるいは溶液状態での−８０℃凍結保存等が挙げられる。
【００３０】
ＤＮＡ断片を含むサンプルの形状は特に限定されないが、液体クロマトグラフィーに供する際は溶液状態であることが好ましい。
【００３１】
〔液体クロマトグラフィー−質量分析〕
本発明において１回の測定に供されるＤＮＡ断片の量は、１００ｎｇ以下、好ましくは１０ｎｇ以下、より好ましくは２ｎｇ以下、あるいは、細胞１００〜１０００個から調製されたＤＮＡ断片全量、好ましくは、細胞１００〜２００個から調製されたＤＮＡ断片全量である。
【００３２】
本発明において、１回の測定に供されるＤＮＡ断片の量の下限は本来的には限定されるものではないが、現実の測定においては、使用する分析機器の定量限界の影響を受けうる。仮に下限値を例示するならば、１回の測定に供されるＤＮＡ断片の量は、０．１〜１００ｎｇであり、好ましくは０．１〜１０ｎｇであり、より好ましくは０．１〜２ｎｇ、あるいは、細胞１００〜１０００個から調製されたＤＮＡ断片全量、好ましくは、細胞１００〜２００個から調製されたＤＮＡ断片全量である。
【００３３】
本発明において内部標準とは、ｄＣ、ｍｄＣ、又はｈｍｄＣの同定や定量に用いるものをいう。測定するｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣの安定同位体を内部標準として使用することが好ましい。安定同位体として、１３Ｃ、２Ｈ、１５Ｎなどの原子を１以上含むｄＣ、ｍｄＣ、又はｈｍｄＣが例示される。これらの安定同位体は、質量分析の検出質量が変化する。内部標準を添加する工程は特に限定されないが、ＤＮＡの断片化後に添加することが好ましい。
【００３４】
液体クロマトグラフィー−質量分析の装置構成は、液体クロマトグラフィーを行った後、質量分析を行うのであれば特に限定されない。例えば、液体クロマトグラフィー機器と質量分析機器とを結合したＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析の他、液体クロマトグラフィーによりサンプルを分画した後、特定の画分を質量分析に供する分析も含まれる。好ましくは液体クロマトグラフィー機器と質量分析機器を結合した分析であり、より好ましくはＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析である。
【００３５】
質量分析でのイオン化法は特に限定されず、ＥＳＩ―ＭＳ、ＣＩ―ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＡＰＣＩ−ＭＳ等が含まれる。好ましくは、ＥＳＩ−ＭＳである。これらの質量分析は、ＭＳ／ＭＳとすることが好ましい。イオン化を伴う質量分析において、当該イオン化は、ＬＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおけるインターフェイスに組み込むことができる。
【００３６】
本発明においては、ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定するにあたって、デオキシリボース部位の開裂を捉える。ＤＮＡに含まれる、ＤＮＡ断片たるｄＡ、ｄＧ、ｄＣ（ｍｄＣ、ｈｍｄＣ）、Ｔ等の各残基は、デオキシリボースを包含する。例えばＥＳＩ−ＭＳもしくはＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳのポジティブイオン化モードで測定した場合、デオキシリボース部位に相当する−１１６の開裂を捉えることができる。例え夾雑物がｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣと同じ保持時間で液体クロマトグラフィー機器から溶出しても、デオキシリボース部位の開裂を捉えることで、ＤＮＡ断片であると同定することができる。ただし、夾雑物がＤＮＡ断片のイオン化を阻害する場合等、測定に悪影響を与える場合もありえるので、液体クロマトグラフィーの移動相は後述の組成を採用することが好ましい。
【００３７】
測定に際し、ｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣの内部標準等により予め検量線を作成しておけば、一度の分析でｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣの各含有量が一斉測定できる。
【００３８】
質量分析は破壊分析であり、高感度を実現することができ、微量サンプルの解析に適している。また、デオキシリボースというＤＮＡ残基に特徴的な部位の開裂を捉えるので、短時間かつ簡便に標的物質の同定・定量が可能となる。上記特許文献１に記載のＰＣＲ法は、目的遺伝子を単離した後、更に目的遺伝子を増幅して定量するため、一回の測定に長時間を要するが、本発明は、ＤＮＡ断片を含むサンプルを調製するだけでよく、その上一回の測定が短時間ですむ。
【００３９】
液体クロマトグラフィーとは、ＨＰＬＣ又はＵＰＬＣを指す。
【００４０】
液体クロマトグラフィーを実施するのは、質量分析に供するためにサンプルを分画することが主目的である。よって、必ずしもｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣを単離する必要はない。サンプルを質量分析に供し、ｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣが定量可能な程度に分画されることが好ましい。より少ないＤＮＡ断片量でｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣの定量ができるように分画することが、より好ましい。
【００４１】
ｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣの測定には、質量分析を利用する。ＤＮＡ断片を含むサンプルに夾雑物が含まれる場合、当該夾雑物の存在により質量分析が妨げられる（例えば、測定の再現性が失われる、定量限界が引き上げられる等）場合があるが、特定ｍ／ｚの選択的イオンモニタリングでは夾雑物が検出できない場合が多い。液体クロマトグラフィーにはＵＶ−ＶＩＳ検出器、蛍光検出器等の検出器を組み込むことが可能であるので、これらの検出器を利用してカラムから溶出されるｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣと夾雑物とを、ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣの定量を妨げない程度に分離できたか確認できる。
【００４２】
移動相はｐＨ６．０〜８．０の緩衝液とｌｏｇＰ値−０．７〜−０．３の有機溶媒を組み合わせることが好ましい。
【００４３】
移動相の混合比は、上記緩衝液に対して上記有機溶媒１０〜３０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１５〜２５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは２０％（ｖ／ｖ）である。
【００４４】
本発明において「ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液に対してｌｏｇＰ値−０．７〜−０．３の有機溶媒を１０〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲内」とするとは、移動相全量中、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液は９０〜７０％（ｖ／ｖ）とすることができ、対応してｌｏｇＰ値−０．７〜−０．３の有機溶媒は１０〜３０％（ｖ／ｖ）とすることができることを意味する。この溶媒組成であれば、カラムから溶出されるｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣと夾雑物とを、ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣの測定、好ましくは定量を妨げない程度に分離することができる。特に、後述する好ましい担体を利用すると、分離効果は一層顕著になる。
【００４５】
本発明においては、ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣの測定中に、上記範囲内でグラジエントをかけても良いし、溶媒濃度を一定として測定を行っても良いし、これらを組み合わせても良い。好ましくは、上記混合比の範囲内の特定の値で溶媒濃度を一定とする。
【００４６】
ここで言う「溶媒濃度を一定とする」とは、測定前のカラムの平衡化を省略できる程度までグラジエント範囲を狭くすることを含む概念である。このように移動相の条件を設定した結果、例え１つのサンプルしか測定しなくても、好ましいｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣの分離状態を実現できる。更に、２以上のＤＮＡ断片を含むサンプルを連続分析でき、単位時間当たりの分析数を増やすことができる。
【００４７】
上記溶媒濃度を一定とする手段は特に限定されず、混合後の溶媒を用いて液体クロマトグラフィーを行っても良いし、混合前の複数の溶媒を用い、液体クロマトグラフィー機器に混合させても良い。当然に、ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定していないときは、溶媒、溶媒組成ともに上記記載に限定されない。
【００４８】
上記緩衝液を調製するための緩衝剤は特に限定されないが、例えば、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムを用いることができ、これらを組み合わせて用いることもできる。好ましくはギ酸アンモニウムである。
【００４９】
上記有機溶媒としては、例えば、メタノール、アセトニトリル、があり、これらを組み合わせて用いることもできる。好ましくはメタノールである。
【００５０】
好ましい移動相の組み合わせとして、メタノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液を例示することができる。
【００５１】
液体クロマトグラフィーの担体（ＨＰＬＣ等カラムを用いる場合はカラム充填物）は特に限定されないが、疎水性のものを用いることが好ましい。例えば、ＯＤＳを含む炭素数８〜３０の炭化水素−Ｓｉ結合物、フェニル−Ｓｉ結合物等が好ましく、カルバモイル−Ｓｉ結合物、アミノアルキル―Ｓｉ結合物等も使用可能である。好ましくは、ＯＤＳである。
【００５２】
液体クロマトグラフィーに用いるカラムの担体充填部位の断面積は限定されないが好ましくは０．８〜４７．８ｍｍ２であり、より好ましくは１６．０〜１７．０ｍｍ２である。カラムの担体充填部位の長さは特に限定されないが、好ましくは５００〜２５００ｍｍであり、より好ましくは７００〜８００ｍｍである。カラムを決定するに際しては、分析機器の特性を考慮して、適宜好ましい担体、断面積と長さを組み合わせることができる。
【００５３】
液体クロマトグラフィーにおける流量は特に限定されないが、０．２〜１．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、より好ましくは０．２５〜０．３５ｍＬ／ｍｉｎである。
【００５４】
液体クロマトグラフィー−質量分析に供したサンプルのトータルｄＣに対するメチル化、ヒドロキシメチル化の割合は、例えば下記「数１」に示す式で求めることができる。式中、ｄＣ等の単位は質量、ｍｏｌ、残基数など適宜選択すればよい。
【００５５】
【数１】
ほかに、ｄＧはｄＣと相補的な塩基であることを利用し、ｄＧ量に対するｍｄＣ、ｈｍｄＣ量を求めることで、ｄＣのメチル化、ヒドロキシメチル化の程度を求めることもできる。これらのように、サンプルのトータルｄＣに対するメチル化、ヒドロキシメチル化の割合は、分析者が適当な計算式を用いて求めることができる。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されない。
【００５７】
−実施例１−
〔ＤＮＡ抽出〕
（ｉ）比較的多い量の抽出対象を抽出に使用できる場合
サルの大脳皮質、小脳、子宮、心臓、筋肉、腎臓、卵巣、肝臓、肺、及び小腸、マウスの大脳皮質、筋肉、心臓、膀胱、腎臓、肝臓、肺、胃、副腎、すい臓、大腸、小腸、及び精巣をＤＮＡ抽出対象として準備した。
【００５８】
以上の各ＤＮＡ抽出対象について、サル大脳皮質１連、サル小脳１連、サル子宮３連、サル心臓３連、サル筋肉３連、サル腎臓３連、サル卵巣４連、サル肝臓３連、サル肺３連、サル小腸３連、マウス大脳皮質４連、マウス筋肉４連、マウス心臓４連、マウス膀胱４連、マウス腎臓４連、マウス肝臓４連、マウス肺４連、マウス胃４連、マウス副腎４連、マウスすい臓４連、マウス大腸４連、マウス小腸４連、マウス精巣４連、それぞれ測定を行った。以下においては、各組織の測定結果などは平均値を記載する。
【００５９】
準備した上述の各ＤＮＡ抽出対象からスピンカラム法によってゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出量の測定のため、ＤＮＡ濃度の測定には分光光度計を使用し、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより定量した（Ａ２６０１．０＝５０ｎｇ／μＬ）。
【００６０】
調製したゲノムＤＮＡから１〜２ｎｇを新しいマイクロチューブに分注したものを遠心濃縮した後、以下の「ＤＮＡ断片化」工程に使用した。
【００６１】
（ｉｉ）抽出対象量が制限される場合（細胞１００個、又は１０００個）
ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＴｉｓｓｕｅＸＳを用いて、マウスＥＳ細胞（ＥＳ−Ｄ３株、米国ＡＴＣＣより購入）１００個又は１０００個を１連として各２連、ＤＮＡ抽出をスピンカラム法により行った。抽出したゲノムＤＮＡの全量を以下の「ＤＮＡ断片化」工程に使用した。以下においては、各細胞数における測定結果などは平均値を記載する。
【００６２】
〔ＤＮＡ断片化〕
上記「ＤＮＡ抽出」工程で用意したゲノムＤＮＡを、マイクロチューブを用いて、２−メルカプトエタノール（１０ｍＭ）および硫酸亜鉛（１ｍＭ）を含む酢酸ナトリウム緩衝液（３０ｍＭ、ｐＨ５．３）１００μＬ中で和光純薬工業社製のヌクレアーゼＰ１（４Ｕ）およびアルカリフォスファターゼ（３Ｕ）存在下、３７℃、３時間インキュベートした。
【００６３】
その後、トリス−塩酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）を２０μＬ加えて、さらに３時間インキュベートした。
【００６４】
その後、反応液に対して５倍量のエタノールを加えて十分混和することにより、酵素反応を停止した。
【００６５】
続いて、酵素反応を停止した混液を１０，０００×ｇ、室温で５分間遠心分離し、上清を新しいマイクロチューブに分注した。
【００６６】
分注した上清を遠心濃縮により完全にドライアップ後、内部標準（１５Ｎ３−ｄＣおよびｍｄＣ−ｄ３）を含む蒸留水（１００μＬ）に再溶解したものをＬＣ−ＭＳ／ＭＳサンプル溶液とした。
【００６７】
〔ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析〕
定量解析にはトリプル四重極ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＰＩ４０００、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を使用した。また、測定条件は以下の通りである。
サンプル注入量：６０μＬ
カラム：ＴＯＳＯＨ社製ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｖ ３μｍ（ＯＤＳカラム）
カラムサイズ：４．６ｍｍφ×７５０ｍｍ
移動相１：メタノール
移動相２：１０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ６．６）
移動相の体積比：移動相１：移動相２（２０：８０）固定
流量：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
インターフェイス（イオン化）：ＥＳＩ
ＭＳ測定モード：ポジティブイオンモード
総分析時間：７．０分
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの定量限界は、ｄＣ５．４ｐｇ（相関係数ｒ＝０．９９９８）、ｍｄＣ５７．８ｆｇ（ｒ＝０．９９９６）、ｈｍｄＣ１５．４ｆｇ（ｒ＝０．９９９７）であった。即ち、超高感度の測定を実現した。
【００６８】
図２（ＭＳクロマトグラム）に示すとおり、ｄＣは保持時間約４．６分、ｍｄＣは保持時間約５．５分、ｈｍｄＣは保持時間約４．４分に検出された。検出・定量は、内部標準を利用して行った。その際、デオキシリボースの開裂を示す分子量−１１６を捉えた。
【００６９】
ｄＣのメチル化の程度は「Ｍｅｔｈｙｌ（％）＝ｍｄＣ質量×１００／（ｍｄＣ質量＋ｄＣ質量＋ｈｍｄＣ質量）」によって計算した。
【００７０】
メチル化の計算結果は、サル大脳皮質４．６２％、サル小脳４．７２％、サル子宮３．９２％、サル心臓３．８０％、サル筋肉３．７６％、サル腎臓３．９６％、サル卵巣３．７７％、サル肝臓３．７９％、サル肺４．０６％、サル小腸３．９４％（以上の結果の棒グラフを図３に示す。）、マウス大脳皮質３．７８％、マウス筋肉３．１０％、マウス心臓３．０８％、マウス膀胱３．０４％、マウス腎臓３．２８％、マウス肝臓３．２５％、マウス肺３．１８％、マウス胃３．０７％、マウス副腎３．８７％、マウスすい臓２．８６％、マウス大腸３．２７％、マウス小腸３．５８％、マウス精巣３．２３％（以上の結果の棒グラフを図５に示す。）、マウスＥＳ細胞２．９１％であった。
【００７１】
ｄＣのヒドロキシメチル化の程度は「Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ（％）＝ｈｍｄＣ質量×１００／（ｍｄＣ質量＋ｄＣ質量＋ｈｍｄＣ質量）」によって計算した。
【００７２】
ヒドロキシメチル化の計算結果は、サル大脳皮質１．１７％、サル小脳０．９５％、サル子宮０．３１％、サル心臓０．２６％、サル筋肉０．２３％、サル腎臓０．２１％、サル卵巣０．１７％、サル肝臓０．１７％、サル肺０．１０％、サル小腸０．０８％（以上の結果の棒グラフを図４に示す。）、マウス大脳皮質０．６１％、マウス筋肉０．１７％、マウス心臓０．１６％、マウス膀胱０．１６％、マウス腎臓０．１５％、マウス肝臓０．１３％、マウス肺０．１３％、マウス胃０．１０％、マウス副腎０．０９％、マウスすい臓０．０７％、マウス大腸０．０６％、マウス小腸０．０５％、マウス精巣０．０５％（以上の結果の棒グラフを図６に示す。）、マウスＥＳ細胞０．２５％であった。
【００７３】
本実施例においては、１つのサンプルについてｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣの一斉解析に成功した。更に、測定１回あたりの時間は７．０分であり、短時間かつ超高感度の測定を実現した。短時間で分析ができるので、単位時間当たりの測定サンプル数を大幅に増やすことが可能である。
【００７４】
−実施例２−
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析における、溶媒濃度とｄＣ、ｍｄＣ及びｈｍｄＣ各ピークの分離について検討した。
【００７５】
測定にはｄＣ、ｍｄＣ及びｈｍｄＣ標品の混合液を用いた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、「移動相の体積比」以外は実施例１と同様とした。移動相の体積比を以下の（Ａ）〜（Ｆ）として分析を行った。
（Ａ）移動相１：移動相２（０：１００）固定
（Ｂ）移動相１：移動相２（１０：９０）固定
（Ｃ）移動相１：移動相２（２０：８０）固定
（Ｄ）移動相１：移動相２（３０：７０）固定
（Ｅ）移動相１：移動相２（４０：６０）固定
（Ｆ）移動相１：移動相２（５０：５０）固定
測定結果を図７に示す。図７においては、実線のピークがｈｍｄＣピークであり、破線のピークがｄＣピークであり、一点鎖線のピークがｍｄＣピークである。ピークの検出順序は図２を参照できる。
【００７６】
体積比（Ｂ）〜体積比（Ｄ）において、各ピークが良好に分離され、かつ、１回の分析時間を短時間とすることができた。
【００７７】
体積比（Ａ）では１回の分析に時間がかかりすぎてしまう。また、ピークの分離も良くない。体積比（Ｅ）及び体積比（Ｆ）では各ピークの分離が十分でなかった。
【００７８】
−実施例３−
ＤＮＡ断片を含むサンプルの連続分析について検討を行った。
【００７９】
実施例１のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析において、ＵＶ−ＶＩＳ検出器では保持時間１０分までｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣの定量を妨げる夾雑物が検出された。
【００８０】
サンプルの連続分析では、夾雑物をｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣの定量を妨げないように溶出させる必要があるため、１サイクルの分析時間は確実を期して１２分とした。
【００８１】
本実施例のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は移動相の体積比を固定しているので、毎回の分析前のカラム平衡化を省略できる。
【００８２】
よって、実施例１のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析と同じ条件で、１２分を１サイクルとして、ＤＮＡ断片を含むサンプルの連続分析を行うことができた。連続分析の各回で、ｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣの一斉解析に成功した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明により、迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣを測定する方法が提供される。更に、ｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣを一斉測定する方法が提供される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法に関する。更に詳しくは、ｄＣ、ｍｄＣ及びｈｍｄＣを一斉測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡのデオキシシトシンのメチル化やヒドロキシメチル化は、動物の初期発生、インプリンティング、細胞分化、がん化および老化等によって変化し（いわゆるエピジェネティック変化）、遺伝子発現と深い関わりがある。
【０００３】
一方で、遺伝子の発現順序や細胞の分化の過程を研究し再生医療に活用しようという試みが、近年一層活発化している。胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞とも称する。）や誘導多能性幹細胞（以下、ｉＰＳ細胞とも称する）分野においては、エピジェネティック変化に着目し、多能性の獲得メカニズムや分化のメカニズムが研究されている。
【０００４】
以上のような背景に鑑み、下記特許文献１においては、定量的ＰＣＲ法を利用してゲノム中の特定の遺伝子のメチル化の程度を決定する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００９−５０８４７５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｌｏｂｉｓｃｈ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（１２），ｅ１５３６７（２０１０）．
【非特許文献２】Ｋｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４６８，８３９−８４３（２０１０）.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願明細書において、デオキシシトシンはｄＣとも称する。５−メチルデオキシシトシンはｍｄＣとも称する。５−ヒドロキシメチルデオキシシトシンはｈｍｄＣとも称する。
ゲノムＤＮＡ中のｄＣのメチル化やヒドロキシメチル化の程度は、動物の初期発生、インプリンティング、細胞分化、がん化および老化等によって変化し、遺伝子発現と深い関わりがある。ｄＣのメチル化／ヒドロキシメチル化は遺伝子配列が関与しない遺伝情報の発現制御模様を示すと考えられる。従って、ｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣを迅速かつ超高感度に測定する方法の開発が望まれている。更には、その測定結果を利用して、ｄＣのメチル化、ヒドロキシメチル化の割合を知ることが重要であると考えられる。
【０００８】
感度良く、そして短い時間での分析が可能になれば、生命現象・病態のより深い理解、新規薬物の探索が可能となる。また、量が少ない極めて貴重なサンプル（例えば、卵子・受精卵等の初期胚発生段階のサンプル、ＥＳ細胞および病理生検）の研究においては超高感度の分析が要求される。
【０００９】
上記特許文献１においては、特定の遺伝子のメチル化の程度を知る方法の開示があるが、ゲノム全体におけるＤＮＡのメチル化の把握が困難であったばかりでなく、ヒドロキシメチル化を測定できないという問題があった。その上、ＰＣＲ法を利用するがゆえに解析には時間がかかってしまうという問題があった。
【００１０】
非特許文献１に記載の分析方法は溶媒濃度の変化を利用するため１サンプルの分析に９５分も要し、産業応用を考えると極めて非効率的であった。また、１回の分析時間が非常に長いので、破壊分析を積極的に利用する契機の提供がないばかりでなく、産業応用の面で上記ＰＣＲ法に対して有利な側面が提供されていなかった。
【００１１】
本願発明者らは鋭意研究し、受精卵及びサル／マウス胚性幹細胞及びその分化段階における量的なエピジェネティック変化について解析した結果、迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣを測定する方法を確立するに至った。更には、ｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣを一斉測定する方法を確立するに至った。
【００１２】
よって、迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣを測定する方法を提供することを、本発明が解決すべき課題とする。更に、ｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣを一斉測定する方法を提供することを本発明が解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、
ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法であって、
内部標準、及び、１００ｎｇ以下のＤＮＡ断片あるいは細胞１００〜１０００個から調製されたＤＮＡ断片を含むサンプルを、
液体クロマトグラフィー−質量分析に供し、
液体クロマトグラフィーの移動相は、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液に対してｌｏｇＰ値−０．７〜−０．３の有機溶媒を１０〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲内とし、
デオキシリボースの開裂に基づいて測定することを特徴とするｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法である。
【００１４】
本願第１発明はｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法であるので、ＤＮＡ断片の量が０となることはない。１回の測定に供されるＤＮＡ断片の量の下限は本来的には限定されるものではないが、現実の測定においては、使用する分析機器の定量限界の影響を受けうる。
【００１５】
（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、
前記ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法であって、
液体クロマトグラフィーの移動相の溶媒濃度を一定にする第１発明に記載のｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、破壊分析の利点を生かし、迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣを測定する方法が提供される。好ましくは、迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣを一斉測定する方法が提供される。従来の測定方法に比べて測定時間の著しい短縮に成功し、かつ、量が少ない極めて貴重なサンプルの有効な解析が可能となった。
【００１７】
特に、溶媒濃度を一定にして測定を行う場合、第１に、より好ましいｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣの分離状態を実現できる。第２に、各回の分析前のカラム平衡化を省略することができ、単位時間当たりより多くのサンプルを解析可能である。
【００１８】
本発明の測定は定量的に行うことができるので、ＤＮＡ断片の由来の解析に役立つ。例えば、特定のＤＮＡをプローブなどにより吊り上げてＤＮＡ断片を調製した場合、当該特定のＤＮＡについてのｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣの測定が可能である。エピジェネティック変化をより広い視点から解析できる。また、例えば、細胞のゲノムＤＮＡからＤＮＡ断片を調製すれば、特定の遺伝子についてのエピジェネティック変化を捉えるのではなく、細胞のゲノムＤＮＡ全体のｄＣのメチル化やヒドロキシメチル化の程度を知ることができる。
【００１９】
特定の遺伝子のエピジェネティック変化のみならず、例えばゲノムＤＮＡ全体のｄＣのメチル化やヒドロキシメチル化の程度を知ることは、ＥＳ／ｉＰＳ細胞のクオリティーコントロール、がんの悪性度・進行度合いの評価、神経変性疾患およびその他の老化関連疾患のリスク評価において重要であると推測される。実際、臨床調査において白血病患者から採取した白血球ゲノムＤＮＡの多くでｄＣのメチル化／ヒドロキシメチル化に異常が見られることが報告されている（非特許文献２）。
【００２０】
また、タンパク質の機能解析において、そのタンパク質を大量に合成する必要がある場合、宿主としてはハエ由来細胞などのＤＮＡメチル化が起こらない、あるいは起こりにくい細胞系を用いることがある。これらは研究者の経験によるところが大きいが、本測定法を用いれば、プラスミドＤＮＡのメチル化レベルを測定することにより、最適な宿主、あるいは最適なプラスミドベクターを定量的に選定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】マウスＥＳ細胞１００個又は１０００個からゲノムＤＮＡ抽出をした場合でも、ｍｄＣが定量可能であることを示す図である。
【図２】本実施例（サル大脳皮質）に係る測定での、ｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣの保持時間を示す図である。
【図３】本実施例に係る、サルの各組織のゲノムＤＮＡ中のｄＣのメチル化の程度を示す。
【図４】本実施例に係る、サルの各組織のゲノムＤＮＡ中のｄＣのヒドロキシメチル化の程度を示す。
【図５】本実施例に係る、マウスの各組織のゲノムＤＮＡ中のｄＣのメチル化の程度を示す。
【図６】本実施例に係る、マウスの各組織のゲノムＤＮＡ中のｄＣのヒドロキシメチル化の程度を示す。
【図７】移動相の体積比条件を変化させた場合のｄＣピーク、ｍｄＣピーク、ｈｍｄＣピークの分離状態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に、本発明を実施するための形態を、最良の形態を含めて説明する。
【００２３】
〔ＤＮＡ抽出・断片化〕
本発明は迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣを測定可能であり、ｄＣのメチル化／ヒドロキシメチル化の割合を解析するのに適している。また、デオキシリボースの開裂を捉えてｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣを測定するため、抽出したＤＮＡをデオキシアデニン（以下、ｄＡとも称する。）、デオキシグアニン（以下、ｄＧとも称する。）、デオキシシトシン、チミン（以下、Ｔとも称する。）等の１残基単位に断片化することが好ましい。
【００２４】
よって、本発明のＤＮＡ断片とは、例えばｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣ等、１残基単位に調製されたＤＮＡ残基をいう。ＤＮＡ断片を含むサンプルには、夾雑物が含まれていても構わない。
【００２５】
ＤＮＡの断片化の方法は特に限定されない。トータルｄＣに対するメチル化、ヒドロキシメチル化の割合を維持できるＤＮＡの断片化の方法が好ましく、後述の実施例におけるような酵素法を好ましく例示できる。
【００２６】
本発明に用いるＤＮＡ断片の由来は特に限定されず、動物、植物、微生物等に由来するＤＮＡ断片を限定なく用いることができる。例えば、生殖・内分泌に関与する細胞（乳腺細胞、卵原細胞、子宮上皮細胞、セルトリ細胞等）、皮膚に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（脳や脊髄などの中枢神経系や末梢神経系の神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯根膜細胞及び骨芽細胞等）、血液に関与する細胞（白血球及び赤血球等）、及び幹細胞｛例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞（ｏｖａｌ ｃｅｌｌ、ｓｍａｌｌ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ等）、脂肪組織幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、精子幹細胞、胚生殖幹（ＥＧ）細胞、膵臓幹細胞（膵管上皮幹細胞等）、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞、前駆細胞（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞等）等｝等が挙げられる。また、昆虫細胞として、カイコ細胞（ＢｍＮ細胞及びＢｏＭｏ細胞等）、クワコ細胞、サクサン細胞、シンジュサン細胞、ヨトウガ細胞（Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等）、クワゴマダラヒトリ細胞、ハマキムシ細胞、ショウジョウバエ細胞、センチニクバエ細胞、ヒトスジシマカ細胞、アゲハチョウ細胞、ワモンゴキブリ細胞及びイラクサキンウワバ細胞（Ｔｎ−５細胞、ＨＩＧＨ
ＦＩＶＥ細胞及びＭＧ１細胞等）等が挙げられる。また、植物は、細胞やカルスなどのほか、表皮組織、柔組織、師管・師部繊維等の師部組織、道管・仮道管・木部繊維等の木部組織、茎、塊茎、葉、根、塊根、穂木、蕾、花、花弁、雌ずい、雄ずい、葯、花粉、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維、胚珠等が挙げられる。その他、上述した組織パラフィン切片に由来するＤＮＡ断片を用いることも可能である。また、酵母、線虫およびハエのようなＤＮＡのメチル化が起こらない、あるいは起こりにくいと考えられている生物についても分析対象となり得る。
【００２７】
抽出操作を適宜工夫することにより、特定の遺伝子をコードするＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等から調製したＤＮＡ断片を測定対象とすることができる。測定対象としては、ゲノムＤＮＡ、特定の遺伝子をコードするＤＮＡから調製したＤＮＡ断片が好ましく、ゲノムＤＮＡから調製したＤＮＡ断片が特に好ましい。
【００２８】
ＤＮＡの抽出方法は特に限定されず、一般に用いられている手法を採用することができる。例えば、フェノール−クロロホルム法やスピンカラム法、アルカリ法等を採用することができる。特定遺伝子のプロモーター領域を組み込んだプラスミドＤＮＡを用いれば、遺伝子導入した細胞内での特定プロモーター領域のメチル化動態を定量するモデル実験系を構築することができる。ＤＮＡ抽出の対象の量が微量である場合、市販されている微量サンプルＤＮＡ抽出用キットを用いることができる。
【００２９】
抽出、必要により断片化の工程を経て調製されたＤＮＡ断片を含むサンプルは、すぐに液体クロマトグラフィー−質量分析に供しても良いし、サンプルを安定に保存できる条件で保存してもよい。即ち、所定期間サンプルを保存した後に液体クロマトグラフィー−質量分析を行っても良い。好ましいサンプルの保存方法としては、乾燥状態あるいは溶液状態での−８０℃凍結保存等が挙げられる。
【００３０】
ＤＮＡ断片を含むサンプルの形状は特に限定されないが、液体クロマトグラフィーに供する際は溶液状態であることが好ましい。
【００３１】
〔液体クロマトグラフィー−質量分析〕
本発明において１回の測定に供されるＤＮＡ断片の量は、１００ｎｇ以下、好ましくは１０ｎｇ以下、より好ましくは２ｎｇ以下、あるいは、細胞１００〜１０００個から調製されたＤＮＡ断片全量、好ましくは、細胞１００〜２００個から調製されたＤＮＡ断片全量である。
【００３２】
本発明において、１回の測定に供されるＤＮＡ断片の量の下限は本来的には限定されるものではないが、現実の測定においては、使用する分析機器の定量限界の影響を受けうる。仮に下限値を例示するならば、１回の測定に供されるＤＮＡ断片の量は、０．１〜１００ｎｇであり、好ましくは０．１〜１０ｎｇであり、より好ましくは０．１〜２ｎｇ、あるいは、細胞１００〜１０００個から調製されたＤＮＡ断片全量、好ましくは、細胞１００〜２００個から調製されたＤＮＡ断片全量である。
【００３３】
本発明において内部標準とは、ｄＣ、ｍｄＣ、又はｈｍｄＣの同定や定量に用いるものをいう。測定するｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣの安定同位体を内部標準として使用することが好ましい。安定同位体として、１３Ｃ、２Ｈ、１５Ｎなどの原子を１以上含むｄＣ、ｍｄＣ、又はｈｍｄＣが例示される。これらの安定同位体は、質量分析の検出質量が変化する。内部標準を添加する工程は特に限定されないが、ＤＮＡの断片化後に添加することが好ましい。
【００３４】
液体クロマトグラフィー−質量分析の装置構成は、液体クロマトグラフィーを行った後、質量分析を行うのであれば特に限定されない。例えば、液体クロマトグラフィー機器と質量分析機器とを結合したＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析の他、液体クロマトグラフィーによりサンプルを分画した後、特定の画分を質量分析に供する分析も含まれる。好ましくは液体クロマトグラフィー機器と質量分析機器を結合した分析であり、より好ましくはＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析である。
【００３５】
質量分析でのイオン化法は特に限定されず、ＥＳＩ―ＭＳ、ＣＩ―ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＡＰＣＩ−ＭＳ等が含まれる。好ましくは、ＥＳＩ−ＭＳである。これらの質量分析は、ＭＳ／ＭＳとすることが好ましい。イオン化を伴う質量分析において、当該イオン化は、ＬＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおけるインターフェイスに組み込むことができる。
【００３６】
本発明においては、ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定するにあたって、デオキシリボース部位の開裂を捉える。ＤＮＡに含まれる、ＤＮＡ断片たるｄＡ、ｄＧ、ｄＣ（ｍｄＣ、ｈｍｄＣ）、Ｔ等の各残基は、デオキシリボースを包含する。例えばＥＳＩ−ＭＳもしくはＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳのポジティブイオン化モードで測定した場合、デオキシリボース部位に相当する−１１６の開裂を捉えることができる。例え夾雑物がｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣと同じ保持時間で液体クロマトグラフィー機器から溶出しても、デオキシリボース部位の開裂を捉えることで、ＤＮＡ断片であると同定することができる。ただし、夾雑物がＤＮＡ断片のイオン化を阻害する場合等、測定に悪影響を与える場合もありえるので、液体クロマトグラフィーの移動相は後述の組成を採用することが好ましい。
【００３７】
測定に際し、ｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣの内部標準等により予め検量線を作成しておけば、一度の分析でｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣの各含有量が一斉測定できる。
【００３８】
質量分析は破壊分析であり、高感度を実現することができ、微量サンプルの解析に適している。また、デオキシリボースというＤＮＡ残基に特徴的な部位の開裂を捉えるので、短時間かつ簡便に標的物質の同定・定量が可能となる。上記特許文献１に記載のＰＣＲ法は、目的遺伝子を単離した後、更に目的遺伝子を増幅して定量するため、一回の測定に長時間を要するが、本発明は、ＤＮＡ断片を含むサンプルを調製するだけでよく、その上一回の測定が短時間ですむ。
【００３９】
液体クロマトグラフィーとは、ＨＰＬＣ又はＵＰＬＣを指す。
【００４０】
液体クロマトグラフィーを実施するのは、質量分析に供するためにサンプルを分画することが主目的である。よって、必ずしもｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣを単離する必要はない。サンプルを質量分析に供し、ｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣが定量可能な程度に分画されることが好ましい。より少ないＤＮＡ断片量でｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣの定量ができるように分画することが、より好ましい。
【００４１】
ｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣの測定には、質量分析を利用する。ＤＮＡ断片を含むサンプルに夾雑物が含まれる場合、当該夾雑物の存在により質量分析が妨げられる（例えば、測定の再現性が失われる、定量限界が引き上げられる等）場合があるが、特定ｍ／ｚの選択的イオンモニタリングでは夾雑物が検出できない場合が多い。液体クロマトグラフィーにはＵＶ−ＶＩＳ検出器、蛍光検出器等の検出器を組み込むことが可能であるので、これらの検出器を利用してカラムから溶出されるｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣと夾雑物とを、ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣの定量を妨げない程度に分離できたか確認できる。
【００４２】
移動相はｐＨ６．０〜８．０の緩衝液とｌｏｇＰ値−０．７〜−０．３の有機溶媒を組み合わせることが好ましい。
【００４３】
移動相の混合比は、上記緩衝液に対して上記有機溶媒１０〜３０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１５〜２５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは２０％（ｖ／ｖ）である。
【００４４】
本発明において「ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液に対してｌｏｇＰ値−０．７〜−０．３の有機溶媒を１０〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲内」とするとは、移動相全量中、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液は９０〜７０％（ｖ／ｖ）とすることができ、対応してｌｏｇＰ値−０．７〜−０．３の有機溶媒は１０〜３０％（ｖ／ｖ）とすることができることを意味する。この溶媒組成であれば、カラムから溶出されるｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣと夾雑物とを、ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣの測定、好ましくは定量を妨げない程度に分離することができる。特に、後述する好ましい担体を利用すると、分離効果は一層顕著になる。
【００４５】
本発明においては、ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣの測定中に、上記範囲内でグラジエントをかけても良いし、溶媒濃度を一定として測定を行っても良いし、これらを組み合わせても良い。好ましくは、上記混合比の範囲内の特定の値で溶媒濃度を一定とする。
【００４６】
ここで言う「溶媒濃度を一定とする」とは、測定前のカラムの平衡化を省略できる程度までグラジエント範囲を狭くすることを含む概念である。このように移動相の条件を設定した結果、例え１つのサンプルしか測定しなくても、好ましいｄＣ、ｍｄＣ、ｈｍｄＣの分離状態を実現できる。更に、２以上のＤＮＡ断片を含むサンプルを連続分析でき、単位時間当たりの分析数を増やすことができる。
【００４７】
上記溶媒濃度を一定とする手段は特に限定されず、混合後の溶媒を用いて液体クロマトグラフィーを行っても良いし、混合前の複数の溶媒を用い、液体クロマトグラフィー機器に混合させても良い。当然に、ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定していないときは、溶媒、溶媒組成ともに上記記載に限定されない。
【００４８】
上記緩衝液を調製するための緩衝剤は特に限定されないが、例えば、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムを用いることができ、これらを組み合わせて用いることもできる。好ましくはギ酸アンモニウムである。
【００４９】
上記有機溶媒としては、例えば、メタノール、アセトニトリル、があり、これらを組み合わせて用いることもできる。好ましくはメタノールである。
【００５０】
好ましい移動相の組み合わせとして、メタノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液を例示することができる。
【００５１】
液体クロマトグラフィーの担体（ＨＰＬＣ等カラムを用いる場合はカラム充填物）は特に限定されないが、疎水性のものを用いることが好ましい。例えば、ＯＤＳを含む炭素数８〜３０の炭化水素−Ｓｉ結合物、フェニル−Ｓｉ結合物等が好ましく、カルバモイル−Ｓｉ結合物、アミノアルキル―Ｓｉ結合物等も使用可能である。好ましくは、ＯＤＳである。
【００５２】
液体クロマトグラフィーに用いるカラムの担体充填部位の断面積は限定されないが好ましくは０．８〜４７．８ｍｍ２であり、より好ましくは１６．０〜１７．０ｍｍ２である。カラムの担体充填部位の長さは特に限定されないが、好ましくは５００〜２５００ｍｍであり、より好ましくは７００〜８００ｍｍである。カラムを決定するに際しては、分析機器の特性を考慮して、適宜好ましい担体、断面積と長さを組み合わせることができる。
【００５３】
液体クロマトグラフィーにおける流量は特に限定されないが、０．２〜１．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、より好ましくは０．２５〜０．３５ｍＬ／ｍｉｎである。
【００５４】
液体クロマトグラフィー−質量分析に供したサンプルのトータルｄＣに対するメチル化、ヒドロキシメチル化の割合は、例えば下記「数１」に示す式で求めることができる。式中、ｄＣ等の単位は質量、ｍｏｌ、残基数など適宜選択すればよい。
【００５５】
【数１】
ほかに、ｄＧはｄＣと相補的な塩基であることを利用し、ｄＧ量に対するｍｄＣ、ｈｍｄＣ量を求めることで、ｄＣのメチル化、ヒドロキシメチル化の程度を求めることもできる。これらのように、サンプルのトータルｄＣに対するメチル化、ヒドロキシメチル化の割合は、分析者が適当な計算式を用いて求めることができる。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されない。
【００５７】
−実施例１−
〔ＤＮＡ抽出〕
（ｉ）比較的多い量の抽出対象を抽出に使用できる場合
サルの大脳皮質、小脳、子宮、心臓、筋肉、腎臓、卵巣、肝臓、肺、及び小腸、マウスの大脳皮質、筋肉、心臓、膀胱、腎臓、肝臓、肺、胃、副腎、すい臓、大腸、小腸、及び精巣をＤＮＡ抽出対象として準備した。
【００５８】
以上の各ＤＮＡ抽出対象について、サル大脳皮質１連、サル小脳１連、サル子宮３連、サル心臓３連、サル筋肉３連、サル腎臓３連、サル卵巣４連、サル肝臓３連、サル肺３連、サル小腸３連、マウス大脳皮質４連、マウス筋肉４連、マウス心臓４連、マウス膀胱４連、マウス腎臓４連、マウス肝臓４連、マウス肺４連、マウス胃４連、マウス副腎４連、マウスすい臓４連、マウス大腸４連、マウス小腸４連、マウス精巣４連、それぞれ測定を行った。以下においては、各組織の測定結果などは平均値を記載する。
【００５９】
準備した上述の各ＤＮＡ抽出対象からスピンカラム法によってゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出量の測定のため、ＤＮＡ濃度の測定には分光光度計を使用し、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより定量した（Ａ２６０１．０＝５０ｎｇ／μＬ）。
【００６０】
調製したゲノムＤＮＡから１〜２ｎｇを新しいマイクロチューブに分注したものを遠心濃縮した後、以下の「ＤＮＡ断片化」工程に使用した。
【００６１】
（ｉｉ）抽出対象量が制限される場合（細胞１００個、又は１０００個）
ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＴｉｓｓｕｅＸＳを用いて、マウスＥＳ細胞（ＥＳ−Ｄ３株、米国ＡＴＣＣより購入）１００個又は１０００個を１連として各２連、ＤＮＡ抽出をスピンカラム法により行った。抽出したゲノムＤＮＡの全量を以下の「ＤＮＡ断片化」工程に使用した。以下においては、各細胞数における測定結果などは平均値を記載する。
【００６２】
〔ＤＮＡ断片化〕
上記「ＤＮＡ抽出」工程で用意したゲノムＤＮＡを、マイクロチューブを用いて、２−メルカプトエタノール（１０ｍＭ）および硫酸亜鉛（１ｍＭ）を含む酢酸ナトリウム緩衝液（３０ｍＭ、ｐＨ５．３）１００μＬ中で和光純薬工業社製のヌクレアーゼＰ１（４Ｕ）およびアルカリフォスファターゼ（３Ｕ）存在下、３７℃、３時間インキュベートした。
【００６３】
その後、トリス−塩酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）を２０μＬ加えて、さらに３時間インキュベートした。
【００６４】
その後、反応液に対して５倍量のエタノールを加えて十分混和することにより、酵素反応を停止した。
【００６５】
続いて、酵素反応を停止した混液を１０，０００×ｇ、室温で５分間遠心分離し、上清を新しいマイクロチューブに分注した。
【００６６】
分注した上清を遠心濃縮により完全にドライアップ後、内部標準（１５Ｎ３−ｄＣおよびｍｄＣ−ｄ３）を含む蒸留水（１００μＬ）に再溶解したものをＬＣ−ＭＳ／ＭＳサンプル溶液とした。
【００６７】
〔ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析〕
定量解析にはトリプル四重極ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＰＩ４０００、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を使用した。また、測定条件は以下の通りである。
サンプル注入量：６０μＬ
カラム：ＴＯＳＯＨ社製ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｖ ３μｍ（ＯＤＳカラム）
カラムサイズ：４．６ｍｍφ×７５０ｍｍ
移動相１：メタノール
移動相２：１０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ６．６）
移動相の体積比：移動相１：移動相２（２０：８０）固定
流量：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
インターフェイス（イオン化）：ＥＳＩ
ＭＳ測定モード：ポジティブイオンモード
総分析時間：７．０分
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの定量限界は、ｄＣ５．４ｐｇ（相関係数ｒ＝０．９９９８）、ｍｄＣ５７．８ｆｇ（ｒ＝０．９９９６）、ｈｍｄＣ１５．４ｆｇ（ｒ＝０．９９９７）であった。即ち、超高感度の測定を実現した。
【００６８】
図２（ＭＳクロマトグラム）に示すとおり、ｄＣは保持時間約４．６分、ｍｄＣは保持時間約５．５分、ｈｍｄＣは保持時間約４．４分に検出された。検出・定量は、内部標準を利用して行った。その際、デオキシリボースの開裂を示す分子量−１１６を捉えた。
【００６９】
ｄＣのメチル化の程度は「Ｍｅｔｈｙｌ（％）＝ｍｄＣ質量×１００／（ｍｄＣ質量＋ｄＣ質量＋ｈｍｄＣ質量）」によって計算した。
【００７０】
メチル化の計算結果は、サル大脳皮質４．６２％、サル小脳４．７２％、サル子宮３．９２％、サル心臓３．８０％、サル筋肉３．７６％、サル腎臓３．９６％、サル卵巣３．７７％、サル肝臓３．７９％、サル肺４．０６％、サル小腸３．９４％（以上の結果の棒グラフを図３に示す。）、マウス大脳皮質３．７８％、マウス筋肉３．１０％、マウス心臓３．０８％、マウス膀胱３．０４％、マウス腎臓３．２８％、マウス肝臓３．２５％、マウス肺３．１８％、マウス胃３．０７％、マウス副腎３．８７％、マウスすい臓２．８６％、マウス大腸３．２７％、マウス小腸３．５８％、マウス精巣３．２３％（以上の結果の棒グラフを図５に示す。）、マウスＥＳ細胞２．９１％であった。
【００７１】
ｄＣのヒドロキシメチル化の程度は「Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ（％）＝ｈｍｄＣ質量×１００／（ｍｄＣ質量＋ｄＣ質量＋ｈｍｄＣ質量）」によって計算した。
【００７２】
ヒドロキシメチル化の計算結果は、サル大脳皮質１．１７％、サル小脳０．９５％、サル子宮０．３１％、サル心臓０．２６％、サル筋肉０．２３％、サル腎臓０．２１％、サル卵巣０．１７％、サル肝臓０．１７％、サル肺０．１０％、サル小腸０．０８％（以上の結果の棒グラフを図４に示す。）、マウス大脳皮質０．６１％、マウス筋肉０．１７％、マウス心臓０．１６％、マウス膀胱０．１６％、マウス腎臓０．１５％、マウス肝臓０．１３％、マウス肺０．１３％、マウス胃０．１０％、マウス副腎０．０９％、マウスすい臓０．０７％、マウス大腸０．０６％、マウス小腸０．０５％、マウス精巣０．０５％（以上の結果の棒グラフを図６に示す。）、マウスＥＳ細胞０．２５％であった。
【００７３】
本実施例においては、１つのサンプルについてｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣの一斉解析に成功した。更に、測定１回あたりの時間は７．０分であり、短時間かつ超高感度の測定を実現した。短時間で分析ができるので、単位時間当たりの測定サンプル数を大幅に増やすことが可能である。
【００７４】
−実施例２−
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析における、溶媒濃度とｄＣ、ｍｄＣ及びｈｍｄＣ各ピークの分離について検討した。
【００７５】
測定にはｄＣ、ｍｄＣ及びｈｍｄＣ標品の混合液を用いた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、「移動相の体積比」以外は実施例１と同様とした。移動相の体積比を以下の（Ａ）〜（Ｆ）として分析を行った。
（Ａ）移動相１：移動相２（０：１００）固定
（Ｂ）移動相１：移動相２（１０：９０）固定
（Ｃ）移動相１：移動相２（２０：８０）固定
（Ｄ）移動相１：移動相２（３０：７０）固定
（Ｅ）移動相１：移動相２（４０：６０）固定
（Ｆ）移動相１：移動相２（５０：５０）固定
測定結果を図７に示す。図７においては、実線のピークがｈｍｄＣピークであり、破線のピークがｄＣピークであり、一点鎖線のピークがｍｄＣピークである。ピークの検出順序は図２を参照できる。
【００７６】
体積比（Ｂ）〜体積比（Ｄ）において、各ピークが良好に分離され、かつ、１回の分析時間を短時間とすることができた。
【００７７】
体積比（Ａ）では１回の分析に時間がかかりすぎてしまう。また、ピークの分離も良くない。体積比（Ｅ）及び体積比（Ｆ）では各ピークの分離が十分でなかった。
【００７８】
−実施例３−
ＤＮＡ断片を含むサンプルの連続分析について検討を行った。
【００７９】
実施例１のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析において、ＵＶ−ＶＩＳ検出器では保持時間１０分までｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣの定量を妨げる夾雑物が検出された。
【００８０】
サンプルの連続分析では、夾雑物をｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣの定量を妨げないように溶出させる必要があるため、１サイクルの分析時間は確実を期して１２分とした。
【００８１】
本実施例のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は移動相の体積比を固定しているので、毎回の分析前のカラム平衡化を省略できる。
【００８２】
よって、実施例１のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析と同じ条件で、１２分を１サイクルとして、ＤＮＡ断片を含むサンプルの連続分析を行うことができた。連続分析の各回で、ｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣの一斉解析に成功した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明により、迅速かつ超高感度にｄＣ、ｍｄＣ、及び／又はｈｍｄＣを測定する方法が提供される。更に、ｄＣ、ｍｄＣ、及びｈｍｄＣを一斉測定する方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法であって、
内部標準、及び、１００ｎｇ以下のＤＮＡ断片あるいは細胞１００〜１０００個から調製されたＤＮＡ断片を含むサンプルを、
液体クロマトグラフィー−質量分析に供し、
液体クロマトグラフィーの移動相は、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液に対してｌｏｇＰ値−０．７〜−０．３の有機溶媒を１０〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲内とし、
デオキシリボースの開裂に基づいて測定することを特徴とするｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法。
【請求項２】
前記ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法であって、
液体クロマトグラフィーの移動相の溶媒濃度を一定にすることを特徴とする請求項１に記載のｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法。
【請求項１】
ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法であって、
内部標準、及び、１００ｎｇ以下のＤＮＡ断片あるいは細胞１００〜１０００個から調製されたＤＮＡ断片を含むサンプルを、
液体クロマトグラフィー−質量分析に供し、
液体クロマトグラフィーの移動相は、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液に対してｌｏｇＰ値−０．７〜−０．３の有機溶媒を１０〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲内とし、
デオキシリボースの開裂に基づいて測定することを特徴とするｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法。
【請求項２】
前記ｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法であって、
液体クロマトグラフィーの移動相の溶媒濃度を一定にすることを特徴とする請求項１に記載のｄＣ、ｍｄＣ及び／又はｈｍｄＣを測定する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−２３３７９４（Ｐ２０１２−２３３７９４Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０２７６５（Ｐ２０１１−１０２７６５）
【出願日】平成２３年５月２日（２０１１．５．２）
【出願人】（５９９００２０４３）学校法人 名城大学 (142)
【出願人】（５９３００６６３０）学校法人立命館 (359)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月２日（２０１１．５．２）
【出願人】（５９９００２０４３）学校法人 名城大学 (142)
【出願人】（５９３００６６３０）学校法人立命館 (359)
【Ｆターム（参考）】
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