Δ9エロンガーゼおよびそれらの多価不飽和脂肪酸製造における使用
本発明は、リノール酸[18:2、LA]をエイコサジエン酸[20:2、EDA]に転換する能力を有するΔ9エロンガーゼに関する。Δ9エロンガーゼをコードする単離された核酸断片およびこのような断片を含んでなる組み換えコンストラクトと共に、植物および油性酵母中でこれらのΔ9エロンガーゼを使用して長鎖多価不飽和脂肪酸(PUFA)を製造する方法が開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
(a)Δ9エロンガーゼ活性を有し、クラスタルV法のアラインメントに基づいて配列番号2または配列番号5で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
(b)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、BLASTN法のアラインメントに基づいて配列番号1、配列番号3、配列番号4または配列番号6で記載されるヌクレオチド配列と比べると少なくとも70%の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
(c)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、0.1×SSC、0.1%SDSで65℃、そして2×SSC、0.1%SDSで洗浄後、0.1×SSC、0.1%SDSというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1、配列番号3、配列番号4または配列番号6で記載されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
または
(d)(a)、(b)または(c)のヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドからなりそれと100%相補的である、前記ヌクレオチド配列の相補体
よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項2】
ヌクレオチド配列が、配列番号1、配列番号3、配列番号4または配列番号6を含んでなる請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
配列番号1、配列番号3、配列番号4または配列番号6よりなる群から選択される請求項2に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、
(a)配列番号2または配列番号5で記載されるアミノ酸配列、および
(b)少なくとも1つの保存的アミノ酸置換によって(a)のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列
よりなる群から選択されるΔ9エロンガーゼポリペプチド。
【請求項5】
請求項1に記載の単離された核酸配列を含んでなる単離された形質転換宿主細胞。
【請求項6】
宿主細胞が、藻類、細菌、酵母、卵菌類、および菌・カビよりなる群から選択される請求項5に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項7】
宿主細胞が、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)種、シゾキトリウム(Schizochytrium)種、およびモルティエラ(Mortierella)種よりなる群から選択される菌・カビである請求項6に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項8】
酵母が油性酵母である請求項6に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項9】
油性酵母が、ヤロウィア(Yarrowia)、カンジダ(Candida)、ロドトルラ(Rhodotorula)、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、トリコスポロン(Trichosporon)、およびリポミセス(Lipomyces)よりなる群から選択される請求項8に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項10】
酵母がヤロウィア(Yarrowia)種である請求項9に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項11】
ヤロウィア(Yarrowia)種が、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#8862、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#18944、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#76982、およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)LGAMS(7)1よりなる群から選択される請求項10に記載の形質転換された酵母。
【請求項12】
a)i)(1)Δ9エロンガーゼ活性を有し、クラスタルV法のアラインメントに基づいて配列番号2または配列番号5で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
(2)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、0.1×SSC、0.1%SDSで65℃、そして2×SSC、0.1%SDSで洗浄後、0.1×SSC、0.1%SDSというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1、配列番号3、配列番号4または配列番号6で記載されるヌクレオチドとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列
よりなる群から選択される、Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、および
(ii)リノール酸源
を含んでなる単離された形質転換酵母宿主細胞を提供し、
b)ステップ(a)の酵母宿主細胞をΔ9エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸配列が発現されてリノール酸がエイコサジエン酸に転換される条件下で生育させ、そして
c)場合によりステップ(b)のエイコサジエン酸を回収する
ことを含んでなるエイコサジエン酸の製造方法。
【請求項13】
a)i)(1)Δ9エロンガーゼ活性を有し、クラスタルV法のアラインメントに基づいて配列番号2または配列番号5で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
(2)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、0.1×SSC、0.1%SDSで65℃、そして2×SSC、0.1%SDSで洗浄後、0.1×SSC、0.1%SDSというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1、配列番号3、配列番号4または配列番号6で記載されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列
よりなる群から選択される、Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、および
(ii)α−リノレン酸源
を含んでなる単離された形質転換酵母宿主細胞を提供し、
b)ステップ(a)の宿主細胞をΔ9エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸配列が発現されてα−リノレン酸がエイコサトリエン酸に転換される条件下で生育させ、そして
c)場合によりステップ(b)のエイコサトリエン酸を回収する
ことを含んでなるエイコサトリエン酸の製造方法。
【請求項14】
Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列が、配列番号2または配列番号5で記載されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする請求項12または13に記載の方法。
【請求項15】
Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列が、
a)少なくとも113コドンがヤロウィア(Yarrowia)中での発現のためにコドン最適化される配列番号5、および
b)少なくとも106コドンがヤロウィア(Yarrowia)中での発現のためにコドン最適化される配列番号2
よりなる群から選択される請求項14に記載の方法。
【請求項16】
請求項6に記載の宿主細胞によって産生される微生物油。
【請求項17】
請求項16に記載の微生物油の有効量を含んでなる食品。
【請求項18】
類似食品、肉製品、穀物製品、ベーカリー食品、スナック食品、および乳製品よりなる群から選択される請求項17に記載の食品。
【請求項19】
請求項16に記載の微生物油の有効量を含んでなる、メディカルフード、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品。
【請求項20】
請求項に16に記載の微生物油の有効量を含んでなる動物飼料。
【請求項21】
ペットフード、反芻動物飼料、家禽飼料、および水産養殖飼料よりなる群から選択される請求項20に記載の動物飼料。
【請求項1】
(a)Δ9エロンガーゼ活性を有し、クラスタルV法のアラインメントに基づいて配列番号2または配列番号5で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
(b)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、BLASTN法のアラインメントに基づいて配列番号1、配列番号3、配列番号4または配列番号6で記載されるヌクレオチド配列と比べると少なくとも70%の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
(c)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、0.1×SSC、0.1%SDSで65℃、そして2×SSC、0.1%SDSで洗浄後、0.1×SSC、0.1%SDSというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1、配列番号3、配列番号4または配列番号6で記載されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
または
(d)(a)、(b)または(c)のヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドからなりそれと100%相補的である、前記ヌクレオチド配列の相補体
よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項2】
ヌクレオチド配列が、配列番号1、配列番号3、配列番号4または配列番号6を含んでなる請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
配列番号1、配列番号3、配列番号4または配列番号6よりなる群から選択される請求項2に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、
(a)配列番号2または配列番号5で記載されるアミノ酸配列、および
(b)少なくとも1つの保存的アミノ酸置換によって(a)のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列
よりなる群から選択されるΔ9エロンガーゼポリペプチド。
【請求項5】
請求項1に記載の単離された核酸配列を含んでなる単離された形質転換宿主細胞。
【請求項6】
宿主細胞が、藻類、細菌、酵母、卵菌類、および菌・カビよりなる群から選択される請求項5に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項7】
宿主細胞が、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)種、シゾキトリウム(Schizochytrium)種、およびモルティエラ(Mortierella)種よりなる群から選択される菌・カビである請求項6に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項8】
酵母が油性酵母である請求項6に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項9】
油性酵母が、ヤロウィア(Yarrowia)、カンジダ(Candida)、ロドトルラ(Rhodotorula)、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、トリコスポロン(Trichosporon)、およびリポミセス(Lipomyces)よりなる群から選択される請求項8に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項10】
酵母がヤロウィア(Yarrowia)種である請求項9に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項11】
ヤロウィア(Yarrowia)種が、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#8862、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#18944、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#76982、およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)LGAMS(7)1よりなる群から選択される請求項10に記載の形質転換された酵母。
【請求項12】
a)i)(1)Δ9エロンガーゼ活性を有し、クラスタルV法のアラインメントに基づいて配列番号2または配列番号5で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
(2)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、0.1×SSC、0.1%SDSで65℃、そして2×SSC、0.1%SDSで洗浄後、0.1×SSC、0.1%SDSというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1、配列番号3、配列番号4または配列番号6で記載されるヌクレオチドとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列
よりなる群から選択される、Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、および
(ii)リノール酸源
を含んでなる単離された形質転換酵母宿主細胞を提供し、
b)ステップ(a)の酵母宿主細胞をΔ9エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸配列が発現されてリノール酸がエイコサジエン酸に転換される条件下で生育させ、そして
c)場合によりステップ(b)のエイコサジエン酸を回収する
ことを含んでなるエイコサジエン酸の製造方法。
【請求項13】
a)i)(1)Δ9エロンガーゼ活性を有し、クラスタルV法のアラインメントに基づいて配列番号2または配列番号5で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
(2)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、0.1×SSC、0.1%SDSで65℃、そして2×SSC、0.1%SDSで洗浄後、0.1×SSC、0.1%SDSというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1、配列番号3、配列番号4または配列番号6で記載されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列
よりなる群から選択される、Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、および
(ii)α−リノレン酸源
を含んでなる単離された形質転換酵母宿主細胞を提供し、
b)ステップ(a)の宿主細胞をΔ9エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸配列が発現されてα−リノレン酸がエイコサトリエン酸に転換される条件下で生育させ、そして
c)場合によりステップ(b)のエイコサトリエン酸を回収する
ことを含んでなるエイコサトリエン酸の製造方法。
【請求項14】
Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列が、配列番号2または配列番号5で記載されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする請求項12または13に記載の方法。
【請求項15】
Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列が、
a)少なくとも113コドンがヤロウィア(Yarrowia)中での発現のためにコドン最適化される配列番号5、および
b)少なくとも106コドンがヤロウィア(Yarrowia)中での発現のためにコドン最適化される配列番号2
よりなる群から選択される請求項14に記載の方法。
【請求項16】
請求項6に記載の宿主細胞によって産生される微生物油。
【請求項17】
請求項16に記載の微生物油の有効量を含んでなる食品。
【請求項18】
類似食品、肉製品、穀物製品、ベーカリー食品、スナック食品、および乳製品よりなる群から選択される請求項17に記載の食品。
【請求項19】
請求項16に記載の微生物油の有効量を含んでなる、メディカルフード、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品。
【請求項20】
請求項に16に記載の微生物油の有効量を含んでなる動物飼料。
【請求項21】
ペットフード、反芻動物飼料、家禽飼料、および水産養殖飼料よりなる群から選択される請求項20に記載の動物飼料。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図7】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図7】
【公表番号】特表2009−517019(P2009−517019A)
【公表日】平成21年4月30日(2009.4.30)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2008−542346(P2008−542346)
【出願日】平成18年11月16日(2006.11.16)
【国際出願番号】PCT/US2006/044480
【国際公開番号】WO2007/061742
【国際公開日】平成19年5月31日(2007.5.31)
【出願人】(390023674)イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
【Fターム(参考)】
【公表日】平成21年4月30日(2009.4.30)
【国際特許分類】
【出願日】平成18年11月16日(2006.11.16)
【国際出願番号】PCT/US2006/044480
【国際公開番号】WO2007/061742
【国際公開日】平成19年5月31日(2007.5.31)
【出願人】(390023674)イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
【Fターム(参考)】
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