α−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方法
【課題】食品への添加や保存においてアミノ酸やタンパク質が損なわれることがなく、食品素材や医薬素材として期待できるα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の簡便な製造方法を提供すること。
【解決手段】ガラクトースとグルコースを含む物質にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）に由来するα−ガラクトシダーゼを作用させ、脱水縮合反応によりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を生成させ、混在するＧａｌα１−１βＧａｌをβ−ガラクトシダーゼにより加水分解し、さらに前記オリゴ糖中の還元糖の分解後、分離操作することを特徴とする下記式（１）で表されるα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方法。
【化１】
【解決手段】ガラクトースとグルコースを含む物質にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）に由来するα−ガラクトシダーゼを作用させ、脱水縮合反応によりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を生成させ、混在するＧａｌα１−１βＧａｌをβ−ガラクトシダーゼにより加水分解し、さらに前記オリゴ糖中の還元糖の分解後、分離操作することを特徴とする下記式（１）で表されるα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方法。
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方法に関し、詳細には、非還元性二糖のＧａｌα１−１βＧｌｃの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、非還元性二糖の一種であるトレハロース（Ｇｌｃα１−１αＧｌｃ）は非還元性で耐熱・耐酸性に優れ、アミノ化合物と還元糖との反応に起因するメイラード反応によりアミノ酸やタンパク質が損なわれることがないなど、食品の加工や保存において他の素材への悪影響が少ないことが知られている。また、デンプンの老化、タンパク質の変性、脂質の酸化を抑制する作用も強い等、食品素材として優れた性質を有している。一方、α−ガラクトシル基を非還元末端に有する糖質は、天然には三糖のラフィノースやメリビオースが知られ、強いビフィズス菌選択増殖活性や抗う蝕性の他に、免疫細胞活性化作用、制がん効果、アトピー性皮膚炎の改善効果などの様々な生理機能が報告されている。従って、α−ガラクトシル基を含む非還元性二糖を合成できれば、叙述のトレハロースの有する諸性質あるいはラフィノースやメリビオースなどの有する諸機能を備え、ひいては優れた食品素材や医薬品素材の提供が期待できる。また、α−ガラクトシル基を含む非還元性二糖は、従来、Ｇａｌα１−１αＧｌｃがあるのみである（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平１０−３０４８８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、有用な食品素材や医薬品素材として期待されるα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の簡便な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討し、本発明に想到した。
すなわち、本発明は、ガラクトースとグルコースを含む物質にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）に由来するα−ガラクトシダーゼを作用させ、脱水縮合反応によりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を生成させ、混在するＧａｌα１−１βＧａｌをβ−ガラクトシダーゼにより加水分解し、さらに前記オリゴ糖中の還元糖の分解後、分離操作することを特徴とする下記式（１）で表されるα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方法に関する。
【０００５】
【化１】
【発明の効果】
【０００６】
本発明の式（１）で表される非還元性二糖の製造方法は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）に由来するα−ガラクトシダーゼを用いることにより、アミノ化合物と還元糖との反応に起因するメイラード反応によりアミノ酸やタンパク質が損なわれることがなく、食品の加工や保存において他の素材への悪影響が少ない食品素材として期待され、また、医薬素材として期待される非還元性二糖を高収量で製造でき、しかもこの酵素は有機発酵や種々の食品用酵素剤の給源として利用されており安全性にも優れる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
式（１）で表される非還元性二糖の製造は、まずガラクトースとグルコースを含む物質にα−ガラクトシダーゼを作用させ、脱水縮合反応によりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を製造する。
【０００８】
α−ガラクトシダーゼを生産する微生物としては、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などのカビ類、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属などの酵母類、あるいはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌類等が挙げられるが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来のα−ガラクトシダーゼが好ましい。
【０００９】
上記微生物の内、アスペルギルス属カビ類としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・プルベルレンタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｕｌｖｅｒｕｌｅｎｔｕｓ）、ペニシリウム属カビ類としては、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、ペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ属カビ類としては、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）が好ましく、これらの中でもアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）がより好ましい。
【００１０】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中でも、本出願人らにより寄託されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）が特に好ましい。この菌株が生産するα−ガラクトシダーゼは、脱水縮合反応の活性が極めて高く、従来α−ガラクトシダーゼの中でも脱水縮合反応の触媒活性が最も高いことで知られるカンジダ・ギリエルモンディー（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｈ−４０４株（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１１０６２）の生産するα−ガラクトシダーゼよりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖が高収量で製造でき（ＰＣＴ／ＪＰ０１／０６８４８参照）、これに対応して式（１）の非還元性二糖を高収量で製造できる。
【００１１】
また、サッカロマイセス属酵母としては、サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、バチルス属細菌としては、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）が好ましい。
【００１２】
上記の各微生物からα−ガラクトシダーゼを生産する方法は、通常、固体培養又は液体培養が用いられる。固体培養の培地としては、小麦ふすま単独あるいは小麦ふすまに種々の添加物、例えば、きな粉、大豆粉、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリペプトン、コーンスティープリカー、肉エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物などの有機及び無機の窒素化合物などを適宜添加して用いることができる。さらに、適当な無機塩類を加えることもできる。また、液体培養の培地としては、当該微生物が良好に成育し、酵素を順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培地又は天然培地が挙げられる。例えば、炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα−澱粉あるいはガラクトースを含む物質等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース、ガラクトース、ラクトース、ラフィノース等が挙げられ、これらを単独で、もしくは２種以上を組み合わせて用いることができる。窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩窒素化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられ、これらを単独で、もしくは２種以上を組み合わせて使用できる。無機塩類としては、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等を単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いられる。
【００１３】
固体培養の場合には、静置培養で行い、培地のｐＨを３〜７、好ましくは４〜７に調整したものに本菌を接種し、１０〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃で１〜１０日間培養を行う。培養後、その培養抽出物からα−ガラクトシダーゼをエタノール沈降などの手段により、粗酵素沈殿物として得ることができる。また、液体培養の場合、培養は振盪培養もしくは通気撹拌培養等の好気的条件下に行い、培地をｐＨ４〜１０の範囲、好ましくはｐＨ５〜８の範囲に調整し、温度１０〜４０℃の範囲、好ましくは、２５〜３７℃で、２４〜９６時間培養する。培養後、遠心分離、その他の適当な固−液分離手段で菌体を除去し、培養上清液を得ることができる。また、菌体を物理的あるいは酵素的に処理し、菌体内抽出液を得ることができる。
【００１４】
次いで、これらの粗酵素液から硫安塩析処理法、ゲル濾過処理、疎水クロマトグラフィー処理などを適宜組み合わせることにより、高純度のα−ガラクトシダーゼが得られる。
【００１５】
α−ガラクトシル基を含むオリゴ糖の製造に用いる酵素としては、上記のようにして得た酵素標品の他に、固体培養の場合は、その抽出液を、液体培養の場合は、培養上清液又は菌体内抽出液を、そのまま酵素剤として用いることができる。また、必要に応じて、既知の方法で精製した酵素も使用できる。また、菌体をそのまま酵素剤として利用することも可能である。あるいは市販酵素剤、例えばセルラーゼ剤やプロテアーゼ剤等に混在したα−ガラクトシダーゼも使用でき、その場合、酵素剤をそのまま使用するか、あるいは酵素剤の中からα−ガラクトシダーゼを種々の既知方法で精製して使用することもできる。
また、これら酵素あるいは酵素を生産する菌体は、固定化して連続式で、あるいはバッチ式で繰り返し反応に利用することも可能である。
【００１６】
式（１）の非還元性二糖を製造するためにα−ガラクトシダーゼの反応に供する原料は、ガラクトースとグルコースを含む物質が挙げられ、具体的にはガラクトースとグルコースの混合物を適当な比率に混合したものや乳糖などのガラクトースとグルコースを含む化合物を挙げられ、安価な乳糖をβ−ガラクトシダーゼあるいは酸によって加水分解した乳糖加水分解物をそのまま利用することが好ましい。ガラクトースとグルコースの比率は特に制限されない。
【００１７】
ガラクトースとの結合の相手となるグルコースは、市販のグルコースはもちろん、澱粉、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、コージオリゴ糖、シクロデキストリン、トレハロース、マルチトール、セルロース、セロオリゴ糖、ソホロオリゴ糖、ラミナリオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖などのα−グルコシル基あるいはβ−グルコシル基を含む天然あるいは合成オリゴ糖、配糖体あるいは多糖を酵素（アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼなど）あるいは酸を使用して加水分解したものから調製したグルコースを使用できる。
【００１８】
本発明の式（１）で表される非還元性二糖のＧａｌα１−１βＧｌｃは、混在するＧａｌα１−１βＧａｌを加水分解し、さらに上記で得られたα−（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃのオリゴ糖中の還元糖の分解及び分離操作を行うことにより製造できる。Ｇａｌα１−１βＧａｌの加水分解は、酵素を用いて行うことができ、酵素はβ−ガラクトシダーゼが好ましい。β−ガラクトシダーゼの添加量は、酵素の起源、活性などそれぞれの酵素に応じた条件を考慮して適宜決定する。また、オリゴ糖中の還元糖の分解は、アルカリ分解により行うことができ、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリをオリゴ糖に添加して行うことができ、この分解操作により、Ｇａｌα１−１βＧｌｃ以外のオリゴ糖が分解される。アルカリの添加量は、終濃度０．１〜６．０Ｎが好ましい。分離操作は、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーなど既知の分離手段を用いて行うことができるが、活性炭クロマトグラフィーが好ましい。
【００１９】
なお、上記（１）の非還元性二糖の製造において、酵素反応が進むにつれ、脱水縮合反応によって合成されたα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖が再度α−ガラクトシダーゼによって分解され、糖転移反応も並行して起こるため、糖転移反応もα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖の合成に寄与している。また、生成した化合物のガラクトースの結合位置、結合数、あるいはこれらの化合物の比率は原料のガラクトースとグルコースの組成、用いた酵素の由来や反応条件により影響を受ける。α−ガラクトシダーゼの反応条件は、用いる酵素により異なるが、反応ｐＨは３．０〜１０．０、好ましくは４．０〜９．０の範囲である。反応温度は、溶解度や反応速度の点から高い方が望ましく、通常２０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃の範囲である。反応時間は、酵素の使用量によって異なるが、通常１〜１５０時間である。しかしながら、以上の条件、あるいは反応形態のみに限定されるものではない。さらに、α−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を製造するには、原料のガラクトースの濃度は高い程良く、ガラクトースやグルコースは反応系に析出しても、また、ガラクトースやグルコースが過飽和状態でも良く、通常５〜１１０％（ｗ／ｖ）の濃度で用い、好ましくは５０〜１１０％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【実施例】
【００２０】
次いで、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２１】
参考例１（パラニトロフェニルα−ガラクトシドを基質とするα−ガラクトシダーゼの活性測定法）
１０ｍＭパラニトロフェニルα−ガラクトシド０．２ｍｌと４０ｍＭの緩衝液（ｐＨは酵素の至適ｐＨに準じる）０．２ｍｌにα−ガラクトシダーゼ溶液０．０５ｍｌを添加して、４０℃にて１０分間反応させた。反応後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム０．５ｍｌを加えて反応を停止し、遊離したパラニトロフェノール量を分光光度計にて４００ｎｍの吸光度を計ることにより測定した。酵素活性１単位（Ｕ）は、この条件で１分間に１マイクロモルのパラニトロフェノールを遊離する酵素量とした。
【００２２】
参考例２（メリビオースを基質とするα−ガラクトシダーゼの活性測定法）
１０ｍＭメリビオース０．２ｍｌと４０ｍＭの緩衝液（ｐＨは酵素の至適ｐＨに準じる）０．２ｍｌにα−ガラクトシダーゼ溶液０．０５ｍｌを添加して、４０℃にて１０分間反応させた。次いで、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させ、生じたグルコース量をロシュ・ダイアグノスティックス（株）製のＦ−キット（グルコース／フルクトース）あるいは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
酵素活性１単位（ＵＭ）は、この条件下で１分間に１マイクロモルのグルコースを生成する酵素量とした。
【００２３】
製造例（α−ガラクトシダーゼの製造）
５％の小麦ふすまを含む液体培地（ｐＨ６．０）９０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、常法によりオートクレーブで殺菌後、アスペルギルス・ニガーＡＰＣ−９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）を接種して、２５℃で３日間、前培養（種培養）を行った。ふすま５００ｇに水４００ｍｌを添加して殺菌後、前培養液１０ｍｌを接種して良く撹拌した後、２５℃にて４日間、本培養を行った。培養後、ふすま麹を細かく砕き、水を８Ｌ添加して４℃で一夜抽出した後、濾紙にて濾過して抽出濾過液を得た。得られた抽出濾過液のα−ガラクトシダーゼ活性を測定したところ、抽出濾過液１ｍｌ当たり３単位（Ｕ）であった。抽出濾過液６Ｌを限外濾過膜（旭化成（株）製ＳＩＰ）で１Ｌまで濃縮し、７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して塩析を行った。続いて、沈殿を遠心分離にて集め、５００ｍｌの水に溶解し、限外濾過膜で１００ｍｌまで濃縮し、更に５００ｍｌの水を加えて１００ｍｌまで濃縮し、この操作を３回繰り返し、脱塩を行った。脱塩後、凍結乾燥を行い、凍結乾燥粉末（２５０Ｕ／ｇ）を得た。
【００２４】
上記で得られた抽出濾過液に７０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加して撹拌した後、４℃にて一晩放置した。その沈殿を遠心分離にて集め、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した後、限外濾過膜（旭化成（株）製ＳＩＰ）で濃縮し、再度同緩衝液を添加して濃縮した。この操作を３回繰り返し、脱塩を行った。
【００２５】
次に、イオン交換クロマトグラフィーを行うために、同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラムに供した。続いて、疎水クロマトグラフィーを行うために、５０％飽和硫酸アンモニウム中で、ブチル−トヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラムに供した。活性画分を集めて、ゲル濾過クロマトグラフィーを行うために、０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）にて平 衡化したトヨパールＨＷ−５５Ｓ（東ソー（株）製）カラムに供した。これらのカラムクロマトによりタンパク質的に均一なα−ガラクトシダーゼを得た。
【００２６】
上記で得られたα−ガラクトシダーゼは、以下の理化学的性質を有する。
（１）作用
α−ガラクトシド結合を加水分解してＤ−ガラクトースを遊離する反応を触媒する。
Ｇａｌα１−ＯＲ＋Ｈ２Ｏ→Ｇａｌ−ＯＨ＋Ｒ−ＯＨ
（式中、Ｇａｌα１−ＯＲはα−ガラクトシル基を含む糖質を、Ｇａｌ−ＯＨは遊離のガラクトースを、Ｒ−ＯＨは種々の糖、アルコール及びフェノール類などのヒドロキシル基を有する化合物を示す。）
（２）基質特異性
非還元末端にα−ガラクトシル基を有するメリビオース、ラフィノース、スタキオースなどや、パラニトロフェニルα−ガラクトシドに作用する。パラニトロフェニルα−ガラクトシドを基質とした場合の分解速度を１００とした場合、メリビオースを分解する相対速度は約９である。
（３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性
至適ｐＨは２．５〜６．０である。また、４０℃で１時間放置した場合、ｐＨ３．５〜８．０の範囲で安定である。
（４）至適温度及び温度安定性
ｐＨ４．５（酢酸緩衝液）における至適温度は６０℃である。また、ｐＨ４．５（酢酸緩衝液）で１５分間放置した場合、６０℃まで安定である。
（５）分子量及び等電点
ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−２００カラム（（株）ワイエムシィ製）を用いたゲル濾過法で測定した分子量は２１７，０００で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量は１１７，０００である（図１及び図２）。また、等電点電気泳動法により測定した等電点は４．２である。
本酵素は、これまでに報告されているアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の生産するα−ガラクトシダーゼの７２，０００及び６９，０００（いずれもＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に比べ、分子量が大きいことに特徴を有する。
【００２７】
実施例１（式（１）のＧａｌα１−１βＧｌｃの製造）
乳糖（和光純薬（株）製）１００ｇを市販のβ−ガラクトシダーゼ（ノボザイム（株）製ラクトザイム）によって加水分解し、ガラクトースとグルコースの等量混合物を得た。
このガラクトースとグルコースの等量混合物８５ｇと上記の製造例で得られたα−ガラクトシダーゼ１，５００ＵＭを含むｐＨ４．５の酢酸緩衝液１００ｍｌ（糖度８５％（ｗ／ｖ）、酵素濃度３５ＵＭ／ｇ−ガラクトース）を調製し、５０℃にて８７時間反応させた。反応液から活性炭カラムクロマトグラフィーによりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖２７ｇを得た（カンジダ・ギリエルモンディー（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｈ−４０４由来のα−ガラクトシダーゼの場合は１６ｇ）。このα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖は、酸やα−ガラクトシダーゼにより加水分解すると、ガラクトースとグルコースのみ生成した。
【００２８】
次いで、上記で得られたオリゴ糖はＧａｌα１−１βＧａｌが混在していることから、精製を容易にするため本オリゴ２０ｇを１００ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、４５，０００ＬＡＵ（ノボザイム（株）ラクターゼ単位）となるようにβ−ガラクトシダーゼ（ノボザイム（株）製ラクトザイム）を添加し、さらに液量が１８０ｍｌとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を添加した。この溶液を４０℃で２４時間処理し、Ｇａｌα１−１βＧａｌをＤ−ガラクトースに加水分解した。さらに、β−ガラクトシダーゼ処理液に２．０Ｎ水酸化ナトリウムを２０ｍｌ添加し、１００℃で３０分し還元糖のみを分解させた。塩酸で中和後、その処理液を活性炭カラムに供し、ピークａを検出・分取した。得られたピークａ画分を１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲで構造解析を行ったところ、ピークａは非還元性二糖のＧａｌα１−１βＧｌｃであることが確認された。帰属データを表２に示した。なお、数値はＴＰＳを内部標準とした時の化学シフト値（δ）を、括弧内の数値は結合定数を記した。
【００２９】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】製造例で得られたα−ガラクトシダーゼの分子量をＨＰＬＣで測定した際の検量線を示す図である。
【図２】製造例で得られたα−ガラクトシダーゼの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方法に関し、詳細には、非還元性二糖のＧａｌα１−１βＧｌｃの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、非還元性二糖の一種であるトレハロース（Ｇｌｃα１−１αＧｌｃ）は非還元性で耐熱・耐酸性に優れ、アミノ化合物と還元糖との反応に起因するメイラード反応によりアミノ酸やタンパク質が損なわれることがないなど、食品の加工や保存において他の素材への悪影響が少ないことが知られている。また、デンプンの老化、タンパク質の変性、脂質の酸化を抑制する作用も強い等、食品素材として優れた性質を有している。一方、α−ガラクトシル基を非還元末端に有する糖質は、天然には三糖のラフィノースやメリビオースが知られ、強いビフィズス菌選択増殖活性や抗う蝕性の他に、免疫細胞活性化作用、制がん効果、アトピー性皮膚炎の改善効果などの様々な生理機能が報告されている。従って、α−ガラクトシル基を含む非還元性二糖を合成できれば、叙述のトレハロースの有する諸性質あるいはラフィノースやメリビオースなどの有する諸機能を備え、ひいては優れた食品素材や医薬品素材の提供が期待できる。また、α−ガラクトシル基を含む非還元性二糖は、従来、Ｇａｌα１−１αＧｌｃがあるのみである（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平１０−３０４８８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、有用な食品素材や医薬品素材として期待されるα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の簡便な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討し、本発明に想到した。
すなわち、本発明は、ガラクトースとグルコースを含む物質にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）に由来するα−ガラクトシダーゼを作用させ、脱水縮合反応によりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を生成させ、混在するＧａｌα１−１βＧａｌをβ−ガラクトシダーゼにより加水分解し、さらに前記オリゴ糖中の還元糖の分解後、分離操作することを特徴とする下記式（１）で表されるα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方法に関する。
【０００５】
【化１】
【発明の効果】
【０００６】
本発明の式（１）で表される非還元性二糖の製造方法は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）に由来するα−ガラクトシダーゼを用いることにより、アミノ化合物と還元糖との反応に起因するメイラード反応によりアミノ酸やタンパク質が損なわれることがなく、食品の加工や保存において他の素材への悪影響が少ない食品素材として期待され、また、医薬素材として期待される非還元性二糖を高収量で製造でき、しかもこの酵素は有機発酵や種々の食品用酵素剤の給源として利用されており安全性にも優れる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
式（１）で表される非還元性二糖の製造は、まずガラクトースとグルコースを含む物質にα−ガラクトシダーゼを作用させ、脱水縮合反応によりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を製造する。
【０００８】
α−ガラクトシダーゼを生産する微生物としては、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などのカビ類、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属などの酵母類、あるいはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌類等が挙げられるが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来のα−ガラクトシダーゼが好ましい。
【０００９】
上記微生物の内、アスペルギルス属カビ類としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・プルベルレンタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｕｌｖｅｒｕｌｅｎｔｕｓ）、ペニシリウム属カビ類としては、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、ペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ属カビ類としては、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）が好ましく、これらの中でもアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）がより好ましい。
【００１０】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中でも、本出願人らにより寄託されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）が特に好ましい。この菌株が生産するα−ガラクトシダーゼは、脱水縮合反応の活性が極めて高く、従来α−ガラクトシダーゼの中でも脱水縮合反応の触媒活性が最も高いことで知られるカンジダ・ギリエルモンディー（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｈ−４０４株（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１１０６２）の生産するα−ガラクトシダーゼよりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖が高収量で製造でき（ＰＣＴ／ＪＰ０１／０６８４８参照）、これに対応して式（１）の非還元性二糖を高収量で製造できる。
【００１１】
また、サッカロマイセス属酵母としては、サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、バチルス属細菌としては、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）が好ましい。
【００１２】
上記の各微生物からα−ガラクトシダーゼを生産する方法は、通常、固体培養又は液体培養が用いられる。固体培養の培地としては、小麦ふすま単独あるいは小麦ふすまに種々の添加物、例えば、きな粉、大豆粉、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリペプトン、コーンスティープリカー、肉エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物などの有機及び無機の窒素化合物などを適宜添加して用いることができる。さらに、適当な無機塩類を加えることもできる。また、液体培養の培地としては、当該微生物が良好に成育し、酵素を順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培地又は天然培地が挙げられる。例えば、炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα−澱粉あるいはガラクトースを含む物質等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース、ガラクトース、ラクトース、ラフィノース等が挙げられ、これらを単独で、もしくは２種以上を組み合わせて用いることができる。窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩窒素化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられ、これらを単独で、もしくは２種以上を組み合わせて使用できる。無機塩類としては、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等を単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いられる。
【００１３】
固体培養の場合には、静置培養で行い、培地のｐＨを３〜７、好ましくは４〜７に調整したものに本菌を接種し、１０〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃で１〜１０日間培養を行う。培養後、その培養抽出物からα−ガラクトシダーゼをエタノール沈降などの手段により、粗酵素沈殿物として得ることができる。また、液体培養の場合、培養は振盪培養もしくは通気撹拌培養等の好気的条件下に行い、培地をｐＨ４〜１０の範囲、好ましくはｐＨ５〜８の範囲に調整し、温度１０〜４０℃の範囲、好ましくは、２５〜３７℃で、２４〜９６時間培養する。培養後、遠心分離、その他の適当な固−液分離手段で菌体を除去し、培養上清液を得ることができる。また、菌体を物理的あるいは酵素的に処理し、菌体内抽出液を得ることができる。
【００１４】
次いで、これらの粗酵素液から硫安塩析処理法、ゲル濾過処理、疎水クロマトグラフィー処理などを適宜組み合わせることにより、高純度のα−ガラクトシダーゼが得られる。
【００１５】
α−ガラクトシル基を含むオリゴ糖の製造に用いる酵素としては、上記のようにして得た酵素標品の他に、固体培養の場合は、その抽出液を、液体培養の場合は、培養上清液又は菌体内抽出液を、そのまま酵素剤として用いることができる。また、必要に応じて、既知の方法で精製した酵素も使用できる。また、菌体をそのまま酵素剤として利用することも可能である。あるいは市販酵素剤、例えばセルラーゼ剤やプロテアーゼ剤等に混在したα−ガラクトシダーゼも使用でき、その場合、酵素剤をそのまま使用するか、あるいは酵素剤の中からα−ガラクトシダーゼを種々の既知方法で精製して使用することもできる。
また、これら酵素あるいは酵素を生産する菌体は、固定化して連続式で、あるいはバッチ式で繰り返し反応に利用することも可能である。
【００１６】
式（１）の非還元性二糖を製造するためにα−ガラクトシダーゼの反応に供する原料は、ガラクトースとグルコースを含む物質が挙げられ、具体的にはガラクトースとグルコースの混合物を適当な比率に混合したものや乳糖などのガラクトースとグルコースを含む化合物を挙げられ、安価な乳糖をβ−ガラクトシダーゼあるいは酸によって加水分解した乳糖加水分解物をそのまま利用することが好ましい。ガラクトースとグルコースの比率は特に制限されない。
【００１７】
ガラクトースとの結合の相手となるグルコースは、市販のグルコースはもちろん、澱粉、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、コージオリゴ糖、シクロデキストリン、トレハロース、マルチトール、セルロース、セロオリゴ糖、ソホロオリゴ糖、ラミナリオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖などのα−グルコシル基あるいはβ−グルコシル基を含む天然あるいは合成オリゴ糖、配糖体あるいは多糖を酵素（アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼなど）あるいは酸を使用して加水分解したものから調製したグルコースを使用できる。
【００１８】
本発明の式（１）で表される非還元性二糖のＧａｌα１−１βＧｌｃは、混在するＧａｌα１−１βＧａｌを加水分解し、さらに上記で得られたα−（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃのオリゴ糖中の還元糖の分解及び分離操作を行うことにより製造できる。Ｇａｌα１−１βＧａｌの加水分解は、酵素を用いて行うことができ、酵素はβ−ガラクトシダーゼが好ましい。β−ガラクトシダーゼの添加量は、酵素の起源、活性などそれぞれの酵素に応じた条件を考慮して適宜決定する。また、オリゴ糖中の還元糖の分解は、アルカリ分解により行うことができ、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリをオリゴ糖に添加して行うことができ、この分解操作により、Ｇａｌα１−１βＧｌｃ以外のオリゴ糖が分解される。アルカリの添加量は、終濃度０．１〜６．０Ｎが好ましい。分離操作は、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーなど既知の分離手段を用いて行うことができるが、活性炭クロマトグラフィーが好ましい。
【００１９】
なお、上記（１）の非還元性二糖の製造において、酵素反応が進むにつれ、脱水縮合反応によって合成されたα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖が再度α−ガラクトシダーゼによって分解され、糖転移反応も並行して起こるため、糖転移反応もα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖の合成に寄与している。また、生成した化合物のガラクトースの結合位置、結合数、あるいはこれらの化合物の比率は原料のガラクトースとグルコースの組成、用いた酵素の由来や反応条件により影響を受ける。α−ガラクトシダーゼの反応条件は、用いる酵素により異なるが、反応ｐＨは３．０〜１０．０、好ましくは４．０〜９．０の範囲である。反応温度は、溶解度や反応速度の点から高い方が望ましく、通常２０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃の範囲である。反応時間は、酵素の使用量によって異なるが、通常１〜１５０時間である。しかしながら、以上の条件、あるいは反応形態のみに限定されるものではない。さらに、α−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を製造するには、原料のガラクトースの濃度は高い程良く、ガラクトースやグルコースは反応系に析出しても、また、ガラクトースやグルコースが過飽和状態でも良く、通常５〜１１０％（ｗ／ｖ）の濃度で用い、好ましくは５０〜１１０％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【実施例】
【００２０】
次いで、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２１】
参考例１（パラニトロフェニルα−ガラクトシドを基質とするα−ガラクトシダーゼの活性測定法）
１０ｍＭパラニトロフェニルα−ガラクトシド０．２ｍｌと４０ｍＭの緩衝液（ｐＨは酵素の至適ｐＨに準じる）０．２ｍｌにα−ガラクトシダーゼ溶液０．０５ｍｌを添加して、４０℃にて１０分間反応させた。反応後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム０．５ｍｌを加えて反応を停止し、遊離したパラニトロフェノール量を分光光度計にて４００ｎｍの吸光度を計ることにより測定した。酵素活性１単位（Ｕ）は、この条件で１分間に１マイクロモルのパラニトロフェノールを遊離する酵素量とした。
【００２２】
参考例２（メリビオースを基質とするα−ガラクトシダーゼの活性測定法）
１０ｍＭメリビオース０．２ｍｌと４０ｍＭの緩衝液（ｐＨは酵素の至適ｐＨに準じる）０．２ｍｌにα−ガラクトシダーゼ溶液０．０５ｍｌを添加して、４０℃にて１０分間反応させた。次いで、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させ、生じたグルコース量をロシュ・ダイアグノスティックス（株）製のＦ−キット（グルコース／フルクトース）あるいは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
酵素活性１単位（ＵＭ）は、この条件下で１分間に１マイクロモルのグルコースを生成する酵素量とした。
【００２３】
製造例（α−ガラクトシダーゼの製造）
５％の小麦ふすまを含む液体培地（ｐＨ６．０）９０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、常法によりオートクレーブで殺菌後、アスペルギルス・ニガーＡＰＣ−９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）を接種して、２５℃で３日間、前培養（種培養）を行った。ふすま５００ｇに水４００ｍｌを添加して殺菌後、前培養液１０ｍｌを接種して良く撹拌した後、２５℃にて４日間、本培養を行った。培養後、ふすま麹を細かく砕き、水を８Ｌ添加して４℃で一夜抽出した後、濾紙にて濾過して抽出濾過液を得た。得られた抽出濾過液のα−ガラクトシダーゼ活性を測定したところ、抽出濾過液１ｍｌ当たり３単位（Ｕ）であった。抽出濾過液６Ｌを限外濾過膜（旭化成（株）製ＳＩＰ）で１Ｌまで濃縮し、７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して塩析を行った。続いて、沈殿を遠心分離にて集め、５００ｍｌの水に溶解し、限外濾過膜で１００ｍｌまで濃縮し、更に５００ｍｌの水を加えて１００ｍｌまで濃縮し、この操作を３回繰り返し、脱塩を行った。脱塩後、凍結乾燥を行い、凍結乾燥粉末（２５０Ｕ／ｇ）を得た。
【００２４】
上記で得られた抽出濾過液に７０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加して撹拌した後、４℃にて一晩放置した。その沈殿を遠心分離にて集め、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した後、限外濾過膜（旭化成（株）製ＳＩＰ）で濃縮し、再度同緩衝液を添加して濃縮した。この操作を３回繰り返し、脱塩を行った。
【００２５】
次に、イオン交換クロマトグラフィーを行うために、同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラムに供した。続いて、疎水クロマトグラフィーを行うために、５０％飽和硫酸アンモニウム中で、ブチル−トヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラムに供した。活性画分を集めて、ゲル濾過クロマトグラフィーを行うために、０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）にて平 衡化したトヨパールＨＷ−５５Ｓ（東ソー（株）製）カラムに供した。これらのカラムクロマトによりタンパク質的に均一なα−ガラクトシダーゼを得た。
【００２６】
上記で得られたα−ガラクトシダーゼは、以下の理化学的性質を有する。
（１）作用
α−ガラクトシド結合を加水分解してＤ−ガラクトースを遊離する反応を触媒する。
Ｇａｌα１−ＯＲ＋Ｈ２Ｏ→Ｇａｌ−ＯＨ＋Ｒ−ＯＨ
（式中、Ｇａｌα１−ＯＲはα−ガラクトシル基を含む糖質を、Ｇａｌ−ＯＨは遊離のガラクトースを、Ｒ−ＯＨは種々の糖、アルコール及びフェノール類などのヒドロキシル基を有する化合物を示す。）
（２）基質特異性
非還元末端にα−ガラクトシル基を有するメリビオース、ラフィノース、スタキオースなどや、パラニトロフェニルα−ガラクトシドに作用する。パラニトロフェニルα−ガラクトシドを基質とした場合の分解速度を１００とした場合、メリビオースを分解する相対速度は約９である。
（３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性
至適ｐＨは２．５〜６．０である。また、４０℃で１時間放置した場合、ｐＨ３．５〜８．０の範囲で安定である。
（４）至適温度及び温度安定性
ｐＨ４．５（酢酸緩衝液）における至適温度は６０℃である。また、ｐＨ４．５（酢酸緩衝液）で１５分間放置した場合、６０℃まで安定である。
（５）分子量及び等電点
ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−２００カラム（（株）ワイエムシィ製）を用いたゲル濾過法で測定した分子量は２１７，０００で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量は１１７，０００である（図１及び図２）。また、等電点電気泳動法により測定した等電点は４．２である。
本酵素は、これまでに報告されているアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の生産するα−ガラクトシダーゼの７２，０００及び６９，０００（いずれもＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に比べ、分子量が大きいことに特徴を有する。
【００２７】
実施例１（式（１）のＧａｌα１−１βＧｌｃの製造）
乳糖（和光純薬（株）製）１００ｇを市販のβ−ガラクトシダーゼ（ノボザイム（株）製ラクトザイム）によって加水分解し、ガラクトースとグルコースの等量混合物を得た。
このガラクトースとグルコースの等量混合物８５ｇと上記の製造例で得られたα−ガラクトシダーゼ１，５００ＵＭを含むｐＨ４．５の酢酸緩衝液１００ｍｌ（糖度８５％（ｗ／ｖ）、酵素濃度３５ＵＭ／ｇ−ガラクトース）を調製し、５０℃にて８７時間反応させた。反応液から活性炭カラムクロマトグラフィーによりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖２７ｇを得た（カンジダ・ギリエルモンディー（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｈ−４０４由来のα−ガラクトシダーゼの場合は１６ｇ）。このα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖は、酸やα−ガラクトシダーゼにより加水分解すると、ガラクトースとグルコースのみ生成した。
【００２８】
次いで、上記で得られたオリゴ糖はＧａｌα１−１βＧａｌが混在していることから、精製を容易にするため本オリゴ２０ｇを１００ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、４５，０００ＬＡＵ（ノボザイム（株）ラクターゼ単位）となるようにβ−ガラクトシダーゼ（ノボザイム（株）製ラクトザイム）を添加し、さらに液量が１８０ｍｌとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を添加した。この溶液を４０℃で２４時間処理し、Ｇａｌα１−１βＧａｌをＤ−ガラクトースに加水分解した。さらに、β−ガラクトシダーゼ処理液に２．０Ｎ水酸化ナトリウムを２０ｍｌ添加し、１００℃で３０分し還元糖のみを分解させた。塩酸で中和後、その処理液を活性炭カラムに供し、ピークａを検出・分取した。得られたピークａ画分を１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲで構造解析を行ったところ、ピークａは非還元性二糖のＧａｌα１−１βＧｌｃであることが確認された。帰属データを表２に示した。なお、数値はＴＰＳを内部標準とした時の化学シフト値（δ）を、括弧内の数値は結合定数を記した。
【００２９】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】製造例で得られたα−ガラクトシダーゼの分子量をＨＰＬＣで測定した際の検量線を示す図である。
【図２】製造例で得られたα−ガラクトシダーゼの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトースとグルコースを含む物質にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）に由来するα−ガラクトシダーゼを作用させ、脱水縮合反応によりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を生成させ、混在するＧａｌα１−１βＧａｌをβ−ガラクトシダーゼにより加水分解し、さらに前記オリゴ糖中の還元糖の分解後、分離操作することを特徴とする下記式（１）で表されるα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方法。
【化１】
【請求項１】
ガラクトースとグルコースを含む物質にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）に由来するα−ガラクトシダーゼを作用させ、脱水縮合反応によりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を生成させ、混在するＧａｌα１−１βＧａｌをβ−ガラクトシダーゼにより加水分解し、さらに前記オリゴ糖中の還元糖の分解後、分離操作することを特徴とする下記式（１）で表されるα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方法。
【化１】
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−３０７０５４（Ｐ２００８−３０７０５４Ａ）
【公開日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９７１０４（Ｐ２００８−１９７１０４）
【出願日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【分割の表示】特願２００１−３５９７７７（Ｐ２００１−３５９７７７）の分割
【原出願日】平成１３年１１月２６日（２００１．１１．２６）
【出願人】（０００２１６１６２）天野エンザイム株式会社 (26)
【出願人】（３９００２１６３６）塩水港精糖株式会社 (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【分割の表示】特願２００１−３５９７７７（Ｐ２００１−３５９７７７）の分割
【原出願日】平成１３年１１月２６日（２００１．１１．２６）
【出願人】（０００２１６１６２）天野エンザイム株式会社 (26)
【出願人】（３９００２１６３６）塩水港精糖株式会社 (11)
【Ｆターム（参考）】
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