Notice: Undefined variable: fterm_desc_sub in /mnt/www/biblio_conv.php on line 353
α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸の産生方法。
説明

α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸の産生方法。

【課題】本発明は、コンタミネーションの生じにくい環境下にて、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、並びにα−ケトグルタル酸及び/またはグルタミン酸、及びポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)の製造方法を提供することを目的とする。
【解決手段】以下の工程を含む、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸の製造方法:
(1)ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で培養する工程1、
(2)工程1にて得られる培養液からα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を回収する工程2。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸の製造方法に関する。更に、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、及びポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年ピークオイルが叫ばれ、エネルギーのみならずケミカル・リファイナリーのバイオベース化、工業用原料の石油からバイオマスへの転換等が、喫緊の課題となっている。
【0003】
α−ケトグルタル酸は、グルタミン酸、ビタミンC等の原料、医薬品等の原料として使用されている。また、α−ケトグルタル酸そのものの用途として、例えば、肉体疲労改善剤としての用途が知られており、サプリメント等の商品としての用いることが可能である(特許文献1)。
【0004】
また、非特許文献1の「バイオリファイナリーの出発中間体として期待しうる32化合物」には、α−ケトグルタル酸、及びグルタミン酸が、バイオリファイナリーの出発中間体の有望な化合物として挙げられており、将来的には利用が拡大されることが大いに見込まれている。
【0005】
α-ケトグルタル酸の製造方法として、例えば、アラビノースを原料にして生産する手法が特許文献2に記載される方法が知られている。他の製造方法として、大腸菌群細菌等の細菌、キャンディタ属等の酵母等を用い、ブドウ糖、n−パラフィン等を原料にしたα-ケトグルタル酸の製造方法が知られている。
【0006】
グルタミン酸は、コリネバクテリウム属の細菌で生産されることが知られ、世界で200万トン以上生産されている重要なアミノ酸である。また、腸内細菌科に属する微生物においても遺伝子改変すること等で生産が可能であることが知られている(特許文献3)。しかしながら、自然の菌体においてはコリネバクテリウム属以外の菌体がグルタミン酸等を分泌発現することは、ほぼ知られていない。
【0007】
本発明者らは、商業的な屋外培養を行っても、コンタミがほとんどないことが知られている微細藻類スピルリナの効率的な培養方法を検討していたところ、ある条件下では、特定の好塩菌が唯一のコンタミ菌として生育することを認めた。
【0008】
当該好塩菌そのものは、通常はpH5〜12程度の条件下の、高濃度のナトリウムを含む培地中でも良好に生育するため、好気発酵下であっても他のバクテリア等のコンタミが極めて起こりにくいことが推定された。そこで、当該好塩菌の各種の炭素源の資化性を検討していたところ、当該好塩菌の菌体内に著量のポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates:PHAs)が蓄積していることが明らかとなった(特許文献4)。さらに、特許文献4では当該好塩菌のPHAsの産生について特化した調査が記載されている。
【0009】
近年、地球に優しい燃料として利用が進んでいるバイオディーゼルフュエル(BDF)の生産において、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ触媒を用いて、植物、動物油脂から脂肪酸メチルエステル(BDFの主体)を作製する方法が主流である。そのため、この手法による副生物であるアルカリを多く含んだ廃グリセロールの処理が問題となっている。特許文献4には、これらの廃グリセロールからメタノール除去を行えば、当該好塩菌が廃グリセロールを炭素源として、PHAsを生産できることが記載されている。
【0010】
以上のように、当該好塩菌を用いたPHAsの製造について数多くの研究がなされてきたところ、当該好塩菌が乳酸、酢酸等といった特定の物質の産生に関与することも知られている(特許文献5)。しかしながら、上述のようなα−ケトグルタル酸、グルタミン酸等を、好塩菌を用いて産生する方法についての報告は何ら認められない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】特開平10−175855号公報
【特許文献2】特開2009−011161号公報
【特許文献3】特開2009−207483号公報
【特許文献4】国際公開第2009/041531号パンフレット
【特許文献5】特開2010−273582号公報
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】第15回地球環境産業技術動向調査報告会資料−持続可能な発展を求めて−バイオリファイナリー産業の早期構築へ向けて(財)地球環境産業技術研究機構(RITE)微生物研究グループ 湯川英明 平成18年1月31日
【非特許文献2】Monteil−Rivera Fら.2007 Jun 22;1154(1−2):34−41
【非特許文献3】三重保環研年報 第9号(通巻第52号),27−32頁(2007)「三重県における日間生産量100LクラスのBDF製造施設の現状と課題」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明は、コンタミネーションの生じにくい環境下にて、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、及びポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは、特許文献4に記載された好塩菌の培養条件を検討していたところ、過剰の炭素源が存在する培地中にて当該菌体の濃度が上昇した際に、培地のpHの低下が見られることを認めた。そして、この培養液を分析したところ、培地中に著量の乳酸、及び酢酸が蓄積していることを見出した(特許文献5)。
【0015】
さらに、培養を続けると、上記の乳酸、酢酸の蓄積が減少することを認めた。引き続いて、上記好塩菌の代謝物をメタボローム解析に供したところ、著量のα−ケトグルタル酸、並びにグルタミン酸が培養液中に分泌されていることを認め、それと同時に該菌体内において著量のポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)が蓄積されていることを認めた。
【0016】
本願発明者は、特定の属に属する好塩菌を、無機塩と単一又は複数の有機炭素源を基質として含む培地を用いて培養すれば、培養液中にα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を産生されるという知見を得た。そして該菌体内にはPHAsを産生させることができるという知見も得た。
【0017】
また、上記のα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、及びPHAsを製造するための培養は、BDF廃液等を用いた培養、光合成できる微細藻類スピルリナ等との混合培養、及び他のバクテリアのコンタミが起こりにくい環境での培養が可能であることも見出した。
【0018】
さらに、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、及びPHAsの製造は、特定の属に属する好塩菌体の一連の増殖と共に行われるため、一段階の培養での製造が可能であることも明らかにした。
【0019】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、以下に示すα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、及びPHAsの製造方法を提供するものである。
【0020】
項1 以下の工程を含む、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸の製造方法:
(1)ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で培養する工程1、
(2)工程1にて得られる培養液からα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を回収する工程2。
【0021】
項2 以下の工程を含む、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、及びポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)の製造方法:
(1)ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で培養する工程1、
(2)工程1にて得られる培養液からα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を回収し、且つ培養して得られる好塩菌体内からPHAsを回収する工程2。
【0022】
項3 工程2にて得られる培養液1L当り、10g以上のα−ケトグルタル酸が含まれることを特徴とする上記項1又は2に記載の方法。
【0023】
項4 工程2にて得られる培養液1L当り、0.1g以上のグルタミン酸が含まれることを特徴とする上記項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【0024】
項5 工程2にて得られる好塩菌から、該好塩菌の乾燥重量に対して30重量%以上、又は培地1L当り3.5g以上のPHAsが回収される、上記項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
【0025】
項6 PHAsがポリヒドロキシブチレート(polyhydroxybutyrate:PHB)である、上記項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
【0026】
項7 有機炭素源が廃グリセロールである上記項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【0027】
項8 アラビノースを含む有機炭素源である上記項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【0028】
項9 前記好塩菌がハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM−1株(FERM BP−10995)である、上記項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【0029】
本発明の製造方法は、単一、若しくは複数の有機炭素源と、無機窒素、無機リン等の無機塩を加えた培地を用いることにより、一段階の培養で、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸及びポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)を、培地中、又は菌体中を蓄積させることができる。さらにこのような培養は、他のバクテリアのコンタミが起こりにくい環境で行うことができるので有意な製造方法である。
【0030】
本発明の製造方法において用いる好塩菌は、例えば、安価な無機塩に加え、バイオディーゼル生産に副生する廃グリセロール、エタノール発酵等の過程で生産される木材糖化液等を有機炭素源として単独で、又は他の有機炭素源と組み合わせて用いることが可能である。さらに、酵母細胞を用いたエタノール発酵において得られ、利用が難しいとされる五炭糖のキシロース、アラビノース等を有機炭素源として有効に利用することも可能である。
【0031】
これらのことから、例えば現状の遺伝子組換えをしていない酵母細胞を用いた木材糖化液のエタノール発酵後の残渣(主にキシロールやアラビノースを含む)を有機炭素源として利用して、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、及びPHAsの生産を行うことが可能である。
【0032】
そして、本発明の製造方法によって得られるα−ケトグルタル酸、及びグルタミン酸は、化粧品、医薬品、機能性食品等の原料に有用であり、PHAsはプラスチックのバイオベース化において有用である。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】好塩菌ハロモナス・エスピーKM−1株を、グリセロール、廃グリセロールを用い33℃にて培養したときの菌体濁度OD600(縦軸)と培養時間(横軸:h)を調べたグラフである。凡例に示す「%」はすべて、「w/v%」を示す(図2〜7においても同じ)。
【図2】好塩菌ハロモナス・エスピーKM−1株を、グリセロール、廃グリセロールを用い33℃にて培養したときに蓄積された乾燥菌体重量(縦軸:mg/ml)と培養時間(横軸:h)を示したグラフである。
【図3】好塩菌ハロモナス・エスピーKM−1株を、グリセロール、廃グリセロールを用い33℃にて培養したときに蓄積されたPHBの割合(縦軸:PHB/乾燥菌体(%))と培養時間(横軸:h)を示したグラフである。
【図4】好塩菌ハロモナス・エスピーKM−1株を、グリセロール、廃グリセロールを用い33℃にて培養したときに蓄積されたPHBの総量(縦軸:g(PHB)/L(培養液))と培養時間(横軸:h)を示したグラフである。
【図5】好塩菌ハロモナス・エスピーKM−1株を、グリセロール、廃グリセロールを用い33℃にて培養したときに、上清中に蓄積されたα-ケトグルタル酸の上清中の割合(縦軸:α-ケトグルタル酸重量(g)/培養上清(L)を%に換算、即ち、1%とは培養上清1Lあたり、10gのα-ケトグルタル酸が含まれていることに相当する。)と培養時間(横軸:h)を調べたグラフである。
【図6】好塩菌ハロモナス・エスピーKM−1株を、グリセロール、廃グリセロールを用い33℃にて培養したときに、上清中に蓄積されたグルタミン酸の上清中の割合(縦軸:グルタミン酸重量(mg)/培養上清(L)と培養時間(横軸:h)を調べたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本発明の方法は、ハロモナス属に属する好塩菌を用いたα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を製造する方法、又はα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、及びポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)を製造する方法である。
【0035】
(a)好塩菌
本発明の製造方法にて用いる好塩菌は、下記の(1)〜(3)のいずれかによって示される好塩菌である。
(1)無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて増殖し、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を生産して培地中に分泌させることを特徴とするハロモナス属に属する好塩菌。
(2)前記条件の培地で増殖し、PHAsを生産して自らの菌体内にて蓄積させることを特徴とするハロモナス属に属する好塩菌。
(3)前記条件の培地で増殖し、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を生産して培地中に分泌させ、且つPHAsを生産して自らの菌体内にて蓄積させることを特徴とするハロモナス属に属する好塩菌。
【0036】
上記の無機塩、及び有機炭素源については、培地の欄にて後述するものが適用される。
【0037】
ハロモナス属に属する好塩菌は、0.1〜1.0Mの塩濃度を適とする好塩性を有し、時には塩を含まない培地においても生育する細菌である。ハロモナス属に属する好塩菌は、通常はpH5〜12程度の培地にて生育する。
【0038】
このようなハロモナス属に属する好塩菌としては、例えば、ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM−1株が挙げられる。ハロモナス・エスピーKM−1株は、平成19年7月10日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305−8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6)に受託番号FERM P−21316として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はFERM BP−10995である。当該ハロモナス・エスピーKM−1株の16S rRNA遺伝子は、DDBJにAccession Number AB477015として登録されている。
【0039】
本発明の製造方法において用いられる、ハロモナス・エスピーKM−1株以外のハロモナス属に属する好塩菌の具体例として、例えば、16SリボゾームRNA配列による分析から、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア等が挙げられる。
【0040】
さらに、上述した性質と同様の性質を有するハロモナス属に属する好塩菌であれば、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・エスピーKM−1等に限らず、本発明のα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、及びPHAsの製造方法が適用できる。
【0041】
上述したハロモナス属に属する好塩菌には、遺伝子が導入されていてもよい。導入される遺伝子は、本発明の製造方法において、生産効率等を向上させる機能を発現させるものであれば特に限定されない。例えば、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を該好塩菌体外に分泌され易くする機能を発現させる遺伝子、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸の発現量を増大させる遺伝子、PHAsの該菌体内への蓄積を上昇させる機能を発現させる遺伝子等が挙げられる。
【0042】
これらの遺伝子の導入は、導入する遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えDNAを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換することにより行なわれる。例えば宿主菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に該遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びSD(シヤイン・アンド・ダルガーノ)塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン(例えばATG)を付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。かくして得られる所望の組換えDNAの宿主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。
【0043】
(b)培地
本発明の製造方法にて用いる培地は、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源に追加した培地である。培地のpHは特に限定されないが、上述した好塩菌の生育条件を満たすpHであることが好ましく、具体的にはpH5〜12程度にすればよい。より好ましくはpH8.8〜12の培地である。アルカリ性の培地を用いることによって、他の菌のコンタミネーションをより効果的に防止ことができるので好ましい。
【0044】
無機塩は、特に限定されることは無く、例えばリン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、及びナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。例えば、ナトリウムを含む培地成分として、NaCl、NaNO、NaHCO3、Na2CO等が挙げられる。本発明の製造方法おいては、無機塩として上述の好塩菌にとって窒素源やリン源となるような化合物を用いることが好ましい。これらの無機塩は単一で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0045】
上述の窒素源としては、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩等が挙げられる。より具体的には、NaNO3、NaNO、NHCl等の化合物が挙げられる。
【0046】
窒素源の使用量は、菌体の生育に影響を及ぼすことなく、本発明の培地、又は乾燥菌体あたりにおける、それぞれα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、又はPHAsの生産目的が達成される範囲において適宜設定すればよい。具体的には、培地100mLあたり通常であれば500mg程度以上とすればよく、より好ましくは1000mg程度以上、更に好ましくは1250mg程度以上である。
【0047】
また、上述のリン源としては、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等が挙げられる。より具体的には、KHPO、KH2PO等の化合物が挙げられる。
【0048】
リン源の使用量も、上記窒素源の使用量と同様の観点から、上述の好塩菌の生育に影響を及ぼすことなく、本発明の培地、又は乾燥菌体あたりにおける、それぞれα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、又はPHAsの生産目的が達成される範囲において、適宜設定すればよい。具体的には、培地100mLあたり通常は50〜400mg程度とすればよく、より好ましくは100〜200mg程度である。
【0049】
その他の化合物等も含めた無機塩は、総量で通常は0.1〜2.5M程度となる濃度で用いればよく、好ましくは0.2〜1.0M程度、より好ましくは0.2〜0.5M程度である。
【0050】
有機炭素源としては、トリプトン、イーストエキストラクト等の一般的に発酵に用いられる有機炭素源;可溶性デンプン、六炭糖(グルコース、フラクトース)、五炭糖(キシロース、アラビノース)、二糖(スクロース)、糖アルコール(マンニトール、ソルビトール)等の糖類;エタノール、n−プロパノール等の炭素数1〜6の低級アルコール;酢酸、酢酸ナトリウム、プロピオン酸等のカルボン酸又はその誘導体;グリセロール等の多価アルコール等が挙げられる。なお、グリセロールには、下記に示すような廃グリセロールも含まれる。また、アラビノースを含む木材糖化液、若しくはその残渣も、有機炭素源として用いることができる。
【0051】
中でも、製造方法にかかるコストを低減する観点から、廃グリセロール、木材糖化液等が有機炭素源として好ましく用いられる。これらの有機炭素源は、単一で使用してもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0052】
本発明の廃グリセロールとは、植物、動物等に由来する油脂に、メタノール等のアルコールと、KOH、NaOH等のアルカリ触媒を添加し、65℃程度の温度にて反応させて得られる、脂肪酸メチルエステルを主体とするバイオディーゼルの製造時に、副産物として得られるものである。
【0053】
上記の廃グリセロールの組成は、バイオディーゼルの製造設備や、原料として用いる油脂の組成により異なり、特に限定されるものではない。例えば、非特許文献3に示されるように、グリセロール濃度がおよそ30〜65%程度で、上記のアルカリ触媒をおよそ4〜7%程度含有し、pHは10〜12程度の廃グリセロールが挙げられる。また、上記の廃グリセロールには、得られるバイオディーゼルを洗浄する際に用いられる水が含まれている。
【0054】
有機炭素源の使用量は、使用する有機炭素源の種類により異なるが、通常は培地に対して終濃度が、通常1〜20%w/v程度で使用すればよい。
【0055】
中でも、有機炭素源として廃グリセロールを用いる場合、その使用量は、培地に対して終濃度が通常1〜20w/v%程度とすればよく、好ましくは10〜15w/v%程度である。
【0056】
また、有機炭素源としてアラビノースを用いる場合、その使用量は、培地に対して終濃度が通常1〜5w/v%程度とすればよく、好ましくは2〜3w/v%程度である。
【0057】
本発明の製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の培地で、好塩菌を培養するため、他のバクテリアのコンタミネーションの恐れがほとんどない。そして、コンタミネーションの恐れが低いことから、培地に対して滅菌処理等を行う必要も無く、簡便な設備で培養することも可能である。
【0058】
(c)培養方法
本発明の製造方法における上述の好塩菌の培養方法としては、上述のように培地中にα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を産生し、培養液中に分泌させる方法、又はα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を培養液中に分泌産生させつつ、且つ前記の好塩菌体内でPHAsを生産させる方法であれば特に制限されないが、培養の例を以下に挙げる。
【0059】
上述の本発明の好塩菌の培養環境は好気条件下が望ましい。例えば、5ml程度の培地に当該好塩菌植菌し、通常30〜37℃程度、攪拌速度120〜180rpmで1晩振盪前培養を行う。続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、ジャーファーメンター等に入った培地中に100倍程度に希釈し本培養する。通常であれば、本培養は20〜45℃程度で可能であるが、30〜37℃で行うことが好ましい。
【0060】
本発明の培養方法は、特に限定されず、回分培養、半回分培養、連続培養等の培養方法が挙げられる。特に、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を効率よく製造するには、本発明の方法によって用いる好塩菌がコンタミネーションの可能性が極めて低いことを考慮すれば、半回分培養又は連続培養が好ましい。
【0061】
本発明の製造方法では、上述の好塩菌の生育速度が低下するにつれて、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を効率的に培養液中に分泌産生する傾向にある。
【0062】
従って、上述の好塩菌を生育の旺盛にする有機炭素源(例えば、グルコース等)を含む培地を用いて培養して当該菌体を生育させた後に、生育が制限される有機炭素源(例えば廃グリセロール、アラビノース等)を含む培地に変更して培養することによって、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸をより効率的に産生することができる。
【0063】
一方、本発明においてα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸と同時に産生されるPHAsは、上記好塩菌体内に蓄積されるため、効率よくPHAsを産生させるには、当該菌体をグルコースなどの生育効率のよい有機炭素源を含む培地にて生育し続けることが好ましい。
【0064】
培養時間は、培地に用いる無機塩、有機炭素源などといった培地の条件により異なるが、後述するような所望の量のα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、又はPHAsが回収できるのに十分な時間の培養時間とすればよい。
【0065】
(d)α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸の回収
本発明の製造方法において、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸は、上述の方法によって培養して得られる培養液中から回収される。ここでの回収とは、培養液中にα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸が存在している時に上述の培養を停止し、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸培養液と、上記好塩菌体を分離することである。
【0066】
分離の手法は、遠心操作、濾過等の公知の固液分離の操作を採用すればよい。また、培養の停止方法も特に限定はされず、例えば、上記好塩菌を加熱、酸処理等の方法によって殺菌する方法、遠心操作、濾過等の公知の固液分離方法を用いて培養液と上記好塩菌体を分離する方法等が挙げられる。
【0067】
培養液中にα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸が含まれたまま培養をし続けていると、培養液中に分泌されたα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸が、当該好塩菌体内に再度取り込まれて利用されるために、結果として培養液中のα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸が減少し、ひいては培養液から消失してしまうためにてしまうために、培養液中にα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸が存在しているときに、上記培養を停止する必要がある。
【0068】
培養液中のα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸の存在を確認する方法は、菌種、培地成分、培養条件等により変わり得るものであるので、これらの要素を考慮して適宜決定する。例えば、キャピラリー電気泳動等の分析方法を使用して、培養を行いながら培養を停止する時間を決定することもできる。
【0069】
また、α−ケトグルタル酸及びグルタミン酸は酸性を示す化合物であることから、培養の際の培地のpHの低下を基準にして、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸の存在を確認してもよい。
【0070】
なお回収されるα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸は、培養液中に含まれる無機塩に基づく、ナトリウムやカルシウム等のアルカリ金属陽イオン等と反応したアルカリ金属塩として回収される。したがって、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を酸の状態にて製造するには、回収した培養液を蒸留等の常法に供すればよい。また、回収した培養液を適切なカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製工程に供してもよい。
【0071】
本発明の製造方法によって得られるα−ケトグルタル酸は、得られる培地1Lに対して通常は、10g程度以上(1w/v%)であり、より好ましくは30g程度以上である。
【0072】
本発明の製造方法によって得られるグルタミン酸は、得られる培地1Lに対して通常は、100mg程度以上であり、より好ましくは150mg程度以上である。
【0073】
本発明の方法によって製造されるα-ケトグルタル酸、及びグルタミン酸は、生体内にて通常の光学活性を持った化合物である。特に、本発明の方法によって製造されるグルタミン酸は、L−グルタミン酸である。
【0074】
(d)PHAsの回収
本発明の製造方法において、PHAsは、上述の方法によって培養して得られる培養液中にα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸が存在し、且つ得られる好塩菌体内から回収される。ここでの回収とは、PHAsが蓄積している時に上述の培養を停止して、当該菌体を培養液から分離した当該菌体を破砕した後に、トリクロロエチレン等で抽出することである。例えば、好塩菌を分離した後の具体的な方法については、非特許文献2に記載された方法を参照すればよい。
【0075】
本発明の製造方法によって、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸と主に生産されるPHAsは、ヒドロキシアルカノエート単位からなるポリマーである。ヒドロキシアルカノエートの具体例としては、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート等が挙げられる。
【0076】
上記の培地に用いる有機炭素源として、グリセロール、グルコース、木材糖化液等をそれぞれ単独で用いれば、産生されるPHAsが、同一のヒドロキシブチレートをモノマー単位として構成されるホモポリマーとなる傾向となる。
【0077】
また、n−プロパノール、プロピオン酸、又はこれらの塩等を、上記培地の有機炭素源として用いれば、ヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレートからなるPHAsコポリマーが産生される傾向となる。このようなPHAsコポリマーに含まれるヒドロキシバレレートの含有量は、通常は0.5〜13重量%程度であり、好ましくは5〜13重量%程度である。
【0078】
本発明の製造方法によって、α−ケトグルタル酸並びに/もしくはグルタミン酸と共に得られるPHAsは、培地1Lに対して通常は、3.5g程度以上であり、得られる乾燥菌体重量に対して、通常は30重量%以上である。
【0079】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、本発明が実施例に限定されないことは言うまでも無い。
【0080】
<実施例>
<α−ケトグルタル酸、及びグルタミン酸の測定>
培養液に分泌されたα−ケトグルタル酸、及びグルタミン酸を測定するため、非特許文献2に記載されたポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)分析の手法を応用し、以下の実験を行った。
【0081】
下記の方法で培養して得られた培養液を遠心分離して上清のみ採取し、50μLを乾燥させた。この上清乾燥物に、3vol%のHSOを含むメタノール0.25mlを加え105℃で1時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、クロロホルム0.25ml、蒸留水0.125mlを加えて、激しく攪拌した。その後、1分間遠心分離したのち、クロロホルム層を1μl分取し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、α−ケトグルタル酸を分析した。α−ケトグルタル酸の標品を上清乾燥物と同様に処理、分析し、これを基準として培地あたりのα−ケトグルタル酸蓄積率(α−ケトグルタル酸(g)/上清液(L))を求めた。
【0082】
またグルタミン酸は、酵素法・食品分析試薬 F-キット(株式会社J.K.インターナショナル)を用いて測定し、(グルタミン酸(g)/上清液(L))を求めた。
【0083】
<PHAs蓄積率測定>
菌体内に蓄積されたPHAs(例えば、ヒドロキシブチレート:PHB)の蓄積量を測定するため、非特許文献2に記載の手法を用い以下の実験を行った。
【0084】
上記培養した培養液を遠心分離して菌体のみ採取し、蒸留水で数回洗浄したのち乾燥させた。この乾燥菌体1〜3mgに、3vol%のHSOを含むメタノール0.5mlを加え105℃で2時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、クロロホルム0.5ml、蒸留水0.25mlを加え、激しく攪拌した。その後、1分間遠心分離したのち、クロロホルム層を1μl分取し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、PHAsを分析した。PHAsの標品を乾燥菌体と同様に処理、分析し、これを基準として乾燥菌体あたりのPHAs蓄積率(PHAs(g)/乾燥菌体重量(g))を求めた。
【実施例1】
【0085】
本実施例では、微生物により産生されるα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、及びPHBを産生する方法について詳述する。
【0086】
表1に示すSOT改5(Spirulina platensis Medium改)を基本にした培地を用いた。この培地は、Spirulina platensis Medium(国立環境研究所のHP)であり、NaHCO、NaCOの量を調整し、窒素源のNaNOを5倍に、リン源のKHPOを4倍に増加させて調整した。上記の培地を調整した後のpHは9.4±0.1であり、オートクレーブ等の滅菌操作は行わずにそのまま用いた。
【0087】
培養の際には、上述の培地に対して各種有機炭素源を適宜追加して用いた。具体的な有機炭素源としてそれぞれ培地中での終濃度がそれぞれ10%、及び15%となる量でグリセリンを使用した。廃グリセリン(グリセリン含有量約65%)は、培地中での終濃度が15%となる量で用い、アラビノースを培地中での終濃度で5%となる量で用いた。
【0088】
また、表1に示すNaNOの量を、通常の1250mgにかえて、1000mg、又は1500mgに変化させ、該好塩菌の生育速度、該好塩菌体重量、PHBの産生量、α−ケトグルタル酸の産生量、及びグルタミン酸の生産量を検討した。
【0089】
【表1】

【0090】
<ハロモナス・エスピーKM−1株のプレ培養>
プレート培養より、16.5mm径の試験管に5mlの上記SOT5改培地(この場合、炭素源として1w/v%グルコース等を含むものを用いた)を加え、37℃で1晩振盪培養した。
【0091】
<ハロモナス・エスピーKM−1株の培養、サンプルの回収等>
プレ培養した菌体0.2mlを、100ml容の三角フラスコに入れた上記SOT改5培地20mlに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、33℃で振盪培養し、24時間後より、およそ12時間おきに培養液を0.5ml回収して、OD600、乾燥菌体重量、PHB含有量、及び上清中のα-ケトグルタル酸蓄積率を測定した。培養液は、再度シリコセンをし、33℃で振盪培養を継続し、回分培養した。結果を以下に示す。
【0092】
図1、2では、33℃において、グリセリン、廃グリセリンを炭素源に培養した生育の状況が示している。図3、4では、同条件で培養した際のPHBの生産量について示している。図5では、同条件で培養した際のα-ケトグルタル酸の生産量について示している。
【0093】
炭素源としてグリセリンの影響のみを比較した場合、10%のグリセリンを含む培地では、菌体の生育抑制がさほど起こらないため、菌体生育、及びPHBの蓄積が盛んである。
【0094】
一方、15%のグリセリンでは、初期の生育が抑制される傾向がある。また、15%においては、培養開始から48時間後に約1%のα-ケトグルタル酸の蓄積が見られることから、ある程度の菌体の生育の抑制がα-ケトグルタル酸の蓄積に有効であることが推定される。また有機炭素源として廃グリセリンを用いた場合には、培養開始後24時間から36時間の間に、菌体の生育抑制が見られたが、培養開始から36時間以降には、培地中において著量のα-ケトグルタル酸の蓄積が認められ、最大値は80g/L(培養液)にも達した。
【0095】
一方で、窒素源においては、ある程度の濃度範囲であればα−ケトグルタル酸の蓄積にさほどの差はないものと推定する。
【0096】
さらに終濃度で5%のアラビノースを有機炭素源として含む培地を用いて60時間培養した場合、培養液1Lあたりに10gのα-ケトグルタル酸が含まれていることが明らかになった。
【0097】
上記結果から、グリセロール、廃グリセロール、アラビノース等を有機炭素源として含む培地を用いれば、ハロモナス・エスピーKM−1株は、α-ケトグルタル酸を収量として培地1L当り10g以上、かつPHAsを収量として培地1L当り3.5g(乾燥菌体重量に対して30重量%以上)を産生することができることが明らかとなった。また、α-ケトグルタル酸のみを生産することを目指せば、収量として培地1L当り50g以上得ることも可能であることを示した。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程を含む、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸の製造方法:
(1)ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で培養する工程1、
(2)工程1にて得られる培養液からα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を回収する工程2。
【請求項2】
以下の工程を含む、α−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸、及びポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)の製造方法:
(1)ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で培養する工程1、
(2)工程1にて得られる培養液からα−ケトグルタル酸並びに/若しくはグルタミン酸を回収し、且つ培養して得られる好塩菌体内からPHAsを回収する工程2。
【請求項3】
工程2にて得られる培養液1L当り、10g以上のα−ケトグルタル酸が含まれることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
【請求項4】
工程2にて得られる培養液1L当り、0.1g以上のグルタミン酸が含まれることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
工程2にて得られる好塩菌から、該好塩菌の乾燥重量に対して30重量%以上、又は培地1L当り3.5g以上のPHAsが回収される、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
PHAsがポリヒドロキシブチレート(polyhydroxybutyrate:PHB)である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
有機炭素源が廃グリセロールである請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
アラビノースを含有する有機炭素源である請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記好塩菌がハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM−1株(FERM BP−10995)である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。

【図1】
image rotate

【図2】
image rotate

【図3】
image rotate

【図4】
image rotate

【図5】
image rotate

【図6】
image rotate


【公開番号】特開2012−170385(P2012−170385A)
【公開日】平成24年9月10日(2012.9.10)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−34622(P2011−34622)
【出願日】平成23年2月21日(2011.2.21)
【公序良俗違反の表示】
(特許庁注:以下のものは登録商標)
1.BDF
【出願人】(301021533)独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Fターム(参考)】