α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法、α−ＡＭＰエステラーゼおよびα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法
【課題】簡便かつ高収率で安価に、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの中間体であるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを製造することができる方法、および、簡便かつ高収率で安価に、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルを製造する方法を提供すること。
【解決手段】α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する、テトラチオバクター属およびブレバンディモナス属の持つ酵素または酵素含有物を用いて、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する。さらに、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルを生成する。
【解決手段】α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する、テトラチオバクター属およびブレバンディモナス属の持つ酵素または酵素含有物を用いて、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する。さらに、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルを生成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン（α−Ｌ−ａｓｐａｒｔｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（略称：α−ＡＰ））の製造方法およびα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（α−Ｌ−ａｓｐａｒｔｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（略称：α−ＡＰＭ））の製造方法に関し、より詳しくは、甘味料として大きな需要があるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（製品名：アスパルテーム）製造の重要な中間体であるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法、および、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの並びに前記α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法を利用したα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（「α−ＡＰＭ」と略称される場合がある）の製造法としては従来から化学合成法、酵素合成法が知られている。化学合成法としては、Ｎ保護のＬ−アスパラギン酸無水物とＬ−フェニルアラニンメチルエステルを縮合させてＮ保護ＡＰＭを合成し、このＮ保護基を脱離してＡＰＭを得る方法、酵素合成法としては、Ｎ保護のＬ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニンメチルエステルを縮合させてＮ保護ＡＰＭを合成し、このＮ保護基を脱離してＡＰＭを得る方法が知られているが、両方法とも保護基の導入、保護基の脱離工程が必要で、工程が極めて煩雑になっていた。一方、Ｎ保護基を使用しないＡＰＭ製法も検討されている（特許文献１）が、収率が極めて低く工業的生産には適していない。このような背景の下、アスパルテームの更なる安価な工業的製造法の開発が望まれていた。
【０００３】
【特許文献１】特公平０２−０１５１９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価に、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの中間体であるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを製造することができる方法を提供することを課題とする。また、本発明は、簡便かつ高収率で安価な、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは新たに見出した酵素、あるいは酵素含有物が、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルから、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを選択的に生成する能力を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕 α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成することを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
〔２〕 前記酵素または酵素含有物が、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、〔１〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
〔３〕 前記微生物が、テトラチオバクター属およびブレバンディモナス属からなる群より選ばれる属に属する微生物であることを特徴とする、〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
〔４〕 前記微生物が、下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれるタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔５〕 前記微生物が、下記（ａ）〜（ｊ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが導入された、形質転換微生物であることを特徴とする、〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔６〕 前記酵素が、下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、〔１〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔７〕 〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法によりα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを合成する反応工程と、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンをα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルに変換する反応工程とを含む、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法。
〔８〕 テトラチオバクター属およびブレバンディモナス属からなる群より選ばれる属に属する微生物に由来し、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質。
〔９〕 下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔１０〕 〔９〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１１〕 下記（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔１２〕 前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である、〔１１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１３〕 〔１０〕から〔１２〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチド。
〔１４〕 〔１３〕に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、簡便なα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成するための方法およびα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの生成反応を触媒するタンパク質等が提供される。本発明により、保護基の導入・脱離などの複雑な合成方法における負担を軽減し、簡便かつ高収率で安価にα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを製造することができる。
【０００８】
また、本発明によれば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルを、簡便かつ高収率で安価に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について、
＜１＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法
１．α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法
２．本発明で用いられる微生物
３．本発明で用いられる酵素
＜２＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法、
の順に説明する。
【００１０】
＜１＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法
１．α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法
本発明のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを製造する方法（以下、「本発明のペプチド製造方法」ともいう）は、所定のペプチド生成活性を有する酵素の存在下で、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する。すなわち、本発明のペプチド製造方法は、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成せしめるものである。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する酵素または酵素含有物とは、実質的に、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルのβエステル部位を加水分解等により脱エステル化する反応を触媒する能力または活性を有する酵素（エステラーゼ）または酵素含有物のことをいう。
【００１１】
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルが脱エステル化されてα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンが生成する反応式を、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルとしてα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（α−ＡＭＰ）を用いた場合を例にとって示す。
【化１】
【００１２】
酵素または酵素含有物を、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルに作用せしめる方法としては、当該酵素または酵素含有物と、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルとを混合する方法が挙げられる。より具体的には、酵素または酵素含有物をα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを含む溶液中に添加して反応せしめる方法を用いることができる。また、当該酵素含有物として当該酵素を生産する微生物を用いる場合には、当該酵素を生産する微生物を上記のように溶液中に添加して反応させる方法の他、当該酵素を生産する微生物を培養し、微生物中または微生物の培養液中に当該酵素を生成・蓄積せしめ、培養液中にα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを添加する方法などを用いてもよい。生成されたα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンは、常法により回収し、必要に応じて精製することができる。
【００１３】
「酵素含有物」とは、当該酵素を含む混合物である。酵素含有物は、さらに１種類以上のその他の物質を含みうる。具体的には、微生物の培養など、酵素を生産する工程をその中において行った酵素含有混合物、又はそれをさらに必要に応じて後処理に供したものを、酵素含有物として用いることができる。当該その他の物質には、培地を構成する物質に加え、微生物の細胞、及び微生物の細胞の破片を含みうる。当該後処理としては、培養終了後の培養液からの培地の回収又は菌体の回収；菌体の破砕、溶菌及び凍結乾燥；粗精製等によるその他の物質の一部の除去；共有結合法、吸着法、包括法等による酵素又は酵素を含む構造体（例えば細胞）の固定化；及びこれらの組み合わせが挙げられる。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
【００１４】
また、当該酵素を含む微生物としては野生株を用いても良いし、本酵素を発現した遺伝子組換え株を用いてもよい。当該微生物としては、酵素微生物菌体に限らず、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化菌体、固定化菌体処理物を使用してもよい。
【００１５】
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する活性のあるα−ＡＭＰエステラーゼを生産できる野生株を用いる場合には、遺伝子組み換え株などを作製する手間なしに、より簡便にペプチド生産を行える点などで好適である。他方、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する活性のあるα−ＡＭＰエステラーゼをより大量生成するように改変された変異株（例えば、前記酵素遺伝子を大量発現可能なように形質転換された遺伝子組み換え株）を用いれば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの合成も大量により速く行うことが可能となり得る。すなわち、本発明の方法においては、微生物として、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する活性のあるα−ＡＭＰエステラーゼ、例えば、後述する本発明のタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物や、前記酵素遺伝子、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを発現可能なように形質転換された微生物も、用いることができる。野生株または変異株の微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、当該α−ＡＭＰエステラーゼを蓄積させて、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルに混合して、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成することができる。
【００１６】
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの生成に関与せずに生成α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを分解する酵素が存在することが多い。従って、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加することが可能である。添加量は、例えば０．１ｍＭから３００ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭから１００ｍＭの範囲で適宜定めることができる。
【００１７】
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよい。この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば酵素を用いる場合には、０．０１〜１００ユニット（Ｕ）程度、洗浄菌体を用いる場合は０．１〜５００ｇ／Ｌ程度である。なお、１Ｕは、５０ｍＭのα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを含む１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ）を用いて、２０℃の温度条件下で反応させた場合に、１分間により１μｍｏｌｅのα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成せしめる酵素量とする。
【００１８】
反応に用いられるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルとしては、脱エステル化されてα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成できるものであれば、いかなるものを使用してよい。例えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル等が挙げられる。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法は特に限定されない。例えば、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとを縮合して製造することができる。Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとを縮合してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成する反応式を、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとしてＬ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステルを用いた場合の例をとって示す。
【化２】
【００１９】
出発原料であるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの濃度は１ｍＭ〜２Ｍ、好ましくは２０〜６００ｍＭである。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。
【００２０】
反応温度は５〜６０℃で、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン生成が可能であり、好ましくは１０〜４０℃である。また反応ｐＨはｐＨ５〜１２で、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン生成が可能であり、好ましくはｐＨ６〜１１である。
【００２１】
２．本発明で用いられる微生物
本発明に使用される微生物としては、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する能力を有する微生物を特に限定なく使用することができる。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する能力を有する微生物としては、例えば、テトラチオバクター属およびブレバンディモナス属に属する微生物を挙げることができるが、具体的にはテトラチオバクター エスピー（Ｔｅｔｒａｔｈｉｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．） ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２、ブレバンディモナス エスピー（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５を例示することができる。テトラチオバクター エスピー（Ｔｅｔｒａｔｈｉｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．） ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に２００６年１１月２１日付けで寄託されている。
【００２２】
上記菌株のうち、ＮＲＲＬ番号が記載されているものは、アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（１８１５ Ｎ． Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ ６１６０４，ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）に寄託されており、番号を参照して分譲を受けることができる。
上記菌株のうち、ＦＥＲＭ番号が記載されているものは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
【００２３】
これらの微生物としては、野生株または変異株のいずれを用いてもよいし、また、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導される組み換え株等も用いることができる。
【００２４】
このような微生物の菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【００２５】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭化水素類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
【００２６】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、リン酸一カリウム、リン酸二カリウムなどのリン酸塩、硫酸マグネシウムなどの硫酸塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００２７】
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
【００２８】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
【００２９】
３．本発明で用いられる酵素
本発明では、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する酵素（エステラーゼ）が用いられる。本発明では、このような活性を有する酵素であれば、その由来、取得方法などの限定なく用いることができる。以下に、本発明の酵素タンパク質、その精製、遺伝子工学的な手法の利用などについて説明する。
【００３０】
（３−１）本発明のタンパク質
本発明のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質は、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する能力を有する微生物から入手することができる。例えば上述の本発明に使用される微生物の例として挙げた属の微生物、すなわちテトラチオバクター属およびブレバンディモナス属からなる群より選ばれる属に属する細菌などを利用できる。より具体的にはテトラチオバクター エスピー、ブレバンディモナス エスピーを挙げることができる。などが挙げられる。これらの菌株テトラチオバクター エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２、ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５は、本発明者らが、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを高収率で生産する酵素の生産菌を検索した結果に選出した微生物である。
【００３１】
本発明のタンパク質を、上述の微生物から単離・精製する方法を説明する。
まず、微生物の菌体から、超音波破砕等の物理的方法、あるいは細胞壁溶解酵素等を用いた酵素法等により菌体を破壊し、遠心分離等により不溶性画分を除いて菌体抽出液を調製する。このようにして得られる菌体抽出液を、通常のタンパク質の精製法、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて分画することによって、α−ＡＭＰエステラーゼを精製することができる。
【００３２】
陰イオン交換クロマトグラフィー用の担体としては、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２６／１０，１６／１０、ＨＰ（いずれもアマシャム社製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させると当該酵素はｐＨ８．５の条件下で非吸着画分に回収される。
【００３３】
陽イオンクロマトグラフィー用担体としては、ＭｏｎｏＳ ＨＲ（アマシャム社製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させて本酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。例えば、ＭｏｎｏＳ ＨＲを用いた場合には、カラムに吸着した本酵素は、０．２〜０．５Ｍ程度のＮａＣｌで溶出される。
【００３４】
上記のようにして精製された本酵素は、さらにゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等により均一に精製できる。ゲル濾過クロマトグラフィー用担体としては、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ２００ｐｇ（いずれもアマシャム社製）が挙げられる。また、疎水性クロマトグラフィー用の担体としては、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｅｔｈｙｌ（アマシャム社製）が挙げられる。
【００３５】
上記精製操作において、本酵素を含む画分は、後述する実施例に示される方法等により、各画分のペプチド生成活性を測定することにより、確認することができる。上記のようにして精製された本酵素の内部アミノ酸配列を、配列表の配列番号９、１０に示す。
本発明のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質として、より具体的には、下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれるタンパク質が挙げられる。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【００３６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、テトラチオバクター エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２株から、本発明者らが新規に単離し、上記のα−ＡＭＰエステラーゼのタンパク質のアミノ酸配列として特定したものである。配列番号２に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜１３または１〜２４がリーダーペプチドにあたり、アミノ酸残基番号１４〜３４０または２５〜３４０が成熟タンパク質領域である。
一方、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株から、本発明者らが新規に単離し、上記のα−ＡＭＰエステラーゼのタンパク質のアミノ酸配列として特定したものである。配列番号１７に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜２５がリーダーペプチドにあたり、アミノ酸残基番号２６〜５５０が成熟タンパク質領域である。
【００３７】
本発明のタンパク質は、その成熟タンパク質がペプチド生成活性を有するタンパク質であれば、そのリーダーペプチドを含んでも含まなくてもよい。また、本発明のタンパク質には、配列表の配列番号２もしくは配列番号１７に記載されたアミノ酸配列中の成熟タンパク質領域、或いは更にリーダーペプチドを含む全領域を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質も含まれる。具体的には、上記（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｊ）を挙げることができる。
【００３８】
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。また、１若しくは数個のアミノ酸の変異を有する配列は、変異を有さない配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上のホモロジーを有するものとすることができる。ただし、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｊ）のタンパク質のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、変異を含まない状態でのタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、（Ｂ）の場合について説明すると、（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００３９】
上記（Ｂ）などに示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、上記（Ａ）などに示すアミノ酸配列中の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されるように改変されたアミノ酸配列をあらかじめ設計し、このアミノ酸配列に対応する塩基配列を発現させることによって得られる。
【００４０】
また、上記のような塩基の置換、欠失、および／または挿入等には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列表の配列番号２もしくは配列番号１７に記載されたアミノ酸配列中の成熟タンパク質領域を有するタンパク質或いは更にリーダーペプチドを含む全領域を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質が得られる。
【００４１】
（３−２）本発明のポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、形質転換体の作製およびα−ＡＭＰエステラーゼの精製
（３−２−１）α−ＡＭＰエステラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明は、上述したα−ＡＭＰエステラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドは、上述したα−ＡＭＰエステラーゼタンパク質を構成するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであるが、コドンの縮重により、１つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。具体的には、上述の（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれるタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドの好ましい具体例としては、下記（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを挙げることができる。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００４３】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、テトラチオバクター エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２株より単離されたものである。なお、配列番号１の塩基番号６１〜１０８０の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１０８０の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は、塩基番号６１〜９９の領域または６１〜１３２の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１００〜１０８０の領域または１３３〜１０８０の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むα−ＡＭＰエステラーゼタンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのα−ＡＭＰエステラーゼタンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号１に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、リーダー配列がコードするリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１０１〜１０８０、又は１３３〜１０８０でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示すと推定される。
【００４４】
また、配列表の配列番号１６に記載の塩基番号３９〜１６８８の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５より単離されたものである。配列番号１６に記載の塩基番号３９〜１６８８の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号３９〜１６８８の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は、塩基番号３９〜１１３の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１１４〜１６８８の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むα−ＡＭＰエステラーゼタンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのα−ＡＭＰエステラーゼタンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号１６に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、リーダー配列がコードするリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号３９〜１１３でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示すと推定される。
【００４５】
なお、以下に挙げる種々の遺伝子組換え技法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）などの記載に準じて行うことができる。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドは、テトラチオバクター エスピー、ブレバンディモナス エスピーなどの染色体ＤＮＡ、もしくはＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｉｏｎ、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）参照）又はハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、上記（３）の欄で説明したようにして精製されたα−ＡＭＰエステラーゼに基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、本発明によりα−ＡＭＰエステラーゼ遺伝子（配列番号１、配列番号１６）の塩基配列が明らかになったので、これらの塩基配列に基づいてプライマーやハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、プローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、５'非翻訳領域及び３'非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーを用いると、本酵素のコード領域全長を増幅することができる。配列番号１に記載された、リーダー配列および成熟タンパク質コード領域の双方を含む領域を増幅する場合を例にとると、具体的には、５'側プライマーとしては配列番号１において塩基番号６１よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマーが、３'側プライマーとしては塩基番号１０８０よりも下流の領域の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーが挙げられる。
【００４７】
プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機 ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。ＰＣＲ反応は、例えばＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）及びＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００４８】
本発明のペプチド製造方法で用いることができる酵素をコードするポリヌクレオチドとしては、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号１に記載のＣＤＳからなるポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするポリヌクレオチドまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号１に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離することによっても、本発明のポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドが得られる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドには、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号１６に記載のＣＤＳからなるポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするポリヌクレオチドまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号１６に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離することによっても、本発明のポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドが得られる。
【００５０】
プローブは、例えば配列番号１に記載の塩基配列に基づいて常法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするポリヌクレオチドをつり上げ、目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブはプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするポリヌクレオチドに応じて調節することができる。
【００５１】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いポリヌクレオチド同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、中でも好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００５２】
ただし、上記のようにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチドの場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、元となる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、上記（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合について説明すると、５０℃、ｐＨ８の条件下で、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１００〜１０８０のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００５３】
このような改変されたポリヌクレオチドは、従来知られている突然変異処理によって取得され得る。突然変異処理としては、本酵素をコードするポリヌクレオチド、例えば（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドを、ヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および本酵素をコードするポリヌクレオチドを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００５４】
尚、配列表の配列番号１に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示される。また、配列表の配列番号１６に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１７に示される。
【００５５】
（３−２−２）組換えポリヌクレオチドおよび形質転換体の作製、ならびにα−ＡＭＰエステラーゼの生成
上記（３−２−１）で説明したポリヌクレオチドを適当な宿主に導入し組換えポリヌクレオチドとし、得られる形質転換細胞（形質転換体）に該ポリヌクレオチドにより特定されるタンパク質を発現させることによっても、本発明で用いることができるα−ＡＭＰエステラーゼを生成することができる。
【００５６】
ポリヌクレオチドにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、宿主としては、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、及びバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。
【００５７】
ポリヌクレオチドを宿主に導入するのに用いる組換えポリヌクレオチドは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、導入しようとするポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモータとしては、テトラチオバクター エスピー、ブレバンディモナス エスピーなどのα−ＡＭＰエステラーゼ遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には該プロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを本発明のポリヌクレオチドに連結し、該プロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。
【００５８】
組換えポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８，３２６（１９７９））あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してポリヌクレオチドの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等が挙げられる。
【００５９】
タンパク質を組換えポリヌクレオチド技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換細胞内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【００６０】
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００６１】
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
【００６２】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
【００６３】
以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いてα−ＡＭＰエステラーゼを製造する方法を例として、より具体的に説明する。なお、大腸菌などの微生物にα−ＡＭＰエステラーゼを作製させる場合、タンパク質のコード配列として、リーダー配列を含む前駆タンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み込こんでも、リーダー配列を含まない成熟タンパク質領域のポリヌクレオチドのみを組み込んでもよく、作製しようとする酵素の製造条件、形態、使用条件などにより適宜選択することができる。
【００６４】
α−ＡＭＰエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージポリヌクレオチドのベクターも利用できる。さらに、プロモータを含み、挿入ポリヌクレオチド配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。
【００６５】
α−ＡＭＰエステラーゼを融合タンパク質封入体として生産させるためには、α−ＡＭＰエステラーゼ遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、γインターフェロン遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００６６】
これらの遺伝子とα−ＡＭＰエステラーゼをコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ポリヌクレオチドを利用すればよい。
【００６７】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、ｒｒｎＢターミネータ、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
【００６８】
α−ＡＭＰエステラーゼまたはα−ＡＭＰエステラーゼと他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、および／または挿入などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００６９】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
【００７０】
プロモータ、α−ＡＭＰエステラーゼまたはα−ＡＭＰエステラーゼと他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したポリヌクレオチド断片と、ベクターポリヌクレオチドとを連結して組換えポリヌクレオチドを得る。
【００７１】
該組換えポリヌクレオチドを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、α−ＡＭＰエステラーゼまたはα−ＡＭＰエステラーゼと他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒア コリ ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
【００７２】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、α−ＡＭＰエステラーゼ内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてα−ＡＭＰエステラーゼを切り出せるようにしてもよい。
【００７３】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００７４】
α−ＡＭＰエステラーゼまたはα−ＡＭＰエステラーゼと他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。α−ＡＭＰエステラーゼあるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりα−ＡＭＰエステラーゼあるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、α−ＡＭＰエステラーゼあるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００７５】
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【００７６】
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００７７】
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したα−ＡＭＰエステラーゼが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【００７８】
＜２＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法
本発明のα−ＡＰＭの製造方法は、上記の「＜１＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法」に沿ってα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを合成する第１の工程と、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンをα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルに変換する第２の工程、とを含む。
【００７９】
第１の工程における好ましい条件等は、上記の「＜１＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法」の欄に記載の通りである。また、第２の工程については、公知の方法により行うことができる。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンをα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルに変換する第２の工程の反応式は、下記に示すとおりである。
【化３】
本発明のα−ＡＰＭの製造方法によれば、甘味料等として重要なα−ＡＰＭを簡便かつ高収率で安価に製造することができる。
【実施例】
【００８０】
実施例１ α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する微生物
細菌の培養には、１Ｌ中にグリセロール ２０ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌したものを用いた（培地１）。培地１の１Ｌ中に、さらにグルコース ５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを含む斜面寒天培地（寒天 ２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）を調製し、この斜面寒天培地にて３０℃、２４時間培養した表１に示す微生物を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分で１７時間振とう培養を行った。培養後菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。
【００８１】
これらの微生物の菌体懸濁液０．１ｍＬに、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（α−ＡＭＰ）１００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍＬをそれぞれ添加し、全量を０．２ｍＬとした後、２０℃にて３時間反応をおこなった。このとき、テトラチオバクター エスピーにα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン（α−ＡＰ）の生成が確認された。
【００８２】
実施例２ テトラチオバクター エスピー由来のα−ＡＭＰエステラーゼ遺伝子の単離
以下、α−ＡＭＰエステラーゼ遺伝子の単離について述べるが、微生物はテトラチオバクター エスピー（Ｔｅｔｒａｔｈｉｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．） ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２株を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１１８を用いた。
【００８３】
テトラチオバクター エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２株をＣＭ２Ｇ寒天培地（５０ｇ／ｌ グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ ペプトン、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ 寒天，ｐＨ７．０））上で３０℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃で振盪培養した。
【００８４】
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
【００８５】
テトラチオバクター エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２株より調製した染色体ＤＮＡ５μｇをＰｓｔＩで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約４ｋｂのＤＮＡを分離し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、ｐＵＣ１１８ ＰｓｔＩ／ＢＡＰ（宝酒造製）とを混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９のコンピテント・セル（東洋紡績製）１００μｌとを混合して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【００８６】
コロニーの形成された固定培地上に、終濃度としてα−ＡＭＰ５ｍＭ、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ １０Ｕ／ｍｌ、ａｌｃｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ０．１Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ５ｍＭ、ＡＬＰＳ １０ｍＭ、ＥＤＴＡ １０ｍＭ、ＫＰＢ（ｐＨ７） ２０ｍＭ、ＳｅｑＰｒｅｐＡｇａｒｏｓｅ ８ｇ／ｌとなるような活性検出液を塗布し、紫色に発色する株をＡＭＰエステラーゼ活性（α−ＡＭＰに対するエステラーゼ活性をいう。以下、同じ。）菌株として採取した。
【００８７】
本発明に用いられる酵素の活性単位については、５０ｍＭ α−ＡＭＰを含む１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、２０℃で反応させた条件で、１分間に１μｍｏｌｅのα−ＡＰを生成する酵素量を１単位（Ｕ）と定義した。
【００８８】
比色法によりＡＭＰエステラーゼ活性が確認された株を、５０ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地３ｍｌを張り込んだ試験管で、３７℃、１６時間培養した。培養液１ｍｌあたり０．１ＵのＡＭＰエステラーゼ活性を有しており、クローニングした遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＵＣ１１８のみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
【００８９】
ＡＭＰエステラーゼ活性を有することが確認された上記菌株から、エシェリヒア コリ ＪＭ１０９が保有するプラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （プロメガ社製）を用いて調製し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。シーケンス反応はＣＥＱ ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はＣＥＱ ２０００−ＸＬ（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
【００９０】
その結果、エステラーゼに相同性を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが存在し、α−ＡＭＰエステラーゼをコードする遺伝子であることを確認した。ＡＭＰエステラーゼ遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号１および配列番号２に示した。得られたオープンリーディングフレームをＢＬＡＳＴＰ．プログラムで相同性解析した結果、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＩＭＢ−４０７００由来ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ（ＷＯ９８０２５５６）と５６％の相同性が検出された。
【００９１】
配列表に記載の配列番号２のアミノ酸配列をＳｉｇｎａｌＰ ｖ３．０プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０：７８３−７９５，２００４．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ ３．０．）にて解析したところ、アミノ酸配列の１−１３番目もしくは１−２４番目までがシグナルとして機能して分泌すると予測され、成熟タンパクは１４番目もしくは２５番目より下流であると推定された。
【００９２】
実施例３ テトラチオバクター エスピー由来ＡＭＰエステラーゼ（Ｔ＿ｅｓｔ）遺伝子発現株の作成
エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を配列番号３および配列番号４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモータと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモータを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩにて処理して得られるＤＮＡ断片と、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネータを含むＤＮＡ断片とをライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩにて処理して得られるｔｒｐプロモータを含むＤＮＡ断片と、ｐＳＴＶ２８（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＰｖｕＩにて処理して得られるＤＮＡ断片と、ｐＫＫ２２３−３をＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネータを含むＤＮＡ断片とをライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐ６と命名した。
【００９３】
テトラチオバクター エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号５および配列番号６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をＡｓｅＩ／ＰｓｔＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ６のＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＢＥ１１０と命名した。
【００９４】
ｐＢＥ１１０を有するエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を５０ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で、３７℃、１６時間シード培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地（２ｇ／ｌ Ｄ−グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ カザミノ酸、５ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌ リン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌ リン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、５０ｍｇ／ｌ クロラムフェニコール）を張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコにシードし、３７℃、１６時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり１０ＵのＡＭＰエステラーゼ活性を有しており、クローニングした遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＴｒｐ６のみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
【００９５】
実施例４ ブレバンディモナス エスピーからのＡＭＰエステラーゼの精製
１Ｌ中にグルコース １ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．１ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ６．２）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌した（培地３）。培地３に、同培地で３０℃、１６時間培養したブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分で１６時間振盪培養を行った。
【００９６】
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。得られた培養液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）し、菌体を集めた。菌体１６ｇを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）と１０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸からなる緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）にて洗浄後、同緩衝液４０ｍｌに懸濁し、１９５Ｗにて４５分間超音波破砕処理を行った。この超音波破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）し、破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。この超音波破砕液上清を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡに対して一夜透析し、超遠心分離（５４，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡにて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２６／１０カラム（アマシャム社製）に供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中のＮａＣｌ濃度を直線的に０Ｍから１Ｍまで変化させることで吸着タンパク質を溶出させた。この操作により０．１Ｍ付近の活性画分を集めた。得られたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分を濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡに対して透析後、同緩衝液にて予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（アマシャム社製）に供した。この操作により分子量２０−２５ｋＤａと見積もられる溶出位置にて活性が確認され、回収した。さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ画分を濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡにて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １６／１０カラム（アマシャム社製）に供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中のＮａＣｌ濃度を直線的に０Ｍから０．３Ｍまで変化させることで吸着タンパク質を溶出させた。この操作により０．０５Ｍ付近の活性画分を集めた。最後に、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分を濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７５Ｍ 硫酸アンモニウムからなる緩衝液に対して透析し、同緩衝液で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ ｅｔｈｙｌ（アマシャム社製）に供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を直線的に０．７５Ｍから０Ｍまで変化させることで吸着タンパク質を溶出した。この操作により０．４Ｍ付近にＡＭＰエステラーゼ活性を検出した。活性の存在する画分を回収した。これらの操作により、本実施例４で得られたＡＭＰ脱エステル化酵素は電気泳動の実験結果より均一に精製されたことが確認された。上記の精製工程における活性の回収率は３７％、精製度は５．０６倍であった。
【００９７】
実施例５ ブレバンディモナス エスピー由来ＡＭＰエステラーゼを用いたα−ＡＰの生産
実施例４で得られたＲｅｓｏｕｒｃｅ ｅｔｈｙｌ画分酵素（約３．３Ｕ／ｍｌ）２μｌを、２０ｍＭのα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（α−ＡＭＰ）、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に加え、３０℃にて１時間反応した。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン（α−ＡＰ）の生成を確認した。尚、酵素無添加区でのα−ＡＰの生成はほとんど認められなかった。
【００９８】
実施例６ ブレバンディモナス エスピー由来ＡＭＰエステラーゼ遺伝子の採取
ブレバンディモナス エスピーＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株をＣＭ２Ｇ寒天培地（５ｇ／ｌ グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ ペプトン、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ 寒天、ｐＨ７．０）上で３０℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃で振盪培養した。
【００９９】
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
【０１００】
以下、ＡＭＰエステラーゼ遺伝子の単離について述べるが、微生物はブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ−１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１８を用いた。
【０１０１】
前述のブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株由来のＡＭＰエステラーゼをエドマン分解法により決定したアミノ酸配列（配列番号７）をもとに配列番号８に示す塩基配列を有するミックスプライマーを作成した。ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株由来のＡＭＰエステラーゼのリジルエンドペプチダーゼによる消化物をエドマン分解法により決定したアミノ酸配列（配列番号９）をもとに、配列番号１１に示す塩基配列を有するミックスプライマーを作成した。
【０１０２】
ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株由来のＡＭＰエステラーゼ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号８及び配列番号１１に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
【０１０３】
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造製）を用いて行い、以下の条件の反応を３０サイクル行った。
９４℃ ３０秒
５２℃ １分
７２℃ １分
【０１０４】
反応後、反応液３μｌを２％アガロース電気泳動に供した。その結果、約８００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認された。
【０１０５】
α−ＡＭＰエステラーゼ遺伝子全長を取得するために、まず、上記約８００ｂｐのＤＮＡ断片の配列情報より配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５に示す塩基配列を有すプライマーを作成した。上記ＰＣＲ条件にてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）に説明されている。
【０１０６】
上記ＰＣＲで増幅された２４０ｂｐ及び４３０ｂｐのＤＮＡ断片を、２％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。二つのＤＮＡ断片をＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
【０１０７】
ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ ｍｅｍｅｂｒａｎｅｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
【０１０８】
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、ＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約５ｋｂと４．５ｋｂのバンドが検出できた。
【０１０９】
ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株の染色体ＤＮＡ５μｇをＢａｍＨＩで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約４−５ｋｂのＤＮＡを分離し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、ｐＵＣ１１８ ＢａｍＨＩ／ＢＡＰ（宝酒造製）とを混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９のコンピテント・セル（東洋紡績製）１００μｌとを混合して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１１０】
ＡＭＰエステラーゼ遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）に説明されている。
【０１１１】
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｎｙ ａｎｄ Ｐｌａｑｕｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
【０１１２】
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、ＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーをそれぞれ４株および５株確認できた。
【０１１３】
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記２菌株から、エシェリヒア コリ ＪＭ１０９が保有するプラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （プロメガ社製）を用いて調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はＣＥＱ ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はＣＥＱ ２０００−ＸＬ（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
【０１１４】
その結果、ＡＭＰエステラーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列番号７）及び内部アミノ酸配列（配列番号９及び配列番号１０）を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが存在し、ＡＭＰエステラーゼをコードする遺伝子であることを確認した。ＡＭＰエステラーゼ遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列番号１６および配列番号１７に示した。得られたオープンリーディングフレームをＢＬＡＳＴＰ．プログラムで相同性解析した結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉａｃｉｎｉのエステラーゼ５４（Ｊ．Ｍｏｌ.Ｃａｔａｌ．，Ｂ Ｅｎｚｙｍ．２７（４−６），２３７−２４１（２００４））とは、アミノ酸配列で３７％、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｇｅｎｅ ３２９（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ），１８７−１９５（２００４））の熱安定性カルボキシルエステラーゼとは、アミノ酸配列で３５％の相同性を示した。
【０１１５】
配列表に記載の配列番号１７のアミノ酸配列をＳｉｇｎａｌＰ ｖ３．０プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０：７８３−７９５，２００４．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ ３．０．）にて解析したところ、アミノ酸配列の１−２５番目までがシグナルとして機能して分泌すると予測され、成熟タンパクは２６番目より下流であると推定された。
【０１１６】
実施例７ ブレバンディモナス エスピー由来ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）発現株の作成
ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１８及び配列番号１９に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＳＴＶ２８（Ｔａｋａｒａ製）のＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＢｒｅ−２と命名した。
【０１１７】
ｐＢｒｅ−２を有するエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を５０ｍｇ／ｌ クロラムフェニコールを含むＬＢ培地で、３０℃、２４時間シード培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地（２ｇ／ｌＤ−グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ カザミノ酸、５ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌ リン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌ リン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、５０ｍｇ／ｌ アンピシリン）を張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコにシードし、３０℃、２４時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり０．０８ＵのＡＭＰエステラーゼ活性を有しており、クローニングした遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＳＴＶ２８のみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
【０１１８】
実施例８
ＡＭＰエステラーゼ遺伝子発現菌株をアンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を含むＬ−寒天培地上で、２０℃で４８時間培養した。次に１／４プレート分の細胞を５０ｍｌのＬ−培地（ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）に移した。シェーカー（１４０ｒｐｍ）を用いて２２℃、１６時間培養した培養液３ｍｌ分（ＯＤ＝０．１５、２６倍希釈）を以下に示す組成の培地３００ｍｌに植菌し、１．０Ｌの容量の実験室用ファーメンター内で７００ｒｐｍの回転数で攪拌通気（１／１ｖｖｍ）しながらバッチ培養を行った。糖切れの後の培養液１５ｍｌ分（ＯＤ６１０＝０．６０、５１倍希釈）を同じ組成の培地３００ｍｌに植菌し、同様のファーメンターによる攪拌通気（１／１ｖｖｍ）、２０℃で糖フィード培養を行った。ｐＨの値は気体アンモニアで自動的に７．０に調整した。
【０１１９】
培地の組成（ｇ／ｌ）:
Ｇｌｕｃｏｓｅ ２５．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ５．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０５
Ｍａｍｅｎｏ（ＴＮ） ０．４５
ＧＤ１１３ ０．１
【０１２０】
グルコースと硫酸マグネシウムは別々に滅菌した。他の組成分のｐＨはＫＯＨで５．０に調整した。
【０１２１】
フィード糖液の組成（ｇ／ｌ）
Ｇｌｕｃｏｓｅ ５００
ｐＨ無調
【０１２２】
この培養液２５ｍｌを遠心分離（２２００ｇ×１５分）し、菌体沈殿物を得た。これに、水を２５ｍｌ添加し、菌体懸濁液とした。
【０１２３】
実施例９
Ｌ−フェニルアラニン １１２．５ｇと水 ２２５０ｇとを加え、１０Ｍ アンモニア水６ｍｌでｐＨ８．７とした。Ｌ−アスパラギン酸ジメチルエステル・モノメチル硫酸溶液２２３．９ｇを１０Ｍ アンモニア水でｐＨ８．７に維持しつつ添加した。水を加えて全量を２７７０ｍｌとした後、縮合酵素菌体懸濁液２３０ｍｌを添加し、２０℃で３０分攪拌した。反応中は１０Ｍアンモニア水を添加することによりｐＨを８．７に維持した。縮合反応終了後、９５％硫酸６１．８９ｇを添加し、ｐＨ＝３．０とした。４０℃に昇温の後、１時間攪拌した。反応液温度を２０℃にした後に１０Ｍアンモニア水８８ｍｌを添加しｐＨ７．０とした。ＡＭＰエステラーゼ酵素菌体懸濁液１５０ｍｌ添加し、２０℃で７時間攪拌した。反応中は１０Ｍアンモニア水を添加することにより、ｐＨを７．０に維持した。反応終了後、酵素反応溶液を９５％硫酸でｐＨ＝６．０とした後、７０℃で８０分攪拌した。膜濾過（ＰＥＬＬＩＣＯＮ２ “ＭＩＮＩ” Ｆｉｌｔｅｒ、分画分子量１０００００）により菌体を除去した後、酵素反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン１４６．２ｇ（収率７６．８％）及びＬ−フェニルアラニン２０．５ｇを含んでいた。
【０１２４】
実施例１０
実施例９で得た菌体除去後の酵素反応溶液２３２３ｇを２００ｈＰａ、６０℃で１．５時間濃縮し１０７２ｇとした。濃縮液のうち２８７ｇを４０℃に昇温後、９５％硫酸５．２ｇを添加しｐＨ３．３とした。残りの濃縮液を３時間かけて添加した。添加中は９５％硫酸を添加することによりｐＨを３．３に維持した。濃縮液添加終了後、４０℃で３時間攪拌した後、析出した結晶を濾別し、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを９２．４ｇ（収率９２．１％）得た。
【０１２５】
実施例１１
実施例１０で得た結晶１２２ｇ（α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン６０．１ｇ含有）にＭｅＯＨ ２７ｍｌ、３５％塩酸１０４ｍｌ、水３６ｍｌを添加した後、３５℃で２４時間、２５℃で４８時間、１０℃で２４ｈ攪拌した。析出した結晶を濾別し、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル塩酸塩を５７．１ｇ（収率８０．２％）得た。
【０１２６】
実施例１２
実施例１１で得られたα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル塩酸塩４４．９ｇを水５３０ｍｌに溶解した後、１８ｗｔ％炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ＝４．９に調整した。析出した結晶を濾別したところ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルを３３．６ｇ（収率８４．２％）得た。
【配列表フリーテキスト】
【０１２７】
配列番号１：ＡＭＰエステラーゼ遺伝子（Ｔ＿ｅｓｔ）の塩基配列と対応するアミノ酸配列
配列番号２：ＡＭＰエステラーゼ遺伝子（Ｔ＿ｅｓｔ）のアミノ酸配列
配列番号３：ｔｒｐプロモータ増幅用１
配列番号４：ｔｒｐプロモータ増幅用２
配列番号５：ＡＭＰエステラーゼ遺伝子（Ｔ＿ｅｓｔ）増幅用プライマー１
配列番号６：ＡＭＰエステラーゼ遺伝子（Ｔ＿ｅｓｔ）増幅用プライマー２
配列番号７：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のＮ末端アミノ酸配列
配列番号８：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のＭｉｘプライマー１
配列番号９：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）の内部アミノ酸配列１
配列番号１０：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）の内部アミノ酸配列２
配列番号１１：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のＭｉｘプライマー２
配列番号１２：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のプローブ作成用プライマー１
配列番号１３：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のプローブ作成用プライマー２
配列番号１４：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のプローブ作成用プライマー３
配列番号１５：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のプローブ作成用プライマー４
配列番号１６：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）の塩基配列と対応するアミノ酸配列
配列番号１７：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のアミノ酸配列
配列番号１８：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）発現株作成用のプライマー１
配列番号１９：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）発現株作成用のプライマー２
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン（α−Ｌ−ａｓｐａｒｔｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（略称：α−ＡＰ））の製造方法およびα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（α−Ｌ−ａｓｐａｒｔｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（略称：α−ＡＰＭ））の製造方法に関し、より詳しくは、甘味料として大きな需要があるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（製品名：アスパルテーム）製造の重要な中間体であるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法、および、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの並びに前記α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法を利用したα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（「α−ＡＰＭ」と略称される場合がある）の製造法としては従来から化学合成法、酵素合成法が知られている。化学合成法としては、Ｎ保護のＬ−アスパラギン酸無水物とＬ−フェニルアラニンメチルエステルを縮合させてＮ保護ＡＰＭを合成し、このＮ保護基を脱離してＡＰＭを得る方法、酵素合成法としては、Ｎ保護のＬ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニンメチルエステルを縮合させてＮ保護ＡＰＭを合成し、このＮ保護基を脱離してＡＰＭを得る方法が知られているが、両方法とも保護基の導入、保護基の脱離工程が必要で、工程が極めて煩雑になっていた。一方、Ｎ保護基を使用しないＡＰＭ製法も検討されている（特許文献１）が、収率が極めて低く工業的生産には適していない。このような背景の下、アスパルテームの更なる安価な工業的製造法の開発が望まれていた。
【０００３】
【特許文献１】特公平０２−０１５１９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価に、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの中間体であるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを製造することができる方法を提供することを課題とする。また、本発明は、簡便かつ高収率で安価な、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは新たに見出した酵素、あるいは酵素含有物が、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルから、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを選択的に生成する能力を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕 α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成することを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
〔２〕 前記酵素または酵素含有物が、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、〔１〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
〔３〕 前記微生物が、テトラチオバクター属およびブレバンディモナス属からなる群より選ばれる属に属する微生物であることを特徴とする、〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
〔４〕 前記微生物が、下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれるタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔５〕 前記微生物が、下記（ａ）〜（ｊ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが導入された、形質転換微生物であることを特徴とする、〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔６〕 前記酵素が、下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、〔１〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔７〕 〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法によりα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを合成する反応工程と、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンをα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルに変換する反応工程とを含む、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法。
〔８〕 テトラチオバクター属およびブレバンディモナス属からなる群より選ばれる属に属する微生物に由来し、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質。
〔９〕 下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔１０〕 〔９〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１１〕 下記（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔１２〕 前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である、〔１１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１３〕 〔１０〕から〔１２〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチド。
〔１４〕 〔１３〕に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、簡便なα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成するための方法およびα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの生成反応を触媒するタンパク質等が提供される。本発明により、保護基の導入・脱離などの複雑な合成方法における負担を軽減し、簡便かつ高収率で安価にα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを製造することができる。
【０００８】
また、本発明によれば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルを、簡便かつ高収率で安価に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について、
＜１＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法
１．α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法
２．本発明で用いられる微生物
３．本発明で用いられる酵素
＜２＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法、
の順に説明する。
【００１０】
＜１＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法
１．α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法
本発明のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを製造する方法（以下、「本発明のペプチド製造方法」ともいう）は、所定のペプチド生成活性を有する酵素の存在下で、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する。すなわち、本発明のペプチド製造方法は、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成せしめるものである。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する酵素または酵素含有物とは、実質的に、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルのβエステル部位を加水分解等により脱エステル化する反応を触媒する能力または活性を有する酵素（エステラーゼ）または酵素含有物のことをいう。
【００１１】
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルが脱エステル化されてα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンが生成する反応式を、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルとしてα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（α−ＡＭＰ）を用いた場合を例にとって示す。
【化１】
【００１２】
酵素または酵素含有物を、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルに作用せしめる方法としては、当該酵素または酵素含有物と、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルとを混合する方法が挙げられる。より具体的には、酵素または酵素含有物をα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを含む溶液中に添加して反応せしめる方法を用いることができる。また、当該酵素含有物として当該酵素を生産する微生物を用いる場合には、当該酵素を生産する微生物を上記のように溶液中に添加して反応させる方法の他、当該酵素を生産する微生物を培養し、微生物中または微生物の培養液中に当該酵素を生成・蓄積せしめ、培養液中にα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを添加する方法などを用いてもよい。生成されたα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンは、常法により回収し、必要に応じて精製することができる。
【００１３】
「酵素含有物」とは、当該酵素を含む混合物である。酵素含有物は、さらに１種類以上のその他の物質を含みうる。具体的には、微生物の培養など、酵素を生産する工程をその中において行った酵素含有混合物、又はそれをさらに必要に応じて後処理に供したものを、酵素含有物として用いることができる。当該その他の物質には、培地を構成する物質に加え、微生物の細胞、及び微生物の細胞の破片を含みうる。当該後処理としては、培養終了後の培養液からの培地の回収又は菌体の回収；菌体の破砕、溶菌及び凍結乾燥；粗精製等によるその他の物質の一部の除去；共有結合法、吸着法、包括法等による酵素又は酵素を含む構造体（例えば細胞）の固定化；及びこれらの組み合わせが挙げられる。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
【００１４】
また、当該酵素を含む微生物としては野生株を用いても良いし、本酵素を発現した遺伝子組換え株を用いてもよい。当該微生物としては、酵素微生物菌体に限らず、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化菌体、固定化菌体処理物を使用してもよい。
【００１５】
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する活性のあるα−ＡＭＰエステラーゼを生産できる野生株を用いる場合には、遺伝子組み換え株などを作製する手間なしに、より簡便にペプチド生産を行える点などで好適である。他方、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する活性のあるα−ＡＭＰエステラーゼをより大量生成するように改変された変異株（例えば、前記酵素遺伝子を大量発現可能なように形質転換された遺伝子組み換え株）を用いれば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの合成も大量により速く行うことが可能となり得る。すなわち、本発明の方法においては、微生物として、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する活性のあるα−ＡＭＰエステラーゼ、例えば、後述する本発明のタンパク質を発現可能なように形質転換された微生物や、前記酵素遺伝子、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを発現可能なように形質転換された微生物も、用いることができる。野生株または変異株の微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、当該α−ＡＭＰエステラーゼを蓄積させて、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルに混合して、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成することができる。
【００１６】
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの生成に関与せずに生成α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを分解する酵素が存在することが多い。従って、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加することが可能である。添加量は、例えば０．１ｍＭから３００ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭから１００ｍＭの範囲で適宜定めることができる。
【００１７】
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよい。この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば酵素を用いる場合には、０．０１〜１００ユニット（Ｕ）程度、洗浄菌体を用いる場合は０．１〜５００ｇ／Ｌ程度である。なお、１Ｕは、５０ｍＭのα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを含む１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ）を用いて、２０℃の温度条件下で反応させた場合に、１分間により１μｍｏｌｅのα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成せしめる酵素量とする。
【００１８】
反応に用いられるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルとしては、脱エステル化されてα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成できるものであれば、いかなるものを使用してよい。例えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル等が挙げられる。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法は特に限定されない。例えば、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとを縮合して製造することができる。Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとを縮合してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成する反応式を、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとしてＬ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステルを用いた場合の例をとって示す。
【化２】
【００１９】
出発原料であるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの濃度は１ｍＭ〜２Ｍ、好ましくは２０〜６００ｍＭである。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。
【００２０】
反応温度は５〜６０℃で、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン生成が可能であり、好ましくは１０〜４０℃である。また反応ｐＨはｐＨ５〜１２で、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン生成が可能であり、好ましくはｐＨ６〜１１である。
【００２１】
２．本発明で用いられる微生物
本発明に使用される微生物としては、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する能力を有する微生物を特に限定なく使用することができる。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する能力を有する微生物としては、例えば、テトラチオバクター属およびブレバンディモナス属に属する微生物を挙げることができるが、具体的にはテトラチオバクター エスピー（Ｔｅｔｒａｔｈｉｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．） ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２、ブレバンディモナス エスピー（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５を例示することができる。テトラチオバクター エスピー（Ｔｅｔｒａｔｈｉｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．） ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に２００６年１１月２１日付けで寄託されている。
【００２２】
上記菌株のうち、ＮＲＲＬ番号が記載されているものは、アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（１８１５ Ｎ． Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ ６１６０４，ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）に寄託されており、番号を参照して分譲を受けることができる。
上記菌株のうち、ＦＥＲＭ番号が記載されているものは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
【００２３】
これらの微生物としては、野生株または変異株のいずれを用いてもよいし、また、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導される組み換え株等も用いることができる。
【００２４】
このような微生物の菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【００２５】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭化水素類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
【００２６】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、リン酸一カリウム、リン酸二カリウムなどのリン酸塩、硫酸マグネシウムなどの硫酸塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００２７】
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
【００２８】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
【００２９】
３．本発明で用いられる酵素
本発明では、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する酵素（エステラーゼ）が用いられる。本発明では、このような活性を有する酵素であれば、その由来、取得方法などの限定なく用いることができる。以下に、本発明の酵素タンパク質、その精製、遺伝子工学的な手法の利用などについて説明する。
【００３０】
（３−１）本発明のタンパク質
本発明のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質は、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する能力を有する微生物から入手することができる。例えば上述の本発明に使用される微生物の例として挙げた属の微生物、すなわちテトラチオバクター属およびブレバンディモナス属からなる群より選ばれる属に属する細菌などを利用できる。より具体的にはテトラチオバクター エスピー、ブレバンディモナス エスピーを挙げることができる。などが挙げられる。これらの菌株テトラチオバクター エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２、ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５は、本発明者らが、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを高収率で生産する酵素の生産菌を検索した結果に選出した微生物である。
【００３１】
本発明のタンパク質を、上述の微生物から単離・精製する方法を説明する。
まず、微生物の菌体から、超音波破砕等の物理的方法、あるいは細胞壁溶解酵素等を用いた酵素法等により菌体を破壊し、遠心分離等により不溶性画分を除いて菌体抽出液を調製する。このようにして得られる菌体抽出液を、通常のタンパク質の精製法、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて分画することによって、α−ＡＭＰエステラーゼを精製することができる。
【００３２】
陰イオン交換クロマトグラフィー用の担体としては、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２６／１０，１６／１０、ＨＰ（いずれもアマシャム社製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させると当該酵素はｐＨ８．５の条件下で非吸着画分に回収される。
【００３３】
陽イオンクロマトグラフィー用担体としては、ＭｏｎｏＳ ＨＲ（アマシャム社製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させて本酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。例えば、ＭｏｎｏＳ ＨＲを用いた場合には、カラムに吸着した本酵素は、０．２〜０．５Ｍ程度のＮａＣｌで溶出される。
【００３４】
上記のようにして精製された本酵素は、さらにゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等により均一に精製できる。ゲル濾過クロマトグラフィー用担体としては、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ２００ｐｇ（いずれもアマシャム社製）が挙げられる。また、疎水性クロマトグラフィー用の担体としては、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｅｔｈｙｌ（アマシャム社製）が挙げられる。
【００３５】
上記精製操作において、本酵素を含む画分は、後述する実施例に示される方法等により、各画分のペプチド生成活性を測定することにより、確認することができる。上記のようにして精製された本酵素の内部アミノ酸配列を、配列表の配列番号９、１０に示す。
本発明のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質として、より具体的には、下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれるタンパク質が挙げられる。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【００３６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、テトラチオバクター エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２株から、本発明者らが新規に単離し、上記のα−ＡＭＰエステラーゼのタンパク質のアミノ酸配列として特定したものである。配列番号２に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜１３または１〜２４がリーダーペプチドにあたり、アミノ酸残基番号１４〜３４０または２５〜３４０が成熟タンパク質領域である。
一方、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株から、本発明者らが新規に単離し、上記のα−ＡＭＰエステラーゼのタンパク質のアミノ酸配列として特定したものである。配列番号１７に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜２５がリーダーペプチドにあたり、アミノ酸残基番号２６〜５５０が成熟タンパク質領域である。
【００３７】
本発明のタンパク質は、その成熟タンパク質がペプチド生成活性を有するタンパク質であれば、そのリーダーペプチドを含んでも含まなくてもよい。また、本発明のタンパク質には、配列表の配列番号２もしくは配列番号１７に記載されたアミノ酸配列中の成熟タンパク質領域、或いは更にリーダーペプチドを含む全領域を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質も含まれる。具体的には、上記（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｊ）を挙げることができる。
【００３８】
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。また、１若しくは数個のアミノ酸の変異を有する配列は、変異を有さない配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上のホモロジーを有するものとすることができる。ただし、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｊ）のタンパク質のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、変異を含まない状態でのタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、（Ｂ）の場合について説明すると、（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００３９】
上記（Ｂ）などに示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、上記（Ａ）などに示すアミノ酸配列中の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されるように改変されたアミノ酸配列をあらかじめ設計し、このアミノ酸配列に対応する塩基配列を発現させることによって得られる。
【００４０】
また、上記のような塩基の置換、欠失、および／または挿入等には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列表の配列番号２もしくは配列番号１７に記載されたアミノ酸配列中の成熟タンパク質領域を有するタンパク質或いは更にリーダーペプチドを含む全領域を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質が得られる。
【００４１】
（３−２）本発明のポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、形質転換体の作製およびα−ＡＭＰエステラーゼの精製
（３−２−１）α−ＡＭＰエステラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明は、上述したα−ＡＭＰエステラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドは、上述したα−ＡＭＰエステラーゼタンパク質を構成するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであるが、コドンの縮重により、１つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。具体的には、上述の（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれるタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドの好ましい具体例としては、下記（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを挙げることができる。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００４３】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、テトラチオバクター エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２株より単離されたものである。なお、配列番号１の塩基番号６１〜１０８０の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１０８０の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は、塩基番号６１〜９９の領域または６１〜１３２の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１００〜１０８０の領域または１３３〜１０８０の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むα−ＡＭＰエステラーゼタンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのα−ＡＭＰエステラーゼタンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号１に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、リーダー配列がコードするリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１０１〜１０８０、又は１３３〜１０８０でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示すと推定される。
【００４４】
また、配列表の配列番号１６に記載の塩基番号３９〜１６８８の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５より単離されたものである。配列番号１６に記載の塩基番号３９〜１６８８の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号３９〜１６８８の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は、塩基番号３９〜１１３の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１１４〜１６８８の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むα−ＡＭＰエステラーゼタンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのα−ＡＭＰエステラーゼタンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号１６に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、リーダー配列がコードするリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号３９〜１１３でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示すと推定される。
【００４５】
なお、以下に挙げる種々の遺伝子組換え技法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）などの記載に準じて行うことができる。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドは、テトラチオバクター エスピー、ブレバンディモナス エスピーなどの染色体ＤＮＡ、もしくはＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｉｏｎ、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）参照）又はハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、上記（３）の欄で説明したようにして精製されたα−ＡＭＰエステラーゼに基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、本発明によりα−ＡＭＰエステラーゼ遺伝子（配列番号１、配列番号１６）の塩基配列が明らかになったので、これらの塩基配列に基づいてプライマーやハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、プローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、５'非翻訳領域及び３'非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーを用いると、本酵素のコード領域全長を増幅することができる。配列番号１に記載された、リーダー配列および成熟タンパク質コード領域の双方を含む領域を増幅する場合を例にとると、具体的には、５'側プライマーとしては配列番号１において塩基番号６１よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマーが、３'側プライマーとしては塩基番号１０８０よりも下流の領域の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーが挙げられる。
【００４７】
プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機 ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。ＰＣＲ反応は、例えばＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）及びＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００４８】
本発明のペプチド製造方法で用いることができる酵素をコードするポリヌクレオチドとしては、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号１に記載のＣＤＳからなるポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするポリヌクレオチドまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号１に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離することによっても、本発明のポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドが得られる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドには、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号１６に記載のＣＤＳからなるポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするポリヌクレオチドまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号１６に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離することによっても、本発明のポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドが得られる。
【００５０】
プローブは、例えば配列番号１に記載の塩基配列に基づいて常法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするポリヌクレオチドをつり上げ、目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブはプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするポリヌクレオチドに応じて調節することができる。
【００５１】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いポリヌクレオチド同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、中でも好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００５２】
ただし、上記のようにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチドの場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、元となる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、上記（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合について説明すると、５０℃、ｐＨ８の条件下で、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１００〜１０８０のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００５３】
このような改変されたポリヌクレオチドは、従来知られている突然変異処理によって取得され得る。突然変異処理としては、本酵素をコードするポリヌクレオチド、例えば（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドを、ヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および本酵素をコードするポリヌクレオチドを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００５４】
尚、配列表の配列番号１に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示される。また、配列表の配列番号１６に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１７に示される。
【００５５】
（３−２−２）組換えポリヌクレオチドおよび形質転換体の作製、ならびにα−ＡＭＰエステラーゼの生成
上記（３−２−１）で説明したポリヌクレオチドを適当な宿主に導入し組換えポリヌクレオチドとし、得られる形質転換細胞（形質転換体）に該ポリヌクレオチドにより特定されるタンパク質を発現させることによっても、本発明で用いることができるα−ＡＭＰエステラーゼを生成することができる。
【００５６】
ポリヌクレオチドにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、宿主としては、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、及びバチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。
【００５７】
ポリヌクレオチドを宿主に導入するのに用いる組換えポリヌクレオチドは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、導入しようとするポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモータとしては、テトラチオバクター エスピー、ブレバンディモナス エスピーなどのα−ＡＭＰエステラーゼ遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には該プロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを本発明のポリヌクレオチドに連結し、該プロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。
【００５８】
組換えポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８，３２６（１９７９））あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してポリヌクレオチドの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等が挙げられる。
【００５９】
タンパク質を組換えポリヌクレオチド技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換細胞内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【００６０】
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００６１】
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
【００６２】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
【００６３】
以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いてα−ＡＭＰエステラーゼを製造する方法を例として、より具体的に説明する。なお、大腸菌などの微生物にα−ＡＭＰエステラーゼを作製させる場合、タンパク質のコード配列として、リーダー配列を含む前駆タンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み込こんでも、リーダー配列を含まない成熟タンパク質領域のポリヌクレオチドのみを組み込んでもよく、作製しようとする酵素の製造条件、形態、使用条件などにより適宜選択することができる。
【００６４】
α−ＡＭＰエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージポリヌクレオチドのベクターも利用できる。さらに、プロモータを含み、挿入ポリヌクレオチド配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。
【００６５】
α−ＡＭＰエステラーゼを融合タンパク質封入体として生産させるためには、α−ＡＭＰエステラーゼ遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、γインターフェロン遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００６６】
これらの遺伝子とα−ＡＭＰエステラーゼをコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ポリヌクレオチドを利用すればよい。
【００６７】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、ｒｒｎＢターミネータ、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
【００６８】
α−ＡＭＰエステラーゼまたはα−ＡＭＰエステラーゼと他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、および／または挿入などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００６９】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
【００７０】
プロモータ、α−ＡＭＰエステラーゼまたはα−ＡＭＰエステラーゼと他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したポリヌクレオチド断片と、ベクターポリヌクレオチドとを連結して組換えポリヌクレオチドを得る。
【００７１】
該組換えポリヌクレオチドを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、α−ＡＭＰエステラーゼまたはα−ＡＭＰエステラーゼと他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒア コリ ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
【００７２】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、α−ＡＭＰエステラーゼ内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてα−ＡＭＰエステラーゼを切り出せるようにしてもよい。
【００７３】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００７４】
α−ＡＭＰエステラーゼまたはα−ＡＭＰエステラーゼと他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。α−ＡＭＰエステラーゼあるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりα−ＡＭＰエステラーゼあるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、α−ＡＭＰエステラーゼあるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００７５】
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【００７６】
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００７７】
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したα−ＡＭＰエステラーゼが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【００７８】
＜２＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法
本発明のα−ＡＰＭの製造方法は、上記の「＜１＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法」に沿ってα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを合成する第１の工程と、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンをα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルに変換する第２の工程、とを含む。
【００７９】
第１の工程における好ましい条件等は、上記の「＜１＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法」の欄に記載の通りである。また、第２の工程については、公知の方法により行うことができる。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンをα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルに変換する第２の工程の反応式は、下記に示すとおりである。
【化３】
本発明のα−ＡＰＭの製造方法によれば、甘味料等として重要なα−ＡＰＭを簡便かつ高収率で安価に製造することができる。
【実施例】
【００８０】
実施例１ α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成する微生物
細菌の培養には、１Ｌ中にグリセロール ２０ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌したものを用いた（培地１）。培地１の１Ｌ中に、さらにグルコース ５ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを含む斜面寒天培地（寒天 ２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）を調製し、この斜面寒天培地にて３０℃、２４時間培養した表１に示す微生物を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分で１７時間振とう培養を行った。培養後菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。
【００８１】
これらの微生物の菌体懸濁液０．１ｍＬに、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（α−ＡＭＰ）１００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍＬをそれぞれ添加し、全量を０．２ｍＬとした後、２０℃にて３時間反応をおこなった。このとき、テトラチオバクター エスピーにα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン（α−ＡＰ）の生成が確認された。
【００８２】
実施例２ テトラチオバクター エスピー由来のα−ＡＭＰエステラーゼ遺伝子の単離
以下、α−ＡＭＰエステラーゼ遺伝子の単離について述べるが、微生物はテトラチオバクター エスピー（Ｔｅｔｒａｔｈｉｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．） ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２株を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１１８を用いた。
【００８３】
テトラチオバクター エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２株をＣＭ２Ｇ寒天培地（５０ｇ／ｌ グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ ペプトン、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ 寒天，ｐＨ７．０））上で３０℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃で振盪培養した。
【００８４】
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
【００８５】
テトラチオバクター エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２株より調製した染色体ＤＮＡ５μｇをＰｓｔＩで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約４ｋｂのＤＮＡを分離し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、ｐＵＣ１１８ ＰｓｔＩ／ＢＡＰ（宝酒造製）とを混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９のコンピテント・セル（東洋紡績製）１００μｌとを混合して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【００８６】
コロニーの形成された固定培地上に、終濃度としてα−ＡＭＰ５ｍＭ、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ １０Ｕ／ｍｌ、ａｌｃｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ０．１Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ５ｍＭ、ＡＬＰＳ １０ｍＭ、ＥＤＴＡ １０ｍＭ、ＫＰＢ（ｐＨ７） ２０ｍＭ、ＳｅｑＰｒｅｐＡｇａｒｏｓｅ ８ｇ／ｌとなるような活性検出液を塗布し、紫色に発色する株をＡＭＰエステラーゼ活性（α−ＡＭＰに対するエステラーゼ活性をいう。以下、同じ。）菌株として採取した。
【００８７】
本発明に用いられる酵素の活性単位については、５０ｍＭ α−ＡＭＰを含む１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、２０℃で反応させた条件で、１分間に１μｍｏｌｅのα−ＡＰを生成する酵素量を１単位（Ｕ）と定義した。
【００８８】
比色法によりＡＭＰエステラーゼ活性が確認された株を、５０ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地３ｍｌを張り込んだ試験管で、３７℃、１６時間培養した。培養液１ｍｌあたり０．１ＵのＡＭＰエステラーゼ活性を有しており、クローニングした遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＵＣ１１８のみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
【００８９】
ＡＭＰエステラーゼ活性を有することが確認された上記菌株から、エシェリヒア コリ ＪＭ１０９が保有するプラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （プロメガ社製）を用いて調製し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。シーケンス反応はＣＥＱ ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はＣＥＱ ２０００−ＸＬ（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
【００９０】
その結果、エステラーゼに相同性を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが存在し、α−ＡＭＰエステラーゼをコードする遺伝子であることを確認した。ＡＭＰエステラーゼ遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号１および配列番号２に示した。得られたオープンリーディングフレームをＢＬＡＳＴＰ．プログラムで相同性解析した結果、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＩＭＢ−４０７００由来ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ（ＷＯ９８０２５５６）と５６％の相同性が検出された。
【００９１】
配列表に記載の配列番号２のアミノ酸配列をＳｉｇｎａｌＰ ｖ３．０プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０：７８３−７９５，２００４．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ ３．０．）にて解析したところ、アミノ酸配列の１−１３番目もしくは１−２４番目までがシグナルとして機能して分泌すると予測され、成熟タンパクは１４番目もしくは２５番目より下流であると推定された。
【００９２】
実施例３ テトラチオバクター エスピー由来ＡＭＰエステラーゼ（Ｔ＿ｅｓｔ）遺伝子発現株の作成
エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を配列番号３および配列番号４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモータと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモータを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩにて処理して得られるＤＮＡ断片と、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネータを含むＤＮＡ断片とをライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩにて処理して得られるｔｒｐプロモータを含むＤＮＡ断片と、ｐＳＴＶ２８（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＰｖｕＩにて処理して得られるＤＮＡ断片と、ｐＫＫ２２３−３をＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネータを含むＤＮＡ断片とをライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐ６と命名した。
【００９３】
テトラチオバクター エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０２株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号５および配列番号６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をＡｓｅＩ／ＰｓｔＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ６のＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＢＥ１１０と命名した。
【００９４】
ｐＢＥ１１０を有するエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を５０ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で、３７℃、１６時間シード培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地（２ｇ／ｌ Ｄ−グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ カザミノ酸、５ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌ リン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌ リン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、５０ｍｇ／ｌ クロラムフェニコール）を張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコにシードし、３７℃、１６時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり１０ＵのＡＭＰエステラーゼ活性を有しており、クローニングした遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＴｒｐ６のみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
【００９５】
実施例４ ブレバンディモナス エスピーからのＡＭＰエステラーゼの精製
１Ｌ中にグルコース １ｇ、硫酸アンモニウム ５ｇ、リン酸一カリウム １ｇ、リン酸二カリウム ３ｇ、硫酸マグネシウム ０．１ｇ、酵母エキス １０ｇ、ペプトン １０ｇを含む培地（ｐＨ６．２）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌した（培地３）。培地３に、同培地で３０℃、１６時間培養したブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分で１６時間振盪培養を行った。
【００９６】
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。得られた培養液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）し、菌体を集めた。菌体１６ｇを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）と１０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸からなる緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）にて洗浄後、同緩衝液４０ｍｌに懸濁し、１９５Ｗにて４５分間超音波破砕処理を行った。この超音波破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）し、破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。この超音波破砕液上清を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡに対して一夜透析し、超遠心分離（５４，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡにて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２６／１０カラム（アマシャム社製）に供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中のＮａＣｌ濃度を直線的に０Ｍから１Ｍまで変化させることで吸着タンパク質を溶出させた。この操作により０．１Ｍ付近の活性画分を集めた。得られたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分を濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡに対して透析後、同緩衝液にて予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（アマシャム社製）に供した。この操作により分子量２０−２５ｋＤａと見積もられる溶出位置にて活性が確認され、回収した。さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ画分を濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡにて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １６／１０カラム（アマシャム社製）に供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中のＮａＣｌ濃度を直線的に０Ｍから０．３Ｍまで変化させることで吸着タンパク質を溶出させた。この操作により０．０５Ｍ付近の活性画分を集めた。最後に、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分を濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７５Ｍ 硫酸アンモニウムからなる緩衝液に対して透析し、同緩衝液で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ ｅｔｈｙｌ（アマシャム社製）に供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を直線的に０．７５Ｍから０Ｍまで変化させることで吸着タンパク質を溶出した。この操作により０．４Ｍ付近にＡＭＰエステラーゼ活性を検出した。活性の存在する画分を回収した。これらの操作により、本実施例４で得られたＡＭＰ脱エステル化酵素は電気泳動の実験結果より均一に精製されたことが確認された。上記の精製工程における活性の回収率は３７％、精製度は５．０６倍であった。
【００９７】
実施例５ ブレバンディモナス エスピー由来ＡＭＰエステラーゼを用いたα−ＡＰの生産
実施例４で得られたＲｅｓｏｕｒｃｅ ｅｔｈｙｌ画分酵素（約３．３Ｕ／ｍｌ）２μｌを、２０ｍＭのα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（α−ＡＭＰ）、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に加え、３０℃にて１時間反応した。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン（α−ＡＰ）の生成を確認した。尚、酵素無添加区でのα−ＡＰの生成はほとんど認められなかった。
【００９８】
実施例６ ブレバンディモナス エスピー由来ＡＭＰエステラーゼ遺伝子の採取
ブレバンディモナス エスピーＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株をＣＭ２Ｇ寒天培地（５ｇ／ｌ グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ ペプトン、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ 寒天、ｐＨ７．０）上で３０℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃で振盪培養した。
【００９９】
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
【０１００】
以下、ＡＭＰエステラーゼ遺伝子の単離について述べるが、微生物はブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ−１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１８を用いた。
【０１０１】
前述のブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株由来のＡＭＰエステラーゼをエドマン分解法により決定したアミノ酸配列（配列番号７）をもとに配列番号８に示す塩基配列を有するミックスプライマーを作成した。ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株由来のＡＭＰエステラーゼのリジルエンドペプチダーゼによる消化物をエドマン分解法により決定したアミノ酸配列（配列番号９）をもとに、配列番号１１に示す塩基配列を有するミックスプライマーを作成した。
【０１０２】
ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株由来のＡＭＰエステラーゼ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号８及び配列番号１１に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
【０１０３】
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造製）を用いて行い、以下の条件の反応を３０サイクル行った。
９４℃ ３０秒
５２℃ １分
７２℃ １分
【０１０４】
反応後、反応液３μｌを２％アガロース電気泳動に供した。その結果、約８００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認された。
【０１０５】
α−ＡＭＰエステラーゼ遺伝子全長を取得するために、まず、上記約８００ｂｐのＤＮＡ断片の配列情報より配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５に示す塩基配列を有すプライマーを作成した。上記ＰＣＲ条件にてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）に説明されている。
【０１０６】
上記ＰＣＲで増幅された２４０ｂｐ及び４３０ｂｐのＤＮＡ断片を、２％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。二つのＤＮＡ断片をＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
【０１０７】
ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ ｍｅｍｅｂｒａｎｅｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
【０１０８】
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、ＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約５ｋｂと４．５ｋｂのバンドが検出できた。
【０１０９】
ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株の染色体ＤＮＡ５μｇをＢａｍＨＩで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約４−５ｋｂのＤＮＡを分離し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、ｐＵＣ１１８ ＢａｍＨＩ／ＢＡＰ（宝酒造製）とを混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９のコンピテント・セル（東洋紡績製）１００μｌとを混合して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１１０】
ＡＭＰエステラーゼ遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８９）に説明されている。
【０１１１】
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｎｙ ａｎｄ Ｐｌａｑｕｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
【０１１２】
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、ＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーをそれぞれ４株および５株確認できた。
【０１１３】
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記２菌株から、エシェリヒア コリ ＪＭ１０９が保有するプラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （プロメガ社製）を用いて調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はＣＥＱ ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はＣＥＱ ２０００−ＸＬ（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
【０１１４】
その結果、ＡＭＰエステラーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列番号７）及び内部アミノ酸配列（配列番号９及び配列番号１０）を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが存在し、ＡＭＰエステラーゼをコードする遺伝子であることを確認した。ＡＭＰエステラーゼ遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列番号１６および配列番号１７に示した。得られたオープンリーディングフレームをＢＬＡＳＴＰ．プログラムで相同性解析した結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉａｃｉｎｉのエステラーゼ５４（Ｊ．Ｍｏｌ.Ｃａｔａｌ．，Ｂ Ｅｎｚｙｍ．２７（４−６），２３７−２４１（２００４））とは、アミノ酸配列で３７％、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｇｅｎｅ ３２９（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ），１８７−１９５（２００４））の熱安定性カルボキシルエステラーゼとは、アミノ酸配列で３５％の相同性を示した。
【０１１５】
配列表に記載の配列番号１７のアミノ酸配列をＳｉｇｎａｌＰ ｖ３．０プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０：７８３−７９５，２００４．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ ３．０．）にて解析したところ、アミノ酸配列の１−２５番目までがシグナルとして機能して分泌すると予測され、成熟タンパクは２６番目より下流であると推定された。
【０１１６】
実施例７ ブレバンディモナス エスピー由来ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）発現株の作成
ブレバンディモナス エスピー ＮＲＲＬ Ｂ−２３９５株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１８及び配列番号１９に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＳＴＶ２８（Ｔａｋａｒａ製）のＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＢｒｅ−２と命名した。
【０１１７】
ｐＢｒｅ−２を有するエシェリヒア コリ ＪＭ１０９を５０ｍｇ／ｌ クロラムフェニコールを含むＬＢ培地で、３０℃、２４時間シード培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地（２ｇ／ｌＤ−グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ カザミノ酸、５ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌ リン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌ リン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、５０ｍｇ／ｌ アンピシリン）を張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコにシードし、３０℃、２４時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり０．０８ＵのＡＭＰエステラーゼ活性を有しており、クローニングした遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＳＴＶ２８のみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
【０１１８】
実施例８
ＡＭＰエステラーゼ遺伝子発現菌株をアンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を含むＬ−寒天培地上で、２０℃で４８時間培養した。次に１／４プレート分の細胞を５０ｍｌのＬ−培地（ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）に移した。シェーカー（１４０ｒｐｍ）を用いて２２℃、１６時間培養した培養液３ｍｌ分（ＯＤ＝０．１５、２６倍希釈）を以下に示す組成の培地３００ｍｌに植菌し、１．０Ｌの容量の実験室用ファーメンター内で７００ｒｐｍの回転数で攪拌通気（１／１ｖｖｍ）しながらバッチ培養を行った。糖切れの後の培養液１５ｍｌ分（ＯＤ６１０＝０．６０、５１倍希釈）を同じ組成の培地３００ｍｌに植菌し、同様のファーメンターによる攪拌通気（１／１ｖｖｍ）、２０℃で糖フィード培養を行った。ｐＨの値は気体アンモニアで自動的に７．０に調整した。
【０１１９】
培地の組成（ｇ／ｌ）:
Ｇｌｕｃｏｓｅ ２５．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ５．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０５
Ｍａｍｅｎｏ（ＴＮ） ０．４５
ＧＤ１１３ ０．１
【０１２０】
グルコースと硫酸マグネシウムは別々に滅菌した。他の組成分のｐＨはＫＯＨで５．０に調整した。
【０１２１】
フィード糖液の組成（ｇ／ｌ）
Ｇｌｕｃｏｓｅ ５００
ｐＨ無調
【０１２２】
この培養液２５ｍｌを遠心分離（２２００ｇ×１５分）し、菌体沈殿物を得た。これに、水を２５ｍｌ添加し、菌体懸濁液とした。
【０１２３】
実施例９
Ｌ−フェニルアラニン １１２．５ｇと水 ２２５０ｇとを加え、１０Ｍ アンモニア水６ｍｌでｐＨ８．７とした。Ｌ−アスパラギン酸ジメチルエステル・モノメチル硫酸溶液２２３．９ｇを１０Ｍ アンモニア水でｐＨ８．７に維持しつつ添加した。水を加えて全量を２７７０ｍｌとした後、縮合酵素菌体懸濁液２３０ｍｌを添加し、２０℃で３０分攪拌した。反応中は１０Ｍアンモニア水を添加することによりｐＨを８．７に維持した。縮合反応終了後、９５％硫酸６１．８９ｇを添加し、ｐＨ＝３．０とした。４０℃に昇温の後、１時間攪拌した。反応液温度を２０℃にした後に１０Ｍアンモニア水８８ｍｌを添加しｐＨ７．０とした。ＡＭＰエステラーゼ酵素菌体懸濁液１５０ｍｌ添加し、２０℃で７時間攪拌した。反応中は１０Ｍアンモニア水を添加することにより、ｐＨを７．０に維持した。反応終了後、酵素反応溶液を９５％硫酸でｐＨ＝６．０とした後、７０℃で８０分攪拌した。膜濾過（ＰＥＬＬＩＣＯＮ２ “ＭＩＮＩ” Ｆｉｌｔｅｒ、分画分子量１０００００）により菌体を除去した後、酵素反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン１４６．２ｇ（収率７６．８％）及びＬ−フェニルアラニン２０．５ｇを含んでいた。
【０１２４】
実施例１０
実施例９で得た菌体除去後の酵素反応溶液２３２３ｇを２００ｈＰａ、６０℃で１．５時間濃縮し１０７２ｇとした。濃縮液のうち２８７ｇを４０℃に昇温後、９５％硫酸５．２ｇを添加しｐＨ３．３とした。残りの濃縮液を３時間かけて添加した。添加中は９５％硫酸を添加することによりｐＨを３．３に維持した。濃縮液添加終了後、４０℃で３時間攪拌した後、析出した結晶を濾別し、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを９２．４ｇ（収率９２．１％）得た。
【０１２５】
実施例１１
実施例１０で得た結晶１２２ｇ（α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン６０．１ｇ含有）にＭｅＯＨ ２７ｍｌ、３５％塩酸１０４ｍｌ、水３６ｍｌを添加した後、３５℃で２４時間、２５℃で４８時間、１０℃で２４ｈ攪拌した。析出した結晶を濾別し、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル塩酸塩を５７．１ｇ（収率８０．２％）得た。
【０１２６】
実施例１２
実施例１１で得られたα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル塩酸塩４４．９ｇを水５３０ｍｌに溶解した後、１８ｗｔ％炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ＝４．９に調整した。析出した結晶を濾別したところ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルを３３．６ｇ（収率８４．２％）得た。
【配列表フリーテキスト】
【０１２７】
配列番号１：ＡＭＰエステラーゼ遺伝子（Ｔ＿ｅｓｔ）の塩基配列と対応するアミノ酸配列
配列番号２：ＡＭＰエステラーゼ遺伝子（Ｔ＿ｅｓｔ）のアミノ酸配列
配列番号３：ｔｒｐプロモータ増幅用１
配列番号４：ｔｒｐプロモータ増幅用２
配列番号５：ＡＭＰエステラーゼ遺伝子（Ｔ＿ｅｓｔ）増幅用プライマー１
配列番号６：ＡＭＰエステラーゼ遺伝子（Ｔ＿ｅｓｔ）増幅用プライマー２
配列番号７：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のＮ末端アミノ酸配列
配列番号８：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のＭｉｘプライマー１
配列番号９：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）の内部アミノ酸配列１
配列番号１０：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）の内部アミノ酸配列２
配列番号１１：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のＭｉｘプライマー２
配列番号１２：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のプローブ作成用プライマー１
配列番号１３：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のプローブ作成用プライマー２
配列番号１４：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のプローブ作成用プライマー３
配列番号１５：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のプローブ作成用プライマー４
配列番号１６：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）の塩基配列と対応するアミノ酸配列
配列番号１７：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）のアミノ酸配列
配列番号１８：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）発現株作成用のプライマー１
配列番号１９：ＡＭＰエステラーゼ（Ｖ＿ｅｓｔ）発現株作成用のプライマー２
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成することを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項２】
前記酵素または酵素含有物が、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項３】
前記微生物が、テトラチオバクター属およびブレバンディモナス属からなる群より選ばれる属に属する微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項４】
前記微生物が、下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれるタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項５】
前記微生物が、下記（ａ）〜（ｊ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが導入された、形質転換微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項６】
前記酵素が、下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法によりα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを合成する反応工程と、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンをα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルに変換する反応工程とを含む、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法。
【請求項８】
テトラチオバクター属およびブレバンディモナス属からなる群より選ばれる属に属する微生物に由来し、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質。
【請求項９】
下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項１０】
請求項９に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
下記（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項１２】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞。
【請求項１】
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを生成することを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項２】
前記酵素または酵素含有物が、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項３】
前記微生物が、テトラチオバクター属およびブレバンディモナス属からなる群より選ばれる属に属する微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項４】
前記微生物が、下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれるタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項５】
前記微生物が、下記（ａ）〜（ｊ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが導入された、形質転換微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項６】
前記酵素が、下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造方法によりα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを合成する反応工程と、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンをα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルに変換する反応工程とを含む、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法。
【請求項８】
テトラチオバクター属およびブレバンディモナス属からなる群より選ばれる属に属する微生物に由来し、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質。
【請求項９】
下記（Ａ）〜（Ｊ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１４〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２５〜３４０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜５５０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むアミノ酸配列を有し、かつ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項１０】
請求項９に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
下記（ａ）〜（ｊ）からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１００〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１３３〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号１１４〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列のうち塩基番号３９〜１６８８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｊ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号６１〜１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを脱エステル化する活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項１２】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する組換えポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞。
【公開番号】特開２００８−１７８３４０（Ｐ２００８−１７８３４０Ａ）
【公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１４０８６（Ｐ２００７−１４０８６）
【出願日】平成１９年１月２４日（２００７．１．２４）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２４日（２００７．１．２４）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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