α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼを使用する赤血球Ａ、ＢおよびＡＢの変換
【課題】本発明は、血液製剤中における血液型群Ａ、Ｂ、およびＡＢに反応性の細胞からＡ型抗原およびＢ型抗原の酵素的除去、それによって、これらを非Ａおよび非Ｂ反応性細胞に変換することに関する。
【解決手段】本発明はさらに、血液型群Ａ抗原および血液型群Ｂ抗原を除去するための免疫的に優勢なモノサッカリドを除去するためのすばらしい速度論的特性および赤血球の酵素的変換における高性能を有する特定のＮ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼの使用に関する。
【解決手段】本発明はさらに、血液型群Ａ抗原および血液型群Ｂ抗原を除去するための免疫的に優勢なモノサッカリドを除去するためのすばらしい速度論的特性および赤血球の酵素的変換における高性能を有する特定のＮ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、血液産物中の血液型群Ａ、Ｂ、およびＡＢ反応性細胞からＡ型抗原およびＢ型抗原を酵素的に除去し、それによってこれらを非Ａ反応性細胞および非Ｂ反応性細胞に変換することに関する。特に、本発明は、血液型群Ａ抗原およびＢ抗原を特定する免疫優先的モノサッカリド（単糖）（すなわち、それぞれ、α１，３−Ｄ−ガラクトースおよびα１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン）の酵素的除去に関する。より詳細には、本発明は、血液型群Ａ抗原およびＢ抗原の免疫優先的モノサッカリドの除去について優勢な動力学的特性ならびに赤血球の酵素的変換において改善された性能を有する、特有のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼの使用に関する。具体的には、好ましい特有のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼは、以下の特性を示す：（ｉ）単一のモノサッカリド構造およびジサッカリド構造ならびにこれらのアグリコン誘導体に関する測定可能な活性に比べて、Ａ型分枝鎖ポリサッカリド構造およびＢ型分枝鎖ポリサッカリド構造に対する、排他的な基質特異性、好ましい基質特異性または１０％以上の基質特異性；（ｉｉ）血液型群オリゴサッカリド（オリゴ糖）との中性ｐＨにおける最適な性能および細胞の酵素的変換における最適な性能；ならびに（ｉｉｉ）モノサッカリド基質およびオリゴサッカリド基質との好ましい動力学的定数（Ｋｍ）。本発明はさらに、標準的血液バンクの血清学的型別および交差一致分析によって決定された、Ａ型、Ｂ型およびＡＢ型細胞のＡ抗原およびＢ抗原を完全に除去することにおける、これらの特有のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼの使用についての方法に関する。より詳細には、本発明は、以前に使用されたより有意に低い量の組換えグリコシダーゼ酵素タンパク質を使用し、そして全ての血液型群Ａ赤血球および血液型群Ｂ赤血球の完全なセロコンバージョンを得る、細胞の変換方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本明細書中で使用される場合、用語「血液産物」は、血液（成熟赤血球（赤血球）および血小板）に由来する、全血および細胞性成分を含む。
【０００３】
３０を超える血液型（血液型群）（ｇｒｏｕｐ）（または型（ｔｙｐｅ））系が、存在し、これらのうち最も重要な１つは、ＡＢＯ系である。この系は、抗原Ａおよび／または抗原Ｂの存在または非存在に基づく。これらの抗原は、成熟赤血球および血小板の表面ならびに内皮細胞およびほとんどの上皮細胞の表面に見い出される。輸血に使用される主要な血液産物は、成熟赤血球であり、これは、ヘモグロビンを含む赤血球であり、この主な機能は、酸素の輸送である。Ａ型の血液は、その成熟赤血球上に抗原Ａを含む。同様に、Ｂ型の血液は、その成熟赤血球上に抗原Ｂを含む。ＡＢ型の血液は、両方の抗原を含み、Ｏ型の血液は、どちらの抗原も含まない。
【０００４】
血液型群構造は、糖タンパク質および糖脂質であり、そしてかなりの研究が、Ａ決定基（または抗原）およびＢ決定基（または抗原）をつくる特定の構造を同定するためになされてきた。ＡＢＨ血液型群は、炭水化物鎖の末端でのモノサッカリドの性質および結合によって決定される。炭水化物鎖は、ペプチド骨格（糖タンパク質）または脂質（グリコスフィンゴリピド）骨格に結合され、これらは、細胞の細胞膜に結合される。Ａ型特異性を決定する免疫優先的モノサッカリドは、末端のα１−３結合Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であるのに対して、Ｂ型特異性の対応するモノサッカリドは、α１−３結合ガラクトース（Ｇａｌ）である。Ｏ型細胞は、オリゴサッカリド鎖の末端のこれらのモノサッカリドのいずれも欠き、これは、代わりとして、α１−２結合フコース（Ｆｕｃ）残基で終結する。
【０００５】
血液型群ＡＢＨ炭水化物構造の非常に大きな多様性は、ＡＢＨ免疫優先的サッカリドを保有するオリゴサッカリド鎖における構造のバリエーションに起因して見出される。表１は、男性において報告された構造であり、ヒト赤血球、または血液抽出物において見出される構造を列挙する。概説については、Ｃｌａｕｓｅｎ ＆ Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｖｏｘ
Ｓａｎｇ ５６（１）：１−２０，１９８９を参照のこと。赤血球は、Ｎ−結合型糖タンパク質およびグリコスフィンゴリピド上にＡＢＨ抗原を含むのに対して、一般的に、成熟赤血球の糖タンパク質（主に、グリコホリン）は、シアル酸によって終結するが、ＡＢＨ抗原では終結しないと考えられている。１型鎖グリコスフィンゴリピドは、赤血球の内因性生成物ではなく、血漿から吸着されたものである。
【０００６】
（表Ｉ：ヒト細胞の組織−血液型群ＡＢＨ免疫反応性決定基１）
【０００７】
【表１−１】
【０００８】
【表１−２】
【０００９】
【表１−３】
【００１０】
１ＣｌａｕｓｅｎおよびＨａｋｏｍｏｒｉ，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ５６（１）：１−２０，１９８９を改変。記号：「クエスチョンマーク」は、現在まで報告されなかった潜在的な糖脂質構造を示す。
【００１１】
血液型群ＡおよびＢには、いくつかの亜型が存在する。血液型群Ａは、最も頻繁に存在し、そして血液型Ａとして３つの認識される主要な亜型が存在する。これらの亜型は、Ａ１、Ａ中間体（Ａｉｎｔ）およびＡ２として公知である。これらの３つの亜型を区別する、定量的相違および定性的相違が存在する。定量的に、Ａ１成熟赤血球は、Ａｉｎｔ成熟赤血球より多くの抗原性Ａ部位（すなわち、末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基）を有し、このＡｉｎｔ成熟赤血球は、次いで、Ａ２成熟赤血球より多くの抗原性Ａ部位を有する。定性的には、Ａ１成熟赤血球は、部分集団のグリコスフィンゴリピドに二重反復Ａ構造を有するが、一方Ａ２成熟赤血球は、類似する部分集団の糖脂質において内部Ａ構造上のＨ構造を有する（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２（４）：１１９９−２０３，１９８５，Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８０−７，１９８６）。Ａ１亜型と弱いＡ亜型との間のこれらの差異は、Ａ抗原の形成を担う血液型型Ａアイソザイム改変体の動力学的特性における差異に関すると考えられる（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８８−９２，１９８６）。Ｂ型亜型の差異は、定量的性質のみであると考えられる。
【００１２】
Ａ型血液は、抗原Ｂに対する抗体を含む。逆に、Ｂ型血液は、抗原Ａに対する抗体を含む。ＡＢ型血液は、いずれの抗体も含まず、Ｏ型血液は、両方を含む。これらおよび他の炭水化物規定血液型群抗原に対する抗体は、関連する炭水化物構造を保有する微生物的生物に連続的に曝露されることによって惹起されると考えられる。抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体のいずれか（または両方）を含む個々の全血は、対応する不適合性抗原を含む血液の輸血を受容し得ない。個体が、不適合性基の血液の輸血を受容する場合、輸血患者の抗体は、輸血された不適合性基の赤血球を覆い、そして輸血赤血球を凝集または一緒に粘着させる。輸血反応および／または溶血（赤血球の破壊）は、これらから生じ得る。
【００１３】
赤血球凝集、輸血反応および溶血を避けるために、輸血型は、輸血レシピエントの血液型に対して交差試験される。例えば、血液型Ａレシピエントは、適合性抗原を含む、Ａ型血液で安全に輸血される。Ｏ型血液は、Ａ抗原もＢ抗原も含まないので、これは、任意の血液型を有する任意のレシピエント（すなわち、血液型（Ａ、Ｂ、ＡＢまたはＯ）を有するレシピエント）に輸血され得る。従って、Ｏ型血液は、「万能」であると考えられ、そして全ての輸血について使用され得る。それ故、大量のＯ型血液を維持することが血液バンクにとって望ましい。しかし、血液型Ｏのドナーは、不十分である。従って、大量の万能血液産物を維持するために、Ａ型血液、Ｂ型血液およびＡＢ型血液中の免疫優先性Ａ抗原および免疫優先性Ｂ抗原を除去することが望ましくかつ有用である。
【００１４】
Ｏ型血液の供給を増加させる試みにおいて、特定のＡ型血液、Ｂ型血液およびＡＢ型血液をＯ型血液に変換するための方法が、開発されてきた。Ｂ型細胞のＯ型細胞への変換は、過去において達成された。しかし、より豊富なＡ型細胞の変換は、より少ない弱いＡ亜型細胞でのみ達成された。酵素変換万能Ｏ細胞の開発および使用に対する主要な障害は、過去において、強いＡ１細胞を酵素的に変換することの失敗していた。この障害は、まだ残っている。以下に詳細に示すように、先行技術で使用された酵素および方法は、不十分であり、非実用的であり、そして／または市販されるプロセスにおいて使用し、万能Ｏ型細胞を供給するには非常に費用がかかり過ぎる。
【００１５】
（Ｂ細胞の変換：）
精製または組換えの、コーヒーマメ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）α−ガラクトシダーゼを使用するＢ型血液の酵素的変換は、１００〜２００Ｕ／ｍｌ（米国特許第４，４２７，７７７号；Ｚｈｕら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９６；３２７（２）：３２４−９；Ｋｒｕｓｋａｌｌら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０００；４０（１１）：１２９０−８）を使用して達成される。コーヒーマメα−ガラクトシダーゼの比活性は、１分間に加水分解される１μモルの基質として定義される１単位（Ｕ）を用いて、ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−Ｇａｌを使用して、３２Ｕ／ｍｇであることが報告された（Ｚｈｕら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９６；３２７（２）：３２４−９）。酵素的変換は、ｐＨ５．５で、８０〜９０％のヘマトクリットで約６ｍｇ／ｍｌの酵素を使用して実施され、そして得られた変換Ｏ細胞は、輸血実験において通常に機能し、有意な有害臨床パラメーターの観察されなかった（Ｋｒｕｓｋａｌｌら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０００；４０（１１）：１２９０−８）。以前の刊行物に加えてこのデータは、赤血球の酵素的変換が、可能であり、このような酵素群Ｂ変換Ｏ細胞（Ｂ ＥＣＯ）が、輸血医学において一致した型の未処理細胞型として十分に機能し得ることをはっきりと示す。それにも関わらず、これらの研究において使用される酵素の量は、現在の最も有効な組換え発現技術を用いてさえも、主に経済的理由で、ＥＣＯ細胞を非実用的にする。
【００１６】
約２００Ｕ／ｍｇの比活性を有する組換えＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのα−ガラクトシダーゼを用いたＢ細胞の変換のための改善されたプロトコルの請求項は、１６％ヘマトクリットにて５〜１０単位／ｍｌを用いて報告されている（米国特許第５，６０６，０４２号；同第５，６３３，１３０号；同第５，７３１，４２６号；同第６，１８４，０１７号）。このようにして用いられたＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのα−ガラクトシダーゼは、２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌであった。これは、必要とされる酵素タンパク質量の顕著な低減（５０倍〜２００倍）を表す（Ｄａｖｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，３９（３）：４７１−４８５，１９９６）。この低減は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのα−ガラクトシダーゼ（約６倍）のより高い比活性、ならびに変換および評価のために用いられる異なる方法に部分的に起因する。Ｋｒｕｓｋａｌｌら（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４０（１１）：１２９０−８，２０００）の研究において用いられた２００Ｕ／ｍｌの酵素は、８０％〜９０％ヘマトクリットでの十分な単位（約２２０ｍｌの充填細胞）変換となり、そして標準的血液銀行分類ならびにより高感度の交差適合分析によって徹底的に分析された。さらに、変換効率は、変換細胞の複数回の輸血を受けた患者における、生存率および誘導された免疫の分析によって評価された。酵素的変換を、米国特許第５，６０６，０４２号（および米国特許第５，６３３，１３０号；同第５，７３１，４２６号；同第６，１８４，０１７号）に記載されるとおりに、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのα−ガラクトシダーゼを用いて、１６％ヘマトクリットにて、ｍｌ規模で試験管において行い、そして変換効率を交差一致分析によって評価しなかった。１６％ヘマトクリットでの細胞の変換は、１０Ｕ／ｍｌを必要とし、一方、８％での変換は、５Ｕ／ｍｌを必要とした。このことは、増大したヘマトクリットでの変換が、より多くの酵素を必要とすることを示すが、より高い細胞濃度は試験されなかった。従って、Ｋｒｕｓｋａｌｌら（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０００；４０（１１）：１２９０−８）によって報告されるプロトコルと比較した、必要とされた酵素タンパク質量の低減部分は、変換に用いられる細胞の濃度（ヘマトクリット）に関連し、そしてこれは、５〜１０倍よりも高いことをを表し得るが、直接比較は、実験なしでは不可能である。米国特許第５，６０６，０４２号（および米国特許第５，６３３，１３０号；同第５，７３１，４２６号；同第６，１８４，０１７号）は、それほど酸性ではないｐＨ（好ましくはｐＨ５．８）にてクエン酸Ｎａおよびグリシンを用い、安定化のためにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の形態のさらなるタンパク質を含む、変換緩衝液における改善をさらに提供する。興味深いことに、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのα−ガラクトシダーゼのために開発された変換緩衝液は、コーヒーマメのα−ガラクトシダーゼに適用可能ではないことがわかった。Ｂ細胞の変換におけるいくつかの改善は、米国特許第５，６０６，０４２号（および米国特許第５，６３３，１３０号；同第５，７３１，４２６号；同第６，１８４，０１７号）によって提供され得るが、開示されたプロトコルを用いると、１ｍｌの充填Ｂ型赤血球につき少なくとも０．５ｍｇを超える酵素が必要とされることが明らかである。これよりも相当多量の酵素が、標準的な血液銀行分類プロトコルにおいて用いられる最も感度の高い分類手順によってＯ型細胞へと十分に変換された細胞を得るために必要とされるようである。さらに、このプロトコルは、さらなる外部タンパク質（ＢＳＡまたはヒト血清アルブミン）の導入ならびに細胞を酸性ｐＨに暴露することを必要とする。
【００１７】
これを実用的に適用可能な技術および商業的に適用可能な技術とするために、Ｂ細胞の変換におけるさらなる改善が必要とされることが上記から明らかである。必要な改善は、より効率的なα−ガラクトシダーゼ酵素を得ること含む。より効率的なα−ガラクトシダーゼ酵素は、変換が、中性ｐＨにて、外部タンパク質を添加することなく、好適に生じることを可能にする。
【００１８】
（Ａ細胞の変換：）
ＬｅｖｙおよびＡｎｉｍｏｆｆ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１７３７−４２，１９８０）は、精製されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼがＡ細胞を変換する能力を試験し、そして抗原発現における低下を見出したが、相当の血液型Ａ活性が残っていた。この酵素のさらなる研究は、αＧａｌＮＡｃ ｐ−ニトロフェニル基質を用いて４３．９２Ｕ／ｍｇの比活性を有する、明らかに均質になるまでの精製をもたらした（Ｈｓｉｅｈら，ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ，５０（２）：９１−７，２０００；ＰＣＴ出願第ＷＯ ９９／２３２１０号）。この精製された酵素は、αＧａｌＮＡｃ ｐ−ニトロフェニル基質について中性の至適ｐＨを有したが、オリゴサッカリドを用いたこの酵素の活性の研究は提示されなかった。ＥＬＩＳＡアッセイにおいてこの精製された酵素を用いたＡ２エピトープのいくらかの分解が報告されているが、この酵素は、適切な血液分類を用いてＡ２細胞の酵素変換において評価されていない。
【００１９】
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ（Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ １６５：１３９−５７，１９８４；Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ｍｅｄ Ｒｅｖ ３（３）：２０６−１２，１９８９）は、ニワトリ肝臓のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いてＡ細胞を変換することに失敗した。米国特許第４，６０９，６２７号（「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｔａｉｎ Ｓｕｂ−Ｔｙｐｅ Ａ ａｎｄ ＡＢ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ」との発明の名称）は、ＡｉｎｔおよびＡ２（Ａ２Ｂ赤血球を含む）をＨ抗原型の赤血球へと変換するためのプロセス、ならびにＡ抗原を欠くＢ型赤血球の組成物（この組成物は、処置の前に、この赤血球の表面にＡ抗原およびＢ抗原の両方を含んでいた）に関する。Ａｉｎｔ赤血球およびＡ２赤血球をＨ抗原型の赤血球へと変換するためのプロセス（これは、米国特許第４，６０９，６２７号に記載される）は、特定のサブタイプＡの赤血球またはサブタイプＡＢの赤血球を平衡化する工程、この平衡化した赤血球を、Ａ抗原をＨ抗原へと変換するに十分な期間にわたって、精製されたニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素と接触させる工程、この酵素をこの赤血球から除去する工程、およびこの赤血球を再度平衡化する工程を包含する。「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
α−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｓａｉｄ ｅｎｚｙｍｅ」との発明の名称の米国特許第６，２２８，６３１号は、ニワトリ酵素についての組換え供給源を提供する。精製されたニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよび組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓによって産生されたニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの比活性は、ｐ−ニトロフェニルαＧａｌＮＡｃを基質として用いて約５１Ｕ／ｍｇ〜約５６Ｕ／ｍｇであると報告された（Ｚｈｕら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８：４５６−６２，１９９６）。米国特許第４，６０９，６２７号における、Ａｉｎｔ細胞およびＡ２細胞についてのこの記載された変換条件は、酸性ｐＨ５．７での１８０Ｕ／ｍｌ細胞（ヘマトクリットは指定されていない）を含んでおり、そして処理された細胞は、不特定の抗Ａ試薬と凝集しなかった。このプロトコルは、３ｍｇ／ｍｌより多くの酵素タンパク質を必要とし、そしてＡ１型細胞を変換するとは報告されていない。
【００２０】
Ｈａｔａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ．２８（１）：７７−８６，１９９２）はまた、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを酸性ｐＨにて用いる、Ａ２細胞の変換を報告した。米国特許第５，６０６，０４２号（および米国特許第５，６３３，１３０号；同第５，７３１，４２６号；同第６，１８４，０１７号）は、同様の結果を開示する。
【００２１】
Ｆａｌｋら（Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２９０（２）：３１２−９１９９１，１９９１）は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ ＩＸ−７０株から精製されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが、Ｄｏｌｉｃｈｕｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓの凝集性を破壊し得ることを実証した。このことは、Ａ１細胞のＡ抗原強度が、Ａ２細胞レベルまで低減したことを示す。
【００２２】
Ｉｚｕｍｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １１１６：７２−７４，１９９２）は、Ａ１型細胞に対して、精製されたＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを試験した。凝集力価におけるいくらかの低減が、７，０００Ｕ／ｍｌ（１４０Ｕ／２０μｌ）の４％ヘマトクリットを用いて観察されたとはいえ、変換は完全ではなかった。
【００２３】
ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素が単離され、クローニングされ、そして発現された（Ｔｓｕｊｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６３：１４９８−１５０４，１９８９，Ｗａｎｇら，Ｈｕｍａｎ α−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ．Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ α−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ａ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ｃｏｍｍｏｎ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｇｅｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８５９−６６，１９９０）（米国特許第５，４９１，０７５号）。ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの至適ｐＨは３．５であり（Ｄｅａｎ ＫＪ，Ｓｗｅｅｌｅｙ ＣＣ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｓ．ＩＩ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｂ（ａｌｐｈａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：１０００１−５，１９７９）、これは、ヒトα−ガラクトシダーゼの至適ｐＨと同様である（Ｄｅａｎ Ｋ Ｊ，Ｓｗｅｅｌｅｙ Ｃ Ｃ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｓ．Ｉ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ａ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：９９９４−１００００，１９７９）。
【００２４】
Ａ型細胞、および特に、Ａ型の８０％までを構成するサブグループＡ１細胞の酵素的変換が今日まで達成されていないことが上記から明らかである。それゆえ、全ての免疫反応性Ａ抗原を除去することによってＡ型細胞を変換し得る適切な酵素を同定する必要性が当該分野において存在する。さらに、適切な変換条件（好ましくは中性ｐＨでかつさらなる外部タンパク質が必要ない変換条件）を開発する必要性が存在する。
【００２５】
（スクリーニングアッセイ：）
エキソ−グリコシダーゼの探索、同定および特徴付けのための以前の方法は、一般に、単純なモノサッカリド誘導体を基質として使用してサッカリド特異性および潜在的結合特異性を同定することを頼りとする。誘導体化されたモノサッカリド基質または稀にはオリゴサッカリド基質としては、ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）、ベンジル（Ｂｚ）、４−メチル−ウンベリフェリル（４−ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍｂｒｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）（Ｕｍｂ）、および７−アミノ−４−メチル−クマリン（ＡＭＣ）が挙げられるがこれらに限定されない。このような基質の使用は、グリコシダーゼ活性を同定するための、そして実用的に適用可能な多様な酵素供給源の大規模スクリーニングを行うための、容易で迅速でかつ安価なツールを提供する。しかし、グリコシダーゼ酵素の反応速度特性および優れた基質特異性は、このような単純な構造体を用いるアッセイにおいて必ずしも反映されないかもしれない。複雑なオリゴサッカリドおよび独特の糖結合体構造についての高い程度の特異性および／または選択的効率を有する新規の酵素が存在することもまた可能であるが、これらは、分析方法に起因して、見過ごされて認識されていないままであるかもしれない。従って、特定の複雑なオリゴサッカリドまたは糖結合体構造について最適なエキソ−グリコシダーゼを同定および選択するために、酵素供給源をスクリーニングするために用いられるアッセイにおいてこのような複雑な構造体を使用することが好適であり得る。さらに、スクリーニングするために用いられるアッセイは、好ましい反応速度特性（例えば、ｐＨ必要要件および（例えば、細胞の膜に結合した）基質についての性能）についての選択を含み得る。
【００２６】
先行技術では、血球のＢ抗原およびＡ抗原を破壊するために用いられる全てのα−ガラクトシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２２）およびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．４９）が、主にｐ−ニトロフェニルモノサッカリド誘導体を用いて同定され、そして特徴付けられている。興味深いことに、細胞上のＡ抗原およびＢ抗原の除去を試みる過去の研究において用いられた全てのα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、顕著なＤＮＡ配列類似性およびアミノ酸配列類似性によって明らかなように、進化的に相同である。従って、ヒトα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、密接に相同であり（Ｗａｎｇら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６５：２１８５９−６６，１９９０）、そして血球変換において以前に用いられた他の酵素（ニワトリ肝臓のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、真菌ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、および細菌のα−ガラクトシダーゼを含む）は、全て、顕著な配列類似性を示す。細菌のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの一次構造は、科学文献において報告されている。これらのグリコシダーゼは、配列類似性を共有するので、この酵素が関連の反応速度特性を有することが予期され得る。全ての既知のＯ−グリコシドヒドロラーゼの配列分析によって、配列分析に基づいて８５の異なるファミリーに分類され、そして上記のα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、ファミリー２７およびファミリー３６に分類される（例えば、「ＣＡＺｙ−Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ （Ｆａｍｉｌｙ ＧＨ３２）」との表題で、ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ａｚｙ／ＣＡＺＹ／ＧＨ＿３２．ｈｔｍｌに位置するウェブページを参照のこと）。これらの酵素は、維持される触媒機構を有することおよびアスパラギン酸を触媒求核試薬として用いることによって特徴付けられる（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，２６（２）：１５３−６，１９９８；ＲｙｅおよびＷｉｔｈｅｒｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，４（５）：５７３−８０，２０００）。
【００２７】
それゆえ、当該分野には、新たなα−ガラクトシダーゼ活性およびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性、ならびに対応する酵素タンパク質を同定する必要性が存在する。このような酵素が存在するならば、これらはファミリー２７およびファミリー３６には分類されないようである。なぜなら、これらは、顕著に異なる反応速度特性を有するように選択されるからである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
（発明の要旨）
本発明は、血液製剤中の血液型Ａ反応細胞、血液型Ｂ反応細胞、および血液型ＡＢ反応細胞からの、Ａ型抗原およびＢ型抗原の酵素的除去のための組成物および方法、ならびに非Ａ反応性細胞および非Ｂ反応性細胞へのこれらの変換を提供する。具体的には、本発明は、血液型Ａ抗原および血液型Ｂ抗原を指定する免疫優性モノサッカリド（すなわち、それぞれ、α１，３−Ｄ−ガラクトースおよびα１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン）の酵素的除去のための組成物および方法を提供する。したがって、本発明は、以下を提供する。
（１）血液製剤中の血液型群Ｂ反応性細胞または血液型群ＡＢ反応性細胞からＢ型抗原を除去するためα−ガラクトシダーゼであって、ここで、該α−ガラクトシダーゼは、以下の特徴：
（ｉ）単純なα−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉ）中性ｐＨでの、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドの赤血球細胞変換における活性
を有する、α−ガラクトシダーゼ。
（２）項目１に記載のα−ガラクトシダーゼであって、ここで、前記血液型群Ｂ型オリゴサッカリドが群Ｂ型テトラサッカリドである、α−ガラクトシダーゼ。
（３）項目１に記載のα−ガラクトシダーゼであって、該α−ガラクトシダーゼが、α−Ｇａｌ ｐ−ニトロフェニルモノサッカリド誘導体に関する検出可能な活性を有さない、α−ガラクトシダーゼ。
（４）配列番号１を含む、項目１に記載のα−ガラクトシダーゼ。
（５）項目１に記載のα−ガラクトシダーゼであって、該α−ガラクトシダーゼは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって４０〜８０ｋＤ領域を移動するとしてさらに特徴付けられる、α−ガラクトシダーゼ。
（６）項目１に記載のα−ガラクトシダーゼであって、Ｐ１抗原に関して検出可能な活性を有さない、α−ガラクトシダーゼ。
（７）項目１に記載のα−ガラクトシダーゼを発現することが可能な原核生物細胞系統。
（８）項目２に記載のα−ガラクトシダーゼを発現することが可能な原核生物細胞系統。
（９）項目３に記載のα−ガラクトシダーゼを発現することが可能な原核生物細胞系統。
（１０）項目４に記載のα−ガラクトシダーゼを発現することが可能な原核生物細胞系統。
（１１）項目５に記載のα−ガラクトシダーゼを発現することが可能な原核生物細胞系統。
（１２）項目６に記載のα−ガラクトシダーゼを発現することが可能な原核生物細胞系統。
（１３）血液製剤中の、血液型群Ａ型反応性細胞または血液型群ＡＢ型反応性細胞からＡ型抗原を除去するための方法であって、該方法は、以下（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）該Ａ型抗原を除去するのに十分な期間にわたって、中性ｐＨ条件下で、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素と該血液製剤を接触させる工程、ならびに
（ｂ）該血液製剤から該酵素を除去する工程であって、ここで、該α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴：
（ｉ）血液型群Ａ型反応性細胞または血液型群ＡＢ型反応性細胞から全ての検出可能なＡ型抗原を除去することが可能であること
（ｉｉ）単純なα−Ｇａｌ ＮＡｃモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ａ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有する、工程
を包含する、
方法。
（１４）Ａ型赤血球またはＡＢ型赤血球を非Ａ型赤血球に変換するための方法であって、該方法は、以下（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）該赤血球の中の該Ａ型抗原をＨ抗原に変換するのに十分な期間にわたって、中性ｐＨ条件下で、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素と該赤血球を接触させる工程、ならびに
（ｂ）該赤血球から該酵素を除去する工程であって、ここで、該α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴：
（ｉ）群Ａ型反応性細胞または群ＡＢ型反応性細胞から検出可能なＡ型抗原を除去することが可能であること
（ｉｉ）単純なα−Ｇａｌ ＮＡｃモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ａ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有する、工程
を包含する、
方法。
（１５）血液製剤中の、血液型群Ｂ型反応性細胞または血液型群ＡＢ型反応性細胞からＢ型抗原を除去するための方法であって、該方法は、以下（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）該Ｂ型抗原を除去するのに十分な期間にわたって、中性ｐＨ条件下で、α−ガラクトシダーゼ酵素と該血液製剤を接触させる工程、ならびに
（ｂ）該血液製剤から該酵素を除去する工程であって、ここで、該α−ガラクトシダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉ）の特徴：
（ｉ）単純なα−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有する、工程
を包含する、
方法。
（１６）Ｂ型赤血球またはＡＢ型赤血球を非Ｂ型赤血球に変換するための方法であって、該方法は、以下（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）該Ｂ型抗原を除去するのに十分な期間にわたって、中性ｐＨ条件下で、α−Ｎ−ガラクトシダーゼ酵素と該赤血球を接触させる工程、ならびに
（ｂ）該血液製剤から該酵素を除去する工程であって、ここで、該α−ガラクトシダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉ）の特徴：
（ｉ）単純なα−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有する、工程
を包含する、
方法。
（１７）血液製剤中の、血液型群Ａ型反応性細胞、血液型群Ｂ型反応性細胞または血液型群ＡＢ型反応性細胞からＡ型抗原およびＢ型抗原を除去するための方法であって、該方法は、以下（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）該Ａ型抗原および該Ｂ型抗原を除去するのに十分な期間にわたって、中性ｐＨ条件下で、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素およびα−ガラクトシダーゼ酵素と、該血液製剤を接触させる工程、および
（ｂ）該血液製剤から該酵素を除去する工程であって、ここで、該α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴：
（ｉ）群Ａ型反応性細胞または群ＡＢ型反応性細胞から全ての検出可能なＡ型抗原を除去することが可能であること
（ｉｉ）単純なα−Ｇａｌ ＮＡｃモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ａ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有しており、ここで、該α−ガラクトシダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉ）の特徴：
（ｉ）単純なα−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有する、工程
を包含する、
方法。
（１８）血液製剤中の血液型群Ａ、ＢまたはＡＢ反応性細胞からの、Ａ型赤血球およびＢ型赤血球を、非Ａ非Ｂ型赤血球に変換するための方法であって、該方法は、以下（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）該赤血球の中の該Ａ型抗原および該Ｂ抗原を変換するのに十分な期間にわたって、中性ｐＨ条件下で、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素およびα−ガラクトシダーゼ酵素と、該赤血球を接触させる工程、および
（ｂ）該赤血球から該酵素を除去する工程であって、ここで、該α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴：
（ｉ）群Ａ型反応性細胞および血液型群ＡＢ型反応性細胞から全ての検出可能なＡ型抗原を除去することが可能であること
（ｉｉ）単純なα−Ｇａｌ ＮＡｃモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ａ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有しており、ここで、該α−ガラクトシダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉ）の特徴：
（ｉ）単純なα−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有する、工程
を包含する、
方法。
（１９）中性条件下で、血液製剤中の血液型群Ｂ反応性細胞および血液型群ＡＢ反応性細胞からＢ型抗原を除去するのに有用なα−ガラクトシダーゼ酵素をスクリーニングおよび選択するための方法であって、該方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）中性ｐＨ条件下で、該Ｂ型群オリゴサッカリド基質と、候補α−ガラクトシダーゼ酵素を接触させ、該Ｂ型群オリゴサッカリド基質に関する、該候補酵素の活性を測定する工程、
（ｂ）中性ｐＨ条件下で、α−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と、該候補α−ガラクトシダーゼ酵素を接触させ、該Ｂ型群モノサッカリド誘導体に関する、該候補酵素の活性を測定する工程、ならびに
（ｃ）該Ｂ型群オリゴサッカリド基質に関する、該候補酵素の活性と、α−Ｇａｌモノサッカリド誘導体に関する、該候補酵素の活性とを比較する工程、
を包含し、
ここで、単純なα−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリド誘導体に関する少なくとも１０％の活性を有する、候補α−ガラクトシダーゼが、中性ｐＨ条件で、血液製剤中の血液型群Ｂ型反応性細胞および血液型群ＡＢ型反応性細胞から、Ｂ型抗原を除去するのに有用であるとして選択される、
方法。
（２０）中性ｐＨ条件下で、血液製剤中の血液型群Ｂ反応性細胞および血液型群ＡＢ反応性細胞からＡ型抗原を除去するのに有用なα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素をスクリーニングおよび選択するための方法であって、該方法は、以下の（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）中性ｐＨ条件下で、Ａ型群オリゴサッカリド基質と、候補α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を接触させ、該Ａ型群オリゴサッカリド基質に関する、該候補酵素の活性を測定する工程、
（ｂ）中性ｐＨ条件下で、α−Ｇａｌ ＮＡｃモノサッカリド誘導体と、該候補α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を接触させ、該Ａ型群モノサッカリド誘導体に関する、該候補酵素の活性を測定する工程、ならびに
（ｃ）該Ａ型群オリゴサッカリド基質に関する、該候補酵素の活性と、α−ＧａｌＮＡｃモノサッカリド誘導体に関する候補酵素の活性とを比較する工程、
を包含し、
ここで、単純なα−ＧａｌＮＡｃモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性を有する、候補α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素が、中性ｐＨ条件下で、血液製剤中の血液型群Ｂ型反応性細胞および血液型群ＡＢ型反応性細胞から、Ａ型抗原を除去するのに有用であるとして選択される、
方法。
（２１）血清変換型赤血球であって、ここで、該血清変換型赤地球は、：
（ａ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼによって、Ａ型赤血球またはＡＢ赤血球から非Ａ赤血球へと変換され、
（ｂ）Ａ結合Ｈ構造を有し、そして
（ｃ）標準的な血液銀行血清型分類によって決定されるような、検出可能なＡ型抗原を有さない、
血清変換型赤血球。
（２２）血清変換型赤血球を含む血液製剤であって、ここで、該血清変換型赤血球が：
（ａ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼによって、Ａ型赤血球またはＡＢ赤血球から非Ａ赤血球へと、変換され、
（ｂ）Ａ結合Ｈ構造を有して、そして、
（ｃ）標準的な血液銀行血清型分類によって決定されるような、検出可能なＡ型抗原を有さない、
血液製剤。
（２３）血清変換型赤血球であって、ここで、該血清変換型赤血球が：
（ａ）α−ガラクトシダーゼによって、Ｂ型赤血球またはＡＢ赤血球から非Ｂ赤血球へと変換され、
（ｂ）Ｐ１抗原を保持し、そして、
（ｃ）標準的な血液銀行血清型分類によって決定されるような、検出可能なＢ型抗原を有さない、
血清変換型赤血球。
（２４）血清変換型赤血球を含む血液製剤であって、ここで、該血清変換型赤血球は：
（ａ）α−ガラクトシダーゼによって、Ｂ型赤血球またはＡＢ赤血球から非Ｂ赤血球へと変換され、
（ｂ）Ｐ１抗原を保持し、そして、
（ｃ）標準的な血液銀行血清型分類によって決定されるような、検出可能なＢ型抗原を有さない、
血液製剤。
（２５）血清変換型赤血球であって、ここで、該血清変換型赤血球は：
（ａ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼによって、Ａ型赤血球またはＡＢ赤血球から非Ａ非Ｂ型赤血球へと変換され、
（ｂ）Ａ結合Ｈ構造を有し、
（ｃ）Ｐ１抗原を保持し、そして、
（ｄ）標準的な血液銀行血清型分類によって決定されるような、検出可能なＡ型抗原およびＢ型抗原を有さない、
血清変換型赤血球。
（２６）血清変換型赤血球を含む血液製剤であって、ここで、該血清変換型赤血球は：
（ａ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼによって、ＡＢ型赤血球から、非Ａ非Ｂ赤血球へ変換され、そして
（ｂ）Ａ結合Ｈ構造を有して、
（ｃ）Ｐ１抗原を保持し、そして、
（ｄ）標準的な血液銀行血清型分類によって決定されるような、検出可能なＡ型抗原またはＢ型抗原を有さない、
血液製剤。
（２７）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈａｔｔａｎｏｏｇｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４０７６）である、項目７に記載の系統。
（２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｐｌａｎｕｓ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４０７７）である、項目７に記載の系統。
（２９）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４０７６である、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈａｔｔａｎｏｏｇｅｎｓｉｓ。
（３０）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４０７７である、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｐｌａｎｕｓ。
（３１）前記α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼがＮＥＢ α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼである、項目１３に記載の方法。
（３２）前記α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼがＮＥＢα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼである、項目１４に記載の方法。
（３３）前記α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼがＮＥＢ α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼである、項目１７に記載の方法。
（３４）前記α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼがＮＥＢ α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼである、項目１８に記載の方法。
【００２９】
本発明の新規グルコシダーゼ酵素は、免疫優性の単糖類、αＧａｌＮＡｃおよびαＧａｌを、血液産物中の細胞表面の真性Ａ型糖質抗原および真性Ｂ型糖質抗原に近接した複合オリゴ糖標的から除去する際の使用のために、特異的に選択される。本発明の好ましいα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）の特徴を有する：（ｉ）単純なα−ＧａｌＮＡｃ単糖類誘導体と比較して、Ａ型オリゴ糖（四糖類またはそれより高次）との１０％以上の活性；および、（ｉｉ）天然のｐＨ（ｐＨ６〜８）での赤血球変換における、Ａ型オリゴ糖との活性。本発明のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、全てのＡ型群（Ａ１型群を含む）細胞の、全ての検出可能なＡ型抗原を除去する。本発明の好ましいα−ガラクトシダーゼ酵素は、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）の特徴を有する：（ｉ）単純なα−Ｇａｌ単糖類誘導体と比較して、Ｂ型オリゴ糖（四糖類またはそれより高次）との１０％以上の活性；および、（ｉｉ）天然のｐＨ（ｐＨ６〜８）での赤血球変換における、Ｂ型オリゴ糖に関する活性。本発明のα−ガラクトシダーゼ酵素は、Ｐ１抗原との検出可能な活性を有さない。より好ましいアセチルガラクトサミニダーゼ酵素およびα−ガラクトシダーゼ酵素は、細菌起源または真菌起源のものであり、それによって、原核生物および下等真核生物における、効果的かつ安価な組換え発現が可能になる。好ましい実施形態において、本発明の酵素は、ｐ−ニトロフェニル単糖類誘導体との検出可能な活性を有さない。別の好ましい実施形態において、本発明の酵素は、単糖類基質およびオリゴ糖基質との好ましい速度定数Ｋｍを有する。特に好ましいα−ガラクトシダーゼ酵素は、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、４０〜８０ｋＤの領域で移動するとしてさらに特徴付けられる。別の特に好ましいα−ガラクトシダーゼ酵素は、アミノ酸配列：Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号１）を含む。
【００３０】
別の局面において、本発明は、全ての血液型群Ａ型および血液型群Ｂ型の赤血球の完全なセロコンバージョンのための方法を提供し、この結果、Ａ型細胞、Ｂ型細胞、およびＡＢ型細胞から、Ａ型抗原およびＢ型抗原が完全に除去される。このＡ型抗原および／またはＢ型抗原の除去は、標準的な血液銀行の血清学分類または交叉分析によって、決定され得る。本発明の方法に従って、このＡ型抗原およびＢ型抗原は、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよび／またはα−ガラクトシダーゼを使用して除去され、これらの、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよび／またはα−ガラクトシダーゼは、（ｉ）単純な単糖類構造および二糖類構造ならびにアグリコン誘導体と比較して、血液型群Ａ型または血液型群Ｂ型のオリゴ糖（四糖類またはそれより高次）に対して１０％以上の活性を有し；かつ、（ｉｉ）中性のｐＨ（ｐＨ６〜８）での赤血球変換において活性である。好ましい実施形態において、これらのセロコンバージョン方法は、当該分野で公知の方法よりも、有意に低量の組換えグリコシダーゼ酵素タンパク質を使用する。これらの方法は、以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を包含する：（ａ）中性のｐＨ条件下で、抗体を除去するのに十分な時間、血液産物を酵素と接触させる工程；および（ｂ）この血液産物から酵素を除去する工程。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明は、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用して、全ての検出可能なＡ型抗原を、Ａ型赤血球およびＡＢ型赤血球（Ａ１型を含む）から除去するための方法を提供し、このα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、（ｉ）単純なα−ＧａｌＮＡｃ単糖類誘導体と比較して、血液型群Ａ型のオリゴ糖（四糖類またはそれより高次）に対して１０％以上の活性を有し；かつ、（ｉｉ）中性のｐＨ（ｐＨ６〜８）での赤血球変換において、血液型群Ａ型オリゴ糖に対して活性である。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、α−ガラクトシダーゼを使用して、検出可能な全てのＢ型抗原を、Ｂ型赤血球またはＡＢ型赤血球から除去するための方法を提供し、このα−ガラクトシダーゼは、（ｉ）単純なα−Ｇａｌ単糖類誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴ糖（四糖類またはそれより高次）に対して１０％以上の活性を有し；かつ、（ｉｉ）中性のｐＨ（ｐＨ６〜８）での赤血球変換において、血液型群オリゴ糖に対して活性である。
【００３３】
なお別の実施形態において、本発明は、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼを使用して、全ての検出可能なＡ型抗原およびＢ型抗原をＡＢ型赤血球から除去するための方法を提供し、これらの各々は、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）の１つ以上の特徴を有する：（ｉ）単純な単糖類構造および二糖類構造ならびにアグリコン誘導体と比較して、オリゴ糖構造（四糖類またはそれより高次）に対して１０％以上の活性を有し；そして（ｉｉ）中性ｐＨ（ｐＨ６〜８）での赤血球変換において、血液型群オリゴ糖に対して活性である。
【００３４】
本発明の別の局面において、セロコンバージョン赤血球が提供される。１つの実施形態において、このセロコンバージョン赤血球は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のように特徴付けられる：（ｉ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼによって、Ａ型またはＡＢ型の赤血球から非Ａ型赤血球に変換される；（ｉｉ）Ａ型関連Ｈ構造を有する；および（ｉｉｉ）標準的な血液銀行の血清学分類または交叉分析によって決定されるような、検出可能なＡ型抗原（Ａ１型抗原を含む）を有さない。別の実施形態において、このセミコンバゼーション赤血球は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のように特徴付けられる：（ｉ）α−ガラクトシダーゼによって、Ｂ型赤血球またはＡＢ型赤血球から非Ｂ型赤血球に変換される；（ｉｉ）Ｐ１型血液型群である場合、保持されたＰ１抗原性を有する；および（ｉｉｉ）標準的な血液銀行の血清学分類または交叉分析によって決定されるような、検出可能なＢ型抗原を有さない。なお別の実施形態において、このセミコンバゼーション赤血球は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のように特徴付けられる：（ｉ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミノダーゼおよびα−ガラクトシダーゼによって、ＡＢ型赤血球から非Ａ型赤血球、非Ｂ型赤血球に変換される；（ｉｉ）Ａ型関連Ｈ構造を有する；および（ｉｉｉ）Ｐ１型血液型群である場合、保持されたＰ１抗原性を有する；および（ｉｉｉ）標準的な血液銀行の血清学分類または交叉分析によって決定されるような、検出可能なＢ型抗原を有さない。
【００３５】
なお別の局面において、本発明は、上記の好ましい独自の特徴を有する酵素のスクリーニング方法および選択方法、ならびにこれらの酵素をコードする遺伝子のクローニングおよび発現に有用な精製方法およびこれらのアミノ酸の配列決定方法を提供する。これらの方法は、このような好ましい酵素を産生する細菌単離物を提供する。
【００３６】
１つの実施形態において、中性のｐＨ条件下で、血液産物中で血液型群Ｂ型反応性細胞および血液型群ＡＢ型反応性細胞からＢ型抗原を除去するために有用なα−ガラクトシダーゼ酵素をスクリーニングおよび選択するための方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を包含する：（ａ）中性のｐＨ条件下で、候補α−ガラクトシダーゼ酵素を、Ｂ型オリゴ糖基質と接触させて、この候補酵素のＢ型オリゴ糖基質に対する活性を測定する工程；（ｂ）中性の条件下で、この候補α−ガラクトシダーゼ酵素を、α−Ｇａｌ単糖類誘導体と接触させて、この候補酵素のＢ型単糖類誘導体に対する活性を測定する工程；および（ｃ）この候補酵素の、Ｂ型オリゴ糖基質およびα−Ｇａｌ単糖類誘導体に対する相対的な活性を比較する工程。単純なα−Ｇａｌ単糖類誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴ糖（四糖類またはそれより高次）に対する１０％以上の活性を有する候補体は、中性のｐＨ条件下において血液産物中で血液型群Ｂ型および血液型群ＡＢ型の反応性細胞からＢ型抗原を除去するために有用であるように選択される。
【００３７】
別の実施形態において、中性のｐＨ条件下において、血液産物中で血液型群Ａ型および血液型群ＡＢ型の反応性細胞からＡ型抗原を除去するために有用なα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素をスクリーニングおよび選択するための方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を包含する：中性のｐＨ条件下で、候補α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を、Ａ型オリゴ糖基質と接触させて、この候補酵素をＡ型オリゴ糖基質に対する活性を測定する工程；（ｂ）中性の条件下で、この候補α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を、α−ＧａｌＮＡｃ単糖類誘導体と接触させて、この候補酵素のＡ型単糖類誘導体に対する活性を測定する工程；および（ｃ）この候補酵素の、Ａ型オリゴ基質およびα−ＧａｌＮＡｃ単糖類誘導体に対する相対的な活性を比較する工程。単純なα−ＧａｌＮＡｃ単糖類誘導体と比較して、血液型群Ａ型オリゴ糖（四糖類またはそれより高次）に対する１０％以上の活性を有する候補体は、中性のｐＨ条件下において血液産物中で血液型群Ａ型および血液型群ＡＢ型の反応性細胞からＡ型抗原を除去するために有用であるように選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、異なるｐＨにおける、Ｇａｌα−ｐＮＰに関する組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼの活性を示す。１．２５μｍｏｌ（２．５ｍＭ）の基質を含む０．５ｍｌの反応容量で、アッセイを行った。反応を、２６℃にて２０分間インキュベートし、そして等量の０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）を添加することによって、クエンチした。ｐ−ニトロフェニルの放出を、ＯＤ４０５ｎｍで定量し、そしてｐＨに対してプロットした。以下の緩衝液を使用した：ｐＨ５．０および５．５：２０ｍＭ ＮａＯＡｃ；ｐＨ６．０〜８．０：２０ｍＭ ＮａＰＯ４。
【図２】図２は、異なるｐＨにおける、血液型群Ｂ型四糖ＡＭＣ基質に関する組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼの活性を示す。クエン酸ナトリウム−ＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ２．６〜７．４）およびＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ８．０）中１ｎｍｏｌの基質を含有する１０μｌの反応容量で、アッセイを行った。反応を、２６℃にて４０分間インキュベートし、３μｌの反応混合物を、ＨＰＴＬＣ上にスポットし、そしてＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）中に展開し、写真に撮った。パネルＡは、ＨＰＴＬＣ分析を示し、Ｓｔｄは、酵素を含まない基質の移動を示し；パネルＢは、スキャニングによって定量し、ｐＨに対してプロットした基質切断を示す。
【図３】図３は、異なるｐＨにおける、Ｇａｌｉｌｉ五糖（ペンタサッカリド）基質に関する組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼの活性を示す。クエン酸ナトリウム−ＮａＰＯ４緩衝液中５ｎｍｏｌの基質を含有する１０μの反応容量で、アッセイを行った。反応を、２６℃にて２０分間インキュベートし、２μｌの各反応混合物を、ＨＰＴＬＣ上にスポットし、そしてＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（３０：６０：２０）中に展開して、オルシノール噴霧によって可視化した。パネルＡは、ＨＰＴＬＣ分析を示し；パネルＢは、スキャニングによって定量し、ｐＨに対してプロットした基質切断を示す。
【図４】図４は、Ｂ型四糖ＡＭＣ基質に関する、５つの選択されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ α−ガラクトシダーゼ活性のＨＰＴＬＣ分析である。表Ｖと同様に、株の数を設定する。ＨＰＴＬＣによって評価される、２０分、１００分および１０００分の時間点を用いる時間経過に従って、アッセイを行った。標準的な二糖類、三糖類（Ｈ）、および四糖類（Ｂ）のＡＭＣ誘導体の移動を、矢印によって示す。ＮＥ、酵素コントロールなし；Ｏｒｉｇｉｎ、サンプル適用位置。２０７５番において最も顕著であった二糖類ＡＭＣ産物の出現は、汚染されたα−フコシダーゼの活性に起因する。
【図５】図５は、Ｇａｌα−ｐＮＰ基質に関する、５つの選択されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ α−ガラクトシダーゼ活性のＨＰＴＬＣ分析である。アッセイを、３０℃にて４日間行った。２２６０番の株のみが、ｐＮＰ基質に対する有意な活性を示し、２３５７番の株の抽出物中に、ガラクトースの放出は全く検出されなかった。
【図５ｂ】図５ｂは、血液型群Ａ型四糖類（パネルＡ）および血液型群Ａ型五糖類ＡＭＣ（パネルＢ）の基質に関する、５つの選択されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ α−Ｎ−ガラクトサミニダーゼ活性のＨＰＴＬＣ分析である。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ株を、表ＶＩＩにおけるような数によって同定した。１ｎｍｏｌのＡＭＣ基質、５．０μｌの選択された酵素の画分、および緩衝液（０．０５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０））を含有する１０μｌの反応物中で、アッセイを行った。反応を、３０℃にて１８０分間インキュベートし、そして２．５μｌの反応混合物を、ＨＰＴＬＣ上にスポットし、そしてＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）中に展開して、写真に撮った。三糖類（Ｈ）、および四糖類（Ａ）、七糖類（ヘプタサッカリド）および六糖類（ヘキササッカリド）（Ｈ−Ａ）のＡＭＣ誘導体の移動を、矢印によって示す。ＮＥ、酵素コントロールなし；ｒＣＨｌ−Ａｚ、組換えニワトリ肝臓Ａ−Ｚｙｍｅ；Ｏｒｉｇｉｎ、サンプル適用位置。二糖類ＡＭＣの出現は、汚染されたα−フコシダーゼの活性に起因する。
【図６】図６は、Ｓ１２クロマトグラフィーによって分離されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ ２３５７番のα−ガラクトシダーゼ酵素の分析である。Ｐｒｅ：クロマトグラフィー前のサンプル。パネルＡ：Ｂ型四糖類ＡＭＣ基質に対する活性のＨＰＴＬＣ分析。５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中１ｎｍｏｌの基質、２μｌの指向されたＳ１２画分を含有する１０μｌの容量で、３０℃にて８０分間、反応を行った。ＨＰＴＬＣを、２．５μｌで行い、そしてＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）中に展開し、乾燥し、そして写真に撮った。７〜９の画分においてα−フコシダーゼ活性を含むピーク活性領域を、プールした。意味：Ｓｔｄ、酵素を含まないＢ型四糖類ＡＭＣ基質；Ｃｏ、コーヒーマメα−ガラクトシダーゼに対するコントロール反応。パネルＢ：画分のＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥ分析。パネルＡと同じ意味。
【図７】図７は、２３５７番から精製された酵素活性のＳ１２クロマトグラフィーからプールした画分のＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥである。Ｒ−２５０は、ＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥのＰＶＤＦ膜を染色した。配列決定のために取られたタンパク質バンドを、矢印によって示す。
【図８】図８は、組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼおよび２３５７番から精製されたα−ガラクトシダーゼの基質特異性のＨＰＴＬＣ分析である。このコーヒーマメα−ガラクトシダーゼ（レーン１）は、試験した全ての基質を切断したが、２３５７番から精製されたα−ガラクトシダーゼのみが、血液型群Ｂ型四糖類を選択的に切断した。パネルＡ：Ｇａｌｉｌｉ基質（Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）；パネルＢ：Ｐｋ基質（Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＯＧｒ）；パネルＣ：Ｐ１基質（Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＧｒ）；およびパネルＤ：Ｂ基質（Ｇａｌα１−３［Ｆｕｃα１−２］Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＧｒ）。パネルＡ、Ｂ、およびＣにおけるＨＰＴＬＣを、ＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）を使用して展開し、そしてパネルＤにおけるＨＰＴＬＣを、ＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（３０：６０：１０）を使用して展開した。
【図９】図９は、種々のｐＨにおいて、血液型群Ｂ四糖ＡＭＣ基質を用いて、＃２３５７由来の精製α−ガラクトシダーゼの活性を示す。２０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０〜５．５）またはＮａＰＯ４（ｐＨ６．０〜８．０）中の１ｎｍｏｌの基質を含む１０μｌの反応容積で、アッセイを実施した。反応物を、４０分間、２６℃でインキュベーションし、３μｌの反応混合物をＨＰＴＬＣ上にスポットし、そしてＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）中で展開し、写真を撮影した。パネルＡ：ＨＰＴＬＣ分析。Ｓｔｄは、酵素なしの基質の移動を示す；パネルＢ：基質切断は、走査によって定量化され、そしてｐＨに対してプロットした。
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｓ１２クロマトグラフィーによって分離されたＢＳＡを用いてスパイクした＃２３５７由来の精製α−ガラクトシダーゼの分析を示す。パネルＡ：画分２６〜３６のＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥ分析。命名：Ｍｗ：分子量マーカー；Ｐｒｅ：クロマトグラフィーの前のサンプル。パネルＢ：Ｂ四糖ＡＭＣ基質を用いた活性のＨＰＴＬＣ分析。反応を、１ｎｍｏｌ基質、２μｌの示されたＳ１２画分を、５０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）中に含む１０μｌの容積で行った。ＨＰＴＬＣを２μｌで行い、ＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）で展開し、乾燥し、そして写真を撮影した。命名：Ｓｔｄ、酵素のないＢ四糖ＡＭＣ基質；Ｃｏ、コーヒーマメα−ガラクトシダーゼを用いるコントロール反応；Ｄ−ＡＭＣ、二糖−ＡＭＣ；Ｔｒｉ−ＡＭＣ、三糖−ＡＭＣ；Ｔｅｔｒ−ＡＭＣ、四糖−ＡＭＣ。
【図１０】図１０は、種々のｐＨにおいて、血液型群Ａ四糖ＡＭＣ基質を用いる、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの活性を示す。ｐＨ２．６〜８．０で変動する、１ｎｍｏｌのＡ−ｔｅｔｒａ、０．０５μｇ酵素、および緩衝液Ｎａ−クエン酸−ＮａＰＯ４を含む１０μｌの反応でアッセイを実施した。反応物を、４０分間、２６℃でインキュベーションし、３μｌのサンプルをＨＰＴＬＣによって分析した。パネルＡ：ＨＰＴＬＣ分析；パネルＢ：基質切断は、走査によって定量化され、そしてｐＨに対してプロットした。
【図１１】図１１は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用する、Ａ２細胞の酵素変換に対する緩衝系の影響を示す。洗浄したＡ２赤血球を、２５℃で、指定された緩衝液中の５〜２０ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（３０％細胞懸濁液）とともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって３０分および６０分に変換を評価した。
【図１２】図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用する、Ａ１細胞およびＡ２細胞の酵素変換に対する２５０ｍＭグリシン緩衝液を使用するｐＨの影響を示す。洗浄した赤血球を、２５℃で、２５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）中の７．５ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（３０％細胞懸濁液）とともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって３０分および６０分に変換を評価した。
【図１３】図１３は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用する、Ａ１細胞の酵素変換に対するグリシン緩衝液濃度の影響を示す。洗浄した赤血球を、２５℃で、１００〜４００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ７．０）中の７．５ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（３０％細胞懸濁液）とともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって３０分および６０分に変換を評価した。
【図１４】図１４は、Ａ１細胞およびＡ２細胞の酵素変換に対するＥ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの濃度の影響を示す。洗浄した赤血球を、２５℃で、２５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ７．０）中の５〜５０ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（３０％細胞懸濁液）とともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって３０分および６０分に変換を評価した。
【図１５】図１５は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用する、Ａ１細胞の酵素変換に対する細胞（ヘマトクリット）濃度の影響を示す。洗浄した赤血球を、２５℃で、２０〜９０％の濃度で変化させて、２５０ｍＭグリシン（ｐＨ７．０）中の２０ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼとともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって３０分および６０分に変換を評価した。
【図１６】図１６は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用する、Ａ１細胞およびＡ２細胞の酵素変換に対する反応時間の影響を示す。洗浄した赤血球を、２５℃で、１５０ｍＭグリシン（ｐＨ７．０）中の５〜５０ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（３０％細胞懸濁液）とともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって２０分、４０分、６０分および１２０分に変換を評価した。
【図１７】図１７は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用する、Ａ２細胞の酵素変換に対する温度の影響を示す。洗浄した赤血球を、１５℃、２５℃および３７℃で、２００ｍＭグリシン（ｐＨ５．５）中の１〜１０ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（３０％細胞懸濁液）とともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって２０分、４０分、および６０分に変換を評価した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、血液型群ＡおよびＢの構造に対する好ましい特異性および中性ｐＨにおける血球の酵素変換における好ましい性能を用いる、新規なα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼについてのスクリーニングおよび選択ストラテジーの開発および適用に関する。表１は、血球において見出されるＡ抗原およびＢ抗原の複合体構造を列挙する。これらの複合体構造を用いる既存のグリコシダーゼの速度論的特性の定量的研究は、報告されていない。これは、これらの化合物を天然の供給源から得ることの困難性に一部起因し、そして有機化学によってこのような複合体オリゴ糖を合成することに関する困難性および時間のかかることに一部起因する。
【００４０】
本発明の目的のために、血液型群ＡおよびＢの活性なオリゴ糖ＡＭＣ誘導体は、合成され（構造３、６、１１、２５）、そしてそれらのＨ改変体は、上記構造からのαＧａｌまたはαＧａｌＮＡｃの酵素的除去によって合成または産生された。さらに、構造３、６、２１および２５を有するグリコスフィンゴリピドは、ヒト赤血球から精製されたか、または先に記載されるように、グリコシダーゼ処理によってヒト赤血球から精製された（Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（４）：１１９９−２０３，１９８５，Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８０−７，１９８６，Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５（２２）：７０７５−８５，１９８６，Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６２（２９）：１４２２８−３４，１９８７）。ＡＭＣ誘導体またはグリコスフィンゴリピドからのαＧａｌまたはαＧａｌＮＡｃの除去を定量的に決定するための薄層クロマトグラフィーアッセイが開発された。
【００４１】
ｐ−ニトロフェニルα−ガラクトシドおよび血液型Ｂ抗原の代表として、四糖群Ｂハプテン基質（構造１１ＡＭＣ誘導体）を用いて活性を比較する、組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼの相対的比活性の本発明者らの最初の分析は、２０００倍近い顕著な差を明らかにした。従って、コーヒーマメα−ガラクトシダーゼは、先に報告される（Ｚｈｕら，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３２４：６５−７０，１９９５）ように、ｐ−ニトロフェニルα−ガラクトシドを用いてｐＨ６．５で約３０〜４０Ｕ／ｍｇの比活性を有したが、四糖群Ｂ基質を用いると、たった１７ｍＵ／ｍｇであった。従って、この酵素は、群Ｂ抗原を破壊するのに比較的不活性であり、Ｂ四糖に対して好ましい酵素は、群Ｂ基質とかなりより良い速度論的効率を示すようである。
【００４２】
ｐ−ニトロフェニル α−Ｎ−アセチルガラクトサミニン、および血液型群Ａ抗原の代表としての四糖群Ａハプテン基質（構造３ＡＭＣ誘導体）を用いた活性を比較する、組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの相対的な比活性の本発明者らの最初の分析は、１００倍を超える顕著な差を再び明らかにした。従って、先に報告されたニワトリα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、ｐ−ニトロフェニルα−Ｎ−アセチルガラクトサミニンを用いて約５０Ｕ／ｍｇ（ｐＨ３．６５）の比活性を有した（Ｚｈｕら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８：４５６−４６２，１９９６）が、四糖群Ａ基質を用いて、たった０．２Ｕ／ｍｇ（ｐＨ５．５）（０．３Ｕ／ｍｇ（ｐＨ３．６５））であった。従って、この酵素は、群Ａ抗原の破壊において相対的に非常に非効率である。
【００４３】
これらの２つの酵素が血球の酵素的変換における先端技術の性能を構成し、そしてこれらが、両方の酵素が酸性ｐＨでのみ血球変換を実施する事に加えて、細胞を変換しない（群Ａ）かまたは必要とされる酵素量に起因して実施不可能である（群Ｂ）かのいずれかであるので、血液変換における使用のための酵素の改善された速度論的特性が必要とされ、そして最初の同定のための１つの類似のストラテジーが、ｐ−ニトロフェニルおよび複合体Ａ／Ｂ基質を用いて活性の比を分析することであることが明らかである。群Ａまたは群Ｂの複合体基質の対する好ましいまたは排他的な活性を有する酵素は、血球変換においてより効率的に実行するようである。
【００４４】
群Ａ血球を変換することにおける過去の困難性は、主に、強力なＡ１亜群を変換することができないことに起因した。上記のように、群Ａ１亜群は、他の亜群よりも多いＡ抗原を有するが、グリコスフィンゴリピドの形態で繰り返しＡ構造もまた含む（表１、構造６）。Ａ２および可能なより弱い亜群はまた、Ａ拡大シリーズのグリコスフィンゴリピド（Ｈ−ＡおよびＧａｌ−Ａと指定される）（表１、構造２１、および２５）を含むが、これらは、元々、Ｃｌａｕｓｅｎら（Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（４）：１１９９−２０３，１９８５，Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８０−７，１９８６，Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５（２２）：７０７５−８５，１９８６，Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６２（２９）：１４２２８−３４，１９８７）によって記載されるように、抗Ａ抗体と反応しない。これは、過剰なα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが、上記のように分類試薬を用いて亜群Ａ２細胞型をＯとして処理したという発見によってさらに確認された。従って、亜群Ａ２と比較して、亜群Ａ１を変換することの困難性は、ある量のＡ抗原における定量的な差、Ａ１細胞のみの反復Ａグリコスフィンゴリピドの存在、またはこれらの組合せに起因し得る。群Ａ変換における使用のための好ましいα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの重要なパラメーターは、反復Ａグリコスフィンゴリピド上の末端αＧａｌＮＡｃ残基を効率的に切断する能力である。組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの効率性の分析は、Ａ２型四糖ＡＭＣ誘導体（構造３）および反復Ａ３型ＡＭＣ誘導体（構造６）の比較可能な比活性（約０．３Ｕ／ｍｇ）を明らかにした。ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが、全ての群Ａ細胞を変換しないことは、独特のＡ１構造に起因しないことが、このことから結論づけられ得る。さらに、このデータは、Ａ四糖がα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの速度論的特性および特異性を決定し、血球変換におけるそれらの性能の予測のために使用されるのに十分な構造の群Ａ（およびＢ）抗原を含むことを示し得る。
【００４５】
好ましいα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼは、中性ｐＨで最適であり、単細胞生物（例えば、細菌および酵母）における組換えタンパク質として対費用効果的に産生され得る。本発明は、ＡおよびＢの四糖ＡＭＣ誘導体基質を使用し、そして中性ｐＨでの活性を測定して、好ましい酵素活性についてのスクリーニングアッセイを開発した。さらに、活性は、複合体基質に対する優先性または排他性を有する活性を同定するために、ｐ−ニトロフェニル単糖類誘導体を使用して、活性を比較した。大きなパネルの細菌および真菌の単離物（３１００）についてのこのスクリーニングの適用は、ＡまたはＢの四糖ＡＭＣ基質を用いて測定されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼまたはα−ガラクトシダーゼの活性を発現するいくつかの細菌単離物を同定したが、対応のｐ−ニトロフェニル単糖類基質では活性レベルがないかまたは些細なレベルであった。各活性の１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｕｃｅｓ株としてこれらを血清型特徴付けおよび遺伝子型特徴付けした後に、さらに分析された。α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性を発現することが決定された株＃８の分析は、この活性が、不溶性であり、細胞塊と会合していたことを明らかにした。株＃８は、２００２年２月１４日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０７６と指定された。対照的に、α−ガラクトシダーゼ活性を発現すると決定された＃２３５７は、この活性が、可能性であり、そしてＦｒｅｎｃｈプレスの上清に見出されたことを明らかにした。株＃２３５７は、２００２年２月１４日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０７７と指定された。可溶性タンパク質を精製することはかなり単純であるので、本発明者らは、最初に、＃２３５７由来の酵素タンパク質を精製し、そして配列決定することを選ぶ。＃２３５７の活性は、Ｂ四糖基質を用いて、１０Ｕｍｇより高い比活性に精製されたが、ｐ−ニトロフェニルα−ガラクトシドを用いた活性は、検出可能でなかった。得られた調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、４０〜８０ｋＤの領域において３〜４のタンパク質バンドを明らかにした。調製物のゲル濾過分析は、４０〜８０ｋＤの分子量を示すＢＳＡと匹敵する活性の移動を示した。単一の短い配列を得た：
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号１）。
【００４６】
部分的に精製されたα−ガラクトシダーゼ活性の基質特異性の詳細な分析は、分枝Ｂ血液型群構造に対して先例のない良好な特異性を示し、そしてα１−３またはα１−４のガラクトース残基によってキャップされた線形構造が切断されなかったことを示した。ｐＨ最適の分析は、これが、５．５〜７．０であることを示した。従って、同定されたα−ガラクトシダーゼ活性は、制限された基質特異性、群Ｂ構造に対する高い比活性、およびｐＨ最適に関して、先行技術における酵素よりも非常に好ましい。
【００４７】
＃８のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性の予備的分析は、同様の特性を示したが、直鎖状構造もまた切断した。精製が困難であることに起因して、この酵素の比活性を評価することは可能でなかったが、０．１Ｕ／ｍｇでの部分的に精製した調製物でさえ、ｐ−ニトロフェニル単糖誘導体についての検出可能な活性は示さなかった。
【００４８】
２つの同定された活性および部分的に特徴付けられた活性が、性質が似ており、そして以前に報告されたあらゆるα−ガラクトシダーゼ活性およびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性とは全く異なるという知見は、独特の相同なグリコシダーゼの新規ファミリーが、用いられたスクリーニングストラテジーによって同定されることを強力に示唆した。
【００４９】
本発明者らは次いで、本発明者らの選択アッセイを用いて全ての市販のα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼのアッセイに着手し、好ましい特異性を有する酵素が入手可能であるか否かを決定した。ＡテトラサッカリドＡＭＣ誘導体およびＡヘプタサッカリドＡＭＣ誘導体について、単純なαＧａｌＮＡｃ単糖誘導体と比較して相対的に高い基質特異性を示す、１つのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＥＢのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ）が同定された。この酵素は、供給業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ，カタログ番号Ｐ０７３４Ｂ）によって、特許株に由来し、かつＥ．ｃｏｌｉにおいて発現されると開示され、そしてその基質特異性は、オリゴサッカリドからの末端α−ＧａｌＮＡｃ結合の加水分解を触媒すると記載されている。詳細には、酵素とともに供給された材料に、この基質特異性が、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミノピラノシド（ｐ−ニトロフェニルα−ＧａｌＮＡｃ）およびＡテトラサッカリドＡＭＣ基質（構造３〜構造８）を含むと開示される。本発明者らは、科学文献においても他の箇所でも、この酵素に関してさらなる情報を見出さなかった。本発明者らの基質パネルを用いてのこの酵素の反応速度特性の分析は、この酵素が、ＡテトラサッカリドＡＭＣ基質について約０．２５Ｕ／ｍｇの比活性を、そしてｐ−ニトロフェニルαＧａｌＮＡｃについて２．５Ｕ／ｍｇ未満の比活性を有すること明らかにした。さらに、この酵素は、６．０〜８．０という広い至適ｐＨを有する。この酵素は、ＡテトラサッカリドＡＭＣ基質についての中程度の優先的基質特異性しか示さず、そしてこの基質についての比活性は比較的低いが、この酵素は、血球変換において用いられるべき最適酵素の提案された特性を部分的に有し、そしてこれは細菌において発現され得る。
【００５０】
上記のように、同定されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのα−ガラクトシダーゼは、Ｂテトラサッカリド基質についての、１０Ｕ／ｍｇを超える比活性を有し、そしてこれは、中性ｐＨにて最大速度で機能する。しかし、この酵素は、血球変換におけるその性能の評価のために必要とされる量および純度では入手可能でなかった。この同定されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、同様に入手可能でなかった。このＮＥＢのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、Ａテトラサッカリド基質についてのその比活性はほんの約０．２５Ｕ／ｍｇであるとはいえ、２つの同定されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ活性と同じ同定特徴を有するので、純粋な組換え形態でのこの入手可能性は、この新たなクラスのグリコシダーゼの、血球変換における評価を可能にした。
【００５１】
それゆえ、本発明者らは、上記のスクリーニングおよび選択のストラテジーにおいて用いられるα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの提案された好ましい特性が、赤血球の酵素変換において改善された特徴を有する酵素を実際に選択したことを確認するために、Ａ型血球変換におけるＮＥＢのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの性能を試験した。このＮＥＢのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、中性ｐＨでのＡ１血球およびＡ２血球の両方の変換において顕著な効率を示した。酵素反応において３０％という固定されたヘマトクリットを用いて、変換プロセスの多数のパラメーターを分析した。好ましい緩衝液系は、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５での２００ｍＭ〜３００ｍＭのグリシンである。以下を含むがこれらに限定されないいくつかの添加物をこの緩衝液系に添加し得る：１ｍＭ〜５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ〜５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ〜１０ｍＭリン酸緩衝化クエン酸塩、０．２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および３００〜１０，０００の種々の分子量の０．１％〜１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。６０分間（３０％ヘマトクリット）において、約５ｍＵ／ｍｌのＮＥＢ α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、Ａ２細胞を変換して、そして約２０ｍＵ／ｍｌではＡ１細胞を変換して、慣用的な血液銀行試薬および手順によってＯと分類される細胞にした。増大した量の使用酵素は、変換に必要な時間の短縮をもたらした。変換された細胞は、抗Ｈ試薬とＯ細胞として反応し、そして変換された細胞の物理的パラメーターの分析は、未処理細胞と何の違いもないことを明らかにした（メトヘモグロビン、２，３ＤＰＧ、ＡＴＰおよび浸透圧ぜい弱性）。本発明者らが知る限り、これは、インタクトなＡ１型細胞の、Ｏと分類される細胞への、酵素的変換の初めての例である。
【００５２】
Ａ型細胞の変換のために必要とされる、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの量（５〜２０ｍＵ／ｍｌ）は、２０〜８０μｇ／ｍｌ酵素タンパク質に等しい。これは、先行技術においてＡ２細胞を変換するために用いられたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの量（３ｍｇ／ｍｌ）と比べてかなりの改善である。これはまた、コーヒーマメのα−ガラクトシダーゼ（８０％ヘマトクリットにて６ｍｇ／ｍｌ）またはＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのα−ガラクトシダーゼ（１６％ヘマトクリットにて５０μｇ／ｍｌ）のいずれであろうと、Ｂ細胞を変換するために用いられたα−ガラクトシダーゼの量と比較しての改善である。さらに、ＮＥＢのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いた変換を中性ｐＨにて行ったが、一方、過去の他の全ての変換は、酸性ｐＨである４．５〜５．８にて行われた。
【００５３】
それゆえ、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの性能は、上記のような基準によって定義されたとおりの、この提案された新たなクラスのエキソ−グリコシダーゼの特性が、ＡおよびＢの血球変換において改善された特性を有することを明らかに確認する。さらに、Ａ型テトラサッカリドについてのＮＥＢのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの比活性と比較して、血液型Ｂテトラサッカリド基質について４０倍以上高い比活性を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのα−ガラクトシダーゼの同定および特徴付けは、このＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ酵素が、変換において４０倍以上少ない（すなわち、反応中３０％ヘマトクリットにおいて０．５μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの）タンパク質を必要とし得ることを示す。従って、１単位のパックされた血球（約２２０ｍｌ）の変換は、０．３５ｍｇ／単位〜１．４ｍｇ／単位未満を必要とする。本発明の細菌発現技術、酵母発現技術および真菌発現技術を用いて、５ＵＳ＄／ｍｇ〜１０ＵＳ＄／ｍｇにて組換え酵素を産生することが可能である。それゆえ、血球の酵素的変換は、本発明によって提供される酵素の特性および性能を有する酵素を必要とすることが明らかである。
【００５４】
系統８および系統２３５７の両方は、２００２年２月１４日付けで、アメリカン タイプ カルチャー コレクションに寄託され、そして、これらは、それぞれ、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０７６および同 ＰＴＡ−４０７７が割り当てられた。特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約の合意の下で、ＡＴＣＣに対するこれらの寄託は行われた。特許が発行される期間の終わりの前のこの寄託物の条件のために、この保管においては、要求されたとしても、分与することはないが、サンプルを刷新する義務を本出願人は承認する。本出願人はまた、ＡＴＣＣにこの特許の発行を知らせる責任を認め、特許が発行されるときに、この寄託物は、公に利用可能となる。そのときの前に、この寄託物は、Ｃ．Ｆ．Ｒ．第３７章第１．１４節およびＵ．Ｓ．Ｃ．第３５章第１１２節に基づき、特許庁にとって利用可能である。
【実施例】
【００５５】
（使用した一般的な方法：）
７−アミノ−４−メチル−クマリン誘導体のような、一連の複雑な血液型群ＡＢＨのオリゴサッカリド構造は、表ＩＩ、表ＩＩＩおよび表ＩＶにおいて列挙されるように、アルバート ケミカル リサーチ カウンシル（Ａｌｂｅｒｔａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）によってつくられた慣習であった。他の構造が、異なる供給業者（Ｓｉｇｍａ，ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手可能であった。酵素は、これまで報告されているように（Ｚｈｕら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．８（４）：４５６−６２，１９９６，Ｚｈｕら，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２４（１）：６５−７０，１９９５）調製されるか、または指示されるような供給業者から購入された。使用した全ての試薬は、分析等級またはそれ以上のものであった。標準的な酵素アッセイを用いて様々なグリコシダーゼを以下のように実施した：
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現される組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼ：）
ｐ−ニトロフェニルモノサッカリド誘導体を用いたアッセイを、以下の２つの手順によって実施した：
ｉ）５０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を含む総容積０．５ｍｌの反応混合物中に１．２５μｍｏｌの基質を、２６℃にて、１０分間でインキュベートした。等容積の０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）を添加することによって、反応をクエンチした。遊離したｐ−ニトロフェノールの量を、ｐ−ニトロフェノールの標準曲線（０．０１μｍｏｌ〜０．１５μｍｏｌ）と比較して、４０５ｎｍの吸光度を測定することによって決定した；
ｉｉ）５０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ５．５）を含む総容積０．５ｍｌの反応混合物中の１．２５μｍｏｌ基質を、２６℃でインキュベートした。５μｌアリコートを、異なる時点（０分、５分、１５分、３０分、６０分）で採取して、生成物の発生を追跡し、そして、オルシノール染色によって可視化した。生成物の発生を、クロロホルム−メタノール−水（容積／容積／容積：６０／３５／８）中の高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）によって分析した。
【００５６】
（誘導化オリゴサッカリド基質を用いたアッセイ）
誘導化オリゴサッカリド（ＡＭＣ，ＯＧｒ）基質を用いたアッセイを、以下の手順によって実施した：
ｉｉｉ）５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を含む総容積１０μｌの反応混合物中の１（ＡＭＣ）ｎｍｏｌまたは５（ＯＧｒ）の基質を、２６℃でインキュベートした。２．５μｌ〜３．０μｌのアリコートを、異なる時点（０分、１５分、３０分、６０分）で採取して、生成物の発生を追跡した。生成物の発生を、クロロホルム−メタノール−水（容積／容積／容積：６０／３５／８）中のＨＰＴＬＣによって分析し、そして、ＵＶまたはオルシノール染色によって可視化した。
【００５７】
遊離したオリゴサッカリド基質を用いたアッセイを、以下の手順によって実施した：
ｉｖ）５ｍｍｏｌ基質を、２６℃または３０℃で３０〜１８０分間にて、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を含む１０μｌ反応容積の中でインキュベートした。生成物の発生を、クロロホルム−メタノール−水（容積／容積／容積：３０／６０／１０）中のＨＰＴＬＣによって分析し、そして、オルシノール染色によって可視化した。
【００５８】
基質に対するＫｍを決定するためのアッセイを、以下のように改変した：
ｖ）０．１〜０．５μｇの酵素を使用してαＧａｌ ｐ−ニトロフェニル基質の濃度を、５．０ｍＭから０．０４ｍＭ（５ｐｍｏｌ／１０μｌ）で変化させた。
【００５９】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現される組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ：
ｐ−ニトロフェニルモノサッカリド誘導体を用いたアッセイを、以下の２つの手順で実施した：
ｖｉ）１．２５μｍｏｌのαＧａｌＮＡｃ ｐ−ニトロフェニルモノサッカリドを、５０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２０ｍＭリン酸ナトリウムを含む試験管内で、ｐＨ２．８、３７℃にて、６０分間に亘りインキュベートした。５．０μｌのアリコートを、異なる時点（０分、１５分、３０分、６０分）で採取して、生成物の発生の速度論を追跡した。生成物の発生を、クロロホルム−メタノール−水（容積／容積／容積：６０／３５／８）中の高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）によって分析し、ｐ−アニスアルデヒドで染色し、そして、ＵＶまたはオルシノール染色によって可視化した。
【００６０】
（市販の組換えα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））：
ｖｉｉ）０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０を含む試験管中のαＧａｌＮＡｃ ｐ−ニトロフェニルモノサッカリド誘導体の出発濃度としての、０．５ｍＭを、これを等容積の緩衝液を混合することによって、続いて、２倍に希釈した。０．５μｇの酵素を、各試験管に添加し、そして、３７℃で１０分間に亘ってインキュベートした。等容量の０．２Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）を添加することによって、この反応をクエンチした。遊離したｐ−ニトロフェノールの量を、４０５ｎｍで吸光度を測定することによって決定した。
【００６１】
（実施例１：Ａ／Ｂ血液細胞変換において以前に使用された、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼの、詳細な基質特異性の特徴付け）
赤血球のＢ抗原性活性およびＡ抗原性活性を排除するために、過去において使用された最も有効なエキソグリコシダーゼは、それぞれコーヒーマメα−ガラクトシダーゼおよびニワトリ肝α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼであった。これらの酵素は、広範囲に研究されており、そして赤血球変換におけるこれらの特徴および性能は、上で参照されるように、文献および特許出願に記載されている。
【００６２】
（（ｉ）異なる基質との比活性（Ｕ／ｍｇ））
表ＩＩは、ｐ−ニトロフェニル単糖類誘導体とのこれらの酵素の報告された比活性を列挙する。１単位は、規定された最適なアッセイ条件下で１分間に１マイクロモルの基質を変換する活性として定義される。ｐ−ニトロフェニル基質を用いるアッセイを、使用した基質の１０％未満を用いて、初速度で評価した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
本発明において、精製した組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼおよびニワトリ肝α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼについて、類似の結果を得た。Ａ抗原およびＢ抗原に類似のオリゴ等基質との比活性の情報は、報告されていない。このことはおそらく、このような化合物の制限された利用可能性に起因する。本発明において、複合体Ａおよび
Ｂの構造を合成し、そして赤血球において見出されるような抗原を模倣する基質とのこれらの酵素の反応速度論的パラメータの分析は、赤血球の変換においてより良好な特性を有する新規な酵素を選択するための基準を規定する際に役立つと予測された。
【００６５】
表ＩＩＩに示されるように、これら２つの酵素の、四糖類ＡＭＣ誘導体との比活性の分析は、ｐ−ニトロフェニル単糖類誘導体を用いて得られる活性より劇的に低かった。
【００６６】
【表３】
【００６７】
１ 比活性を、以下の実施例に記載されるように、３つの時間点（２０分、４０分、および６０分）において評価した基質の約５０％および１００％の最終変換でのアッセイを使用して決定した。
【００６８】
酵母中で発現され、そして均質まで精製された組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼの比活性は、Ｇａｌα１−ｐＮＰを用いて（最適なｐＨ６．５において）３２Ｕ／ｍｇを示した。しかし、組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼの比活性は、この酵素での赤血球の酵素的変換のために使用される最適なｐＨ（ｐＨ５．５）において、血液型Ｂの四糖類−ＡＭＣ基質を用いて測定される場合に、ほんの１７ｍＵ／ｍｇ（約２０００分の１の低さ）であった（表ＩＩＩ）。
【００６９】
同様に、ニワトリ肝由来の組換えα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、非血液型Ａ構造に対する強い優先を示し、最高の活性が、非天然基質ＧａｌＮＡｃα１−ｐＮＰを用いて測定された。酵母中で発現され、そして均質まで精製された組換えニワトリα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの比活性は、最適な３．６５のｐＨにおいて、ＧａｌＮＡｃα１−ｐＮＰを用いて、約５０Ｕ／ｍｇを示し（表ＩＩ）、一方でほんの０．３Ｕ／ｍｇ（１６６分の１の低さ）が、ｐＨ３．６５において、血液型Ａ四糖類−ＡＭＣ基質を用いて測定された（表ＩＩＩ）。ｐＨ５．５における比活性は、ほんの０．２Ｕ／ｍｇ程度に低かった。
【００７０】
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．およびＰａｔｅｌｌａ ｖｕｌｇａｔａのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼについて、類似の結果が見出された（示さず）。
【００７１】
（（ｉｉ）異なる基質についてのＫｍ）
コーヒーマメα−ガラクトシダーゼおよびニワトリ肝α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの、異なる基質での報告されたミヒャエーリス−メンテン定数ＫｍおよびＶｍａｘ（ラインウィーヴァー−ブルクプロットから決定した）を、表ＩＶに示す。
【００７２】
表ＩＶ：モノサッカリド誘導体を含むα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの見かけのＫｍおよびＶｍａｘ
【００７３】
【表４】
【００７４】
１ Ｚｈｕら，（１９９５）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３２４：６５−７０、２ Ｖｏｓｎｉｄｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ ４６（１）：１７５−１８６，１９９８、 ３ Ｚｈｕら，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８：４５６−４６２．意味：ｎ．ｄ．＝決定せず。
【００７５】
本発明において、類似のＫｍ値を、組換え精製コーヒーマメα−ガラクトシダーゼおよびニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼについて得た。これらのＫｍ値は、比較的高く、そして１０〜１００倍低いＫｍを有する酵素は、抗原のほぼ完全な除去が重要であると予想される場合、赤血球変換に好ましい候補を示す。
【００７６】
従って、全ての基質を含むこれらの酵素の観察された高いＫｍは、赤血球の変換におけるこれらの酵素の乏しい性能の別の理由を示すようである。
【００７７】
Ｒ．ｔｏｒｇｕｅｓから見かけの均一性まで単離されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、ＧａｌＮＡｃα-ｐＮＰに対する５０Ｕ／ｍｇの比活性および２〜８ｍＭの
Ｋｍを有することが報告されている（Ｈｏｓｋｉｎｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７２（１２）：７９３２−９，１９９７）。この酵素は、中性ｐＨ最適条件を有するようであるが、実験は、現在まで、Ａ型細胞の効率的な酵素的変換を証明できていない（Ｈｏｓｋｉｎｓら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．４１（７）：９０８−１６，２００１）。この酵素の乏しい性能は非常に高いＫｍに関連しているようである。
【００７８】
（ｉｉｉ）異なる基質についてのｐＨ最適条件
コーヒーマメおよびダイズ（グリシンマックス）（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）のα−ガラクトシダーゼのｐＨ最適条件は、広く、そして中性のｐＨを含むことが報告されている。ｐＨ最適条件を測定するためのアッセイを、簡単な人工α−Ｇａｌモノサッカリドｐ−ニトロフェニル誘導体を用いて実施した。それにもかかわらず、これらの酵素のいずれも、中性ｐＨにおける血球変換において機能せず、そして変換は、ｐＨ５．５〜６．４においてのみ首尾良く観察された（上記の考察を参照のこと）。この現象に関する知見を提供するために、本発明者らは、コーヒーマメ酵素のｐＨ最適条件を、ｐ−ニトロフェニルガラクトースならびにオリゴサッカリド基質のＢテトラサッカリドおよびＧａｌｉｌｉペンタサッカリドを用いて分析した。図１に示されるように、単純なモノサッカリド基質を用いた場合のｐＨ最適条件は、以前に報告されたように、広く、６．４で最大活性を有した。逆に、Ｂテトラサッカリド基質を用いた場合のｐＨ最適条件は、酸性であり、図２に示されるように、３．５〜５．０で最大であった。さらに、同様の低いｐＨ最適条件が、図３に示されるように、Ｇａｌｉｌｉオリゴサッカリドの切断について観察された。
【００７９】
メリビオース、ラフィノースおよびスタキオースを用いた場合のコーヒーマメ酵素のｐＨ最適条件は、低い（３．６〜４の間）ことが報告されている（Ｚｈｕら、（１９９５）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３２４：６５−７０，ＣｏｕｒｔｏｉｓおよびＰｅｔｅｋ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３：５６５−５７１）。これは、ＢおよびＧａｌｉｌｉオリゴサッカリドについての本発明者らの知見と一致しており、このことは、酵素が一般に、天然のジサッカリドおよびオリゴサッカリドを用いた場合に低いｐＨ最適条件を有することを示唆している。
【００８０】
ｐ−ニトロフェニル基質を用いた場合の酵素のｐＨ最適条件は、人工的であり、そして天然の基質を用いた場合の酵素の特性を示すよりもむしろアグリカン（ａｇｌｙｃａｎ）の物理的特性に関連するようである。従って、本明細書中で示されるデータは、この酵素が中性のｐＨにおいて赤血球変換を行わないことについての説明を提供し得る。
【００８１】
ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、上記のように、ＧａｌＮＡｃα−ｐＮＰを使用してｐＨ３．６５のｐＨ最適条件を有することが報告された。血液型ＡテトラサッカリドＡＭＣ基質を用いた場合のこの酵素活性に対するｐＨの影響の分析は、報告されたデータと一致し、そして３．５〜４．５のｐＨ最適条件を示した（示さず）。
【００８２】
上記のように、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびコーヒーマメα−ガラクトシダーゼ酵素は、ヒトリソソーム酵素を含む大きな相同グリコシダーゼ遺伝子ファミリーのメンバーである。リソソーム酵素は、一般に、酸性ｐＨで機能し、そしてこれらの全ては、酸性ｐＨ最適条件を有すると報告されている。従って、この群と配列類似性を有する他の相同酵素は、酸性ｐＨ最適条件のこの特徴的な特性を共有するようである。従って、本発明者らは、適切な基質および中性ｐＨを使用して、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼの活性のための新たな供給源をスクリーニングすることを選択する。
【００８３】
（実施例２：中性ｐＨにおける血液型Ａおよび／または血液型Ｂの構造に対して高度に優先的または排他的な基質特異性を有するα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼの同定）
血液型Ａおよび血液型Ｂの構造に対して好ましいおよび／または排他的な特異性を有する潜在的な酵素を同定するために、真菌単離体および細菌単離体の大きなパネルを分析した。血液型Ａ／ＢテトラサッカリドＡＭＣ誘導体およびＧａｌ／ＧａｌＮＡｃα−ｐＮＰ誘導体を用いる最初のスクリーニングのためのプロトコールを開発した。簡単には、培養物の貯蔵した凍結ストックを、ＹＭ斜面培養物（管サイズ：１．８×１．８ｃｍ）に播種し、２７℃で８日間増殖させ、そしてこの培養物（胞子）を、５ｍｌの凍結剤（１０％グリセロール＋５％ラクトース）で洗い流し、次いで解離（ネジ付き管１．３×１３ｃｍ中、ガラスビーズと共に激しく回転）することにより収集した。１ｍｌの斜面培養物を、有酸素発酵のための適切な特定の培地に、７２〜９６時間かけて播種した（真菌培養について２５℃、および放線菌類培養について２８℃）。各増殖培養物の２．５ｍｌのサンプルを、約８〜１０個のガラスビーズ（サイズ＝直径３ｍｍ）を含むネジ付き管（１．３×１３ｃｍ）中で、１５分間撹拌することによって解離し、その後、クエン酸緩衝液を用いてｐＨを６．５に調整し、そしてこの解離した培養物を、管中、−２０℃で凍結した。凍結培養物を解凍し、そして上記のようにして再び解離し、そして２１００×ｇで１５分間遠心分離した。この上清は、初期アッセイのための酵素供給源として働いた。１０μｌのサンプルを、以下のように試験した：
（Ａ型およびＢ型のテトラサッカリドＡＭＣ基質を用いるアッセイ）
５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．２５ｎｍｏｌのオリゴサッカリドＡＭＣ基質および１０μｌの上記のような酵素供給源を含有する反応混合物（１０μｌ）を、３０℃でインキュベートし、そして生成物の発生を、異なる時間間隔（２０分〜４８時間）でＨＰＴＬＣによりモニタリングした。
【００８４】
（ｐ−ニトロフェニルモノサッカリド基質を用いたアッセイ）
上記のような、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、２〜５ｍＭモノサッカリドｐＮＰ基質および１０μｌ酵素供給源を含む反応混合物（２０μｌ）を、３０℃でインキュベートし、そして生成物の発生を、異なる時間間隔（２０分間〜２４時間）で、ＯＤ４０５ｎｍまたはＨＰＴＬＣによりモニターした。
【００８５】
（α−ガラクトシダーゼ活性についてのスクリーニング）
合計２４００個の単離体をスクリーニングし、そしてＢ群テトラサッカリドＡＭＣ基質との顕著な活性を有する５つの株を単離した。これらの株は、小規模発酵のために選択され、これらはＦｒｅｎｃｈプレス、（ＮＨ４）２ＳＯ４での沈殿、およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでの分離によって処理された。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分において見出された活性ピークのプールについてのさらなる分析により、（表ＶＩ）に列挙されるような、２つの基質との比活性が明らかにされた。
【００８６】
（表ＶＩ：同定された５つのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ α−ガラクトシダーゼ活性の基質特異性）
【００８７】
【表６】
【００８８】
１比活性の分析を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーからプールされた活性画分において決定した。精製を、１０，０００ｐｓｉでのＦｒｅｎｃｈプレス処理に供されたプロテアーゼインヒビター（ＰＭＳＦ、ロイペプチン、ペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｉｎ）、ＥＤＴＡ）を含むブロス（６０ｍｌ）から行った。この調製物を、１３，０００×ｇで３０分間にわたり遠心分離し、そして上清を、１５％および５０％の硫酸アンモニウム沈降によって分画した。１５〜５０％のペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に溶解し、そして０．４５μｍフィルターを通して濾過した。清澄化濾液を、５ｍｌ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｈｉ−ｔｒａｐ Ｑカラムにロードし、そしてタンパク質を、０〜０．１５Ｍ ＮａＣｌ勾配で溶出した。表示：ｎ．ｄ．決定されず。
【００８９】
５つの候補株のＢ群テトラサッカリドＡＭＣ基質を用いたＨＰＴＬＣ分析を、図４に示す。５つの株の活性は、Ｂ群テトラサッカリドＡＭＣ基質を、Ｈ トリサッカリドＡＭＣとして移動する生成物へと、そしていくつかの場合にはジサッカリドＡＭＣ誘導体へと、種々の程度で切断した。この後者は、夾雑したα−フコシダーゼ活性に起因する。
【００９０】
株２０５７および２３５７は、Ｂ群テトラサッカリド基質との最高の活性を発現した。αＧａｌ ｐ−ニトロフェニル基質との活性は、Ｂ群テトラサッカリド基質との活性と相関しなかった。精製の間に、この２つの活性は分離され得ることがさらに確認された。このことは、これらの２つの活性が、異なるタンパク質に由来したことを示す。株２３５７のみが、αＧａｌ ｐ−ニトロフェニル基質との活性を完全に欠損した。このことはさらなる分析をより容易にする。そしてこの活性を、さらなる精製および特徴付けのために選択した。＃２３５７の小規模発酵を実施し、そして酵素活性を、Ｆｒｅｎｃｈプレス（表ＶＩの説明文を参照のこと）後の溶解画分において見出した。
【００９１】
コロニー形態による株＃２３５７の血清型決定を、Ａｃｃｕｇｅｎｉｘ Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥによって実施し、これを放線菌類として確認した。５００塩基対のＳｈｏｒｔ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓによる遺伝子型決定は、株＃２３５７を、１．６０％差異で、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｐｌａｎｕｓの属に位置づけた。
【００９２】
（α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性についてのスクリーニング）
Ａ群テトラサッカリドＡＭＣ基質との顕著な活性を有する合計４つの株を同定した（表ＩＶ）。
【００９３】
（表ＶＩＩ：同定された４つのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性の基質特異性）
【００９４】
【表７】
【００９５】
１精製およびアッセイは、表ＶＩに対する説明文に記載の通り。
【００９６】
４つの候補株のＡ群テトラサッカリドＡＭＣ基質を用いたＨＰＴＬＣ分析を、図５ｂに示す。
【００９７】
Ａ群テトラサッカリド基質との顕著な活性を有する同定されたすべての株は、ｐ−ニトロフェニル誘導体とは、全くまたはほとんど検出可能なレベルの活性を示さなかった。
【００９８】
株８、１４８８、および１６４７は、Ａ群テトラサッカリド基質と最も高い活性を発現したが、＃８における活性のみが安定であり、そしてさらなる特徴付けのために回収され得た。この単離体を、さらなる分析のために選択した。小規模発酵を実施した。そして、酵素活性は、不溶性であり、そしてＦｒｅｎｃｈプレス後のペレット化画分と関連付けられることが見出された。
【００９９】
コロニー形態による株＃８の血清型決定を、Ａｃｃｕｇｅｎｉｘ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥによって実施し、これを放線菌類として確認した。５００塩基対のＳｈｏｒｔ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓによる遺伝子型決定は、株＃８を、０．００％差異で、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈａｔｔａｎｏｏｇｅｎｓｉｓの属に位置づけた。
【０１００】
上記のデータにより、この細菌が、複合的な血液型Ａ抗原およびＢ抗原の免疫優性なαＧａｌＮＡｃ残基またはαＧａｌ残基に対して独特な基質特異性を有するα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼエキソグリコシダーゼを含むことが示された。このような酵素は、赤血球において見出されるような基質に対するその高度に優先的または排他的な特異性に起因して、酵素学的な血球変換における使用に好ましいことが提案される。
【０１０１】
（実施例３：分枝血液型Ｂ抗原に対する排他的な基質特異性を有し、このような基質との予期せぬ高い比活性を有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株２３５７番から同定された新規のα−ガラクトシダーゼの単離および特徴付け）
２０リットルの発酵培養物を、フレンチプレス法により処理した。主なα−ガラクトシダーゼ活性が、１０，０００×ｇでの遠心分離後の上清に存在することを決定した。この上清を、硫酸アンモニウム沈殿により分画し、そして２０〜６０％画分に約７０％の活性を見出した。２０〜６０％カットの沈殿物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に溶解し、そして遠心分離により清澄化した。この上清を、Ｑ−セファロース（緩衝液２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０〜１．５ＭのＮａＣｌ勾配）、Ｓ−セファロース（緩衝液２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．３、０〜０．１ＭのＮａＣｌ勾配）、におけるクロマトグラフィー、およびＳ１２ゲル濾過クロマトグラフィー（０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．３、または０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ６．５）により連続的に分画した。この精製スキームを通じて、Ｂ四糖ＡＭＣ基質との酵素活性を、回収した画分においてモニタリングした。Ｇａｌα−ｐＮＰとの活性の欠如を、分離工程を通して確認した。最終的に精製した酵素活性を、ウシ血清アルブミン（標準）の溶出に類似する、分子量約７０，０００に対応して溶出したＳ１２クロマトグラフィーの画分において回収した（図６、パネルＡ）。Ｓ１２クロマトグラフィー画分のＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥ分析により、α−ガラクトシダーゼ活性を含む画分において複数のバンドが明らかになったが、ピーク活性を有する画分は、４０〜８０ｋＤの領域で移動するいくつかのバンドを含むに過ぎなかった（図６、パネルＢ）。
【０１０２】
最後のＳ１２クロマトグラフィー工程からプールした酵素ピークの比活性は、約１０Ｕ／ｍｇ（ＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥの銀染色および分子量マーカーにおけるタンパク質バンド中のタンパク質量と所望のタンパク質バンドとの比較により決定されたタンパク質）であった。ウシ血清アルブミンの溶出とこの活性の溶出を比較すると、活性がＢＳＡの後に溶出したことが明らかになった。このことは、この活性タンパク質が、ゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した場合、ＢＳＡより小さい（すなわち、６５ｋｄよりも小さい）分子サイズを有するという証拠を提供する（図９ｂ）。
【０１０３】
ピーク活性を含有するＳ１２クロマトグラフィーからプールした画分を、Ｃ４カラム（ＢｉｏＲａｄ）（緩衝液：０．１％ＴＦＡ、０〜１００％のアセトニトリル勾配）を用いた逆相クロマトグラフィーによりさらに精製した。溶出したタンパク質を、ＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥにより分析し、７０ｋＤに移動する所望のタンパク質バンドの大部分を含む画分をプールし、そして真空下で乾燥させた。プールした画分を、ＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥで再度泳動し、ＰＶＤＦ膜にブロットし、Ｒ−２５０で染色した（図７）。所望のタンパク質バンドを切り出し、そしてＭｏｄｅｌ １４０Ｃ Ｍｉｃｒｏｇｒａｄｉｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＳｙｓｔｅｍとＭｏｄｅｌ ７８５Ａ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒとを備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４９４ Ｐｒｅｃｉｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いたＮ末端配列決定に供した。以下のような単一の短い配列を得た：
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号１）。
【０１０４】
単離されたα−ガラクトシダーゼ活性は、均一に精製されていなかったので、得られた配列が、別のタンパク質に由来する可能性がある。この新規の酵素タンパク質およびそのコード遺伝子を単離および特徴付けるために、さらなる精製が必要であり、これは現在進行中である。
【０１０５】
そうであるとしても、この新規のα−ガラクトシダーゼ活性を高度に精製し、そしてこれは、Ｂ四糖を用いて、１０Ｕ／ｍｇを超える比活性を有した。この酵素調製物は、この新規の酵素の基質特異性および反応速度特性の詳細な研究を可能にした。精製された２３５７番α−ガラクトシダーゼの基質特異性を、末端α−Ｇａｌ残基を有するオリゴ糖および誘導体の大パネルを用いて特徴付けた。このアッセイを、上記のように、１〜４ｎｍｏｌの基質およびこの量のＢ四糖ＡＭＣ構造物を６０分以内に切断するのに必要とされる酵素量を用いて実施した。ＨＰＴＬＣ分析を、異なる時点で実施した。この分析の例を、図８に示す。精製された２３５７番α−ガラクトシダーゼ活性の基質特異性を、表ＶＩＩＩに要約する。
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
１表示：「＋」：切断が６０分以内に検出された、「−」：切断が、一晩のインキュベーションによって検出されなかった。直鎖三糖（トリサッカリド）およびＧａｌｉｌｉ Ｂ切断反応物を、ＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（３０：６０：１０）を用いるＨＰＴＬＣによって評価した。全ての他の切断反応物を、ＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）を用いて分析した。
【０１０８】
比較のために、組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼを、すべての分析に含めた。実施例１に記載した本発明者らの研究と一致して、コーヒーマメα−ガラクトシダーゼは、末端α−Ｇａｌ残基を含むすべての構造にて活性を示した。α１−３（血液型Ｂ、およびフコースを含まない「Ｇａｌｉｌｉエピトープ」）およびα１−４（血液型Ｐ１およびＰｋ）の両方が基質であった。そのオリゴサッカライド構造の長さまたは分枝のみが、相対的活性（すなわち、完了に達するに必要な酵素の量）に対して影響を有した（比活性のみを、Ｇａｌα ｐ−ニトロフェニルおよびＢテトラサッカライドＡＭＣについて決定した）。
【０１０９】
著しく対照的に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株＃２３５７から同定および精製した活性のみが、テトラサッカライドまたはそれより長いものとして提示された場合、血液型Ｂ構造にて活性を示す。この酵素がｐ−ニトロフェニルモノサッカライドαＧａｌ誘導体もメチル−ウンベリフリルモノサッカライドαＧａｌ誘導体も切断できないことは、モノサッカライドにて活性が欠如していることが、単にアグリカンおよび結合体化にのみ起因しないことを示した。結合化学に関連し得るトリサッカライド構造であるＧａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌ−ＡＭＣは、対応する構造Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ−ＯＧｒが基質として役立ったので、不活性であった。このこと以外は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ α−ガラクトシダーゼは、すべての分枝型Ｂ群関連構造（これは、すべて、赤血球上に見出される公知のＢ構造を示す（表１））を効率的に利用した。これは、血液型Ｂ構造に対して独特の基質特異性を示しかつヒト血液型抗原Ｐ１および希な抗原Ｐｋとの活性を示さない、最初のα−ガラクトシダーゼである。従って、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ α−ガラクトシダーゼによる赤血球の酵素的変換は、コーヒーマメα−ガラクトシダーゼ（Ｋｒｕｓｋａｌｌら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０００；４０（１１）：１２９０〜８）を含む公知のα−ガラクトシダーゼによる処理とは対照的に、インタクトなＰ１抗原性を生じる。同様に、希なＰｋ抗原は、酵素的変換後にインタクトであると予測される。白色人種集団の約８０％が、赤血球上にＰ１抗原を発現し、そしてこの抗原の機能は未知であるが、Ａ血液型抗原およびＢ血液型抗原に対してのみ抗原除去を制限することは、酵素的変換において重要な改善であると見なされる。
【０１１０】
精製Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ α−ガラクトシダーゼの至適ｐＨを、図９に示されるように分析した。ＢテトラサッカライドＡＭＣ基質との酵素活性は、５．５〜７．０付近の広範な至適ｐＨを有した。従って、この酵素は、過去に使用した酵素とは対照的に、中性ｐＨにて、赤血球変換を実施すると予測される。
【０１１１】
これは、単純なモノサッカライド誘導体を超える血液型Ｂ構造または血液型Ａ構造について包括的な基質特異性を有するかまたは好ましい基質特異性さえ有する、同定された最初のα−ガラクトシダーゼ活性またはα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性である。α−ガラクトシダーゼ酵素は、１０Ｕ／ｍｇより高い血液型Ｂ構造との比活性を有し、これは、実施例１に記載されるようなコーヒーマメα−ガラクトシダーゼについて測定された比活性より５００倍高い。この情報は、同定され特徴付けられた他のすべてのα−ガラクトシダーゼについて利用可能ではないが、これらは、コーヒーマメα−ガラクトシダーゼと同じ乏しい特性を示しそうである。なぜなら、これらは、一般には、αＧａｌ ｐ−ニトロフェニル誘導体と効率的に機能し、そしてこれらをコードする遺伝子は、相同性であるからである。従って、本発明において同定されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ α−ガラクトシダーゼは、独特であり、先行技術において先行物は存在せず、そしてこの酵素について同定された速度論特性は、酵素的Ｂ型血球変換における性能について大きな期待を保持する。
【０１１２】
（実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される組換えα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの特徴付け）
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるように開示された組換えα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（カタログ番号Ｐ０７３４Ｂ）を最近市販した。この酵素は、私有株に由来し、報告によると、オリゴサッカライドおよびαＧａｌＮＡｃ ｐ−ニトロフェニルからの末端α−ＧａｌＮＡｃ結合の加水分解を触媒する（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．カタログ情報）。市販のエキソ−グリコシダーゼのスクリーニングにおいて、本発明者らは、このα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが、αＧａｌＮＡｃモノサッカライド誘導体と比較してＡテトラサッカライドＡＭＣ誘導体およびＡヘプタサッカライドＡＭＣ誘導体と比較的高い比活性を有する好ましい特徴を部分的に示すことを見出した（表ＩＸ）。重要なことには、この酵素の血液型Ａ誘導体との絶対的比活性は、例えば、ニワトリ肝酵素とかなり異なるわけではない。しかし、モノサッカライド基質と比較した相対的活性は、かなり異なる。従って、このデータは、Ｅ．ｃｏｌｉに発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが、血液型Ａ抗原について良好な相対的特異性を有することを示唆する。
【０１１３】
（表ＩＸ：Ｅ．ｃｏｌｉに発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの比活性）
【０１１４】
【表９】
【０１１５】
１アッセイ条件は、以下の通りであった：ｐ−ニトロフェニルを用いるアッセイを、０．０５マイクロモル（１００μＭ）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５または７．０）および０．５μｇ酵素を含む、反応体積０．５ｍｌにて行った。反応を、３７℃にて１０分間インキュベートし、そして等体積の０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）を添加することによりクエンチした。ＡＭＣ基質を用いるアッセイを、１ナノモル基質（１００μＭ）、５０ｍＭリン酸ナトリウムまたは０．２５Ｍグリシン（ｐＨ５．５または７．０）、および０．０５〜０．１μｇ酵素を含む、反応体積１０μｌにて行った。反応を、２６℃または３７℃にてインキュベートし、そして０分、１５分、３０分、および６０分の時点でＨＰＴＬＣにて分析した。タンパク質定量を、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用し秤量ＢＳＡを比較物として使用する半定量によって、実施した。
【０１１６】
Ｅ．ｃｏｌｉに発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの微細な基質特異性の分析により、このＥ．ｃｏｌｉに発現されたＮ−アセチルガラクトサミニダーゼが、ニワトリ肝α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼと同様に、等しく効率的な血液型Ａおよび反復Ａ構造を使用したことが明らかになった（表ＩＸ）。
【０１１７】
末端αＧａｌＮＡｃ残基を備える一群の非フコシル化オリゴサッカライド構造を用いるさらなる分析により、この酵素が、Ａ群分枝型基質と比較してこれらの基質とほぼ等しい効率を有することが示された（表Ｘ）。
【０１１８】
（表Ｘ：Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの基質特異性）
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】
１アッセイを、１〜４ナノモルの基質（１００〜４００μＭ）、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、および０．１２５μｇの酵素を含む１０μｌの反応混合物において実施した。反応物を、３１℃でインキュベートし、そして０分、３０分、６０分、および１２０分の時点で、ＨＰＴＬＣにより分析した。
【０１２１】
Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、図１０の単糖基質およびオリゴ糖基質の両方についてｐＨ６．０〜７．０を含む広範な至適ｐＨを示した。５．５を下回る酸性のｐＨにおいて、この活性は、迅速に減少し、そしてｐＨ４．４以下では、活性は、ほとんど検出不可能である。これは、赤血球変換に特徴的な好ましい中性の至適ｐＨと共に同定された最初のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼである。
【０１２２】
α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性は、以下の緩衝液の型にほとんど影響されなかった：５０〜２５０ｍＭグリシン、０．１Ｍグリシルグリシン、２０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム、１２．５〜２５．０ｍＭクエン酸ナトリウム、１２．５〜２５．０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび５．０〜１０．０ｍＭリン酸ナトリウム、ＭｃＩｌｖｉｎｅナトリウムｐＨ５．５、ＰＢＳ、ＭＥＳ。この酵素はまた、ＮａＣｌ（０〜１５０ｍＭ）、グルタチオンおよびｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドにより影響されなかった。
【０１２３】
最後に、単糖誘導体についての速度定数Ｋｍの評価により、この酵素が、実施例１（表ＩＶ）に記載されるニワトリ肝臓のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼまたはα−ガラクトシダーゼと比較して有意に低い見かけのＫｍを有すること（表ＸＩ）が明らかになった。
【０１２４】
（表ＸＩ：Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの、単糖誘導体との見かけのＫｍおよびＶｍａｘ）
【０１２５】
【表１１】
【０１２６】
１アッセイ条件は、以下の通りであった：ｐ−ニトロフェニルを用いるアッセイを、３．９〜５０ナノモル（１．５〜１００μＭ）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５またはｐＨ７．０）、および０．５μｇの酵素を含む０．５ｍｌの反応物容量で行った。反応物を、３７℃で１０分間、インキュベートし、そして等容量の２０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）を添加することによってクエンチした。遊離ｐ−ニトロフェノールの量を、４０５ｎｍでの吸光度で測定し、ｐ−ニトロフェノールの標準曲線と比較することによって決定した。ミカエリス−メンテン定数ＫｍおよびＶｍａｘを、ラインウェーバー−バークプロットから決定した。
【０１２７】
３Ｚｈｕら、（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８：４５６−４６２。
【０１２８】
さらに、予備実験の結果は、血液型Ａのオリゴ糖基質についてのＫｍが、同様に約２０μＭであることを示す。この決定のために用いられるアッセイは、四糖（テトラサッカリド）ＡＭＣ基質（ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃ−ＡＭＣ）を用いる基質／生成物比の濃度測定走査を包含した。このアッセイは、低濃度では信頼性がなく、従って、Ｋｍは、２０μＭより低くさえあることがあり得る。
【０１２９】
要するに、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、血液型Ａの基質について相対的に高い選択性を示し、中性ｐＨで血液型Ａ基質と最大の活性を示し、そして低いＫｍにより規定される有利な速度論的特性を示す。
【０１３０】
（実施例５：従来の型決定プロトコルにより評価される、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いる、Ａ１赤血球およびＡ２赤血球からＯ表現型細胞への酵素的変換）
ヒトＡ型赤血球上の免疫優性Ａエピトープの完全な除去は、以前に、上で詳述されるように報告されていた。弱い（ｗｅａｋ）サブグループＡ２のＡ型血球の酵素的変換が、酸性のｐＨでニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いて報告されているが、変換の結果は、標準的な血液型決定手順において用いられる感度の高い型決定試薬および型決定方法により実証されなかった。以下の表ＸＩＩにおいて詳述されるように、種々の反応条件を用いるニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの能力を改善するための最初の試みは、完全に変換された細胞を産生することに失敗した。Ｄａｋｏ由来のモノクローナル抗Ａ抗体との反応性は、Ａ２細胞について破壊され得たが、一方で、より感度の高い試薬を用いる型決定は、Ａ型エピトープの酵素的分解が不完全であったことを明白に、明らかにした。
【０１３１】
（表ＸＩＩ．組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いるＡ１赤血球およびＡ２赤血球の変換１）
【０１３２】
【表１２】
【０１３３】
１ニワトリα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いる変換について用いたプロトコル：
３つの変換プロトコルを、組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いるＡ１赤血球およびＡ２赤血球について評価した。
【０１３４】
（変換プロトコル−Ａ）
ＥＤＴＡチューブに吸引しそして７日間まで４℃で保存した、Ａ２赤血球（Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４）中で３回洗浄し、そしてＰＢＳおよび７．５％ＰＥＧの溶液（ｐＨ７．４）中に１０％まで再懸濁した。細胞を、組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）を用いて、振盪しながら、３０℃で、１８０分間、処理した。細胞を、０．９％生理食塩水中で３回洗浄し、そして型決定のために生理食塩水中に３〜５％まで再懸濁した。
【０１３５】
（変換プロトコル−Ｂ）
ＥＤＴＡチューブに吸引したＡ１赤血球（Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）および白血球を減少させたＡ２赤血球（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｒｅｇｉｏｎ、Ｄｅｄｈａｍ、ＭＡ）を、ＡＡＢＢ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ、１３版、Ｍｅｔｈｏｄ６．６に従い、Ｇｌｙｃｅｒｏｌｙｔｅ５７（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ：Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）中で凍結し、そして−７０℃で保存した。酵素処理の前に、細胞を、９．０％の生理食塩水、２．５％生理食塩水、および０．９％生理食塩水を用いて脱グリセロールし（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ ＣｒｏｓｓによるＩｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＭｅｔｈｏｄｓのＭｅｔｈｏｄ １２５に従った）、ＰＢＳおよび７．５％ＰＥＧの溶液（ｐＨ７．４）中に５０％のヘマトクリットまで再懸濁し、そして組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）を添加した。反応物を、４時間にわたり撹拌しながら３７℃でインキュベートし、引き続き、０．９％生理食塩水で３回洗浄し、そして型決定のために生理食塩水中に３〜５％まで最終的に懸濁した。
【０１３６】
（変換プロトコル−Ｃ）
細胞の起源および保存は、プロトコルＢに記載したのと同様である。脱グリセロールした赤血球を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを有するＰＣＩ（ｐＨ５．５）中で２回洗浄し、そして１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＰＣＩ中に５０％ヘマトクリットまで再懸濁した。細胞を、４時間にわたり撹拌しながら３７℃で組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）で処理し、引き続き０.９％生理食塩水で３回洗浄し、そして型決定のために生理食塩水中に３〜５％まで最終的に懸濁した。
【０１３７】
表ＸＩＩのデータから、Ａ抗原の見かけ上の除去が、血液型決定手順（ＤＡＫＯ）について認可されていない１つの特定の抗血液型Ａ特異的モノクローナル抗体によって定義される場合、に達成されることが明らかである。多くのこのような抗体が存在し、そしてこれらの特異性および低い親和性結合に起因して、これらは、血清学的な型決定目的のために不適切である。従来使用されるポリクローナル抗体試薬に代わるＡＢＯの常用の型決定用のモノクローナルカクテルの開発は、１９９０年代の血液バンク産業にとって主要な成果であった。これらの高感度かつ認められた常用の型決定試薬によるＡ抗原の除去の分析は、ＤＡＫＯとは対照的に、凝集素価によって定義されるような、ごくわずかな変換しか生じない抗体を示した。この実施例において使用される型決定アッセイの詳細は、以下のとおりである：
赤血球凝集アッセイにおいて使用される認可された型決定試薬は、マウスモノクローナル抗体およびＯｒｔｈｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ；Ｇａｍｍｍａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ／Ｉｍｍｕｃｏｒ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡから入手される植物レクチンであった。非認可試薬としては、Ｄａｋｏ製のマウスモノクローナル抗Ａ抗体およびＨ．Ｃｌａｕｓｅｎによって製造される血液型Ａ改変体（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２（４）：１１９９−２０３，１９８５、Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８０−７，１９８６、Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５（２２）：７０７５−８５、１９８６、Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（２９）：１４２２８−３４，１９８７）に対するモノクローナル抗体のパネルが挙げられる。型決定試薬は、製造業者の推奨および滴定によって決定されるような他のモノクローナル抗体に従って使用された。
【０１３８】
赤血球凝集アッセイ（室温）
１．等張性血液バンク生理食塩水中の、３〜５％の洗浄された赤血球の懸濁液を調製した。
２．抗体／レクチン試薬を一滴（約５０μｌ）加えた。
３．赤血球懸濁液を一滴（約５０μｌ）加えた。
４．チューブを混合し、３５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。
５．細胞を穏やかな攪拌で再懸濁し、そして凝集について顕微試験した。
６．この凝集を、ＡＡＢＢ 技術マニュアル（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ）第１３版の方法１．８に従って、等級付けした。
【０１３９】
同様の結果を、精製したａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）製の真菌α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼで得た（示さず）。
【０１４０】
前述の実施例に記載するように、赤血球由来の血液型ＡまたはＢのエピトープを除去するのに使用するための好ましい酵素は、オリゴ糖基質が血液型ＡまたはＢの抗原と似ている、特に良好な力学的特性を有しているようである。このような好ましい力学的特性は、血液型ＡまたはＢのオリゴ糖についての好ましい基質特性または排他的な基質特性、および単糖−ｐＮＰ基質のような単純な単糖誘導体に対して低い活性を有するかまたは活性を有さないことで表され得る。好ましい力学的特性はまた、関連する基質に対する特に低いＫｍによって表され得る。さらに好ましい力学的特性は、関連する血液型活性基質に対する反応、および赤血球の品質および機能に適合する他の反応条件の中性の至適ｐＨからなる。酵素の他の好ましい特性（例えば、サイズ、電荷、溶解度、および他の物理化学的特性）はまた、赤血球の酵素変換における性能に関する。
【０１４１】
改良された力学的特性を有する新規のα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、実施例２、３、および４に記載されるように、本発明の種々の細菌株から同定された。実施例４に記載されるα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）は、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼのような一例を示し、そして、上述の好ましい特性を有する酵素は、赤血球変換における優れた性能を示すという本発明者らの仮定を試験するために、十分に精製された組換え形態で利用可能であった。
【０１４２】
中性ｐＨでの赤血球変換における、このα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの性能は、表ＸＩＩＩに示される。このα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、常用の血液バンク型決定プロトコルによってＯとして規定される細胞型に、Ａ１およびＡ２赤血球の両方を完全に変換し得た。
【０１４３】
【表１３】
【０１４４】
プロトコル：白血球が減少した（ｌｅｕｋｏ−ｒｅｄｕｃｅｄ）赤血球（Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）またはボランティアから回収される赤血球（ＡＣＤ）は、０．９％の生理食塩水中で一旦洗浄され、そして３０％のヘマトクリットまで変換緩衝液中に再懸濁された。細胞を１０〜２０ｍＵ／ｍｌ（１単位（ｕｎｉｔ）は、他に記載される標準的な反応条件を使用して、１分間で１μｍｏｌの四糖ＡＭＣを加水分解する量の酵素として定義される）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理し、そして混合しながら２５℃にて６０分間インキュベートした。処理した細胞を０．９％の生理食塩水で１度洗浄し、生理食塩水中に３〜５％で再懸濁し、上記のとおりに型決定した。
【０１４５】
中性ｐＨで、１０〜２０ｍＵのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼで処理したＡ１サブタイプおよびＡ２サブタイプの両方の赤血球は、直接的な凝集アッセイにおいて抗Ａ型試薬に対して全体的に未反応性であった。酵素処理されたＡ細胞が、レクチンＵｌｅｘ
Ｅｕｒｏｐａｅｕｓに対して、コントロールのＯ細胞と等しく反応性になるかわりに、一般的に、抗Ｈ試薬として使用される。抗Ａ１試薬として一般的に使用されるＤｏｌｉｃｈｕｓ Ｂｉｆｌｏｒｕｓに対する反応性は、処理の始めの数分間で破壊された（示さず）。
【０１４６】
表ＸＩＶに示されるα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ処理された細胞の交差試験分析によって、両方のＡ１およびＡ２酵素が、Ｏコントロール細胞として振舞ったことが確認された。
【０１４７】
（表ＸＩＶ．ＮＥＢα-Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いた、変換されたＡ１
赤血球およびＡ２赤血球の交差一致分析（ｃｒｏｓｓ ｍａｔｃｈ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＩＳ，即時スピン（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｓｐｉｎ）））
【０１４８】
【表１４】
【０１４９】
この結果は、Ｏ型の個体とＢ型の個体（彼らは、Ａ型赤血球の血液型Ａ抗原に対する抗体の種々の力価を有する）が、免疫優勢なαＧａｌＮＡｃ残基が十分に取り除かれる場合、これら細胞を認識しないことを示す。「発明の背景」の節に記載し、そしてさらに表Ｉに示されるように、この結果は、実施例４における本発明者らの分析に合致する反復性の血液型Ａ型構造を含有する、より少量の糖スフィンゴ脂質がＨ関連Ａ型構造に完全に変換されることを示す（表Ｉ、構造２１）。さらに、このＨ関連Ａ型構造が免疫系によって正常なＨ抗原として認識されることを示す。このことは、マウスにおけるこの糖脂質抗原の免疫原性についての本発明者らの以前の研究と、合致する。（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１（３）１３８０−７、１９８６；Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８８−９２、１９８９）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素単独での酵素的消化が、抗Ａ型決定試薬ならびにＯ型個体およびＢ型個体の血漿に対して、Ａ１赤血球およびＡ２赤血球を無反応性にさせるという知見は、新規であり、そして普遍的に受容可能な酵素で変換されたＯ型細胞を提供するための、商業的に実施可能な技術の開発における、重要な進歩である。酵素変換されたＢ細胞は、化学的に、Ｏ型細胞と同一であることが予測される一方、酵素変換されたＡ細胞は、Ｏ型としての表現型をとる（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）が、２つの異なる型のＨ抗原を有する。これら２つの大部分が、Ｏ型細胞上で見出される存在する２型Ｈ構造（表Ｉ、構造１８）であるが、また、マスクされたＡ型の三糖からなる内部構造を有する、少量のＨ糖脂質が存在する（表Ｉ、構造２１）。従って、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素単独で変換されたＡ型細胞は、前もって調製され、そして輸血薬中で使用された、Ｏ型細胞および任意の赤血球とは異なるが、これらは、Ｏ型細胞と同一に機能することが予測される。
【０１５０】
Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を用いた、赤血球細胞の酵素変換のパラメーターについての詳細な研究を、最適化のために実施した。ｐＨは、Ａ型四糖ＡＭＣ基質に対する酵素活性の活性に影響を与えたが、試験し、そして以下に記載したパラメーターのいずれも、この活性には有意には影響しなかった。
【０１５１】
（緩衝系）
図１１に示されるように、最適な緩衝系は、２５０ｍＭ グリシンであるようである。ＮａＰ緩衝液およびＰＣＩ緩衝液（これらは、一般的にＢ細胞の酵素的変換のために使用される）における反応は、有意な変換を生成しなかった。
【０１５２】
（グリシン緩衝液のｐＨ）
Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、実施例４で、中性ｐＨの辺りで、幅広い至適ｐＨを有することが見出された。Ａ１細胞およびＡ２細胞の酵素的変換における至適ｐＨの分析は、ｐＨ７により規定された至適を明らかにした（図１２）。弱いＡ２細胞の変換は、７．５ｍＵ／ｍｌの酵素を用いて、ｐＨ６〜８のより幅広い範囲で達成したが、より少ない酵素を使用した場合は、至適はｐＨ７にあった（示さず）。
【０１５３】
（グリシン緩衝液のモル濃度）
グリシンの濃度は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いた、Ａ型細胞の酵素変換のための重要なパラメーターであることが見出された（図１３）。最適な変換は、２５０ｍＭ〜３００ｍＭで達成された。
【０１５４】
（酵素濃度）
図１４は、Ａ１細胞およびＡ２細胞を用いた、５〜５０ｍＵ／ｍｌの、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの滴定を図示する。Ａ１がＡ２よりも多くのＡ抗原性のエピトープを有することと一致して、Ａ１細胞を変換するためにより多くの酵素を必要とする。１〜１０ｍＵの、Ａ２細胞についての酵素の滴定は、使用された条件を用いて完全に変換するのに、３ｍＵ／ｍｌを必要とすることを明らかにした（示さず）。
【０１５５】
（処理の間の細胞濃度（ヘマトクリット）の影響）
一定量の酵素（２０ｍＵ）を用いた、２０％〜９０％の濃度でのＡ１細胞の処理は、細胞濃度の増加に伴い変換効率が減少することを示した（図１５）。より高濃度の酵素では変換はより速やかに生じたが、５０％より高い細胞濃度での変換効率は、比例して向上せず、最適な変換条件が２０％〜５０％であることを示唆する。
【０１５６】
（処理時間の影響）
図１６は、変換が酵素量および時間に比例することを示す。
【０１５７】
（温度の影響）
温度２０℃〜４０℃の間での、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼのサッカリド誘導体に対する活性は、同等であることが見出され、そして図１７に示される、Ａ型細胞の変換における酵素の能力は、このことを確認した。
【０１５８】
これらの結果は、本発明において規定される好ましい特有の速度論的特性を有するこの実施例において使用されるＥ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼにより例示される、１つのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが、Ａ型細胞の酵素的変換における改善された性能を示すことを、明確に示す。Ａ１型細胞の変換（これは以前に達成されていない）を、中性のｐＨで、かつＡ２細胞およびＢ細胞を変換させるのに以前に使用された濃度より、かなり低い酵素タンパク質濃度で、好ましい酵素を用いて達成した。細胞の３０％懸濁物（ヘマトクリット）の変換のために使用された酵素量（１０〜２０ｍＵ／ｍｌ（これは３０〜６０μｇ／ｍｌに等価））は、Ａ赤血球およびＢ赤血球を酵素的に変換する先行技術において報告されている、いかなる酵素量よりも低い。
【０１５９】
本実施例において使用されるＥ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼとしてのエキソ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（これは、全てのＡ型血液構造体からのＧａｌＮＡｃを開裂することが可能である）により処理されるＡ１細胞およびＡ２細胞は、血液Ｏ型細胞上に見出されるような古典的なＨ２型鎖抗原（構造体１８、表１）を露出するが、これはまた、Ａ関連Ｈ構造体（構造体２１、表１）を有する、少量の糖脂質を残す。Ｈ２型（ＢＥ２）およびＨ３型（ＨＨ１４、ＭＢｒ−１）に対して特異的に反応するモノクローナル抗体についての研究（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８０〜７、１９８６年を参照のこと）は、予想されるように、エキソ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ処理したＡ細胞が、ＢＥ２と強く反応し、そしてＨＨ１４およびＭＢｒ−１とはより弱く反応したことを明らかにした（図示せず）。通常の血液型決定に使用される抗体を含む抗Ａ抗体は、処理細胞とは何ら反応しなかったので（表１３）、Ａ関連Ｈ糖脂質構造体は、Ａ抗原として認識されない。このことは、交差適合分析によりさらに確実となった（表１４）。Ｈ３型鎖抗体は、上記糖脂質と、Ｈ−ＧｌｏｂｏおよびムチンＨ型と称される構造体（それぞれ構造体２２および２１、表１）との間を、区別不能であるという事実に一致する（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８０〜７、１９８６年）。従って、エキソ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ処理したＡ細胞は、表現型的にＯ細胞として振る舞うが、それらは、より少ない量の特有Ｈ糖脂質抗原を有することにより、Ｏ細胞とは構造的に異なる。従って、Ｏ型として型決定する、Ａ型酵素で変換された細胞は、万能の輸血可能な血液型として非常に有用である新規な実体を構築する。
【０１６０】
実施例３において規定される新規なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ酵素は、本実施例において使用されるα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼと比較して３０倍以上の特性を有し、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ酵素および類似の特性を有する他の酵素は、酵素的赤血球変換において、同様により良く機能すると予想される。
【０１６１】
（等価物）
当業者は、本明細書で記載される特定の手順に対する多くの等価物を認識するか、または通常の実験以上のものを使用せずに、確認し得る。このような等価物は、本発明の範囲内にあると考えられ、そして、添付の特許請求の範囲によって包含される。種々の置換、変更、および改変が、添付の特許請求の範囲により規定されるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に対してなされ得る。他の局面、利点、および改変は、本発明の範囲内にある。本出願の全体を通じて引用される、全ての引用文献、ＵＲＬ、発行された特許、および公開された特許出願の内容は、本明細書で参考として援用される。これらの特許、出願および他の文献の適切な構成要素、プロセス、および方法が、本発明および本発明の実施形態のために選択され得る。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、血液産物中の血液型群Ａ、Ｂ、およびＡＢ反応性細胞からＡ型抗原およびＢ型抗原を酵素的に除去し、それによってこれらを非Ａ反応性細胞および非Ｂ反応性細胞に変換することに関する。特に、本発明は、血液型群Ａ抗原およびＢ抗原を特定する免疫優先的モノサッカリド（単糖）（すなわち、それぞれ、α１，３−Ｄ−ガラクトースおよびα１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン）の酵素的除去に関する。より詳細には、本発明は、血液型群Ａ抗原およびＢ抗原の免疫優先的モノサッカリドの除去について優勢な動力学的特性ならびに赤血球の酵素的変換において改善された性能を有する、特有のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼの使用に関する。具体的には、好ましい特有のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼは、以下の特性を示す：（ｉ）単一のモノサッカリド構造およびジサッカリド構造ならびにこれらのアグリコン誘導体に関する測定可能な活性に比べて、Ａ型分枝鎖ポリサッカリド構造およびＢ型分枝鎖ポリサッカリド構造に対する、排他的な基質特異性、好ましい基質特異性または１０％以上の基質特異性；（ｉｉ）血液型群オリゴサッカリド（オリゴ糖）との中性ｐＨにおける最適な性能および細胞の酵素的変換における最適な性能；ならびに（ｉｉｉ）モノサッカリド基質およびオリゴサッカリド基質との好ましい動力学的定数（Ｋｍ）。本発明はさらに、標準的血液バンクの血清学的型別および交差一致分析によって決定された、Ａ型、Ｂ型およびＡＢ型細胞のＡ抗原およびＢ抗原を完全に除去することにおける、これらの特有のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼの使用についての方法に関する。より詳細には、本発明は、以前に使用されたより有意に低い量の組換えグリコシダーゼ酵素タンパク質を使用し、そして全ての血液型群Ａ赤血球および血液型群Ｂ赤血球の完全なセロコンバージョンを得る、細胞の変換方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本明細書中で使用される場合、用語「血液産物」は、血液（成熟赤血球（赤血球）および血小板）に由来する、全血および細胞性成分を含む。
【０００３】
３０を超える血液型（血液型群）（ｇｒｏｕｐ）（または型（ｔｙｐｅ））系が、存在し、これらのうち最も重要な１つは、ＡＢＯ系である。この系は、抗原Ａおよび／または抗原Ｂの存在または非存在に基づく。これらの抗原は、成熟赤血球および血小板の表面ならびに内皮細胞およびほとんどの上皮細胞の表面に見い出される。輸血に使用される主要な血液産物は、成熟赤血球であり、これは、ヘモグロビンを含む赤血球であり、この主な機能は、酸素の輸送である。Ａ型の血液は、その成熟赤血球上に抗原Ａを含む。同様に、Ｂ型の血液は、その成熟赤血球上に抗原Ｂを含む。ＡＢ型の血液は、両方の抗原を含み、Ｏ型の血液は、どちらの抗原も含まない。
【０００４】
血液型群構造は、糖タンパク質および糖脂質であり、そしてかなりの研究が、Ａ決定基（または抗原）およびＢ決定基（または抗原）をつくる特定の構造を同定するためになされてきた。ＡＢＨ血液型群は、炭水化物鎖の末端でのモノサッカリドの性質および結合によって決定される。炭水化物鎖は、ペプチド骨格（糖タンパク質）または脂質（グリコスフィンゴリピド）骨格に結合され、これらは、細胞の細胞膜に結合される。Ａ型特異性を決定する免疫優先的モノサッカリドは、末端のα１−３結合Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であるのに対して、Ｂ型特異性の対応するモノサッカリドは、α１−３結合ガラクトース（Ｇａｌ）である。Ｏ型細胞は、オリゴサッカリド鎖の末端のこれらのモノサッカリドのいずれも欠き、これは、代わりとして、α１−２結合フコース（Ｆｕｃ）残基で終結する。
【０００５】
血液型群ＡＢＨ炭水化物構造の非常に大きな多様性は、ＡＢＨ免疫優先的サッカリドを保有するオリゴサッカリド鎖における構造のバリエーションに起因して見出される。表１は、男性において報告された構造であり、ヒト赤血球、または血液抽出物において見出される構造を列挙する。概説については、Ｃｌａｕｓｅｎ ＆ Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｖｏｘ
Ｓａｎｇ ５６（１）：１−２０，１９８９を参照のこと。赤血球は、Ｎ−結合型糖タンパク質およびグリコスフィンゴリピド上にＡＢＨ抗原を含むのに対して、一般的に、成熟赤血球の糖タンパク質（主に、グリコホリン）は、シアル酸によって終結するが、ＡＢＨ抗原では終結しないと考えられている。１型鎖グリコスフィンゴリピドは、赤血球の内因性生成物ではなく、血漿から吸着されたものである。
【０００６】
（表Ｉ：ヒト細胞の組織−血液型群ＡＢＨ免疫反応性決定基１）
【０００７】
【表１−１】
【０００８】
【表１−２】
【０００９】
【表１−３】
【００１０】
１ＣｌａｕｓｅｎおよびＨａｋｏｍｏｒｉ，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ５６（１）：１−２０，１９８９を改変。記号：「クエスチョンマーク」は、現在まで報告されなかった潜在的な糖脂質構造を示す。
【００１１】
血液型群ＡおよびＢには、いくつかの亜型が存在する。血液型群Ａは、最も頻繁に存在し、そして血液型Ａとして３つの認識される主要な亜型が存在する。これらの亜型は、Ａ１、Ａ中間体（Ａｉｎｔ）およびＡ２として公知である。これらの３つの亜型を区別する、定量的相違および定性的相違が存在する。定量的に、Ａ１成熟赤血球は、Ａｉｎｔ成熟赤血球より多くの抗原性Ａ部位（すなわち、末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基）を有し、このＡｉｎｔ成熟赤血球は、次いで、Ａ２成熟赤血球より多くの抗原性Ａ部位を有する。定性的には、Ａ１成熟赤血球は、部分集団のグリコスフィンゴリピドに二重反復Ａ構造を有するが、一方Ａ２成熟赤血球は、類似する部分集団の糖脂質において内部Ａ構造上のＨ構造を有する（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２（４）：１１９９−２０３，１９８５，Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８０−７，１９８６）。Ａ１亜型と弱いＡ亜型との間のこれらの差異は、Ａ抗原の形成を担う血液型型Ａアイソザイム改変体の動力学的特性における差異に関すると考えられる（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８８−９２，１９８６）。Ｂ型亜型の差異は、定量的性質のみであると考えられる。
【００１２】
Ａ型血液は、抗原Ｂに対する抗体を含む。逆に、Ｂ型血液は、抗原Ａに対する抗体を含む。ＡＢ型血液は、いずれの抗体も含まず、Ｏ型血液は、両方を含む。これらおよび他の炭水化物規定血液型群抗原に対する抗体は、関連する炭水化物構造を保有する微生物的生物に連続的に曝露されることによって惹起されると考えられる。抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体のいずれか（または両方）を含む個々の全血は、対応する不適合性抗原を含む血液の輸血を受容し得ない。個体が、不適合性基の血液の輸血を受容する場合、輸血患者の抗体は、輸血された不適合性基の赤血球を覆い、そして輸血赤血球を凝集または一緒に粘着させる。輸血反応および／または溶血（赤血球の破壊）は、これらから生じ得る。
【００１３】
赤血球凝集、輸血反応および溶血を避けるために、輸血型は、輸血レシピエントの血液型に対して交差試験される。例えば、血液型Ａレシピエントは、適合性抗原を含む、Ａ型血液で安全に輸血される。Ｏ型血液は、Ａ抗原もＢ抗原も含まないので、これは、任意の血液型を有する任意のレシピエント（すなわち、血液型（Ａ、Ｂ、ＡＢまたはＯ）を有するレシピエント）に輸血され得る。従って、Ｏ型血液は、「万能」であると考えられ、そして全ての輸血について使用され得る。それ故、大量のＯ型血液を維持することが血液バンクにとって望ましい。しかし、血液型Ｏのドナーは、不十分である。従って、大量の万能血液産物を維持するために、Ａ型血液、Ｂ型血液およびＡＢ型血液中の免疫優先性Ａ抗原および免疫優先性Ｂ抗原を除去することが望ましくかつ有用である。
【００１４】
Ｏ型血液の供給を増加させる試みにおいて、特定のＡ型血液、Ｂ型血液およびＡＢ型血液をＯ型血液に変換するための方法が、開発されてきた。Ｂ型細胞のＯ型細胞への変換は、過去において達成された。しかし、より豊富なＡ型細胞の変換は、より少ない弱いＡ亜型細胞でのみ達成された。酵素変換万能Ｏ細胞の開発および使用に対する主要な障害は、過去において、強いＡ１細胞を酵素的に変換することの失敗していた。この障害は、まだ残っている。以下に詳細に示すように、先行技術で使用された酵素および方法は、不十分であり、非実用的であり、そして／または市販されるプロセスにおいて使用し、万能Ｏ型細胞を供給するには非常に費用がかかり過ぎる。
【００１５】
（Ｂ細胞の変換：）
精製または組換えの、コーヒーマメ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）α−ガラクトシダーゼを使用するＢ型血液の酵素的変換は、１００〜２００Ｕ／ｍｌ（米国特許第４，４２７，７７７号；Ｚｈｕら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９６；３２７（２）：３２４−９；Ｋｒｕｓｋａｌｌら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０００；４０（１１）：１２９０−８）を使用して達成される。コーヒーマメα−ガラクトシダーゼの比活性は、１分間に加水分解される１μモルの基質として定義される１単位（Ｕ）を用いて、ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−Ｇａｌを使用して、３２Ｕ／ｍｇであることが報告された（Ｚｈｕら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９６；３２７（２）：３２４−９）。酵素的変換は、ｐＨ５．５で、８０〜９０％のヘマトクリットで約６ｍｇ／ｍｌの酵素を使用して実施され、そして得られた変換Ｏ細胞は、輸血実験において通常に機能し、有意な有害臨床パラメーターの観察されなかった（Ｋｒｕｓｋａｌｌら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０００；４０（１１）：１２９０−８）。以前の刊行物に加えてこのデータは、赤血球の酵素的変換が、可能であり、このような酵素群Ｂ変換Ｏ細胞（Ｂ ＥＣＯ）が、輸血医学において一致した型の未処理細胞型として十分に機能し得ることをはっきりと示す。それにも関わらず、これらの研究において使用される酵素の量は、現在の最も有効な組換え発現技術を用いてさえも、主に経済的理由で、ＥＣＯ細胞を非実用的にする。
【００１６】
約２００Ｕ／ｍｇの比活性を有する組換えＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのα−ガラクトシダーゼを用いたＢ細胞の変換のための改善されたプロトコルの請求項は、１６％ヘマトクリットにて５〜１０単位／ｍｌを用いて報告されている（米国特許第５，６０６，０４２号；同第５，６３３，１３０号；同第５，７３１，４２６号；同第６，１８４，０１７号）。このようにして用いられたＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのα−ガラクトシダーゼは、２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌであった。これは、必要とされる酵素タンパク質量の顕著な低減（５０倍〜２００倍）を表す（Ｄａｖｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，３９（３）：４７１−４８５，１９９６）。この低減は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのα−ガラクトシダーゼ（約６倍）のより高い比活性、ならびに変換および評価のために用いられる異なる方法に部分的に起因する。Ｋｒｕｓｋａｌｌら（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４０（１１）：１２９０−８，２０００）の研究において用いられた２００Ｕ／ｍｌの酵素は、８０％〜９０％ヘマトクリットでの十分な単位（約２２０ｍｌの充填細胞）変換となり、そして標準的血液銀行分類ならびにより高感度の交差適合分析によって徹底的に分析された。さらに、変換効率は、変換細胞の複数回の輸血を受けた患者における、生存率および誘導された免疫の分析によって評価された。酵素的変換を、米国特許第５，６０６，０４２号（および米国特許第５，６３３，１３０号；同第５，７３１，４２６号；同第６，１８４，０１７号）に記載されるとおりに、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのα−ガラクトシダーゼを用いて、１６％ヘマトクリットにて、ｍｌ規模で試験管において行い、そして変換効率を交差一致分析によって評価しなかった。１６％ヘマトクリットでの細胞の変換は、１０Ｕ／ｍｌを必要とし、一方、８％での変換は、５Ｕ／ｍｌを必要とした。このことは、増大したヘマトクリットでの変換が、より多くの酵素を必要とすることを示すが、より高い細胞濃度は試験されなかった。従って、Ｋｒｕｓｋａｌｌら（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０００；４０（１１）：１２９０−８）によって報告されるプロトコルと比較した、必要とされた酵素タンパク質量の低減部分は、変換に用いられる細胞の濃度（ヘマトクリット）に関連し、そしてこれは、５〜１０倍よりも高いことをを表し得るが、直接比較は、実験なしでは不可能である。米国特許第５，６０６，０４２号（および米国特許第５，６３３，１３０号；同第５，７３１，４２６号；同第６，１８４，０１７号）は、それほど酸性ではないｐＨ（好ましくはｐＨ５．８）にてクエン酸Ｎａおよびグリシンを用い、安定化のためにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の形態のさらなるタンパク質を含む、変換緩衝液における改善をさらに提供する。興味深いことに、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのα−ガラクトシダーゼのために開発された変換緩衝液は、コーヒーマメのα−ガラクトシダーゼに適用可能ではないことがわかった。Ｂ細胞の変換におけるいくつかの改善は、米国特許第５，６０６，０４２号（および米国特許第５，６３３，１３０号；同第５，７３１，４２６号；同第６，１８４，０１７号）によって提供され得るが、開示されたプロトコルを用いると、１ｍｌの充填Ｂ型赤血球につき少なくとも０．５ｍｇを超える酵素が必要とされることが明らかである。これよりも相当多量の酵素が、標準的な血液銀行分類プロトコルにおいて用いられる最も感度の高い分類手順によってＯ型細胞へと十分に変換された細胞を得るために必要とされるようである。さらに、このプロトコルは、さらなる外部タンパク質（ＢＳＡまたはヒト血清アルブミン）の導入ならびに細胞を酸性ｐＨに暴露することを必要とする。
【００１７】
これを実用的に適用可能な技術および商業的に適用可能な技術とするために、Ｂ細胞の変換におけるさらなる改善が必要とされることが上記から明らかである。必要な改善は、より効率的なα−ガラクトシダーゼ酵素を得ること含む。より効率的なα−ガラクトシダーゼ酵素は、変換が、中性ｐＨにて、外部タンパク質を添加することなく、好適に生じることを可能にする。
【００１８】
（Ａ細胞の変換：）
ＬｅｖｙおよびＡｎｉｍｏｆｆ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１７３７−４２，１９８０）は、精製されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼがＡ細胞を変換する能力を試験し、そして抗原発現における低下を見出したが、相当の血液型Ａ活性が残っていた。この酵素のさらなる研究は、αＧａｌＮＡｃ ｐ−ニトロフェニル基質を用いて４３．９２Ｕ／ｍｇの比活性を有する、明らかに均質になるまでの精製をもたらした（Ｈｓｉｅｈら，ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ，５０（２）：９１−７，２０００；ＰＣＴ出願第ＷＯ ９９／２３２１０号）。この精製された酵素は、αＧａｌＮＡｃ ｐ−ニトロフェニル基質について中性の至適ｐＨを有したが、オリゴサッカリドを用いたこの酵素の活性の研究は提示されなかった。ＥＬＩＳＡアッセイにおいてこの精製された酵素を用いたＡ２エピトープのいくらかの分解が報告されているが、この酵素は、適切な血液分類を用いてＡ２細胞の酵素変換において評価されていない。
【００１９】
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ（Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ １６５：１３９−５７，１９８４；Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ｍｅｄ Ｒｅｖ ３（３）：２０６−１２，１９８９）は、ニワトリ肝臓のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いてＡ細胞を変換することに失敗した。米国特許第４，６０９，６２７号（「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｔａｉｎ Ｓｕｂ−Ｔｙｐｅ Ａ ａｎｄ ＡＢ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ」との発明の名称）は、ＡｉｎｔおよびＡ２（Ａ２Ｂ赤血球を含む）をＨ抗原型の赤血球へと変換するためのプロセス、ならびにＡ抗原を欠くＢ型赤血球の組成物（この組成物は、処置の前に、この赤血球の表面にＡ抗原およびＢ抗原の両方を含んでいた）に関する。Ａｉｎｔ赤血球およびＡ２赤血球をＨ抗原型の赤血球へと変換するためのプロセス（これは、米国特許第４，６０９，６２７号に記載される）は、特定のサブタイプＡの赤血球またはサブタイプＡＢの赤血球を平衡化する工程、この平衡化した赤血球を、Ａ抗原をＨ抗原へと変換するに十分な期間にわたって、精製されたニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素と接触させる工程、この酵素をこの赤血球から除去する工程、およびこの赤血球を再度平衡化する工程を包含する。「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
α−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｓａｉｄ ｅｎｚｙｍｅ」との発明の名称の米国特許第６，２２８，６３１号は、ニワトリ酵素についての組換え供給源を提供する。精製されたニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよび組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓによって産生されたニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの比活性は、ｐ−ニトロフェニルαＧａｌＮＡｃを基質として用いて約５１Ｕ／ｍｇ〜約５６Ｕ／ｍｇであると報告された（Ｚｈｕら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８：４５６−６２，１９９６）。米国特許第４，６０９，６２７号における、Ａｉｎｔ細胞およびＡ２細胞についてのこの記載された変換条件は、酸性ｐＨ５．７での１８０Ｕ／ｍｌ細胞（ヘマトクリットは指定されていない）を含んでおり、そして処理された細胞は、不特定の抗Ａ試薬と凝集しなかった。このプロトコルは、３ｍｇ／ｍｌより多くの酵素タンパク質を必要とし、そしてＡ１型細胞を変換するとは報告されていない。
【００２０】
Ｈａｔａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ．２８（１）：７７−８６，１９９２）はまた、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを酸性ｐＨにて用いる、Ａ２細胞の変換を報告した。米国特許第５，６０６，０４２号（および米国特許第５，６３３，１３０号；同第５，７３１，４２６号；同第６，１８４，０１７号）は、同様の結果を開示する。
【００２１】
Ｆａｌｋら（Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２９０（２）：３１２−９１９９１，１９９１）は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ ＩＸ−７０株から精製されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが、Ｄｏｌｉｃｈｕｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓの凝集性を破壊し得ることを実証した。このことは、Ａ１細胞のＡ抗原強度が、Ａ２細胞レベルまで低減したことを示す。
【００２２】
Ｉｚｕｍｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １１１６：７２−７４，１９９２）は、Ａ１型細胞に対して、精製されたＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを試験した。凝集力価におけるいくらかの低減が、７，０００Ｕ／ｍｌ（１４０Ｕ／２０μｌ）の４％ヘマトクリットを用いて観察されたとはいえ、変換は完全ではなかった。
【００２３】
ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素が単離され、クローニングされ、そして発現された（Ｔｓｕｊｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６３：１４９８−１５０４，１９８９，Ｗａｎｇら，Ｈｕｍａｎ α−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ．Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ α−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ａ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ｃｏｍｍｏｎ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｇｅｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８５９−６６，１９９０）（米国特許第５，４９１，０７５号）。ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの至適ｐＨは３．５であり（Ｄｅａｎ ＫＪ，Ｓｗｅｅｌｅｙ ＣＣ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｓ．ＩＩ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｂ（ａｌｐｈａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：１０００１−５，１９７９）、これは、ヒトα−ガラクトシダーゼの至適ｐＨと同様である（Ｄｅａｎ Ｋ Ｊ，Ｓｗｅｅｌｅｙ Ｃ Ｃ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｓ．Ｉ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ａ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：９９９４−１００００，１９７９）。
【００２４】
Ａ型細胞、および特に、Ａ型の８０％までを構成するサブグループＡ１細胞の酵素的変換が今日まで達成されていないことが上記から明らかである。それゆえ、全ての免疫反応性Ａ抗原を除去することによってＡ型細胞を変換し得る適切な酵素を同定する必要性が当該分野において存在する。さらに、適切な変換条件（好ましくは中性ｐＨでかつさらなる外部タンパク質が必要ない変換条件）を開発する必要性が存在する。
【００２５】
（スクリーニングアッセイ：）
エキソ−グリコシダーゼの探索、同定および特徴付けのための以前の方法は、一般に、単純なモノサッカリド誘導体を基質として使用してサッカリド特異性および潜在的結合特異性を同定することを頼りとする。誘導体化されたモノサッカリド基質または稀にはオリゴサッカリド基質としては、ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）、ベンジル（Ｂｚ）、４−メチル−ウンベリフェリル（４−ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍｂｒｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）（Ｕｍｂ）、および７−アミノ−４−メチル−クマリン（ＡＭＣ）が挙げられるがこれらに限定されない。このような基質の使用は、グリコシダーゼ活性を同定するための、そして実用的に適用可能な多様な酵素供給源の大規模スクリーニングを行うための、容易で迅速でかつ安価なツールを提供する。しかし、グリコシダーゼ酵素の反応速度特性および優れた基質特異性は、このような単純な構造体を用いるアッセイにおいて必ずしも反映されないかもしれない。複雑なオリゴサッカリドおよび独特の糖結合体構造についての高い程度の特異性および／または選択的効率を有する新規の酵素が存在することもまた可能であるが、これらは、分析方法に起因して、見過ごされて認識されていないままであるかもしれない。従って、特定の複雑なオリゴサッカリドまたは糖結合体構造について最適なエキソ−グリコシダーゼを同定および選択するために、酵素供給源をスクリーニングするために用いられるアッセイにおいてこのような複雑な構造体を使用することが好適であり得る。さらに、スクリーニングするために用いられるアッセイは、好ましい反応速度特性（例えば、ｐＨ必要要件および（例えば、細胞の膜に結合した）基質についての性能）についての選択を含み得る。
【００２６】
先行技術では、血球のＢ抗原およびＡ抗原を破壊するために用いられる全てのα−ガラクトシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２２）およびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．４９）が、主にｐ−ニトロフェニルモノサッカリド誘導体を用いて同定され、そして特徴付けられている。興味深いことに、細胞上のＡ抗原およびＢ抗原の除去を試みる過去の研究において用いられた全てのα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、顕著なＤＮＡ配列類似性およびアミノ酸配列類似性によって明らかなように、進化的に相同である。従って、ヒトα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、密接に相同であり（Ｗａｎｇら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６５：２１８５９−６６，１９９０）、そして血球変換において以前に用いられた他の酵素（ニワトリ肝臓のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、真菌ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、および細菌のα−ガラクトシダーゼを含む）は、全て、顕著な配列類似性を示す。細菌のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの一次構造は、科学文献において報告されている。これらのグリコシダーゼは、配列類似性を共有するので、この酵素が関連の反応速度特性を有することが予期され得る。全ての既知のＯ−グリコシドヒドロラーゼの配列分析によって、配列分析に基づいて８５の異なるファミリーに分類され、そして上記のα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、ファミリー２７およびファミリー３６に分類される（例えば、「ＣＡＺｙ−Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ （Ｆａｍｉｌｙ ＧＨ３２）」との表題で、ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ａｚｙ／ＣＡＺＹ／ＧＨ＿３２．ｈｔｍｌに位置するウェブページを参照のこと）。これらの酵素は、維持される触媒機構を有することおよびアスパラギン酸を触媒求核試薬として用いることによって特徴付けられる（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，２６（２）：１５３−６，１９９８；ＲｙｅおよびＷｉｔｈｅｒｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，４（５）：５７３−８０，２０００）。
【００２７】
それゆえ、当該分野には、新たなα−ガラクトシダーゼ活性およびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性、ならびに対応する酵素タンパク質を同定する必要性が存在する。このような酵素が存在するならば、これらはファミリー２７およびファミリー３６には分類されないようである。なぜなら、これらは、顕著に異なる反応速度特性を有するように選択されるからである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
（発明の要旨）
本発明は、血液製剤中の血液型Ａ反応細胞、血液型Ｂ反応細胞、および血液型ＡＢ反応細胞からの、Ａ型抗原およびＢ型抗原の酵素的除去のための組成物および方法、ならびに非Ａ反応性細胞および非Ｂ反応性細胞へのこれらの変換を提供する。具体的には、本発明は、血液型Ａ抗原および血液型Ｂ抗原を指定する免疫優性モノサッカリド（すなわち、それぞれ、α１，３−Ｄ−ガラクトースおよびα１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン）の酵素的除去のための組成物および方法を提供する。したがって、本発明は、以下を提供する。
（１）血液製剤中の血液型群Ｂ反応性細胞または血液型群ＡＢ反応性細胞からＢ型抗原を除去するためα−ガラクトシダーゼであって、ここで、該α−ガラクトシダーゼは、以下の特徴：
（ｉ）単純なα−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉ）中性ｐＨでの、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドの赤血球細胞変換における活性
を有する、α−ガラクトシダーゼ。
（２）項目１に記載のα−ガラクトシダーゼであって、ここで、前記血液型群Ｂ型オリゴサッカリドが群Ｂ型テトラサッカリドである、α−ガラクトシダーゼ。
（３）項目１に記載のα−ガラクトシダーゼであって、該α−ガラクトシダーゼが、α−Ｇａｌ ｐ−ニトロフェニルモノサッカリド誘導体に関する検出可能な活性を有さない、α−ガラクトシダーゼ。
（４）配列番号１を含む、項目１に記載のα−ガラクトシダーゼ。
（５）項目１に記載のα−ガラクトシダーゼであって、該α−ガラクトシダーゼは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって４０〜８０ｋＤ領域を移動するとしてさらに特徴付けられる、α−ガラクトシダーゼ。
（６）項目１に記載のα−ガラクトシダーゼであって、Ｐ１抗原に関して検出可能な活性を有さない、α−ガラクトシダーゼ。
（７）項目１に記載のα−ガラクトシダーゼを発現することが可能な原核生物細胞系統。
（８）項目２に記載のα−ガラクトシダーゼを発現することが可能な原核生物細胞系統。
（９）項目３に記載のα−ガラクトシダーゼを発現することが可能な原核生物細胞系統。
（１０）項目４に記載のα−ガラクトシダーゼを発現することが可能な原核生物細胞系統。
（１１）項目５に記載のα−ガラクトシダーゼを発現することが可能な原核生物細胞系統。
（１２）項目６に記載のα−ガラクトシダーゼを発現することが可能な原核生物細胞系統。
（１３）血液製剤中の、血液型群Ａ型反応性細胞または血液型群ＡＢ型反応性細胞からＡ型抗原を除去するための方法であって、該方法は、以下（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）該Ａ型抗原を除去するのに十分な期間にわたって、中性ｐＨ条件下で、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素と該血液製剤を接触させる工程、ならびに
（ｂ）該血液製剤から該酵素を除去する工程であって、ここで、該α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴：
（ｉ）血液型群Ａ型反応性細胞または血液型群ＡＢ型反応性細胞から全ての検出可能なＡ型抗原を除去することが可能であること
（ｉｉ）単純なα−Ｇａｌ ＮＡｃモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ａ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有する、工程
を包含する、
方法。
（１４）Ａ型赤血球またはＡＢ型赤血球を非Ａ型赤血球に変換するための方法であって、該方法は、以下（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）該赤血球の中の該Ａ型抗原をＨ抗原に変換するのに十分な期間にわたって、中性ｐＨ条件下で、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素と該赤血球を接触させる工程、ならびに
（ｂ）該赤血球から該酵素を除去する工程であって、ここで、該α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴：
（ｉ）群Ａ型反応性細胞または群ＡＢ型反応性細胞から検出可能なＡ型抗原を除去することが可能であること
（ｉｉ）単純なα−Ｇａｌ ＮＡｃモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ａ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有する、工程
を包含する、
方法。
（１５）血液製剤中の、血液型群Ｂ型反応性細胞または血液型群ＡＢ型反応性細胞からＢ型抗原を除去するための方法であって、該方法は、以下（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）該Ｂ型抗原を除去するのに十分な期間にわたって、中性ｐＨ条件下で、α−ガラクトシダーゼ酵素と該血液製剤を接触させる工程、ならびに
（ｂ）該血液製剤から該酵素を除去する工程であって、ここで、該α−ガラクトシダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉ）の特徴：
（ｉ）単純なα−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有する、工程
を包含する、
方法。
（１６）Ｂ型赤血球またはＡＢ型赤血球を非Ｂ型赤血球に変換するための方法であって、該方法は、以下（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）該Ｂ型抗原を除去するのに十分な期間にわたって、中性ｐＨ条件下で、α−Ｎ−ガラクトシダーゼ酵素と該赤血球を接触させる工程、ならびに
（ｂ）該血液製剤から該酵素を除去する工程であって、ここで、該α−ガラクトシダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉ）の特徴：
（ｉ）単純なα−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有する、工程
を包含する、
方法。
（１７）血液製剤中の、血液型群Ａ型反応性細胞、血液型群Ｂ型反応性細胞または血液型群ＡＢ型反応性細胞からＡ型抗原およびＢ型抗原を除去するための方法であって、該方法は、以下（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）該Ａ型抗原および該Ｂ型抗原を除去するのに十分な期間にわたって、中性ｐＨ条件下で、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素およびα−ガラクトシダーゼ酵素と、該血液製剤を接触させる工程、および
（ｂ）該血液製剤から該酵素を除去する工程であって、ここで、該α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴：
（ｉ）群Ａ型反応性細胞または群ＡＢ型反応性細胞から全ての検出可能なＡ型抗原を除去することが可能であること
（ｉｉ）単純なα−Ｇａｌ ＮＡｃモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ａ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有しており、ここで、該α−ガラクトシダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉ）の特徴：
（ｉ）単純なα−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有する、工程
を包含する、
方法。
（１８）血液製剤中の血液型群Ａ、ＢまたはＡＢ反応性細胞からの、Ａ型赤血球およびＢ型赤血球を、非Ａ非Ｂ型赤血球に変換するための方法であって、該方法は、以下（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）該赤血球の中の該Ａ型抗原および該Ｂ抗原を変換するのに十分な期間にわたって、中性ｐＨ条件下で、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素およびα−ガラクトシダーゼ酵素と、該赤血球を接触させる工程、および
（ｂ）該赤血球から該酵素を除去する工程であって、ここで、該α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴：
（ｉ）群Ａ型反応性細胞および血液型群ＡＢ型反応性細胞から全ての検出可能なＡ型抗原を除去することが可能であること
（ｉｉ）単純なα−Ｇａｌ ＮＡｃモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ａ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有しており、ここで、該α−ガラクトシダーゼ酵素は、以下（ｉ）〜（ｉｉ）の特徴：
（ｉ）単純なα−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性、および
（ｉｉ）中性ｐＨでの、赤血球細胞変換における活性
を有する、工程
を包含する、
方法。
（１９）中性条件下で、血液製剤中の血液型群Ｂ反応性細胞および血液型群ＡＢ反応性細胞からＢ型抗原を除去するのに有用なα−ガラクトシダーゼ酵素をスクリーニングおよび選択するための方法であって、該方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）中性ｐＨ条件下で、該Ｂ型群オリゴサッカリド基質と、候補α−ガラクトシダーゼ酵素を接触させ、該Ｂ型群オリゴサッカリド基質に関する、該候補酵素の活性を測定する工程、
（ｂ）中性ｐＨ条件下で、α−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と、該候補α−ガラクトシダーゼ酵素を接触させ、該Ｂ型群モノサッカリド誘導体に関する、該候補酵素の活性を測定する工程、ならびに
（ｃ）該Ｂ型群オリゴサッカリド基質に関する、該候補酵素の活性と、α−Ｇａｌモノサッカリド誘導体に関する、該候補酵素の活性とを比較する工程、
を包含し、
ここで、単純なα−Ｇａｌモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリド誘導体に関する少なくとも１０％の活性を有する、候補α−ガラクトシダーゼが、中性ｐＨ条件で、血液製剤中の血液型群Ｂ型反応性細胞および血液型群ＡＢ型反応性細胞から、Ｂ型抗原を除去するのに有用であるとして選択される、
方法。
（２０）中性ｐＨ条件下で、血液製剤中の血液型群Ｂ反応性細胞および血液型群ＡＢ反応性細胞からＡ型抗原を除去するのに有用なα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素をスクリーニングおよび選択するための方法であって、該方法は、以下の（ａ）〜（ｂ）の工程：
（ａ）中性ｐＨ条件下で、Ａ型群オリゴサッカリド基質と、候補α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を接触させ、該Ａ型群オリゴサッカリド基質に関する、該候補酵素の活性を測定する工程、
（ｂ）中性ｐＨ条件下で、α−Ｇａｌ ＮＡｃモノサッカリド誘導体と、該候補α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を接触させ、該Ａ型群モノサッカリド誘導体に関する、該候補酵素の活性を測定する工程、ならびに
（ｃ）該Ａ型群オリゴサッカリド基質に関する、該候補酵素の活性と、α−ＧａｌＮＡｃモノサッカリド誘導体に関する候補酵素の活性とを比較する工程、
を包含し、
ここで、単純なα−ＧａｌＮＡｃモノサッカリド誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴサッカリドに関する少なくとも１０％の活性を有する、候補α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素が、中性ｐＨ条件下で、血液製剤中の血液型群Ｂ型反応性細胞および血液型群ＡＢ型反応性細胞から、Ａ型抗原を除去するのに有用であるとして選択される、
方法。
（２１）血清変換型赤血球であって、ここで、該血清変換型赤地球は、：
（ａ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼによって、Ａ型赤血球またはＡＢ赤血球から非Ａ赤血球へと変換され、
（ｂ）Ａ結合Ｈ構造を有し、そして
（ｃ）標準的な血液銀行血清型分類によって決定されるような、検出可能なＡ型抗原を有さない、
血清変換型赤血球。
（２２）血清変換型赤血球を含む血液製剤であって、ここで、該血清変換型赤血球が：
（ａ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼによって、Ａ型赤血球またはＡＢ赤血球から非Ａ赤血球へと、変換され、
（ｂ）Ａ結合Ｈ構造を有して、そして、
（ｃ）標準的な血液銀行血清型分類によって決定されるような、検出可能なＡ型抗原を有さない、
血液製剤。
（２３）血清変換型赤血球であって、ここで、該血清変換型赤血球が：
（ａ）α−ガラクトシダーゼによって、Ｂ型赤血球またはＡＢ赤血球から非Ｂ赤血球へと変換され、
（ｂ）Ｐ１抗原を保持し、そして、
（ｃ）標準的な血液銀行血清型分類によって決定されるような、検出可能なＢ型抗原を有さない、
血清変換型赤血球。
（２４）血清変換型赤血球を含む血液製剤であって、ここで、該血清変換型赤血球は：
（ａ）α−ガラクトシダーゼによって、Ｂ型赤血球またはＡＢ赤血球から非Ｂ赤血球へと変換され、
（ｂ）Ｐ１抗原を保持し、そして、
（ｃ）標準的な血液銀行血清型分類によって決定されるような、検出可能なＢ型抗原を有さない、
血液製剤。
（２５）血清変換型赤血球であって、ここで、該血清変換型赤血球は：
（ａ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼによって、Ａ型赤血球またはＡＢ赤血球から非Ａ非Ｂ型赤血球へと変換され、
（ｂ）Ａ結合Ｈ構造を有し、
（ｃ）Ｐ１抗原を保持し、そして、
（ｄ）標準的な血液銀行血清型分類によって決定されるような、検出可能なＡ型抗原およびＢ型抗原を有さない、
血清変換型赤血球。
（２６）血清変換型赤血球を含む血液製剤であって、ここで、該血清変換型赤血球は：
（ａ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼによって、ＡＢ型赤血球から、非Ａ非Ｂ赤血球へ変換され、そして
（ｂ）Ａ結合Ｈ構造を有して、
（ｃ）Ｐ１抗原を保持し、そして、
（ｄ）標準的な血液銀行血清型分類によって決定されるような、検出可能なＡ型抗原またはＢ型抗原を有さない、
血液製剤。
（２７）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈａｔｔａｎｏｏｇｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４０７６）である、項目７に記載の系統。
（２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｐｌａｎｕｓ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４０７７）である、項目７に記載の系統。
（２９）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４０７６である、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈａｔｔａｎｏｏｇｅｎｓｉｓ。
（３０）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４０７７である、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｐｌａｎｕｓ。
（３１）前記α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼがＮＥＢ α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼである、項目１３に記載の方法。
（３２）前記α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼがＮＥＢα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼである、項目１４に記載の方法。
（３３）前記α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼがＮＥＢ α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼである、項目１７に記載の方法。
（３４）前記α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼがＮＥＢ α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼである、項目１８に記載の方法。
【００２９】
本発明の新規グルコシダーゼ酵素は、免疫優性の単糖類、αＧａｌＮＡｃおよびαＧａｌを、血液産物中の細胞表面の真性Ａ型糖質抗原および真性Ｂ型糖質抗原に近接した複合オリゴ糖標的から除去する際の使用のために、特異的に選択される。本発明の好ましいα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素は、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）の特徴を有する：（ｉ）単純なα−ＧａｌＮＡｃ単糖類誘導体と比較して、Ａ型オリゴ糖（四糖類またはそれより高次）との１０％以上の活性；および、（ｉｉ）天然のｐＨ（ｐＨ６〜８）での赤血球変換における、Ａ型オリゴ糖との活性。本発明のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、全てのＡ型群（Ａ１型群を含む）細胞の、全ての検出可能なＡ型抗原を除去する。本発明の好ましいα−ガラクトシダーゼ酵素は、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）の特徴を有する：（ｉ）単純なα−Ｇａｌ単糖類誘導体と比較して、Ｂ型オリゴ糖（四糖類またはそれより高次）との１０％以上の活性；および、（ｉｉ）天然のｐＨ（ｐＨ６〜８）での赤血球変換における、Ｂ型オリゴ糖に関する活性。本発明のα−ガラクトシダーゼ酵素は、Ｐ１抗原との検出可能な活性を有さない。より好ましいアセチルガラクトサミニダーゼ酵素およびα−ガラクトシダーゼ酵素は、細菌起源または真菌起源のものであり、それによって、原核生物および下等真核生物における、効果的かつ安価な組換え発現が可能になる。好ましい実施形態において、本発明の酵素は、ｐ−ニトロフェニル単糖類誘導体との検出可能な活性を有さない。別の好ましい実施形態において、本発明の酵素は、単糖類基質およびオリゴ糖基質との好ましい速度定数Ｋｍを有する。特に好ましいα−ガラクトシダーゼ酵素は、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、４０〜８０ｋＤの領域で移動するとしてさらに特徴付けられる。別の特に好ましいα−ガラクトシダーゼ酵素は、アミノ酸配列：Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号１）を含む。
【００３０】
別の局面において、本発明は、全ての血液型群Ａ型および血液型群Ｂ型の赤血球の完全なセロコンバージョンのための方法を提供し、この結果、Ａ型細胞、Ｂ型細胞、およびＡＢ型細胞から、Ａ型抗原およびＢ型抗原が完全に除去される。このＡ型抗原および／またはＢ型抗原の除去は、標準的な血液銀行の血清学分類または交叉分析によって、決定され得る。本発明の方法に従って、このＡ型抗原およびＢ型抗原は、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよび／またはα−ガラクトシダーゼを使用して除去され、これらの、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよび／またはα−ガラクトシダーゼは、（ｉ）単純な単糖類構造および二糖類構造ならびにアグリコン誘導体と比較して、血液型群Ａ型または血液型群Ｂ型のオリゴ糖（四糖類またはそれより高次）に対して１０％以上の活性を有し；かつ、（ｉｉ）中性のｐＨ（ｐＨ６〜８）での赤血球変換において活性である。好ましい実施形態において、これらのセロコンバージョン方法は、当該分野で公知の方法よりも、有意に低量の組換えグリコシダーゼ酵素タンパク質を使用する。これらの方法は、以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を包含する：（ａ）中性のｐＨ条件下で、抗体を除去するのに十分な時間、血液産物を酵素と接触させる工程；および（ｂ）この血液産物から酵素を除去する工程。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明は、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用して、全ての検出可能なＡ型抗原を、Ａ型赤血球およびＡＢ型赤血球（Ａ１型を含む）から除去するための方法を提供し、このα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、（ｉ）単純なα−ＧａｌＮＡｃ単糖類誘導体と比較して、血液型群Ａ型のオリゴ糖（四糖類またはそれより高次）に対して１０％以上の活性を有し；かつ、（ｉｉ）中性のｐＨ（ｐＨ６〜８）での赤血球変換において、血液型群Ａ型オリゴ糖に対して活性である。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、α−ガラクトシダーゼを使用して、検出可能な全てのＢ型抗原を、Ｂ型赤血球またはＡＢ型赤血球から除去するための方法を提供し、このα−ガラクトシダーゼは、（ｉ）単純なα−Ｇａｌ単糖類誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴ糖（四糖類またはそれより高次）に対して１０％以上の活性を有し；かつ、（ｉｉ）中性のｐＨ（ｐＨ６〜８）での赤血球変換において、血液型群オリゴ糖に対して活性である。
【００３３】
なお別の実施形態において、本発明は、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼを使用して、全ての検出可能なＡ型抗原およびＢ型抗原をＡＢ型赤血球から除去するための方法を提供し、これらの各々は、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）の１つ以上の特徴を有する：（ｉ）単純な単糖類構造および二糖類構造ならびにアグリコン誘導体と比較して、オリゴ糖構造（四糖類またはそれより高次）に対して１０％以上の活性を有し；そして（ｉｉ）中性ｐＨ（ｐＨ６〜８）での赤血球変換において、血液型群オリゴ糖に対して活性である。
【００３４】
本発明の別の局面において、セロコンバージョン赤血球が提供される。１つの実施形態において、このセロコンバージョン赤血球は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のように特徴付けられる：（ｉ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼによって、Ａ型またはＡＢ型の赤血球から非Ａ型赤血球に変換される；（ｉｉ）Ａ型関連Ｈ構造を有する；および（ｉｉｉ）標準的な血液銀行の血清学分類または交叉分析によって決定されるような、検出可能なＡ型抗原（Ａ１型抗原を含む）を有さない。別の実施形態において、このセミコンバゼーション赤血球は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のように特徴付けられる：（ｉ）α−ガラクトシダーゼによって、Ｂ型赤血球またはＡＢ型赤血球から非Ｂ型赤血球に変換される；（ｉｉ）Ｐ１型血液型群である場合、保持されたＰ１抗原性を有する；および（ｉｉｉ）標準的な血液銀行の血清学分類または交叉分析によって決定されるような、検出可能なＢ型抗原を有さない。なお別の実施形態において、このセミコンバゼーション赤血球は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のように特徴付けられる：（ｉ）α−Ｎ−アセチルガラクトサミノダーゼおよびα−ガラクトシダーゼによって、ＡＢ型赤血球から非Ａ型赤血球、非Ｂ型赤血球に変換される；（ｉｉ）Ａ型関連Ｈ構造を有する；および（ｉｉｉ）Ｐ１型血液型群である場合、保持されたＰ１抗原性を有する；および（ｉｉｉ）標準的な血液銀行の血清学分類または交叉分析によって決定されるような、検出可能なＢ型抗原を有さない。
【００３５】
なお別の局面において、本発明は、上記の好ましい独自の特徴を有する酵素のスクリーニング方法および選択方法、ならびにこれらの酵素をコードする遺伝子のクローニングおよび発現に有用な精製方法およびこれらのアミノ酸の配列決定方法を提供する。これらの方法は、このような好ましい酵素を産生する細菌単離物を提供する。
【００３６】
１つの実施形態において、中性のｐＨ条件下で、血液産物中で血液型群Ｂ型反応性細胞および血液型群ＡＢ型反応性細胞からＢ型抗原を除去するために有用なα−ガラクトシダーゼ酵素をスクリーニングおよび選択するための方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を包含する：（ａ）中性のｐＨ条件下で、候補α−ガラクトシダーゼ酵素を、Ｂ型オリゴ糖基質と接触させて、この候補酵素のＢ型オリゴ糖基質に対する活性を測定する工程；（ｂ）中性の条件下で、この候補α−ガラクトシダーゼ酵素を、α−Ｇａｌ単糖類誘導体と接触させて、この候補酵素のＢ型単糖類誘導体に対する活性を測定する工程；および（ｃ）この候補酵素の、Ｂ型オリゴ糖基質およびα−Ｇａｌ単糖類誘導体に対する相対的な活性を比較する工程。単純なα−Ｇａｌ単糖類誘導体と比較して、血液型群Ｂ型オリゴ糖（四糖類またはそれより高次）に対する１０％以上の活性を有する候補体は、中性のｐＨ条件下において血液産物中で血液型群Ｂ型および血液型群ＡＢ型の反応性細胞からＢ型抗原を除去するために有用であるように選択される。
【００３７】
別の実施形態において、中性のｐＨ条件下において、血液産物中で血液型群Ａ型および血液型群ＡＢ型の反応性細胞からＡ型抗原を除去するために有用なα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素をスクリーニングおよび選択するための方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を包含する：中性のｐＨ条件下で、候補α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を、Ａ型オリゴ糖基質と接触させて、この候補酵素をＡ型オリゴ糖基質に対する活性を測定する工程；（ｂ）中性の条件下で、この候補α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を、α−ＧａｌＮＡｃ単糖類誘導体と接触させて、この候補酵素のＡ型単糖類誘導体に対する活性を測定する工程；および（ｃ）この候補酵素の、Ａ型オリゴ基質およびα−ＧａｌＮＡｃ単糖類誘導体に対する相対的な活性を比較する工程。単純なα−ＧａｌＮＡｃ単糖類誘導体と比較して、血液型群Ａ型オリゴ糖（四糖類またはそれより高次）に対する１０％以上の活性を有する候補体は、中性のｐＨ条件下において血液産物中で血液型群Ａ型および血液型群ＡＢ型の反応性細胞からＡ型抗原を除去するために有用であるように選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、異なるｐＨにおける、Ｇａｌα−ｐＮＰに関する組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼの活性を示す。１．２５μｍｏｌ（２．５ｍＭ）の基質を含む０．５ｍｌの反応容量で、アッセイを行った。反応を、２６℃にて２０分間インキュベートし、そして等量の０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）を添加することによって、クエンチした。ｐ−ニトロフェニルの放出を、ＯＤ４０５ｎｍで定量し、そしてｐＨに対してプロットした。以下の緩衝液を使用した：ｐＨ５．０および５．５：２０ｍＭ ＮａＯＡｃ；ｐＨ６．０〜８．０：２０ｍＭ ＮａＰＯ４。
【図２】図２は、異なるｐＨにおける、血液型群Ｂ型四糖ＡＭＣ基質に関する組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼの活性を示す。クエン酸ナトリウム−ＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ２．６〜７．４）およびＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ８．０）中１ｎｍｏｌの基質を含有する１０μｌの反応容量で、アッセイを行った。反応を、２６℃にて４０分間インキュベートし、３μｌの反応混合物を、ＨＰＴＬＣ上にスポットし、そしてＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）中に展開し、写真に撮った。パネルＡは、ＨＰＴＬＣ分析を示し、Ｓｔｄは、酵素を含まない基質の移動を示し；パネルＢは、スキャニングによって定量し、ｐＨに対してプロットした基質切断を示す。
【図３】図３は、異なるｐＨにおける、Ｇａｌｉｌｉ五糖（ペンタサッカリド）基質に関する組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼの活性を示す。クエン酸ナトリウム−ＮａＰＯ４緩衝液中５ｎｍｏｌの基質を含有する１０μの反応容量で、アッセイを行った。反応を、２６℃にて２０分間インキュベートし、２μｌの各反応混合物を、ＨＰＴＬＣ上にスポットし、そしてＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（３０：６０：２０）中に展開して、オルシノール噴霧によって可視化した。パネルＡは、ＨＰＴＬＣ分析を示し；パネルＢは、スキャニングによって定量し、ｐＨに対してプロットした基質切断を示す。
【図４】図４は、Ｂ型四糖ＡＭＣ基質に関する、５つの選択されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ α−ガラクトシダーゼ活性のＨＰＴＬＣ分析である。表Ｖと同様に、株の数を設定する。ＨＰＴＬＣによって評価される、２０分、１００分および１０００分の時間点を用いる時間経過に従って、アッセイを行った。標準的な二糖類、三糖類（Ｈ）、および四糖類（Ｂ）のＡＭＣ誘導体の移動を、矢印によって示す。ＮＥ、酵素コントロールなし；Ｏｒｉｇｉｎ、サンプル適用位置。２０７５番において最も顕著であった二糖類ＡＭＣ産物の出現は、汚染されたα−フコシダーゼの活性に起因する。
【図５】図５は、Ｇａｌα−ｐＮＰ基質に関する、５つの選択されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ α−ガラクトシダーゼ活性のＨＰＴＬＣ分析である。アッセイを、３０℃にて４日間行った。２２６０番の株のみが、ｐＮＰ基質に対する有意な活性を示し、２３５７番の株の抽出物中に、ガラクトースの放出は全く検出されなかった。
【図５ｂ】図５ｂは、血液型群Ａ型四糖類（パネルＡ）および血液型群Ａ型五糖類ＡＭＣ（パネルＢ）の基質に関する、５つの選択されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ α−Ｎ−ガラクトサミニダーゼ活性のＨＰＴＬＣ分析である。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ株を、表ＶＩＩにおけるような数によって同定した。１ｎｍｏｌのＡＭＣ基質、５．０μｌの選択された酵素の画分、および緩衝液（０．０５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０））を含有する１０μｌの反応物中で、アッセイを行った。反応を、３０℃にて１８０分間インキュベートし、そして２．５μｌの反応混合物を、ＨＰＴＬＣ上にスポットし、そしてＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）中に展開して、写真に撮った。三糖類（Ｈ）、および四糖類（Ａ）、七糖類（ヘプタサッカリド）および六糖類（ヘキササッカリド）（Ｈ−Ａ）のＡＭＣ誘導体の移動を、矢印によって示す。ＮＥ、酵素コントロールなし；ｒＣＨｌ−Ａｚ、組換えニワトリ肝臓Ａ−Ｚｙｍｅ；Ｏｒｉｇｉｎ、サンプル適用位置。二糖類ＡＭＣの出現は、汚染されたα−フコシダーゼの活性に起因する。
【図６】図６は、Ｓ１２クロマトグラフィーによって分離されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ ２３５７番のα−ガラクトシダーゼ酵素の分析である。Ｐｒｅ：クロマトグラフィー前のサンプル。パネルＡ：Ｂ型四糖類ＡＭＣ基質に対する活性のＨＰＴＬＣ分析。５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中１ｎｍｏｌの基質、２μｌの指向されたＳ１２画分を含有する１０μｌの容量で、３０℃にて８０分間、反応を行った。ＨＰＴＬＣを、２．５μｌで行い、そしてＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）中に展開し、乾燥し、そして写真に撮った。７〜９の画分においてα−フコシダーゼ活性を含むピーク活性領域を、プールした。意味：Ｓｔｄ、酵素を含まないＢ型四糖類ＡＭＣ基質；Ｃｏ、コーヒーマメα−ガラクトシダーゼに対するコントロール反応。パネルＢ：画分のＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥ分析。パネルＡと同じ意味。
【図７】図７は、２３５７番から精製された酵素活性のＳ１２クロマトグラフィーからプールした画分のＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥである。Ｒ−２５０は、ＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥのＰＶＤＦ膜を染色した。配列決定のために取られたタンパク質バンドを、矢印によって示す。
【図８】図８は、組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼおよび２３５７番から精製されたα−ガラクトシダーゼの基質特異性のＨＰＴＬＣ分析である。このコーヒーマメα−ガラクトシダーゼ（レーン１）は、試験した全ての基質を切断したが、２３５７番から精製されたα−ガラクトシダーゼのみが、血液型群Ｂ型四糖類を選択的に切断した。パネルＡ：Ｇａｌｉｌｉ基質（Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）；パネルＢ：Ｐｋ基質（Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＯＧｒ）；パネルＣ：Ｐ１基質（Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＧｒ）；およびパネルＤ：Ｂ基質（Ｇａｌα１−３［Ｆｕｃα１−２］Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＧｒ）。パネルＡ、Ｂ、およびＣにおけるＨＰＴＬＣを、ＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）を使用して展開し、そしてパネルＤにおけるＨＰＴＬＣを、ＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（３０：６０：１０）を使用して展開した。
【図９】図９は、種々のｐＨにおいて、血液型群Ｂ四糖ＡＭＣ基質を用いて、＃２３５７由来の精製α−ガラクトシダーゼの活性を示す。２０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０〜５．５）またはＮａＰＯ４（ｐＨ６．０〜８．０）中の１ｎｍｏｌの基質を含む１０μｌの反応容積で、アッセイを実施した。反応物を、４０分間、２６℃でインキュベーションし、３μｌの反応混合物をＨＰＴＬＣ上にスポットし、そしてＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）中で展開し、写真を撮影した。パネルＡ：ＨＰＴＬＣ分析。Ｓｔｄは、酵素なしの基質の移動を示す；パネルＢ：基質切断は、走査によって定量化され、そしてｐＨに対してプロットした。
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｓ１２クロマトグラフィーによって分離されたＢＳＡを用いてスパイクした＃２３５７由来の精製α−ガラクトシダーゼの分析を示す。パネルＡ：画分２６〜３６のＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥ分析。命名：Ｍｗ：分子量マーカー；Ｐｒｅ：クロマトグラフィーの前のサンプル。パネルＢ：Ｂ四糖ＡＭＣ基質を用いた活性のＨＰＴＬＣ分析。反応を、１ｎｍｏｌ基質、２μｌの示されたＳ１２画分を、５０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）中に含む１０μｌの容積で行った。ＨＰＴＬＣを２μｌで行い、ＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）で展開し、乾燥し、そして写真を撮影した。命名：Ｓｔｄ、酵素のないＢ四糖ＡＭＣ基質；Ｃｏ、コーヒーマメα−ガラクトシダーゼを用いるコントロール反応；Ｄ−ＡＭＣ、二糖−ＡＭＣ；Ｔｒｉ−ＡＭＣ、三糖−ＡＭＣ；Ｔｅｔｒ−ＡＭＣ、四糖−ＡＭＣ。
【図１０】図１０は、種々のｐＨにおいて、血液型群Ａ四糖ＡＭＣ基質を用いる、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの活性を示す。ｐＨ２．６〜８．０で変動する、１ｎｍｏｌのＡ−ｔｅｔｒａ、０．０５μｇ酵素、および緩衝液Ｎａ−クエン酸−ＮａＰＯ４を含む１０μｌの反応でアッセイを実施した。反応物を、４０分間、２６℃でインキュベーションし、３μｌのサンプルをＨＰＴＬＣによって分析した。パネルＡ：ＨＰＴＬＣ分析；パネルＢ：基質切断は、走査によって定量化され、そしてｐＨに対してプロットした。
【図１１】図１１は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用する、Ａ２細胞の酵素変換に対する緩衝系の影響を示す。洗浄したＡ２赤血球を、２５℃で、指定された緩衝液中の５〜２０ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（３０％細胞懸濁液）とともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって３０分および６０分に変換を評価した。
【図１２】図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用する、Ａ１細胞およびＡ２細胞の酵素変換に対する２５０ｍＭグリシン緩衝液を使用するｐＨの影響を示す。洗浄した赤血球を、２５℃で、２５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）中の７．５ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（３０％細胞懸濁液）とともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって３０分および６０分に変換を評価した。
【図１３】図１３は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用する、Ａ１細胞の酵素変換に対するグリシン緩衝液濃度の影響を示す。洗浄した赤血球を、２５℃で、１００〜４００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ７．０）中の７．５ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（３０％細胞懸濁液）とともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって３０分および６０分に変換を評価した。
【図１４】図１４は、Ａ１細胞およびＡ２細胞の酵素変換に対するＥ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの濃度の影響を示す。洗浄した赤血球を、２５℃で、２５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ７．０）中の５〜５０ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（３０％細胞懸濁液）とともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって３０分および６０分に変換を評価した。
【図１５】図１５は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用する、Ａ１細胞の酵素変換に対する細胞（ヘマトクリット）濃度の影響を示す。洗浄した赤血球を、２５℃で、２０〜９０％の濃度で変化させて、２５０ｍＭグリシン（ｐＨ７．０）中の２０ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼとともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって３０分および６０分に変換を評価した。
【図１６】図１６は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用する、Ａ１細胞およびＡ２細胞の酵素変換に対する反応時間の影響を示す。洗浄した赤血球を、２５℃で、１５０ｍＭグリシン（ｐＨ７．０）中の５〜５０ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（３０％細胞懸濁液）とともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって２０分、４０分、６０分および１２０分に変換を評価した。
【図１７】図１７は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを使用する、Ａ２細胞の酵素変換に対する温度の影響を示す。洗浄した赤血球を、１５℃、２５℃および３７℃で、２００ｍＭグリシン（ｐＨ５．５）中の１〜１０ｍＵ／ｍｌのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（３０％細胞懸濁液）とともにインキュベートし、そしてＯｒｔｈｏ抗−Ａとの凝集によって２０分、４０分、および６０分に変換を評価した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、血液型群ＡおよびＢの構造に対する好ましい特異性および中性ｐＨにおける血球の酵素変換における好ましい性能を用いる、新規なα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼについてのスクリーニングおよび選択ストラテジーの開発および適用に関する。表１は、血球において見出されるＡ抗原およびＢ抗原の複合体構造を列挙する。これらの複合体構造を用いる既存のグリコシダーゼの速度論的特性の定量的研究は、報告されていない。これは、これらの化合物を天然の供給源から得ることの困難性に一部起因し、そして有機化学によってこのような複合体オリゴ糖を合成することに関する困難性および時間のかかることに一部起因する。
【００４０】
本発明の目的のために、血液型群ＡおよびＢの活性なオリゴ糖ＡＭＣ誘導体は、合成され（構造３、６、１１、２５）、そしてそれらのＨ改変体は、上記構造からのαＧａｌまたはαＧａｌＮＡｃの酵素的除去によって合成または産生された。さらに、構造３、６、２１および２５を有するグリコスフィンゴリピドは、ヒト赤血球から精製されたか、または先に記載されるように、グリコシダーゼ処理によってヒト赤血球から精製された（Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（４）：１１９９−２０３，１９８５，Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８０−７，１９８６，Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５（２２）：７０７５−８５，１９８６，Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６２（２９）：１４２２８−３４，１９８７）。ＡＭＣ誘導体またはグリコスフィンゴリピドからのαＧａｌまたはαＧａｌＮＡｃの除去を定量的に決定するための薄層クロマトグラフィーアッセイが開発された。
【００４１】
ｐ−ニトロフェニルα−ガラクトシドおよび血液型Ｂ抗原の代表として、四糖群Ｂハプテン基質（構造１１ＡＭＣ誘導体）を用いて活性を比較する、組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼの相対的比活性の本発明者らの最初の分析は、２０００倍近い顕著な差を明らかにした。従って、コーヒーマメα−ガラクトシダーゼは、先に報告される（Ｚｈｕら，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３２４：６５−７０，１９９５）ように、ｐ−ニトロフェニルα−ガラクトシドを用いてｐＨ６．５で約３０〜４０Ｕ／ｍｇの比活性を有したが、四糖群Ｂ基質を用いると、たった１７ｍＵ／ｍｇであった。従って、この酵素は、群Ｂ抗原を破壊するのに比較的不活性であり、Ｂ四糖に対して好ましい酵素は、群Ｂ基質とかなりより良い速度論的効率を示すようである。
【００４２】
ｐ−ニトロフェニル α−Ｎ−アセチルガラクトサミニン、および血液型群Ａ抗原の代表としての四糖群Ａハプテン基質（構造３ＡＭＣ誘導体）を用いた活性を比較する、組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの相対的な比活性の本発明者らの最初の分析は、１００倍を超える顕著な差を再び明らかにした。従って、先に報告されたニワトリα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、ｐ−ニトロフェニルα−Ｎ−アセチルガラクトサミニンを用いて約５０Ｕ／ｍｇ（ｐＨ３．６５）の比活性を有した（Ｚｈｕら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８：４５６−４６２，１９９６）が、四糖群Ａ基質を用いて、たった０．２Ｕ／ｍｇ（ｐＨ５．５）（０．３Ｕ／ｍｇ（ｐＨ３．６５））であった。従って、この酵素は、群Ａ抗原の破壊において相対的に非常に非効率である。
【００４３】
これらの２つの酵素が血球の酵素的変換における先端技術の性能を構成し、そしてこれらが、両方の酵素が酸性ｐＨでのみ血球変換を実施する事に加えて、細胞を変換しない（群Ａ）かまたは必要とされる酵素量に起因して実施不可能である（群Ｂ）かのいずれかであるので、血液変換における使用のための酵素の改善された速度論的特性が必要とされ、そして最初の同定のための１つの類似のストラテジーが、ｐ−ニトロフェニルおよび複合体Ａ／Ｂ基質を用いて活性の比を分析することであることが明らかである。群Ａまたは群Ｂの複合体基質の対する好ましいまたは排他的な活性を有する酵素は、血球変換においてより効率的に実行するようである。
【００４４】
群Ａ血球を変換することにおける過去の困難性は、主に、強力なＡ１亜群を変換することができないことに起因した。上記のように、群Ａ１亜群は、他の亜群よりも多いＡ抗原を有するが、グリコスフィンゴリピドの形態で繰り返しＡ構造もまた含む（表１、構造６）。Ａ２および可能なより弱い亜群はまた、Ａ拡大シリーズのグリコスフィンゴリピド（Ｈ−ＡおよびＧａｌ−Ａと指定される）（表１、構造２１、および２５）を含むが、これらは、元々、Ｃｌａｕｓｅｎら（Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（４）：１１９９−２０３，１９８５，Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８０−７，１９８６，Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５（２２）：７０７５−８５，１９８６，Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６２（２９）：１４２２８−３４，１９８７）によって記載されるように、抗Ａ抗体と反応しない。これは、過剰なα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが、上記のように分類試薬を用いて亜群Ａ２細胞型をＯとして処理したという発見によってさらに確認された。従って、亜群Ａ２と比較して、亜群Ａ１を変換することの困難性は、ある量のＡ抗原における定量的な差、Ａ１細胞のみの反復Ａグリコスフィンゴリピドの存在、またはこれらの組合せに起因し得る。群Ａ変換における使用のための好ましいα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの重要なパラメーターは、反復Ａグリコスフィンゴリピド上の末端αＧａｌＮＡｃ残基を効率的に切断する能力である。組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの効率性の分析は、Ａ２型四糖ＡＭＣ誘導体（構造３）および反復Ａ３型ＡＭＣ誘導体（構造６）の比較可能な比活性（約０．３Ｕ／ｍｇ）を明らかにした。ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが、全ての群Ａ細胞を変換しないことは、独特のＡ１構造に起因しないことが、このことから結論づけられ得る。さらに、このデータは、Ａ四糖がα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの速度論的特性および特異性を決定し、血球変換におけるそれらの性能の予測のために使用されるのに十分な構造の群Ａ（およびＢ）抗原を含むことを示し得る。
【００４５】
好ましいα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼは、中性ｐＨで最適であり、単細胞生物（例えば、細菌および酵母）における組換えタンパク質として対費用効果的に産生され得る。本発明は、ＡおよびＢの四糖ＡＭＣ誘導体基質を使用し、そして中性ｐＨでの活性を測定して、好ましい酵素活性についてのスクリーニングアッセイを開発した。さらに、活性は、複合体基質に対する優先性または排他性を有する活性を同定するために、ｐ−ニトロフェニル単糖類誘導体を使用して、活性を比較した。大きなパネルの細菌および真菌の単離物（３１００）についてのこのスクリーニングの適用は、ＡまたはＢの四糖ＡＭＣ基質を用いて測定されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼまたはα−ガラクトシダーゼの活性を発現するいくつかの細菌単離物を同定したが、対応のｐ−ニトロフェニル単糖類基質では活性レベルがないかまたは些細なレベルであった。各活性の１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｕｃｅｓ株としてこれらを血清型特徴付けおよび遺伝子型特徴付けした後に、さらに分析された。α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性を発現することが決定された株＃８の分析は、この活性が、不溶性であり、細胞塊と会合していたことを明らかにした。株＃８は、２００２年２月１４日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０７６と指定された。対照的に、α−ガラクトシダーゼ活性を発現すると決定された＃２３５７は、この活性が、可能性であり、そしてＦｒｅｎｃｈプレスの上清に見出されたことを明らかにした。株＃２３５７は、２００２年２月１４日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０７７と指定された。可溶性タンパク質を精製することはかなり単純であるので、本発明者らは、最初に、＃２３５７由来の酵素タンパク質を精製し、そして配列決定することを選ぶ。＃２３５７の活性は、Ｂ四糖基質を用いて、１０Ｕｍｇより高い比活性に精製されたが、ｐ−ニトロフェニルα−ガラクトシドを用いた活性は、検出可能でなかった。得られた調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、４０〜８０ｋＤの領域において３〜４のタンパク質バンドを明らかにした。調製物のゲル濾過分析は、４０〜８０ｋＤの分子量を示すＢＳＡと匹敵する活性の移動を示した。単一の短い配列を得た：
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号１）。
【００４６】
部分的に精製されたα−ガラクトシダーゼ活性の基質特異性の詳細な分析は、分枝Ｂ血液型群構造に対して先例のない良好な特異性を示し、そしてα１−３またはα１−４のガラクトース残基によってキャップされた線形構造が切断されなかったことを示した。ｐＨ最適の分析は、これが、５．５〜７．０であることを示した。従って、同定されたα−ガラクトシダーゼ活性は、制限された基質特異性、群Ｂ構造に対する高い比活性、およびｐＨ最適に関して、先行技術における酵素よりも非常に好ましい。
【００４７】
＃８のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性の予備的分析は、同様の特性を示したが、直鎖状構造もまた切断した。精製が困難であることに起因して、この酵素の比活性を評価することは可能でなかったが、０．１Ｕ／ｍｇでの部分的に精製した調製物でさえ、ｐ−ニトロフェニル単糖誘導体についての検出可能な活性は示さなかった。
【００４８】
２つの同定された活性および部分的に特徴付けられた活性が、性質が似ており、そして以前に報告されたあらゆるα−ガラクトシダーゼ活性およびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性とは全く異なるという知見は、独特の相同なグリコシダーゼの新規ファミリーが、用いられたスクリーニングストラテジーによって同定されることを強力に示唆した。
【００４９】
本発明者らは次いで、本発明者らの選択アッセイを用いて全ての市販のα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼのアッセイに着手し、好ましい特異性を有する酵素が入手可能であるか否かを決定した。ＡテトラサッカリドＡＭＣ誘導体およびＡヘプタサッカリドＡＭＣ誘導体について、単純なαＧａｌＮＡｃ単糖誘導体と比較して相対的に高い基質特異性を示す、１つのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＥＢのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ）が同定された。この酵素は、供給業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ，カタログ番号Ｐ０７３４Ｂ）によって、特許株に由来し、かつＥ．ｃｏｌｉにおいて発現されると開示され、そしてその基質特異性は、オリゴサッカリドからの末端α−ＧａｌＮＡｃ結合の加水分解を触媒すると記載されている。詳細には、酵素とともに供給された材料に、この基質特異性が、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミノピラノシド（ｐ−ニトロフェニルα−ＧａｌＮＡｃ）およびＡテトラサッカリドＡＭＣ基質（構造３〜構造８）を含むと開示される。本発明者らは、科学文献においても他の箇所でも、この酵素に関してさらなる情報を見出さなかった。本発明者らの基質パネルを用いてのこの酵素の反応速度特性の分析は、この酵素が、ＡテトラサッカリドＡＭＣ基質について約０．２５Ｕ／ｍｇの比活性を、そしてｐ−ニトロフェニルαＧａｌＮＡｃについて２．５Ｕ／ｍｇ未満の比活性を有すること明らかにした。さらに、この酵素は、６．０〜８．０という広い至適ｐＨを有する。この酵素は、ＡテトラサッカリドＡＭＣ基質についての中程度の優先的基質特異性しか示さず、そしてこの基質についての比活性は比較的低いが、この酵素は、血球変換において用いられるべき最適酵素の提案された特性を部分的に有し、そしてこれは細菌において発現され得る。
【００５０】
上記のように、同定されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのα−ガラクトシダーゼは、Ｂテトラサッカリド基質についての、１０Ｕ／ｍｇを超える比活性を有し、そしてこれは、中性ｐＨにて最大速度で機能する。しかし、この酵素は、血球変換におけるその性能の評価のために必要とされる量および純度では入手可能でなかった。この同定されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、同様に入手可能でなかった。このＮＥＢのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、Ａテトラサッカリド基質についてのその比活性はほんの約０．２５Ｕ／ｍｇであるとはいえ、２つの同定されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ活性と同じ同定特徴を有するので、純粋な組換え形態でのこの入手可能性は、この新たなクラスのグリコシダーゼの、血球変換における評価を可能にした。
【００５１】
それゆえ、本発明者らは、上記のスクリーニングおよび選択のストラテジーにおいて用いられるα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの提案された好ましい特性が、赤血球の酵素変換において改善された特徴を有する酵素を実際に選択したことを確認するために、Ａ型血球変換におけるＮＥＢのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの性能を試験した。このＮＥＢのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、中性ｐＨでのＡ１血球およびＡ２血球の両方の変換において顕著な効率を示した。酵素反応において３０％という固定されたヘマトクリットを用いて、変換プロセスの多数のパラメーターを分析した。好ましい緩衝液系は、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５での２００ｍＭ〜３００ｍＭのグリシンである。以下を含むがこれらに限定されないいくつかの添加物をこの緩衝液系に添加し得る：１ｍＭ〜５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ〜５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ〜１０ｍＭリン酸緩衝化クエン酸塩、０．２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および３００〜１０，０００の種々の分子量の０．１％〜１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。６０分間（３０％ヘマトクリット）において、約５ｍＵ／ｍｌのＮＥＢ α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、Ａ２細胞を変換して、そして約２０ｍＵ／ｍｌではＡ１細胞を変換して、慣用的な血液銀行試薬および手順によってＯと分類される細胞にした。増大した量の使用酵素は、変換に必要な時間の短縮をもたらした。変換された細胞は、抗Ｈ試薬とＯ細胞として反応し、そして変換された細胞の物理的パラメーターの分析は、未処理細胞と何の違いもないことを明らかにした（メトヘモグロビン、２，３ＤＰＧ、ＡＴＰおよび浸透圧ぜい弱性）。本発明者らが知る限り、これは、インタクトなＡ１型細胞の、Ｏと分類される細胞への、酵素的変換の初めての例である。
【００５２】
Ａ型細胞の変換のために必要とされる、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの量（５〜２０ｍＵ／ｍｌ）は、２０〜８０μｇ／ｍｌ酵素タンパク質に等しい。これは、先行技術においてＡ２細胞を変換するために用いられたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの量（３ｍｇ／ｍｌ）と比べてかなりの改善である。これはまた、コーヒーマメのα−ガラクトシダーゼ（８０％ヘマトクリットにて６ｍｇ／ｍｌ）またはＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのα−ガラクトシダーゼ（１６％ヘマトクリットにて５０μｇ／ｍｌ）のいずれであろうと、Ｂ細胞を変換するために用いられたα−ガラクトシダーゼの量と比較しての改善である。さらに、ＮＥＢのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いた変換を中性ｐＨにて行ったが、一方、過去の他の全ての変換は、酸性ｐＨである４．５〜５．８にて行われた。
【００５３】
それゆえ、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの性能は、上記のような基準によって定義されたとおりの、この提案された新たなクラスのエキソ−グリコシダーゼの特性が、ＡおよびＢの血球変換において改善された特性を有することを明らかに確認する。さらに、Ａ型テトラサッカリドについてのＮＥＢのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの比活性と比較して、血液型Ｂテトラサッカリド基質について４０倍以上高い比活性を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのα−ガラクトシダーゼの同定および特徴付けは、このＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ酵素が、変換において４０倍以上少ない（すなわち、反応中３０％ヘマトクリットにおいて０．５μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの）タンパク質を必要とし得ることを示す。従って、１単位のパックされた血球（約２２０ｍｌ）の変換は、０．３５ｍｇ／単位〜１．４ｍｇ／単位未満を必要とする。本発明の細菌発現技術、酵母発現技術および真菌発現技術を用いて、５ＵＳ＄／ｍｇ〜１０ＵＳ＄／ｍｇにて組換え酵素を産生することが可能である。それゆえ、血球の酵素的変換は、本発明によって提供される酵素の特性および性能を有する酵素を必要とすることが明らかである。
【００５４】
系統８および系統２３５７の両方は、２００２年２月１４日付けで、アメリカン タイプ カルチャー コレクションに寄託され、そして、これらは、それぞれ、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０７６および同 ＰＴＡ−４０７７が割り当てられた。特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約の合意の下で、ＡＴＣＣに対するこれらの寄託は行われた。特許が発行される期間の終わりの前のこの寄託物の条件のために、この保管においては、要求されたとしても、分与することはないが、サンプルを刷新する義務を本出願人は承認する。本出願人はまた、ＡＴＣＣにこの特許の発行を知らせる責任を認め、特許が発行されるときに、この寄託物は、公に利用可能となる。そのときの前に、この寄託物は、Ｃ．Ｆ．Ｒ．第３７章第１．１４節およびＵ．Ｓ．Ｃ．第３５章第１１２節に基づき、特許庁にとって利用可能である。
【実施例】
【００５５】
（使用した一般的な方法：）
７−アミノ−４−メチル−クマリン誘導体のような、一連の複雑な血液型群ＡＢＨのオリゴサッカリド構造は、表ＩＩ、表ＩＩＩおよび表ＩＶにおいて列挙されるように、アルバート ケミカル リサーチ カウンシル（Ａｌｂｅｒｔａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）によってつくられた慣習であった。他の構造が、異なる供給業者（Ｓｉｇｍａ，ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手可能であった。酵素は、これまで報告されているように（Ｚｈｕら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．８（４）：４５６−６２，１９９６，Ｚｈｕら，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２４（１）：６５−７０，１９９５）調製されるか、または指示されるような供給業者から購入された。使用した全ての試薬は、分析等級またはそれ以上のものであった。標準的な酵素アッセイを用いて様々なグリコシダーゼを以下のように実施した：
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現される組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼ：）
ｐ−ニトロフェニルモノサッカリド誘導体を用いたアッセイを、以下の２つの手順によって実施した：
ｉ）５０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を含む総容積０．５ｍｌの反応混合物中に１．２５μｍｏｌの基質を、２６℃にて、１０分間でインキュベートした。等容積の０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）を添加することによって、反応をクエンチした。遊離したｐ−ニトロフェノールの量を、ｐ−ニトロフェノールの標準曲線（０．０１μｍｏｌ〜０．１５μｍｏｌ）と比較して、４０５ｎｍの吸光度を測定することによって決定した；
ｉｉ）５０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ５．５）を含む総容積０．５ｍｌの反応混合物中の１．２５μｍｏｌ基質を、２６℃でインキュベートした。５μｌアリコートを、異なる時点（０分、５分、１５分、３０分、６０分）で採取して、生成物の発生を追跡し、そして、オルシノール染色によって可視化した。生成物の発生を、クロロホルム−メタノール−水（容積／容積／容積：６０／３５／８）中の高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）によって分析した。
【００５６】
（誘導化オリゴサッカリド基質を用いたアッセイ）
誘導化オリゴサッカリド（ＡＭＣ，ＯＧｒ）基質を用いたアッセイを、以下の手順によって実施した：
ｉｉｉ）５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を含む総容積１０μｌの反応混合物中の１（ＡＭＣ）ｎｍｏｌまたは５（ＯＧｒ）の基質を、２６℃でインキュベートした。２．５μｌ〜３．０μｌのアリコートを、異なる時点（０分、１５分、３０分、６０分）で採取して、生成物の発生を追跡した。生成物の発生を、クロロホルム−メタノール−水（容積／容積／容積：６０／３５／８）中のＨＰＴＬＣによって分析し、そして、ＵＶまたはオルシノール染色によって可視化した。
【００５７】
遊離したオリゴサッカリド基質を用いたアッセイを、以下の手順によって実施した：
ｉｖ）５ｍｍｏｌ基質を、２６℃または３０℃で３０〜１８０分間にて、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を含む１０μｌ反応容積の中でインキュベートした。生成物の発生を、クロロホルム−メタノール−水（容積／容積／容積：３０／６０／１０）中のＨＰＴＬＣによって分析し、そして、オルシノール染色によって可視化した。
【００５８】
基質に対するＫｍを決定するためのアッセイを、以下のように改変した：
ｖ）０．１〜０．５μｇの酵素を使用してαＧａｌ ｐ−ニトロフェニル基質の濃度を、５．０ｍＭから０．０４ｍＭ（５ｐｍｏｌ／１０μｌ）で変化させた。
【００５９】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現される組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ：
ｐ−ニトロフェニルモノサッカリド誘導体を用いたアッセイを、以下の２つの手順で実施した：
ｖｉ）１．２５μｍｏｌのαＧａｌＮＡｃ ｐ−ニトロフェニルモノサッカリドを、５０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２０ｍＭリン酸ナトリウムを含む試験管内で、ｐＨ２．８、３７℃にて、６０分間に亘りインキュベートした。５．０μｌのアリコートを、異なる時点（０分、１５分、３０分、６０分）で採取して、生成物の発生の速度論を追跡した。生成物の発生を、クロロホルム−メタノール−水（容積／容積／容積：６０／３５／８）中の高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）によって分析し、ｐ−アニスアルデヒドで染色し、そして、ＵＶまたはオルシノール染色によって可視化した。
【００６０】
（市販の組換えα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））：
ｖｉｉ）０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０を含む試験管中のαＧａｌＮＡｃ ｐ−ニトロフェニルモノサッカリド誘導体の出発濃度としての、０．５ｍＭを、これを等容積の緩衝液を混合することによって、続いて、２倍に希釈した。０．５μｇの酵素を、各試験管に添加し、そして、３７℃で１０分間に亘ってインキュベートした。等容量の０．２Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）を添加することによって、この反応をクエンチした。遊離したｐ−ニトロフェノールの量を、４０５ｎｍで吸光度を測定することによって決定した。
【００６１】
（実施例１：Ａ／Ｂ血液細胞変換において以前に使用された、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼの、詳細な基質特異性の特徴付け）
赤血球のＢ抗原性活性およびＡ抗原性活性を排除するために、過去において使用された最も有効なエキソグリコシダーゼは、それぞれコーヒーマメα−ガラクトシダーゼおよびニワトリ肝α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼであった。これらの酵素は、広範囲に研究されており、そして赤血球変換におけるこれらの特徴および性能は、上で参照されるように、文献および特許出願に記載されている。
【００６２】
（（ｉ）異なる基質との比活性（Ｕ／ｍｇ））
表ＩＩは、ｐ−ニトロフェニル単糖類誘導体とのこれらの酵素の報告された比活性を列挙する。１単位は、規定された最適なアッセイ条件下で１分間に１マイクロモルの基質を変換する活性として定義される。ｐ−ニトロフェニル基質を用いるアッセイを、使用した基質の１０％未満を用いて、初速度で評価した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
本発明において、精製した組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼおよびニワトリ肝α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼについて、類似の結果を得た。Ａ抗原およびＢ抗原に類似のオリゴ等基質との比活性の情報は、報告されていない。このことはおそらく、このような化合物の制限された利用可能性に起因する。本発明において、複合体Ａおよび
Ｂの構造を合成し、そして赤血球において見出されるような抗原を模倣する基質とのこれらの酵素の反応速度論的パラメータの分析は、赤血球の変換においてより良好な特性を有する新規な酵素を選択するための基準を規定する際に役立つと予測された。
【００６５】
表ＩＩＩに示されるように、これら２つの酵素の、四糖類ＡＭＣ誘導体との比活性の分析は、ｐ−ニトロフェニル単糖類誘導体を用いて得られる活性より劇的に低かった。
【００６６】
【表３】
【００６７】
１ 比活性を、以下の実施例に記載されるように、３つの時間点（２０分、４０分、および６０分）において評価した基質の約５０％および１００％の最終変換でのアッセイを使用して決定した。
【００６８】
酵母中で発現され、そして均質まで精製された組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼの比活性は、Ｇａｌα１−ｐＮＰを用いて（最適なｐＨ６．５において）３２Ｕ／ｍｇを示した。しかし、組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼの比活性は、この酵素での赤血球の酵素的変換のために使用される最適なｐＨ（ｐＨ５．５）において、血液型Ｂの四糖類−ＡＭＣ基質を用いて測定される場合に、ほんの１７ｍＵ／ｍｇ（約２０００分の１の低さ）であった（表ＩＩＩ）。
【００６９】
同様に、ニワトリ肝由来の組換えα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、非血液型Ａ構造に対する強い優先を示し、最高の活性が、非天然基質ＧａｌＮＡｃα１−ｐＮＰを用いて測定された。酵母中で発現され、そして均質まで精製された組換えニワトリα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの比活性は、最適な３．６５のｐＨにおいて、ＧａｌＮＡｃα１−ｐＮＰを用いて、約５０Ｕ／ｍｇを示し（表ＩＩ）、一方でほんの０．３Ｕ／ｍｇ（１６６分の１の低さ）が、ｐＨ３．６５において、血液型Ａ四糖類−ＡＭＣ基質を用いて測定された（表ＩＩＩ）。ｐＨ５．５における比活性は、ほんの０．２Ｕ／ｍｇ程度に低かった。
【００７０】
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．およびＰａｔｅｌｌａ ｖｕｌｇａｔａのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼについて、類似の結果が見出された（示さず）。
【００７１】
（（ｉｉ）異なる基質についてのＫｍ）
コーヒーマメα−ガラクトシダーゼおよびニワトリ肝α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの、異なる基質での報告されたミヒャエーリス−メンテン定数ＫｍおよびＶｍａｘ（ラインウィーヴァー−ブルクプロットから決定した）を、表ＩＶに示す。
【００７２】
表ＩＶ：モノサッカリド誘導体を含むα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの見かけのＫｍおよびＶｍａｘ
【００７３】
【表４】
【００７４】
１ Ｚｈｕら，（１９９５）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３２４：６５−７０、２ Ｖｏｓｎｉｄｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ ４６（１）：１７５−１８６，１９９８、 ３ Ｚｈｕら，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８：４５６−４６２．意味：ｎ．ｄ．＝決定せず。
【００７５】
本発明において、類似のＫｍ値を、組換え精製コーヒーマメα−ガラクトシダーゼおよびニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼについて得た。これらのＫｍ値は、比較的高く、そして１０〜１００倍低いＫｍを有する酵素は、抗原のほぼ完全な除去が重要であると予想される場合、赤血球変換に好ましい候補を示す。
【００７６】
従って、全ての基質を含むこれらの酵素の観察された高いＫｍは、赤血球の変換におけるこれらの酵素の乏しい性能の別の理由を示すようである。
【００７７】
Ｒ．ｔｏｒｇｕｅｓから見かけの均一性まで単離されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、ＧａｌＮＡｃα-ｐＮＰに対する５０Ｕ／ｍｇの比活性および２〜８ｍＭの
Ｋｍを有することが報告されている（Ｈｏｓｋｉｎｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７２（１２）：７９３２−９，１９９７）。この酵素は、中性ｐＨ最適条件を有するようであるが、実験は、現在まで、Ａ型細胞の効率的な酵素的変換を証明できていない（Ｈｏｓｋｉｎｓら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．４１（７）：９０８−１６，２００１）。この酵素の乏しい性能は非常に高いＫｍに関連しているようである。
【００７８】
（ｉｉｉ）異なる基質についてのｐＨ最適条件
コーヒーマメおよびダイズ（グリシンマックス）（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）のα−ガラクトシダーゼのｐＨ最適条件は、広く、そして中性のｐＨを含むことが報告されている。ｐＨ最適条件を測定するためのアッセイを、簡単な人工α−Ｇａｌモノサッカリドｐ−ニトロフェニル誘導体を用いて実施した。それにもかかわらず、これらの酵素のいずれも、中性ｐＨにおける血球変換において機能せず、そして変換は、ｐＨ５．５〜６．４においてのみ首尾良く観察された（上記の考察を参照のこと）。この現象に関する知見を提供するために、本発明者らは、コーヒーマメ酵素のｐＨ最適条件を、ｐ−ニトロフェニルガラクトースならびにオリゴサッカリド基質のＢテトラサッカリドおよびＧａｌｉｌｉペンタサッカリドを用いて分析した。図１に示されるように、単純なモノサッカリド基質を用いた場合のｐＨ最適条件は、以前に報告されたように、広く、６．４で最大活性を有した。逆に、Ｂテトラサッカリド基質を用いた場合のｐＨ最適条件は、酸性であり、図２に示されるように、３．５〜５．０で最大であった。さらに、同様の低いｐＨ最適条件が、図３に示されるように、Ｇａｌｉｌｉオリゴサッカリドの切断について観察された。
【００７９】
メリビオース、ラフィノースおよびスタキオースを用いた場合のコーヒーマメ酵素のｐＨ最適条件は、低い（３．６〜４の間）ことが報告されている（Ｚｈｕら、（１９９５）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３２４：６５−７０，ＣｏｕｒｔｏｉｓおよびＰｅｔｅｋ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３：５６５−５７１）。これは、ＢおよびＧａｌｉｌｉオリゴサッカリドについての本発明者らの知見と一致しており、このことは、酵素が一般に、天然のジサッカリドおよびオリゴサッカリドを用いた場合に低いｐＨ最適条件を有することを示唆している。
【００８０】
ｐ−ニトロフェニル基質を用いた場合の酵素のｐＨ最適条件は、人工的であり、そして天然の基質を用いた場合の酵素の特性を示すよりもむしろアグリカン（ａｇｌｙｃａｎ）の物理的特性に関連するようである。従って、本明細書中で示されるデータは、この酵素が中性のｐＨにおいて赤血球変換を行わないことについての説明を提供し得る。
【００８１】
ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、上記のように、ＧａｌＮＡｃα−ｐＮＰを使用してｐＨ３．６５のｐＨ最適条件を有することが報告された。血液型ＡテトラサッカリドＡＭＣ基質を用いた場合のこの酵素活性に対するｐＨの影響の分析は、報告されたデータと一致し、そして３．５〜４．５のｐＨ最適条件を示した（示さず）。
【００８２】
上記のように、ニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびコーヒーマメα−ガラクトシダーゼ酵素は、ヒトリソソーム酵素を含む大きな相同グリコシダーゼ遺伝子ファミリーのメンバーである。リソソーム酵素は、一般に、酸性ｐＨで機能し、そしてこれらの全ては、酸性ｐＨ最適条件を有すると報告されている。従って、この群と配列類似性を有する他の相同酵素は、酸性ｐＨ最適条件のこの特徴的な特性を共有するようである。従って、本発明者らは、適切な基質および中性ｐＨを使用して、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼの活性のための新たな供給源をスクリーニングすることを選択する。
【００８３】
（実施例２：中性ｐＨにおける血液型Ａおよび／または血液型Ｂの構造に対して高度に優先的または排他的な基質特異性を有するα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼの同定）
血液型Ａおよび血液型Ｂの構造に対して好ましいおよび／または排他的な特異性を有する潜在的な酵素を同定するために、真菌単離体および細菌単離体の大きなパネルを分析した。血液型Ａ／ＢテトラサッカリドＡＭＣ誘導体およびＧａｌ／ＧａｌＮＡｃα−ｐＮＰ誘導体を用いる最初のスクリーニングのためのプロトコールを開発した。簡単には、培養物の貯蔵した凍結ストックを、ＹＭ斜面培養物（管サイズ：１．８×１．８ｃｍ）に播種し、２７℃で８日間増殖させ、そしてこの培養物（胞子）を、５ｍｌの凍結剤（１０％グリセロール＋５％ラクトース）で洗い流し、次いで解離（ネジ付き管１．３×１３ｃｍ中、ガラスビーズと共に激しく回転）することにより収集した。１ｍｌの斜面培養物を、有酸素発酵のための適切な特定の培地に、７２〜９６時間かけて播種した（真菌培養について２５℃、および放線菌類培養について２８℃）。各増殖培養物の２．５ｍｌのサンプルを、約８〜１０個のガラスビーズ（サイズ＝直径３ｍｍ）を含むネジ付き管（１．３×１３ｃｍ）中で、１５分間撹拌することによって解離し、その後、クエン酸緩衝液を用いてｐＨを６．５に調整し、そしてこの解離した培養物を、管中、−２０℃で凍結した。凍結培養物を解凍し、そして上記のようにして再び解離し、そして２１００×ｇで１５分間遠心分離した。この上清は、初期アッセイのための酵素供給源として働いた。１０μｌのサンプルを、以下のように試験した：
（Ａ型およびＢ型のテトラサッカリドＡＭＣ基質を用いるアッセイ）
５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．２５ｎｍｏｌのオリゴサッカリドＡＭＣ基質および１０μｌの上記のような酵素供給源を含有する反応混合物（１０μｌ）を、３０℃でインキュベートし、そして生成物の発生を、異なる時間間隔（２０分〜４８時間）でＨＰＴＬＣによりモニタリングした。
【００８４】
（ｐ−ニトロフェニルモノサッカリド基質を用いたアッセイ）
上記のような、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、２〜５ｍＭモノサッカリドｐＮＰ基質および１０μｌ酵素供給源を含む反応混合物（２０μｌ）を、３０℃でインキュベートし、そして生成物の発生を、異なる時間間隔（２０分間〜２４時間）で、ＯＤ４０５ｎｍまたはＨＰＴＬＣによりモニターした。
【００８５】
（α−ガラクトシダーゼ活性についてのスクリーニング）
合計２４００個の単離体をスクリーニングし、そしてＢ群テトラサッカリドＡＭＣ基質との顕著な活性を有する５つの株を単離した。これらの株は、小規模発酵のために選択され、これらはＦｒｅｎｃｈプレス、（ＮＨ４）２ＳＯ４での沈殿、およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでの分離によって処理された。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分において見出された活性ピークのプールについてのさらなる分析により、（表ＶＩ）に列挙されるような、２つの基質との比活性が明らかにされた。
【００８６】
（表ＶＩ：同定された５つのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ α−ガラクトシダーゼ活性の基質特異性）
【００８７】
【表６】
【００８８】
１比活性の分析を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーからプールされた活性画分において決定した。精製を、１０，０００ｐｓｉでのＦｒｅｎｃｈプレス処理に供されたプロテアーゼインヒビター（ＰＭＳＦ、ロイペプチン、ペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｉｎ）、ＥＤＴＡ）を含むブロス（６０ｍｌ）から行った。この調製物を、１３，０００×ｇで３０分間にわたり遠心分離し、そして上清を、１５％および５０％の硫酸アンモニウム沈降によって分画した。１５〜５０％のペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に溶解し、そして０．４５μｍフィルターを通して濾過した。清澄化濾液を、５ｍｌ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｈｉ−ｔｒａｐ Ｑカラムにロードし、そしてタンパク質を、０〜０．１５Ｍ ＮａＣｌ勾配で溶出した。表示：ｎ．ｄ．決定されず。
【００８９】
５つの候補株のＢ群テトラサッカリドＡＭＣ基質を用いたＨＰＴＬＣ分析を、図４に示す。５つの株の活性は、Ｂ群テトラサッカリドＡＭＣ基質を、Ｈ トリサッカリドＡＭＣとして移動する生成物へと、そしていくつかの場合にはジサッカリドＡＭＣ誘導体へと、種々の程度で切断した。この後者は、夾雑したα−フコシダーゼ活性に起因する。
【００９０】
株２０５７および２３５７は、Ｂ群テトラサッカリド基質との最高の活性を発現した。αＧａｌ ｐ−ニトロフェニル基質との活性は、Ｂ群テトラサッカリド基質との活性と相関しなかった。精製の間に、この２つの活性は分離され得ることがさらに確認された。このことは、これらの２つの活性が、異なるタンパク質に由来したことを示す。株２３５７のみが、αＧａｌ ｐ−ニトロフェニル基質との活性を完全に欠損した。このことはさらなる分析をより容易にする。そしてこの活性を、さらなる精製および特徴付けのために選択した。＃２３５７の小規模発酵を実施し、そして酵素活性を、Ｆｒｅｎｃｈプレス（表ＶＩの説明文を参照のこと）後の溶解画分において見出した。
【００９１】
コロニー形態による株＃２３５７の血清型決定を、Ａｃｃｕｇｅｎｉｘ Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥによって実施し、これを放線菌類として確認した。５００塩基対のＳｈｏｒｔ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓによる遺伝子型決定は、株＃２３５７を、１．６０％差異で、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｐｌａｎｕｓの属に位置づけた。
【００９２】
（α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性についてのスクリーニング）
Ａ群テトラサッカリドＡＭＣ基質との顕著な活性を有する合計４つの株を同定した（表ＩＶ）。
【００９３】
（表ＶＩＩ：同定された４つのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性の基質特異性）
【００９４】
【表７】
【００９５】
１精製およびアッセイは、表ＶＩに対する説明文に記載の通り。
【００９６】
４つの候補株のＡ群テトラサッカリドＡＭＣ基質を用いたＨＰＴＬＣ分析を、図５ｂに示す。
【００９７】
Ａ群テトラサッカリド基質との顕著な活性を有する同定されたすべての株は、ｐ−ニトロフェニル誘導体とは、全くまたはほとんど検出可能なレベルの活性を示さなかった。
【００９８】
株８、１４８８、および１６４７は、Ａ群テトラサッカリド基質と最も高い活性を発現したが、＃８における活性のみが安定であり、そしてさらなる特徴付けのために回収され得た。この単離体を、さらなる分析のために選択した。小規模発酵を実施した。そして、酵素活性は、不溶性であり、そしてＦｒｅｎｃｈプレス後のペレット化画分と関連付けられることが見出された。
【００９９】
コロニー形態による株＃８の血清型決定を、Ａｃｃｕｇｅｎｉｘ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥによって実施し、これを放線菌類として確認した。５００塩基対のＳｈｏｒｔ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓによる遺伝子型決定は、株＃８を、０．００％差異で、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈａｔｔａｎｏｏｇｅｎｓｉｓの属に位置づけた。
【０１００】
上記のデータにより、この細菌が、複合的な血液型Ａ抗原およびＢ抗原の免疫優性なαＧａｌＮＡｃ残基またはαＧａｌ残基に対して独特な基質特異性を有するα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼエキソグリコシダーゼを含むことが示された。このような酵素は、赤血球において見出されるような基質に対するその高度に優先的または排他的な特異性に起因して、酵素学的な血球変換における使用に好ましいことが提案される。
【０１０１】
（実施例３：分枝血液型Ｂ抗原に対する排他的な基質特異性を有し、このような基質との予期せぬ高い比活性を有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株２３５７番から同定された新規のα−ガラクトシダーゼの単離および特徴付け）
２０リットルの発酵培養物を、フレンチプレス法により処理した。主なα−ガラクトシダーゼ活性が、１０，０００×ｇでの遠心分離後の上清に存在することを決定した。この上清を、硫酸アンモニウム沈殿により分画し、そして２０〜６０％画分に約７０％の活性を見出した。２０〜６０％カットの沈殿物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に溶解し、そして遠心分離により清澄化した。この上清を、Ｑ−セファロース（緩衝液２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０〜１．５ＭのＮａＣｌ勾配）、Ｓ−セファロース（緩衝液２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．３、０〜０．１ＭのＮａＣｌ勾配）、におけるクロマトグラフィー、およびＳ１２ゲル濾過クロマトグラフィー（０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．３、または０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ６．５）により連続的に分画した。この精製スキームを通じて、Ｂ四糖ＡＭＣ基質との酵素活性を、回収した画分においてモニタリングした。Ｇａｌα−ｐＮＰとの活性の欠如を、分離工程を通して確認した。最終的に精製した酵素活性を、ウシ血清アルブミン（標準）の溶出に類似する、分子量約７０，０００に対応して溶出したＳ１２クロマトグラフィーの画分において回収した（図６、パネルＡ）。Ｓ１２クロマトグラフィー画分のＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥ分析により、α−ガラクトシダーゼ活性を含む画分において複数のバンドが明らかになったが、ピーク活性を有する画分は、４０〜８０ｋＤの領域で移動するいくつかのバンドを含むに過ぎなかった（図６、パネルＢ）。
【０１０２】
最後のＳ１２クロマトグラフィー工程からプールした酵素ピークの比活性は、約１０Ｕ／ｍｇ（ＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥの銀染色および分子量マーカーにおけるタンパク質バンド中のタンパク質量と所望のタンパク質バンドとの比較により決定されたタンパク質）であった。ウシ血清アルブミンの溶出とこの活性の溶出を比較すると、活性がＢＳＡの後に溶出したことが明らかになった。このことは、この活性タンパク質が、ゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した場合、ＢＳＡより小さい（すなわち、６５ｋｄよりも小さい）分子サイズを有するという証拠を提供する（図９ｂ）。
【０１０３】
ピーク活性を含有するＳ１２クロマトグラフィーからプールした画分を、Ｃ４カラム（ＢｉｏＲａｄ）（緩衝液：０．１％ＴＦＡ、０〜１００％のアセトニトリル勾配）を用いた逆相クロマトグラフィーによりさらに精製した。溶出したタンパク質を、ＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥにより分析し、７０ｋＤに移動する所望のタンパク質バンドの大部分を含む画分をプールし、そして真空下で乾燥させた。プールした画分を、ＳＤＳ−ＮｕＰＡＧＥで再度泳動し、ＰＶＤＦ膜にブロットし、Ｒ−２５０で染色した（図７）。所望のタンパク質バンドを切り出し、そしてＭｏｄｅｌ １４０Ｃ Ｍｉｃｒｏｇｒａｄｉｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＳｙｓｔｅｍとＭｏｄｅｌ ７８５Ａ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒとを備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４９４ Ｐｒｅｃｉｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いたＮ末端配列決定に供した。以下のような単一の短い配列を得た：
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号１）。
【０１０４】
単離されたα−ガラクトシダーゼ活性は、均一に精製されていなかったので、得られた配列が、別のタンパク質に由来する可能性がある。この新規の酵素タンパク質およびそのコード遺伝子を単離および特徴付けるために、さらなる精製が必要であり、これは現在進行中である。
【０１０５】
そうであるとしても、この新規のα−ガラクトシダーゼ活性を高度に精製し、そしてこれは、Ｂ四糖を用いて、１０Ｕ／ｍｇを超える比活性を有した。この酵素調製物は、この新規の酵素の基質特異性および反応速度特性の詳細な研究を可能にした。精製された２３５７番α−ガラクトシダーゼの基質特異性を、末端α−Ｇａｌ残基を有するオリゴ糖および誘導体の大パネルを用いて特徴付けた。このアッセイを、上記のように、１〜４ｎｍｏｌの基質およびこの量のＢ四糖ＡＭＣ構造物を６０分以内に切断するのに必要とされる酵素量を用いて実施した。ＨＰＴＬＣ分析を、異なる時点で実施した。この分析の例を、図８に示す。精製された２３５７番α−ガラクトシダーゼ活性の基質特異性を、表ＶＩＩＩに要約する。
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
１表示：「＋」：切断が６０分以内に検出された、「−」：切断が、一晩のインキュベーションによって検出されなかった。直鎖三糖（トリサッカリド）およびＧａｌｉｌｉ Ｂ切断反応物を、ＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（３０：６０：１０）を用いるＨＰＴＬＣによって評価した。全ての他の切断反応物を、ＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ（６０：３５：８）を用いて分析した。
【０１０８】
比較のために、組換えコーヒーマメα−ガラクトシダーゼを、すべての分析に含めた。実施例１に記載した本発明者らの研究と一致して、コーヒーマメα−ガラクトシダーゼは、末端α−Ｇａｌ残基を含むすべての構造にて活性を示した。α１−３（血液型Ｂ、およびフコースを含まない「Ｇａｌｉｌｉエピトープ」）およびα１−４（血液型Ｐ１およびＰｋ）の両方が基質であった。そのオリゴサッカライド構造の長さまたは分枝のみが、相対的活性（すなわち、完了に達するに必要な酵素の量）に対して影響を有した（比活性のみを、Ｇａｌα ｐ−ニトロフェニルおよびＢテトラサッカライドＡＭＣについて決定した）。
【０１０９】
著しく対照的に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株＃２３５７から同定および精製した活性のみが、テトラサッカライドまたはそれより長いものとして提示された場合、血液型Ｂ構造にて活性を示す。この酵素がｐ−ニトロフェニルモノサッカライドαＧａｌ誘導体もメチル−ウンベリフリルモノサッカライドαＧａｌ誘導体も切断できないことは、モノサッカライドにて活性が欠如していることが、単にアグリカンおよび結合体化にのみ起因しないことを示した。結合化学に関連し得るトリサッカライド構造であるＧａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌ−ＡＭＣは、対応する構造Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ−ＯＧｒが基質として役立ったので、不活性であった。このこと以外は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ α−ガラクトシダーゼは、すべての分枝型Ｂ群関連構造（これは、すべて、赤血球上に見出される公知のＢ構造を示す（表１））を効率的に利用した。これは、血液型Ｂ構造に対して独特の基質特異性を示しかつヒト血液型抗原Ｐ１および希な抗原Ｐｋとの活性を示さない、最初のα−ガラクトシダーゼである。従って、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ α−ガラクトシダーゼによる赤血球の酵素的変換は、コーヒーマメα−ガラクトシダーゼ（Ｋｒｕｓｋａｌｌら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２０００；４０（１１）：１２９０〜８）を含む公知のα−ガラクトシダーゼによる処理とは対照的に、インタクトなＰ１抗原性を生じる。同様に、希なＰｋ抗原は、酵素的変換後にインタクトであると予測される。白色人種集団の約８０％が、赤血球上にＰ１抗原を発現し、そしてこの抗原の機能は未知であるが、Ａ血液型抗原およびＢ血液型抗原に対してのみ抗原除去を制限することは、酵素的変換において重要な改善であると見なされる。
【０１１０】
精製Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ α−ガラクトシダーゼの至適ｐＨを、図９に示されるように分析した。ＢテトラサッカライドＡＭＣ基質との酵素活性は、５．５〜７．０付近の広範な至適ｐＨを有した。従って、この酵素は、過去に使用した酵素とは対照的に、中性ｐＨにて、赤血球変換を実施すると予測される。
【０１１１】
これは、単純なモノサッカライド誘導体を超える血液型Ｂ構造または血液型Ａ構造について包括的な基質特異性を有するかまたは好ましい基質特異性さえ有する、同定された最初のα−ガラクトシダーゼ活性またはα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性である。α−ガラクトシダーゼ酵素は、１０Ｕ／ｍｇより高い血液型Ｂ構造との比活性を有し、これは、実施例１に記載されるようなコーヒーマメα−ガラクトシダーゼについて測定された比活性より５００倍高い。この情報は、同定され特徴付けられた他のすべてのα−ガラクトシダーゼについて利用可能ではないが、これらは、コーヒーマメα−ガラクトシダーゼと同じ乏しい特性を示しそうである。なぜなら、これらは、一般には、αＧａｌ ｐ−ニトロフェニル誘導体と効率的に機能し、そしてこれらをコードする遺伝子は、相同性であるからである。従って、本発明において同定されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ α−ガラクトシダーゼは、独特であり、先行技術において先行物は存在せず、そしてこの酵素について同定された速度論特性は、酵素的Ｂ型血球変換における性能について大きな期待を保持する。
【０１１２】
（実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される組換えα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの特徴付け）
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるように開示された組換えα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（カタログ番号Ｐ０７３４Ｂ）を最近市販した。この酵素は、私有株に由来し、報告によると、オリゴサッカライドおよびαＧａｌＮＡｃ ｐ−ニトロフェニルからの末端α−ＧａｌＮＡｃ結合の加水分解を触媒する（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．カタログ情報）。市販のエキソ−グリコシダーゼのスクリーニングにおいて、本発明者らは、このα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが、αＧａｌＮＡｃモノサッカライド誘導体と比較してＡテトラサッカライドＡＭＣ誘導体およびＡヘプタサッカライドＡＭＣ誘導体と比較的高い比活性を有する好ましい特徴を部分的に示すことを見出した（表ＩＸ）。重要なことには、この酵素の血液型Ａ誘導体との絶対的比活性は、例えば、ニワトリ肝酵素とかなり異なるわけではない。しかし、モノサッカライド基質と比較した相対的活性は、かなり異なる。従って、このデータは、Ｅ．ｃｏｌｉに発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが、血液型Ａ抗原について良好な相対的特異性を有することを示唆する。
【０１１３】
（表ＩＸ：Ｅ．ｃｏｌｉに発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの比活性）
【０１１４】
【表９】
【０１１５】
１アッセイ条件は、以下の通りであった：ｐ−ニトロフェニルを用いるアッセイを、０．０５マイクロモル（１００μＭ）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５または７．０）および０．５μｇ酵素を含む、反応体積０．５ｍｌにて行った。反応を、３７℃にて１０分間インキュベートし、そして等体積の０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）を添加することによりクエンチした。ＡＭＣ基質を用いるアッセイを、１ナノモル基質（１００μＭ）、５０ｍＭリン酸ナトリウムまたは０．２５Ｍグリシン（ｐＨ５．５または７．０）、および０．０５〜０．１μｇ酵素を含む、反応体積１０μｌにて行った。反応を、２６℃または３７℃にてインキュベートし、そして０分、１５分、３０分、および６０分の時点でＨＰＴＬＣにて分析した。タンパク質定量を、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用し秤量ＢＳＡを比較物として使用する半定量によって、実施した。
【０１１６】
Ｅ．ｃｏｌｉに発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの微細な基質特異性の分析により、このＥ．ｃｏｌｉに発現されたＮ−アセチルガラクトサミニダーゼが、ニワトリ肝α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼと同様に、等しく効率的な血液型Ａおよび反復Ａ構造を使用したことが明らかになった（表ＩＸ）。
【０１１７】
末端αＧａｌＮＡｃ残基を備える一群の非フコシル化オリゴサッカライド構造を用いるさらなる分析により、この酵素が、Ａ群分枝型基質と比較してこれらの基質とほぼ等しい効率を有することが示された（表Ｘ）。
【０１１８】
（表Ｘ：Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの基質特異性）
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】
１アッセイを、１〜４ナノモルの基質（１００〜４００μＭ）、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、および０．１２５μｇの酵素を含む１０μｌの反応混合物において実施した。反応物を、３１℃でインキュベートし、そして０分、３０分、６０分、および１２０分の時点で、ＨＰＴＬＣにより分析した。
【０１２１】
Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、図１０の単糖基質およびオリゴ糖基質の両方についてｐＨ６．０〜７．０を含む広範な至適ｐＨを示した。５．５を下回る酸性のｐＨにおいて、この活性は、迅速に減少し、そしてｐＨ４．４以下では、活性は、ほとんど検出不可能である。これは、赤血球変換に特徴的な好ましい中性の至適ｐＨと共に同定された最初のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼである。
【０１２２】
α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性は、以下の緩衝液の型にほとんど影響されなかった：５０〜２５０ｍＭグリシン、０．１Ｍグリシルグリシン、２０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム、１２．５〜２５．０ｍＭクエン酸ナトリウム、１２．５〜２５．０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび５．０〜１０．０ｍＭリン酸ナトリウム、ＭｃＩｌｖｉｎｅナトリウムｐＨ５．５、ＰＢＳ、ＭＥＳ。この酵素はまた、ＮａＣｌ（０〜１５０ｍＭ）、グルタチオンおよびｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドにより影響されなかった。
【０１２３】
最後に、単糖誘導体についての速度定数Ｋｍの評価により、この酵素が、実施例１（表ＩＶ）に記載されるニワトリ肝臓のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼまたはα−ガラクトシダーゼと比較して有意に低い見かけのＫｍを有すること（表ＸＩ）が明らかになった。
【０１２４】
（表ＸＩ：Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの、単糖誘導体との見かけのＫｍおよびＶｍａｘ）
【０１２５】
【表１１】
【０１２６】
１アッセイ条件は、以下の通りであった：ｐ−ニトロフェニルを用いるアッセイを、３．９〜５０ナノモル（１．５〜１００μＭ）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５またはｐＨ７．０）、および０．５μｇの酵素を含む０．５ｍｌの反応物容量で行った。反応物を、３７℃で１０分間、インキュベートし、そして等容量の２０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）を添加することによってクエンチした。遊離ｐ−ニトロフェノールの量を、４０５ｎｍでの吸光度で測定し、ｐ−ニトロフェノールの標準曲線と比較することによって決定した。ミカエリス−メンテン定数ＫｍおよびＶｍａｘを、ラインウェーバー−バークプロットから決定した。
【０１２７】
３Ｚｈｕら、（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８：４５６−４６２。
【０１２８】
さらに、予備実験の結果は、血液型Ａのオリゴ糖基質についてのＫｍが、同様に約２０μＭであることを示す。この決定のために用いられるアッセイは、四糖（テトラサッカリド）ＡＭＣ基質（ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃ−ＡＭＣ）を用いる基質／生成物比の濃度測定走査を包含した。このアッセイは、低濃度では信頼性がなく、従って、Ｋｍは、２０μＭより低くさえあることがあり得る。
【０１２９】
要するに、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、血液型Ａの基質について相対的に高い選択性を示し、中性ｐＨで血液型Ａ基質と最大の活性を示し、そして低いＫｍにより規定される有利な速度論的特性を示す。
【０１３０】
（実施例５：従来の型決定プロトコルにより評価される、Ｅ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いる、Ａ１赤血球およびＡ２赤血球からＯ表現型細胞への酵素的変換）
ヒトＡ型赤血球上の免疫優性Ａエピトープの完全な除去は、以前に、上で詳述されるように報告されていた。弱い（ｗｅａｋ）サブグループＡ２のＡ型血球の酵素的変換が、酸性のｐＨでニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いて報告されているが、変換の結果は、標準的な血液型決定手順において用いられる感度の高い型決定試薬および型決定方法により実証されなかった。以下の表ＸＩＩにおいて詳述されるように、種々の反応条件を用いるニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの能力を改善するための最初の試みは、完全に変換された細胞を産生することに失敗した。Ｄａｋｏ由来のモノクローナル抗Ａ抗体との反応性は、Ａ２細胞について破壊され得たが、一方で、より感度の高い試薬を用いる型決定は、Ａ型エピトープの酵素的分解が不完全であったことを明白に、明らかにした。
【０１３１】
（表ＸＩＩ．組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いるＡ１赤血球およびＡ２赤血球の変換１）
【０１３２】
【表１２】
【０１３３】
１ニワトリα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いる変換について用いたプロトコル：
３つの変換プロトコルを、組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いるＡ１赤血球およびＡ２赤血球について評価した。
【０１３４】
（変換プロトコル−Ａ）
ＥＤＴＡチューブに吸引しそして７日間まで４℃で保存した、Ａ２赤血球（Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４）中で３回洗浄し、そしてＰＢＳおよび７．５％ＰＥＧの溶液（ｐＨ７．４）中に１０％まで再懸濁した。細胞を、組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）を用いて、振盪しながら、３０℃で、１８０分間、処理した。細胞を、０．９％生理食塩水中で３回洗浄し、そして型決定のために生理食塩水中に３〜５％まで再懸濁した。
【０１３５】
（変換プロトコル−Ｂ）
ＥＤＴＡチューブに吸引したＡ１赤血球（Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）および白血球を減少させたＡ２赤血球（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｒｅｇｉｏｎ、Ｄｅｄｈａｍ、ＭＡ）を、ＡＡＢＢ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ、１３版、Ｍｅｔｈｏｄ６．６に従い、Ｇｌｙｃｅｒｏｌｙｔｅ５７（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ：Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）中で凍結し、そして−７０℃で保存した。酵素処理の前に、細胞を、９．０％の生理食塩水、２．５％生理食塩水、および０．９％生理食塩水を用いて脱グリセロールし（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ ＣｒｏｓｓによるＩｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＭｅｔｈｏｄｓのＭｅｔｈｏｄ １２５に従った）、ＰＢＳおよび７．５％ＰＥＧの溶液（ｐＨ７．４）中に５０％のヘマトクリットまで再懸濁し、そして組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）を添加した。反応物を、４時間にわたり撹拌しながら３７℃でインキュベートし、引き続き、０．９％生理食塩水で３回洗浄し、そして型決定のために生理食塩水中に３〜５％まで最終的に懸濁した。
【０１３６】
（変換プロトコル−Ｃ）
細胞の起源および保存は、プロトコルＢに記載したのと同様である。脱グリセロールした赤血球を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを有するＰＣＩ（ｐＨ５．５）中で２回洗浄し、そして１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＰＣＩ中に５０％ヘマトクリットまで再懸濁した。細胞を、４時間にわたり撹拌しながら３７℃で組換えニワトリ肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）で処理し、引き続き０.９％生理食塩水で３回洗浄し、そして型決定のために生理食塩水中に３〜５％まで最終的に懸濁した。
【０１３７】
表ＸＩＩのデータから、Ａ抗原の見かけ上の除去が、血液型決定手順（ＤＡＫＯ）について認可されていない１つの特定の抗血液型Ａ特異的モノクローナル抗体によって定義される場合、に達成されることが明らかである。多くのこのような抗体が存在し、そしてこれらの特異性および低い親和性結合に起因して、これらは、血清学的な型決定目的のために不適切である。従来使用されるポリクローナル抗体試薬に代わるＡＢＯの常用の型決定用のモノクローナルカクテルの開発は、１９９０年代の血液バンク産業にとって主要な成果であった。これらの高感度かつ認められた常用の型決定試薬によるＡ抗原の除去の分析は、ＤＡＫＯとは対照的に、凝集素価によって定義されるような、ごくわずかな変換しか生じない抗体を示した。この実施例において使用される型決定アッセイの詳細は、以下のとおりである：
赤血球凝集アッセイにおいて使用される認可された型決定試薬は、マウスモノクローナル抗体およびＯｒｔｈｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ；Ｇａｍｍｍａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ／Ｉｍｍｕｃｏｒ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡから入手される植物レクチンであった。非認可試薬としては、Ｄａｋｏ製のマウスモノクローナル抗Ａ抗体およびＨ．Ｃｌａｕｓｅｎによって製造される血液型Ａ改変体（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２（４）：１１９９−２０３，１９８５、Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８０−７，１９８６、Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５（２２）：７０７５−８５、１９８６、Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（２９）：１４２２８−３４，１９８７）に対するモノクローナル抗体のパネルが挙げられる。型決定試薬は、製造業者の推奨および滴定によって決定されるような他のモノクローナル抗体に従って使用された。
【０１３８】
赤血球凝集アッセイ（室温）
１．等張性血液バンク生理食塩水中の、３〜５％の洗浄された赤血球の懸濁液を調製した。
２．抗体／レクチン試薬を一滴（約５０μｌ）加えた。
３．赤血球懸濁液を一滴（約５０μｌ）加えた。
４．チューブを混合し、３５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。
５．細胞を穏やかな攪拌で再懸濁し、そして凝集について顕微試験した。
６．この凝集を、ＡＡＢＢ 技術マニュアル（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ）第１３版の方法１．８に従って、等級付けした。
【０１３９】
同様の結果を、精製したａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）製の真菌α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼで得た（示さず）。
【０１４０】
前述の実施例に記載するように、赤血球由来の血液型ＡまたはＢのエピトープを除去するのに使用するための好ましい酵素は、オリゴ糖基質が血液型ＡまたはＢの抗原と似ている、特に良好な力学的特性を有しているようである。このような好ましい力学的特性は、血液型ＡまたはＢのオリゴ糖についての好ましい基質特性または排他的な基質特性、および単糖−ｐＮＰ基質のような単純な単糖誘導体に対して低い活性を有するかまたは活性を有さないことで表され得る。好ましい力学的特性はまた、関連する基質に対する特に低いＫｍによって表され得る。さらに好ましい力学的特性は、関連する血液型活性基質に対する反応、および赤血球の品質および機能に適合する他の反応条件の中性の至適ｐＨからなる。酵素の他の好ましい特性（例えば、サイズ、電荷、溶解度、および他の物理化学的特性）はまた、赤血球の酵素変換における性能に関する。
【０１４１】
改良された力学的特性を有する新規のα−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、実施例２、３、および４に記載されるように、本発明の種々の細菌株から同定された。実施例４に記載されるα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）は、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼのような一例を示し、そして、上述の好ましい特性を有する酵素は、赤血球変換における優れた性能を示すという本発明者らの仮定を試験するために、十分に精製された組換え形態で利用可能であった。
【０１４２】
中性ｐＨでの赤血球変換における、このα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの性能は、表ＸＩＩＩに示される。このα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、常用の血液バンク型決定プロトコルによってＯとして規定される細胞型に、Ａ１およびＡ２赤血球の両方を完全に変換し得た。
【０１４３】
【表１３】
【０１４４】
プロトコル：白血球が減少した（ｌｅｕｋｏ−ｒｅｄｕｃｅｄ）赤血球（Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）またはボランティアから回収される赤血球（ＡＣＤ）は、０．９％の生理食塩水中で一旦洗浄され、そして３０％のヘマトクリットまで変換緩衝液中に再懸濁された。細胞を１０〜２０ｍＵ／ｍｌ（１単位（ｕｎｉｔ）は、他に記載される標準的な反応条件を使用して、１分間で１μｍｏｌの四糖ＡＭＣを加水分解する量の酵素として定義される）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理し、そして混合しながら２５℃にて６０分間インキュベートした。処理した細胞を０．９％の生理食塩水で１度洗浄し、生理食塩水中に３〜５％で再懸濁し、上記のとおりに型決定した。
【０１４５】
中性ｐＨで、１０〜２０ｍＵのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼで処理したＡ１サブタイプおよびＡ２サブタイプの両方の赤血球は、直接的な凝集アッセイにおいて抗Ａ型試薬に対して全体的に未反応性であった。酵素処理されたＡ細胞が、レクチンＵｌｅｘ
Ｅｕｒｏｐａｅｕｓに対して、コントロールのＯ細胞と等しく反応性になるかわりに、一般的に、抗Ｈ試薬として使用される。抗Ａ１試薬として一般的に使用されるＤｏｌｉｃｈｕｓ Ｂｉｆｌｏｒｕｓに対する反応性は、処理の始めの数分間で破壊された（示さず）。
【０１４６】
表ＸＩＶに示されるα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ処理された細胞の交差試験分析によって、両方のＡ１およびＡ２酵素が、Ｏコントロール細胞として振舞ったことが確認された。
【０１４７】
（表ＸＩＶ．ＮＥＢα-Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いた、変換されたＡ１
赤血球およびＡ２赤血球の交差一致分析（ｃｒｏｓｓ ｍａｔｃｈ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＩＳ，即時スピン（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｓｐｉｎ）））
【０１４８】
【表１４】
【０１４９】
この結果は、Ｏ型の個体とＢ型の個体（彼らは、Ａ型赤血球の血液型Ａ抗原に対する抗体の種々の力価を有する）が、免疫優勢なαＧａｌＮＡｃ残基が十分に取り除かれる場合、これら細胞を認識しないことを示す。「発明の背景」の節に記載し、そしてさらに表Ｉに示されるように、この結果は、実施例４における本発明者らの分析に合致する反復性の血液型Ａ型構造を含有する、より少量の糖スフィンゴ脂質がＨ関連Ａ型構造に完全に変換されることを示す（表Ｉ、構造２１）。さらに、このＨ関連Ａ型構造が免疫系によって正常なＨ抗原として認識されることを示す。このことは、マウスにおけるこの糖脂質抗原の免疫原性についての本発明者らの以前の研究と、合致する。（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１（３）１３８０−７、１９８６；Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８８−９２、１９８９）α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素単独での酵素的消化が、抗Ａ型決定試薬ならびにＯ型個体およびＢ型個体の血漿に対して、Ａ１赤血球およびＡ２赤血球を無反応性にさせるという知見は、新規であり、そして普遍的に受容可能な酵素で変換されたＯ型細胞を提供するための、商業的に実施可能な技術の開発における、重要な進歩である。酵素変換されたＢ細胞は、化学的に、Ｏ型細胞と同一であることが予測される一方、酵素変換されたＡ細胞は、Ｏ型としての表現型をとる（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）が、２つの異なる型のＨ抗原を有する。これら２つの大部分が、Ｏ型細胞上で見出される存在する２型Ｈ構造（表Ｉ、構造１８）であるが、また、マスクされたＡ型の三糖からなる内部構造を有する、少量のＨ糖脂質が存在する（表Ｉ、構造２１）。従って、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素単独で変換されたＡ型細胞は、前もって調製され、そして輸血薬中で使用された、Ｏ型細胞および任意の赤血球とは異なるが、これらは、Ｏ型細胞と同一に機能することが予測される。
【０１５０】
Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素を用いた、赤血球細胞の酵素変換のパラメーターについての詳細な研究を、最適化のために実施した。ｐＨは、Ａ型四糖ＡＭＣ基質に対する酵素活性の活性に影響を与えたが、試験し、そして以下に記載したパラメーターのいずれも、この活性には有意には影響しなかった。
【０１５１】
（緩衝系）
図１１に示されるように、最適な緩衝系は、２５０ｍＭ グリシンであるようである。ＮａＰ緩衝液およびＰＣＩ緩衝液（これらは、一般的にＢ細胞の酵素的変換のために使用される）における反応は、有意な変換を生成しなかった。
【０１５２】
（グリシン緩衝液のｐＨ）
Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、実施例４で、中性ｐＨの辺りで、幅広い至適ｐＨを有することが見出された。Ａ１細胞およびＡ２細胞の酵素的変換における至適ｐＨの分析は、ｐＨ７により規定された至適を明らかにした（図１２）。弱いＡ２細胞の変換は、７．５ｍＵ／ｍｌの酵素を用いて、ｐＨ６〜８のより幅広い範囲で達成したが、より少ない酵素を使用した場合は、至適はｐＨ７にあった（示さず）。
【０１５３】
（グリシン緩衝液のモル濃度）
グリシンの濃度は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いた、Ａ型細胞の酵素変換のための重要なパラメーターであることが見出された（図１３）。最適な変換は、２５０ｍＭ〜３００ｍＭで達成された。
【０１５４】
（酵素濃度）
図１４は、Ａ１細胞およびＡ２細胞を用いた、５〜５０ｍＵ／ｍｌの、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの滴定を図示する。Ａ１がＡ２よりも多くのＡ抗原性のエピトープを有することと一致して、Ａ１細胞を変換するためにより多くの酵素を必要とする。１〜１０ｍＵの、Ａ２細胞についての酵素の滴定は、使用された条件を用いて完全に変換するのに、３ｍＵ／ｍｌを必要とすることを明らかにした（示さず）。
【０１５５】
（処理の間の細胞濃度（ヘマトクリット）の影響）
一定量の酵素（２０ｍＵ）を用いた、２０％〜９０％の濃度でのＡ１細胞の処理は、細胞濃度の増加に伴い変換効率が減少することを示した（図１５）。より高濃度の酵素では変換はより速やかに生じたが、５０％より高い細胞濃度での変換効率は、比例して向上せず、最適な変換条件が２０％〜５０％であることを示唆する。
【０１５６】
（処理時間の影響）
図１６は、変換が酵素量および時間に比例することを示す。
【０１５７】
（温度の影響）
温度２０℃〜４０℃の間での、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼのサッカリド誘導体に対する活性は、同等であることが見出され、そして図１７に示される、Ａ型細胞の変換における酵素の能力は、このことを確認した。
【０１５８】
これらの結果は、本発明において規定される好ましい特有の速度論的特性を有するこの実施例において使用されるＥ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼにより例示される、１つのα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが、Ａ型細胞の酵素的変換における改善された性能を示すことを、明確に示す。Ａ１型細胞の変換（これは以前に達成されていない）を、中性のｐＨで、かつＡ２細胞およびＢ細胞を変換させるのに以前に使用された濃度より、かなり低い酵素タンパク質濃度で、好ましい酵素を用いて達成した。細胞の３０％懸濁物（ヘマトクリット）の変換のために使用された酵素量（１０〜２０ｍＵ／ｍｌ（これは３０〜６０μｇ／ｍｌに等価））は、Ａ赤血球およびＢ赤血球を酵素的に変換する先行技術において報告されている、いかなる酵素量よりも低い。
【０１５９】
本実施例において使用されるＥ．ｃｏｌｉ発現α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼとしてのエキソ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（これは、全てのＡ型血液構造体からのＧａｌＮＡｃを開裂することが可能である）により処理されるＡ１細胞およびＡ２細胞は、血液Ｏ型細胞上に見出されるような古典的なＨ２型鎖抗原（構造体１８、表１）を露出するが、これはまた、Ａ関連Ｈ構造体（構造体２１、表１）を有する、少量の糖脂質を残す。Ｈ２型（ＢＥ２）およびＨ３型（ＨＨ１４、ＭＢｒ−１）に対して特異的に反応するモノクローナル抗体についての研究（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８０〜７、１９８６年を参照のこと）は、予想されるように、エキソ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ処理したＡ細胞が、ＢＥ２と強く反応し、そしてＨＨ１４およびＭＢｒ−１とはより弱く反応したことを明らかにした（図示せず）。通常の血液型決定に使用される抗体を含む抗Ａ抗体は、処理細胞とは何ら反応しなかったので（表１３）、Ａ関連Ｈ糖脂質構造体は、Ａ抗原として認識されない。このことは、交差適合分析によりさらに確実となった（表１４）。Ｈ３型鎖抗体は、上記糖脂質と、Ｈ−ＧｌｏｂｏおよびムチンＨ型と称される構造体（それぞれ構造体２２および２１、表１）との間を、区別不能であるという事実に一致する（Ｃｌａｕｓｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６１（３）：１３８０〜７、１９８６年）。従って、エキソ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ処理したＡ細胞は、表現型的にＯ細胞として振る舞うが、それらは、より少ない量の特有Ｈ糖脂質抗原を有することにより、Ｏ細胞とは構造的に異なる。従って、Ｏ型として型決定する、Ａ型酵素で変換された細胞は、万能の輸血可能な血液型として非常に有用である新規な実体を構築する。
【０１６０】
実施例３において規定される新規なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ酵素は、本実施例において使用されるα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼと比較して３０倍以上の特性を有し、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ酵素および類似の特性を有する他の酵素は、酵素的赤血球変換において、同様により良く機能すると予想される。
【０１６１】
（等価物）
当業者は、本明細書で記載される特定の手順に対する多くの等価物を認識するか、または通常の実験以上のものを使用せずに、確認し得る。このような等価物は、本発明の範囲内にあると考えられ、そして、添付の特許請求の範囲によって包含される。種々の置換、変更、および改変が、添付の特許請求の範囲により規定されるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に対してなされ得る。他の局面、利点、および改変は、本発明の範囲内にある。本出願の全体を通じて引用される、全ての引用文献、ＵＲＬ、発行された特許、および公開された特許出願の内容は、本明細書で参考として援用される。これらの特許、出願および他の文献の適切な構成要素、プロセス、および方法が、本発明および本発明の実施形態のために選択され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図９】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図５ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図５ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−１５３５２５（Ｐ２００９−１５３５２５Ａ）
【公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８９６１９（Ｐ２００９−８９６１９）
【出願日】平成２１年４月１日（２００９．４．１）
【分割の表示】特願２００３−５３０８１７（Ｐ２００３−５３０８１７）の分割
【原出願日】平成１４年９月２５日（２００２．９．２５）
【出願人】（５０２１５２６２１）ザイムクエスト， インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１日（２００９．４．１）
【分割の表示】特願２００３−５３０８１７（Ｐ２００３−５３０８１７）の分割
【原出願日】平成１４年９月２５日（２００２．９．２５）
【出願人】（５０２１５２６２１）ザイムクエスト， インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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