【課題】新しいαアミラーゼを設計する方法及びその使用方法を提供する。
【解決手段】酸性、中性及びアルカリ性のpH並びに上昇した温度において、増加した活性及び増加した安定性を有し、特定の塩基配列を有する遺伝子にコードされた、特定のアミノ酸配列を有するαアミラーゼ及び該アミラーゼをコードする核酸、該酵素に特異的に結合し得る抗体、更に該酵素を生産する方法。また該酵素の、食品、洗浄、繊維処理、紙加工等への、各種利用方法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)αアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ,47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297又は299に記載の核酸配列を有する核酸に対して少なくとも90％、95％、97％又は100％の配列同一性を有する前記核酸配列；
(b)αアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ,47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297又は299に記載の核酸配列を有する核酸と高ストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする前記核酸配列；
(c)αアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列であって、前記ポリペプチドが配列番号2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296若しくは298に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、95％、97％又は100％の配列同一性を有する前記核酸配列；
(d)(a)〜(c)のいずれかに記載の核酸配列であって、シグナル配列を欠くαアミラーゼをコードする、前記核酸配列；または、
(e)(a)、(b)、(c)又は(d)の配列に対して相補的な配列、
を含む単離、合成又は組換え核酸。
【請求項２】
(a)配列番号2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296若しくは298に記載のアミノ酸配列又はこれらの酵素的に活性な断片に対して少なくとも90％、95％又は100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、αアミラーゼ活性を有する単離、合成又は組換えポリペプチド；
(b)請求項１に記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、αアミラーゼ活性を有する単離、合成又は組換えポリペプチド；または、
(c)(a)または(b)に記載のポリペプチドであって、シグナル配列を欠く、前記ポリペプチド。
【請求項３】
(a)請求項２記載のポリペプチドに特異的に結合し得る、単離または組換え抗体、または、
(b)モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、または単一鎖抗体である、(a)記載の抗体。
【請求項４】
(i)(a)請求項１記載の核酸を提供する工程、および、
(b)ポリペプチドをコードする前記核酸を、前記ポリペプチド発現を可能にする条件下で宿主細胞に導入する工程、を含む、ポリペプチドを生産する方法、
または、
(ii)さらに、請求項１記載の核酸によって発現された前記ポリペプチドを単離することを含む、（ｉ）記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）(a)請求項１に記載の核酸を提供すること；及び
(b)前記核酸において一つ以上のヌクレオチド残基を別のヌクレオチド残基に改変すること、前記核酸において一つ以上のヌクレオチド残基を欠失すること、又は前記核酸に一つ以上のヌクレオチド残基を付加すること、を含む変異ポリヌクレオチドを作製する方法、
または、
(ii)ヌクレオチド残基の改変、付加および／または欠失が、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、アセンブリーPCR、有性PCR変異誘発、in vivo変異誘発、カセット変異誘発、帰納的アンサンブル変異誘発、指数的アンサンブル変異誘発、部位特異的変異誘発、遺伝子リアセンブリー、遺伝子部位飽和変異誘発及びこれらの方法の組合せからなる群より選択される方法によって導入される、(i)に記載の方法。
【請求項６】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む組成物、を提供する工程、
および、
(b)前記組成物を、ポリサッカライド結合またはオリゴサッカライド結合の加水分解を促進する条件下で、前記ポリペプチドと接触させる工程、
を含む、
ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む基質をαアミラーゼ活性を有するポリペプチドと接触させることを含む、ポリサッカライド結合またはオリゴサッカライド結合を加水分解する方法、
または、
(ii)ポリサッカライド結合またはオリゴサッカライド結合がデンプン結合であるまたはデンプン結合を含む、(i)記載の方法、
または、
(iii)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドまたはデンプンが、コメ、発芽米、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、マメ科植物若しくはサツマイモである、または、コメ、発芽米、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、マメ科植物若しくはサツマイモから単離された、またはコメ、発芽米、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、マメ科植物若しくはサツマイモに由来する、(i)または(ii)記載の方法、または
(iv)さらに、第２のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼまたはこれらの組合せを添加することを含む、(i)〜(iii)のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
(a)請求項１記載の核酸を含む核酸プローブ、
(b)さらに検出可能な同位体標識または非同位体標識を含む、(a)記載の核酸プローブ、または、
(c)さらに、蛍光分子、化学発光分子、酵素、コファクター、酵素基質またはハプテンを含む、(a)記載の核酸プローブ。
【請求項８】
(a)請求項１に記載の核酸を含むベクター；または、
(b)クローニングベクター若しくは発現ベクター、哺乳動物発現ベクター、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、または細菌人工染色体（BAC）である、(a)記載のベクター。
【請求項９】
(a)請求項１に記載の核酸を含む宿主細胞、または、
(b)原核細胞、真核細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は植物細胞である、(a)記載の宿主細胞。
【請求項１０】
(i)(a)請求項2記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む組成物、を提供する工程、および、
(b) 前記組成物を、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドの液化（加水分解）の触媒作用を促進する条件下で、前記ポリペプチドと接触させる工程、
を含む、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを液化する方法、
(ii)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドがデンプンを含むまたはデンプンである、(i)記載の方法、
(iii)液化（加水分解）反応が液化シロップを生成する、(i)記載の方法、
(iv)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドが、コメ、発芽米、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、マメ科植物若しくはサツマイモである、若しくはコメ、発芽米、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、マメ科植物若しくはサツマイモから単離された、または、コメ、発芽米、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、マメ科植物若しくはサツマイモに由来する、(i)〜(iii)のいずれかに記載の方法、または、
（v）さらに、第２のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼまたはこれらの組合せを添加することを含む、(i)〜(iv)のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法によって製造される液化シロップ。
【請求項１２】
アミラーゼ活性を有する、請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドと、対象物とを、洗浄に十分な条件下で接触することを含む、対象物を洗滌するための方法。
【請求項１３】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む繊維製品、を提供する工程、および、
(b)前記繊維製品を、前記繊維製品の処理に十分な条件下で、前記ポリペプチドと接触させる工程、を含む、繊維製品の処理方法、
(ii)繊維製品の処理方法が繊維製品の糊抜きを含む、(i)記載の方法、または、
（iii）さらに、第2のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼ、またはこれらの組合せを添加すること含む、(i)または（ii）記載の方法。
【請求項１４】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、リグノセルロース繊維を含む組成物、を提供する工程、および、
(b)前記組成物を前記処理に十分な条件下で、前記ポリペプチドと接触させる工程、を含む、リグノセルロース繊維の処理方法、または、
(ii)さらに、第2のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼ、またはこれらの組合せを添加すること含む、(i)記載の方法。
【請求項１５】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、紙パルプ、を提供する工程、および、
(b)脱インクに十分な条件下で、前記紙パルプと前記ポリペプチドとを接触させる工程、を含む、紙パルプの酵素的脱インキ方法、
(ii)紙パルプが再生紙パルプである、(i)記載の方法、または、
(iii)さらに、第2のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼまたはこれらの組合せを添加することを含む、（i）または(ii)に記載の方法。
【請求項１６】
(a)請求項２記載のポリペプチドを含むポリペプチド、または請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、洗浄剤または洗浄剤添加物、を含む洗浄剤または洗浄剤添加物、または、
(b)さらに第２のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼまたはこれらの組合せを含む、(a)記載の洗浄剤または洗浄性添加物。
【請求項１７】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む組成物、を提供する工程、および、
(b)前記組成物を、前記ポリペプチドが前記ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドの液化（加水分解）するに十分な条件下で、前記ポリペプチドと接触させる工程、を含む、高マルトースシロップ又は高グルコースシロップ又は混合シロップを製造する方法、
(ii)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドがデンプンであるまたはデンプンを含み、可溶性デンプン加水分解物を生成する、(i)記載の方法、
(iii)さらに、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドまたは可溶性デンプン加水分解物の糖化を含み、それによりシロップが生成されることを含む、(i)または（ii）記載の方法、
(iv)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドまたはデンプンが、コメ、発芽米、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、マメ科植物若しくはサツマイモである、または、コメ、発芽米、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、マメ科植物若しくはサツマイモから単離された、またはコメ、発芽米、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、マメ科植物若しくはサツマイモに由来する、(i)〜(iii)のいずれかに記載の方法、または、
(v)さらに、第２のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼまたはこれらの組合せを添加することを含む、(i)〜(iv)のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む組成物、を提供する工程、
(b)産出流体を掘削穴から流れ出させること、
(c)前記構造物からの前記産出流体の流量を期待流速より減少させること、
(d)水溶性流体と(a)記載のポリペプチドとを一緒に混合することによって、酵素処理剤を調剤すること、
(e)前記掘削穴内部の所望する位置に前記酵素処理剤をポンプで注入すること、および、
(f)前記酵素処理剤に前記粘着性でデンプンを含む有害な流体を分解させること、を含む、
産出作業の間に形成され、完成した掘削穴を囲む地下構造物内に見出される、粘着性でデンプンを含む有害な流体を除去することによって、前記地下構造物からの産出流体の流量を増加させる方法、
(ii)流体が地下構造物から前記掘削穴の表層に移動する、(i)記載の方法、または、
(iii)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドがデンプンであるまたはデンプンを含む、(i)〜(iii)のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む組成物、を提供する工程、および、
(b)前記組成物を、前記ポリペプチドが前記ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドの液化（加水分解）を触媒するに十分な条件下で、前記ポリペプチドと接触させる工程、を含むアルコールの製造方法、
(ii)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドがデンプンであるまたはデンプンを含み、加水分解が可溶性デンプン加水分解物を生成する、(i)記載の方法、
(iii)さらに、液化または加水分解されたポリサッカライドまたはオリゴサッカライドの発酵を含む、(i)または(ii)記載の方法、
(iv)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドまたはデンプンが、コメ、発芽米、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、マメ科植物若しくはサツマイモである、または、コメ、発芽米、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、マメ科植物若しくはサツマイモから単離された、または、コメ、発芽米、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、マメ科植物若しくはサツマイモに由来する、(i)〜(iii)のいずれかに記載の方法、
(v)さらに、第２のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼまたはこれらの組合せを添加することを含む、(i)〜(iv)のいずれかに記載の方法、または、
(vi)製造されるアルコールがエタノールを含む、(iii)記載の方法。
【請求項２０】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む組成物、を提供する工程、および、
(b)前記組成物を、前記ポリペプチドが前記ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドの液化（加水分解）を触媒するに十分な条件下で、前記ポリペプチドと接触させる工程、を含む，トウモロコシの湿式粉砕方法、
(ii)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドがデンプンであるまたはデンプンを含む、(i)記載の方法、または、
(iii)さらに、第２のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼまたはこれらの組合せを添加することを含む、(i)または（ii）に記載の方法。
【請求項２１】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む組成物、を提供する工程および、
(b)前記組成物を、前記ポリペプチドが前記ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドの液化（加水分解）を触媒するに十分な条件下で、前記ポリペプチドと接触させる工程、を含むパン焼き方法、
(ii)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドがデンプンであるまたはデンプンを含む、(i)記載の方法、または、
(iii)さらに、第２のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼまたはこれらの組合せを添加することを含む、(i)または(ii)記載の方法。
【請求項２２】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む組成物、を提供する工程、および、
(b)前記組成物を、前記ポリペプチドが前記ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドの液化（加水分解）を触媒するに十分な条件下で、前記ポリペプチドと接触させる工程、を含む掘削方法、
(ii)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドがデンプンであるまたはデンプンを含む、(i)記載の方法、または、
(iii)さらに、第２のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼまたはこれらの組合せを添加することを含む、(i)または(ii)記載の方法。
【請求項２３】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む組成物、を提供する工程、および、
(b)前記組成物を、前記ポリペプチドが前記ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドの液化（加水分解）するに十分な条件下で、前記ポリペプチドと接触させる工程、を含む醸造加工方法、
(ii)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドがデンプンであるまたはデンプンを含む、(i)記載の方法、または、
(iii)さらに、第２のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼまたはこれらの組合せを添加することを含む、(i)または(ii)記載の方法。
【請求項２４】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、リグノセルロース繊維またはポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む紙またはパルプ、を提供する工程、および、
(b)紙またはパルプを、前記ポリペプチドが前記リグノセルロース繊維またはポリサッカライドまたはオリゴサッカライドの液化（加水分解）を触媒することのできる条件下で、前記ポリペプチドと接触させる工程、を含む紙またはパルプ加工方法、
(ii)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドがデンプンであるまたはデンプンを含む、(i)記載の方法、
（iii）パルプが再生紙パルプである、(i)または(ii）記載の方法、または、
(iv)さらに、第２のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼまたはこれらの組合せを添加することを含む、(i)〜(iii)のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
(i)(a)請求項２記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む飼料、を提供する工程、および、
(b)前記飼料を前記ポリペプチドと、前記ポリペプチドが前記ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドの液化（加水分解）するに十分な条件下で接触または混合する工程、
を含む、飼料の製造方法、
(ii)ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドがデンプンであるまたはデンプンを含む、(ii)記載の方法、または、
(iii)飼料組成物が、トウモロコシ、コムギ、マイロ、ソルガム、ライムギおよび／又はブルガーを含む、(i)または（ii）に記載の方法、または、
(iv)さらに、第２のアミラーゼ、αアミラーゼまたはβアミラーゼまたはこれらの組合せを添加することを含む、(i)〜(iii)のいずれかに記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９ａ】

【図９ｂ】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４ａ−１】

【図１４ａ−２】

【図１４ｂ−１】

【図１４ｂ−２】

【図１４ｂ−３】

【図１４ｃ−１】

【図１４ｃ−２】

【図１４ｃ−３】

【図１４ｃ−４】

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【公開番号】特開２０１１−１７２５６６（Ｐ２０１１−１７２５６６Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２２８８（Ｐ２０１１−２２２８８）
【出願日】平成２３年２月４日（２０１１．２．４）
【分割の表示】特願２００８−１３６８７６（Ｐ２００８−１３６８７６）の分割
【原出願日】平成１４年２月２１日（２００２．２．２１）
【出願人】（５０３０８９４８９）ヴェレニウム　コーポレイション (31)
【Ｆターム（参考）】