αリポイルビタミンＥ誘導体を有効成分とする抗サイトカイン介在疾患剤
【課題】炎症性サイトカインが介在して発症または悪化する疾患、特に敗血症性ショック、急性臓器障害や臓器不全、虚血再還流によって生じる各種臓器障害の予防または治療に有効な医薬組成物、及びその有効成分である新規化合物を提供することを目的とする。
【解決手段】下記一般式（Ｉ）で示されるαリポイルビタミンＥ誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする：
〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子またはメチル基を示す〕。
【解決手段】下記一般式（Ｉ）で示されるαリポイルビタミンＥ誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする：
〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子またはメチル基を示す〕。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にＴＮＦ−α及びＩＬ−６等の炎症性サイトカインが介在して発症または悪化する疾患（サイトカイン介在疾患）の予防及び治療に有効な抗サイトカイン介在疾患剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの病態においてサイトカインの増加はその病態悪化に密接な関係があることが示されている。サイトカインの種類としては多数存在するが、腫瘍壊死因子α（以下、「ＴＮＦ−α」という）は、様々な細胞への刺激（例えば、リポ多糖体（ＬＰＳ））または外部細胞性ストレス（例えば、浸透圧ショックおよび過酸化物）に応答して、単球およびマクロファージを含む様々な細胞によって分泌される重要なサイトカインである。
【０００３】
基底レベルを上回るＴＮＦ−αのレベルの上昇は幾つかの疾患状態への介在またはこの悪化に関連付けられており、これらの疾患状態にはパジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性および慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛が含まれる。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２を含む）、および帯状疱疹もＴＮＦ−αの上昇によって悪化することが知られている。
【０００４】
更に、ＴＮＦ−αは頭部外傷、脳卒中、および虚血においてもその臓器障害に重要な役割を果たすことが報告されている。例えば、頭部外傷ラットにおいて、ＴＮＦ−αのレベルは打撲を負った半球において増加した（非特許文献１）、中央脳動脈が閉塞された虚血ラットにおいては、ＴＮＦ−αの ｍＲＮＡが増加した（非特許文献２）、との報告があり、この点においてもサイトカインが臓器障害に重要な役割を演じていることが示されている。
【０００５】
具体的な組織におけるＴＮＦ−αの働きとしては、ラット皮質へのＴＮＦ−αの投与による毛細血管における好中球の著しい堆積および小血管内での付着を生じることが報告されている。このＴＮＦ−αは複雑なサイトカインカスケードにおける上流因子である。結果として、ＴＮＦ−αのレベルの上昇は他の様々なサイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＩＬ−８のレベルの上昇につながり得る。よってＴＮＦ−αは、他のサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６）やケモカインの浸潤を促進し、これが梗塞領域への好中球浸潤を促進することが報告されている（非特許文献３）。
【０００６】
ＩＬ−６はT細胞やマクロファージ等の細胞により産生されるレクチンであり、液性免疫を制御するサイトカインの一つである。ＩＬ−６は１９８６年に相補的ＤＮＡ（cDNA）がクローニングされ、その後、ＩＬ−６は種々の生理現象や炎症・免疫疾患の発症メカニズムに関与していることが明らかになった。また炎症部位または傷害（例えば虚血）部位でのＩＬ−６の産生が介在する多くの疾患状態の悪化および／または発症が関連付けられている(非特許文献４)。さらに、虚血再還流障害においてもＩＬ−６の抑制が臓器障害改善効果をもたらすことが報告されている（非特許文献５）。これらのことからこのような疾患状態には、例えば喘息、炎症性腸疾患、乾癬、成人呼吸促進症候群、心臓および腎臓再還流傷害、血栓症並びに糸球体腎炎が含まれるといえる。
【０００７】
ＴＮＦ−αの効果を遮断するのに幾つかのアプローチが採用されている。１つのアプローチは、ＴＮＦ−αの可溶性受容体（例えば、ＴＮＦＲ−５５またはＴＮＦＲ−７５）の使用であり、ＴＮＦ−α介在疾患状態の動物モデルにおいて効力が認められている。第２のアプローチはＴＮＦ−αに特異的なモノクローナル抗体、ｃＡ２を用いてＴＮＦ−αを中和する方法である（非特許文献６）。また、ＩＬ−６の抑制が虚血再還流障害における病態を改善することも報告されており（非特許文献５）、これらのアプローチは、タンパク質分離または受容体拮抗のいずれかによってＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の効果を遮断するというものである。
【０００８】
またＴＮＦ−αを始めとするサイトカインが介在する疾患の治療に１，４，５−トリ置換イミダゾール、縮合トリアゾール、及びインダゾールなどの複素環化合物を用いることも提案されている（特許文献１及び２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2004-99622号公報
【特許文献２】特表2008-504294号公報
【特許文献３】特開2004-217669号公報
【特許文献４】特開2009-227632号公報
【特許文献５】特表2003-535134号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Shohamiら、J. Cereb. Blood Flow Metab. 14, 615(1994)
【非特許文献２】Feursteinら、Neurosci. Lett. 165, 125 (1993)
【非特許文献３】Feurstein、Stroke 25, 1481 (1994)
【非特許文献４】Frink Mら、Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2009 Sep 27;17(1):49.
【非特許文献５】Kimizuka Kら、Am J Transplant. 2004 Apr;4(4):482-94.
【非特許文献６】Feldmannら．5 Immunological Reviews, pp.195-223 (1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、炎症性サイトカイン（特に、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）が介在して発症または悪化する疾患（本発明ではこれを「サイトカイン介在疾患」と称する）の予防または治療に有効な医薬組成物（本発明ではこれを「抗サイトカイン介在疾患剤」と称する）を提供することを目的とする。より詳細には、炎症、並びに炎症によって生じる各種の病態、例えば敗血症性ショック、急性臓器障害や臓器不全を予防または治療したり、また虚血再還流によって生じる各種臓器障害を保護するために有用な医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねていたところ、下記の一般式（１）で示されるαリポイルビタミンＥ誘導体に、細胞刺激因子（リポ多糖体（ＬＰＳ））による組織の炎症、並びに炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）やサイトカインメディエーター（ＨＭＧＢ１）の誘導を有意に抑制する作用があり、また炎症性サイトカインによる炎症性分子（ｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ−１）の発現誘導をも有意に抑制されることを見出し、かかる知見から、αリポイルビタミンＥ誘導体（Ｉ）が抗炎症剤として有効であるとともに、炎症性サイトカイン（特に、ＴＮＦ−αやＩＬ−６）が介在して発症または悪化する疾患の予防または治療剤として有効であることを確信した。
【００１３】
ちなみに、従来からα−リポ酸やビタミンＥに抗炎症作用があることが知られているものの、（例えば特許文献３〜５等参照）、α−リポ酸は安定性が悪いため用法や用途が限られるなどの問題があり、それを安定化するための技術の確立が求められていた。また、ビタミンＥも酸化しやすく、着色などの劣化を受けやすいことが知られている。これに対して、本発明が提供するαリポイルビタミンＥ誘導体は、α−リポ酸やビタミンＥに比べて安定した化合物であり、用法や取り扱いに制限されずに、広く用いることができる。
【００１４】
本発明は上記のかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施態様を包含する。
（Ｉ）αリポイルビタミンＥ誘導体及びその製造方法
（I-1）下記一般式（Ｉ）で示されるαリポイルビタミンＥ誘導体：
【００１５】
【化１】
【００１６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示す）。
【００１７】
（I-2）上記炭素数１〜３の低級アルキル基がメチル基である、（I-1）に記載するαリポイルビタミンＥ誘導体。
（I-3）一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が同時に水素原子である化合物を除く、（I-1）に記載するαリポイルビタミンＥ誘導体。
（I-4）一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がいずれもメチル基である、（I-1）に記載するαリポイルビタミンＥ誘導体。
（I-5）αリポ酸と下記一般式（II）で示されるビタミンＥ誘導体とをエステル結合する工程を有する、（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載するαリポイルビタミンＥ誘導体（Ｉ）の製造方法：
【００１８】
【化２】
【００１９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示す）。
【００２０】
（I-6）上記エステル結合する工程が、混合酸無水物法を用いてエステル結合する工程である（I-5）に記載する製造方法。
【００２１】
（II）医薬組成物
（II-1）（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載するαリポイルビタミンＥ誘導体（Ｉ）を有効成分とする、医薬組成物。
（II-2）サイトカイン介在疾患を予防または治療するための抗サイトカイン介在疾患剤である、（II-1）記載の医薬組成物。
（II-3）上記サイトカイン介在疾患が、炎症性サイトカインが介在して発症または悪化する炎症性疾患であって、上記抗サイトカイン介在疾患剤が抗炎症剤である（II-2）記載の医薬組成物。
（II-4）サイトカイン介在疾患が、パジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性およ慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛からなる群から選択されるいずれか少なくとも１つである（II-2）に記載する医薬組成物。
（II-5）抗サイトカイン介在疾患剤が、敗血症性ショック、急性臓器障害または臓器不全の予防又は治療剤である（II-2）に記載する医薬組成物。
（II-6）抗サイトカイン介在疾患剤が、敗血症性ショックによる臓器障害または虚血再還流障害に対する臓器若しくは組織の保護剤である（II-2）に記載する医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】製造例１で製造したα−リポイルα−トコフェロール（α−リポ酸α−トコフェロールエステル）のＩＲデータを示す。
【図２】実験例１において各群に分けたラット（対照群、LPS群、Lipoyl-VE＋LPS群、VE＋LPS群）のうち、対照群（図Ａ〜Ｃ）、LPS群（図Ｄ〜Ｆ）、及びLipoyl-VE＋LPS群（図Ｇ〜Ｉ）にリポ多糖類（LPS）を投与し、12時間後に採取した肺組織の光学顕微鏡画像を示す。なお、図Ａ→Ｂ→Ｃの順、図Ｄ→Ｅ→Ｆの順、及び図Ｇ→Ｈ→Ｉの順で、画像の表示倍率を上げている。
【図３】図１の肺組織の結果を、鬱血、浮腫、炎症及び出血のパラメーター毎に各群（対照群、LPS群、Lipoyl-VE＋LPS群）の組織学的スコアで示したものである（黒棒：対照群、白棒：LPS群、斜線棒：Lipoyl-VE＋LPS群）。結果は平均値±SDとして示す。* は、LPS群に対して有意差（p<0.05）があることを示す。
【図４】LPS群（―□―）、Lipoyl-VE＋LPS群（―●―）、及びVE＋LPS群（―▲―）について、LPS投与前、LPS投与から3時間目、6時間目及び12時間目に血液を採取し、各血清中のTNF-α濃度（図４（Ａ））、血清中のIL-6濃度（図４（Ｂ））を測定した結果を示す（実験例１）。
【図５】LPS群（―■―）およびLipoyl-VE＋LPS群（―●―）について、LPS投与から3時間目、6時間目及び12時間目に血液を採取し、各血清中のHMGB1濃度を測定した結果を示す（実験例１）。データは、平均値±SDとして示す。*はLPS群に対して有意差（P<0.05）があることを示す。
【図６】対照群、LPS群およびLipoyl-VE＋LPS群の肺組織中のiNOS、ICAM-1、及びHMGB1の発現を測定した結果を示す（実験例１（2-4））。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、下記一般式（Ｉ）で示される新規なαリポイルビタミンＥ誘導体に関する。また、本発明は下記一般式（Ｉ）で示されるαリポイルビタミンＥ誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物に関する。
【００２４】
【化３】
【００２５】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示す。〕。
【００２６】
当該αリポイルビタミンＥ誘導体（以下、本明細書において、これを「本化合物」ともいう）は、式（Ｉ）で表されるように、α−リポ酸と下式（II）で示されるビタミンＥ誘導体とがエステル結合してなる化学構造を有している。
【００２７】
【化４】
【００２８】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記と同じ意味を示す。〕。
【００２９】
なお、上記式（Ｉ）及び（II）中、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３で示される炭素数１〜３の低級アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、及びイソプロピル基を挙げることができる。好ましくはメチル基及びエチル基であり、より好ましくはメチル基である。一般式（II）及び（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がいずれもメチル基である化合物は、それぞれα−トコフェロール（II-1）及びα−リポイルα−トコフェロール（I-1）（製造例１参照）；Ｒ１とＲ２がメチル基、Ｒ３が水素原子である化合物は、それぞれβ−トコフェロール（II-2）及びα−リポイルβ−トコフェロール（I-2）（製造例４参照）；Ｒ１及びＲ３がメチル基、Ｒ２が水素原子である化合物は、それぞれγ−トコフェロール（II-3）及びα−リポイルγ−トコフェロール（I-3）（製造例２参照）；Ｒ１がメチル基、Ｒ２及びＲ３が水素原子である化合物は、それぞれδ−トコフェロール（II-4）及びα−リポイルδ−トコフェロール（I-4）（製造例３参照）である。
【００３０】
一般式（Ｉ）で示されるαリポイルビタミンＥ誘導体として好ましくは、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がいずれもメチル基であるα−リポイルα−トコフェロールである。
【００３１】
本化合物は、α−リポ酸と上記式（II）で示されるビタミンＥ誘導体（好ましくはα−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロールまたはδ−トコフェロール）の製造法はαリポ酸の重合化を防ぐためにも、塩基性条件下でのエステル化法である混合酸無水物法が適している。一例として、製造例１〜４に示すように、α−リポ酸をトリエチルアミンとともにアセトニトリルまたはテトラハイドフラン（THF）などの無極性溶媒に溶解しておき、これにクロロ炭酸エチルまたは2,4,6-トリクロロ安息香酸クロリド等を用いて、低温条件下（例えば、-5℃〜0℃程度）で、ビタミンＥ誘導体（II）を反応させることによって、他のエステル化法と比較して安価に且つ高収率に本化合物（αリポイルビタミンＥ誘導体）を製造することができる。
【００３２】
斯くして製造される本化合物は粗生成物（油状組成物）の状態であってもよいが、上記反応物をイソプロピルエーテルで抽出後、抽出物をアルカリ水や水で洗浄し、次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどを用いて精製することもできる。
【００３３】
後述する実験例１（2-2）及び（2-3）に示すように、α−リポイルα−トコフェロール（実験例１では「lipoyl-VE」と称する）を始めとする本化合物は、リポ多糖類（LPS）で誘導された炎症性サイトカイン(IL-6およびTNF-α)及びサイトカインメディエーター（HMGB1）の生成または分泌を、完全ではないものの抑制することができる。
【００３４】
これらのサイトカイン(IL-6およびTNF-α)は、通常ＬＰＳによって強く誘導され、炎症反応の初期の段階で生成分泌される。特にＴＮＦ−αは炎症を仲介する主要因子であり、その放出はさらにＩＫ−１βおよびＩＬ−６のような他のサイトカインを活性化し、細胞の損傷に関わることも知られている(Bone RC. Crit Care Med1996;24:163-172)。またＴＮＦ−αは、敗血症性ショックと関係する初期のショック状態(つまり低血圧、熱)や臓器不全の病因に極めて重要な役割を果たしている(Russell JA. N Engl J Med2006;355:1699-1713)。実験例１に示すように、上記本化合物は、これらの炎症性サイトカインの生成または分泌を顕著に抑制することから、当該化合物によれば、かかる炎症性サイトカインが介在して発症したり悪化したりする疾患（サイトカイン介在疾患）を予防または改善できると考えられる。
【００３５】
一方、ＩＬ−６は敗血症の重篤度や致死によく関連しており、敗血症の予測因子でもある(Remick DG, et al., Shock2002;17:463-467)。ＩＬ−６もまた、敗血症性ショックおよび臓器障害の病因に重要な役割を果たすと考えられている(Frink M, et al., Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2009 Sep 27;17(1):49.)。あるデータは、ＩＬ−６の上昇制御が、その後に生じるＩＬ−６上昇に関連した細胞毒性や臓器障害に関係していることを示している（Frink M, et al., Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2009 Sep 27;17(1):49.）。さらには、ＩＬ−６の制御が臓器障害の軽減作用を有している可能性が示唆されている（Kimizuka K, et al., Am J Transplant. 2004 Apr;4(4):482-94.）。後述する実験例１において、ＬＰＳで誘導された炎症性サイトカイン（IL-6、TNF-α）が、インビボで、本化合物の経口投与で減少することが確認された。本化合物の経口投与による炎症性サイトカインの抑制は、細胞に対する直接効果であるか、あるいは実験例１（2-4）に示すように、ｉＮＯＳやＩＣＡＭ−１の発現抑制を介してサイトカイン生成を抑制することによる間接的な効果によるものであるかもしれないが、いずれにしても本化合物によれば、炎症性サイトカイン（IL-6、TNF-α）の生成が抑制され、ＩＬ−６による細胞毒性は低下し、敗血症性ショックや臓器障害を改善することができると考えられる。
【００３６】
これを裏付ける実験として、後述の実験例１（2-1）では、ＬＰＳで誘導される全身性炎症モデルラットにおいてみられる肺における急性臓器障害が、本化合物の経口投与により有意に予防ないし抑制されることを示している。
【００３７】
また従来から、虚血再還流に起因する臓器障害が炎症性サイトカイン生成に関係していることが示唆されており、心筋と大脳の虚血再還流（I/R）によって炎症性サイトカインが増加することが報告されている(Zhang M, Chen L. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 2008 Sep;8(3):161-72.)。前述するよう本化合物は、炎症性サイトカインを低減させる作用を有するが、当該サイトカイン低減作用に基づいて血清サイトカイン濃度を著しく低下させる結果、腎虚血再還流障害や脳虚血再還流障害等の虚血性再還流障害が保護され防止できると考えられる。
【００３８】
前述するように、実験例１（2-3）において、α−リポイルα−トコフェロールを始めとする本化合物は、ＬＰＳで誘導されたサイトカインメディエーター（HMGB1）の生成または分泌を抑制することができるが、当該ＨＭＧＢ１は、後期の炎症応答を増幅し、サイトカイン分泌を促進することが知られている物質である（van Zoelen MA, et al., Shock 2009;31:280-284）。また最近では、敗血症ショック時の末期の炎症性メディエーターとして、また虚血再還流障害の初期のメディエーターとして機能することが知られている（Tsung A, et al., J Exp Med 2005; 201:1135-1143）。
【００３９】
以上のことから、本化合物は、炎症性サイトカイン、特にＴＮＦαやＩＬ−６が介在して発症若しくは悪化する疾患（サイトカイン介在疾患）、特に全身性炎症及びそれに付随する疾病（例えば、敗血症性ショック、急性臓器障害、臓器不全等）を予防または治療するための有効成分として有用であり、当該本化合物を有効成分とする本発明の医薬組成物は、かかるサイトカイン介在疾患の予防または治療剤、またサイトカイン介在疾患から保護する保護剤として有用である。
【００４０】
本発明が対象とするサイトカイン介在疾患としては、炎症性疾患；パジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性および慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛を挙げることができる。
【００４１】
特に本発明のサイトカイン介在疾患剤は、炎症性サイトカインが介在して発生する敗血症性ショック、急性臓器障害または臓器不全を予防又は治療する薬剤として、またさらに虚血再還流障害に対する臓器または組織の保護剤として有効に利用することができる。なお、虚血再還流障害（「虚血再灌流障害」ともいう）とは、虚血状態にある臓器や組織に血液再還流が生じたときに、その臓器や組織内の微小循環において種々の毒性物質の産生が惹起されることで引き起こされる障害である。かかる虚血再還流障害は、例えば脳梗塞、心筋梗塞及び腸間膜血管閉塞症などに対する再還流障害後や、臓器移植後にみられることが多い。その発生機序としては、スーパーオキシドやヒドロキシラジカル等の活性酸素や一酸化窒素などのフリーラジカル産生による障害、及び活性化好中球と血管内皮細胞の相互作用に基づく障害のほか、各種サイトカインなどのケミカルメディエーター産生による障害などが考えられている。虚血再還流障害は、虚血状態に陥った局所だけでなく、二次的に全身の主要臓器にも障害（遠隔臓器障害）をきたすことが知られている。特に脳、肺、肝臓、腎臓などが標的臓器となり、多臓器不全をもたらすこともある。
【００４２】
本化合物を抗サイトカイン介在疾患剤の有効成分として用いる場合、目的と必要に応じて、本化合物のうち１種または２種以上を適宜組み合わせて含有させることもできる。本化合物のうち、好ましくは、上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３で示される低級アルキル基が、メチル基である化合物であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３がいずれもメチル基であるα−リポイルα−トコフェロールである。
【００４３】
本化合物は、抗サイトカイン介在疾患剤として、経口的にあるいは非経口的〔静脈投与、皮下投与、経皮投与、経肺投与、経粘膜投与（点鼻など）、直腸投与など〕に投与される。好ましくは経口投与である。抗サイトカイン介在疾患剤は、本化合物を、経口または非経口投与に通常用いられる薬学的に許容される担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊補助剤、滑沢剤、湿潤剤など）や添加剤などと混合し、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、バッカル剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、硬カプセル剤を含む）、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、軟膏剤、点眼剤、注射剤、点滴剤、点鼻剤などの所望の形態に製剤化することにより調製することができる。
【００４４】
特に本化合物は、水に不溶性の油溶性であるので、エマルジョンの形態に調製することも可能である。
【００４５】
これらの製剤には通常用いられる薬学的に許容される担体、例えば、結合剤（例えば、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドン）、賦形剤（例えば、乳糖、砂糖、コーンスターチ、リン酸カリウム、ソルビット、グリシン）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉）、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、増粘剤、分散剤等、またその他の添加剤として、再吸収促進剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤等を適宜使用してもよい。
【００４６】
本化合物を抗サイトカイン介在疾患剤として使用する際の投与量は、使用する本化合物の種類、患者の体重や年齢、対象とする疾患の種類やその状態および投与方法などによっても異なるが、たとえば、本化合物の量に換算して、注射剤の場合は成人１日１回約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、錠剤等の経口投与剤の場合は、成人１日数回、１回量約１ｍｇ〜約１００ｍｇ程度投与するのがよい。また、点眼剤等のような粘膜投与剤の場合は、成人１日数回、１回数滴、濃度が約０．０１〜５（ｗ／ｖ）％の製剤を投与するのがよい。
【００４７】
本化合物を含有する医薬組成物（抗サイトカイン介在疾患剤）には、本発明の目的に反しない限り、その他の抗炎症剤、抗サイトカイン介在疾患剤または別種の薬効成分を適宜含有させてもよい。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明の構成および効果を製造例及び実験例に基づいてより詳細に説明する。但し、これらの実験例等は一例であり、本発明はかかる実験例によって何ら拘束されるものではない。
【００４９】
[製造例]
製造例１
α−リポイルα−トコフェロール（α−リポ酸 α−トコフェロールエステル）の製造
α‐リポ酸2.06g（0.01モル）およびトリエチルアミン1.1gをアセトニトリル20mlに溶かして−5℃に冷却しておき、撹拌しながら、これにクロロ炭酸エチル1.1gを徐々に滴下した。滴下終了後、5〜10分後に、さらにTHF 30mlにα−トコフェロール4.3g（0.01モル）を溶かしたもの（10〜20℃）を一挙に加えて15分間撹拌した。次いでこれを室温（25℃）に戻して、さらに約１時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をイソプロピルエーテルで抽出して、抽出物を１％水酸化ナトリウムおよび水で洗い、イソプロピルエーテルを留去させることにより、残渣油状物を約6g得た。
【００５０】
この残渣油状物を、順相のシリカゲル（和光純薬工業（株）製）を担体としたカラムクロマトグラフィーに供して、ｎ−ヘキサンとイソプロピルエーテルを5：3の容量比で含む溶媒を用いて展開溶出して分画した（温度条件：室温（25℃））。各画分の一部を、それぞれ順相のシリカゲルを担体とした薄層クロマトグラフィーに供して、ｎ−ヘキサンとイソプロピルエーテルを5：3の容量比で含む溶媒を用いて展開し、α−トコフェロールのスポットとα−リポ酸のスポットとの間に位置する新しいスポットの出現を確認した。かかるスポットを有する画分を集めて濃縮し、標記の目的化合物（α−リポイルα−トコフェロール）の淡黄色油状物3.5g（収率56.6％）を得た。斯くして製造したα−リポイルα−トコフェロールをＩＲに供した結果を図１に示す。図１に示すように、2850〜2980cm-1にα−トコフェロールに起因するメチレン基に相当するピークと、1730 cm-1にα−リポイルに起因するカルボキシル基に相当するピークが確認されたことから、当該化合物はα−リポイルα−トコフェロールの構造を備えていると判断された。
【００５１】
また、得られたα−リポイルα−トコフェロールを順相のシリカゲルを担体とした薄層クロマトグラフィーに供して、ｎ−ヘキサンとイソプロピルエーテルを5：3の容量比で含む溶媒を用いて展開したところ、単一スポットを示し、そのＲｆは0.43であった。
【００５２】
製造例２
α−リポイルγ−トコフェロール（α−リポ酸 γ−トコフェロールエステル）の製造
α‐リポ酸を0.5g（0.0024モル）、トコフェロールとしてγ−トコフェロールを1.0g（0.0024モル）用いて、製造例１と同様に処理して、標記の目的化合物（α−リポイルγ−トコフェロール）の淡黄色油状物530mg（収率35.0 ％）を得た。
【００５３】
なお、得られたα−リポイルγ−トコフェロールを順相のシリカゲルを担体とした薄層クロマトグラフィーに供して、ｎ−ヘキサンとイソプロピルエーテルを5：3の容量比で含む溶媒を用いて展開したところ、単一スポットを示し、Ｒｆは0.42であった。
【００５４】
製造例３
α−リポイルδ−トコフェロール（α−リポ酸 δ−トコフェロールエステル）の製造
α‐リポ酸を2.06g（0.01モル）、トコフェロールとしてδ−トコフェロールを4.0g（0.01モル）用いて、製造例１と同様に処理して、標記の目的化合物（α−リポイルδ−トコフェロール）の淡黄色油状物3.0g（51.0％）を得た。
【００５５】
なお、得られたα−リポイルδ−トコフェロールを順相のシリカゲルを担体とした薄層クロマトグラフィーに供して、ｎ−ヘキサンとイソプロピルエーテルを5：3の容量比で含む溶媒を用いて展開した結果、単一スポットを示し、Ｒｆは0.41であった。
【００５６】
製造例４
α−リポイルβ−トコフェロール（α−リポ酸 β−トコフェロールエステル）の製造
α‐リポ酸を0.5g（0.0024モル）、トコフェロールとしてβ−トコフェロールを1.0g（0.0024モル）用いて、製造例１と同様に処理して、標記の目的化合物（α−リポイルβ−トコフェロール）の淡黄色油状物550mg（収率36.3 ％）を得た。なお、得られたα−リポイルβ−トコフェロールを順相のシリカゲルを担体とした薄層クロマトグラフィーに供して、ｎ−ヘキサンとイソプロピルエーテルを5：3の容量比で含む溶媒を用いて展開した結果、単一スポットを示し、Ｒｆは0.42であった。
【００５７】
製造例１〜４で製造したα−リポ酸のトコフェロールエステルは、いずれも既存のトコフェロールに比べて、空気中に放置しても色調に変化がなく酸化が進んでないことを示し、安定性において優れていることが確認された。また、重合しやすく不安定なα−リポ酸と比べても格段に安定性に優れている。
【００５８】
［実験例］
下記の実験において、α−リポイルビタミンＥ誘導体の一例として、下式で示されるα−リポイルα−トコフェロール（本化合物）を用いた。この化合物は親油性（油溶性）で、上記するように安定であることを特徴とする。
【００５９】
【化５】
【００６０】
実験例
腫瘍壊死因子α(TNF-α)およびインターロイキン-6（IL-6）のような前炎症性サイトカインの過剰発現は、ショックや臓器障害に関与している(Bhatia M, et al., J Pathol2004;202:145-156)。
【００６１】
そこで下記の実験例では、上記本化合物が、サイトカイン（TNF-α、IL-6）の生成または分泌を阻害し、それにより、リポ多糖体（LPS）で誘導する全身性炎症モデルラット（敗血症モデルラット）における臓器障害を予防ないし改善するかどうかについて調べた。
【００６２】
なお、データはすべて平均値±ＳＤとして示し、一元配置分散分析(ANOVA)を使用して評価した。 p-値<0.05を統計的有意とした。
【００６３】
（１）被験動物
体重２５０-３００ｇの雄性ラット（Wister rat）を使用した。ラットはすべて、実験前後に食物と水を無制限に摂取できるようにした。研究は大分大学医学部の動物研究の倫理委員会によって承認された。すべてのプロトコルは国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに沿って行った。麻酔は４％のセボフルラン（丸石製薬（株）製）を用いて行った。
【００６４】
実験例１ ＬＰＳ処置ラットに対するαリポイルビタミンＥの影響
（１）試験方法
上記雄性ラットを無作為に、1)対照群、2)ＬＰＳ群、3)リポイルビタミンＥ群（lipoyl-VE＋LPS群）、及び4)ビタミンＥ群（VE＋LPS群）の４群に分け、これらの各群に、胃管を用いて、1)生理食塩水（0.9% NaCl水溶液、以下同じ）、2)生理食塩水、3)リポイルビタミンＥ（1mmol/kg）、及び4)ビタミンＥ（1mmol/kg）をそれぞれ経口投与した。投与から１時間経過した後、2)〜4)の３群のラットにはＬＰＳ(10mg/kg)を尾静脈に静脈注射し、また1)の対照群には生理食塩水を尾静脈に静脈注射した。ＬＰＳ又は生理食塩水の静注から３、６、及び１２時間後に採血して血清サイトカイン（TNF-α、IL-6）濃度を測定して、その経時的変化を評価するとともに、静注から１２時間後に各群のラットから肺を取り出し、摘出肺の組織について組織学的評価を行った。
【００６５】
（２）試験結果
（2-1）光学顕微鏡分析
ＬＰＳ又は生理食塩水の静注から１２時間後に採取した各群（対照群、LPS群[生理食塩水＋LPS]、Lipoyl-VE＋LPS群）のラットの肺の組織標本を定法に従ってホルマリンに固定し、パラフィン内に埋設し、ミクロトーム上で切片を作成した。作成した切片をヘマトキシロンとエオシンで染色した。
【００６６】
そのサンプルを分析し、村上の技術(Murakami K, et al., Shock2002;18:236-241)に基づいて肺障害の程度を決定した。肺実質中の24のエリアを、４つのパラメーター（鬱血、浮腫、炎症および出血）に関して０〜４の５段階に類別した（０：無しまたは正常にみえる、１：軽度、２：中度、３：重度、４：非常に重度）。
【００６７】
肺組織の染色切片を光学顕微鏡で観察した結果を図２に示す。肺の組織変化は対照群(図１Ａ〜Ｃ)では観察されなかったが、LPS群（生理食塩水＋LPS群）の肺組織で顕著な間質性の浮腫および炎症細胞の浸潤がみとめられた(図１Ｄ〜Ｆ)。本化合物で処置した「Lipoyl-VE＋LPS群」では、間質性の浮腫および炎症細胞の浸潤が、LPS群と比較して、顕著に低減されていた(図１Ｇ〜Ｉ)。肺組織に関する組織学的スコアの結果を図３に示す。これからわかるように、LPS群（白棒）の肺組織の組織学的スコアは、対照群（黒棒）のスコアと比較して、すべて著しく高く、本化合物で処置した「Lipoyl-VE＋LPS群」（斜線棒）のスコアはその中間であった。
【００６８】
この結果から、ＬＰＳ投与で誘導される全身性炎症モデル動物（敗血症モデル動物）における肺組織の急性障害が、予め本化合物を投与しておくことにより有意に予防できることが判明した。
【００６９】
（2-2）血清ＴＮＦ−α、及びＩＬ−６レベルに対するαリポイルビタミンＥの影響
ＬＰＳ又は生理食塩水の静注から３、６及び１２時間後に、各群（対照群、LPS群[生理食塩水＋LPS]、Lipoyl-VE＋LPS群、VE＋LPS群）のラットから採取した血液をサンプルとして、血清サイトカイン濃度（TNF-α、IL-6）を測定し、血清サイトカインに対する本化合物の影響を調べた。なお、血清中のＴＮＦ-αおよびＩＬ−６の濃度は、市販のＥＬＩＳＡキットとＴＮＦ-αおよびＩＬ−６のそれぞれに対するラット特異的モノクローナル抗体（Invitrogen社）を用いて分析した。吸光度は540nmで測定した(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ)。
【００７０】
血清中のＴＮＦ-α濃度及びＩＬ−６濃度の経時的変化を、図４Ａ及びＢにそれぞれ示す。
【００７１】
血清中のＴＮＦ−α濃度は、対照群では増加は認められなかったが（結果示さず）、LPS群（---□---）、Lipoyl-VE＋LPS群（―●―）、及びVE＋LPS群（―▲―）では増加が認められ、いずれもLPS投与後３時間でピークに達した。しかし、その増加の程度は、Lipoyl-VE＋LPS群（―●―）は、LPS群（---□---）と比較して著しく低く、さらにVE＋LPS群（―▲―）と比較しても有意に低かった(図４Ａ)。同様に、血清中のＩＬ−６濃度は、対照群では増加は認められなかったが（結果示さず）、LPS群（---□---）、Lipoyl-VE＋LPS群（―●―）、及びVE＋LPS群（―▲―）はともに、LPS投与後３時間でピークに達した (図４Ｂ)。しかし、その増加の程度は、ＴＮＦ−α濃度と同様に、LPS群（---□---）及びVE＋LPS群（―▲―）と比較して、Lipoyl-VE＋LPS群（―●―）では有意に低かった(図４Ｂ)。
【００７２】
これらの結果から、ＬＰＳ投与（LPS刺激）によって誘導されるサイトカイン（TNF-α、IL-6）はいずれも本化合物により有意に抑制されることが判明した。
【００７３】
（2-3）血清ＨＭＧＢ１レベルに対するαリポイルビタミンＥの影響
ＨＭＧＢ１（high-mobility group box1 protein）は、３０ｋＤの非ヒストン性染色体関連タンパク質であり（Bianchi ME, et al., Science, 1898;243:1056-1059）、その血清中の濃度は、重度の敗血症や敗血症ショックにより増加することが報告されている（Wang H, et al., Science 1999; 285:248-251）。また、ＨＭＧＢ１は、後期の炎症応答を増幅し、サイトカイン分泌を促進することが知られているが（サイトカインメディエーター）（van Zoelen MA, et al., Shock 2009;31:280-284）、最近、敗血症ショック時の末期の炎症性メディエーターとして、また虚血再還流障害の初期のメディエーターとして機能することがわかっている（Tsung A, et al., J Exp Med 2005; 201:1135-1143）。また、局所的な疾患では、関節リウマチや炎症性腸疾患などでもＨＭＧＢ１濃度が上昇することが報告されている。
【００７４】
ＬＰＳ又は生理食塩水の静注から３、６及び１２時間後に、各群（対照群、LPS群[生理食塩水＋LPS]、Lipoyl-VE＋LPS群）のラットから採取した血液をサンプルとして、血清ＨＭＧＢ１濃度を測定し、血清ＨＭＧＢ１に対する本化合物の影響を調べた。なお、血清中ＨＭＧＢ１の濃度は、市販のＥＬＩＳＡキットとＨＭＧＢ１に対するラット特異的モノクローナル抗体（Invitrogen社）を用いて分析した。吸光度は540nmで測定した(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ)。
【００７５】
血清中のＨＭＧＢ１濃度の経時的変化を、図５にそれぞれ示す。
【００７６】
血清中のＨＭＧＢ１濃度は、対照群では増加は認められなかったが（結果示さず）、LPS群（―■―）、及びLipoyl-VE＋LPS群（―●―）では経時的に増加が認められ、いずれもLPS投与後１２時間でピークに達した。しかし、その増加の程度は、LPS群（―■―）と比較して、Lipoyl-VE＋LPS群（―●―）では著しく低かった(図５)。
【００７７】
この結果から、ＬＰＳ投与（LPS刺激）によって誘導されるＨＭＧＢ１は本化合物の投与により有意に抑制されることが判明した。
【００７８】
（2-4）ｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ−１及びＨＭＧＢ１の発現に対するリポイルビタミンＥの影響
各群（対照群、LPS群、Lipoyl-VE＋LPS群）のラットの肺組織中の、ｉＮＯＳ（inducible nitric oxide synthase）、ＩＣＡＭ−１（Intercellular adhesion molecule-1）及びＨＭＧＢ１の発現状況を、Western blottingを用いて調べた。結果を図６に示す。図６に示すように、LPS群では、ｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ−１及びＨＭＧＢ１の発現がいずれも増加していたのに対して、lipoyl-VE＋LPS群では、それらの増加が顕著に抑制されていた。
【００７９】
この結果から、本化合物による炎症性サイトカインの誘導抑制作用は、本化合物がｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ−１及びＨＭＧＢ１等の炎症性分子の発現を抑制することを一つのメカニズムとすることが示唆される。つまり、本化合物は、炎症のカギとなるタンパク質の発現を抑制し、それに基づいて抗炎症作用を発揮するものと考えられる。
【００８０】
結論として、上記の実験例から、本化合物は、炎症性サイトカインの分泌を抑制することで、炎症性サイトカインが介在する各種の疾患、例えば、炎症や炎症が関係する各種の疾患、並びにそれによって生じる臓器や組織の障害の発生を阻止する作用を有していると考えられる。つまり、本化合物による処置で、炎症だけでなく、並びに敗血症性ショックや虚血再還流によって生じる各種臓器の障害（急性臓器障害、臓器不全）も保護し防止できると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にＴＮＦ−α及びＩＬ−６等の炎症性サイトカインが介在して発症または悪化する疾患（サイトカイン介在疾患）の予防及び治療に有効な抗サイトカイン介在疾患剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの病態においてサイトカインの増加はその病態悪化に密接な関係があることが示されている。サイトカインの種類としては多数存在するが、腫瘍壊死因子α（以下、「ＴＮＦ−α」という）は、様々な細胞への刺激（例えば、リポ多糖体（ＬＰＳ））または外部細胞性ストレス（例えば、浸透圧ショックおよび過酸化物）に応答して、単球およびマクロファージを含む様々な細胞によって分泌される重要なサイトカインである。
【０００３】
基底レベルを上回るＴＮＦ−αのレベルの上昇は幾つかの疾患状態への介在またはこの悪化に関連付けられており、これらの疾患状態にはパジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性および慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛が含まれる。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２を含む）、および帯状疱疹もＴＮＦ−αの上昇によって悪化することが知られている。
【０００４】
更に、ＴＮＦ−αは頭部外傷、脳卒中、および虚血においてもその臓器障害に重要な役割を果たすことが報告されている。例えば、頭部外傷ラットにおいて、ＴＮＦ−αのレベルは打撲を負った半球において増加した（非特許文献１）、中央脳動脈が閉塞された虚血ラットにおいては、ＴＮＦ−αの ｍＲＮＡが増加した（非特許文献２）、との報告があり、この点においてもサイトカインが臓器障害に重要な役割を演じていることが示されている。
【０００５】
具体的な組織におけるＴＮＦ−αの働きとしては、ラット皮質へのＴＮＦ−αの投与による毛細血管における好中球の著しい堆積および小血管内での付着を生じることが報告されている。このＴＮＦ−αは複雑なサイトカインカスケードにおける上流因子である。結果として、ＴＮＦ−αのレベルの上昇は他の様々なサイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＩＬ−８のレベルの上昇につながり得る。よってＴＮＦ−αは、他のサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６）やケモカインの浸潤を促進し、これが梗塞領域への好中球浸潤を促進することが報告されている（非特許文献３）。
【０００６】
ＩＬ−６はT細胞やマクロファージ等の細胞により産生されるレクチンであり、液性免疫を制御するサイトカインの一つである。ＩＬ−６は１９８６年に相補的ＤＮＡ（cDNA）がクローニングされ、その後、ＩＬ−６は種々の生理現象や炎症・免疫疾患の発症メカニズムに関与していることが明らかになった。また炎症部位または傷害（例えば虚血）部位でのＩＬ−６の産生が介在する多くの疾患状態の悪化および／または発症が関連付けられている(非特許文献４)。さらに、虚血再還流障害においてもＩＬ−６の抑制が臓器障害改善効果をもたらすことが報告されている（非特許文献５）。これらのことからこのような疾患状態には、例えば喘息、炎症性腸疾患、乾癬、成人呼吸促進症候群、心臓および腎臓再還流傷害、血栓症並びに糸球体腎炎が含まれるといえる。
【０００７】
ＴＮＦ−αの効果を遮断するのに幾つかのアプローチが採用されている。１つのアプローチは、ＴＮＦ−αの可溶性受容体（例えば、ＴＮＦＲ−５５またはＴＮＦＲ−７５）の使用であり、ＴＮＦ−α介在疾患状態の動物モデルにおいて効力が認められている。第２のアプローチはＴＮＦ−αに特異的なモノクローナル抗体、ｃＡ２を用いてＴＮＦ−αを中和する方法である（非特許文献６）。また、ＩＬ−６の抑制が虚血再還流障害における病態を改善することも報告されており（非特許文献５）、これらのアプローチは、タンパク質分離または受容体拮抗のいずれかによってＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の効果を遮断するというものである。
【０００８】
またＴＮＦ−αを始めとするサイトカインが介在する疾患の治療に１，４，５−トリ置換イミダゾール、縮合トリアゾール、及びインダゾールなどの複素環化合物を用いることも提案されている（特許文献１及び２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2004-99622号公報
【特許文献２】特表2008-504294号公報
【特許文献３】特開2004-217669号公報
【特許文献４】特開2009-227632号公報
【特許文献５】特表2003-535134号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Shohamiら、J. Cereb. Blood Flow Metab. 14, 615(1994)
【非特許文献２】Feursteinら、Neurosci. Lett. 165, 125 (1993)
【非特許文献３】Feurstein、Stroke 25, 1481 (1994)
【非特許文献４】Frink Mら、Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2009 Sep 27;17(1):49.
【非特許文献５】Kimizuka Kら、Am J Transplant. 2004 Apr;4(4):482-94.
【非特許文献６】Feldmannら．5 Immunological Reviews, pp.195-223 (1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、炎症性サイトカイン（特に、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）が介在して発症または悪化する疾患（本発明ではこれを「サイトカイン介在疾患」と称する）の予防または治療に有効な医薬組成物（本発明ではこれを「抗サイトカイン介在疾患剤」と称する）を提供することを目的とする。より詳細には、炎症、並びに炎症によって生じる各種の病態、例えば敗血症性ショック、急性臓器障害や臓器不全を予防または治療したり、また虚血再還流によって生じる各種臓器障害を保護するために有用な医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねていたところ、下記の一般式（１）で示されるαリポイルビタミンＥ誘導体に、細胞刺激因子（リポ多糖体（ＬＰＳ））による組織の炎症、並びに炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）やサイトカインメディエーター（ＨＭＧＢ１）の誘導を有意に抑制する作用があり、また炎症性サイトカインによる炎症性分子（ｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ−１）の発現誘導をも有意に抑制されることを見出し、かかる知見から、αリポイルビタミンＥ誘導体（Ｉ）が抗炎症剤として有効であるとともに、炎症性サイトカイン（特に、ＴＮＦ−αやＩＬ−６）が介在して発症または悪化する疾患の予防または治療剤として有効であることを確信した。
【００１３】
ちなみに、従来からα−リポ酸やビタミンＥに抗炎症作用があることが知られているものの、（例えば特許文献３〜５等参照）、α−リポ酸は安定性が悪いため用法や用途が限られるなどの問題があり、それを安定化するための技術の確立が求められていた。また、ビタミンＥも酸化しやすく、着色などの劣化を受けやすいことが知られている。これに対して、本発明が提供するαリポイルビタミンＥ誘導体は、α−リポ酸やビタミンＥに比べて安定した化合物であり、用法や取り扱いに制限されずに、広く用いることができる。
【００１４】
本発明は上記のかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施態様を包含する。
（Ｉ）αリポイルビタミンＥ誘導体及びその製造方法
（I-1）下記一般式（Ｉ）で示されるαリポイルビタミンＥ誘導体：
【００１５】
【化１】
【００１６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示す）。
【００１７】
（I-2）上記炭素数１〜３の低級アルキル基がメチル基である、（I-1）に記載するαリポイルビタミンＥ誘導体。
（I-3）一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が同時に水素原子である化合物を除く、（I-1）に記載するαリポイルビタミンＥ誘導体。
（I-4）一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がいずれもメチル基である、（I-1）に記載するαリポイルビタミンＥ誘導体。
（I-5）αリポ酸と下記一般式（II）で示されるビタミンＥ誘導体とをエステル結合する工程を有する、（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載するαリポイルビタミンＥ誘導体（Ｉ）の製造方法：
【００１８】
【化２】
【００１９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示す）。
【００２０】
（I-6）上記エステル結合する工程が、混合酸無水物法を用いてエステル結合する工程である（I-5）に記載する製造方法。
【００２１】
（II）医薬組成物
（II-1）（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載するαリポイルビタミンＥ誘導体（Ｉ）を有効成分とする、医薬組成物。
（II-2）サイトカイン介在疾患を予防または治療するための抗サイトカイン介在疾患剤である、（II-1）記載の医薬組成物。
（II-3）上記サイトカイン介在疾患が、炎症性サイトカインが介在して発症または悪化する炎症性疾患であって、上記抗サイトカイン介在疾患剤が抗炎症剤である（II-2）記載の医薬組成物。
（II-4）サイトカイン介在疾患が、パジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性およ慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛からなる群から選択されるいずれか少なくとも１つである（II-2）に記載する医薬組成物。
（II-5）抗サイトカイン介在疾患剤が、敗血症性ショック、急性臓器障害または臓器不全の予防又は治療剤である（II-2）に記載する医薬組成物。
（II-6）抗サイトカイン介在疾患剤が、敗血症性ショックによる臓器障害または虚血再還流障害に対する臓器若しくは組織の保護剤である（II-2）に記載する医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】製造例１で製造したα−リポイルα−トコフェロール（α−リポ酸α−トコフェロールエステル）のＩＲデータを示す。
【図２】実験例１において各群に分けたラット（対照群、LPS群、Lipoyl-VE＋LPS群、VE＋LPS群）のうち、対照群（図Ａ〜Ｃ）、LPS群（図Ｄ〜Ｆ）、及びLipoyl-VE＋LPS群（図Ｇ〜Ｉ）にリポ多糖類（LPS）を投与し、12時間後に採取した肺組織の光学顕微鏡画像を示す。なお、図Ａ→Ｂ→Ｃの順、図Ｄ→Ｅ→Ｆの順、及び図Ｇ→Ｈ→Ｉの順で、画像の表示倍率を上げている。
【図３】図１の肺組織の結果を、鬱血、浮腫、炎症及び出血のパラメーター毎に各群（対照群、LPS群、Lipoyl-VE＋LPS群）の組織学的スコアで示したものである（黒棒：対照群、白棒：LPS群、斜線棒：Lipoyl-VE＋LPS群）。結果は平均値±SDとして示す。* は、LPS群に対して有意差（p<0.05）があることを示す。
【図４】LPS群（―□―）、Lipoyl-VE＋LPS群（―●―）、及びVE＋LPS群（―▲―）について、LPS投与前、LPS投与から3時間目、6時間目及び12時間目に血液を採取し、各血清中のTNF-α濃度（図４（Ａ））、血清中のIL-6濃度（図４（Ｂ））を測定した結果を示す（実験例１）。
【図５】LPS群（―■―）およびLipoyl-VE＋LPS群（―●―）について、LPS投与から3時間目、6時間目及び12時間目に血液を採取し、各血清中のHMGB1濃度を測定した結果を示す（実験例１）。データは、平均値±SDとして示す。*はLPS群に対して有意差（P<0.05）があることを示す。
【図６】対照群、LPS群およびLipoyl-VE＋LPS群の肺組織中のiNOS、ICAM-1、及びHMGB1の発現を測定した結果を示す（実験例１（2-4））。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、下記一般式（Ｉ）で示される新規なαリポイルビタミンＥ誘導体に関する。また、本発明は下記一般式（Ｉ）で示されるαリポイルビタミンＥ誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物に関する。
【００２４】
【化３】
【００２５】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示す。〕。
【００２６】
当該αリポイルビタミンＥ誘導体（以下、本明細書において、これを「本化合物」ともいう）は、式（Ｉ）で表されるように、α−リポ酸と下式（II）で示されるビタミンＥ誘導体とがエステル結合してなる化学構造を有している。
【００２７】
【化４】
【００２８】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記と同じ意味を示す。〕。
【００２９】
なお、上記式（Ｉ）及び（II）中、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３で示される炭素数１〜３の低級アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、及びイソプロピル基を挙げることができる。好ましくはメチル基及びエチル基であり、より好ましくはメチル基である。一般式（II）及び（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がいずれもメチル基である化合物は、それぞれα−トコフェロール（II-1）及びα−リポイルα−トコフェロール（I-1）（製造例１参照）；Ｒ１とＲ２がメチル基、Ｒ３が水素原子である化合物は、それぞれβ−トコフェロール（II-2）及びα−リポイルβ−トコフェロール（I-2）（製造例４参照）；Ｒ１及びＲ３がメチル基、Ｒ２が水素原子である化合物は、それぞれγ−トコフェロール（II-3）及びα−リポイルγ−トコフェロール（I-3）（製造例２参照）；Ｒ１がメチル基、Ｒ２及びＲ３が水素原子である化合物は、それぞれδ−トコフェロール（II-4）及びα−リポイルδ−トコフェロール（I-4）（製造例３参照）である。
【００３０】
一般式（Ｉ）で示されるαリポイルビタミンＥ誘導体として好ましくは、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がいずれもメチル基であるα−リポイルα−トコフェロールである。
【００３１】
本化合物は、α−リポ酸と上記式（II）で示されるビタミンＥ誘導体（好ましくはα−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロールまたはδ−トコフェロール）の製造法はαリポ酸の重合化を防ぐためにも、塩基性条件下でのエステル化法である混合酸無水物法が適している。一例として、製造例１〜４に示すように、α−リポ酸をトリエチルアミンとともにアセトニトリルまたはテトラハイドフラン（THF）などの無極性溶媒に溶解しておき、これにクロロ炭酸エチルまたは2,4,6-トリクロロ安息香酸クロリド等を用いて、低温条件下（例えば、-5℃〜0℃程度）で、ビタミンＥ誘導体（II）を反応させることによって、他のエステル化法と比較して安価に且つ高収率に本化合物（αリポイルビタミンＥ誘導体）を製造することができる。
【００３２】
斯くして製造される本化合物は粗生成物（油状組成物）の状態であってもよいが、上記反応物をイソプロピルエーテルで抽出後、抽出物をアルカリ水や水で洗浄し、次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどを用いて精製することもできる。
【００３３】
後述する実験例１（2-2）及び（2-3）に示すように、α−リポイルα−トコフェロール（実験例１では「lipoyl-VE」と称する）を始めとする本化合物は、リポ多糖類（LPS）で誘導された炎症性サイトカイン(IL-6およびTNF-α)及びサイトカインメディエーター（HMGB1）の生成または分泌を、完全ではないものの抑制することができる。
【００３４】
これらのサイトカイン(IL-6およびTNF-α)は、通常ＬＰＳによって強く誘導され、炎症反応の初期の段階で生成分泌される。特にＴＮＦ−αは炎症を仲介する主要因子であり、その放出はさらにＩＫ−１βおよびＩＬ−６のような他のサイトカインを活性化し、細胞の損傷に関わることも知られている(Bone RC. Crit Care Med1996;24:163-172)。またＴＮＦ−αは、敗血症性ショックと関係する初期のショック状態(つまり低血圧、熱)や臓器不全の病因に極めて重要な役割を果たしている(Russell JA. N Engl J Med2006;355:1699-1713)。実験例１に示すように、上記本化合物は、これらの炎症性サイトカインの生成または分泌を顕著に抑制することから、当該化合物によれば、かかる炎症性サイトカインが介在して発症したり悪化したりする疾患（サイトカイン介在疾患）を予防または改善できると考えられる。
【００３５】
一方、ＩＬ−６は敗血症の重篤度や致死によく関連しており、敗血症の予測因子でもある(Remick DG, et al., Shock2002;17:463-467)。ＩＬ−６もまた、敗血症性ショックおよび臓器障害の病因に重要な役割を果たすと考えられている(Frink M, et al., Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2009 Sep 27;17(1):49.)。あるデータは、ＩＬ−６の上昇制御が、その後に生じるＩＬ−６上昇に関連した細胞毒性や臓器障害に関係していることを示している（Frink M, et al., Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2009 Sep 27;17(1):49.）。さらには、ＩＬ−６の制御が臓器障害の軽減作用を有している可能性が示唆されている（Kimizuka K, et al., Am J Transplant. 2004 Apr;4(4):482-94.）。後述する実験例１において、ＬＰＳで誘導された炎症性サイトカイン（IL-6、TNF-α）が、インビボで、本化合物の経口投与で減少することが確認された。本化合物の経口投与による炎症性サイトカインの抑制は、細胞に対する直接効果であるか、あるいは実験例１（2-4）に示すように、ｉＮＯＳやＩＣＡＭ−１の発現抑制を介してサイトカイン生成を抑制することによる間接的な効果によるものであるかもしれないが、いずれにしても本化合物によれば、炎症性サイトカイン（IL-6、TNF-α）の生成が抑制され、ＩＬ−６による細胞毒性は低下し、敗血症性ショックや臓器障害を改善することができると考えられる。
【００３６】
これを裏付ける実験として、後述の実験例１（2-1）では、ＬＰＳで誘導される全身性炎症モデルラットにおいてみられる肺における急性臓器障害が、本化合物の経口投与により有意に予防ないし抑制されることを示している。
【００３７】
また従来から、虚血再還流に起因する臓器障害が炎症性サイトカイン生成に関係していることが示唆されており、心筋と大脳の虚血再還流（I/R）によって炎症性サイトカインが増加することが報告されている(Zhang M, Chen L. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 2008 Sep;8(3):161-72.)。前述するよう本化合物は、炎症性サイトカインを低減させる作用を有するが、当該サイトカイン低減作用に基づいて血清サイトカイン濃度を著しく低下させる結果、腎虚血再還流障害や脳虚血再還流障害等の虚血性再還流障害が保護され防止できると考えられる。
【００３８】
前述するように、実験例１（2-3）において、α−リポイルα−トコフェロールを始めとする本化合物は、ＬＰＳで誘導されたサイトカインメディエーター（HMGB1）の生成または分泌を抑制することができるが、当該ＨＭＧＢ１は、後期の炎症応答を増幅し、サイトカイン分泌を促進することが知られている物質である（van Zoelen MA, et al., Shock 2009;31:280-284）。また最近では、敗血症ショック時の末期の炎症性メディエーターとして、また虚血再還流障害の初期のメディエーターとして機能することが知られている（Tsung A, et al., J Exp Med 2005; 201:1135-1143）。
【００３９】
以上のことから、本化合物は、炎症性サイトカイン、特にＴＮＦαやＩＬ−６が介在して発症若しくは悪化する疾患（サイトカイン介在疾患）、特に全身性炎症及びそれに付随する疾病（例えば、敗血症性ショック、急性臓器障害、臓器不全等）を予防または治療するための有効成分として有用であり、当該本化合物を有効成分とする本発明の医薬組成物は、かかるサイトカイン介在疾患の予防または治療剤、またサイトカイン介在疾患から保護する保護剤として有用である。
【００４０】
本発明が対象とするサイトカイン介在疾患としては、炎症性疾患；パジェット病；骨粗鬆症；多発性骨髄腫；急性および慢性骨髄性白血病；膵臓β細胞破壊；炎症性腸疾患；成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触性皮膚炎；喘息；筋変性症；悪液質；ライター症候群；Ｉ型およびＩＩ型糖尿病；骨吸収症；移植片対宿主反応；虚血再還流障害；アテローム性動脈硬化；脳外傷；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒素ショック症候群；発熱、および感染による筋肉痛を挙げることができる。
【００４１】
特に本発明のサイトカイン介在疾患剤は、炎症性サイトカインが介在して発生する敗血症性ショック、急性臓器障害または臓器不全を予防又は治療する薬剤として、またさらに虚血再還流障害に対する臓器または組織の保護剤として有効に利用することができる。なお、虚血再還流障害（「虚血再灌流障害」ともいう）とは、虚血状態にある臓器や組織に血液再還流が生じたときに、その臓器や組織内の微小循環において種々の毒性物質の産生が惹起されることで引き起こされる障害である。かかる虚血再還流障害は、例えば脳梗塞、心筋梗塞及び腸間膜血管閉塞症などに対する再還流障害後や、臓器移植後にみられることが多い。その発生機序としては、スーパーオキシドやヒドロキシラジカル等の活性酸素や一酸化窒素などのフリーラジカル産生による障害、及び活性化好中球と血管内皮細胞の相互作用に基づく障害のほか、各種サイトカインなどのケミカルメディエーター産生による障害などが考えられている。虚血再還流障害は、虚血状態に陥った局所だけでなく、二次的に全身の主要臓器にも障害（遠隔臓器障害）をきたすことが知られている。特に脳、肺、肝臓、腎臓などが標的臓器となり、多臓器不全をもたらすこともある。
【００４２】
本化合物を抗サイトカイン介在疾患剤の有効成分として用いる場合、目的と必要に応じて、本化合物のうち１種または２種以上を適宜組み合わせて含有させることもできる。本化合物のうち、好ましくは、上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３で示される低級アルキル基が、メチル基である化合物であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３がいずれもメチル基であるα−リポイルα−トコフェロールである。
【００４３】
本化合物は、抗サイトカイン介在疾患剤として、経口的にあるいは非経口的〔静脈投与、皮下投与、経皮投与、経肺投与、経粘膜投与（点鼻など）、直腸投与など〕に投与される。好ましくは経口投与である。抗サイトカイン介在疾患剤は、本化合物を、経口または非経口投与に通常用いられる薬学的に許容される担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊補助剤、滑沢剤、湿潤剤など）や添加剤などと混合し、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、バッカル剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、硬カプセル剤を含む）、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、軟膏剤、点眼剤、注射剤、点滴剤、点鼻剤などの所望の形態に製剤化することにより調製することができる。
【００４４】
特に本化合物は、水に不溶性の油溶性であるので、エマルジョンの形態に調製することも可能である。
【００４５】
これらの製剤には通常用いられる薬学的に許容される担体、例えば、結合剤（例えば、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドン）、賦形剤（例えば、乳糖、砂糖、コーンスターチ、リン酸カリウム、ソルビット、グリシン）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉）、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、増粘剤、分散剤等、またその他の添加剤として、再吸収促進剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤等を適宜使用してもよい。
【００４６】
本化合物を抗サイトカイン介在疾患剤として使用する際の投与量は、使用する本化合物の種類、患者の体重や年齢、対象とする疾患の種類やその状態および投与方法などによっても異なるが、たとえば、本化合物の量に換算して、注射剤の場合は成人１日１回約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、錠剤等の経口投与剤の場合は、成人１日数回、１回量約１ｍｇ〜約１００ｍｇ程度投与するのがよい。また、点眼剤等のような粘膜投与剤の場合は、成人１日数回、１回数滴、濃度が約０．０１〜５（ｗ／ｖ）％の製剤を投与するのがよい。
【００４７】
本化合物を含有する医薬組成物（抗サイトカイン介在疾患剤）には、本発明の目的に反しない限り、その他の抗炎症剤、抗サイトカイン介在疾患剤または別種の薬効成分を適宜含有させてもよい。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明の構成および効果を製造例及び実験例に基づいてより詳細に説明する。但し、これらの実験例等は一例であり、本発明はかかる実験例によって何ら拘束されるものではない。
【００４９】
[製造例]
製造例１
α−リポイルα−トコフェロール（α−リポ酸 α−トコフェロールエステル）の製造
α‐リポ酸2.06g（0.01モル）およびトリエチルアミン1.1gをアセトニトリル20mlに溶かして−5℃に冷却しておき、撹拌しながら、これにクロロ炭酸エチル1.1gを徐々に滴下した。滴下終了後、5〜10分後に、さらにTHF 30mlにα−トコフェロール4.3g（0.01モル）を溶かしたもの（10〜20℃）を一挙に加えて15分間撹拌した。次いでこれを室温（25℃）に戻して、さらに約１時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をイソプロピルエーテルで抽出して、抽出物を１％水酸化ナトリウムおよび水で洗い、イソプロピルエーテルを留去させることにより、残渣油状物を約6g得た。
【００５０】
この残渣油状物を、順相のシリカゲル（和光純薬工業（株）製）を担体としたカラムクロマトグラフィーに供して、ｎ−ヘキサンとイソプロピルエーテルを5：3の容量比で含む溶媒を用いて展開溶出して分画した（温度条件：室温（25℃））。各画分の一部を、それぞれ順相のシリカゲルを担体とした薄層クロマトグラフィーに供して、ｎ−ヘキサンとイソプロピルエーテルを5：3の容量比で含む溶媒を用いて展開し、α−トコフェロールのスポットとα−リポ酸のスポットとの間に位置する新しいスポットの出現を確認した。かかるスポットを有する画分を集めて濃縮し、標記の目的化合物（α−リポイルα−トコフェロール）の淡黄色油状物3.5g（収率56.6％）を得た。斯くして製造したα−リポイルα−トコフェロールをＩＲに供した結果を図１に示す。図１に示すように、2850〜2980cm-1にα−トコフェロールに起因するメチレン基に相当するピークと、1730 cm-1にα−リポイルに起因するカルボキシル基に相当するピークが確認されたことから、当該化合物はα−リポイルα−トコフェロールの構造を備えていると判断された。
【００５１】
また、得られたα−リポイルα−トコフェロールを順相のシリカゲルを担体とした薄層クロマトグラフィーに供して、ｎ−ヘキサンとイソプロピルエーテルを5：3の容量比で含む溶媒を用いて展開したところ、単一スポットを示し、そのＲｆは0.43であった。
【００５２】
製造例２
α−リポイルγ−トコフェロール（α−リポ酸 γ−トコフェロールエステル）の製造
α‐リポ酸を0.5g（0.0024モル）、トコフェロールとしてγ−トコフェロールを1.0g（0.0024モル）用いて、製造例１と同様に処理して、標記の目的化合物（α−リポイルγ−トコフェロール）の淡黄色油状物530mg（収率35.0 ％）を得た。
【００５３】
なお、得られたα−リポイルγ−トコフェロールを順相のシリカゲルを担体とした薄層クロマトグラフィーに供して、ｎ−ヘキサンとイソプロピルエーテルを5：3の容量比で含む溶媒を用いて展開したところ、単一スポットを示し、Ｒｆは0.42であった。
【００５４】
製造例３
α−リポイルδ−トコフェロール（α−リポ酸 δ−トコフェロールエステル）の製造
α‐リポ酸を2.06g（0.01モル）、トコフェロールとしてδ−トコフェロールを4.0g（0.01モル）用いて、製造例１と同様に処理して、標記の目的化合物（α−リポイルδ−トコフェロール）の淡黄色油状物3.0g（51.0％）を得た。
【００５５】
なお、得られたα−リポイルδ−トコフェロールを順相のシリカゲルを担体とした薄層クロマトグラフィーに供して、ｎ−ヘキサンとイソプロピルエーテルを5：3の容量比で含む溶媒を用いて展開した結果、単一スポットを示し、Ｒｆは0.41であった。
【００５６】
製造例４
α−リポイルβ−トコフェロール（α−リポ酸 β−トコフェロールエステル）の製造
α‐リポ酸を0.5g（0.0024モル）、トコフェロールとしてβ−トコフェロールを1.0g（0.0024モル）用いて、製造例１と同様に処理して、標記の目的化合物（α−リポイルβ−トコフェロール）の淡黄色油状物550mg（収率36.3 ％）を得た。なお、得られたα−リポイルβ−トコフェロールを順相のシリカゲルを担体とした薄層クロマトグラフィーに供して、ｎ−ヘキサンとイソプロピルエーテルを5：3の容量比で含む溶媒を用いて展開した結果、単一スポットを示し、Ｒｆは0.42であった。
【００５７】
製造例１〜４で製造したα−リポ酸のトコフェロールエステルは、いずれも既存のトコフェロールに比べて、空気中に放置しても色調に変化がなく酸化が進んでないことを示し、安定性において優れていることが確認された。また、重合しやすく不安定なα−リポ酸と比べても格段に安定性に優れている。
【００５８】
［実験例］
下記の実験において、α−リポイルビタミンＥ誘導体の一例として、下式で示されるα−リポイルα−トコフェロール（本化合物）を用いた。この化合物は親油性（油溶性）で、上記するように安定であることを特徴とする。
【００５９】
【化５】
【００６０】
実験例
腫瘍壊死因子α(TNF-α)およびインターロイキン-6（IL-6）のような前炎症性サイトカインの過剰発現は、ショックや臓器障害に関与している(Bhatia M, et al., J Pathol2004;202:145-156)。
【００６１】
そこで下記の実験例では、上記本化合物が、サイトカイン（TNF-α、IL-6）の生成または分泌を阻害し、それにより、リポ多糖体（LPS）で誘導する全身性炎症モデルラット（敗血症モデルラット）における臓器障害を予防ないし改善するかどうかについて調べた。
【００６２】
なお、データはすべて平均値±ＳＤとして示し、一元配置分散分析(ANOVA)を使用して評価した。 p-値<0.05を統計的有意とした。
【００６３】
（１）被験動物
体重２５０-３００ｇの雄性ラット（Wister rat）を使用した。ラットはすべて、実験前後に食物と水を無制限に摂取できるようにした。研究は大分大学医学部の動物研究の倫理委員会によって承認された。すべてのプロトコルは国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに沿って行った。麻酔は４％のセボフルラン（丸石製薬（株）製）を用いて行った。
【００６４】
実験例１ ＬＰＳ処置ラットに対するαリポイルビタミンＥの影響
（１）試験方法
上記雄性ラットを無作為に、1)対照群、2)ＬＰＳ群、3)リポイルビタミンＥ群（lipoyl-VE＋LPS群）、及び4)ビタミンＥ群（VE＋LPS群）の４群に分け、これらの各群に、胃管を用いて、1)生理食塩水（0.9% NaCl水溶液、以下同じ）、2)生理食塩水、3)リポイルビタミンＥ（1mmol/kg）、及び4)ビタミンＥ（1mmol/kg）をそれぞれ経口投与した。投与から１時間経過した後、2)〜4)の３群のラットにはＬＰＳ(10mg/kg)を尾静脈に静脈注射し、また1)の対照群には生理食塩水を尾静脈に静脈注射した。ＬＰＳ又は生理食塩水の静注から３、６、及び１２時間後に採血して血清サイトカイン（TNF-α、IL-6）濃度を測定して、その経時的変化を評価するとともに、静注から１２時間後に各群のラットから肺を取り出し、摘出肺の組織について組織学的評価を行った。
【００６５】
（２）試験結果
（2-1）光学顕微鏡分析
ＬＰＳ又は生理食塩水の静注から１２時間後に採取した各群（対照群、LPS群[生理食塩水＋LPS]、Lipoyl-VE＋LPS群）のラットの肺の組織標本を定法に従ってホルマリンに固定し、パラフィン内に埋設し、ミクロトーム上で切片を作成した。作成した切片をヘマトキシロンとエオシンで染色した。
【００６６】
そのサンプルを分析し、村上の技術(Murakami K, et al., Shock2002;18:236-241)に基づいて肺障害の程度を決定した。肺実質中の24のエリアを、４つのパラメーター（鬱血、浮腫、炎症および出血）に関して０〜４の５段階に類別した（０：無しまたは正常にみえる、１：軽度、２：中度、３：重度、４：非常に重度）。
【００６７】
肺組織の染色切片を光学顕微鏡で観察した結果を図２に示す。肺の組織変化は対照群(図１Ａ〜Ｃ)では観察されなかったが、LPS群（生理食塩水＋LPS群）の肺組織で顕著な間質性の浮腫および炎症細胞の浸潤がみとめられた(図１Ｄ〜Ｆ)。本化合物で処置した「Lipoyl-VE＋LPS群」では、間質性の浮腫および炎症細胞の浸潤が、LPS群と比較して、顕著に低減されていた(図１Ｇ〜Ｉ)。肺組織に関する組織学的スコアの結果を図３に示す。これからわかるように、LPS群（白棒）の肺組織の組織学的スコアは、対照群（黒棒）のスコアと比較して、すべて著しく高く、本化合物で処置した「Lipoyl-VE＋LPS群」（斜線棒）のスコアはその中間であった。
【００６８】
この結果から、ＬＰＳ投与で誘導される全身性炎症モデル動物（敗血症モデル動物）における肺組織の急性障害が、予め本化合物を投与しておくことにより有意に予防できることが判明した。
【００６９】
（2-2）血清ＴＮＦ−α、及びＩＬ−６レベルに対するαリポイルビタミンＥの影響
ＬＰＳ又は生理食塩水の静注から３、６及び１２時間後に、各群（対照群、LPS群[生理食塩水＋LPS]、Lipoyl-VE＋LPS群、VE＋LPS群）のラットから採取した血液をサンプルとして、血清サイトカイン濃度（TNF-α、IL-6）を測定し、血清サイトカインに対する本化合物の影響を調べた。なお、血清中のＴＮＦ-αおよびＩＬ−６の濃度は、市販のＥＬＩＳＡキットとＴＮＦ-αおよびＩＬ−６のそれぞれに対するラット特異的モノクローナル抗体（Invitrogen社）を用いて分析した。吸光度は540nmで測定した(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ)。
【００７０】
血清中のＴＮＦ-α濃度及びＩＬ−６濃度の経時的変化を、図４Ａ及びＢにそれぞれ示す。
【００７１】
血清中のＴＮＦ−α濃度は、対照群では増加は認められなかったが（結果示さず）、LPS群（---□---）、Lipoyl-VE＋LPS群（―●―）、及びVE＋LPS群（―▲―）では増加が認められ、いずれもLPS投与後３時間でピークに達した。しかし、その増加の程度は、Lipoyl-VE＋LPS群（―●―）は、LPS群（---□---）と比較して著しく低く、さらにVE＋LPS群（―▲―）と比較しても有意に低かった(図４Ａ)。同様に、血清中のＩＬ−６濃度は、対照群では増加は認められなかったが（結果示さず）、LPS群（---□---）、Lipoyl-VE＋LPS群（―●―）、及びVE＋LPS群（―▲―）はともに、LPS投与後３時間でピークに達した (図４Ｂ)。しかし、その増加の程度は、ＴＮＦ−α濃度と同様に、LPS群（---□---）及びVE＋LPS群（―▲―）と比較して、Lipoyl-VE＋LPS群（―●―）では有意に低かった(図４Ｂ)。
【００７２】
これらの結果から、ＬＰＳ投与（LPS刺激）によって誘導されるサイトカイン（TNF-α、IL-6）はいずれも本化合物により有意に抑制されることが判明した。
【００７３】
（2-3）血清ＨＭＧＢ１レベルに対するαリポイルビタミンＥの影響
ＨＭＧＢ１（high-mobility group box1 protein）は、３０ｋＤの非ヒストン性染色体関連タンパク質であり（Bianchi ME, et al., Science, 1898;243:1056-1059）、その血清中の濃度は、重度の敗血症や敗血症ショックにより増加することが報告されている（Wang H, et al., Science 1999; 285:248-251）。また、ＨＭＧＢ１は、後期の炎症応答を増幅し、サイトカイン分泌を促進することが知られているが（サイトカインメディエーター）（van Zoelen MA, et al., Shock 2009;31:280-284）、最近、敗血症ショック時の末期の炎症性メディエーターとして、また虚血再還流障害の初期のメディエーターとして機能することがわかっている（Tsung A, et al., J Exp Med 2005; 201:1135-1143）。また、局所的な疾患では、関節リウマチや炎症性腸疾患などでもＨＭＧＢ１濃度が上昇することが報告されている。
【００７４】
ＬＰＳ又は生理食塩水の静注から３、６及び１２時間後に、各群（対照群、LPS群[生理食塩水＋LPS]、Lipoyl-VE＋LPS群）のラットから採取した血液をサンプルとして、血清ＨＭＧＢ１濃度を測定し、血清ＨＭＧＢ１に対する本化合物の影響を調べた。なお、血清中ＨＭＧＢ１の濃度は、市販のＥＬＩＳＡキットとＨＭＧＢ１に対するラット特異的モノクローナル抗体（Invitrogen社）を用いて分析した。吸光度は540nmで測定した(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ)。
【００７５】
血清中のＨＭＧＢ１濃度の経時的変化を、図５にそれぞれ示す。
【００７６】
血清中のＨＭＧＢ１濃度は、対照群では増加は認められなかったが（結果示さず）、LPS群（―■―）、及びLipoyl-VE＋LPS群（―●―）では経時的に増加が認められ、いずれもLPS投与後１２時間でピークに達した。しかし、その増加の程度は、LPS群（―■―）と比較して、Lipoyl-VE＋LPS群（―●―）では著しく低かった(図５)。
【００７７】
この結果から、ＬＰＳ投与（LPS刺激）によって誘導されるＨＭＧＢ１は本化合物の投与により有意に抑制されることが判明した。
【００７８】
（2-4）ｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ−１及びＨＭＧＢ１の発現に対するリポイルビタミンＥの影響
各群（対照群、LPS群、Lipoyl-VE＋LPS群）のラットの肺組織中の、ｉＮＯＳ（inducible nitric oxide synthase）、ＩＣＡＭ−１（Intercellular adhesion molecule-1）及びＨＭＧＢ１の発現状況を、Western blottingを用いて調べた。結果を図６に示す。図６に示すように、LPS群では、ｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ−１及びＨＭＧＢ１の発現がいずれも増加していたのに対して、lipoyl-VE＋LPS群では、それらの増加が顕著に抑制されていた。
【００７９】
この結果から、本化合物による炎症性サイトカインの誘導抑制作用は、本化合物がｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ−１及びＨＭＧＢ１等の炎症性分子の発現を抑制することを一つのメカニズムとすることが示唆される。つまり、本化合物は、炎症のカギとなるタンパク質の発現を抑制し、それに基づいて抗炎症作用を発揮するものと考えられる。
【００８０】
結論として、上記の実験例から、本化合物は、炎症性サイトカインの分泌を抑制することで、炎症性サイトカインが介在する各種の疾患、例えば、炎症や炎症が関係する各種の疾患、並びにそれによって生じる臓器や組織の障害の発生を阻止する作用を有していると考えられる。つまり、本化合物による処置で、炎症だけでなく、並びに敗血症性ショックや虚血再還流によって生じる各種臓器の障害（急性臓器障害、臓器不全）も保護し防止できると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示されるαリポイルビタミンＥ誘導体：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示す）。
【請求項２】
上記炭素数１〜３の低級アルキル基がメチル基である、（I-1）に記載するαリポイルビタミンＥ誘導体。
【請求項３】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がいずれもメチル基である、（I-1）に記載するαリポイルビタミンＥ誘導体。
【請求項４】
αリポ酸と下記一般式（II）で示されるビタミンＥ誘導体とをエステル結合する工程を有する、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載するαリポイルビタミンＥ誘導体（Ｉ）の製造方法：
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示す）。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれかに記載するαリポイルビタミンＥ誘導体（Ｉ）を有効成分とする、医薬組成物。
【請求項６】
サイトカイン介在疾患を予防または治療するための抗サイトカイン介在疾患剤である、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示されるαリポイルビタミンＥ誘導体：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示す）。
【請求項２】
上記炭素数１〜３の低級アルキル基がメチル基である、（I-1）に記載するαリポイルビタミンＥ誘導体。
【請求項３】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がいずれもメチル基である、（I-1）に記載するαリポイルビタミンＥ誘導体。
【請求項４】
αリポ酸と下記一般式（II）で示されるビタミンＥ誘導体とをエステル結合する工程を有する、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載するαリポイルビタミンＥ誘導体（Ｉ）の製造方法：
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子または炭素数１〜３の低級アルキル基を示す）。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれかに記載するαリポイルビタミンＥ誘導体（Ｉ）を有効成分とする、医薬組成物。
【請求項６】
サイトカイン介在疾患を予防または治療するための抗サイトカイン介在疾患剤である、請求項５記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−２２９１７９（Ｐ２０１２−２２９１７９Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９８６３９（Ｐ２０１１−９８６３９）
【出願日】平成２３年４月２６日（２０１１．４．２６）
【出願人】（３０４０２８７２６）国立大学法人 大分大学 (181)
【出願人】（５０２３８４０６０）有限会社オガ リサーチ (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２６日（２０１１．４．２６）
【出願人】（３０４０２８７２６）国立大学法人 大分大学 (181)
【出願人】（５０２３８４０６０）有限会社オガ リサーチ (14)
【Ｆターム（参考）】
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