β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸塩（ＨＭＢ）の改善された投与方法
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の投与方法について、具体的には、カルシウム塩ＨＭＢ組成物を含むその他の形態のＨＭＢを投与した場合よりも、ＨＭＢの効果が上昇する遊離酸ＨＭＢのヒトへの投与のような、ＨＭＢ酸の投与ついて記載する。ＨＭＢ酸の投与は、等量のカルシウム塩ＨＭＢ組成物と比較して、ＨＭＢの最高血漿濃度の上昇をもたらす。ＨＭＢ酸を投与した場合、カルシウム塩ＨＭＢ組成物と比較して、ＨＭＢの最高血漿濃度到達時間が短縮される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
[0001]本出願は、２００９年１２月１８日に出願した米国特許出願第６１／２８７，８５７号の優先権を主張し、その全文は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[0002]本発明は基本的には、より効率的でより有効なβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸塩（ＨＭＢ）の送達系に関し、より具体的には、等量のカルシウム塩形態のＨＭＢ（ＣａＨＭＢ）を投与するよりも、より効率的でより有効なＨＭＢの投与方法をもたらすＨＭＢ遊離酸の投与に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]ＨＭＢが様々な応用環境で有用なことが分かっている。具体的には、米国特許第５，３６０，６１３号（Ｎｉｓｓｅｎ）では、ＨＭＢが総コレステロール及び低比重リポプロテインコレステロールの血液レベルを減少させるのに有用であることが記載されている。米国特許第５，３４８，９７９号（Ｎｉｓｓｅｎら）では、ＨＭＢがヒトの窒素保持の促進に有効であることが記載されている。米国特許第５，０２８，４４０号（Ｎｉｓｓｅｎ）は、動物の赤身を増加させるためのＨＭＢの有効性を議論している。米国特許第４，９９２，４７０号（Ｎｉｓｓｅｎ）ではまた、ＨＭＢが哺乳動物の免疫反応の増強に有効であると記載されている。米国特許第６，０３１，０００号（Ｎｉｓｓｅｎら）では、疾患に関連する衰弱を治療するためのＨＭＢと少なくとも１つのアミノ酸の使用が記載されている。米国特許第６，１０３，７６４では、筋肉量の実質的な増加を伴わずに、ＨＭＢが動物の筋肉の有酸素容量を高めることが記載されている。加えて米国特許第６，２９１，５２５号では、ヒトが心の状態を認知することの改善にＨＭＢが有用であることが記載されている。
【０００４】
[0004]ＨＭＢが、癌性悪質液及びＡＩＤＳに関連した衰弱での除脂肪筋肉量の維持及び増加に好ましい効果をもつことが示されてきた。加えてＨＭＢの使用は、筋肉損傷及び、筋肉の痛みや強度損失を引き起こす運動によって生じる炎症性反応に好ましい効果をもたらし、また、ＨＭＢの使用により、炎症を引き起こすサイトカインの増加が見られる。
【０００５】
[0005]これまでに、ＨＭＢを単独で又はその他のアミノ酸と併用してサプリメントとして摂取することが、若い運動選手の筋肉の強度及び機能の復元に有効であることが観察されてきた。さらに、ＨＭＢを２種類のアミノ酸、すなわちアルギニン及びリシンと併用することが、高齢者の筋肉量の増加に有効であることも観察されてきた。
【０００６】
[0006]ＨＭＢはアミノ酸であるロイシンの活性代謝産物である。タンパク質分解を抑制するためのＨＭＢの使用は、ロイシンがタンパク質を節約する特性をもつことが観察されたことに由来する（文献１８；文献２４）。必須アミノ酸であるロイシンを、タンパク質合成又はα−ケト酸へのトランスアミノ化のいずれかに用いることができる（α−ケトイソカプロン酸、ＫＩＣ）（文献２４）。ある経路でＨＭＢは、ロイシンのトランスアミノ化産物であるα−ケトイソカプロン酸の酸化により、肝臓で生成される。この経路では、およそ５％のロイシンが酸化される（文献２８）。ＨＭＢはロイシンよりも優れた筋肉量及び筋肉強度の増強効果をもつ。ＨＭＢの最適効果は１日当たり３．０グラム、又は１日当たり体重１キログラムにつき０．０３８グラムで達成することができるが、ロイシンの最適効果には１日当たり３０．０グラム以上が必要である（文献２９）。
【０００７】
[0007]一旦生成又は摂取されたＨＭＢは２つの運命をもつと考えられている。第一の運命は単純に尿中に排出されることである。ＨＭＢの摂取後、尿中のＨＭＢ濃度は上昇し、ＨＭＢのおよそ２０〜５０％が尿として失われる（文献２６；文献５２）。他方の運命は、ＨＭＢのＨＭＢ−ＣｏＡへの活性化に関わる（文献４；文献６；文献１６；文献１７；文献２０；文献３５；文献３６；文献４１；文献４３；文献５４）。一旦ＨＭＢ−ＣｏＡへと変換されると、次の代謝、すなわちＨＭＢ−ＣｏＡのＭＣ−ＣｏＡへの脱水又はＨＭＢ−ＣｏＡのＨＭＧ−ＣｏＡへの直接的な変換が起こる可能性があり（文献４２）、これにより細胞内でのコレステロール合成の基質が供給される。いくつかの研究から、ＨＭＢがコレステロールの合成経路に組み入れられること（文献２−４；文献１６）及び損傷を受けた細胞膜の再生に用いられる新しい細胞膜用のコレステロール源になる可能性があること（文献２９）が分かっている。ヒトでの研究から、血漿ＣＰＫ（クレアチンホスホキナーゼ）の上昇によって測定される激しい運動後の筋肉損傷が、ＨＭＢを補うことで減少することが分かってきた。ＨＭＢを毎日継続して使用することにより、その保護効果が少なくとも３週間現れることが示された（文献１４；文献２２；文献２３）。
【０００８】
[0008]単離したラットの筋肉を用いた生体外での研究は、ＨＭＢが筋肉のタンパク質分解（文献３２）、特にストレスを受けている間のタンパク質分解の強力な阻害剤であることを示している。これらの発見はヒトでも確認された。例えば、ＨＭＢは負荷をかけて行う筋力トレーニングを行っている対象での筋肉のタンパク質分解を阻害する（文献２６）。この結果は多くの研究で一致している（文献１４；文献２２；文献３３；文献４６；文献５３）（文献９−１１；文献４７；文献４８；文献４８）。Ｃ２Ｃ１２筋肉細胞では、ＨＭＢは実験的に誘導した異化作用を弱める（例えば）。
【０００９】
[0009]ＨＭＢがタンパク質分解を減少させ、タンパク質合成を上昇させる分子機構が報告されている（文献１０；文献４４）。ＭＡＣ１６悪液質誘導性腫瘍に罹患しているマウスでは、ＨＭＢはユビキチン−プロテアソーム経路の重要な活性化因子を下方制御することによりタンパク質分解を弱める（文献４７）。さらにＨＭＢは、タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）の活性化を弱め、そしてマウス筋管でのユビキチン−プロテアソーム経路に関わる遺伝子発現を増加させることによりタンパク質分解を減少させる（文献４８）。ＰＩＦはマウス筋管でのタンパク質合成を５０％阻害し、そしてＨＭＢはタンパク質合成でのこの低下を弱める（文献９）。Ｅｌｅｙらは、ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）に及ぼす作用を介した真核生物翻訳開始因子２（ｅＩＦ２）のリン酸化の下方制御及びラパマイシン／７０−ｋＤａリボソームＳ６キナーゼ（ｍＴＯＲ／ｐ７０ｓ６ｋ）経路の哺乳類標的の亢進を含む数多くの方法により、ＨＭＢがタンパク質合成を増加させることを示した。最終的に起こる結果は、４Ｅ−結合タンパク質（４Ｅ−ＢＰ１）のリン酸化の上昇及び活性型ｅＩＦ４Ｇ−ｅＩＦ４Ｅ複合体の増加である。これらの機序の多くがロイシンとＨＭＢで共通するが、タンパク質合成の刺激についてはＨＭＢがより強力であると考えられている（文献９）。
【００１０】
[00010]ＨＭＢはまた、リポ多糖（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子−α／インターフェロン−γ（ＴＮＦ−α／ＩＦＮ−γ）、及びアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）のようなその他の異化因子の作用に介在する共通な経路を弱めることにより、タンパク質合成を増加させることができる（文献１０；文献１１）。ＨＭＢはカスパーゼ−３と−８の活性化を弱めることにより、それに続くＰＫＲの活性化の抑制とｐ３８分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）を下方制御することによる活性酸素種（ＲＯＳ）の形成を介して作用する。ＲＯＳ形成が増加すると、ユビキチン−プロテアソーム経路を介したタンパク質分解が誘導されることが知られている。ＨＭＢは、ＰＫＲの自己リン酸化とそれに続くｅＩＦ２αのリン酸化、そして部分的にはｍＴＯＲ経路の活性化を介してこの抑制を達成する。
【００１１】
[00011]最近の報告では、ＨＭＢがロイシンのように、Ｃ２Ｃ１２筋管でのｍＴＯＲｃｌ非依存性ＰＩ３Ｋシグナル伝達を刺激するかどうかが試験された（文献１９）。ＨＭＢは、ＡＫＴＳｅｒ４７３（±１２９％）、Ｓ６Ｋ１Ｔｈｒ３８９（±５０％）及び４ＥＢＰ１Ｔｈｒ６５／７０（±５１％）のリン酸化を刺激した。ＨＭＢはロイシンよりも高い有効性で、例えばＳ６Ｋ１Ｔｈｒ３８９をそれぞれ±５０％対±１７％で、同化シグナル伝達を刺激した。予想通り、ＨＭＢをラパマイシン（ｍＴＯＲｃｌ阻害剤）と共にインキュベートするとｍＴＯＲｃｌシグナル伝達の上昇が弱まったが、ＡＫＴのリン酸化は弱まらなかった（±１８８％）。一方、ＬＹ２９００４２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）と共にインキュベートすると、ＨＭＢ誘導性のＡＫＴ及びｍＴＯＲｃｌシグナル伝達の両方の上昇が停止し、このことはＨＭＢがＰＩ３Ｋに依存した方法でｍＴＯＲｃｌにシグナルを伝達していることを示唆している。これらのデータは、ＨＭＢが、ロイシンの代謝産物であるにも関わらず、ロイシンが用いる機構とは異なる機構を介してｍＴＯＲｃｌにシグナルを伝達することを示唆している。
【００１２】
[00012]数多くの研究により、ＨＭＢの有効量が、ＣａＨＭＢとして、１日当たり３．０グラムであることを示されてきた（１日当たり体重１キログラムにつき約３８ｍｇ）。栄養補助食品としては、ＨＭＢカルシウム塩の一水和物が用いられてきた。この実験式はＣａ（ＨＭＢ）２−Ｈ２Ｏである。この用量は、負荷をかけて行う筋力トレーニングによって得られる筋肉量及び強度を増加させ、さらに過剰な運動による筋肉損傷を最小限に抑える（文献１４；文献２６；文献３０；文献３３）。ＨＭＢの安全性についての試験では、健康な若年成人又は高齢者では副作用は見られなかった（文献１５；文献２５）。ＨＭＢをＬ−アルギニン及びＬ−グルタミンと併用してＡＩＤＳ及び癌患者に補った場合にも安全であることが分かっている（文献３８）。
【００１３】
[00013]ヒトでの試験でもまた、１日当たり３．０グラムのＣａＨＭＢをアミノ酸と共に栄養補助食品として使用すると、癌及びＡＩＤＳのような様々な条件での筋肉量の減少が抑制されることが示された（文献５；文献１２）。除脂肪体重及び筋肉強度を向上させるために、ウェイトトレーニングと併用してＨＭＢを補給した場合のメタ分析から、ＨＭＢが、運動と併用した場合に除脂肪体重及び筋肉強度を向上させるたった２つの栄養補助食品の内の１つであることが分かった（文献３０）。高齢者で１年間にわたって行ったより最近の研究により、ＨＭＢと、アミノ酸であるアルギニン及びリシンを併用すると、運動しないでも除脂肪体重が増加することが分かった。
【００１４】
[00014]運動するとロイシン酸化が増大するため、筋肉損傷の最適な予防とその後の回復には、運動中及び運動直後に最適レベルのＨＭＢを摂取することが必要だと考えられる。さらに、損傷が起こっている間には炎症過程が刺激されるが、炎症を放置しておくとこれは有害となり、その結果治癒が遅れる。慢性炎症及び炎症性サイトカインが、心血管疾患及びＩＩ型糖尿病、並びに喘息、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患及び関節リウマチの根底にある主要な原因であることが分かってきた。
【００１５】
[00015]ヒトでの試験により、負荷をかけて行う筋肉トレーニングが、早ければ運動後１〜２時間から筋肉のタンパク質合成に良い効果を及ぼし、それが最大４８時間続くことが示された（文献８；文献３４）。複数の試験から、運動後のタンパク質合成を最大に刺激するため及びタンパク質分解を鈍化させるためには栄養素を摂取するタイミングが重要であることもまた示された（文献４０）。栄養素を送達するのに最も適した時間は、運動後２時間以内と考えられる。Ｄｒｅｙｅｒら（文献７）は、運動後の回復の１時間以内にロイシンを豊富に含む栄養溶液を摂取すると、ｍＴＯＲシグナル伝達経路及び筋肉のタンパク質合成が有意に増強されることを示した。
【００１６】
[00016]ＣａＨＭＢの解離曲線は酢酸カルシウムのものと同様であり（文献４９）、与えられた用量により、６０〜１２０分の間にＨＭＢは最高血漿濃度に達する。一般的な１グラム用量の場合には、最高血漿濃度到達時間は２時間であった（文献５２）。従って、最大の利益を得るためには、ＣａＨＭＢを運動の前に摂取する必要がある。
【００１７】
[00017]従って、ＨＭＢが筋肉に及ぼす効果には、ＨＭＢを投与するタイミングとＨＭＢの血中濃度が重要である。ＨＭＢをより早くより効率的に送達できる系が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第５，３６０，６１３号（Ｎｉｓｓｅｎ）
【特許文献２】米国特許第５，３４８，９７９号（Ｎｉｓｓｅｎら）
【特許文献３】米国特許第５，０２８，４４０号（Ｎｉｓｓｅｎ）
【特許文献４】米国特許第４，９９２，４７０号（Ｎｉｓｓｅｎ）
【特許文献５】米国特許第６，０３１，０００号（Ｎｉｓｓｅｎら）
【特許文献６】米国特許第６，１０３，７６４号
【特許文献７】米国特許第６，２９１，５２５号
【発明の概要】
【００１９】
[00018]本発明では、ＨＭＢを遊離酸の形で投与する（「ＨＭＢ酸」）。ＨＭＢ遊離酸の投与は組織に対するＨＭＢの効果を向上させるため、ＣａＨＭＢを投与するよりも、より迅速でより効率的な組織へのＨＭＢの供給方法を提供する。基質を用いた遊離酸型ＨＭＢの経口摂取又は舌下投与はＨＭＢの直接的で迅速な吸収をもたらし、ＨＭＢの組織に対する効果を高める、より良い送達方法を提示している。
【００２０】
[00019]一実施例では、ゲルのような可溶性基質に溶解した中和したＨＭＢを用いて、遊離酸型ＨＭＢを直接送達する。有効量の遊離酸型ＨＭＢを経口経路又は舌下経路でヒトに投与する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】[00020]図１は、一連の激しい運動を行った後のＣＰＫ及びＬＤＨの血漿レベルを示している。
【図２】[00021]図２は、一連の激しい運動を行った後の筋肉強度及び主観的な痛みを示している。
【図３】[00022]図３は、実験的な実施例１で見られたＨＭＢの血漿濃度を示している。
【図４】[00023]図４は、ＨＭＢの最高血漿濃度及び最高濃度到達時間を示している。
【図５】[00024]図５はＨＭＢの血漿濃度を示している。
【図６】[00025]図６は、ＨＭＢの最高血漿濃度及び最高濃度到達時間を示している。
【図７】[00026]図７は、尿に排出されたＨＭＢ用量をパーセンテージで示している。
【図８】[00027]図８は本発明の治療計画を示している。
【図９】[00028]図９は並外れて激しい一連の運動を行った後のＣＰＫの変化を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
[00029]本発明は、ＨＭＢのヒトへの送達方法であり、具体的には、遊離酸型ＨＭＢの投与が、ＣａＨＭＢを含むその他の形態のＨＭＢを投与するよりもＨＭＢの効果の上昇をもたらすようになる、ＨＭＢ酸のヒトへの投与方法である。ＨＭＢ酸を使用することで、ヒト組織へのＨＭＢの効果が向上する。ＨＭＢ酸を投与すると、その他の形態のＨＭＢを投与するよりも、筋肉損傷とそれに付随する炎症反応に対する保護効果が有意に上昇する。さらに遊離酸型ＨＭＢの投与はまた、悪液質及び衰弱状態での筋肉の保存にも効果があり、また、心血管疾患などの数多くの疾患を引き起こす可能性のある慢性炎症を含む炎症の鈍化に作用する。遊離酸型ＨＭＢがＣａＨＭＢよりも筋肉損傷を低下させるという予想外の驚くべき発見は、遊離酸型ＨＭＢが損傷によって生じる炎症反応もまた減少させる可能性があることを示している。ＨＭＢ遊離酸の投与は、栄養又は医薬用補助食品として広く応用されており、多くの人々に影響を与える可能性がある。
【００２３】
[00030]本発明では、ＨＭＢをその遊離酸型としてヒトに投与する。遊離酸型ＨＭＢには、基質又はゲルなどの担体が付随してもよい。好ましい態様では、遊離酸型ＨＭＢを経口又は舌下で投与するが、ＨＭＢを投与するいかなる手段も適切である。ＨＭＢ酸は市販されている。
【００２４】
[00031]ＨＭＢの酸型は、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸、β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸、又はβ−ヒドロキシ−イソ吉草酸と呼ばれており、また、「ＨＭＢ酸」と呼ぶことができる。構造式は（ＣＨ３）２Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＯＯＨであり、その分子は以下の通りである。
【００２５】
【化１】
【００２６】
[00032]本発明では、有効量のＨＭＢ酸をヒトへ投与する。有効量は、２４時間当たり体重１キログラムにつき、約０．０１グラム〜約０．２グラムの範囲のＨＭＢ酸となる。ＨＭＢ酸を、１日当たり約０．５グラム〜約３０グラムであるＨＭＢ酸の有効量でヒトに投与してもよい。有効量のＨＭＢ酸は等量のＣａＨＭＢを投与するよりも、ＨＭＢの血漿濃度の大幅な上昇及び／又はＨＭＢの最高血漿濃度到達時間の短縮を生じる。ＨＭＢ酸の投与による効果の向上は、等量のＣａＨＭＢを投与するよりも１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、１００％、２００％、４００％、５００％又はそれ以上になるだろう。ＨＭＢ酸とその他の形態のＨＭＢの比較は、当業者に知られているＨＭＢの標準的な指標を用いて、ＨＭＢの効果又は効率に基づいて行われるだろう。
【００２７】
[00033]実施例では、ＨＭＢ酸は可溶性のゲルとして投与されるが、本発明はＨＭＢ酸を含む可溶性のゲル又は基質の使用には限定されない。固体、錠剤、カプセル、及び経口静脈注射用溶液のような液体などの任意の薬学上許容可能な形態のＨＭＢ酸が本発明の範囲に含まれるが、ＨＭＢ酸の形態はこれらには限定されない。ＨＭＢ酸を、様々なデンプン及び食塩水を含むがこれらには限定されない任意の薬学上許容可能な担体を用いて投与することができる。好ましい態様では、有効量のＨＭＢ酸を１日に２回又は３回の用量で投与するが、当然のことながら、有効量のＨＭＢ酸を単回用量で１日１回投与することも本発明の範囲内であり、１日当たりのＨＭＢの投与回数が何回になっても同様に本発明の範囲内である。
【００２８】
[00034]ＨＭＢ酸の送達は、最も一般的にはＨＭＢ酸を含むゲルのような可溶性基質の送達は、ＣａＨＭＢを含む塩としてのＨＭＢの投与又はエステル若しくはラクトンなどのその他の形態のＨＭＢ投与よりも、ＨＭＢの同化作用を有意に上昇させ、ＣＰＫを顕著に減少させる。一態様では、ＨＭＢ酸ゲルの投与は、等量のＣａＨＭＢを投与した場合と比較して、ＨＭＢが約１／４の時間で２倍の最高血漿濃度に達し、かつ、等量のＣａＨＭＢと比較して、血漿クリアランスで測定した送達の効率が２５％向上した。
【００２９】
[00035]この送達方法は応用範囲が広い。ＨＭＢの既知の使用方法又は有効性には、窒素保持及びタンパク質の節約の向上、除脂肪体重の増加、筋肉機能及び／又は筋肉の性能の向上、ストレス又は損傷に曝された筋肉での筋肉損傷の低減、ストレス又は損傷に曝された後の筋肉の炎症反応の低下、ストレス又は損傷後の体の免疫反応の向上、衰弱（癌、慢性肺疾患、年齢、慢性腎臓疾患、長期入院又はＡＩＤＳに伴う衰弱）に関連した疾患の治療、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）から高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）へなどの脂質プロファイルの向上、並びにヒトの心の状態の改善が含まれるがこれらには限定されない。より有効でより効果的なＨＭＢの投与方法は、これら既知のＨＭＢの使用で、幅広い用途に用いられる。
【００３０】
[00036]ＨＭＢ酸の使用については既に述べられているが、遊離酸形態のＨＭＢは、先行技術で提案されているＨＭＢのカルシウム塩やその他の塩と等価であると考えられていた。ＨＭＢ酸とＨＭＢ塩の効果の差についてはこれまでには試験されていなかった。
【００３１】
[00037]これまでは、遊離酸形態のＨＭＢについての詳細な試験及び商業利用の両方に対して数多くの障害があり、また、差がないと考えられていたことから、ＨＭＢの商業的供給源としてはカルシウム塩が採用された。最近まで、包装、具体的には栄養補助食品の流通には、粉末形態の栄養素が取扱いに適していた。そのため、ＨＭＢのカルシウム塩が広く受け入れられた。ＨＭＢ酸は液体であるため、配送、又は製品に組み込むことが非常に難しい。
【００３２】
[00038]その他のカルシウム塩とは異なり、この分子のカルシウム成分とＨＭＢ成分は非常に容易に解離することが分かっており、このことが遊離酸型ＨＭＢとＨＭＢカルシウム塩との間に生理学的な差がないだろうという仮説を指示した。
【００３３】
[00039]加えて、ＨＭＢカルシウム塩の形成及び結晶化は、製造過程の最終的な精製段階として用いられてきた。特に、結晶化に使用が制限された化合物は３，３−ジメチルアクリル酸であった。この化合物は遮るのが難しい異臭を生じる。現在のＨＭＢの製造過程では、高純度ＨＭＢ遊離酸の製造が可能になり、ＨＭＢ遊離酸の経口摂取が可能となった。現在では、経口摂取に十分な純度の商業的な供給源があるだけでなく、ＨＭＢ酸を経口摂取するには緩衝化する必要があり、この過程はこれまでＨＭＢの使用を阻害していた上述の要因により近年にやっと決定された（文献１９）〜（文献４９）。
【００３４】
[00040]カルシウム塩中のカルシウムとＨＭＢの結合は緩やかで（文献４９）、これまでは、ＨＭＢを遊離酸として又はカルシウム塩としてのいずれで経口投与しても違いはないだろうと考えられていた（文献１９）。実施例１で示したように、ＨＭＢ酸の経口投与によって達成される血漿濃度に驚くべき違いがあるだけではなく、血漿クリアランスも２５％上昇し、このことは、筋肉量と機能に対する効果の向上を伴う組織によるＨＭＢ消費の増加を示している。遊離酸型のＨＭＢは、モル等量を与えた場合、ＨＭＢのカルシウム塩と比較してＨＭＢの血漿レベルを約４分の１の時間で２倍にする。実施例２では、筋肉に激しい運動をさせた場合、ＣａＨＭＢよりも遊離酸型で投与したＨＭＢがより保護的であり、筋肉に対する効果の向上がはっきりと示されている。
【００３５】
[00041]ＣａＨＭＢはｐＨが中性から酸性の水溶液に可溶性であり、容易に解離することか知られていることから、当業者は、外観上の短い時間のずれはこの解離工程によるものだと予測していた。ゼラチンカプセルに入れて投与したＣａＨＭＢの消化管での溶解時間は１０〜１５分の範囲である。そのため当業者は、ＨＭＢをＣａＨＭＢとして又はＨＭＢ酸としてのどちらで投与してもＨＭＢの吸収と最高血漿濃度は同様になると予測していたが、記載された差についてはわずかな遅れだった。しかしながらこれらの予測とは対照的に、２つの形態の間では、ピーク血漿に有意な差が認められた。ある例での最高血漿時間の差は９０分であり、これは、カプセルの溶解とＣａＨＭＢの解離によって説明されるよりも数倍長い。
【００３６】
[00042]当業者はまた、ほぼ同量の栄養素であるＨＭＢが消化管中に放出され、ＣａＨＭＢの曲線が時間軸に沿ってさらにシフトしたことから、血漿ピークと曲線下面積も同様であると予測していた。ＨＭＢ酸を投与したときの予想外の結果は血漿中のＨＭＢのピークレベルが２倍であることである。
【００３７】
[00043]さらなる予想外の結果は、血漿中でのＨＭＢの高いクリアランス（利用）である。腎臓にその栄養素に関する保持機構がない限り、多くの栄養素は類似した血漿及び尿プロファイルをもつ。今のところＨＭＢに関するものは知られていないため、当業者は、ＨＭＢの最高血漿濃度が２倍になれば、より高いパーセンテージ用量のＨＭＢが尿に排出されるだろうと考えていただろう。繰り返すと、これは観察されず、そのことは予期しなかった発見である。このことは、より高いクリアランス率と共に、ＨＭＢの組織による利用が増加したことを示しており、繰り返しになるが、これは驚くべき発見だった。
【００３８】
[00044]実験的実施例で、特に実施例２で示したように、ＨＭＢ酸は運動後の筋肉損傷を最小限にする点でＣａＨＭＢよりもより早く効果を表す。この２番目の実施例は、実施例１の発見からは直接予測できなかった有効性を示している。
【００３９】
[00045]本発明の方法を、以下の実験的実施例により、さらに説明する。
【実施例】
【００４０】
実験
実施例１：ＨＭＢ酸ゲルとカプセル形態のＣａＨＭＢの吸収の比較
材料及び方法
[00046]（ヒト対象） 試験１では、大学生の年齢の、４人の男性及び４人の女性を対象として試験した。試験２では、大学生の年齢の、別の４人の男性及び４人の女性を試験した。両試験のプロトコールはアイオワ州立大学（Iowa State University）ＩＲＢで認可され、そして各対象は試験に参加するためのインフォームドコンセントを提出した。治療の特性により、患者だけでなく研究者らに対しても盲検でなくてもよい。
【００４１】
[00047]（治療） 両試験群の対象に、同じ処置を行った。３種類の治療を無作為な順番で各対象に行い、治療と治療の間には少なくとも１週間の休薬期間を設けた。治療はMetabolic Technologies, Inc.（ＭＴＩ、エームズ、アイオワ）により供給され、食品等級の成分を用いて準備された。１グラムのＣａＨＭＢ又は等価なゲル形態の遊離酸型ＨＭＢを対象に投与した。ＣａＨＭＢカプセルは、市場向けのサプリメント製造業者から入手した（Optimum Nutrition、オーロラ、イリノイ）、ＨＭＢ酸ゲルはＭＴＩ研究所で準備した。簡単に説明すると、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）でＨＭＢ酸のｐＨを４．５に調整し、その後香料及び甘味料を添加した。１．０ｇのＣａＨＭＢカプセルを３５５ｍＬの水（およそ１２オンス）と共に摂取した。遊離酸ゲルの用量は０．８０ｇであり、カプセル中のＣａＨＭＢに含まれる遊離酸と等価であった。遊離酸ゲルによる治療は、嚥下する（ＦＡＳＷ）か、又は舌下で１５秒間保持し、その後嚥下する（ＦＡＳＬ）のいずれかとした。ＦＡＳＷは、３ｍｌのシリンジに入れた全用量を口腔内に排出する工程、嚥下する工程、そしてその後３５５ｍＬの水を飲む工程を含む。ＦＡＳＬ対象には、舌下に全用量を入れ、そしてその用量を１５秒間維持するための説明を行った。彼らはその後、口をすすぎ、そして３３５ｍＬの水を飲んだ。
【００４２】
[00048]（試験１の計画） 試験１の対象は、一晩絶食した翌朝、研究所に出向いた。サプリメント治療のうちの１種を摂取する前に、可撓性の滅菌ポリエチレン製カテーテルを無菌的手技により前腕の静脈に挿入し、摂取前の血液試料を採取した。その後血液試料を、治療を摂取した後、０、２、５、１０、１５、２５、３５、４５、６０、９０、１２０及び１８０分に採取した。血漿を分離し、試料をＨＭＢ濃度の解析用に−７０℃で凍結保存した。加えて、摂取前試料の一部と１８０分での血液試料を、グルコース、尿酸、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、塩素、二酸化炭素、リン酸、タンパク質、アルブミン、グロブリン、アルブミン：グロブリン比、総ビリルビン、直接ビリルビン、アルカリホスファターゼ、乳酸塩脱水素酵素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、鉄結合能（ＴＩＢＣ）、非飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）、鉄、鉄飽和、総コレステロール、トリグリセリド、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、及びコレステロール比の測定に用いた（LabCorp、カンザスシティー、ミズーリ）。治療の前及び治療期間の１８０分後に、完全血球算定（ＣＢＣ）もまた行った。対象らはまた、実験の間に彼らが経験する可能性のある何らかの身体症状（悪心、頭痛などのような）について、簡単なアンケートに答えた。
【００４３】
[00049]（試験２の計画） 試験１に以下のような修正を加えて試験２を行った。試験２では、１４４０分（２４時間）でのＨＭＢの血漿レベルを測定し、また、この期間でのＨＭＢの尿中排泄を測定するために、全尿を回収した。１８０分の血液試料を採取した後、対象は研究所を離れることを許可され、そして血液試料をさらに採取するために、サプリメント摂取後３６０、７２０、及び１４４０分に研究所に戻るように説明された。試験１と同様に、対象はそれぞれ、治療の間に少なくとも１週間の休薬期間をはさんで、それぞれの治療を摂取した。血漿及びＨＭＢの尿での濃度を解析するために、試料はここでも−７０℃で凍結保存した。試験１で既に行ったのと同じ測定を、ここでも摂取前、１８０分後及び１４４０分後の血液試料について試験した。対象は１８０分での血液採取の後に統一した昼食が提供され、摂取後およそ２４０分にこれを食べるように説明を受けた。７２０分の血液採取の後、対象は午後１０時までに通常の夕食を食べるように説明を受けた。対象は翌朝、絶食した１４４０分での血液試料について研究所に報告した。尿回収容器が提供され、対象は実験の２４時間の実験期間の間に排出された全ての尿を回収した。回収されなかった尿は、冷蔵庫で保存した。尿容積を測定し、全尿回収の試料を取って、ＨＭＢについて分析するまで−７０℃で凍結保存した。
【００４４】
[00050]（ＨＭＢ解析） これまでに記載されているように（文献２７）、血漿及び尿ＨＭＢをガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）で分析した。
[00051]（計算及び統計） 基準より上の面積を合計する台形法により（文献５１）、それぞれの対象について、曲線下面積を計算した。試験２では血漿ＨＭＢの半減期を計算した。以下の式を用いた。
【００４５】
ｋ＝（Ｉｎ（Ｃｐｅａｋ−Ｉｎ（Ｃｔｒｏｕｇｈ））／Ｔｉｎｔｅｒｖａｌ
ｔ１／２＝０．６９３／ｋ
[00052]各対象の最高血漿濃度をＣｐｅａｋに用いた。７２０分での血漿濃度が基準と有意な差がなかったため、トラフ濃度、すなわちＣｔｒｏｕｇｈは７２０分で測定した濃度である。ＴｐｅａｋはＣｐｅａｋが測定された時間であり、ＴｉｎｔｅｒｖａｌはＴｐｅａｋからＣｔｒｏｕｇｈ（７２０分）時点までの時間である。細胞外液分画は体重の２０％と仮定し、以下の式３を用いて計算した（文献１）。その後、ＨＭＢの血漿クリアランスを、式４に示したように、細胞外液分画であるＶｄと排泄定数であるＫｅｌとを乗算することにより計算した｛Thalhammer, 1998 9588／同上｝。
【００４６】
Ｖｄ＝体重（０．２０）
クリアランス＝Ｖｄ（Ｋｅｌ）（５０）
[00053]データを、ＳＡＳ中のProc GLMを用いて、クロスオーバー法により解析した（文献４５）。各時点で測定した血漿ＨＭＢについては、反復測定多項式モデルを用いた。このモデルには、対象、順序、並びに必要に応じて、治療の相互作用による治療の主要効果及び時間を含めた。その他の指標についてもまた、対象、順序、治療の主要効果及び治療の主要効果について報告されたｐ値を含むProc GLMを使用した。ｐ＜０．０５の場合に統計的な有意差があると見なし、０．０５＜ｐ＜０．１０の場合に傾向があると見なした。
【００４７】
[00054]結果
[00055]試験結果を図１〜７に示す。図１は、一連の激しい運動を行った後のＣＰＫ及びＬＤＨの血漿レベルを示している。図２は、一連の激しい運動を行った後の筋肉強度及び主観的な痛みを示している。図３は、試験１での血漿ＨＭＢレベルを示している。値は平均±ＳＥＭであり、ｎ＝男性４人と女性４人である。遊離酸での治療対ＣａＨＭＢカプセルについて、＊＝ｐ、０．０５、＋＝ｐ、０．００１、＋ｐ、０．０００１である。図４は、試験１での、ＣａＨＭＢ、ＨＭＢ酸ゲルの嚥下（ＦＡＳＷ）、又はＨＭＢ酸ゲルを舌下で維持し、その後嚥下する（ＦＡＳＬ）のいずれかを単回投与した後の、最高血漿ＨＭＢ濃度と、最高濃度到達時間を示している。＊＊＝ｐ、０．０００２。図５は、試験２の血漿ＨＭＢレベルを示している。値は平均±ＳＥＭであり、ｎ＝男性４人と女性４人である。＊＝ｐ、０．０５、＋＝ｐ、０．０１、＋＋ｐ、０．０００１。図６は、試験２で、ＣａＨＭＢ、ＨＭＢ酸ゲルの嚥下（ＦＡＳＷ）、又はＨＭＢ酸ゲルを舌下で維持し、その後嚥下する（ＦＡＳＬ）のいずれかを単回投与した後の、最高血漿ＨＭＢ濃度と、最高濃度到達時間を示している。＊＊は、濃度についてはｐ＜０．０００２であり、時間についてはｐ＜０．０００１である。図７は、摂取後２４時間で、尿中に排出されたＨＭＢの量の割合と、保持された量の相対的な割合を示している。＊＝ｐ＜０．００２。
【００４８】
[00056]（対象の特徴） 表１は試験１及び２の対象の特徴を示している。各試験で同数の男性及び女性を対象とし、そして３回の治療期間を通じて、各試験群の体重を一定に維持した。全ての対象は、各試験で全３回の試験プロトコールを完了した。治療による、悪心のような治療摂取後の副作用は、いずれの試験でも報告されなかった。
【００４９】
[00057]（試験１の結果：表２〜４） 表２は、最高血漿濃度（Ｃｐｅａｋ）及び最高血漿濃度到達時間（Ｔｐｅａｋ）を説明している。カプセルで摂取したＣａＨＭＢの最高血漿ＨＭＢ濃度は１３１±１０ｎｍｏｌ／ｍＬであったが、遊離酸ゲルのＦＡＳＷ又はＦＡＳＬ送達のいずれかで摂取したＨＭＢの濃度は有意に上昇し（２５９±２４及び２３１±２１ｎｍｏｌ／ｍＬ、それぞれ、ｐ＜０．０００１）かつ、血漿ＨＭＢレベルのピークが、カプセルによるＣａＨＭＢでは１２１．９±１５．６時間であったのと比較して早くなった（３３．１±４．６及び３６．３±１．３分、それぞれ）（ｐ＜０．０００１）。１８０分では、全ての送達方法について血漿ＨＭＢはまだ基準よりも高く、かつ、治療による３群間の差は無かった。３種類の治療後の血漿ＨＭＢ濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）もまた、表２に示す。ゲル形態のＨＭＢの投与による曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＦＡＳＷとＦＡＳＬのそれぞれで、９７％と９１％大きくなった（ｐ＜０．０００１）。ここでは、ＦＡＳＷ又はＦＡＳＬによって送達したＨＭＢ酸ゲルの間に差は無かった。
【００５０】
[00058]表３は、試験１での血液化学を示している。測定したいずれの時点または差について、主効果である治療の違いに有意な差は無かった。表４は、試験１で測定した血液学を示している。測定期間にわたって、ＦＡＳＷ群ではリンパ球の絶対数が非常に大幅に減少した（ｐ＜０．０４）。このことは主に、試験開始時点でＦＡＳＷ群が有していたリンパ球の数がより多い傾向にあったことによる（ｐ＜０．０９）。試験終了時ではリンパ球数に有意差はなく、平均は全て、リンパ球数の正常な限度内にあった。
【００５１】
[00059]（試験２の結果：表２、５〜７） ２４時間の血漿ＨＭＢを観察し、この同じ期間の間の尿中排泄を測定するために、試験２を実施した。試験１と同様に、遊離酸ゲル中に加えたＨＭＢをＦＡＳＷ及びＦＡＳＬの両方で与えた場合、ＣａＨＭＢカプセルよりも、血漿ＨＭＢの迅速な上昇と有意な増加が認められた。１８０分では、全ての治療の血漿ＨＭＢ濃度は同程度であった（およそ１１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）。３６０分と７２０分では、カプセルによるＣａＨＭＢによって維持された血漿ＨＭＢ濃度が僅かに高かった（ｐ＜０．０５）。
【００５２】
[00060]表５には、最高血漿ＨＭＢ濃度（Ｃｐｅａｋ）、最高血漿ＨＭＢ濃度到達時間（Ｔｐｅａｋ）、及び血漿ＨＭＢ半減期を挙げている。カプセルによるＣａＨＭＢの血漿ＨＭＢ濃度は、１３５．０±１７．０分で１３１．２±６．０ｎｍｏｌ／ｍＬのピークに達するが、ＦＡＳＷ及びＦＡＳＬでのＨＭＢの血漿ピークは、より短い時間（ｐ＜０．０００１）でより高くなり（ｐ＜０．０００３）、ＦＡＳＷ及びＦＡＳＬのそれぞれについて、４１．９±５．８分で２３８．６±１６．０ｎｍｏｌ／ｍＬ、また３８．８±２．６分で２４７．６±１９．８ｎｍｏｌ／ｍＬであった。
【００５３】
[00061]表５に示したように、カプセルによるＣａＨＭＢの血漿半減期は３．１７±０．２２時間であった。ＨＭＢのＦＡＳＷとＨＭＢのＦＡＳＬの半減期はそれぞれ、２．５０±０．１３時間と２．５１±０．１４時間であった（ｐ＜０．００４）。試験２で測定した曲線下面積及び尿中ＨＭＢも表５に示す。２４時間にわたって遊離酸ゲルとして投与したＨＭＢのＡＵＣは、ＦＡＳＷとＦＡＳＬのそれぞれで１５．４％と１４．３％であり、カプセル中に入れて投与したＣａＨＭＢよりも有意に大きかった（ｐ＜０．００１）。最高血漿ＨＭＢ及びＡＵＣが有意に上昇したにもかかわらず、ＨＭＢの尿中排泄は遊離酸ゲル治療によって有意に上昇せず、ＨＭＢの尿中排泄では、ＣａＨＭＢ、ＦＡＳＷ及びＦＡＳＬのそれぞれで、１４．７±２．０％、１７．８±２．９％、及び１７．２±２．５％が開始時用量から失われた。ＨＭＢクリアランスは、ＣａＨＭＢ形態と比較して、遊離酸ゲルではおよそ２５％上昇した（Ｐ＜０．００３）。
【００５４】
[00062]試験２の間に測定した血液化学を表６に、試験２で測定した血液学を表７に示す。２４時間内に変化した指標の統計分析では、測定したいずれの化学的又は血液学的な値においても、統計的に有意な変化（ｐ＜０．０５）は見られなかった。塩素では差がある傾向が強く認められた（ｐ＜０．０６）。期間中、ＦＡＳＬはＦＡＳＷと比較して大幅な上昇を示したが、ＦＡＳＷもＦＡＳＬもＣａＨＭＢに対しては有意な差を示さなかった。ナトリウムでも一定の傾向が見られ、測定期間中、ＦＡＳＷはＦＡＳＷ又はＣａＨＭＢと比較して大幅な上昇を示した（ｐ＜０．０７）。塩素及びナトリウムの期間中の平均値は正常な値の範囲内であった。
【００５５】
[00063]考察
[00064]本試験から、遊離酸ゲル形態のＨＭＢの経口又は舌下投与が、硬ゼラチンカプセル中に入れカルシウム塩として投与したＨＭＢ（ＣａＨＭＢ）と比較して、血漿ＨＭＢのより迅速な上昇と上昇の維持をもたらすことは明かである。ＨＭＢの遊離酸ゲルの投与は、血漿中ＨＭＢの半減期又は尿中排泄の大きな変化を伴うことなく、血漿ＨＭＢのＡＵＣを有意に上昇させた（平均＋１４．８％）。合わせてこれは、ＨＭＢのクリアランス及び組織による利用を有意に上昇させ、組織による利用はＣａＨＭＢ形態の利用よりも２５％高かった。このデータは、ＨＭＢをこの形態で送達することによる効果の向上を示している。
【００５６】
[00065]この試験からの発見はＣａＨＭＢ送達の血漿動力学に関連しており、Ｖｕｋｏｖｉｃｈら（文献５２）によってこれまでに報告されているものと一致する。ＣａＨＭＢの送達方法に大きな違いがあるにも関わらず（Ｖｕｋｏｖｉｃｈらは２５０ｍｇのカプセル４錠を用いたのに対し、本試験では１グラムのカプセルを用いた）、最高血漿濃度、最高濃度到達時間及び血漿半減期に関するデータは一致している。興味深いことにゲル形態にした遊離酸としてのＨＭＢの送達では、血漿濃度がＣａＨＭＢの経口投与のおよそ２倍に達したにもかかわらず、最高濃度到達時間が短縮されたが（遊離酸形態の利用ではほぼ９０分短縮された）、半減期は同様であった。複数の研究により、運動中の栄養補助食品としてのＨＭＢの利用が支持されてきた。ＨＭＢが筋タンパク及び膜の分解を低減させることが示され（文献２２；文献２３；文献２６）、並びにタンパク質合成を増強させることが示されてきた（文献１０）。そのため、運動中の血漿ＨＭＢ濃度を高くすること及びこれまでの報告（文献２６；文献２９；文献５２）と同程度又はそれ以上にＨＭＢを保持することが有用であると考えられる。この点で、ＣａＨＭＢの経口投与は、非常に負荷の強い任意の一連の運動を行う少なくとも２時間前に投与する必要があるが、ＨＭＢ遊離酸ゲルは運動を行う前に投与してもよく、ほぼ即効性である。
【００５７】
[00066]遊離酸形態のＨＭＢの送達はまた、ＨＭＢの有意に高い保持にも関連した。遊離酸ゲル形態を投与するとＡＵＣが有意に増大したが、尿中排泄は有意に増加せず、このことはＣａＨＭＢ形態と比較して、ＨＭＢの保持及び組織による利用がより多くなったことを示していると考えられる。血漿クリアランスを基にした、保持されたＨＭＢの量は、ＨＭＢ酸ゲルではＣａＨＭＢと比較して２５％高かった。Ｖｕｋｏｖｉｃｈらによるこれまでの試験では、３グラムのＣａＨＭＢの経口送達によって生じる最高血漿濃度は、１グラム用量で達成されるものよりも３倍高いことが分かった（５２）。Ｎｉｓｓｅｎらは、１日当たり１．５グラム又は３グラムいずれかのＣａＨＭＢを、１日２回、経口投与した場合の用量依存反応を示した。彼らは、ＣａＨＭＢの最適用量は３．０グラムであり、筋肉損傷の指示物質であるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）とタンパク質分解の指示物質である３−メチルヒスチンの放出を減少させることを示した（文献２６）。同様の発見は、１日当たり６グラムの投与が１日当たり３グラムよりもより有益であることをも示したＧａｌｌａｇｈｅｒによって報告された（文献１４）。総合すると上記試験は、筋肉に有用なＨＭＢを運動中により多く摂取することの有効性を示している。
【００５８】
[00067]遊離酸ゲルによるＨＭＢの送達は、カプセルに入れたＣａＨＭＢの投与と比較して、ＨＭＢの血中濃度ピークをより早く、かつ、より高くし、そして濃度を同程度に維持する。この形態の送達は、ＣａＨＭＢの経口投与について現在及びこれまでに分かっているもの（文献１５；文献２５）と同程度に安全である。
【００５９】
【表１】
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【００６４】
【表６】
【００６５】
【表７】
【００６６】
実施例２
[00068]この実施例では、一連の激しい運動を行った後の筋肉損傷におよぼすＨＭＢ酸ゲルの投与の効果を、カルシウムＨＭＢの効果と比較した。実施例１に示したように、ＨＭＢ遊離酸を投与すると、ＣａＨＭＢと比較して、ＨＭＢの最高血漿濃度とＨＭＢのクリアランス率が上昇した（文献１３）。この実施例は、一連の激しい運動の前後に遊離酸ゲルとして投与したＨＭＢのより迅速な反応が、ＨＭＢをカルシウムＨＭＢ塩として投与するよりも、筋肉損傷に対してより保護的であること示している。
【００６７】
[00069]ＨＭＢ及び運動が、筋肉損傷マーカー及び炎症性因子に及ぼす効果。負荷をかけて行う運動又は最大限の運動のような激しい運動は、筋肉細胞からのクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の漏出を増加させる（文献２１；文献３１）。ヒトでの試験から、血漿ＣＰＫの上昇によって測定した運動後の筋肉損傷が、カルシウムＨＭＢの補給によって低下することが分かってきた（文献１４；文献２２；文献２６；文献３３）。登り坂と下り坂を含む大学のクロスカントリーのコースを継続して２０ｋｍ走った後の筋肉損傷についての試験から、持続したカルシウムＨＭＢの投与が血漿ＣＰＫの上昇の抑制に、走行後４日間にわたって有効であることもまた分かった（文献２３）。Ｎｉｓｓｅｎらは（文献２６）、ＣＰＫの減少におけるカルシウムＨＭＢの量的効果（１日当たり３．０グラムが１日当たり１．５グラムよりも有効である）と、その結果の尿中３−メチルヒスチジン（３−ＭＨ）の有意な減少を示し、ここで、３−メチルヒスチジンは、よく確立された筋原繊維のタンパク質分解の指示物質である（文献３９）。Ｇａｌｌａｇｈｅｒらは、負荷をかけて行う運動を行っている大学生の男性３７人に、１日当たり３．０（体重１ｋｇ当たり３８ｍｇ）及び６．０グラム（体重１ｋｇ当たり７６ｍｇ）のカルシウムＨＭＢに相当するＨＭＢを補給した。両用量とも、除脂肪体重及び強度増加に同様の効果を示したが、より高い用量の方がＣＰＫの漏出を最小限に抑える点で有意な改善をもたらし、このことは、運動後の筋肉損傷の有意な回復を示唆している。これらの観察は、より高い血漿ＨＭＢ濃度が運動後の筋肉損傷に対してより保護的である可能性を示している。
【００６８】
[00070]実施例１で示したように、遊離酸としてのＨＭＢ（ゲルに加えた）はカルシウムＨＭＢより早く吸収され、その結果ＨＭＢの血漿濃度が上昇し、そして筋肉よってより早く利用される。
【００６９】
（方法）
[00071]対象： アイオワ州立大学ヘルスアンドヒューマンパフォーマンス研究室（Iowa State University Health and Human Performance Laboratory）で試験を実施した。この試験はアイオワ州立大学の施設内治験審査委員会（Iowa State University Institutional Review Board）で認可され、ClinicalTrials.gov（NCTOl 150526）に登録された。アイオワ州立大学の共同体と周辺地域から、年齢が２０才から３６才の間の、１２人の男性と１３人の女性に試験に参加してもらった。
【００７０】
[00072]（治療） 実験計画を図８に示す。５種類の治療を以下のように投与した。
・治療１： 偽薬。この群は、各回の投与で偽薬カプセルと偽薬のシリンジ投与を受けた。
・治療２： ＣａＨＭＢ、運動前。この群は、一連の激しい運動の３０分前に、ＣａＨＭＢカプセルと偽薬のシリンジ投与を受けた。試験期間中の残りの投与では、偽薬カプセル１錠と、偽薬のシリンジ投与１回を受けた。
・治療３： ＨＭＢ酸ゲル、運動前。この群は、一連の激しい運動の３０分前に、偽薬カプセルとＨＭＢ酸ゲルのシリンジ投与を受けた。試験期間中の残りの投与では、偽薬カプセル１錠と、偽薬のシリンジ投与１回を受けた。
・治療４： ＣａＨＭＢ、運動前後。この群は、試験期間中の全ての投与時間に、ＣａＨＭＢカプセルと偽薬のシリンジ投与を受けた。
・治療５： ＨＭＢ酸ゲル、運動前後。この群は、試験期間中の全ての投与時間に、ＨＭＢ酸ゲルのシリンジ投与と偽薬カプセル１錠を受けた。
【００７１】
[00073]研究者と対象の両方に対して治療を隠すために、対象は各投与でカプセルとシリンジ投与を受けた。カプセルには１グラムの乳酸カルシウム（偽薬）又は１グラムのβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸カルシウム（ＣａＨＭＢ）のいずれかが含まれていた。シリンジ投与は、味及び外観が同じようになるように処方され、かつ、０．８グラムのコーンシロップ（偽薬）又は０．８グラムのβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸遊離酸、すなわちカプセルの用量と同量のＨＭＢになる、のいずれかを含んだ。３種類の１日用量は、合計して同量のＨＭＢ用量を提供した（カプセルに入れた、カルシウムＨＭＢとして２．４ｇ又はシリンジに入れたＨＭＢ遊離酸として２．４ｇ）。
【００７２】
[00074]（一連の激しい運動） 対象は、研究所に来所する前の３日間は、激しい運動を自制した。全ての対象について、一晩絶食した後に試験した。対象から絶食時血液試料を採取し、その時点で尿を回収した。その後、対象は彼らに割り当てられたサプリメントを消費し、３０分後に一連の激しい運動を行った。この運動は、バイオデックスのレバーアームが、膝関節を完全に伸展した状態から９０℃曲がるように動かすのに抵抗する、膝伸筋の５０最大効果収縮からなる。これは、着席した状態で、重い物をゆっくりと下に移動させる運動と類似している。各収縮を約２秒間維持し、そして収縮と収縮の間は１２秒間とした。このプロトコールを右脚について行い、その後左脚について行った。対象は１日あたり、さらに２回の治療の投与を受け（偽薬又はＨＭＢ）、これを昼食及び夕食の時に摂取するように説明された。続く４日間、対象は絶食した状態で毎朝に研究所に出向き、血液採取と尿の回収を行い、その後、朝用の彼らのサプリメントを摂取した。対象はここでも、１日当たり２回分の残りのサプリメントを受け取り、それらを昼食と夕食で摂取するように説明を受けた。
【００７３】
[00075]（血清及び尿試料） 対象が試験のために研究所に出向いた時に毎朝、絶食時血液試料を浅前腕静脈から採取した。加えてこの時点で、中間尿試料を回収した。血清ＣＰＫを民間の試験所で解析した（Quest Diagnostics、マディソン、ニュージャージー）。尿中の３−メチルヒスチジン（３ＭＨ）は、既に出版されているＧＣ／ＭＳ方法（９）により分析した。尿クレアチニンは、比色試験により分析した（Cayman Chemical Company、アナーバー、ミシガン）。尿中３ＭＨのデータを、尿中クレアチニンに対して正規化し、３ＭＨ：クレアチニン比（μｍｏｌ：ｍｇ）として表した。
【００７４】
[00076]（統計） データを、ウィンドウズ用のStatistical Analysis System（リリース版９．１．３、SAS Institute、ケアリー、ノースカロライナ）に含まれている混合モデル法を用いて解析した。それぞれの変数の変化を、各測定時について解析した。モデルには、基線すなわち０値を共変数として含め、そして性別及び治療を主効果として含めた。解析の前に、ＣＰＫのデータをＳＡＳ中のランク法を用いて変換した。運動の前後にＨＭＢ酸ゲルを摂取した場合の平均を、その他の治療の平均と比較するために、コントラストを用いた。
【００７５】
[00077]（結果） 対象の人口統計学を表８に示す。治療ごとの、対象の年齢、身長及び体重はほぼ同じであった。
【００７６】
【表８】
【００７７】
[00078]治療は以下のとおりである。
（治療１）： 偽薬カプセル及び偽薬のシリンジ投与
（治療２）： 運動前にカルシウムＨＭＢカプセルと偽薬のシリンジ投与、及び運動後に偽薬カプセルと偽薬のシリンジ投与
（治療３）： 運動前に偽薬カプセルとＨＭＢ酸ゲルのシリンジ投与及び運動後に偽薬カプセルと偽薬のシリンジ投与
（治療４）： 運動前後にカルシウムＨＭＢカプセルと偽薬のシリンジ投与
（治療５）： 運動前後に偽薬カプセルとＨＭＢ酸ゲルのシリンジ投与
治療を１日３回、朝の試験の３０分前、その後、およそ正午と午後６時に投与した。
【００７８】
[00079]血清ＣＰＫ及び尿中３ＭＨ
尿中クレアチニン比を表９に示す。基準値（０時間）と差は無かった。激しい運動によって血清ＣＰＫが４倍まで上昇したことは筋肉膜の損傷を示している。しかしながら、運動前と運動後の両方でＨＭＢ酸ゲルを投与すると（治療５）、この上昇は、運動後２４時間では６４％（Ｐ＜０．０３）、そして運動後４８時間では８６％（Ｐ＜０．００５）抑えられた。７２時間まで継続すると、ＨＭＢ酸ゲル治療を行ってもＣＰＫの上昇はほとんど認められなかった。図９は、この試験の時間経過に伴うＣＰＫ値の上昇と減少を示している。表２でもまた、筋肉でのタンパク質分解の指標である、３ＭＨ：クレアチニン比に及ぼす治療の効果を示している。これらのデータは傾向を表しているだけではあるが、運動前後にＨＭＢ酸ゲルで治療すると、タンパク質分解が上昇せずに減少さえすることを示している。これは、タンパク質分解の減少が、筋内でのより適したタンパク質代謝及びタンパク質沈着をもたらしていることを示していると考えられる。
【００７９】
【表９】
【００８０】
（考察）
[00080]実施例１での観察に基づき、ＨＭＢ遊離酸を投与した場合、筋肉組織はかなり高い濃度の血清ＨＭＢに曝された。加えて実施例１では、ＨＭＢ酸を投与した場合には、ＣａＨＭＢ投与と比較して、ＨＭＢの血清から筋肉及び組織へのクリアランスがかなり上昇したことが分かった。従って実施例２からは、筋肉による遊離酸形態のＨＭＢのこの利用の増加が、カルシウム形態のＨＭＢを投与した場合よりも、一連の激しい運動を行った後の筋肉組織に対してより保護的であることが分かった。
【００８１】
[00081]前述した詳細及び図面は、本発明の実例となる実施形態を含む。前述した実施形態及び本明細書に記載した方法は、当業者の能力、経験、及び資質によって異なってもよい。この方法を特定の順番で単に列挙することは、この方法の工程の順番にいかなる制限も構成しない。前述した説明及び図面は単に本発明を解説し、かつ、説明するものであり、本発明はそれらによって制限されない。この明細書に対面している当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、これに修正や変更を加えることができるだろう。本発明組成物の投与は、当業者によって認識される所望の効果を達成するのに十分な量で行われるだろう。
【００８２】
参照文献リスト
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【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
[0001]本出願は、２００９年１２月１８日に出願した米国特許出願第６１／２８７，８５７号の優先権を主張し、その全文は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[0002]本発明は基本的には、より効率的でより有効なβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸塩（ＨＭＢ）の送達系に関し、より具体的には、等量のカルシウム塩形態のＨＭＢ（ＣａＨＭＢ）を投与するよりも、より効率的でより有効なＨＭＢの投与方法をもたらすＨＭＢ遊離酸の投与に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]ＨＭＢが様々な応用環境で有用なことが分かっている。具体的には、米国特許第５，３６０，６１３号（Ｎｉｓｓｅｎ）では、ＨＭＢが総コレステロール及び低比重リポプロテインコレステロールの血液レベルを減少させるのに有用であることが記載されている。米国特許第５，３４８，９７９号（Ｎｉｓｓｅｎら）では、ＨＭＢがヒトの窒素保持の促進に有効であることが記載されている。米国特許第５，０２８，４４０号（Ｎｉｓｓｅｎ）は、動物の赤身を増加させるためのＨＭＢの有効性を議論している。米国特許第４，９９２，４７０号（Ｎｉｓｓｅｎ）ではまた、ＨＭＢが哺乳動物の免疫反応の増強に有効であると記載されている。米国特許第６，０３１，０００号（Ｎｉｓｓｅｎら）では、疾患に関連する衰弱を治療するためのＨＭＢと少なくとも１つのアミノ酸の使用が記載されている。米国特許第６，１０３，７６４では、筋肉量の実質的な増加を伴わずに、ＨＭＢが動物の筋肉の有酸素容量を高めることが記載されている。加えて米国特許第６，２９１，５２５号では、ヒトが心の状態を認知することの改善にＨＭＢが有用であることが記載されている。
【０００４】
[0004]ＨＭＢが、癌性悪質液及びＡＩＤＳに関連した衰弱での除脂肪筋肉量の維持及び増加に好ましい効果をもつことが示されてきた。加えてＨＭＢの使用は、筋肉損傷及び、筋肉の痛みや強度損失を引き起こす運動によって生じる炎症性反応に好ましい効果をもたらし、また、ＨＭＢの使用により、炎症を引き起こすサイトカインの増加が見られる。
【０００５】
[0005]これまでに、ＨＭＢを単独で又はその他のアミノ酸と併用してサプリメントとして摂取することが、若い運動選手の筋肉の強度及び機能の復元に有効であることが観察されてきた。さらに、ＨＭＢを２種類のアミノ酸、すなわちアルギニン及びリシンと併用することが、高齢者の筋肉量の増加に有効であることも観察されてきた。
【０００６】
[0006]ＨＭＢはアミノ酸であるロイシンの活性代謝産物である。タンパク質分解を抑制するためのＨＭＢの使用は、ロイシンがタンパク質を節約する特性をもつことが観察されたことに由来する（文献１８；文献２４）。必須アミノ酸であるロイシンを、タンパク質合成又はα−ケト酸へのトランスアミノ化のいずれかに用いることができる（α−ケトイソカプロン酸、ＫＩＣ）（文献２４）。ある経路でＨＭＢは、ロイシンのトランスアミノ化産物であるα−ケトイソカプロン酸の酸化により、肝臓で生成される。この経路では、およそ５％のロイシンが酸化される（文献２８）。ＨＭＢはロイシンよりも優れた筋肉量及び筋肉強度の増強効果をもつ。ＨＭＢの最適効果は１日当たり３．０グラム、又は１日当たり体重１キログラムにつき０．０３８グラムで達成することができるが、ロイシンの最適効果には１日当たり３０．０グラム以上が必要である（文献２９）。
【０００７】
[0007]一旦生成又は摂取されたＨＭＢは２つの運命をもつと考えられている。第一の運命は単純に尿中に排出されることである。ＨＭＢの摂取後、尿中のＨＭＢ濃度は上昇し、ＨＭＢのおよそ２０〜５０％が尿として失われる（文献２６；文献５２）。他方の運命は、ＨＭＢのＨＭＢ−ＣｏＡへの活性化に関わる（文献４；文献６；文献１６；文献１７；文献２０；文献３５；文献３６；文献４１；文献４３；文献５４）。一旦ＨＭＢ−ＣｏＡへと変換されると、次の代謝、すなわちＨＭＢ−ＣｏＡのＭＣ−ＣｏＡへの脱水又はＨＭＢ−ＣｏＡのＨＭＧ−ＣｏＡへの直接的な変換が起こる可能性があり（文献４２）、これにより細胞内でのコレステロール合成の基質が供給される。いくつかの研究から、ＨＭＢがコレステロールの合成経路に組み入れられること（文献２−４；文献１６）及び損傷を受けた細胞膜の再生に用いられる新しい細胞膜用のコレステロール源になる可能性があること（文献２９）が分かっている。ヒトでの研究から、血漿ＣＰＫ（クレアチンホスホキナーゼ）の上昇によって測定される激しい運動後の筋肉損傷が、ＨＭＢを補うことで減少することが分かってきた。ＨＭＢを毎日継続して使用することにより、その保護効果が少なくとも３週間現れることが示された（文献１４；文献２２；文献２３）。
【０００８】
[0008]単離したラットの筋肉を用いた生体外での研究は、ＨＭＢが筋肉のタンパク質分解（文献３２）、特にストレスを受けている間のタンパク質分解の強力な阻害剤であることを示している。これらの発見はヒトでも確認された。例えば、ＨＭＢは負荷をかけて行う筋力トレーニングを行っている対象での筋肉のタンパク質分解を阻害する（文献２６）。この結果は多くの研究で一致している（文献１４；文献２２；文献３３；文献４６；文献５３）（文献９−１１；文献４７；文献４８；文献４８）。Ｃ２Ｃ１２筋肉細胞では、ＨＭＢは実験的に誘導した異化作用を弱める（例えば）。
【０００９】
[0009]ＨＭＢがタンパク質分解を減少させ、タンパク質合成を上昇させる分子機構が報告されている（文献１０；文献４４）。ＭＡＣ１６悪液質誘導性腫瘍に罹患しているマウスでは、ＨＭＢはユビキチン−プロテアソーム経路の重要な活性化因子を下方制御することによりタンパク質分解を弱める（文献４７）。さらにＨＭＢは、タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）の活性化を弱め、そしてマウス筋管でのユビキチン−プロテアソーム経路に関わる遺伝子発現を増加させることによりタンパク質分解を減少させる（文献４８）。ＰＩＦはマウス筋管でのタンパク質合成を５０％阻害し、そしてＨＭＢはタンパク質合成でのこの低下を弱める（文献９）。Ｅｌｅｙらは、ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）に及ぼす作用を介した真核生物翻訳開始因子２（ｅＩＦ２）のリン酸化の下方制御及びラパマイシン／７０−ｋＤａリボソームＳ６キナーゼ（ｍＴＯＲ／ｐ７０ｓ６ｋ）経路の哺乳類標的の亢進を含む数多くの方法により、ＨＭＢがタンパク質合成を増加させることを示した。最終的に起こる結果は、４Ｅ−結合タンパク質（４Ｅ−ＢＰ１）のリン酸化の上昇及び活性型ｅＩＦ４Ｇ−ｅＩＦ４Ｅ複合体の増加である。これらの機序の多くがロイシンとＨＭＢで共通するが、タンパク質合成の刺激についてはＨＭＢがより強力であると考えられている（文献９）。
【００１０】
[00010]ＨＭＢはまた、リポ多糖（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子−α／インターフェロン−γ（ＴＮＦ−α／ＩＦＮ−γ）、及びアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）のようなその他の異化因子の作用に介在する共通な経路を弱めることにより、タンパク質合成を増加させることができる（文献１０；文献１１）。ＨＭＢはカスパーゼ−３と−８の活性化を弱めることにより、それに続くＰＫＲの活性化の抑制とｐ３８分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）を下方制御することによる活性酸素種（ＲＯＳ）の形成を介して作用する。ＲＯＳ形成が増加すると、ユビキチン−プロテアソーム経路を介したタンパク質分解が誘導されることが知られている。ＨＭＢは、ＰＫＲの自己リン酸化とそれに続くｅＩＦ２αのリン酸化、そして部分的にはｍＴＯＲ経路の活性化を介してこの抑制を達成する。
【００１１】
[00011]最近の報告では、ＨＭＢがロイシンのように、Ｃ２Ｃ１２筋管でのｍＴＯＲｃｌ非依存性ＰＩ３Ｋシグナル伝達を刺激するかどうかが試験された（文献１９）。ＨＭＢは、ＡＫＴＳｅｒ４７３（±１２９％）、Ｓ６Ｋ１Ｔｈｒ３８９（±５０％）及び４ＥＢＰ１Ｔｈｒ６５／７０（±５１％）のリン酸化を刺激した。ＨＭＢはロイシンよりも高い有効性で、例えばＳ６Ｋ１Ｔｈｒ３８９をそれぞれ±５０％対±１７％で、同化シグナル伝達を刺激した。予想通り、ＨＭＢをラパマイシン（ｍＴＯＲｃｌ阻害剤）と共にインキュベートするとｍＴＯＲｃｌシグナル伝達の上昇が弱まったが、ＡＫＴのリン酸化は弱まらなかった（±１８８％）。一方、ＬＹ２９００４２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）と共にインキュベートすると、ＨＭＢ誘導性のＡＫＴ及びｍＴＯＲｃｌシグナル伝達の両方の上昇が停止し、このことはＨＭＢがＰＩ３Ｋに依存した方法でｍＴＯＲｃｌにシグナルを伝達していることを示唆している。これらのデータは、ＨＭＢが、ロイシンの代謝産物であるにも関わらず、ロイシンが用いる機構とは異なる機構を介してｍＴＯＲｃｌにシグナルを伝達することを示唆している。
【００１２】
[00012]数多くの研究により、ＨＭＢの有効量が、ＣａＨＭＢとして、１日当たり３．０グラムであることを示されてきた（１日当たり体重１キログラムにつき約３８ｍｇ）。栄養補助食品としては、ＨＭＢカルシウム塩の一水和物が用いられてきた。この実験式はＣａ（ＨＭＢ）２−Ｈ２Ｏである。この用量は、負荷をかけて行う筋力トレーニングによって得られる筋肉量及び強度を増加させ、さらに過剰な運動による筋肉損傷を最小限に抑える（文献１４；文献２６；文献３０；文献３３）。ＨＭＢの安全性についての試験では、健康な若年成人又は高齢者では副作用は見られなかった（文献１５；文献２５）。ＨＭＢをＬ−アルギニン及びＬ−グルタミンと併用してＡＩＤＳ及び癌患者に補った場合にも安全であることが分かっている（文献３８）。
【００１３】
[00013]ヒトでの試験でもまた、１日当たり３．０グラムのＣａＨＭＢをアミノ酸と共に栄養補助食品として使用すると、癌及びＡＩＤＳのような様々な条件での筋肉量の減少が抑制されることが示された（文献５；文献１２）。除脂肪体重及び筋肉強度を向上させるために、ウェイトトレーニングと併用してＨＭＢを補給した場合のメタ分析から、ＨＭＢが、運動と併用した場合に除脂肪体重及び筋肉強度を向上させるたった２つの栄養補助食品の内の１つであることが分かった（文献３０）。高齢者で１年間にわたって行ったより最近の研究により、ＨＭＢと、アミノ酸であるアルギニン及びリシンを併用すると、運動しないでも除脂肪体重が増加することが分かった。
【００１４】
[00014]運動するとロイシン酸化が増大するため、筋肉損傷の最適な予防とその後の回復には、運動中及び運動直後に最適レベルのＨＭＢを摂取することが必要だと考えられる。さらに、損傷が起こっている間には炎症過程が刺激されるが、炎症を放置しておくとこれは有害となり、その結果治癒が遅れる。慢性炎症及び炎症性サイトカインが、心血管疾患及びＩＩ型糖尿病、並びに喘息、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患及び関節リウマチの根底にある主要な原因であることが分かってきた。
【００１５】
[00015]ヒトでの試験により、負荷をかけて行う筋肉トレーニングが、早ければ運動後１〜２時間から筋肉のタンパク質合成に良い効果を及ぼし、それが最大４８時間続くことが示された（文献８；文献３４）。複数の試験から、運動後のタンパク質合成を最大に刺激するため及びタンパク質分解を鈍化させるためには栄養素を摂取するタイミングが重要であることもまた示された（文献４０）。栄養素を送達するのに最も適した時間は、運動後２時間以内と考えられる。Ｄｒｅｙｅｒら（文献７）は、運動後の回復の１時間以内にロイシンを豊富に含む栄養溶液を摂取すると、ｍＴＯＲシグナル伝達経路及び筋肉のタンパク質合成が有意に増強されることを示した。
【００１６】
[00016]ＣａＨＭＢの解離曲線は酢酸カルシウムのものと同様であり（文献４９）、与えられた用量により、６０〜１２０分の間にＨＭＢは最高血漿濃度に達する。一般的な１グラム用量の場合には、最高血漿濃度到達時間は２時間であった（文献５２）。従って、最大の利益を得るためには、ＣａＨＭＢを運動の前に摂取する必要がある。
【００１７】
[00017]従って、ＨＭＢが筋肉に及ぼす効果には、ＨＭＢを投与するタイミングとＨＭＢの血中濃度が重要である。ＨＭＢをより早くより効率的に送達できる系が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第５，３６０，６１３号（Ｎｉｓｓｅｎ）
【特許文献２】米国特許第５，３４８，９７９号（Ｎｉｓｓｅｎら）
【特許文献３】米国特許第５，０２８，４４０号（Ｎｉｓｓｅｎ）
【特許文献４】米国特許第４，９９２，４７０号（Ｎｉｓｓｅｎ）
【特許文献５】米国特許第６，０３１，０００号（Ｎｉｓｓｅｎら）
【特許文献６】米国特許第６，１０３，７６４号
【特許文献７】米国特許第６，２９１，５２５号
【発明の概要】
【００１９】
[00018]本発明では、ＨＭＢを遊離酸の形で投与する（「ＨＭＢ酸」）。ＨＭＢ遊離酸の投与は組織に対するＨＭＢの効果を向上させるため、ＣａＨＭＢを投与するよりも、より迅速でより効率的な組織へのＨＭＢの供給方法を提供する。基質を用いた遊離酸型ＨＭＢの経口摂取又は舌下投与はＨＭＢの直接的で迅速な吸収をもたらし、ＨＭＢの組織に対する効果を高める、より良い送達方法を提示している。
【００２０】
[00019]一実施例では、ゲルのような可溶性基質に溶解した中和したＨＭＢを用いて、遊離酸型ＨＭＢを直接送達する。有効量の遊離酸型ＨＭＢを経口経路又は舌下経路でヒトに投与する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】[00020]図１は、一連の激しい運動を行った後のＣＰＫ及びＬＤＨの血漿レベルを示している。
【図２】[00021]図２は、一連の激しい運動を行った後の筋肉強度及び主観的な痛みを示している。
【図３】[00022]図３は、実験的な実施例１で見られたＨＭＢの血漿濃度を示している。
【図４】[00023]図４は、ＨＭＢの最高血漿濃度及び最高濃度到達時間を示している。
【図５】[00024]図５はＨＭＢの血漿濃度を示している。
【図６】[00025]図６は、ＨＭＢの最高血漿濃度及び最高濃度到達時間を示している。
【図７】[00026]図７は、尿に排出されたＨＭＢ用量をパーセンテージで示している。
【図８】[00027]図８は本発明の治療計画を示している。
【図９】[00028]図９は並外れて激しい一連の運動を行った後のＣＰＫの変化を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
[00029]本発明は、ＨＭＢのヒトへの送達方法であり、具体的には、遊離酸型ＨＭＢの投与が、ＣａＨＭＢを含むその他の形態のＨＭＢを投与するよりもＨＭＢの効果の上昇をもたらすようになる、ＨＭＢ酸のヒトへの投与方法である。ＨＭＢ酸を使用することで、ヒト組織へのＨＭＢの効果が向上する。ＨＭＢ酸を投与すると、その他の形態のＨＭＢを投与するよりも、筋肉損傷とそれに付随する炎症反応に対する保護効果が有意に上昇する。さらに遊離酸型ＨＭＢの投与はまた、悪液質及び衰弱状態での筋肉の保存にも効果があり、また、心血管疾患などの数多くの疾患を引き起こす可能性のある慢性炎症を含む炎症の鈍化に作用する。遊離酸型ＨＭＢがＣａＨＭＢよりも筋肉損傷を低下させるという予想外の驚くべき発見は、遊離酸型ＨＭＢが損傷によって生じる炎症反応もまた減少させる可能性があることを示している。ＨＭＢ遊離酸の投与は、栄養又は医薬用補助食品として広く応用されており、多くの人々に影響を与える可能性がある。
【００２３】
[00030]本発明では、ＨＭＢをその遊離酸型としてヒトに投与する。遊離酸型ＨＭＢには、基質又はゲルなどの担体が付随してもよい。好ましい態様では、遊離酸型ＨＭＢを経口又は舌下で投与するが、ＨＭＢを投与するいかなる手段も適切である。ＨＭＢ酸は市販されている。
【００２４】
[00031]ＨＭＢの酸型は、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸、β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸、又はβ−ヒドロキシ−イソ吉草酸と呼ばれており、また、「ＨＭＢ酸」と呼ぶことができる。構造式は（ＣＨ３）２Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＯＯＨであり、その分子は以下の通りである。
【００２５】
【化１】
【００２６】
[00032]本発明では、有効量のＨＭＢ酸をヒトへ投与する。有効量は、２４時間当たり体重１キログラムにつき、約０．０１グラム〜約０．２グラムの範囲のＨＭＢ酸となる。ＨＭＢ酸を、１日当たり約０．５グラム〜約３０グラムであるＨＭＢ酸の有効量でヒトに投与してもよい。有効量のＨＭＢ酸は等量のＣａＨＭＢを投与するよりも、ＨＭＢの血漿濃度の大幅な上昇及び／又はＨＭＢの最高血漿濃度到達時間の短縮を生じる。ＨＭＢ酸の投与による効果の向上は、等量のＣａＨＭＢを投与するよりも１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、１００％、２００％、４００％、５００％又はそれ以上になるだろう。ＨＭＢ酸とその他の形態のＨＭＢの比較は、当業者に知られているＨＭＢの標準的な指標を用いて、ＨＭＢの効果又は効率に基づいて行われるだろう。
【００２７】
[00033]実施例では、ＨＭＢ酸は可溶性のゲルとして投与されるが、本発明はＨＭＢ酸を含む可溶性のゲル又は基質の使用には限定されない。固体、錠剤、カプセル、及び経口静脈注射用溶液のような液体などの任意の薬学上許容可能な形態のＨＭＢ酸が本発明の範囲に含まれるが、ＨＭＢ酸の形態はこれらには限定されない。ＨＭＢ酸を、様々なデンプン及び食塩水を含むがこれらには限定されない任意の薬学上許容可能な担体を用いて投与することができる。好ましい態様では、有効量のＨＭＢ酸を１日に２回又は３回の用量で投与するが、当然のことながら、有効量のＨＭＢ酸を単回用量で１日１回投与することも本発明の範囲内であり、１日当たりのＨＭＢの投与回数が何回になっても同様に本発明の範囲内である。
【００２８】
[00034]ＨＭＢ酸の送達は、最も一般的にはＨＭＢ酸を含むゲルのような可溶性基質の送達は、ＣａＨＭＢを含む塩としてのＨＭＢの投与又はエステル若しくはラクトンなどのその他の形態のＨＭＢ投与よりも、ＨＭＢの同化作用を有意に上昇させ、ＣＰＫを顕著に減少させる。一態様では、ＨＭＢ酸ゲルの投与は、等量のＣａＨＭＢを投与した場合と比較して、ＨＭＢが約１／４の時間で２倍の最高血漿濃度に達し、かつ、等量のＣａＨＭＢと比較して、血漿クリアランスで測定した送達の効率が２５％向上した。
【００２９】
[00035]この送達方法は応用範囲が広い。ＨＭＢの既知の使用方法又は有効性には、窒素保持及びタンパク質の節約の向上、除脂肪体重の増加、筋肉機能及び／又は筋肉の性能の向上、ストレス又は損傷に曝された筋肉での筋肉損傷の低減、ストレス又は損傷に曝された後の筋肉の炎症反応の低下、ストレス又は損傷後の体の免疫反応の向上、衰弱（癌、慢性肺疾患、年齢、慢性腎臓疾患、長期入院又はＡＩＤＳに伴う衰弱）に関連した疾患の治療、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）から高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）へなどの脂質プロファイルの向上、並びにヒトの心の状態の改善が含まれるがこれらには限定されない。より有効でより効果的なＨＭＢの投与方法は、これら既知のＨＭＢの使用で、幅広い用途に用いられる。
【００３０】
[00036]ＨＭＢ酸の使用については既に述べられているが、遊離酸形態のＨＭＢは、先行技術で提案されているＨＭＢのカルシウム塩やその他の塩と等価であると考えられていた。ＨＭＢ酸とＨＭＢ塩の効果の差についてはこれまでには試験されていなかった。
【００３１】
[00037]これまでは、遊離酸形態のＨＭＢについての詳細な試験及び商業利用の両方に対して数多くの障害があり、また、差がないと考えられていたことから、ＨＭＢの商業的供給源としてはカルシウム塩が採用された。最近まで、包装、具体的には栄養補助食品の流通には、粉末形態の栄養素が取扱いに適していた。そのため、ＨＭＢのカルシウム塩が広く受け入れられた。ＨＭＢ酸は液体であるため、配送、又は製品に組み込むことが非常に難しい。
【００３２】
[00038]その他のカルシウム塩とは異なり、この分子のカルシウム成分とＨＭＢ成分は非常に容易に解離することが分かっており、このことが遊離酸型ＨＭＢとＨＭＢカルシウム塩との間に生理学的な差がないだろうという仮説を指示した。
【００３３】
[00039]加えて、ＨＭＢカルシウム塩の形成及び結晶化は、製造過程の最終的な精製段階として用いられてきた。特に、結晶化に使用が制限された化合物は３，３−ジメチルアクリル酸であった。この化合物は遮るのが難しい異臭を生じる。現在のＨＭＢの製造過程では、高純度ＨＭＢ遊離酸の製造が可能になり、ＨＭＢ遊離酸の経口摂取が可能となった。現在では、経口摂取に十分な純度の商業的な供給源があるだけでなく、ＨＭＢ酸を経口摂取するには緩衝化する必要があり、この過程はこれまでＨＭＢの使用を阻害していた上述の要因により近年にやっと決定された（文献１９）〜（文献４９）。
【００３４】
[00040]カルシウム塩中のカルシウムとＨＭＢの結合は緩やかで（文献４９）、これまでは、ＨＭＢを遊離酸として又はカルシウム塩としてのいずれで経口投与しても違いはないだろうと考えられていた（文献１９）。実施例１で示したように、ＨＭＢ酸の経口投与によって達成される血漿濃度に驚くべき違いがあるだけではなく、血漿クリアランスも２５％上昇し、このことは、筋肉量と機能に対する効果の向上を伴う組織によるＨＭＢ消費の増加を示している。遊離酸型のＨＭＢは、モル等量を与えた場合、ＨＭＢのカルシウム塩と比較してＨＭＢの血漿レベルを約４分の１の時間で２倍にする。実施例２では、筋肉に激しい運動をさせた場合、ＣａＨＭＢよりも遊離酸型で投与したＨＭＢがより保護的であり、筋肉に対する効果の向上がはっきりと示されている。
【００３５】
[00041]ＣａＨＭＢはｐＨが中性から酸性の水溶液に可溶性であり、容易に解離することか知られていることから、当業者は、外観上の短い時間のずれはこの解離工程によるものだと予測していた。ゼラチンカプセルに入れて投与したＣａＨＭＢの消化管での溶解時間は１０〜１５分の範囲である。そのため当業者は、ＨＭＢをＣａＨＭＢとして又はＨＭＢ酸としてのどちらで投与してもＨＭＢの吸収と最高血漿濃度は同様になると予測していたが、記載された差についてはわずかな遅れだった。しかしながらこれらの予測とは対照的に、２つの形態の間では、ピーク血漿に有意な差が認められた。ある例での最高血漿時間の差は９０分であり、これは、カプセルの溶解とＣａＨＭＢの解離によって説明されるよりも数倍長い。
【００３６】
[00042]当業者はまた、ほぼ同量の栄養素であるＨＭＢが消化管中に放出され、ＣａＨＭＢの曲線が時間軸に沿ってさらにシフトしたことから、血漿ピークと曲線下面積も同様であると予測していた。ＨＭＢ酸を投与したときの予想外の結果は血漿中のＨＭＢのピークレベルが２倍であることである。
【００３７】
[00043]さらなる予想外の結果は、血漿中でのＨＭＢの高いクリアランス（利用）である。腎臓にその栄養素に関する保持機構がない限り、多くの栄養素は類似した血漿及び尿プロファイルをもつ。今のところＨＭＢに関するものは知られていないため、当業者は、ＨＭＢの最高血漿濃度が２倍になれば、より高いパーセンテージ用量のＨＭＢが尿に排出されるだろうと考えていただろう。繰り返すと、これは観察されず、そのことは予期しなかった発見である。このことは、より高いクリアランス率と共に、ＨＭＢの組織による利用が増加したことを示しており、繰り返しになるが、これは驚くべき発見だった。
【００３８】
[00044]実験的実施例で、特に実施例２で示したように、ＨＭＢ酸は運動後の筋肉損傷を最小限にする点でＣａＨＭＢよりもより早く効果を表す。この２番目の実施例は、実施例１の発見からは直接予測できなかった有効性を示している。
【００３９】
[00045]本発明の方法を、以下の実験的実施例により、さらに説明する。
【実施例】
【００４０】
実験
実施例１：ＨＭＢ酸ゲルとカプセル形態のＣａＨＭＢの吸収の比較
材料及び方法
[00046]（ヒト対象） 試験１では、大学生の年齢の、４人の男性及び４人の女性を対象として試験した。試験２では、大学生の年齢の、別の４人の男性及び４人の女性を試験した。両試験のプロトコールはアイオワ州立大学（Iowa State University）ＩＲＢで認可され、そして各対象は試験に参加するためのインフォームドコンセントを提出した。治療の特性により、患者だけでなく研究者らに対しても盲検でなくてもよい。
【００４１】
[00047]（治療） 両試験群の対象に、同じ処置を行った。３種類の治療を無作為な順番で各対象に行い、治療と治療の間には少なくとも１週間の休薬期間を設けた。治療はMetabolic Technologies, Inc.（ＭＴＩ、エームズ、アイオワ）により供給され、食品等級の成分を用いて準備された。１グラムのＣａＨＭＢ又は等価なゲル形態の遊離酸型ＨＭＢを対象に投与した。ＣａＨＭＢカプセルは、市場向けのサプリメント製造業者から入手した（Optimum Nutrition、オーロラ、イリノイ）、ＨＭＢ酸ゲルはＭＴＩ研究所で準備した。簡単に説明すると、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）でＨＭＢ酸のｐＨを４．５に調整し、その後香料及び甘味料を添加した。１．０ｇのＣａＨＭＢカプセルを３５５ｍＬの水（およそ１２オンス）と共に摂取した。遊離酸ゲルの用量は０．８０ｇであり、カプセル中のＣａＨＭＢに含まれる遊離酸と等価であった。遊離酸ゲルによる治療は、嚥下する（ＦＡＳＷ）か、又は舌下で１５秒間保持し、その後嚥下する（ＦＡＳＬ）のいずれかとした。ＦＡＳＷは、３ｍｌのシリンジに入れた全用量を口腔内に排出する工程、嚥下する工程、そしてその後３５５ｍＬの水を飲む工程を含む。ＦＡＳＬ対象には、舌下に全用量を入れ、そしてその用量を１５秒間維持するための説明を行った。彼らはその後、口をすすぎ、そして３３５ｍＬの水を飲んだ。
【００４２】
[00048]（試験１の計画） 試験１の対象は、一晩絶食した翌朝、研究所に出向いた。サプリメント治療のうちの１種を摂取する前に、可撓性の滅菌ポリエチレン製カテーテルを無菌的手技により前腕の静脈に挿入し、摂取前の血液試料を採取した。その後血液試料を、治療を摂取した後、０、２、５、１０、１５、２５、３５、４５、６０、９０、１２０及び１８０分に採取した。血漿を分離し、試料をＨＭＢ濃度の解析用に−７０℃で凍結保存した。加えて、摂取前試料の一部と１８０分での血液試料を、グルコース、尿酸、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、塩素、二酸化炭素、リン酸、タンパク質、アルブミン、グロブリン、アルブミン：グロブリン比、総ビリルビン、直接ビリルビン、アルカリホスファターゼ、乳酸塩脱水素酵素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、鉄結合能（ＴＩＢＣ）、非飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）、鉄、鉄飽和、総コレステロール、トリグリセリド、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、及びコレステロール比の測定に用いた（LabCorp、カンザスシティー、ミズーリ）。治療の前及び治療期間の１８０分後に、完全血球算定（ＣＢＣ）もまた行った。対象らはまた、実験の間に彼らが経験する可能性のある何らかの身体症状（悪心、頭痛などのような）について、簡単なアンケートに答えた。
【００４３】
[00049]（試験２の計画） 試験１に以下のような修正を加えて試験２を行った。試験２では、１４４０分（２４時間）でのＨＭＢの血漿レベルを測定し、また、この期間でのＨＭＢの尿中排泄を測定するために、全尿を回収した。１８０分の血液試料を採取した後、対象は研究所を離れることを許可され、そして血液試料をさらに採取するために、サプリメント摂取後３６０、７２０、及び１４４０分に研究所に戻るように説明された。試験１と同様に、対象はそれぞれ、治療の間に少なくとも１週間の休薬期間をはさんで、それぞれの治療を摂取した。血漿及びＨＭＢの尿での濃度を解析するために、試料はここでも−７０℃で凍結保存した。試験１で既に行ったのと同じ測定を、ここでも摂取前、１８０分後及び１４４０分後の血液試料について試験した。対象は１８０分での血液採取の後に統一した昼食が提供され、摂取後およそ２４０分にこれを食べるように説明を受けた。７２０分の血液採取の後、対象は午後１０時までに通常の夕食を食べるように説明を受けた。対象は翌朝、絶食した１４４０分での血液試料について研究所に報告した。尿回収容器が提供され、対象は実験の２４時間の実験期間の間に排出された全ての尿を回収した。回収されなかった尿は、冷蔵庫で保存した。尿容積を測定し、全尿回収の試料を取って、ＨＭＢについて分析するまで−７０℃で凍結保存した。
【００４４】
[00050]（ＨＭＢ解析） これまでに記載されているように（文献２７）、血漿及び尿ＨＭＢをガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）で分析した。
[00051]（計算及び統計） 基準より上の面積を合計する台形法により（文献５１）、それぞれの対象について、曲線下面積を計算した。試験２では血漿ＨＭＢの半減期を計算した。以下の式を用いた。
【００４５】
ｋ＝（Ｉｎ（Ｃｐｅａｋ−Ｉｎ（Ｃｔｒｏｕｇｈ））／Ｔｉｎｔｅｒｖａｌ
ｔ１／２＝０．６９３／ｋ
[00052]各対象の最高血漿濃度をＣｐｅａｋに用いた。７２０分での血漿濃度が基準と有意な差がなかったため、トラフ濃度、すなわちＣｔｒｏｕｇｈは７２０分で測定した濃度である。ＴｐｅａｋはＣｐｅａｋが測定された時間であり、ＴｉｎｔｅｒｖａｌはＴｐｅａｋからＣｔｒｏｕｇｈ（７２０分）時点までの時間である。細胞外液分画は体重の２０％と仮定し、以下の式３を用いて計算した（文献１）。その後、ＨＭＢの血漿クリアランスを、式４に示したように、細胞外液分画であるＶｄと排泄定数であるＫｅｌとを乗算することにより計算した｛Thalhammer, 1998 9588／同上｝。
【００４６】
Ｖｄ＝体重（０．２０）
クリアランス＝Ｖｄ（Ｋｅｌ）（５０）
[00053]データを、ＳＡＳ中のProc GLMを用いて、クロスオーバー法により解析した（文献４５）。各時点で測定した血漿ＨＭＢについては、反復測定多項式モデルを用いた。このモデルには、対象、順序、並びに必要に応じて、治療の相互作用による治療の主要効果及び時間を含めた。その他の指標についてもまた、対象、順序、治療の主要効果及び治療の主要効果について報告されたｐ値を含むProc GLMを使用した。ｐ＜０．０５の場合に統計的な有意差があると見なし、０．０５＜ｐ＜０．１０の場合に傾向があると見なした。
【００４７】
[00054]結果
[00055]試験結果を図１〜７に示す。図１は、一連の激しい運動を行った後のＣＰＫ及びＬＤＨの血漿レベルを示している。図２は、一連の激しい運動を行った後の筋肉強度及び主観的な痛みを示している。図３は、試験１での血漿ＨＭＢレベルを示している。値は平均±ＳＥＭであり、ｎ＝男性４人と女性４人である。遊離酸での治療対ＣａＨＭＢカプセルについて、＊＝ｐ、０．０５、＋＝ｐ、０．００１、＋ｐ、０．０００１である。図４は、試験１での、ＣａＨＭＢ、ＨＭＢ酸ゲルの嚥下（ＦＡＳＷ）、又はＨＭＢ酸ゲルを舌下で維持し、その後嚥下する（ＦＡＳＬ）のいずれかを単回投与した後の、最高血漿ＨＭＢ濃度と、最高濃度到達時間を示している。＊＊＝ｐ、０．０００２。図５は、試験２の血漿ＨＭＢレベルを示している。値は平均±ＳＥＭであり、ｎ＝男性４人と女性４人である。＊＝ｐ、０．０５、＋＝ｐ、０．０１、＋＋ｐ、０．０００１。図６は、試験２で、ＣａＨＭＢ、ＨＭＢ酸ゲルの嚥下（ＦＡＳＷ）、又はＨＭＢ酸ゲルを舌下で維持し、その後嚥下する（ＦＡＳＬ）のいずれかを単回投与した後の、最高血漿ＨＭＢ濃度と、最高濃度到達時間を示している。＊＊は、濃度についてはｐ＜０．０００２であり、時間についてはｐ＜０．０００１である。図７は、摂取後２４時間で、尿中に排出されたＨＭＢの量の割合と、保持された量の相対的な割合を示している。＊＝ｐ＜０．００２。
【００４８】
[00056]（対象の特徴） 表１は試験１及び２の対象の特徴を示している。各試験で同数の男性及び女性を対象とし、そして３回の治療期間を通じて、各試験群の体重を一定に維持した。全ての対象は、各試験で全３回の試験プロトコールを完了した。治療による、悪心のような治療摂取後の副作用は、いずれの試験でも報告されなかった。
【００４９】
[00057]（試験１の結果：表２〜４） 表２は、最高血漿濃度（Ｃｐｅａｋ）及び最高血漿濃度到達時間（Ｔｐｅａｋ）を説明している。カプセルで摂取したＣａＨＭＢの最高血漿ＨＭＢ濃度は１３１±１０ｎｍｏｌ／ｍＬであったが、遊離酸ゲルのＦＡＳＷ又はＦＡＳＬ送達のいずれかで摂取したＨＭＢの濃度は有意に上昇し（２５９±２４及び２３１±２１ｎｍｏｌ／ｍＬ、それぞれ、ｐ＜０．０００１）かつ、血漿ＨＭＢレベルのピークが、カプセルによるＣａＨＭＢでは１２１．９±１５．６時間であったのと比較して早くなった（３３．１±４．６及び３６．３±１．３分、それぞれ）（ｐ＜０．０００１）。１８０分では、全ての送達方法について血漿ＨＭＢはまだ基準よりも高く、かつ、治療による３群間の差は無かった。３種類の治療後の血漿ＨＭＢ濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）もまた、表２に示す。ゲル形態のＨＭＢの投与による曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＦＡＳＷとＦＡＳＬのそれぞれで、９７％と９１％大きくなった（ｐ＜０．０００１）。ここでは、ＦＡＳＷ又はＦＡＳＬによって送達したＨＭＢ酸ゲルの間に差は無かった。
【００５０】
[00058]表３は、試験１での血液化学を示している。測定したいずれの時点または差について、主効果である治療の違いに有意な差は無かった。表４は、試験１で測定した血液学を示している。測定期間にわたって、ＦＡＳＷ群ではリンパ球の絶対数が非常に大幅に減少した（ｐ＜０．０４）。このことは主に、試験開始時点でＦＡＳＷ群が有していたリンパ球の数がより多い傾向にあったことによる（ｐ＜０．０９）。試験終了時ではリンパ球数に有意差はなく、平均は全て、リンパ球数の正常な限度内にあった。
【００５１】
[00059]（試験２の結果：表２、５〜７） ２４時間の血漿ＨＭＢを観察し、この同じ期間の間の尿中排泄を測定するために、試験２を実施した。試験１と同様に、遊離酸ゲル中に加えたＨＭＢをＦＡＳＷ及びＦＡＳＬの両方で与えた場合、ＣａＨＭＢカプセルよりも、血漿ＨＭＢの迅速な上昇と有意な増加が認められた。１８０分では、全ての治療の血漿ＨＭＢ濃度は同程度であった（およそ１１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）。３６０分と７２０分では、カプセルによるＣａＨＭＢによって維持された血漿ＨＭＢ濃度が僅かに高かった（ｐ＜０．０５）。
【００５２】
[00060]表５には、最高血漿ＨＭＢ濃度（Ｃｐｅａｋ）、最高血漿ＨＭＢ濃度到達時間（Ｔｐｅａｋ）、及び血漿ＨＭＢ半減期を挙げている。カプセルによるＣａＨＭＢの血漿ＨＭＢ濃度は、１３５．０±１７．０分で１３１．２±６．０ｎｍｏｌ／ｍＬのピークに達するが、ＦＡＳＷ及びＦＡＳＬでのＨＭＢの血漿ピークは、より短い時間（ｐ＜０．０００１）でより高くなり（ｐ＜０．０００３）、ＦＡＳＷ及びＦＡＳＬのそれぞれについて、４１．９±５．８分で２３８．６±１６．０ｎｍｏｌ／ｍＬ、また３８．８±２．６分で２４７．６±１９．８ｎｍｏｌ／ｍＬであった。
【００５３】
[00061]表５に示したように、カプセルによるＣａＨＭＢの血漿半減期は３．１７±０．２２時間であった。ＨＭＢのＦＡＳＷとＨＭＢのＦＡＳＬの半減期はそれぞれ、２．５０±０．１３時間と２．５１±０．１４時間であった（ｐ＜０．００４）。試験２で測定した曲線下面積及び尿中ＨＭＢも表５に示す。２４時間にわたって遊離酸ゲルとして投与したＨＭＢのＡＵＣは、ＦＡＳＷとＦＡＳＬのそれぞれで１５．４％と１４．３％であり、カプセル中に入れて投与したＣａＨＭＢよりも有意に大きかった（ｐ＜０．００１）。最高血漿ＨＭＢ及びＡＵＣが有意に上昇したにもかかわらず、ＨＭＢの尿中排泄は遊離酸ゲル治療によって有意に上昇せず、ＨＭＢの尿中排泄では、ＣａＨＭＢ、ＦＡＳＷ及びＦＡＳＬのそれぞれで、１４．７±２．０％、１７．８±２．９％、及び１７．２±２．５％が開始時用量から失われた。ＨＭＢクリアランスは、ＣａＨＭＢ形態と比較して、遊離酸ゲルではおよそ２５％上昇した（Ｐ＜０．００３）。
【００５４】
[00062]試験２の間に測定した血液化学を表６に、試験２で測定した血液学を表７に示す。２４時間内に変化した指標の統計分析では、測定したいずれの化学的又は血液学的な値においても、統計的に有意な変化（ｐ＜０．０５）は見られなかった。塩素では差がある傾向が強く認められた（ｐ＜０．０６）。期間中、ＦＡＳＬはＦＡＳＷと比較して大幅な上昇を示したが、ＦＡＳＷもＦＡＳＬもＣａＨＭＢに対しては有意な差を示さなかった。ナトリウムでも一定の傾向が見られ、測定期間中、ＦＡＳＷはＦＡＳＷ又はＣａＨＭＢと比較して大幅な上昇を示した（ｐ＜０．０７）。塩素及びナトリウムの期間中の平均値は正常な値の範囲内であった。
【００５５】
[00063]考察
[00064]本試験から、遊離酸ゲル形態のＨＭＢの経口又は舌下投与が、硬ゼラチンカプセル中に入れカルシウム塩として投与したＨＭＢ（ＣａＨＭＢ）と比較して、血漿ＨＭＢのより迅速な上昇と上昇の維持をもたらすことは明かである。ＨＭＢの遊離酸ゲルの投与は、血漿中ＨＭＢの半減期又は尿中排泄の大きな変化を伴うことなく、血漿ＨＭＢのＡＵＣを有意に上昇させた（平均＋１４．８％）。合わせてこれは、ＨＭＢのクリアランス及び組織による利用を有意に上昇させ、組織による利用はＣａＨＭＢ形態の利用よりも２５％高かった。このデータは、ＨＭＢをこの形態で送達することによる効果の向上を示している。
【００５６】
[00065]この試験からの発見はＣａＨＭＢ送達の血漿動力学に関連しており、Ｖｕｋｏｖｉｃｈら（文献５２）によってこれまでに報告されているものと一致する。ＣａＨＭＢの送達方法に大きな違いがあるにも関わらず（Ｖｕｋｏｖｉｃｈらは２５０ｍｇのカプセル４錠を用いたのに対し、本試験では１グラムのカプセルを用いた）、最高血漿濃度、最高濃度到達時間及び血漿半減期に関するデータは一致している。興味深いことにゲル形態にした遊離酸としてのＨＭＢの送達では、血漿濃度がＣａＨＭＢの経口投与のおよそ２倍に達したにもかかわらず、最高濃度到達時間が短縮されたが（遊離酸形態の利用ではほぼ９０分短縮された）、半減期は同様であった。複数の研究により、運動中の栄養補助食品としてのＨＭＢの利用が支持されてきた。ＨＭＢが筋タンパク及び膜の分解を低減させることが示され（文献２２；文献２３；文献２６）、並びにタンパク質合成を増強させることが示されてきた（文献１０）。そのため、運動中の血漿ＨＭＢ濃度を高くすること及びこれまでの報告（文献２６；文献２９；文献５２）と同程度又はそれ以上にＨＭＢを保持することが有用であると考えられる。この点で、ＣａＨＭＢの経口投与は、非常に負荷の強い任意の一連の運動を行う少なくとも２時間前に投与する必要があるが、ＨＭＢ遊離酸ゲルは運動を行う前に投与してもよく、ほぼ即効性である。
【００５７】
[00066]遊離酸形態のＨＭＢの送達はまた、ＨＭＢの有意に高い保持にも関連した。遊離酸ゲル形態を投与するとＡＵＣが有意に増大したが、尿中排泄は有意に増加せず、このことはＣａＨＭＢ形態と比較して、ＨＭＢの保持及び組織による利用がより多くなったことを示していると考えられる。血漿クリアランスを基にした、保持されたＨＭＢの量は、ＨＭＢ酸ゲルではＣａＨＭＢと比較して２５％高かった。Ｖｕｋｏｖｉｃｈらによるこれまでの試験では、３グラムのＣａＨＭＢの経口送達によって生じる最高血漿濃度は、１グラム用量で達成されるものよりも３倍高いことが分かった（５２）。Ｎｉｓｓｅｎらは、１日当たり１．５グラム又は３グラムいずれかのＣａＨＭＢを、１日２回、経口投与した場合の用量依存反応を示した。彼らは、ＣａＨＭＢの最適用量は３．０グラムであり、筋肉損傷の指示物質であるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）とタンパク質分解の指示物質である３−メチルヒスチンの放出を減少させることを示した（文献２６）。同様の発見は、１日当たり６グラムの投与が１日当たり３グラムよりもより有益であることをも示したＧａｌｌａｇｈｅｒによって報告された（文献１４）。総合すると上記試験は、筋肉に有用なＨＭＢを運動中により多く摂取することの有効性を示している。
【００５８】
[00067]遊離酸ゲルによるＨＭＢの送達は、カプセルに入れたＣａＨＭＢの投与と比較して、ＨＭＢの血中濃度ピークをより早く、かつ、より高くし、そして濃度を同程度に維持する。この形態の送達は、ＣａＨＭＢの経口投与について現在及びこれまでに分かっているもの（文献１５；文献２５）と同程度に安全である。
【００５９】
【表１】
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【００６４】
【表６】
【００６５】
【表７】
【００６６】
実施例２
[00068]この実施例では、一連の激しい運動を行った後の筋肉損傷におよぼすＨＭＢ酸ゲルの投与の効果を、カルシウムＨＭＢの効果と比較した。実施例１に示したように、ＨＭＢ遊離酸を投与すると、ＣａＨＭＢと比較して、ＨＭＢの最高血漿濃度とＨＭＢのクリアランス率が上昇した（文献１３）。この実施例は、一連の激しい運動の前後に遊離酸ゲルとして投与したＨＭＢのより迅速な反応が、ＨＭＢをカルシウムＨＭＢ塩として投与するよりも、筋肉損傷に対してより保護的であること示している。
【００６７】
[00069]ＨＭＢ及び運動が、筋肉損傷マーカー及び炎症性因子に及ぼす効果。負荷をかけて行う運動又は最大限の運動のような激しい運動は、筋肉細胞からのクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の漏出を増加させる（文献２１；文献３１）。ヒトでの試験から、血漿ＣＰＫの上昇によって測定した運動後の筋肉損傷が、カルシウムＨＭＢの補給によって低下することが分かってきた（文献１４；文献２２；文献２６；文献３３）。登り坂と下り坂を含む大学のクロスカントリーのコースを継続して２０ｋｍ走った後の筋肉損傷についての試験から、持続したカルシウムＨＭＢの投与が血漿ＣＰＫの上昇の抑制に、走行後４日間にわたって有効であることもまた分かった（文献２３）。Ｎｉｓｓｅｎらは（文献２６）、ＣＰＫの減少におけるカルシウムＨＭＢの量的効果（１日当たり３．０グラムが１日当たり１．５グラムよりも有効である）と、その結果の尿中３−メチルヒスチジン（３−ＭＨ）の有意な減少を示し、ここで、３−メチルヒスチジンは、よく確立された筋原繊維のタンパク質分解の指示物質である（文献３９）。Ｇａｌｌａｇｈｅｒらは、負荷をかけて行う運動を行っている大学生の男性３７人に、１日当たり３．０（体重１ｋｇ当たり３８ｍｇ）及び６．０グラム（体重１ｋｇ当たり７６ｍｇ）のカルシウムＨＭＢに相当するＨＭＢを補給した。両用量とも、除脂肪体重及び強度増加に同様の効果を示したが、より高い用量の方がＣＰＫの漏出を最小限に抑える点で有意な改善をもたらし、このことは、運動後の筋肉損傷の有意な回復を示唆している。これらの観察は、より高い血漿ＨＭＢ濃度が運動後の筋肉損傷に対してより保護的である可能性を示している。
【００６８】
[00070]実施例１で示したように、遊離酸としてのＨＭＢ（ゲルに加えた）はカルシウムＨＭＢより早く吸収され、その結果ＨＭＢの血漿濃度が上昇し、そして筋肉よってより早く利用される。
【００６９】
（方法）
[00071]対象： アイオワ州立大学ヘルスアンドヒューマンパフォーマンス研究室（Iowa State University Health and Human Performance Laboratory）で試験を実施した。この試験はアイオワ州立大学の施設内治験審査委員会（Iowa State University Institutional Review Board）で認可され、ClinicalTrials.gov（NCTOl 150526）に登録された。アイオワ州立大学の共同体と周辺地域から、年齢が２０才から３６才の間の、１２人の男性と１３人の女性に試験に参加してもらった。
【００７０】
[00072]（治療） 実験計画を図８に示す。５種類の治療を以下のように投与した。
・治療１： 偽薬。この群は、各回の投与で偽薬カプセルと偽薬のシリンジ投与を受けた。
・治療２： ＣａＨＭＢ、運動前。この群は、一連の激しい運動の３０分前に、ＣａＨＭＢカプセルと偽薬のシリンジ投与を受けた。試験期間中の残りの投与では、偽薬カプセル１錠と、偽薬のシリンジ投与１回を受けた。
・治療３： ＨＭＢ酸ゲル、運動前。この群は、一連の激しい運動の３０分前に、偽薬カプセルとＨＭＢ酸ゲルのシリンジ投与を受けた。試験期間中の残りの投与では、偽薬カプセル１錠と、偽薬のシリンジ投与１回を受けた。
・治療４： ＣａＨＭＢ、運動前後。この群は、試験期間中の全ての投与時間に、ＣａＨＭＢカプセルと偽薬のシリンジ投与を受けた。
・治療５： ＨＭＢ酸ゲル、運動前後。この群は、試験期間中の全ての投与時間に、ＨＭＢ酸ゲルのシリンジ投与と偽薬カプセル１錠を受けた。
【００７１】
[00073]研究者と対象の両方に対して治療を隠すために、対象は各投与でカプセルとシリンジ投与を受けた。カプセルには１グラムの乳酸カルシウム（偽薬）又は１グラムのβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸カルシウム（ＣａＨＭＢ）のいずれかが含まれていた。シリンジ投与は、味及び外観が同じようになるように処方され、かつ、０．８グラムのコーンシロップ（偽薬）又は０．８グラムのβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸遊離酸、すなわちカプセルの用量と同量のＨＭＢになる、のいずれかを含んだ。３種類の１日用量は、合計して同量のＨＭＢ用量を提供した（カプセルに入れた、カルシウムＨＭＢとして２．４ｇ又はシリンジに入れたＨＭＢ遊離酸として２．４ｇ）。
【００７２】
[00074]（一連の激しい運動） 対象は、研究所に来所する前の３日間は、激しい運動を自制した。全ての対象について、一晩絶食した後に試験した。対象から絶食時血液試料を採取し、その時点で尿を回収した。その後、対象は彼らに割り当てられたサプリメントを消費し、３０分後に一連の激しい運動を行った。この運動は、バイオデックスのレバーアームが、膝関節を完全に伸展した状態から９０℃曲がるように動かすのに抵抗する、膝伸筋の５０最大効果収縮からなる。これは、着席した状態で、重い物をゆっくりと下に移動させる運動と類似している。各収縮を約２秒間維持し、そして収縮と収縮の間は１２秒間とした。このプロトコールを右脚について行い、その後左脚について行った。対象は１日あたり、さらに２回の治療の投与を受け（偽薬又はＨＭＢ）、これを昼食及び夕食の時に摂取するように説明された。続く４日間、対象は絶食した状態で毎朝に研究所に出向き、血液採取と尿の回収を行い、その後、朝用の彼らのサプリメントを摂取した。対象はここでも、１日当たり２回分の残りのサプリメントを受け取り、それらを昼食と夕食で摂取するように説明を受けた。
【００７３】
[00075]（血清及び尿試料） 対象が試験のために研究所に出向いた時に毎朝、絶食時血液試料を浅前腕静脈から採取した。加えてこの時点で、中間尿試料を回収した。血清ＣＰＫを民間の試験所で解析した（Quest Diagnostics、マディソン、ニュージャージー）。尿中の３−メチルヒスチジン（３ＭＨ）は、既に出版されているＧＣ／ＭＳ方法（９）により分析した。尿クレアチニンは、比色試験により分析した（Cayman Chemical Company、アナーバー、ミシガン）。尿中３ＭＨのデータを、尿中クレアチニンに対して正規化し、３ＭＨ：クレアチニン比（μｍｏｌ：ｍｇ）として表した。
【００７４】
[00076]（統計） データを、ウィンドウズ用のStatistical Analysis System（リリース版９．１．３、SAS Institute、ケアリー、ノースカロライナ）に含まれている混合モデル法を用いて解析した。それぞれの変数の変化を、各測定時について解析した。モデルには、基線すなわち０値を共変数として含め、そして性別及び治療を主効果として含めた。解析の前に、ＣＰＫのデータをＳＡＳ中のランク法を用いて変換した。運動の前後にＨＭＢ酸ゲルを摂取した場合の平均を、その他の治療の平均と比較するために、コントラストを用いた。
【００７５】
[00077]（結果） 対象の人口統計学を表８に示す。治療ごとの、対象の年齢、身長及び体重はほぼ同じであった。
【００７６】
【表８】
【００７７】
[00078]治療は以下のとおりである。
（治療１）： 偽薬カプセル及び偽薬のシリンジ投与
（治療２）： 運動前にカルシウムＨＭＢカプセルと偽薬のシリンジ投与、及び運動後に偽薬カプセルと偽薬のシリンジ投与
（治療３）： 運動前に偽薬カプセルとＨＭＢ酸ゲルのシリンジ投与及び運動後に偽薬カプセルと偽薬のシリンジ投与
（治療４）： 運動前後にカルシウムＨＭＢカプセルと偽薬のシリンジ投与
（治療５）： 運動前後に偽薬カプセルとＨＭＢ酸ゲルのシリンジ投与
治療を１日３回、朝の試験の３０分前、その後、およそ正午と午後６時に投与した。
【００７８】
[00079]血清ＣＰＫ及び尿中３ＭＨ
尿中クレアチニン比を表９に示す。基準値（０時間）と差は無かった。激しい運動によって血清ＣＰＫが４倍まで上昇したことは筋肉膜の損傷を示している。しかしながら、運動前と運動後の両方でＨＭＢ酸ゲルを投与すると（治療５）、この上昇は、運動後２４時間では６４％（Ｐ＜０．０３）、そして運動後４８時間では８６％（Ｐ＜０．００５）抑えられた。７２時間まで継続すると、ＨＭＢ酸ゲル治療を行ってもＣＰＫの上昇はほとんど認められなかった。図９は、この試験の時間経過に伴うＣＰＫ値の上昇と減少を示している。表２でもまた、筋肉でのタンパク質分解の指標である、３ＭＨ：クレアチニン比に及ぼす治療の効果を示している。これらのデータは傾向を表しているだけではあるが、運動前後にＨＭＢ酸ゲルで治療すると、タンパク質分解が上昇せずに減少さえすることを示している。これは、タンパク質分解の減少が、筋内でのより適したタンパク質代謝及びタンパク質沈着をもたらしていることを示していると考えられる。
【００７９】
【表９】
【００８０】
（考察）
[00080]実施例１での観察に基づき、ＨＭＢ遊離酸を投与した場合、筋肉組織はかなり高い濃度の血清ＨＭＢに曝された。加えて実施例１では、ＨＭＢ酸を投与した場合には、ＣａＨＭＢ投与と比較して、ＨＭＢの血清から筋肉及び組織へのクリアランスがかなり上昇したことが分かった。従って実施例２からは、筋肉による遊離酸形態のＨＭＢのこの利用の増加が、カルシウム形態のＨＭＢを投与した場合よりも、一連の激しい運動を行った後の筋肉組織に対してより保護的であることが分かった。
【００８１】
[00081]前述した詳細及び図面は、本発明の実例となる実施形態を含む。前述した実施形態及び本明細書に記載した方法は、当業者の能力、経験、及び資質によって異なってもよい。この方法を特定の順番で単に列挙することは、この方法の工程の順番にいかなる制限も構成しない。前述した説明及び図面は単に本発明を解説し、かつ、説明するものであり、本発明はそれらによって制限されない。この明細書に対面している当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、これに修正や変更を加えることができるだろう。本発明組成物の投与は、当業者によって認識される所望の効果を達成するのに十分な量で行われるだろう。
【００８２】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の投与方法であって、該組成物の効果が等量のＨＭＢ組成物のカルシウム塩を投与するよりも上昇するように、ＨＭＢ酸約０．５グラム〜ＨＭＢ酸約３０グラムを含む組成物を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項２】
該組成物の投与によって生じる高い効果が、窒素保持の向上、タンパク質節約の向上、除脂肪体重の増加、筋肉機能の向上、筋肉性能の向上、ストレスに曝された筋肉での筋肉損傷の低減、傷つけられた筋肉での筋肉損傷の低減、ヒトの免疫反応の向上、疾患に関連する衰弱の減少、ヒトの脂質プロファイルの向上、及びヒトの心の状態の改善から成る群より選択される、請求項１に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項３】
該ＨＭＢ酸をゲルとして投与する、請求項１に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項４】
該ＨＭＢ酸を舌下に投与する、請求項１に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項５】
該ＨＭＢ酸を嚥下する、請求項１に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項６】
該ＨＭＢ酸を２４時間当たり１回投与する、請求項１に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項７】
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の投与方法であって、ＨＭＢの効果が等量のＨＭＢ組成物のカルシウム塩を投与するよりも少なくとも１０％上昇するように、ＨＭＢ酸約０．５グラム〜ＨＭＢ酸約３０グラムを含む組成物を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項８】
該組成物の投与によってもたらされる効果の向上が、窒素保持の向上、タンパク質節約の向上、除脂肪体重の増加、筋肉機能の向上、筋肉性能の向上、ストレスに曝された筋肉での筋肉損傷の低減、傷つけられた筋肉での筋肉損傷の低減、ヒトの免疫反応の向上、疾患に関連する衰弱の減少、ヒトの脂質プロファイルの向上、及びヒトの心の状態の改善から成る群より選択される、請求項７に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項９】
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の投与方法であって、ＨＭＢの血漿濃度が等量のＨＭＢ組成物のカルシウム塩を投与するよりも大幅に上昇するように、ＨＭＢ酸約０．５グラム〜ＨＭＢ酸約３０グラムを含む組成物を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項１０】
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の投与方法であって、ＨＭＢの最大血漿濃度到達時間が、等量のＨＭＢ組成物のカルシウム塩を投与するよりも短縮されるように、ＨＭＢ酸約０．５グラム〜ＨＭＢ酸約３０グラムを含む組成物を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項１１】
ＨＭＢ酸を投与することによりβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の効果を向上させる工程を含む、β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸の投与方法。
【請求項１２】
ＨＭＢ酸の投与によってもたらされるＨＭＢの効果の向上が、窒素保持の向上、タンパク質節約の向上、除脂肪体重の増加、筋肉機能の向上、筋肉性能の向上、ストレスに曝された筋肉での筋肉損傷の低減、傷つけられた筋肉での筋肉損傷の低減、ヒトの免疫反応の向上、疾患に関連する衰弱の減少、ヒトの脂質プロファイルの向上、及びヒトの心の状態の改善から成る群より選択される、請求項１１に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項１３】
ＨＭＢ酸の投与によってもたらされるＨＭＢの効果の向上が、ＨＭＢの血漿濃度の大幅な上昇及びＨＭＢの最大血漿濃度到達時間の短縮から成る群より選択される、請求項１１記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項１４】
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の投与方法であって、該組成物の効果が等量のＨＭＢ組成物のカルシウム塩を投与するよりも向上するように、ＨＭＢ酸を基準として、体重１キログラムにつき２４時間当たりの量が、０．０１〜０．０２グラムの範囲のＨＭＢを含む組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項１５】
組織によるβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の利用を向上させる方法であって、組織によるＨＭＢの利用が向上し、その結果等量のカルシウム塩ＨＭＢ組成物を投与するよりも代謝効果の改善が生じるように、ＨＭＢ酸約０．５グラム〜ＨＭＢ酸約３０グラムを含む組成物を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項１】
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の投与方法であって、該組成物の効果が等量のＨＭＢ組成物のカルシウム塩を投与するよりも上昇するように、ＨＭＢ酸約０．５グラム〜ＨＭＢ酸約３０グラムを含む組成物を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項２】
該組成物の投与によって生じる高い効果が、窒素保持の向上、タンパク質節約の向上、除脂肪体重の増加、筋肉機能の向上、筋肉性能の向上、ストレスに曝された筋肉での筋肉損傷の低減、傷つけられた筋肉での筋肉損傷の低減、ヒトの免疫反応の向上、疾患に関連する衰弱の減少、ヒトの脂質プロファイルの向上、及びヒトの心の状態の改善から成る群より選択される、請求項１に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項３】
該ＨＭＢ酸をゲルとして投与する、請求項１に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項４】
該ＨＭＢ酸を舌下に投与する、請求項１に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項５】
該ＨＭＢ酸を嚥下する、請求項１に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項６】
該ＨＭＢ酸を２４時間当たり１回投与する、請求項１に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項７】
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の投与方法であって、ＨＭＢの効果が等量のＨＭＢ組成物のカルシウム塩を投与するよりも少なくとも１０％上昇するように、ＨＭＢ酸約０．５グラム〜ＨＭＢ酸約３０グラムを含む組成物を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項８】
該組成物の投与によってもたらされる効果の向上が、窒素保持の向上、タンパク質節約の向上、除脂肪体重の増加、筋肉機能の向上、筋肉性能の向上、ストレスに曝された筋肉での筋肉損傷の低減、傷つけられた筋肉での筋肉損傷の低減、ヒトの免疫反応の向上、疾患に関連する衰弱の減少、ヒトの脂質プロファイルの向上、及びヒトの心の状態の改善から成る群より選択される、請求項７に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項９】
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の投与方法であって、ＨＭＢの血漿濃度が等量のＨＭＢ組成物のカルシウム塩を投与するよりも大幅に上昇するように、ＨＭＢ酸約０．５グラム〜ＨＭＢ酸約３０グラムを含む組成物を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項１０】
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の投与方法であって、ＨＭＢの最大血漿濃度到達時間が、等量のＨＭＢ組成物のカルシウム塩を投与するよりも短縮されるように、ＨＭＢ酸約０．５グラム〜ＨＭＢ酸約３０グラムを含む組成物を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項１１】
ＨＭＢ酸を投与することによりβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の効果を向上させる工程を含む、β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸の投与方法。
【請求項１２】
ＨＭＢ酸の投与によってもたらされるＨＭＢの効果の向上が、窒素保持の向上、タンパク質節約の向上、除脂肪体重の増加、筋肉機能の向上、筋肉性能の向上、ストレスに曝された筋肉での筋肉損傷の低減、傷つけられた筋肉での筋肉損傷の低減、ヒトの免疫反応の向上、疾患に関連する衰弱の減少、ヒトの脂質プロファイルの向上、及びヒトの心の状態の改善から成る群より選択される、請求項１１に記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項１３】
ＨＭＢ酸の投与によってもたらされるＨＭＢの効果の向上が、ＨＭＢの血漿濃度の大幅な上昇及びＨＭＢの最大血漿濃度到達時間の短縮から成る群より選択される、請求項１１記載のＨＭＢの投与方法。
【請求項１４】
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の投与方法であって、該組成物の効果が等量のＨＭＢ組成物のカルシウム塩を投与するよりも向上するように、ＨＭＢ酸を基準として、体重１キログラムにつき２４時間当たりの量が、０．０１〜０．０２グラムの範囲のＨＭＢを含む組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項１５】
組織によるβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）の利用を向上させる方法であって、組織によるＨＭＢの利用が向上し、その結果等量のカルシウム塩ＨＭＢ組成物を投与するよりも代謝効果の改善が生じるように、ＨＭＢ酸約０．５グラム〜ＨＭＢ酸約３０グラムを含む組成物を投与する工程を含む、上記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５１５００９（Ｐ２０１３−５１５００９Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４４９４８（Ｐ２０１２−５４４９４８）
【出願日】平成２２年１２月２０日（２０１０．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６１３６７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７５７４１
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５１２１５７９６６）メタボリック・テクノロジーズ，インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２０日（２０１０．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６１３６７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７５７４１
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５１２１５７９６６）メタボリック・テクノロジーズ，インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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