β−１，３−１，６−グルカンの定量方法
【課題】本発明は、完全に精製した酵素を用いる必要がなく、且つβ−１，３−１，６−グルカンを正確に定量できる方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該方法に用いることができるキットと、当該方法に対して有用な微生物を提供することも目的とする。
【解決手段】本発明に係るβ−１，３−１，６−グルカンの定量方法は、多糖類含有試料に特定のＭｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液および特定のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液を作用させる工程；および、生じたグルコースの量を測定する工程；を含むことを特徴とする。
【解決手段】本発明に係るβ−１，３−１，６−グルカンの定量方法は、多糖類含有試料に特定のＭｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液および特定のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液を作用させる工程；および、生じたグルコースの量を測定する工程；を含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−１，３−１，６−グルカンを定量する方法、当該方法に用いることができるβ−１，３−１，６−グルカンの定量用キット、および当該方法に有用な菌体外酵素を産生する微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、グリコーゲンやデンプンなどエネルギーとなる貯蔵多糖のほか、構造多糖を産生する。構造多糖とは、細胞の表面を保護する細胞膜や細胞壁の構成成分である多糖であり、グルカン、マンナン、糖タンパク質、キチンなど様々な種類が確認されている。
【０００３】
近年、かかる構造多糖の中でも、担子菌類の産生するものが優れた生理活性を有することから注目を集めている。
【０００４】
担子菌類とは、担子胞子を生ずる高等菌類であり、松茸や舞茸、アガリクスと呼ばれる姫松茸などがある。この担子菌類が産生する構造多糖は、食物繊維としての効果のほか、抗腫瘍作用、抗菌作用、血糖・血清コレステロール降下作用などを示し、糖尿病などの生活習慣病やがんなどの予防に有効であるとの研究成果も報告されている。
【０００５】
担子菌類が産生する構造多糖の中でも、β−１，３−グルコシド結合を主鎖に有しβ−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するβ−１，３−１，６−グルカンは、とりわけ特徴的な生理活性を示す（非特許文献１）。
【０００６】
しかし、構造多糖は優れた生理活性を有するものの、細胞壁などの中に存在するためにその抽出は非常に困難である。その上、たとえ抽出したとしてもその抽出物は水に対して不溶性または難溶性を示し、特有の色や不快臭を有し、品質が不安定であり非常に高価であるなどの問題を有する。
【０００７】
それに対して、黒酵母といわれるＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ種菌の中からは、ある条件下でβ−１，３−１，６−グルカンを菌体外へ放出するものが見出されている。しかも、β−１，３−１，６−グルカンを含む当該菌の培養液は、無味無臭で品質が安定しており、安価に製造できる。よって、当該菌から得られるβ−１，３−１，６−グルカンを機能性食品などとして利用する道が開かれつつある。
【０００８】
しかし、β−１，３−１，６−グルカンを含む培養液などを食品の原料として利用する場合には、その含量を測定するなどして品質を評価する必要があるものの、正確な定量方法は未だ存在しない。
【０００９】
例えば、財団法人日本食品分析センターが行っているβ−グルカンの定量方法は、アミラーゼやアミログルコシダーゼなどによる酵素処理の後、硫酸で全てのグルコシド結合を非特異的に加水分解し、生じたグルコースを定量するものである。しかしこの方法では、β−１，３−１，６−グルカンとそれ以外のβ−グルカンを区別することができない。さらに、グルコース以外の単糖を含むヘテログルカンなどに由来するグルコースまで分解され、測定されてしまう。従って当該方法は、β−１，３−１，６−グルカンの定量方法としては不適である。
【００１０】
そのほか、一般的に使用されているβ−グルカンの定量キットは、連続したβ−１，３−グルコシド結合を認識して結合するタンパク質因子を利用するものであるため、試料中に含まれるβ−１，３−グルカンにおける側鎖の割合が多いほど、測定値の誤差は大きくなる。
【００１１】
ところで、非特許文献２〜４のとおり、本発明者らが属する研究室では、土壌から単離したＣｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属微生物由来のβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼが、それぞれβ−１，３−グルコシド結合とβ−１，６−グルコシド結合に対して高い反応性を有することを見出している。よって、これら酵素を利用して試料中のβ−１，３−１，６−グルカン含量を正確に測定できると考えられる。
【非特許文献１】宮崎利夫，「多糖の構造と生理活性」朝倉書店（１９９０年）
【非特許文献２】野田洋彦，「高知大学大学院農学研究科農芸化学専攻醗酵及び醸造学研究室修士論文」（１９９４年）
【非特許文献３】中嶋英夫，「高知大学大学院農学研究科農芸化学専攻醗酵及び醸造学研究室修士論文」（１９９３年）
【非特許文献４】池上裕倫，「高知大学大学院農学研究科生物資源科学専攻応用微生物学研究室修士論文」（２００４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述した様に、本発明者らが属する研究室では、反応性の高いβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼを産生するＣｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属微生物を見出しており、これら酵素を利用して試料中のβ−１，３−１，６−グルカン含量を正確に測定することが考えられる。
【００１３】
しかし、酵素を完全に精製するには、各種クロマトグラフィを繰り返す必要があるなど手間やコストがかかるため、精製酵素を用いる定量方法は、工業的な実施のためには実用的であるとは到底いい難い。よって、菌体外に放出された酵素を完全に精製することなく定量に用いることが考えられる。ところが、上記Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属微生物は非常に強いα−グルコシダーゼ活性を有するため、粗精製酵素中にはα−グルコシダーゼが混入するので、試料中にα−グルカンが存在しているとグルコースまで分解されてしまい、β−１，３−１，６−グルカン含量を正確に測定できなくなる。そのため、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属微生物由来の粗精製酵素を用いて試料中のβ−１，３−１，６−グルカンを定量するには、先ずα−グルコシダーゼなどによりα−グルカンを分解して除去してから、粗精製されたβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼでβ−グルカンを分解し、生じたグルコースを定量する必要がある。このような方法では、時間や手間がかかり非効率的である。
【００１４】
そこで本発明では、完全に精製した酵素を用いる必要がなく、且つβ−１，３−１，６−グルカンを正確かつ効率的に定量できる方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該方法に用いることができるキットと、当該方法に対して有用な微生物を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねたところ、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌と、β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液を用いれば、試料中におけるα−グルカン、他のβ−グルカンおよびヘテログルカンの存在にかかわらず、β−１，３−１，６−グルカンを正確かつ効率的に定量できることを実証して、本発明を完成した。
【００１６】
本発明に係るβ−１，３−１，６−グルカンの定量方法は、多糖類含有試料に、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液、並びに、β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液を作用させる工程；並びに、生じたグルコースの量を測定する工程；を含むことを特徴とする。
【００１７】
上記本発明方法においては、上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌としてＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ Ｈ１株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６２９）が好適であり、また、上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌としてＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６１６）が好適である。上記菌株の優れた効果は、実験により実証されている。
【００１８】
上記本発明方法においては、多糖類含有試料に、２０℃以上、４５℃以下で、上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液と上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液とを同時に作用させることが好ましい。上記２種の菌体外酵素液は同時に多糖類含有試料へ作用させることが効率の面から好ましいが、それぞれの酵素液に含まれるβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼの至適温度は異なる。しかし２０℃以上、４５℃以下の温度範囲であれば、両酵素は良好にその作用効果を発揮することができ、多糖類含有試料に含まれるβ−１，３−１，６−グルカンを効率的に分解することが可能になる。
【００１９】
本発明に係るβ−１，３−１，６−グルカンの定量用キットは、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液またはその乾燥物；β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液またはその乾燥物；並びにグルコース量測定用試薬；を含むことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明は、Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ Ｈ１株（ＮＩＴＥ ＡＰ− ６２９）およびＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６１６）に関する。
【発明の効果】
【００２１】
従来、α−グルカンを含む多糖類含有試料中のβ−１，３−１，６−グルカンを正確に測定するには、先ずアミログルコシダーゼなどでα−グルカンを分解し除去してからβ−グルカン量を測定しなければならず、手間や時間がかかるものであった。また、従来方法では、他のβ−グルカンを含む試料中のβ−１，３−１，６−グルカンを正確に測定することは困難であった。しかし本発明方法によれば、完全に精製された酵素を用いなくとも、α−グルカンを事前に分解する必要も無く、β−１，３−１，６−グルカンを正確かつ効率的に定量することができる。また、本発明に係る定量用キットは、同様の効果を有する。さらに本発明に係る２種の菌株は、これら本発明に係る定量方法と定量用キットにとり非常に好適なものである。よって本発明は、その優れた生理活性が注目されているβ−１，３−１，６−グルカンを含む試料の品質を評価する指標になり得るものとして、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明に係るβ−１，３−１，６−グルカンの定量方法は、多糖類含有試料に、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液、並びに、β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液を作用させる工程；および、生じたグルコースの量を測定する工程；を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明方法の測定対象である多糖類含有試料は、β−１，３−１，６−グルカンを含有するか或いは含有すると考えられるものであって、その含有量を測定すべきものであれば特にその種類などは制限されない。例えば、酵母の集菌体、培地、それらの乾燥物、抽出物、精製品、懸濁液、溶液；担子菌類自体や海藻類自体、それらの乾燥物、抽出物、粉砕物、生成物、懸濁液、溶液などを挙げることができる。
【００２４】
本発明方法では、多糖類含有試料に、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液、並びに、β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液を作用させる。これら菌体外酵素液は、各β−グルカナーゼ活性を示す一方で、α−グルカンや他のβ−グルカンを分解しない。よって、これら菌体外酵素液を用いれば、酵素を精製しなくとも、多糖類含有試料中のβ−１，３−１，６−グルカンを特異的にグルコースまで分解することができる。
【００２５】
なお、上記菌は、α−グルコシダーゼや、β−１，３−グルカナーゼおよびβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼを全く産生しないものに限定されず、β−１，３−１，６−グルカンの正確な定量を阻害しない程度のこれら酵素活性を菌体外へ放出するものや、β−１，３−１，６−グルカナーゼから容易に分離除去できる程度のこれら酵素を産生して菌体外へ放出するものも含まれるものとする。具体的には、比活性が０．０５ｕｎｉｔ／ｍｇ以下のα−グルコシダーゼ、またはβ−１，３−グルカナーゼおよびβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼをその菌体外酵素液に放出する菌も含まれるものとする。但し、上記菌としては、これら酵素活性を実質的に示さないものが好適である。ここでいう実質的とは、菌体外酵素液におけるこれら酵素の活性が、下記実施例に記載の測定方法において、検出限界以下であることをいう。
【００２６】
当該菌体外酵素液としては、上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌および上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌の液体培養液から得た酵素液であって、グルコースやα−グルコシダーゼ、β−１，３−グルカナーゼおよびβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼなどβ−１，３−１，６−グルカンの正確な定量を阻害する成分を含まないものをいう。即ち、上記菌の液体培養液に硫酸アンモニウムを加えて沈殿したタンパク質成分を分離したり、透析などにより、グルコースなどの低分子物質を除去することができる。また、上記菌の菌体外酵素液でもα−グルコシダーゼ活性等を示すことがあるが、その活性は極めて弱いので、硫酸アンモニウムの濃度を調整することにより、α−グルコシダーゼ等は容易に除去可能である。
【００２７】
菌体外酵素液は、具体的には例えば以下のように調製することができる。先ず、上記菌を培養した液体培養液を遠心分離や濾過に付すことによって、菌体などの固体成分を除去する。得られた液体には、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオリド）などのプロテアーゼ阻害剤を加えることが好ましい。次に、タンパク質成分を常法により分離する。例えば、得られた液体をある程度濃縮した上で緩衝液を加えた後、冷却しながら硫酸アンモニウムを加えることにより沈殿したタンパク質成分を分離すればよい。この際、予備実験などにより、β−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼが十分に沈殿し且つα−グルコシダーゼ等が沈殿しない硫酸アンモニウム濃度を事前に決定しておくと効率的である。得られたタンパク質成分からは、さらに透析などの簡便な方法により、所望のβ−グルカナーゼをある程度精製してもよい。但し、本発明で用いるＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌とＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌は菌体外にα−グルコシダーゼ等を放出しないか或いはその放出量は極めて少ないので、クロマトグラフィなど工業的に適さない方法により酵素を精製する必要はない。
【００２８】
上記菌体外酵素液は、保存などのためにいったん乾燥し、使用時に溶液としてもよい。但し、上記β−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼは、それぞれ７０℃と５０℃で失活する。よって、酵素液の濃縮や乾燥時においては、それぞれ温度を７０℃、５０℃以上に上げないことが好ましい。
【００２９】
本発明においては、多糖類含有試料に上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌由来の菌体外酵素液と上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌由来の菌体外酵素液を作用させるが、これら酵素液は同時に作用させてもよいし、逐次的に作用させてもよい。効率を考慮すれば、同時に作用させることが好ましい。
【００３０】
上記菌体外酵素液におけるβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼの濃度は、反応混合液における多糖類の濃度などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、反応混合液中に含まれる各β−グルカナーゼの活性として、β−１,３−１，６−グルカンであるラミナリンを基質に用いた場合で１．０ｕｎｉｔ/ｍｌ以上、５．０ｕｎｉｔ/ｍｌ以下程度、β−１，６−グルカンであるパスツランを基質に用いた場合で０．１ｕｎｉｔ/ｍｌ以上、３．０ｕｎｉｔ/ｍｌ以下程度とすることが好ましい。なお、本発明におけるｕｎｉｔとは、３０℃で１時間に１μｍｏｌの還元糖を精製する酵素量の単位と定義する。
【００３１】
上記菌体外酵素液のｐＨも適宜調整すればよいが、本発明者らによる実験ではｐＨ６．０で良好な結果が得られているので、溶媒としてはｐＨ５．０以上、７．５以下程度の緩衝液が好適である。
【００３２】
上記酵素反応における反応温度も適宜調整すればよい。例えば、Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの至適温度は約４０℃であり、約３０℃以上、約５５℃以下であればその６０％程度の活性を示す。また、Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの至適温度は約３０℃であり、約２０℃以上、約４５℃以下であればその６０％程度の活性を示す。よって、各菌体外酵素液を逐次的に多糖類含有試料に作用させる場合には、各反応温度をそれぞれ約３０℃以上、約５５℃以下と、約２０℃以上、約４５℃以下に調整することが好ましい。また、上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌由来の菌体外酵素液と上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌由来の菌体外酵素液を同時に多糖類含有試料に作用させる場合には、両グルカナーゼを有効に機能させるために、反応温度を２０℃以上、４５℃以下とすることが好ましい。より好ましくは、３５℃以上、４０℃以下で反応を行う。
【００３３】
上記酵素反応の反応時間は、多糖類含有試料中に存在するβ−１，３−１，６−グルカンがグルコースまで十分に分解される時間とする。即ち、当該反応時間は、反応混合液に含まれるβ−１，３−１，６−グルカンの濃度、菌体外酵素液に含まれるβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼの力価、反応温度などにも依存するので、具体的には予備実験で反応混合液中へ数時間おきに数回菌体外酵素液を加えつつ生成されるグルコース量を経時的に測定し、酵素反応によりグルコースが新たに生成されないことが確認できなくなった時間とすればよい。通常は、β−１，３−１，６−グルカンを十分に分解するために一晩反応させることが好ましいが、菌体外酵素液量によっては２時間以上、１０時間以下程度の短時間にて反応を終了させることも可能である。
【００３４】
本発明で用いるＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌としては、Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ Ｈ１株（以下、単に「Ｈ１株」という）が好適である。Ｈ１株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ） 受領機関の名称およびあて名
名称： 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
あて名： 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（ｉｉ） 受領日： 平成２０年（２００８年）８月１２日
（ｉｉｉ） 受領番号： ＮＩＴＥ ＡＰ−６２９
【００３５】
Ｈ１株をＷｉｃｈｅｒｈａｍ寒天培地上で生育させた場合には、培養初期で白色のコロニーを形成し、成熟するにしたがって徐々に乳白色から黄色になる。また、光学顕微鏡を用いて観察した形態的特徴は、以下の通りである。即ち、幅０．７〜１．０μｍ、長さ１．０〜４．０μｍのグラム陰性桿菌で、運動性とカタラーゼ活性を示す。以上の形態的特徴は、Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種に属する細菌に当てはまる。Ｈ１株は好気性であり、３０℃で良好に生育し、中性（ｐＨ６．８〜７．０）の培地で良好に増殖する。よって、Ｈ１株を培養する際の温度は、２５℃以上、３５℃以下程度が好適で、中性付近での培養が好適である。
【００３６】
従来、β−１，３−グルカナーゼを菌体外へ放出する一方で、その他のβ−グルカナーゼやα−グルコシダーゼを実質的に放出しない菌は知られていなかった。よって、本発明に係るＨ１株は新規なものである。
【００３７】
本発明で用いるＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌としては、Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株（以下、単に「ＳＹ２６株」という）が好適である。ＳＹ２６株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ） 受領機関の名称およびあて名
名称： 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
あて名： 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（ｉｉ） 受領日： 平成２０年（２００８年）７月２９日
（ｉｉｉ） 受領番号： ＮＩＴＥ ＡＰ−６１６
【００３８】
ＳＹ２６株をＷｉｃｈｅｒｈａｍ寒天培地で生育させた場合には、培養初期で白色コロニーを形成し、成熟するにしたがって徐々にベージュから灰色のコロニーへと変化する。光学顕微鏡を用いて観察した形態的特徴は、以下の通りである。即ち、培地基質中において無色透明の基生菌糸が観察され、その直径は０．８〜１．５μｍであり、菌糸は直線状で分岐しており、成熟するとその先端が切断されて胞子を形成する。胞子表面にはシワがなく、楕円形もしくは長楕円であり、その大きさは直径０．５〜１．０μｍ、長さは１μｍ〜４μｍである。さらに、前記培地で生育した本菌では、胞子嚢、運動性の胞子、分節胞子は確認されず、メラニン生成は陰性である。以上の形態的特徴は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種に属する担子菌に当てはまる。
【００３９】
また、ＳＹ２６株は好気性であり、３０℃で良好に生育し、中性（ｐＨ６．８〜ｐＨ７．０）の培地で良好に増殖した。よって、ＳＹ２６株を培養する際の温度は、２５℃以上、４０℃以下程度が好適で、中性付近での培養が好適である。
【００４０】
従来、β−１，６−グルカナーゼを菌体外へ放出する一方で、その他のβ−グルカナーゼやα−グルコシダーゼを実質的に放出しない菌は知られていなかった。よって、本発明に係るＳＹ２６株は新規なものである。
【００４１】
上記菌体外酵素液による反応後、β−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼの作用により生じたグルコースの量を測定する。
【００４２】
本発明に係るβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼは、それぞれβ−１，３−グルコシド結合とβ−１，６−グルコシド結合を特異的に切断する。よって、上記菌体外酵素液により、多糖類含有試料中に存在するβ−１，３−１，６−グルカンは選択的にグルコースまで分解されるので、測定されたグルコース量から、β−１，３−１，６−グルカンの量を把握することができる。
【００４３】
具体的には、生成したグルコースの量は、例えばＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法（M．Somogyi，J．Biol．Chem．，195，p．19（1952）を参照）など遊離の還元糖を測定する方法により測定することが可能である。また、酵素法やＨＰＬＣなどでも測定可能である。酵素法としては、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとヘキソキナーゼを組み合わせたＧ６ＰＤＨ−ＨＫ法（Ｆ−キット，Ｒｏｃｈｅ社製）や、ムタロターゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせたムタロターゼ・ＧＯＤ法（グルコースＣＩＩ−テストワコー，Ｗａｋｏ社製）がある。また、ＨＰＬＣ分析用のカラムとしてはＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｇａｒ ＡＸＧ（東ソー社製）やＳｕｇａｒ−ＰａｋＴＭＩ（Ｗａｔｅｒｓ社製）など、グルコースを分析するのに適したカラムが多数存在するので、これを利用できる。
【００４４】
本発明に係るβ−１，３−１，６−グルカンの定量用キットは、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液またはその乾燥物；β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液またはその乾燥物；並びに、
グルコース量測定用試薬；を含むことを特徴とする。
【００４５】
上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液と上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液は、本発明方法で用いるものと同様のものとすることができる。また、それらの乾燥物は、当該菌体外酵素液を乾燥したものであればよい。但し、上述したようにβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼは高温で失活するために、上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌由来の菌体外酵素液は６０℃以下で、上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌由来の菌体外酵素液は４５℃以下で乾燥することが好ましい。
【００４６】
グルコース量の測定用試薬としては、例えば、生じたグルコース量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法で測定する場合には、Ｓｏｍｏｇｙｉ試薬とＮｅｌｓｏｎ試薬、或いはこれらを調製するための化合物を挙げることができる。また酵素法を用いる場合には例えば、生じたグルコース量を酵素法で測定する場合にはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとヘキソキナーゼを組み合わせたＧ６ＰＤＨ−ＨＫ法（Ｆ−キット，Ｒｏｃｈｅ社製）や、ムタロターゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせたムタロターゼ・ＧＯＤ法（グルコースＣＩＩ−テストワコー，Ｗａｋｏ製）に類する試薬または、或いはこれらを調製するための化合物を挙げることができる。
【００４７】
当該キットは、本発明に係るβ−１，３−１，６−グルカンの定量方法で用いることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４９】
実施例１ β−１，３−グルカナーゼ産生菌の単離
高知大学農学部内から土壌試料を採取した。当該土壌試料（５ｇ）に滅菌水（１５ｍＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて攪拌した。次いで、当該混合物を数分間静置し、上清（５０μＬ）をマイクロピペッターで採取した。
【００５０】
別途、カードラン（β−１，３−グルカン、２ｇ）を水道水（２００ｍＬ）に懸濁し、オートクレーブで１２１℃、２０分間処理した。これをミキサーにかけ、生じたゲルを完全にすり潰した。これにポリペプトン（０．１２５ｇ）と酵母エキス（０．１２５ｇ）を溶解し、水道水を加えて５００ｍＬにメスアップした。さらに１０ｇの寒天を加え、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌処理し、シャーレ上で固めることによって、カードラン平板培地を調製した。また、デンプン培地（０．４％デンプン、０．０２５％ポリペプトン、０．０２５％酵母エキス、２％寒天、ｐＨ７．０）も調製した。
【００５１】
上記上清をカードラン平板培地に蒔き、スプレッダーで広げた後、３０℃で１日間培養した。４８０の菌株を単離し、同平板培地に植菌してさらに３０℃で２日間培養した。この培地を０．１％コンゴーレッド溶液で２〜３時間染色した後、流水中で２時間脱色してハロの形成を確認したところ、１菌株のみがハロを形成した。当該菌株をデンプン平板培地に塗布し、３０℃で１日間培養した。この培地をヨウ素溶液で２〜３時間染色した後（中村道徳・貝沼圭二編，「生物化学実験法 １９ 澱粉・関連糖質実験法」学会出版センターを参照）、流水中で２時間脱色したが、ハロの形成は確認されなかった。カードラン平板培地で培養後のコンゴーレッド染色写真を図１に、デンプン培地で培養後のヨウ素染色写真を図２に示す。
【００５２】
図１〜２のとおり、上記菌株はβ−１，３−グルカンの分解活性を示すのに対してデンプン（α−１，４−１，６−グルカン）に分解活性を示さないことから、β−１，３−グルカナーゼを産生する一方でα−グルコシダーゼは産生しないと考えられた。この菌株をＨ１株と仮に命名し、以後の実験に用いた。
【００５３】
実施例２ Ｈ１株の顕微鏡観察
上記実施例１で得たＨ１株を顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製、製品名「ＢＨ−２」）で１０００倍に拡大し、観察した。拡大写真を図３に示す。
【００５４】
図３のとおり、Ｈ１株は幅０．７〜１．０μｍ、長さ１．０〜４．０μｍの桿菌であった。また、Ｈ１株はグラム陰性であり、カタラーゼ活性を示した。
【００５５】
実施例３ Ｈ１株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析
（１） ポリメラーゼ連鎖反応
上記実施例１で得たＨ１株の属種を決定するために、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を解析した。具体的には、先ず１０×ＥｘＴａｑ緩衝液（５μＬ）、ｄＮＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰを各２．５ｍＭ含む混合液（８μＬ）、配列番号１〜２の各プライマーの５ｐｍｏｌ／μＬ溶液（各１μＬ）を混合し、全量が４９．５μＬとなるように滅菌水に加えた。別途、ＭＯ ＢＩＯ社製のUltra Clean Microbial DNA Isolation Kitを用いてＨ１株のゲノムＤＮＡ溶液を得た。当該ゲノムＤＮＡ溶液（１μＬ）か、或いは滅菌した爪楊枝によりＨ１株のコロニーから取得した少量の菌体を、上記溶液に加えて反応混合液とした。ポリメラーゼ連鎖反応には、ＤＮＡサーマルサイクラー（宝酒造社製）を使用した。反応条件は、以下のとおりである。
・ 熱変性 − ９４℃，５分間
・ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造社製，２．５Ｕ）の添加
・ 熱変性 − ９４℃，４５秒間
・ プライマーのアニーリング − ５５℃，１分間
・ ＤＮＡ鎖の伸長反応 − ７２℃，２分間
・ ２回目の熱変性以降のステップを３５サイクル繰り返す
・ 熱処理 − ７２℃，７分間
【００５６】
（２） １６ＳｒＤＮＡ断片の分離
上記ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された１６ＳｒＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動により分離した。電気泳動に用いるアガロースゲルは、Ｓｅａ Ｋｅｍ ＧＴＧ アガロース（ＦＭＣ）の１．５％溶液から調製した。泳動バッファーとしては、Ｈｏｗｌｙ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２０ｍＭ酢酸ナトリウム，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．８）を用いた。分子量マーカーには、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで処理したλＤＮＡを使用した。
【００５７】
電気泳動後、アガロースゲルを１μｇ／ｍＬの臭化エチジウム溶液に１０分間浸して染色することによりＤＮＡを可視化し、紫外線を照射して写真撮影を行った。撮影後、目的の大きさと一致するバンドの部分を滅菌済みのかみそりで切り出し、メンブレンフィルター付きマイクロチューブ（宝酒造社製，ＳＵＰＲＥＣTM−０１）に入れ、完全に凍結させた。３７℃で５分間静置して融解した後、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、２００μＬのＴＥ緩衝液（０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を加え、さらに１０分間遠心分離した。２倍量の冷却エタノールと１／２０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１時間静置した。その後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、エタノールを除去し、吸引乾燥することにより１６ＳｒＤＮＡ断片を含む混合物を得た。
【００５８】
（３） １６ＳｒＤＮＡ断片の塩基配列の決定
ポリメラーゼ連鎖反応により１６ＳｒＤＮＡ断片を増幅した上で、その塩基配列を解析した。具体的には、鋳型ＤＮＡ（４μＬ）、５ｐｍｏｌ／μＬプライマー溶液（１μＬ）、ＢｉｇＤｙｅターミネーターｖｅｒ．３．１ ５×シーケンシング緩衝液（１．５μＬ）、ＢｉｇＤｙｅターミネーターｖｅｒ．３．１（１μＬ）を混合し、滅菌水で全量を１０μＬにし、これを反応液とした。当該反応液に上記（２）で得た混合物を加え、下記反応条件でポリメラーゼ連鎖反応を行った。
・ 熱変性 − ９６℃，１分間
・ 熱変性 − ９６℃，１０秒間
・ プライマーのアニーリング − ５０℃，５秒間
・ ＤＮＡ鎖の伸長反応 − ６０℃，４分間
・ ２回目の熱変性以降のステップを２５サイクル繰り返す
【００５９】
次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用い、冷却した反応混合液から１６ＳｒＤＮＡ断片を精製した。得られた１６ＳｒＤＮＡ断片にＨｉ−Ｄｉホルムアミド（１０μＬ）を加え、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００−Ａｖａｎｔ ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステム社製）により塩基配列を解析した。当該塩基配列を配列表の配列番号３に示す。
【００６０】
得られた１６ＳｒＤＮＡ塩基配列は、Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列と高い相同性を示すものであったことから、Ｈ１株はＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種に属するものであると判断した。
【００６１】
実施例４ Ｈ１株由来の粗酵素液の基質特異性
（１） Ｈ１株由来の粗酵素液の調製
試験管内で、７ｍＬのＷｉｃｈｅｒｈａｍ培地（０．５％ペプトン，０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス，１．０％グルコース，ｐＨ７．０）を作成した。当該培地に白金耳でＨ１株を植菌し、３０℃で１日間振とう培養した。別途、生パン酵母培地（４．０％生パン酵母（協和発酵社製，ダイヤイースト））を調製し、当該培地に前培養したＨ１株を移し、３０℃で２日間培養した。当該培養液を遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）し、沈殿が入らないよう上清を得た。この上清へ終濃度が０．１ｍＭになるようにPhenylmethylsulfonyl fluoride（和光純薬社製，以下、「ＰＭＳＦ」と省略する）を加え、撹拌・氷冷しながら、乳鉢で粉砕した硫酸アンモニウムを飽和濃度の８０％となるように加えた。撹拌・氷冷しながら一晩静置後、遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）し沈殿を得た。得られた沈殿を、０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む少量の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した。これを透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ,ｉｎｃ製）に入れ、２Ｌの同緩衝液を用いて透析することにより粗酵素液を得た。
【００６２】
（２） 粗酵素液の活性測定
前項で得た粗酵素液と様々なグルカン基質を反応させ、生成した還元糖を検出することによりグルカナーゼ活性を測定した。具体的には、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に、黒酵母β−グルカン（Aureobasidium sp.由来，株式会社ソフィより提供）、パスツラン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、リケナン（シグマ社製）、ラミナリン（Eisenia araborea由来，半井化学薬品社製）、ラミナラン（Laminaria由来，東京化成工業社製）、カードラン（和光純薬社製）、セルロース（ＮＩＨＯＮＢＡＳＨＩ社製）、ルテオース（高知大農学部応用微生物学研究室より提供）、デンプン（和光純薬社製）、デキストラン（和光純薬社製）、プルラン（半井化学薬品社製）をそれぞれ１０ｇ／Ｌになるように溶解した。完全に溶解させるために、リケナンは熱湯中で煮沸し、また、パスツランはオートクレーブにより１２１℃で５分間高圧加熱した。なお、基質濃度はすべて０．５％に調整し、粗酵素溶液を加えてから３０℃で１時間反応させた。反応後、５分間煮沸し、生成した還元糖量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法にて測定した（M．Somogyi，J．Biol．Chem．，195，p．19（1952）を参照）。
【００６３】
詳しくは、ＫＮａＣ4Ｈ4Ｏ6・４Ｈ2Ｏ（４．０ｇ）、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ（７．１ｇ）、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（０．８ｇ）、１Ｍ ＮａＯＨ（１０ｍＬ）およびＮａ2ＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（１８．０ｇ）を蒸留水（１００ｍＬ）に溶解し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで当該溶液を濾過し、得られた濾液をＳｏｍｏｇｙｉ試薬とした。また、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ（５．０ｇ）、Ｈ2ＳＯ4（４．２ｇ）およびＮａ2ＨＡｓＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．６ｇ）を蒸留水（１００ｍＬ）に溶解し、２４時間インキュベートした。次いで当該溶液を濾過し、得られた濾液をＮｅｌｓｏｎ試薬とした。上記酵素反応溶液（１ｍＬ）にＳｏｍｏｇｙｉ試薬（１ｍＬ）を加え、湯鍋中にて正確に１０分間反応させた後、即座に流水中で５分間水冷した。当該溶液にＮｅｌｓｏｎ試薬（１ｍＬ）と蒸留水（２ｍＬ）を加え、室温にて約１０分間静置後、分光光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製，ＵＶ−１２００）を用いて５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、標準物質はグルコースを用いた。また、３０℃で１時間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。結果を表１に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
上記結果のとおり、Ｈ１株から得られた粗酵素液は、β−１，３−グリコシド結合を含む黒酵母β−グルカン、ラミナリン、ラミナラン、リケナンおよびカードランに対して高い活性を示した。その一方で、β−１，６−グリコシド結合のみからなるパスツランとルテオースに対する活性は見られなかった。さらに、α−グルカンであるプルランに対する活性が観察されたものの、その比活性は低いものであった。
【００６６】
以上の結果から、Ｈ１株由来の粗酵素液は、β−１，３−グリコシド結合を特異的に切断するβ−１，３−グルカナーゼを含む一方で、その他のβ−グルカナーゼを含まず、また、わずかにα−グルコシダーゼ活性を示すものの、デンプンとデキストランを分解できないことから、その活性は極めて低いことが明らかにされた。
【００６７】
実施例５ Ｈ１株由来の菌体外酵素液の調製
（１） Ｈ１株由来の粗酵素液の調製
上記実施例４（１）と同様に、Mitsuaria chitosanitabida Ｈ１株をＷｉｃｈｅｒｈａｍ培地（７０ｍＬ）で前培養した後、生パン酵母培地（１Ｌ）で本培養した。当該培養液を遠心分離（９，１００ｒｐｍ，２０分間，４℃）し、沈殿が入らないようにして上清を得た。この上清に１／１，０００量の０．１Ｍ ＰＭＳＦと、１／５，０００量の消泡剤を加え、エバポレーターで全量の約１／１０量まで減圧濃縮した。次いで、終濃度が２０ｍＭになるようにリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、撹拌・氷冷しながら、乳鉢で粉砕した硫酸アンモニウムを加えていき沈殿物を分離することにより、０〜２０％画分、２０〜４０％画分、４０〜６０％画分、６０〜８０％画分を得た。各画分を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で透析後、β−１，３−グルカナーゼ活性を測定し、また、全タンパク質を定量した。詳しくは、E．araborea由来のラミナリンに酵素液を加え、３０℃で１時間反応させた後、生じた還元糖量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法により定量することにより全活性と比活性を測定した。また、タンパク質はＬｏｗｒｙ法（Lowry，O．H．ら，J．Biol．Chem．，193，pp．265-275（1951）を参照）により定量した。結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】
上記結果のとおり、全活性は６０〜８０％飽和画分で最も高く、比活性は２０〜４０％飽和画分で最も高かった。それに対して、０〜２０％飽和画分は全活性と比活性が低かった。よって、以後の実験では２０〜８０％飽和画分を用いた。
【００７０】
（２） Ｈ１株由来の菌体外酵素液の調製
０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を使って、上記で得た粗酵素液の２０〜８０％飽和画分を透析した後、遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）したところ、ゲル状の沈殿が生じた。上記実施例４（２）と同様の方法により、Ｅ．ａｒａｂｏｒｅａ由来のラミナリンを基質として、生じたゲル状沈殿と上清のそれぞれのグルカナーゼ活性を測定したところ、ゲル状沈殿に非常に高い活性が見られた。当該ゲル状沈殿を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁してから遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）する操作を繰り返すことにより洗浄した。洗浄した粗酵素液の基質特異性に変化がないかを調べるために、上記実施例４（２）と同様の実験を再び行った。結果を表３に示す。
【００７１】
【表３】
【００７２】
表３に示す結果のとおり、得られた菌体外酵素液はβ−１，３−グリコシド結合を有する基質に対しては作用する一方で、α−１，４−グリコシド結合、α−１，６−グリコシド結合、β−１，４−グリコシド結合およびβ−１，６−グリコシド結合には作用しない。よって、当該Ｈ１株由来の菌体外酵素液は、β−１，３−グリコシド結合を特異的に切断する一方で、α−グルコシダーゼ活性やその他のβ−グルカナーゼ活性を有しないことが実証された。なお、当初はカラムクロマトグラフィによりさらに精製を進めてその酵素学的性質を調べる予定であったが、精製酵素液がゲル状であるためかかる精製は行うことができなかった。
【００７３】
実施例６ Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの至適温度
上記実施例５（２）で得た菌体外酵素液を用い、反応温度を２０〜７０℃に変更した以外は上記実施例５（１）と同様にして比活性を測定し、Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの至適温度を調べた。結果を図４に示す。
【００７４】
図４のとおり、Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの至適温度は４０℃であり、活性は５０℃から徐々に下がり始め、７０℃では活性はほとんど失われることが分かった。
【００７５】
実施例７ Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの熱安定性
上記実施例５（２）で得た菌体外酵素液を３０〜７０℃で１５分間処理した後に、氷上で急冷した。当該溶液を用い、上記実施例５（１）と同様にして比活性を測定し、Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの熱安定性を調べた。結果を図５に示す。
【００７６】
図５のとおり、Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼは５０℃までは高い安定性を示すが、７０℃では完全に失活することが分かった。
【００７７】
実施例８ Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの反応生成物の同定
β−１，３−グルカンであるカードランに、上記実施例５（２）で得た菌体外酵素液を上記実施例４（２）と同様の反応条件で作用させ、反応混合液を経時的に分取し、反応生成物を薄層クロマトグラフィで分析した。具体的には、反応開始から０、１、２、４、２４時間後に反応混合液を分取し、沸騰水で１０分間加熱処理して酵素反応を止めた後、HPTLC Fertigplatten Kieselgel 60（Ｍｅｒｃｋ社製，１０ｃｍ×１０ｃｍ）を用いた薄層クロマトグラフィに供した。標準物質として１％グルコースを用い、展開溶媒にはｎ−ブタノール：エタノール：水＝５：２：２の混合溶媒を用い、上昇法で行った。展開後、発色液として、ジフェニルアミン−アニリン−リン酸（２ｇジフェニルアミン，２ｍＬアニリン，１００ｍＬアセトン，１５ｍＬ ８０％リン酸）をゲルプレート上に噴霧し、乾熱器中、１００℃で１０分間加熱し、出現したスポットを観察した。結果を図６に示す。図６中、「Ｇ３」はカードランを示し、「Ｇ１」はグルコース２分子がβ−１，６結合したゲンチオビオースであり、「Ｇ０」はグルコースである。
【００７８】
図６のとおり、Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼによる反応の最終生成物はグルコースであり、その生成量は経時的に増加した。よって、Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼは、β−１，３−グルカンを構成単糖であるグルコースまで分解できるＳタイプの酵素であることが確認された。
【００７９】
実施例９ β−１，６−グルカナーゼ産生菌の単離
高知大学農学部内から土壌試料を採取した。当該土壌試料（５ｇ）に滅菌水（１５ｍＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて攪拌した。次いで、当該混合物を数分間静置し、上清（５０μＬ）をマイクロピペッターで採取した。当該上清をパスツラン平板培地（０．１％パスツラン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製，０．０２５％ポリペプトン、０．０２５％酵母エキス、２％寒天、ｐＨ７．０）に蒔き、スプレッダーで広げた後、３０℃で２日間培養した。１８０の菌株を単離し、同平板培地に植菌してさらに３０℃で４日間培養した。この培地を０．１％コンゴーレッド溶液で２〜３時間染色した後（Andres Solerら，Journal of microbiological methods，35，pp．245-251（1999）を参照）、流水中で２時間脱色した。さらに２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に一晩浸すことでコンゴーレッドを変色させた後、ハロの形成を確認した。培地の写真を図７に示す。
【００８０】
図７の結果のとおり、１８０の菌株中１菌株のコロニー周辺にハロらしきものが認められた。即ち、この菌株はβ−１，６−グルカンであるパスツランに対する分解活性を示すことから、β−１，６−グルカナーゼを産生していると考えられる。この菌株をＳＹ２６と命名し、以後の実験に用いた。
【００８１】
実施例１０ ＳＹ２６株の顕微鏡観察
上記実施例９で得たＳＹ２６株を顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製、製品名「ＢＨ−２」）で１０００倍に拡大し、観察した。拡大写真を図８に示す。
【００８２】
図８のとおり、ＳＹ２６株は無色透明の基生菌糸を形成する。菌糸の直径は０．８〜１．５μｍであり、直線状で分岐していた。また、当該菌糸は、成熟するとその先端が切断されて胞子を形成した。胞子表面にはシワがなく、楕円形もしくは長楕円であり、その大きさは直径０．５〜１．０μｍ、長さは１μｍ〜４μｍであった。さらに、ＳＹ２６株では、胞子嚢、運動性の胞子、分節胞子は確認されず、メラニン生成は陰性である。
【００８３】
実施例１１ ＳＹ２６株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析
上記実施例３と同様にして、ＳＹ２６株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を解析した。当該塩基配列を配列表の配列番号４に示す。
【００８４】
得られた１６ＳｒＤＮＡ塩基配列は、Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列と高い相同性を示すものであったことから、ＳＹ２６株はＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種に属するものであると判断した。
【００８５】
実施例１２ ＳＹ２６株由来の粗酵素液の基質特異性
本培養期間を６日間とした以外は上記実施例４（１）と同様にして、ＳＹ２６株の培養液から粗酵素液を得た。さらに上記実施例４（２）と同様にして、当該粗酵素液の活性を測定した。結果を表４に示す。
【００８６】
【表４】
【００８７】
上記結果のとおり、ＳＹ２６株から得られた粗酵素液は、β−１，６−グリコシド結合を含む黒酵母β−グルカン、ラミナリン、パスツランおよびルテオースに対して高い活性を示した。それに対して、β−１，６−グリコシド結合を含まず且つβ−１，３−グリコシド結合を含むリケナンとカードランに対する活性は見られなかった。さらに、α−グルコシダーゼ活性は見られなかった。
【００８８】
以上の結果から、ＳＹ２６株の粗酵素液は、β−１，６−グリコシド結合を特異的に切断できる一方で、α−グルコシダーゼ活性とその他のβ−グルカナーゼ活性を有しないことが明らかにされた。
【００８９】
実施例１３ ＳＹ２６株由来の菌体外酵素液の調製
（１） ＳＹ２６株由来の粗酵素液の調製
上記実施例４（１）と同様に、Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株をＷｉｃｈｅｒｈａｍ培地（１４ｍＬ）で前培養した後、生パン酵母培地（２００ｍＬ）で本培養した。当該培養液から上記実施例５（１）と同様にして０〜２０％画分、２０〜４０％画分、４０〜６０％画分、６０〜８０％画分を得た。また、基質としてラミナリンの代わりにパスツランを用いた以外は上記実施例５（１）と同様にして、β−１，６−グルカナーゼ活性を測定し、また、全タンパク質を定量した。結果を表５に示す。
【００９０】
【表５】
【００９１】
上記結果のとおり、全活性は２０〜４０％飽和画分で最も高く、比活性は４０〜６０％飽和画分で最も高かった。６０〜８０％飽和画分もわずかに活性を示したが、全活性と比活性の値が共に低かったため、以後の実験では２０〜６０％飽和画分を用いた。
【００９２】
（２） β−１，６−グルカナーゼの精製
３５ｍＬのＷｉｃｈｅｒｈａｍ培地でＳＹ２６株を前培養した後に５００ｍＬの生パン酵母培地で本培養した以外は上記実施例１３（１）と同様にして、培養液の２０〜６０％飽和画分を得た。
【００９３】
０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を使って、上記で得た粗酵素液の２０〜６０％飽和画分を透析した後、透析中に生じた沈殿物を遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）で取り除いたものを菌体外酵素液とし、上記実施例１３（１）と同様に活性測定を行った。また、全タンパク質量をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社製）により定量した。上記菌体外酵素液の全活性は４０．９ｕｎｉｔ、全タンパク質量は３．２４ｍｇ、比活性は３．８９ｕｎｉｔ／ｍｇであった。
【００９４】
上記菌体外酵素液を、さらにゲル濾過クロマトグラフィにより精製した。具体的には、０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＰ−セファデックス Ｃ−５０ カラム（ファルマシア社製，３．０×３０ｃｍ）に上記粗酵素液を供した。非吸着タンパク質は同緩衝液で溶出させ、吸着タンパク質は０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む同緩衝液でリニアグラジエントにより溶出させ、５ｍＬ毎にフラクションを分取した。各フラクションの比活性を測定し、活性の高いフラクションを集めてアミコンメンブレンフィルターで６ｍＬに濃縮した。０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で透析後、透析中に生じた沈殿物を遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）で取り除いた。上記と同様にして活性測定とタンパク定量を行ったところ、全活性は２９．８ｕｎｉｔ、全タンパク質量は２．２３ｍｇ、比活性は１３．３ｕｎｉｔ／ｍｇであった。
【００９５】
上記酵素液を、さらにイオン交換クロマトグラフィで精製した。詳しくは、０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｍカラム（東ソー株式会社，３．０×３０ｃｍ）に上記酵素液を供した。タンパク質を同緩衝液で溶出させ、５ｍＬ毎にフラクションを分取し、活性の高いフラクションを集めた。当該酵素液の全活性は１８．３ｕｎｉｔ、全タンパク質量は０．３１ｍｇ、比活性は５８．２ｕｎｉｔ／ｍｇであった。
【００９６】
上記酵素液をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐで約１ｍＬまで濃縮し、さらにＭｉｃｒｏｃｏｎを用いて５０μＬまで濃縮した後、ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｄｕｏ Ｆｌｏｗ（バイオラッド製）を用いたＦＰＬＣで精製した。具体的には、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＨＲ １０／３０ カラムに濃縮した酵素液を供した。同緩衝液を通液し続けてタンパク質を溶出させて０．５ｍＬ毎に分取し、活性の高いフラクションを集めてこれを精製酵素液とした。上記と同様にして当該精製酵素液の活性測定とタンパク定量を行ったところ、全活性は３．６５ｕｎｉｔ、全タンパク質量は０．０１ｍｇ、比活性は３８６ｕｎｉｔ／ｍｇであった。
【００９７】
以上の各精製段階における全タンパク質量などのデータを、表６にまとめる。
【００９８】
【表６】
【００９９】
また、上記各精製段階の酵素液を、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（U．K．Laemmli，Nature，277，pp．680-685（1970）を参照）に従って分析した。電流は、濃縮ゲル時は１０ｍＡ、分離ゲル時は２０ｍＡとした。また、分子質量測定の際のマーカーとして、ミオシン（２００ｋＤ）、β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤ）、卵白アルブミン（４５ｋＤ）、炭酸脱水酵素（３１ｋＤ）、トリプシン阻害剤（２１．５ｋＤ）、リゾチーム（１４．４ｋＤ）、アプロチニン（６．５ｋＤ）からなるタンパク質マーカー（ナカライテスク社製）を用いた。泳動終了後は、０．２５％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０を含むメタノール：酢酸：水＝５：１：８８の混合溶液にゲルを浸し、振とうしながら５０℃で３０分間染色した。その後、メタノール：酢酸：水＝５：７：８８の混合溶液に浸し、振とうしながら５０℃で脱色した。脱色したゲルは、デジタルカメラを用いて画像を保存し、ゲル乾燥機で乾燥させて保存した。結果を図９に示す。
【０１００】
図９のとおり、最終的に得られた精製酵素液中には、分子質量が１０ｋＤのタンパク質のみが含まれていることが分かる。
【０１０１】
実施例１４ ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの至適温度
上記実施例１３（２）で得たＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＨＲ １０／３０ カラム溶出画分である精製酵素液を用い、反応温度を１０〜６０℃に変更した以外は上記実施例１３（１）と同様にして比活性を測定し、ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの至適温度を調べた。結果を図１０に示す。
【０１０２】
図１０のとおり、ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの至適温度は３０℃であり、４０℃では３０℃の場合の８３％の活性を示したが、５０℃以上になると活性は急激に失われることが分かった。
【０１０３】
実施例１５ ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの熱安定性
上記実施例１３（２）で得たＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＨＲ １０／３０ カラム溶出画分である精製酵素液を２０〜６０℃で１５分間処理した後に、氷上で急冷した。当該溶液を用い、上記実施例１３（１）と同様にして比活性を測定し、ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの熱安定性を調べた。結果を図１１に示す。
【０１０４】
図１１のとおり、ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼは３０℃までは高い安定性を示し、４０℃では３０℃の場合の約８０％の活性を示したが、５０℃では失活することが分かった。
【０１０５】
実施例１６ ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの反応生成物の同定
β−１，６−グルカンであるパスツランに、上記実施例１３で精製したβ−１，６−グルカナーゼ含有溶液を上記実施例１３（１）と同様の反応条件で作用させ、反応混合液を経時的に分取し、反応生成物を薄層クロマトグラフィで分析した。結果を図１２に示す。図１２中、「Ｇ３」はパスツランを示し、「Ｇ１」はグルコース２分子がβ−１，６結合したゲンチオビオースであり、「Ｇ０」はグルコースである。
【０１０６】
図１２のとおり、ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼによる反応の最終生成物はグルコースであり、その生成量は経時的に増加した。よって、ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼは、β−１，６−グルカンを構成単糖であるグルコースまで分解できるＳタイプの酵素であることが確認された。
【０１０７】
実施例１７ β−１，３−１，６−グルカンの定量
天然由来のグルカン類としては、グルコースのみからなるホモグルカンであるα−グルカンとβ−グルカン、および他の糖と結合したヘテログルカンが存在する。従来方法は、これらグルカン類の内、α-グルカンを取り除いた残りの全てのグルカンを構成単糖まで分解してグルコースを定量するものであることから、有用なβ−１，３−１，６−グルカンのみを定量することはできなかった。
【０１０８】
一方、上記実験により、Ｈ１株とＳＹ２６株に由来する菌体外酵素液は、それぞれβ−１，３−グリコシド結合とβ−１，６−グリコシド結合を特異的に切断できることが実証されていることから、これら酵素液によりグルカンをグルコースまで完全に分解した後にグルコース量を測定すれば、事前にα−グルカンを分解除去しなくてもβ−１，３−１，６−グルカンを正確に定量できると期待できる。
【０１０９】
そこで、先ず、本発明に係る２種の菌体外酵素液を使って、天然由来のグルカン中のβ−１，３−１，６−グルカンを定量し、次に、当該グルカンからα−グルカンを除去した上で同様の操作を行い、両結果を比較することで、本発明方法の効果を評価した。
【０１１０】
（１） 多糖標品の調製
Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ ＡＦＯ２０２株の培養液（ソフィ社より提供，３ｇ）に蒸留水（２７ｍＬ）を加えて１０倍希釈培養液を作成した。これを遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）し、得られた上清（７ｍＬ）に２倍量のエタノールを加え、よく撹拌して多糖を沈殿させた。さらに、遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）後、上清を捨て、沈殿物をエタノール臭がしなくなるまで風乾した。風乾後、沈殿物を１４ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、これを多糖標品とした。
【０１１１】
フェノール硫酸法（Dubois，M．ら，Anal．Chem．，28，p．350（1956）を参照）を用い、上記多糖標品に含まれる全多糖量を測定した。具体的には、上記多糖標品（５００μＬ）と蒸留水（５００μＬ）とを混合し、さらに５％フェノール（１ｍＬ）を加えた。ここへ硫酸（５ｍＬ）を加え、室温で１０分間冷却した。当該混合液を流水で２０分間冷却した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、多糖量を定量したところ、全多糖量は３．８０ｇ／Ｌであった。
【０１１２】
（２） 試料中にα−グルカンが含まれる場合
上記（１）で得た多糖標品（５００μＬ）に、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０，５０μＬ）、Ｈ１株由来の菌体外酵素液（２２５μＬ）およびＳＹ２６株由来の菌体外酵素液（２２５μＬ）を混合し、４０℃で６時間インキュベートした。なお、使用したＨ１株由来の菌体外酵素液の活性はラミナリン（Ｅ．ａｒａｂｏｒｅａ由来）に対して２．２ｕｎｉｔであり、ＳＹ２６株由来の菌体外酵素液の活性はパスツランに対して１．４ｕｎｉｔと、上記多糖標品中のグルカンを完全に分解するに十分である。
【０１１３】
上記酵素反応後における反応混合液について、Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法により還元糖量を測定した。結果を表７に示す。
【０１１４】
（３） 試料中にα−グルカンが含まれない場合
アミログルコシダーゼ（Rhizopus sp由来，シグマ社製）を０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．５）に１μｇ／ｍＬの濃度で溶解し、アミログルコシダーゼ溶液を得た。上記多糖標品（３．６ｍＬ）とアミログルコシダーゼ溶液（０．４ｍＬ）をファルコンチューブに入れ、５５℃で一晩インキュベートした。その後、５分間煮沸し、酵素反応を終了させた。このアミログルコシダーゼ処理で生じた還元糖をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法で定量し、α−グルカン量とした。この反応液（５００μＬ）にＨ１株由来の菌体外酵素液（２２５μＬ）およびＳＹ２６株由来の菌体外酵素液（２２５μＬ）を加え、４０℃で６時間反応させた。当該酵素反応後における反応混合液について、Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法により還元糖量を測定し、当該測定値から上記のα−グルカン量値を引いてβ−１，３−１，６−グルカン量とした。結果を表７に示す。
【０１１５】
【表７】
【０１１６】
α−グルカンを除去しない場合のβ−１，３−１，６−グルカン量は３．０９ｇ／Ｌであり、α−グルカンを除去した場合は３．１８ｇ／Ｌであって、この二つに大きな差はなかった。従って、本発明方法は、標品中にα−グルカンが存在したままでも正確にβ−１，３−１，６−グルカンを定量できることが分かった。
【０１１７】
実施例１８ β−１，３−１，６−グルカンの定量
上記実施例１７のとおり、本発明方法によれば標品中にα−グルカンが存在したままでも正確にβ−１，３−１，６−グルカンを定量できるが、反応溶液中のα−グルカン量がこれより多くなると、α−グルカンを除去しなければ正確にβ−１，３−１，６−グルカン量を正確に定量できない可能性もある。そこで、α−グルカンをより多く生産するA．pullulans １３２株の培養液を試料とし、同様の実験を行った。
【０１１８】
（１） 多糖標品の調製
Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ １３２株（寺尾啓吾（高知大学農学部生物資源科学科），「応用微生物学研究室卒業論文」（2006）を参照）を白金耳で一掻き取り、５ｍＬの米ヌカ含有液体培地（０．２％米ヌカ、０．２％アスコルビン酸、１％スクロース、ｐＨ５．２）に植菌し、２５℃、１２５ｒｐｍで４８時間振とうして前培養した。次いで、３０ｍＬ容の三角フラスコに１００ｍＬの米ヌカ含有液体培地を作成し、ここへ上記前培養液（１ｍＬ）を加え、２５℃、１２５ｒｐｍで７２時間振とうして本培養した。なお、米ヌカ含有液体培地は、多糖の生産を促進する。
【０１１９】
A．pullulans ＡＦＯ２０２株の培養液の代わりに上記本培養の培養液（３ｇ）を用いた以外は上記実施例１７（１）と同様にして、多糖標品を得た。当該多糖標品に含まれる多糖量を上記実施例１７（１）と同様の方法で定量したところ、３．０４ｇ／Ｌであった。
【０１２０】
（２） β−１，３−１，６−グルカンの定量
上記多糖標品について、α−グルカンを除去しない場合と除去した場合において、β−１，３−１，６−グルカンの量を上記実施例１７（２）〜（３）と同様に測定した。結果を表８に示す。
【０１２１】
【表８】
【０１２２】
上記結果のとおり、Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ １３２株の培養液に含まれるα−グルカンは、Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ ＡＦＯ２０２株の培養液に含まれるα−グルカンよりも多い。しかし、本発明方法により測定されるβ−１，３−１，６−グルカンの量は、α−グルカンを除去しない場合で０．９２ｇ／Ｌであり、α−グルカンを除去した場合は１．１０ｇ／Ｌであって、この二つに大きな差はなかった。
【０１２３】
上記実施例１７〜１８の結果から、Ｈ１株とＳＹ２６株にそれぞれ由来するβ−１，３−グルカナーゼおよびβ−１，６−グルカナーゼを用いた本発明方法によれば、試料中におけるα−グルカンの存在または非存在、そして混在するα−グルカンの存在量にかかわらず正確にβ−１，３−１，６−グルカンを定量できることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】実施例１において、土壌試料から単離された菌株をカードラン平板培地で培養した後、コンゴーレッド染色した写真である。
【図２】実施例１において、土壌試料から単離された菌株をデンプン培地で培養した後、ヨウ素染色した写真である。
【図３】実施例１で得たＨ１株の顕微鏡写真である。
【図４】反応温度とＨ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの活性との関係を示すグラフである。
【図５】Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの活性と熱処理温度との関係を示すグラフである。
【図６】Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼによるカードランの分解反応生成物の経時的変化を示す薄層クロマトグラフィの結果である。
【図７】実施例９において、土壌試料から単離された菌株をパスツラン平板培地で培養した後、コンゴーレッド染色した写真である。
【図８】実施例９で得たＳＹ２６株の顕微鏡写真である。
【図９】ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの各精製段階のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図中、１は分子量マーカーレーンを示し、２は２０〜６０％飽和硫安沈殿レーンを示し、３はゲル濾過クロマトグラフィによる精製後のレーンを示し、４はイオン交換クロマトグラフィによる精製後のレーンを示し、５はＦＰＬＣによる精製後のレーンを示す。
【図１０】反応温度とＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの活性との関係を示すグラフである。
【図１１】ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの活性と熱処理温度との関係を示すグラフである。
【図１２】ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼによるパスツランの分解反応生成物の経時的変化を示す薄層クロマトグラフィの結果である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−１，３−１，６−グルカンを定量する方法、当該方法に用いることができるβ−１，３−１，６−グルカンの定量用キット、および当該方法に有用な菌体外酵素を産生する微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、グリコーゲンやデンプンなどエネルギーとなる貯蔵多糖のほか、構造多糖を産生する。構造多糖とは、細胞の表面を保護する細胞膜や細胞壁の構成成分である多糖であり、グルカン、マンナン、糖タンパク質、キチンなど様々な種類が確認されている。
【０００３】
近年、かかる構造多糖の中でも、担子菌類の産生するものが優れた生理活性を有することから注目を集めている。
【０００４】
担子菌類とは、担子胞子を生ずる高等菌類であり、松茸や舞茸、アガリクスと呼ばれる姫松茸などがある。この担子菌類が産生する構造多糖は、食物繊維としての効果のほか、抗腫瘍作用、抗菌作用、血糖・血清コレステロール降下作用などを示し、糖尿病などの生活習慣病やがんなどの予防に有効であるとの研究成果も報告されている。
【０００５】
担子菌類が産生する構造多糖の中でも、β−１，３−グルコシド結合を主鎖に有しβ−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するβ−１，３−１，６−グルカンは、とりわけ特徴的な生理活性を示す（非特許文献１）。
【０００６】
しかし、構造多糖は優れた生理活性を有するものの、細胞壁などの中に存在するためにその抽出は非常に困難である。その上、たとえ抽出したとしてもその抽出物は水に対して不溶性または難溶性を示し、特有の色や不快臭を有し、品質が不安定であり非常に高価であるなどの問題を有する。
【０００７】
それに対して、黒酵母といわれるＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ種菌の中からは、ある条件下でβ−１，３−１，６−グルカンを菌体外へ放出するものが見出されている。しかも、β−１，３−１，６−グルカンを含む当該菌の培養液は、無味無臭で品質が安定しており、安価に製造できる。よって、当該菌から得られるβ−１，３−１，６−グルカンを機能性食品などとして利用する道が開かれつつある。
【０００８】
しかし、β−１，３−１，６−グルカンを含む培養液などを食品の原料として利用する場合には、その含量を測定するなどして品質を評価する必要があるものの、正確な定量方法は未だ存在しない。
【０００９】
例えば、財団法人日本食品分析センターが行っているβ−グルカンの定量方法は、アミラーゼやアミログルコシダーゼなどによる酵素処理の後、硫酸で全てのグルコシド結合を非特異的に加水分解し、生じたグルコースを定量するものである。しかしこの方法では、β−１，３−１，６−グルカンとそれ以外のβ−グルカンを区別することができない。さらに、グルコース以外の単糖を含むヘテログルカンなどに由来するグルコースまで分解され、測定されてしまう。従って当該方法は、β−１，３−１，６−グルカンの定量方法としては不適である。
【００１０】
そのほか、一般的に使用されているβ−グルカンの定量キットは、連続したβ−１，３−グルコシド結合を認識して結合するタンパク質因子を利用するものであるため、試料中に含まれるβ−１，３−グルカンにおける側鎖の割合が多いほど、測定値の誤差は大きくなる。
【００１１】
ところで、非特許文献２〜４のとおり、本発明者らが属する研究室では、土壌から単離したＣｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属微生物由来のβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼが、それぞれβ−１，３−グルコシド結合とβ−１，６−グルコシド結合に対して高い反応性を有することを見出している。よって、これら酵素を利用して試料中のβ−１，３−１，６−グルカン含量を正確に測定できると考えられる。
【非特許文献１】宮崎利夫，「多糖の構造と生理活性」朝倉書店（１９９０年）
【非特許文献２】野田洋彦，「高知大学大学院農学研究科農芸化学専攻醗酵及び醸造学研究室修士論文」（１９９４年）
【非特許文献３】中嶋英夫，「高知大学大学院農学研究科農芸化学専攻醗酵及び醸造学研究室修士論文」（１９９３年）
【非特許文献４】池上裕倫，「高知大学大学院農学研究科生物資源科学専攻応用微生物学研究室修士論文」（２００４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述した様に、本発明者らが属する研究室では、反応性の高いβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼを産生するＣｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属微生物を見出しており、これら酵素を利用して試料中のβ−１，３−１，６−グルカン含量を正確に測定することが考えられる。
【００１３】
しかし、酵素を完全に精製するには、各種クロマトグラフィを繰り返す必要があるなど手間やコストがかかるため、精製酵素を用いる定量方法は、工業的な実施のためには実用的であるとは到底いい難い。よって、菌体外に放出された酵素を完全に精製することなく定量に用いることが考えられる。ところが、上記Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属微生物は非常に強いα−グルコシダーゼ活性を有するため、粗精製酵素中にはα−グルコシダーゼが混入するので、試料中にα−グルカンが存在しているとグルコースまで分解されてしまい、β−１，３−１，６−グルカン含量を正確に測定できなくなる。そのため、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属微生物由来の粗精製酵素を用いて試料中のβ−１，３−１，６−グルカンを定量するには、先ずα−グルコシダーゼなどによりα−グルカンを分解して除去してから、粗精製されたβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼでβ−グルカンを分解し、生じたグルコースを定量する必要がある。このような方法では、時間や手間がかかり非効率的である。
【００１４】
そこで本発明では、完全に精製した酵素を用いる必要がなく、且つβ−１，３−１，６−グルカンを正確かつ効率的に定量できる方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該方法に用いることができるキットと、当該方法に対して有用な微生物を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねたところ、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌と、β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液を用いれば、試料中におけるα−グルカン、他のβ−グルカンおよびヘテログルカンの存在にかかわらず、β−１，３−１，６−グルカンを正確かつ効率的に定量できることを実証して、本発明を完成した。
【００１６】
本発明に係るβ−１，３−１，６−グルカンの定量方法は、多糖類含有試料に、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液、並びに、β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液を作用させる工程；並びに、生じたグルコースの量を測定する工程；を含むことを特徴とする。
【００１７】
上記本発明方法においては、上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌としてＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ Ｈ１株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６２９）が好適であり、また、上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌としてＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６１６）が好適である。上記菌株の優れた効果は、実験により実証されている。
【００１８】
上記本発明方法においては、多糖類含有試料に、２０℃以上、４５℃以下で、上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液と上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液とを同時に作用させることが好ましい。上記２種の菌体外酵素液は同時に多糖類含有試料へ作用させることが効率の面から好ましいが、それぞれの酵素液に含まれるβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼの至適温度は異なる。しかし２０℃以上、４５℃以下の温度範囲であれば、両酵素は良好にその作用効果を発揮することができ、多糖類含有試料に含まれるβ−１，３−１，６−グルカンを効率的に分解することが可能になる。
【００１９】
本発明に係るβ−１，３−１，６−グルカンの定量用キットは、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液またはその乾燥物；β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液またはその乾燥物；並びにグルコース量測定用試薬；を含むことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明は、Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ Ｈ１株（ＮＩＴＥ ＡＰ− ６２９）およびＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６１６）に関する。
【発明の効果】
【００２１】
従来、α−グルカンを含む多糖類含有試料中のβ−１，３−１，６−グルカンを正確に測定するには、先ずアミログルコシダーゼなどでα−グルカンを分解し除去してからβ−グルカン量を測定しなければならず、手間や時間がかかるものであった。また、従来方法では、他のβ−グルカンを含む試料中のβ−１，３−１，６−グルカンを正確に測定することは困難であった。しかし本発明方法によれば、完全に精製された酵素を用いなくとも、α−グルカンを事前に分解する必要も無く、β−１，３−１，６−グルカンを正確かつ効率的に定量することができる。また、本発明に係る定量用キットは、同様の効果を有する。さらに本発明に係る２種の菌株は、これら本発明に係る定量方法と定量用キットにとり非常に好適なものである。よって本発明は、その優れた生理活性が注目されているβ−１，３−１，６−グルカンを含む試料の品質を評価する指標になり得るものとして、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明に係るβ−１，３−１，６−グルカンの定量方法は、多糖類含有試料に、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液、並びに、β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液を作用させる工程；および、生じたグルコースの量を測定する工程；を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明方法の測定対象である多糖類含有試料は、β−１，３−１，６−グルカンを含有するか或いは含有すると考えられるものであって、その含有量を測定すべきものであれば特にその種類などは制限されない。例えば、酵母の集菌体、培地、それらの乾燥物、抽出物、精製品、懸濁液、溶液；担子菌類自体や海藻類自体、それらの乾燥物、抽出物、粉砕物、生成物、懸濁液、溶液などを挙げることができる。
【００２４】
本発明方法では、多糖類含有試料に、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液、並びに、β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液を作用させる。これら菌体外酵素液は、各β−グルカナーゼ活性を示す一方で、α−グルカンや他のβ−グルカンを分解しない。よって、これら菌体外酵素液を用いれば、酵素を精製しなくとも、多糖類含有試料中のβ−１，３−１，６−グルカンを特異的にグルコースまで分解することができる。
【００２５】
なお、上記菌は、α−グルコシダーゼや、β−１，３−グルカナーゼおよびβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼを全く産生しないものに限定されず、β−１，３−１，６−グルカンの正確な定量を阻害しない程度のこれら酵素活性を菌体外へ放出するものや、β−１，３−１，６−グルカナーゼから容易に分離除去できる程度のこれら酵素を産生して菌体外へ放出するものも含まれるものとする。具体的には、比活性が０．０５ｕｎｉｔ／ｍｇ以下のα−グルコシダーゼ、またはβ−１，３−グルカナーゼおよびβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼをその菌体外酵素液に放出する菌も含まれるものとする。但し、上記菌としては、これら酵素活性を実質的に示さないものが好適である。ここでいう実質的とは、菌体外酵素液におけるこれら酵素の活性が、下記実施例に記載の測定方法において、検出限界以下であることをいう。
【００２６】
当該菌体外酵素液としては、上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌および上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌の液体培養液から得た酵素液であって、グルコースやα−グルコシダーゼ、β−１，３−グルカナーゼおよびβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼなどβ−１，３−１，６−グルカンの正確な定量を阻害する成分を含まないものをいう。即ち、上記菌の液体培養液に硫酸アンモニウムを加えて沈殿したタンパク質成分を分離したり、透析などにより、グルコースなどの低分子物質を除去することができる。また、上記菌の菌体外酵素液でもα−グルコシダーゼ活性等を示すことがあるが、その活性は極めて弱いので、硫酸アンモニウムの濃度を調整することにより、α−グルコシダーゼ等は容易に除去可能である。
【００２７】
菌体外酵素液は、具体的には例えば以下のように調製することができる。先ず、上記菌を培養した液体培養液を遠心分離や濾過に付すことによって、菌体などの固体成分を除去する。得られた液体には、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオリド）などのプロテアーゼ阻害剤を加えることが好ましい。次に、タンパク質成分を常法により分離する。例えば、得られた液体をある程度濃縮した上で緩衝液を加えた後、冷却しながら硫酸アンモニウムを加えることにより沈殿したタンパク質成分を分離すればよい。この際、予備実験などにより、β−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼが十分に沈殿し且つα−グルコシダーゼ等が沈殿しない硫酸アンモニウム濃度を事前に決定しておくと効率的である。得られたタンパク質成分からは、さらに透析などの簡便な方法により、所望のβ−グルカナーゼをある程度精製してもよい。但し、本発明で用いるＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌とＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌は菌体外にα−グルコシダーゼ等を放出しないか或いはその放出量は極めて少ないので、クロマトグラフィなど工業的に適さない方法により酵素を精製する必要はない。
【００２８】
上記菌体外酵素液は、保存などのためにいったん乾燥し、使用時に溶液としてもよい。但し、上記β−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼは、それぞれ７０℃と５０℃で失活する。よって、酵素液の濃縮や乾燥時においては、それぞれ温度を７０℃、５０℃以上に上げないことが好ましい。
【００２９】
本発明においては、多糖類含有試料に上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌由来の菌体外酵素液と上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌由来の菌体外酵素液を作用させるが、これら酵素液は同時に作用させてもよいし、逐次的に作用させてもよい。効率を考慮すれば、同時に作用させることが好ましい。
【００３０】
上記菌体外酵素液におけるβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼの濃度は、反応混合液における多糖類の濃度などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、反応混合液中に含まれる各β−グルカナーゼの活性として、β−１,３−１，６−グルカンであるラミナリンを基質に用いた場合で１．０ｕｎｉｔ/ｍｌ以上、５．０ｕｎｉｔ/ｍｌ以下程度、β−１，６−グルカンであるパスツランを基質に用いた場合で０．１ｕｎｉｔ/ｍｌ以上、３．０ｕｎｉｔ/ｍｌ以下程度とすることが好ましい。なお、本発明におけるｕｎｉｔとは、３０℃で１時間に１μｍｏｌの還元糖を精製する酵素量の単位と定義する。
【００３１】
上記菌体外酵素液のｐＨも適宜調整すればよいが、本発明者らによる実験ではｐＨ６．０で良好な結果が得られているので、溶媒としてはｐＨ５．０以上、７．５以下程度の緩衝液が好適である。
【００３２】
上記酵素反応における反応温度も適宜調整すればよい。例えば、Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの至適温度は約４０℃であり、約３０℃以上、約５５℃以下であればその６０％程度の活性を示す。また、Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの至適温度は約３０℃であり、約２０℃以上、約４５℃以下であればその６０％程度の活性を示す。よって、各菌体外酵素液を逐次的に多糖類含有試料に作用させる場合には、各反応温度をそれぞれ約３０℃以上、約５５℃以下と、約２０℃以上、約４５℃以下に調整することが好ましい。また、上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌由来の菌体外酵素液と上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌由来の菌体外酵素液を同時に多糖類含有試料に作用させる場合には、両グルカナーゼを有効に機能させるために、反応温度を２０℃以上、４５℃以下とすることが好ましい。より好ましくは、３５℃以上、４０℃以下で反応を行う。
【００３３】
上記酵素反応の反応時間は、多糖類含有試料中に存在するβ−１，３−１，６−グルカンがグルコースまで十分に分解される時間とする。即ち、当該反応時間は、反応混合液に含まれるβ−１，３−１，６−グルカンの濃度、菌体外酵素液に含まれるβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼの力価、反応温度などにも依存するので、具体的には予備実験で反応混合液中へ数時間おきに数回菌体外酵素液を加えつつ生成されるグルコース量を経時的に測定し、酵素反応によりグルコースが新たに生成されないことが確認できなくなった時間とすればよい。通常は、β−１，３−１，６−グルカンを十分に分解するために一晩反応させることが好ましいが、菌体外酵素液量によっては２時間以上、１０時間以下程度の短時間にて反応を終了させることも可能である。
【００３４】
本発明で用いるＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌としては、Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ Ｈ１株（以下、単に「Ｈ１株」という）が好適である。Ｈ１株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ） 受領機関の名称およびあて名
名称： 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
あて名： 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（ｉｉ） 受領日： 平成２０年（２００８年）８月１２日
（ｉｉｉ） 受領番号： ＮＩＴＥ ＡＰ−６２９
【００３５】
Ｈ１株をＷｉｃｈｅｒｈａｍ寒天培地上で生育させた場合には、培養初期で白色のコロニーを形成し、成熟するにしたがって徐々に乳白色から黄色になる。また、光学顕微鏡を用いて観察した形態的特徴は、以下の通りである。即ち、幅０．７〜１．０μｍ、長さ１．０〜４．０μｍのグラム陰性桿菌で、運動性とカタラーゼ活性を示す。以上の形態的特徴は、Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種に属する細菌に当てはまる。Ｈ１株は好気性であり、３０℃で良好に生育し、中性（ｐＨ６．８〜７．０）の培地で良好に増殖する。よって、Ｈ１株を培養する際の温度は、２５℃以上、３５℃以下程度が好適で、中性付近での培養が好適である。
【００３６】
従来、β−１，３−グルカナーゼを菌体外へ放出する一方で、その他のβ−グルカナーゼやα−グルコシダーゼを実質的に放出しない菌は知られていなかった。よって、本発明に係るＨ１株は新規なものである。
【００３７】
本発明で用いるＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌としては、Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株（以下、単に「ＳＹ２６株」という）が好適である。ＳＹ２６株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ） 受領機関の名称およびあて名
名称： 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
あて名： 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（ｉｉ） 受領日： 平成２０年（２００８年）７月２９日
（ｉｉｉ） 受領番号： ＮＩＴＥ ＡＰ−６１６
【００３８】
ＳＹ２６株をＷｉｃｈｅｒｈａｍ寒天培地で生育させた場合には、培養初期で白色コロニーを形成し、成熟するにしたがって徐々にベージュから灰色のコロニーへと変化する。光学顕微鏡を用いて観察した形態的特徴は、以下の通りである。即ち、培地基質中において無色透明の基生菌糸が観察され、その直径は０．８〜１．５μｍであり、菌糸は直線状で分岐しており、成熟するとその先端が切断されて胞子を形成する。胞子表面にはシワがなく、楕円形もしくは長楕円であり、その大きさは直径０．５〜１．０μｍ、長さは１μｍ〜４μｍである。さらに、前記培地で生育した本菌では、胞子嚢、運動性の胞子、分節胞子は確認されず、メラニン生成は陰性である。以上の形態的特徴は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種に属する担子菌に当てはまる。
【００３９】
また、ＳＹ２６株は好気性であり、３０℃で良好に生育し、中性（ｐＨ６．８〜ｐＨ７．０）の培地で良好に増殖した。よって、ＳＹ２６株を培養する際の温度は、２５℃以上、４０℃以下程度が好適で、中性付近での培養が好適である。
【００４０】
従来、β−１，６−グルカナーゼを菌体外へ放出する一方で、その他のβ−グルカナーゼやα−グルコシダーゼを実質的に放出しない菌は知られていなかった。よって、本発明に係るＳＹ２６株は新規なものである。
【００４１】
上記菌体外酵素液による反応後、β−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼの作用により生じたグルコースの量を測定する。
【００４２】
本発明に係るβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼは、それぞれβ−１，３−グルコシド結合とβ−１，６−グルコシド結合を特異的に切断する。よって、上記菌体外酵素液により、多糖類含有試料中に存在するβ−１，３−１，６−グルカンは選択的にグルコースまで分解されるので、測定されたグルコース量から、β−１，３−１，６−グルカンの量を把握することができる。
【００４３】
具体的には、生成したグルコースの量は、例えばＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法（M．Somogyi，J．Biol．Chem．，195，p．19（1952）を参照）など遊離の還元糖を測定する方法により測定することが可能である。また、酵素法やＨＰＬＣなどでも測定可能である。酵素法としては、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとヘキソキナーゼを組み合わせたＧ６ＰＤＨ−ＨＫ法（Ｆ−キット，Ｒｏｃｈｅ社製）や、ムタロターゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせたムタロターゼ・ＧＯＤ法（グルコースＣＩＩ−テストワコー，Ｗａｋｏ社製）がある。また、ＨＰＬＣ分析用のカラムとしてはＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｇａｒ ＡＸＧ（東ソー社製）やＳｕｇａｒ−ＰａｋＴＭＩ（Ｗａｔｅｒｓ社製）など、グルコースを分析するのに適したカラムが多数存在するので、これを利用できる。
【００４４】
本発明に係るβ−１，３−１，６−グルカンの定量用キットは、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液またはその乾燥物；β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液またはその乾燥物；並びに、
グルコース量測定用試薬；を含むことを特徴とする。
【００４５】
上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液と上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液は、本発明方法で用いるものと同様のものとすることができる。また、それらの乾燥物は、当該菌体外酵素液を乾燥したものであればよい。但し、上述したようにβ−１，３−グルカナーゼとβ−１，６−グルカナーゼは高温で失活するために、上記Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌由来の菌体外酵素液は６０℃以下で、上記Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌由来の菌体外酵素液は４５℃以下で乾燥することが好ましい。
【００４６】
グルコース量の測定用試薬としては、例えば、生じたグルコース量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法で測定する場合には、Ｓｏｍｏｇｙｉ試薬とＮｅｌｓｏｎ試薬、或いはこれらを調製するための化合物を挙げることができる。また酵素法を用いる場合には例えば、生じたグルコース量を酵素法で測定する場合にはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとヘキソキナーゼを組み合わせたＧ６ＰＤＨ−ＨＫ法（Ｆ−キット，Ｒｏｃｈｅ社製）や、ムタロターゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせたムタロターゼ・ＧＯＤ法（グルコースＣＩＩ−テストワコー，Ｗａｋｏ製）に類する試薬または、或いはこれらを調製するための化合物を挙げることができる。
【００４７】
当該キットは、本発明に係るβ−１，３−１，６−グルカンの定量方法で用いることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４９】
実施例１ β−１，３−グルカナーゼ産生菌の単離
高知大学農学部内から土壌試料を採取した。当該土壌試料（５ｇ）に滅菌水（１５ｍＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて攪拌した。次いで、当該混合物を数分間静置し、上清（５０μＬ）をマイクロピペッターで採取した。
【００５０】
別途、カードラン（β−１，３−グルカン、２ｇ）を水道水（２００ｍＬ）に懸濁し、オートクレーブで１２１℃、２０分間処理した。これをミキサーにかけ、生じたゲルを完全にすり潰した。これにポリペプトン（０．１２５ｇ）と酵母エキス（０．１２５ｇ）を溶解し、水道水を加えて５００ｍＬにメスアップした。さらに１０ｇの寒天を加え、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌処理し、シャーレ上で固めることによって、カードラン平板培地を調製した。また、デンプン培地（０．４％デンプン、０．０２５％ポリペプトン、０．０２５％酵母エキス、２％寒天、ｐＨ７．０）も調製した。
【００５１】
上記上清をカードラン平板培地に蒔き、スプレッダーで広げた後、３０℃で１日間培養した。４８０の菌株を単離し、同平板培地に植菌してさらに３０℃で２日間培養した。この培地を０．１％コンゴーレッド溶液で２〜３時間染色した後、流水中で２時間脱色してハロの形成を確認したところ、１菌株のみがハロを形成した。当該菌株をデンプン平板培地に塗布し、３０℃で１日間培養した。この培地をヨウ素溶液で２〜３時間染色した後（中村道徳・貝沼圭二編，「生物化学実験法 １９ 澱粉・関連糖質実験法」学会出版センターを参照）、流水中で２時間脱色したが、ハロの形成は確認されなかった。カードラン平板培地で培養後のコンゴーレッド染色写真を図１に、デンプン培地で培養後のヨウ素染色写真を図２に示す。
【００５２】
図１〜２のとおり、上記菌株はβ−１，３−グルカンの分解活性を示すのに対してデンプン（α−１，４−１，６−グルカン）に分解活性を示さないことから、β−１，３−グルカナーゼを産生する一方でα−グルコシダーゼは産生しないと考えられた。この菌株をＨ１株と仮に命名し、以後の実験に用いた。
【００５３】
実施例２ Ｈ１株の顕微鏡観察
上記実施例１で得たＨ１株を顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製、製品名「ＢＨ−２」）で１０００倍に拡大し、観察した。拡大写真を図３に示す。
【００５４】
図３のとおり、Ｈ１株は幅０．７〜１．０μｍ、長さ１．０〜４．０μｍの桿菌であった。また、Ｈ１株はグラム陰性であり、カタラーゼ活性を示した。
【００５５】
実施例３ Ｈ１株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析
（１） ポリメラーゼ連鎖反応
上記実施例１で得たＨ１株の属種を決定するために、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を解析した。具体的には、先ず１０×ＥｘＴａｑ緩衝液（５μＬ）、ｄＮＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰを各２．５ｍＭ含む混合液（８μＬ）、配列番号１〜２の各プライマーの５ｐｍｏｌ／μＬ溶液（各１μＬ）を混合し、全量が４９．５μＬとなるように滅菌水に加えた。別途、ＭＯ ＢＩＯ社製のUltra Clean Microbial DNA Isolation Kitを用いてＨ１株のゲノムＤＮＡ溶液を得た。当該ゲノムＤＮＡ溶液（１μＬ）か、或いは滅菌した爪楊枝によりＨ１株のコロニーから取得した少量の菌体を、上記溶液に加えて反応混合液とした。ポリメラーゼ連鎖反応には、ＤＮＡサーマルサイクラー（宝酒造社製）を使用した。反応条件は、以下のとおりである。
・ 熱変性 − ９４℃，５分間
・ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造社製，２．５Ｕ）の添加
・ 熱変性 − ９４℃，４５秒間
・ プライマーのアニーリング − ５５℃，１分間
・ ＤＮＡ鎖の伸長反応 − ７２℃，２分間
・ ２回目の熱変性以降のステップを３５サイクル繰り返す
・ 熱処理 − ７２℃，７分間
【００５６】
（２） １６ＳｒＤＮＡ断片の分離
上記ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された１６ＳｒＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動により分離した。電気泳動に用いるアガロースゲルは、Ｓｅａ Ｋｅｍ ＧＴＧ アガロース（ＦＭＣ）の１．５％溶液から調製した。泳動バッファーとしては、Ｈｏｗｌｙ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２０ｍＭ酢酸ナトリウム，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．８）を用いた。分子量マーカーには、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで処理したλＤＮＡを使用した。
【００５７】
電気泳動後、アガロースゲルを１μｇ／ｍＬの臭化エチジウム溶液に１０分間浸して染色することによりＤＮＡを可視化し、紫外線を照射して写真撮影を行った。撮影後、目的の大きさと一致するバンドの部分を滅菌済みのかみそりで切り出し、メンブレンフィルター付きマイクロチューブ（宝酒造社製，ＳＵＰＲＥＣTM−０１）に入れ、完全に凍結させた。３７℃で５分間静置して融解した後、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、２００μＬのＴＥ緩衝液（０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を加え、さらに１０分間遠心分離した。２倍量の冷却エタノールと１／２０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１時間静置した。その後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、エタノールを除去し、吸引乾燥することにより１６ＳｒＤＮＡ断片を含む混合物を得た。
【００５８】
（３） １６ＳｒＤＮＡ断片の塩基配列の決定
ポリメラーゼ連鎖反応により１６ＳｒＤＮＡ断片を増幅した上で、その塩基配列を解析した。具体的には、鋳型ＤＮＡ（４μＬ）、５ｐｍｏｌ／μＬプライマー溶液（１μＬ）、ＢｉｇＤｙｅターミネーターｖｅｒ．３．１ ５×シーケンシング緩衝液（１．５μＬ）、ＢｉｇＤｙｅターミネーターｖｅｒ．３．１（１μＬ）を混合し、滅菌水で全量を１０μＬにし、これを反応液とした。当該反応液に上記（２）で得た混合物を加え、下記反応条件でポリメラーゼ連鎖反応を行った。
・ 熱変性 − ９６℃，１分間
・ 熱変性 − ９６℃，１０秒間
・ プライマーのアニーリング − ５０℃，５秒間
・ ＤＮＡ鎖の伸長反応 − ６０℃，４分間
・ ２回目の熱変性以降のステップを２５サイクル繰り返す
【００５９】
次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用い、冷却した反応混合液から１６ＳｒＤＮＡ断片を精製した。得られた１６ＳｒＤＮＡ断片にＨｉ−Ｄｉホルムアミド（１０μＬ）を加え、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００−Ａｖａｎｔ ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステム社製）により塩基配列を解析した。当該塩基配列を配列表の配列番号３に示す。
【００６０】
得られた１６ＳｒＤＮＡ塩基配列は、Ｍ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列と高い相同性を示すものであったことから、Ｈ１株はＭ．ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種に属するものであると判断した。
【００６１】
実施例４ Ｈ１株由来の粗酵素液の基質特異性
（１） Ｈ１株由来の粗酵素液の調製
試験管内で、７ｍＬのＷｉｃｈｅｒｈａｍ培地（０．５％ペプトン，０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス，１．０％グルコース，ｐＨ７．０）を作成した。当該培地に白金耳でＨ１株を植菌し、３０℃で１日間振とう培養した。別途、生パン酵母培地（４．０％生パン酵母（協和発酵社製，ダイヤイースト））を調製し、当該培地に前培養したＨ１株を移し、３０℃で２日間培養した。当該培養液を遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）し、沈殿が入らないよう上清を得た。この上清へ終濃度が０．１ｍＭになるようにPhenylmethylsulfonyl fluoride（和光純薬社製，以下、「ＰＭＳＦ」と省略する）を加え、撹拌・氷冷しながら、乳鉢で粉砕した硫酸アンモニウムを飽和濃度の８０％となるように加えた。撹拌・氷冷しながら一晩静置後、遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）し沈殿を得た。得られた沈殿を、０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む少量の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した。これを透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ,ｉｎｃ製）に入れ、２Ｌの同緩衝液を用いて透析することにより粗酵素液を得た。
【００６２】
（２） 粗酵素液の活性測定
前項で得た粗酵素液と様々なグルカン基質を反応させ、生成した還元糖を検出することによりグルカナーゼ活性を測定した。具体的には、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に、黒酵母β−グルカン（Aureobasidium sp.由来，株式会社ソフィより提供）、パスツラン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、リケナン（シグマ社製）、ラミナリン（Eisenia araborea由来，半井化学薬品社製）、ラミナラン（Laminaria由来，東京化成工業社製）、カードラン（和光純薬社製）、セルロース（ＮＩＨＯＮＢＡＳＨＩ社製）、ルテオース（高知大農学部応用微生物学研究室より提供）、デンプン（和光純薬社製）、デキストラン（和光純薬社製）、プルラン（半井化学薬品社製）をそれぞれ１０ｇ／Ｌになるように溶解した。完全に溶解させるために、リケナンは熱湯中で煮沸し、また、パスツランはオートクレーブにより１２１℃で５分間高圧加熱した。なお、基質濃度はすべて０．５％に調整し、粗酵素溶液を加えてから３０℃で１時間反応させた。反応後、５分間煮沸し、生成した還元糖量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法にて測定した（M．Somogyi，J．Biol．Chem．，195，p．19（1952）を参照）。
【００６３】
詳しくは、ＫＮａＣ4Ｈ4Ｏ6・４Ｈ2Ｏ（４．０ｇ）、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ（７．１ｇ）、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（０．８ｇ）、１Ｍ ＮａＯＨ（１０ｍＬ）およびＮａ2ＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（１８．０ｇ）を蒸留水（１００ｍＬ）に溶解し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで当該溶液を濾過し、得られた濾液をＳｏｍｏｇｙｉ試薬とした。また、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ（５．０ｇ）、Ｈ2ＳＯ4（４．２ｇ）およびＮａ2ＨＡｓＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．６ｇ）を蒸留水（１００ｍＬ）に溶解し、２４時間インキュベートした。次いで当該溶液を濾過し、得られた濾液をＮｅｌｓｏｎ試薬とした。上記酵素反応溶液（１ｍＬ）にＳｏｍｏｇｙｉ試薬（１ｍＬ）を加え、湯鍋中にて正確に１０分間反応させた後、即座に流水中で５分間水冷した。当該溶液にＮｅｌｓｏｎ試薬（１ｍＬ）と蒸留水（２ｍＬ）を加え、室温にて約１０分間静置後、分光光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製，ＵＶ−１２００）を用いて５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、標準物質はグルコースを用いた。また、３０℃で１時間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。結果を表１に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
上記結果のとおり、Ｈ１株から得られた粗酵素液は、β−１，３−グリコシド結合を含む黒酵母β−グルカン、ラミナリン、ラミナラン、リケナンおよびカードランに対して高い活性を示した。その一方で、β−１，６−グリコシド結合のみからなるパスツランとルテオースに対する活性は見られなかった。さらに、α−グルカンであるプルランに対する活性が観察されたものの、その比活性は低いものであった。
【００６６】
以上の結果から、Ｈ１株由来の粗酵素液は、β−１，３−グリコシド結合を特異的に切断するβ−１，３−グルカナーゼを含む一方で、その他のβ−グルカナーゼを含まず、また、わずかにα−グルコシダーゼ活性を示すものの、デンプンとデキストランを分解できないことから、その活性は極めて低いことが明らかにされた。
【００６７】
実施例５ Ｈ１株由来の菌体外酵素液の調製
（１） Ｈ１株由来の粗酵素液の調製
上記実施例４（１）と同様に、Mitsuaria chitosanitabida Ｈ１株をＷｉｃｈｅｒｈａｍ培地（７０ｍＬ）で前培養した後、生パン酵母培地（１Ｌ）で本培養した。当該培養液を遠心分離（９，１００ｒｐｍ，２０分間，４℃）し、沈殿が入らないようにして上清を得た。この上清に１／１，０００量の０．１Ｍ ＰＭＳＦと、１／５，０００量の消泡剤を加え、エバポレーターで全量の約１／１０量まで減圧濃縮した。次いで、終濃度が２０ｍＭになるようにリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、撹拌・氷冷しながら、乳鉢で粉砕した硫酸アンモニウムを加えていき沈殿物を分離することにより、０〜２０％画分、２０〜４０％画分、４０〜６０％画分、６０〜８０％画分を得た。各画分を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で透析後、β−１，３−グルカナーゼ活性を測定し、また、全タンパク質を定量した。詳しくは、E．araborea由来のラミナリンに酵素液を加え、３０℃で１時間反応させた後、生じた還元糖量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法により定量することにより全活性と比活性を測定した。また、タンパク質はＬｏｗｒｙ法（Lowry，O．H．ら，J．Biol．Chem．，193，pp．265-275（1951）を参照）により定量した。結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】
上記結果のとおり、全活性は６０〜８０％飽和画分で最も高く、比活性は２０〜４０％飽和画分で最も高かった。それに対して、０〜２０％飽和画分は全活性と比活性が低かった。よって、以後の実験では２０〜８０％飽和画分を用いた。
【００７０】
（２） Ｈ１株由来の菌体外酵素液の調製
０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を使って、上記で得た粗酵素液の２０〜８０％飽和画分を透析した後、遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）したところ、ゲル状の沈殿が生じた。上記実施例４（２）と同様の方法により、Ｅ．ａｒａｂｏｒｅａ由来のラミナリンを基質として、生じたゲル状沈殿と上清のそれぞれのグルカナーゼ活性を測定したところ、ゲル状沈殿に非常に高い活性が見られた。当該ゲル状沈殿を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁してから遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）する操作を繰り返すことにより洗浄した。洗浄した粗酵素液の基質特異性に変化がないかを調べるために、上記実施例４（２）と同様の実験を再び行った。結果を表３に示す。
【００７１】
【表３】
【００７２】
表３に示す結果のとおり、得られた菌体外酵素液はβ−１，３−グリコシド結合を有する基質に対しては作用する一方で、α−１，４−グリコシド結合、α−１，６−グリコシド結合、β−１，４−グリコシド結合およびβ−１，６−グリコシド結合には作用しない。よって、当該Ｈ１株由来の菌体外酵素液は、β−１，３−グリコシド結合を特異的に切断する一方で、α−グルコシダーゼ活性やその他のβ−グルカナーゼ活性を有しないことが実証された。なお、当初はカラムクロマトグラフィによりさらに精製を進めてその酵素学的性質を調べる予定であったが、精製酵素液がゲル状であるためかかる精製は行うことができなかった。
【００７３】
実施例６ Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの至適温度
上記実施例５（２）で得た菌体外酵素液を用い、反応温度を２０〜７０℃に変更した以外は上記実施例５（１）と同様にして比活性を測定し、Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの至適温度を調べた。結果を図４に示す。
【００７４】
図４のとおり、Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの至適温度は４０℃であり、活性は５０℃から徐々に下がり始め、７０℃では活性はほとんど失われることが分かった。
【００７５】
実施例７ Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの熱安定性
上記実施例５（２）で得た菌体外酵素液を３０〜７０℃で１５分間処理した後に、氷上で急冷した。当該溶液を用い、上記実施例５（１）と同様にして比活性を測定し、Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの熱安定性を調べた。結果を図５に示す。
【００７６】
図５のとおり、Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼは５０℃までは高い安定性を示すが、７０℃では完全に失活することが分かった。
【００７７】
実施例８ Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの反応生成物の同定
β−１，３−グルカンであるカードランに、上記実施例５（２）で得た菌体外酵素液を上記実施例４（２）と同様の反応条件で作用させ、反応混合液を経時的に分取し、反応生成物を薄層クロマトグラフィで分析した。具体的には、反応開始から０、１、２、４、２４時間後に反応混合液を分取し、沸騰水で１０分間加熱処理して酵素反応を止めた後、HPTLC Fertigplatten Kieselgel 60（Ｍｅｒｃｋ社製，１０ｃｍ×１０ｃｍ）を用いた薄層クロマトグラフィに供した。標準物質として１％グルコースを用い、展開溶媒にはｎ−ブタノール：エタノール：水＝５：２：２の混合溶媒を用い、上昇法で行った。展開後、発色液として、ジフェニルアミン−アニリン−リン酸（２ｇジフェニルアミン，２ｍＬアニリン，１００ｍＬアセトン，１５ｍＬ ８０％リン酸）をゲルプレート上に噴霧し、乾熱器中、１００℃で１０分間加熱し、出現したスポットを観察した。結果を図６に示す。図６中、「Ｇ３」はカードランを示し、「Ｇ１」はグルコース２分子がβ−１，６結合したゲンチオビオースであり、「Ｇ０」はグルコースである。
【００７８】
図６のとおり、Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼによる反応の最終生成物はグルコースであり、その生成量は経時的に増加した。よって、Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼは、β−１，３−グルカンを構成単糖であるグルコースまで分解できるＳタイプの酵素であることが確認された。
【００７９】
実施例９ β−１，６−グルカナーゼ産生菌の単離
高知大学農学部内から土壌試料を採取した。当該土壌試料（５ｇ）に滅菌水（１５ｍＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて攪拌した。次いで、当該混合物を数分間静置し、上清（５０μＬ）をマイクロピペッターで採取した。当該上清をパスツラン平板培地（０．１％パスツラン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製，０．０２５％ポリペプトン、０．０２５％酵母エキス、２％寒天、ｐＨ７．０）に蒔き、スプレッダーで広げた後、３０℃で２日間培養した。１８０の菌株を単離し、同平板培地に植菌してさらに３０℃で４日間培養した。この培地を０．１％コンゴーレッド溶液で２〜３時間染色した後（Andres Solerら，Journal of microbiological methods，35，pp．245-251（1999）を参照）、流水中で２時間脱色した。さらに２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に一晩浸すことでコンゴーレッドを変色させた後、ハロの形成を確認した。培地の写真を図７に示す。
【００８０】
図７の結果のとおり、１８０の菌株中１菌株のコロニー周辺にハロらしきものが認められた。即ち、この菌株はβ−１，６−グルカンであるパスツランに対する分解活性を示すことから、β−１，６−グルカナーゼを産生していると考えられる。この菌株をＳＹ２６と命名し、以後の実験に用いた。
【００８１】
実施例１０ ＳＹ２６株の顕微鏡観察
上記実施例９で得たＳＹ２６株を顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製、製品名「ＢＨ−２」）で１０００倍に拡大し、観察した。拡大写真を図８に示す。
【００８２】
図８のとおり、ＳＹ２６株は無色透明の基生菌糸を形成する。菌糸の直径は０．８〜１．５μｍであり、直線状で分岐していた。また、当該菌糸は、成熟するとその先端が切断されて胞子を形成した。胞子表面にはシワがなく、楕円形もしくは長楕円であり、その大きさは直径０．５〜１．０μｍ、長さは１μｍ〜４μｍであった。さらに、ＳＹ２６株では、胞子嚢、運動性の胞子、分節胞子は確認されず、メラニン生成は陰性である。
【００８３】
実施例１１ ＳＹ２６株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析
上記実施例３と同様にして、ＳＹ２６株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を解析した。当該塩基配列を配列表の配列番号４に示す。
【００８４】
得られた１６ＳｒＤＮＡ塩基配列は、Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列と高い相同性を示すものであったことから、ＳＹ２６株はＳ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種に属するものであると判断した。
【００８５】
実施例１２ ＳＹ２６株由来の粗酵素液の基質特異性
本培養期間を６日間とした以外は上記実施例４（１）と同様にして、ＳＹ２６株の培養液から粗酵素液を得た。さらに上記実施例４（２）と同様にして、当該粗酵素液の活性を測定した。結果を表４に示す。
【００８６】
【表４】
【００８７】
上記結果のとおり、ＳＹ２６株から得られた粗酵素液は、β−１，６−グリコシド結合を含む黒酵母β−グルカン、ラミナリン、パスツランおよびルテオースに対して高い活性を示した。それに対して、β−１，６−グリコシド結合を含まず且つβ−１，３−グリコシド結合を含むリケナンとカードランに対する活性は見られなかった。さらに、α−グルコシダーゼ活性は見られなかった。
【００８８】
以上の結果から、ＳＹ２６株の粗酵素液は、β−１，６−グリコシド結合を特異的に切断できる一方で、α−グルコシダーゼ活性とその他のβ−グルカナーゼ活性を有しないことが明らかにされた。
【００８９】
実施例１３ ＳＹ２６株由来の菌体外酵素液の調製
（１） ＳＹ２６株由来の粗酵素液の調製
上記実施例４（１）と同様に、Ｓ．ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株をＷｉｃｈｅｒｈａｍ培地（１４ｍＬ）で前培養した後、生パン酵母培地（２００ｍＬ）で本培養した。当該培養液から上記実施例５（１）と同様にして０〜２０％画分、２０〜４０％画分、４０〜６０％画分、６０〜８０％画分を得た。また、基質としてラミナリンの代わりにパスツランを用いた以外は上記実施例５（１）と同様にして、β−１，６−グルカナーゼ活性を測定し、また、全タンパク質を定量した。結果を表５に示す。
【００９０】
【表５】
【００９１】
上記結果のとおり、全活性は２０〜４０％飽和画分で最も高く、比活性は４０〜６０％飽和画分で最も高かった。６０〜８０％飽和画分もわずかに活性を示したが、全活性と比活性の値が共に低かったため、以後の実験では２０〜６０％飽和画分を用いた。
【００９２】
（２） β−１，６−グルカナーゼの精製
３５ｍＬのＷｉｃｈｅｒｈａｍ培地でＳＹ２６株を前培養した後に５００ｍＬの生パン酵母培地で本培養した以外は上記実施例１３（１）と同様にして、培養液の２０〜６０％飽和画分を得た。
【００９３】
０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を使って、上記で得た粗酵素液の２０〜６０％飽和画分を透析した後、透析中に生じた沈殿物を遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）で取り除いたものを菌体外酵素液とし、上記実施例１３（１）と同様に活性測定を行った。また、全タンパク質量をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社製）により定量した。上記菌体外酵素液の全活性は４０．９ｕｎｉｔ、全タンパク質量は３．２４ｍｇ、比活性は３．８９ｕｎｉｔ／ｍｇであった。
【００９４】
上記菌体外酵素液を、さらにゲル濾過クロマトグラフィにより精製した。具体的には、０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＰ−セファデックス Ｃ−５０ カラム（ファルマシア社製，３．０×３０ｃｍ）に上記粗酵素液を供した。非吸着タンパク質は同緩衝液で溶出させ、吸着タンパク質は０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む同緩衝液でリニアグラジエントにより溶出させ、５ｍＬ毎にフラクションを分取した。各フラクションの比活性を測定し、活性の高いフラクションを集めてアミコンメンブレンフィルターで６ｍＬに濃縮した。０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で透析後、透析中に生じた沈殿物を遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）で取り除いた。上記と同様にして活性測定とタンパク定量を行ったところ、全活性は２９．８ｕｎｉｔ、全タンパク質量は２．２３ｍｇ、比活性は１３．３ｕｎｉｔ／ｍｇであった。
【００９５】
上記酵素液を、さらにイオン交換クロマトグラフィで精製した。詳しくは、０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｍカラム（東ソー株式会社，３．０×３０ｃｍ）に上記酵素液を供した。タンパク質を同緩衝液で溶出させ、５ｍＬ毎にフラクションを分取し、活性の高いフラクションを集めた。当該酵素液の全活性は１８．３ｕｎｉｔ、全タンパク質量は０．３１ｍｇ、比活性は５８．２ｕｎｉｔ／ｍｇであった。
【００９６】
上記酵素液をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐで約１ｍＬまで濃縮し、さらにＭｉｃｒｏｃｏｎを用いて５０μＬまで濃縮した後、ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｄｕｏ Ｆｌｏｗ（バイオラッド製）を用いたＦＰＬＣで精製した。具体的には、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＨＲ １０／３０ カラムに濃縮した酵素液を供した。同緩衝液を通液し続けてタンパク質を溶出させて０．５ｍＬ毎に分取し、活性の高いフラクションを集めてこれを精製酵素液とした。上記と同様にして当該精製酵素液の活性測定とタンパク定量を行ったところ、全活性は３．６５ｕｎｉｔ、全タンパク質量は０．０１ｍｇ、比活性は３８６ｕｎｉｔ／ｍｇであった。
【００９７】
以上の各精製段階における全タンパク質量などのデータを、表６にまとめる。
【００９８】
【表６】
【００９９】
また、上記各精製段階の酵素液を、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（U．K．Laemmli，Nature，277，pp．680-685（1970）を参照）に従って分析した。電流は、濃縮ゲル時は１０ｍＡ、分離ゲル時は２０ｍＡとした。また、分子質量測定の際のマーカーとして、ミオシン（２００ｋＤ）、β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤ）、卵白アルブミン（４５ｋＤ）、炭酸脱水酵素（３１ｋＤ）、トリプシン阻害剤（２１．５ｋＤ）、リゾチーム（１４．４ｋＤ）、アプロチニン（６．５ｋＤ）からなるタンパク質マーカー（ナカライテスク社製）を用いた。泳動終了後は、０．２５％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０を含むメタノール：酢酸：水＝５：１：８８の混合溶液にゲルを浸し、振とうしながら５０℃で３０分間染色した。その後、メタノール：酢酸：水＝５：７：８８の混合溶液に浸し、振とうしながら５０℃で脱色した。脱色したゲルは、デジタルカメラを用いて画像を保存し、ゲル乾燥機で乾燥させて保存した。結果を図９に示す。
【０１００】
図９のとおり、最終的に得られた精製酵素液中には、分子質量が１０ｋＤのタンパク質のみが含まれていることが分かる。
【０１０１】
実施例１４ ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの至適温度
上記実施例１３（２）で得たＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＨＲ １０／３０ カラム溶出画分である精製酵素液を用い、反応温度を１０〜６０℃に変更した以外は上記実施例１３（１）と同様にして比活性を測定し、ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの至適温度を調べた。結果を図１０に示す。
【０１０２】
図１０のとおり、ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの至適温度は３０℃であり、４０℃では３０℃の場合の８３％の活性を示したが、５０℃以上になると活性は急激に失われることが分かった。
【０１０３】
実施例１５ ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの熱安定性
上記実施例１３（２）で得たＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＨＲ １０／３０ カラム溶出画分である精製酵素液を２０〜６０℃で１５分間処理した後に、氷上で急冷した。当該溶液を用い、上記実施例１３（１）と同様にして比活性を測定し、ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの熱安定性を調べた。結果を図１１に示す。
【０１０４】
図１１のとおり、ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼは３０℃までは高い安定性を示し、４０℃では３０℃の場合の約８０％の活性を示したが、５０℃では失活することが分かった。
【０１０５】
実施例１６ ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの反応生成物の同定
β−１，６−グルカンであるパスツランに、上記実施例１３で精製したβ−１，６−グルカナーゼ含有溶液を上記実施例１３（１）と同様の反応条件で作用させ、反応混合液を経時的に分取し、反応生成物を薄層クロマトグラフィで分析した。結果を図１２に示す。図１２中、「Ｇ３」はパスツランを示し、「Ｇ１」はグルコース２分子がβ−１，６結合したゲンチオビオースであり、「Ｇ０」はグルコースである。
【０１０６】
図１２のとおり、ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼによる反応の最終生成物はグルコースであり、その生成量は経時的に増加した。よって、ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼは、β−１，６−グルカンを構成単糖であるグルコースまで分解できるＳタイプの酵素であることが確認された。
【０１０７】
実施例１７ β−１，３−１，６−グルカンの定量
天然由来のグルカン類としては、グルコースのみからなるホモグルカンであるα−グルカンとβ−グルカン、および他の糖と結合したヘテログルカンが存在する。従来方法は、これらグルカン類の内、α-グルカンを取り除いた残りの全てのグルカンを構成単糖まで分解してグルコースを定量するものであることから、有用なβ−１，３−１，６−グルカンのみを定量することはできなかった。
【０１０８】
一方、上記実験により、Ｈ１株とＳＹ２６株に由来する菌体外酵素液は、それぞれβ−１，３−グリコシド結合とβ−１，６−グリコシド結合を特異的に切断できることが実証されていることから、これら酵素液によりグルカンをグルコースまで完全に分解した後にグルコース量を測定すれば、事前にα−グルカンを分解除去しなくてもβ−１，３−１，６−グルカンを正確に定量できると期待できる。
【０１０９】
そこで、先ず、本発明に係る２種の菌体外酵素液を使って、天然由来のグルカン中のβ−１，３−１，６−グルカンを定量し、次に、当該グルカンからα−グルカンを除去した上で同様の操作を行い、両結果を比較することで、本発明方法の効果を評価した。
【０１１０】
（１） 多糖標品の調製
Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ ＡＦＯ２０２株の培養液（ソフィ社より提供，３ｇ）に蒸留水（２７ｍＬ）を加えて１０倍希釈培養液を作成した。これを遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）し、得られた上清（７ｍＬ）に２倍量のエタノールを加え、よく撹拌して多糖を沈殿させた。さらに、遠心分離（１８，０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）後、上清を捨て、沈殿物をエタノール臭がしなくなるまで風乾した。風乾後、沈殿物を１４ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、これを多糖標品とした。
【０１１１】
フェノール硫酸法（Dubois，M．ら，Anal．Chem．，28，p．350（1956）を参照）を用い、上記多糖標品に含まれる全多糖量を測定した。具体的には、上記多糖標品（５００μＬ）と蒸留水（５００μＬ）とを混合し、さらに５％フェノール（１ｍＬ）を加えた。ここへ硫酸（５ｍＬ）を加え、室温で１０分間冷却した。当該混合液を流水で２０分間冷却した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、多糖量を定量したところ、全多糖量は３．８０ｇ／Ｌであった。
【０１１２】
（２） 試料中にα−グルカンが含まれる場合
上記（１）で得た多糖標品（５００μＬ）に、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０，５０μＬ）、Ｈ１株由来の菌体外酵素液（２２５μＬ）およびＳＹ２６株由来の菌体外酵素液（２２５μＬ）を混合し、４０℃で６時間インキュベートした。なお、使用したＨ１株由来の菌体外酵素液の活性はラミナリン（Ｅ．ａｒａｂｏｒｅａ由来）に対して２．２ｕｎｉｔであり、ＳＹ２６株由来の菌体外酵素液の活性はパスツランに対して１．４ｕｎｉｔと、上記多糖標品中のグルカンを完全に分解するに十分である。
【０１１３】
上記酵素反応後における反応混合液について、Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法により還元糖量を測定した。結果を表７に示す。
【０１１４】
（３） 試料中にα−グルカンが含まれない場合
アミログルコシダーゼ（Rhizopus sp由来，シグマ社製）を０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．５）に１μｇ／ｍＬの濃度で溶解し、アミログルコシダーゼ溶液を得た。上記多糖標品（３．６ｍＬ）とアミログルコシダーゼ溶液（０．４ｍＬ）をファルコンチューブに入れ、５５℃で一晩インキュベートした。その後、５分間煮沸し、酵素反応を終了させた。このアミログルコシダーゼ処理で生じた還元糖をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法で定量し、α−グルカン量とした。この反応液（５００μＬ）にＨ１株由来の菌体外酵素液（２２５μＬ）およびＳＹ２６株由来の菌体外酵素液（２２５μＬ）を加え、４０℃で６時間反応させた。当該酵素反応後における反応混合液について、Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法により還元糖量を測定し、当該測定値から上記のα−グルカン量値を引いてβ−１，３−１，６−グルカン量とした。結果を表７に示す。
【０１１５】
【表７】
【０１１６】
α−グルカンを除去しない場合のβ−１，３−１，６−グルカン量は３．０９ｇ／Ｌであり、α−グルカンを除去した場合は３．１８ｇ／Ｌであって、この二つに大きな差はなかった。従って、本発明方法は、標品中にα−グルカンが存在したままでも正確にβ−１，３−１，６−グルカンを定量できることが分かった。
【０１１７】
実施例１８ β−１，３−１，６−グルカンの定量
上記実施例１７のとおり、本発明方法によれば標品中にα−グルカンが存在したままでも正確にβ−１，３−１，６−グルカンを定量できるが、反応溶液中のα−グルカン量がこれより多くなると、α−グルカンを除去しなければ正確にβ−１，３−１，６−グルカン量を正確に定量できない可能性もある。そこで、α−グルカンをより多く生産するA．pullulans １３２株の培養液を試料とし、同様の実験を行った。
【０１１８】
（１） 多糖標品の調製
Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ １３２株（寺尾啓吾（高知大学農学部生物資源科学科），「応用微生物学研究室卒業論文」（2006）を参照）を白金耳で一掻き取り、５ｍＬの米ヌカ含有液体培地（０．２％米ヌカ、０．２％アスコルビン酸、１％スクロース、ｐＨ５．２）に植菌し、２５℃、１２５ｒｐｍで４８時間振とうして前培養した。次いで、３０ｍＬ容の三角フラスコに１００ｍＬの米ヌカ含有液体培地を作成し、ここへ上記前培養液（１ｍＬ）を加え、２５℃、１２５ｒｐｍで７２時間振とうして本培養した。なお、米ヌカ含有液体培地は、多糖の生産を促進する。
【０１１９】
A．pullulans ＡＦＯ２０２株の培養液の代わりに上記本培養の培養液（３ｇ）を用いた以外は上記実施例１７（１）と同様にして、多糖標品を得た。当該多糖標品に含まれる多糖量を上記実施例１７（１）と同様の方法で定量したところ、３．０４ｇ／Ｌであった。
【０１２０】
（２） β−１，３−１，６−グルカンの定量
上記多糖標品について、α−グルカンを除去しない場合と除去した場合において、β−１，３−１，６−グルカンの量を上記実施例１７（２）〜（３）と同様に測定した。結果を表８に示す。
【０１２１】
【表８】
【０１２２】
上記結果のとおり、Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ １３２株の培養液に含まれるα−グルカンは、Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ ＡＦＯ２０２株の培養液に含まれるα−グルカンよりも多い。しかし、本発明方法により測定されるβ−１，３−１，６−グルカンの量は、α−グルカンを除去しない場合で０．９２ｇ／Ｌであり、α−グルカンを除去した場合は１．１０ｇ／Ｌであって、この二つに大きな差はなかった。
【０１２３】
上記実施例１７〜１８の結果から、Ｈ１株とＳＹ２６株にそれぞれ由来するβ−１，３−グルカナーゼおよびβ−１，６−グルカナーゼを用いた本発明方法によれば、試料中におけるα−グルカンの存在または非存在、そして混在するα−グルカンの存在量にかかわらず正確にβ−１，３−１，６−グルカンを定量できることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】実施例１において、土壌試料から単離された菌株をカードラン平板培地で培養した後、コンゴーレッド染色した写真である。
【図２】実施例１において、土壌試料から単離された菌株をデンプン培地で培養した後、ヨウ素染色した写真である。
【図３】実施例１で得たＨ１株の顕微鏡写真である。
【図４】反応温度とＨ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの活性との関係を示すグラフである。
【図５】Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼの活性と熱処理温度との関係を示すグラフである。
【図６】Ｈ１株由来のβ−１，３−グルカナーゼによるカードランの分解反応生成物の経時的変化を示す薄層クロマトグラフィの結果である。
【図７】実施例９において、土壌試料から単離された菌株をパスツラン平板培地で培養した後、コンゴーレッド染色した写真である。
【図８】実施例９で得たＳＹ２６株の顕微鏡写真である。
【図９】ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの各精製段階のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図中、１は分子量マーカーレーンを示し、２は２０〜６０％飽和硫安沈殿レーンを示し、３はゲル濾過クロマトグラフィによる精製後のレーンを示し、４はイオン交換クロマトグラフィによる精製後のレーンを示し、５はＦＰＬＣによる精製後のレーンを示す。
【図１０】反応温度とＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの活性との関係を示すグラフである。
【図１１】ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼの活性と熱処理温度との関係を示すグラフである。
【図１２】ＳＹ２６株由来のβ−１，６−グルカナーゼによるパスツランの分解反応生成物の経時的変化を示す薄層クロマトグラフィの結果である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類含有試料に、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液、並びにβ−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液を作用させる工程；および
生じたグルコースの量を測定する工程；
を含むことを特徴とする、β−１，３−１，６−グルカンの定量方法。
【請求項２】
上記Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌として、Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ Ｈ１株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６２９）を用いる請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
上記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６１６）を用いる請求項１または２に記載の定量方法。
【請求項４】
多糖類含有試料に、２０℃以上、４５℃以下で、上記Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液と上記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液とを同時に作用させる請求項１〜３の何れかに記載の定量方法。
【請求項５】
β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液またはその乾燥物；
β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液またはその乾燥物；並びに
グルコース量測定用試薬；
を含むことを特徴とする、β−１，３−１，６−グルカンの定量用キット。
【請求項６】
Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ Ｈ１株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６２９）。
【請求項７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６１６）。
【請求項１】
多糖類含有試料に、β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液、並びにβ−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液を作用させる工程；および
生じたグルコースの量を測定する工程；
を含むことを特徴とする、β−１，３−１，６−グルカンの定量方法。
【請求項２】
上記Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌として、Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ Ｈ１株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６２９）を用いる請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
上記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６１６）を用いる請求項１または２に記載の定量方法。
【請求項４】
多糖類含有試料に、２０℃以上、４５℃以下で、上記Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液と上記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液とを同時に作用させる請求項１〜３の何れかに記載の定量方法。
【請求項５】
β−１，３−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，３−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＭｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ種菌に由来する菌体外酵素液またはその乾燥物；
β−１，６−グルカナーゼの産生能を有し且つβ−１，６−グルカナーゼ以外のβ−グルカナーゼ活性およびα−グルコシダーゼ活性を示さないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ種菌に由来する菌体外酵素液またはその乾燥物；並びに
グルコース量測定用試薬；
を含むことを特徴とする、β−１，３−１，６−グルカンの定量用キット。
【請求項６】
Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ Ｈ１株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６２９）。
【請求項７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ ＳＹ２６株（ＮＩＴＥ ＡＰ−６１６）。
【図４】
【図５】
【図１０】
【図１１】
【図１】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１２】
【図５】
【図１０】
【図１１】
【図１】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１２】
【公開番号】特開２０１０−４１９５７（Ｐ２０１０−４１９５７Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０７９６７（Ｐ２００８−２０７９６７）
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年２月１３日に高知大学大学院農学研究科発行の２００７年度修士論文要旨において発表
【出願人】（５９４０６３４７４）株式会社ソフィ (3)
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年２月１３日に高知大学大学院農学研究科発行の２００７年度修士論文要旨において発表
【出願人】（５９４０６３４７４）株式会社ソフィ (3)
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]