β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法
【課題】オーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産させることができる方法を提供する。
【解決課題】グルコン酸、及び／又はアスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法。
【解決課題】グルコン酸、及び／又はアスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)を培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−グルカン（β−１，３−Ｄ−グルカン、β−１，６−Ｄ−グルカン、又はβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン）はキノコ（担子菌の子実体）に多く含まれる成分であり、子実体だけでなく、培養菌糸体にも含まれている。また、β−グルカンには免疫賦活活性、抗腫瘍活性があることも知られている。例えば、スエヒロタケ、カワラタケ、シイタケから抽出されたβ−グルカンが抗がん剤などの医薬品として販売されている（特開昭６１−１４６１９２号公報、特開昭６２−２０１９０１号公報）。
【０００３】
また、不完全菌であるオーレオバシジウム属微生物もβ−グルカンを菌体外に分泌生産することが知られている。このβ−グルカンが免疫賦活活性を有すること、腸内ビフィズス菌の増殖、便秘防止、免疫増強などの機能を果たす機能性食品や整腸剤等として利用できることが報告されている（特開昭６２−２０１９０１号公報、特開平６−３４０７１号公報、特開平５−３０８９８７号公報）。
【０００４】
オーレオバシジウム属微生物によるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの分泌生産量は培養条件により異なるため、効率よく生産できる条件を見出すことが求められている。
【０００５】
例えば、特許文献１は、オーレオバシジウム属微生物を、スクロース、及びアスコルビン酸を添加したツァペック培地のｐＨを４〜７に調整し、１０〜５０℃で培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを培地中に分泌生産させる方法を開示している。
【０００６】
また、特許文献２は、ｐＨ６．８〜８．５に制御した液体培地を用いてオウレオバシディウム属に属する微生物を培養し、所定の高分岐及び分子量を有する着色されていないβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産する方法を開示している。
【０００７】
また、特許文献３は、オウレオバシディウム・プルランス 財団法人発酵研究所寄託番号ＩＦＯ４４６６株を培養して高分岐β-グルカンを高生産させるために、培地成分中の炭素源について検討した結果を開示している。この文献によれば、β−グルカンが高生産された培地の炭素源はキシロースでありスクロース、フラクトースではない。
【０００８】
また、特許文献４は、グルコースとフラクトースとの混合物、又はスクロースを炭素源とした水性培地でオーレオバシディウム属に属する微生物を好気的発酵により培養することにより、β−１，３−グルカンが効率よく生産されることを開示している。この方法では、水性培地が酵母エキスを特定量含有しているためにβ−１，３−グルカン生産量が多くなる。
【０００９】
また、非特許文献１は、オウレオバシディウム属に属するＫ−１株に高分岐β−１，３−グルカンを生産させるに当たり、ツァペック培地にアスコルビン酸関連化合物を加えることにより高分岐β−１，３−グルカンの生産が促進されることを開示している。この文献は、Ｄ−グルコン酸を培地に添加した場合はグルカン生産量が殆ど変化しないことを教えている。
【００１０】
しかし、上記各文献に記載の培養方法では、オーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを実用上十分な程度に高生産させることはできない。
【特許文献１】特開２００４−３２１１７７号公報
【特許文献２】特開平９−５６３９１号公報
【特許文献３】特開平６−３４０７０１号公報
【特許文献４】特開平７−５１０８１号公報
【非特許文献１】Biosci. Biotech. Biochem., 57(8), 1348-1349,（1993）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、オーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産させることができる、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、オーレオバシジウム・プルランスを培養するに当たり、グルコン酸、及び／又はアスコルビン酸を用いてｐＨを３〜５に調整した培地を使用することにより、培地中に分泌されるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン量が非常に高くなることを見出した。
【００１３】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法を提供する。
【００１４】
項１． グルコン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法。
【００１５】
項２． 培地中のグルコン酸濃度を０．２〜１．２％（ｗ/ｖ）とすることによりｐＨを２．７〜６に調整する項１に記載の方法。
【００１６】
項３． グルコン酸に加えてアスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する項１又は２に記載の方法。
【００１７】
項４． 培地中のアスコルビン酸濃度を０．１％（ｗ/ｖ）以下とする項３に記載の方法。
【００１８】
項５． 培養開始時の培地中の酸が、実質的にグルコン酸、又はさらにアスコルビン酸のみである項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１９】
項６． 培養開始時の培地中にフラクトースが濃度１〜１０％（ｗ／ｖ）含まれる項１〜５のいずれかに記載の方法。
【００２０】
項７． 培養開始時の培地中の炭素源が、グルコン酸、又はさらにアスコルビン酸を除き、実質的にフラクトースのみである項６に記載の方法。
【００２１】
項８． オーレオバシジウム・プルランスが、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ−ＮＨ−１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８５）である項１〜７のいずれかに記載の方法。
【００２２】
項９． さらに、生産されたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを回収する工程を含む項１〜８のいずれかに記載の方法。
【００２３】
項１０． グルコン酸を０．２〜１．２％（ｗ/ｖ）含み、ｐＨ２．７〜６である培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法。
【００２４】
項１１． 培地中にアスコルビン酸が０．１％（ｗ/ｖ）以下の濃度で含まれる項１０に記載の方法。
【００２５】
項１２． 培養開始時の培地中の酸が、実質的にグルコン酸、又はさらにアスコルビン酸のみである項１０又は１１に記載の方法。
【００２６】
項１３． 培地中にフラクトースが合計濃度１〜１０％（ｗ／ｖ）含まれる項1０〜１２のいずれかに記載の方法。
【００２７】
項１４． 培地中の炭素源が、グルコン酸、又はさらにアスコルビン酸を除き、実質的にフラクトースのみである項１３に記載の方法。
【００２８】
項１５． オーレオバシジウム・プルランスが、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ−ＮＨ−１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８５）である項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
【００２９】
項１６． さらに、生産されたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを回収する工程を含む項１０〜１５のいずれかに記載の方法。
【００３０】
項１７． アスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法。
【００３１】
項１８． オーレオバシジウム・プルランスが、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ−ＮＨ−１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８５）である項１７に記載の方法。
【発明の効果】
【００３２】
本発明方法では、オーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させるに当たり、ｐＨ調整剤としてグルコン酸、及び／又はアスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整することにより、グルカンの収量が非常に高くなる。
【００３３】
また、ｐＨ調整剤としてグルコン酸を使用し、かつグルコン酸を除く炭素源がフラクトースであるときには、グルカンの収量が一層高くなる。また、ｐＨ調整剤としてアスコルビン酸を使用し、かつアスコルビン酸を除く炭素源がスクロースであるときには、グルカンの収量が一層高くなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）第１の方法
本発明の第１のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法は、グルコン酸を含み、ｐＨが２．７〜６程度である培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む方法である。
【００３５】
好ましくは、グルコン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む方法である。
微生物
微生物は、オーレオバシジウム・プルランスであればよく、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン生産量の多い任意の菌株を選択して使用すればよい。中でも、オーレオバシジウム属 Ｋ−１株の変異菌株であるオーレオバシジウム・プルランスＧＭ−ＮＨ−ＧＭ１Ａ１株（産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１９２８５として寄託済み）、及びＧＭ−ＮＨ−ＧＭ１Ａ２株（産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１９２８６として寄託済み）は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを大量に生産する株であり、かつプルランを産生し難いために好ましい。特に、ＧＭ−ＮＨ−１Ａ１株がより好ましい。
培地組成
本発明方法では、グルコン酸を用いてｐＨ２．７〜６程度に調整した培地を用いる。ｐＨ３〜５程度に調整することが好ましく、ｐＨ３〜４程度に調整することがより好ましい。
【００３６】
ｐＨ調整用のグルコン酸の濃度は、０．２〜１．２％（ｗ／ｖ）程度が好ましく、０．２〜０．５％（ｗ／ｖ）程度がより好ましい。また、培地中に含まれる酸は、実質的にグルコン酸のみであることが好ましい。これにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン生産量が格段に高くなる。
【００３７】
上記濃度範囲のグルコン酸に加えて、アスコルビン酸を０．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で使用して、ｐＨを２．７〜６程度に調整した培地を用いる場合も、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン生産量が格段に高くなる。この場合も、培地中に含まれる酸は、実質的にグルコン酸、及びアスコルビン酸のみであることが好ましい。
【００３８】
培地成分としては、微生物の生育に必要な炭素、窒素が含まれていればよい。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源を挙げることができる。場合によってはβ−グルカンの生産量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類を添加するのも有効な方法である。
【００３９】
炭素源としては、フラクトース、グルコース、スクロースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源を挙げることができる。中でも、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの生産量が高くなる点で、フラクトース、及びスクロースが好ましく、フラクトースがより好ましい。培地中に含まれる炭素源は、ｐＨ調整剤として添加したグルコン酸、場合によりアスコルビン酸を除き、実質的にフラクトースのみ、又はスクロースのみであることが好ましく、フラクトースのみであることがより好ましい。
【００４０】
培地中の炭水化物濃度（特にフラクトース濃度）は、１〜１０％（ｗ／ｖ）程度が好ましく、３〜５％（ｗ／ｖ）程度がより好ましい。上記範囲であれば、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの生産量が十分になるとともに、プルランの生産が抑えられて多糖中のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの比率が高くなりその精製が容易である。
【００４１】
好適な培地としては、ツアペック培地において、炭素源をフルクトース、又はスクロースのみとし、０．２〜１．２％（ｗ／ｖ）のグルコン酸、又はさらに０．１％（ｗ／ｖ）以下のアスコルビン酸を添加した培地が挙げられる。
培養方法
上記説明した液体培地にオーレオバシジウム・プルランスの種培養液、又は固体培地から掻き取った菌体を接種し、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度下で、通気攪拌により好気培養すればよい。種培養液の組成、及びｐＨは特に限定されない。
【００４２】
本発明方法では、上記説明した液体培地に炭素源を培養開始時に一括して添加する回分培養を行ってもよく、基質を分割して添加する流加培養を行ってもよい。また連続培養を採用することもできる。
【００４３】
回分培養の場合は、培養時間は２４〜２４０時間程度が好ましく、７２〜１６８時間程度がより好ましい。上記範囲であれば、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの生産量が高くなる。
【００４４】
一般に、流加培養法は、反応の進行によるｐＨの変動を滴定する酸、アルカリの滴定量、又は反応液中の基質（炭素源）濃度から基質の添加回数及び添加量を判断して、連続的、又は断続的に基質を添加する方法である（笠井ら著, 生物工学会誌，1997, 75, 255-275）。本発明で流加培養を行う場合は、炭素源を連続的、又は断続的に添加すればよい。炭素源は、滅菌した培地や水、緩衝液に溶解して添加するのが一般的である。この炭素源にはｐＨ調整剤として添加したグルコン酸、アスコルビン酸は含まれない。特に、フラクトース、又はスクロース濃度を１〜５％（ｗ／ｖ）程度に保つことが好ましい。流加培養の場合は、培養時間は２４〜２４０時間程度が好ましく、７２〜１６８時間程度がより好ましい。上記範囲であれば、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの生産量が高くなる。
【００４５】
一般に、連続培養は、例えば、反応の進行によるｐＨの変動を滴定する酸、アルカリの滴定量、又は反応液中の基質（炭素源）濃度から基質の添加量を判断して連続的に基質を含む培地を供給し、連続的に排出される精製物を含む培養液を得る方法である（特開２００４−０４１０７６）。本発明で連続培養を行う場合は、炭素源を断続的に添加し、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む培養液を菌体ごと連続的に回収すればよい。この炭素源の定義、及びフラクトース、スクロース濃度は、流加培養について説明した通りである。
【００４６】
いずれの培養方法を採用する場合も、菌の増殖に伴い、ｐＨ調整剤として添加したグルコン酸やアスコルビン酸が消費され、培地ｐＨが上昇する。従って、培養中に、グルコン酸を培地に添加してその濃度を０．２〜１．２％（ｗ／ｖ）程度の範囲に保つことにより、培地ｐＨを２．７〜６程度に制御することが好ましい。場合により、グルコン酸に加えてアスコルビン酸も使用して、培養中の培地ｐＨを２．７〜６程度に保てばよい。アスコルビン酸は、培地中濃度が０．１％（ｗ／ｖ）以下になる範囲で使用することが好ましい。
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの回収
このようにして得られる培養液中には菌体から分泌生産されたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが含まれており、グルカンの粘性のために、培養液は高粘度になっている。従って、通常は、菌体ごとβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む培養液を回収すればよい。
【００４７】
この培養液を１５，０００〜２０，０００ｇ程度で１〜２０分間程度遠心分離して得られる上清に、例えば有機溶媒を添加することにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを沈殿物として得ることができる。
（Ｉ）第２の方法
本発明の第２のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法は、アスコルビン酸を含み、ｐＨが２．７〜６程度である培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む方法である。
【００４８】
好ましくは、アスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６程度に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む方法である。
【００４９】
培地ｐＨを２．７〜６程度に調整するのがより好ましい。培地中のアスコルビン酸濃度は０．２〜１％（ｗ／ｖ）程度が好ましい。また、培地中に含まれる酸は、実質的にアスコルビン酸だけであることが好ましい。アスコルビン酸を用いることにより、培地の透明度、ひいては生成するグルカンの透明度が高くなる。また、アスコルビン酸を除く炭素源は、特に限定されないが、スクロースであることが好ましい。培地組成のその他の点は、第１の方法で述べた通りである。
【００５０】
また、使用する微生物、培養方法、及びグルカンの回収については第１の方法で述べた通りである。
実施例
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５１】
適正ｐＨの検討
後掲の表１に示す組成を有する液体培地５ｍｌを、塩酸または水酸化ナトリウムを用いてｐＨ２〜１０に調整した後、試験管に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め試験管で７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）GM-NH-1A1株（FERM P-19285）の培養液を無菌的に１００μlずつ植菌し１３０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ、２７℃で４８時間振とう培養した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
〈菌体量の測定〉
４８時間後の培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−１１００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定し、菌体量を評価した。
〈多糖濃度測定〉
４８時間培養液を１ｍｌサンプリングし、菌体を１５，０００ｇで１０分間遠心分離することにより除去する。この除菌液１００μｌに最終濃度が６６％（ｗ／ｖ）になるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させた。（多糖が存在すると白色の沈殿物が見られる。）遠心分離機にかけて上清を捨て、そこに６６％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液１（ｍｌ）加えて攪拌後、多糖を洗浄した。遠心分離機にかけて上清を捨て、イオン交換水１（ｍｌ)加えて多糖を溶解させた。
【００５４】
試験管にこの溶液５０（μｌ)とイオン交換水４５０（μl）、５（％（ｗ／ｖ））フェノール溶液５００（μｌ)を入れ攪拌後、濃硫酸２．５（ｍｌ）を加えて攪拌した。室温で３０分放置冷却した溶液の吸光度（Ａｂｓ４９０ｎｍ）を測定し、グルコースを用いて作成した検量線より定量した（「糖質の化学」（朝倉書店）新家龍、南浦能至、北畑寿美雄、大西正健 編参照）。
〈１Ｈ−ＮＭＲによる多糖の同定〉
３０ｍｇの多糖を含む培養液を１５，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し上清を得た。この上清に最終濃度６６％（ｖ／ｖ）になるようにエタノールを加え、多糖を沈殿させた。得られた多糖にイオン水２ｍｌと１ＮのＮａＯＨ１ｍｌを加えて溶解させ、一晩凍結乾燥させた。これを重水１〜２ｍｌに溶解して得られる溶液を１Ｈ−ＮＭＲ（日本電子製500MHZ）に供することにより、多糖類に占めるβ−Ｄ−グルカンの比率を１Ｈ−ＮＭＲシグナルの積分比からから求めた。１Ｈ−ＮＭＲでは、４．７ｐｐｍのシグナルと４．５ｐｐｍのシグナルが観察されたが、他の多糖由来のピーク、例えばプルラン由来の５．２ｐｐｍなどは観測されなかった。このことから、多糖類中のβ−Ｄ−グルカン純度は１００％と判断した。
【００５５】
多糖濃度、及び菌液濁度の結果を以下の表２に示す。多糖濃度は、最も生産量が多かったｐＨ４における多糖濃度を１００として、それに対する相対値で示した。
【００５６】
【表２】
【００５７】
ｐＨ４に調整した液体培地において１．９５９ｍｇ／ｍｌの多糖濃度が得られた。またｐＨ３、ｐＨ５においてもそれぞれ１．００６ｍｇ／ｍｌ、１．２４０ｍｇ／ｍｌの多糖濃度が得られた。このことから、オーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株を培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産する場合の好適な培地ｐＨは３〜５であり、特に至適ｐＨは４であった。ｐＨ４では、菌体量に比して多糖生産量が多かった。
【実施例２】
【００５８】
炭素源の検討
表１の組成において、炭素源として、３．３％（ｗ／ｖ）スクロース、３．３％（ｗ／ｖ）グルコース、３．３％（ｗ／ｖ）フラクトース、及び１．１５％（ｗ／ｖ）グルコースと１．１５％（ｗ／ｖ）フラクトースとの混合物を用いた他は、表１と同様の組成の液体培地を調製した。
【００５９】
これらの培地の１００ｍｌをそれぞれｐＨ３．５に調整した後、坂口フラスコに入れ、１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌的に２ｍｌずつ植菌し、１３０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ、２７℃で９６時間培養した。
【００６０】
多糖濃度、及び菌液濁度を上記のようにして測定した。結果を以下の表３に示す。多糖濃度は、最も生産量が多かったフラクトース使用の場合を１００として、それに対する相対値で示した。
【００６１】
【表３】
【００６２】
炭素源としてフラクトースを用いた液体培地において4.60mg/mlの多糖が得られた。また、菌体量に比して多糖濃度が高かった。このことから、炭素源としてフラクトースを用いることによりβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できることが分かる。
【実施例３】
【００６３】
炭素源の確認
炭素源として、フラクトース、及びスクロースをそれぞれ用いて、培養時間３〜６時間後の多糖生産量を測定した。具体的には、表１の組成において、アスコルビン酸を除き、また炭素源として、それぞれスクロース、及びフラクトースを用いた他は表１と同様の組成の液体培地を作製した。さらにｐＨ３．５に調整した培地１Ｌを２Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌的に１０ｍｌずつ植菌し、０．３Ｌ／分間、４００ｒｐｍで通気撹拌しつつ、２７℃で６日間培養した。多糖濃度、及び菌液濁度を経時的に測定した結果を以下の表４に示す。
【００６４】
【表４】
【００６５】
６日間培養により、フラクトースを炭素源として用いた液体培地において11.02mg/mlの多糖が得られた。またスクロースを炭素源として用いた液体培地において6.596mg/mlの多糖が得られた。坂口フラスコを用いた１００ｍｌの培養も、通気撹拌ジャーを用いた１Ｌの培養も同様に、炭素源としてスクロースを用いるよりもフラクトースを用いることでβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できることが分かる。
【実施例４】
【００６６】
ｐＨ調製剤の検討
表１の組成において、アスコルビン酸を除き、また炭素源を５％（ｗ／ｖ）フラクトースに置き換えた培地を作製した。この液体培地を100mlずつ５つに分け、それぞれアスコルビン酸、グルコン酸、燐酸、クエン酸、及び塩酸を用いてｐＨ３．５に調整した。ｐＨ調整したこれらの液体培地を坂口フラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌的に２ｍｌずつ植菌し、１３０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ、２７℃で１４４時間培養した。
【００６７】
培養後の多糖濃度、及び培養液の濁度の結果を、以下の表５に示す。多糖濃度は、最も高いグルコン酸使用の場合を１００として、それに対する相対値として示した。
【００６８】
【表５】
【００６９】
グルコン酸を用いてｐＨを３．５に調整した液体培地において4.505mg/mlという最も高い多糖濃度が得られた。これよりｐＨ調整剤としてグルコン酸を用いることでβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できると判断される。
【実施例５】
【００７０】
ｐＨ調整剤の確認
表１の組成において、アスコルビン酸を除き、炭素源を５％（ｗ／ｖ）フラクトースに置き換えた培地を作製した。この液体培地を２つに分け、それぞれグルコン酸、及びアスコルビン酸を用いてｐＨ３．５に調整した。これらの液体培地の１Ｌを、それぞれ２Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌１０ｍｌずつ植菌し、０．３Ｌ／分間、４００ｒｐｍで通気撹拌培養しつつ、２７℃で７日間培養した。
【００７１】
多糖濃度、及び培養液の濁度を経時的に測定した結果を、以下の表６に示す。
【００７２】
【表６】
【００７３】
グルコン酸をｐＨ調整剤として用いた液体培地において７日間培養後に14.05 mg/mlの多糖濃度が得られた。これに対してアスコルビン酸をｐＨ調整剤として用いた液体培地においては5.81 mg/mlの多糖濃度が得られた。このことから、ｐＨ調整剤としてアスコルビン酸を用いるよりも、グルコン酸を用いる方がβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できることが確認された。
【実施例６】
【００７４】
ｐＨ調製剤の検討
表１の組成において、炭素源を５％（ｗ／ｖ）フラクトースに置き換え、またアスコルビン酸濃度を、それぞれ０、０．０５、０．１、０．３、及び０．６％（ｗ／ｖ）とした液体培地を調製した。これらをグルコン酸を用いてｐＨ３．５に調整した。アスコルビン酸濃度０．６％（ｗ／ｖ）の液体培地のｐＨは３．５であり、グルコン酸を加えなかった。
【００７５】
各培地を１００ｍｌずつ坂口フラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌的に２ｍｌずつ植菌し、１３０ｒｐｍで撹拌しつつ、２７℃で６日間培養した。
【００７６】
多糖濃度、及び培養液の濁度の結果を以下の表７に示す。多糖濃度はアスコルビン酸濃度０．０５％（ｗ／ｖ）の場合を１００とし、それに対する相対値で示した。
【００７７】
【表７】
【００７８】
アスコルビン酸を０、０．０５、０．１％(ｗ／ｖ)添加した液体培地において、それぞれ９．３ｍｇ／ｍｌ、９．４ｍｇ／ｍｌ、９．１ｍｇ／ｍｌの多糖濃度が得られた。このことから、グルコン酸に加えてアスコルビン酸を０〜０．１％（ｗ／ｖ））添加してｐＨを調整した液体培地を使用してオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株を培養する場合も、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できることが分かる。
【実施例７】
【００７９】
ｐＨ調整剤の確認
表１の組成において、炭素源を５％（ｗ/ｖ）スクロースに置き換えた培地を作製した。この培地を３つに分け、それぞれ0.6%(w/v)アスコルビン酸でｐＨ３．５に調整したもの、グルコン酸でｐＨ３．５に調整したもの、グルコン酸でｐＨ６に調整しさらにアスコルビン酸を加えてｐＨ３．５に調整したものを作製した。
【００８０】
各液体培地の１Ｌを２Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌的に１０ｍｌずつ植菌し、０．３Ｌ／分間、４００ｒｐｍで通気攪拌しつつ、２７℃で５日間培養した。
【００８１】
多糖濃度、及び培養液の濁度の結果を、以下の表８に示す。
【００８２】
【表８】
【００８３】
アスコルビン酸とグルコン酸との両方を用いてｐＨを３．５に調整した培地において、最も高い12.94mg/mlの多糖濃度が得られた。このことから、グルコン酸、又はアスコルビン酸を単独で用いてｐＨを調整した培地よりもグルコン酸とアスコルビン酸との両方を用いてｐＨを調整した培地を用いる方が、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できることが分かる。
【実施例８】
【００８４】
グルコン酸濃度の検討
表１の組成において、アスコルビン酸を除き、炭素源を５％（ｗ／ｖ）フラクトースに置き換えた培地を作製した。液体培地を100mlずつ８つに分け、50%(w/v)グルコン酸溶液（扶桑化学工業株式会社製の食品添加物グルコン酸）を用いてそれぞれｐＨ２．５、３、３．５、４、５、６、７、８．３に調整した。ｐＨ８．３の液体培地はグルコン酸を加えなかった。
【００８５】
これらの培地の１００ｍｌをそれぞれ坂口フラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌的に２ｍｌずつ植菌し、１３０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ、２７℃で７日間培養した。
【００８６】
培養３日目、及び７日目の多糖濃度、及び菌液の濁度の結果を、以下の表９に示す。多糖濃度は、最も高いときの濃度を１００として、それに対する相対値で示した。また、培養液中のグルコン酸の最終濃度を表９に示す。
【００８７】
【表９】
【００８８】
培養３日目では、ｐＨ３．５〜４（グルコン酸濃度０．２５〜０．４２（％（ｗ／ｖ））で多糖濃度が高く、ｐＨ３．５（グルコン酸濃度０．４２（％（ｗ／ｖ））で最大であり、2.743mg/mlの多糖濃度が得られた。また培養７日目では、ｐＨ３〜３．５（グルコン酸濃度０．４２〜１．１（％（ｗ／ｖ））で多糖濃度が高く、ｐＨ３（グルコン酸濃度１．１（％（ｗ／ｖ））で最大であり、5.616mg/mlの多糖濃度が得られた。全体として、ｐＨ２．５付近で多糖濃度が急激に下がり、またｐＨ４を超えても顕著な多糖産生は見られない。
【００８９】
このことから、グルコン酸で培地ｐＨを調整する場合、ｐＨ３〜４（グルコン酸濃度０．２〜１．２％（ｗ／ｖ））にすることでβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できることが分かる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)を培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−グルカン（β−１，３−Ｄ−グルカン、β−１，６−Ｄ−グルカン、又はβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン）はキノコ（担子菌の子実体）に多く含まれる成分であり、子実体だけでなく、培養菌糸体にも含まれている。また、β−グルカンには免疫賦活活性、抗腫瘍活性があることも知られている。例えば、スエヒロタケ、カワラタケ、シイタケから抽出されたβ−グルカンが抗がん剤などの医薬品として販売されている（特開昭６１−１４６１９２号公報、特開昭６２−２０１９０１号公報）。
【０００３】
また、不完全菌であるオーレオバシジウム属微生物もβ−グルカンを菌体外に分泌生産することが知られている。このβ−グルカンが免疫賦活活性を有すること、腸内ビフィズス菌の増殖、便秘防止、免疫増強などの機能を果たす機能性食品や整腸剤等として利用できることが報告されている（特開昭６２−２０１９０１号公報、特開平６−３４０７１号公報、特開平５−３０８９８７号公報）。
【０００４】
オーレオバシジウム属微生物によるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの分泌生産量は培養条件により異なるため、効率よく生産できる条件を見出すことが求められている。
【０００５】
例えば、特許文献１は、オーレオバシジウム属微生物を、スクロース、及びアスコルビン酸を添加したツァペック培地のｐＨを４〜７に調整し、１０〜５０℃で培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを培地中に分泌生産させる方法を開示している。
【０００６】
また、特許文献２は、ｐＨ６．８〜８．５に制御した液体培地を用いてオウレオバシディウム属に属する微生物を培養し、所定の高分岐及び分子量を有する着色されていないβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産する方法を開示している。
【０００７】
また、特許文献３は、オウレオバシディウム・プルランス 財団法人発酵研究所寄託番号ＩＦＯ４４６６株を培養して高分岐β-グルカンを高生産させるために、培地成分中の炭素源について検討した結果を開示している。この文献によれば、β−グルカンが高生産された培地の炭素源はキシロースでありスクロース、フラクトースではない。
【０００８】
また、特許文献４は、グルコースとフラクトースとの混合物、又はスクロースを炭素源とした水性培地でオーレオバシディウム属に属する微生物を好気的発酵により培養することにより、β−１，３−グルカンが効率よく生産されることを開示している。この方法では、水性培地が酵母エキスを特定量含有しているためにβ−１，３−グルカン生産量が多くなる。
【０００９】
また、非特許文献１は、オウレオバシディウム属に属するＫ−１株に高分岐β−１，３−グルカンを生産させるに当たり、ツァペック培地にアスコルビン酸関連化合物を加えることにより高分岐β−１，３−グルカンの生産が促進されることを開示している。この文献は、Ｄ−グルコン酸を培地に添加した場合はグルカン生産量が殆ど変化しないことを教えている。
【００１０】
しかし、上記各文献に記載の培養方法では、オーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを実用上十分な程度に高生産させることはできない。
【特許文献１】特開２００４−３２１１７７号公報
【特許文献２】特開平９−５６３９１号公報
【特許文献３】特開平６−３４０７０１号公報
【特許文献４】特開平７−５１０８１号公報
【非特許文献１】Biosci. Biotech. Biochem., 57(8), 1348-1349,（1993）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、オーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産させることができる、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、オーレオバシジウム・プルランスを培養するに当たり、グルコン酸、及び／又はアスコルビン酸を用いてｐＨを３〜５に調整した培地を使用することにより、培地中に分泌されるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン量が非常に高くなることを見出した。
【００１３】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法を提供する。
【００１４】
項１． グルコン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法。
【００１５】
項２． 培地中のグルコン酸濃度を０．２〜１．２％（ｗ/ｖ）とすることによりｐＨを２．７〜６に調整する項１に記載の方法。
【００１６】
項３． グルコン酸に加えてアスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する項１又は２に記載の方法。
【００１７】
項４． 培地中のアスコルビン酸濃度を０．１％（ｗ/ｖ）以下とする項３に記載の方法。
【００１８】
項５． 培養開始時の培地中の酸が、実質的にグルコン酸、又はさらにアスコルビン酸のみである項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１９】
項６． 培養開始時の培地中にフラクトースが濃度１〜１０％（ｗ／ｖ）含まれる項１〜５のいずれかに記載の方法。
【００２０】
項７． 培養開始時の培地中の炭素源が、グルコン酸、又はさらにアスコルビン酸を除き、実質的にフラクトースのみである項６に記載の方法。
【００２１】
項８． オーレオバシジウム・プルランスが、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ−ＮＨ−１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８５）である項１〜７のいずれかに記載の方法。
【００２２】
項９． さらに、生産されたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを回収する工程を含む項１〜８のいずれかに記載の方法。
【００２３】
項１０． グルコン酸を０．２〜１．２％（ｗ/ｖ）含み、ｐＨ２．７〜６である培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法。
【００２４】
項１１． 培地中にアスコルビン酸が０．１％（ｗ/ｖ）以下の濃度で含まれる項１０に記載の方法。
【００２５】
項１２． 培養開始時の培地中の酸が、実質的にグルコン酸、又はさらにアスコルビン酸のみである項１０又は１１に記載の方法。
【００２６】
項１３． 培地中にフラクトースが合計濃度１〜１０％（ｗ／ｖ）含まれる項1０〜１２のいずれかに記載の方法。
【００２７】
項１４． 培地中の炭素源が、グルコン酸、又はさらにアスコルビン酸を除き、実質的にフラクトースのみである項１３に記載の方法。
【００２８】
項１５． オーレオバシジウム・プルランスが、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ−ＮＨ−１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８５）である項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
【００２９】
項１６． さらに、生産されたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを回収する工程を含む項１０〜１５のいずれかに記載の方法。
【００３０】
項１７． アスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法。
【００３１】
項１８． オーレオバシジウム・プルランスが、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ−ＮＨ−１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８５）である項１７に記載の方法。
【発明の効果】
【００３２】
本発明方法では、オーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させるに当たり、ｐＨ調整剤としてグルコン酸、及び／又はアスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整することにより、グルカンの収量が非常に高くなる。
【００３３】
また、ｐＨ調整剤としてグルコン酸を使用し、かつグルコン酸を除く炭素源がフラクトースであるときには、グルカンの収量が一層高くなる。また、ｐＨ調整剤としてアスコルビン酸を使用し、かつアスコルビン酸を除く炭素源がスクロースであるときには、グルカンの収量が一層高くなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）第１の方法
本発明の第１のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法は、グルコン酸を含み、ｐＨが２．７〜６程度である培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む方法である。
【００３５】
好ましくは、グルコン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む方法である。
微生物
微生物は、オーレオバシジウム・プルランスであればよく、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン生産量の多い任意の菌株を選択して使用すればよい。中でも、オーレオバシジウム属 Ｋ−１株の変異菌株であるオーレオバシジウム・プルランスＧＭ−ＮＨ−ＧＭ１Ａ１株（産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１９２８５として寄託済み）、及びＧＭ−ＮＨ−ＧＭ１Ａ２株（産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１９２８６として寄託済み）は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを大量に生産する株であり、かつプルランを産生し難いために好ましい。特に、ＧＭ−ＮＨ−１Ａ１株がより好ましい。
培地組成
本発明方法では、グルコン酸を用いてｐＨ２．７〜６程度に調整した培地を用いる。ｐＨ３〜５程度に調整することが好ましく、ｐＨ３〜４程度に調整することがより好ましい。
【００３６】
ｐＨ調整用のグルコン酸の濃度は、０．２〜１．２％（ｗ／ｖ）程度が好ましく、０．２〜０．５％（ｗ／ｖ）程度がより好ましい。また、培地中に含まれる酸は、実質的にグルコン酸のみであることが好ましい。これにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン生産量が格段に高くなる。
【００３７】
上記濃度範囲のグルコン酸に加えて、アスコルビン酸を０．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で使用して、ｐＨを２．７〜６程度に調整した培地を用いる場合も、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン生産量が格段に高くなる。この場合も、培地中に含まれる酸は、実質的にグルコン酸、及びアスコルビン酸のみであることが好ましい。
【００３８】
培地成分としては、微生物の生育に必要な炭素、窒素が含まれていればよい。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源を挙げることができる。場合によってはβ−グルカンの生産量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類を添加するのも有効な方法である。
【００３９】
炭素源としては、フラクトース、グルコース、スクロースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源を挙げることができる。中でも、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの生産量が高くなる点で、フラクトース、及びスクロースが好ましく、フラクトースがより好ましい。培地中に含まれる炭素源は、ｐＨ調整剤として添加したグルコン酸、場合によりアスコルビン酸を除き、実質的にフラクトースのみ、又はスクロースのみであることが好ましく、フラクトースのみであることがより好ましい。
【００４０】
培地中の炭水化物濃度（特にフラクトース濃度）は、１〜１０％（ｗ／ｖ）程度が好ましく、３〜５％（ｗ／ｖ）程度がより好ましい。上記範囲であれば、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの生産量が十分になるとともに、プルランの生産が抑えられて多糖中のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの比率が高くなりその精製が容易である。
【００４１】
好適な培地としては、ツアペック培地において、炭素源をフルクトース、又はスクロースのみとし、０．２〜１．２％（ｗ／ｖ）のグルコン酸、又はさらに０．１％（ｗ／ｖ）以下のアスコルビン酸を添加した培地が挙げられる。
培養方法
上記説明した液体培地にオーレオバシジウム・プルランスの種培養液、又は固体培地から掻き取った菌体を接種し、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度下で、通気攪拌により好気培養すればよい。種培養液の組成、及びｐＨは特に限定されない。
【００４２】
本発明方法では、上記説明した液体培地に炭素源を培養開始時に一括して添加する回分培養を行ってもよく、基質を分割して添加する流加培養を行ってもよい。また連続培養を採用することもできる。
【００４３】
回分培養の場合は、培養時間は２４〜２４０時間程度が好ましく、７２〜１６８時間程度がより好ましい。上記範囲であれば、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの生産量が高くなる。
【００４４】
一般に、流加培養法は、反応の進行によるｐＨの変動を滴定する酸、アルカリの滴定量、又は反応液中の基質（炭素源）濃度から基質の添加回数及び添加量を判断して、連続的、又は断続的に基質を添加する方法である（笠井ら著, 生物工学会誌，1997, 75, 255-275）。本発明で流加培養を行う場合は、炭素源を連続的、又は断続的に添加すればよい。炭素源は、滅菌した培地や水、緩衝液に溶解して添加するのが一般的である。この炭素源にはｐＨ調整剤として添加したグルコン酸、アスコルビン酸は含まれない。特に、フラクトース、又はスクロース濃度を１〜５％（ｗ／ｖ）程度に保つことが好ましい。流加培養の場合は、培養時間は２４〜２４０時間程度が好ましく、７２〜１６８時間程度がより好ましい。上記範囲であれば、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの生産量が高くなる。
【００４５】
一般に、連続培養は、例えば、反応の進行によるｐＨの変動を滴定する酸、アルカリの滴定量、又は反応液中の基質（炭素源）濃度から基質の添加量を判断して連続的に基質を含む培地を供給し、連続的に排出される精製物を含む培養液を得る方法である（特開２００４−０４１０７６）。本発明で連続培養を行う場合は、炭素源を断続的に添加し、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む培養液を菌体ごと連続的に回収すればよい。この炭素源の定義、及びフラクトース、スクロース濃度は、流加培養について説明した通りである。
【００４６】
いずれの培養方法を採用する場合も、菌の増殖に伴い、ｐＨ調整剤として添加したグルコン酸やアスコルビン酸が消費され、培地ｐＨが上昇する。従って、培養中に、グルコン酸を培地に添加してその濃度を０．２〜１．２％（ｗ／ｖ）程度の範囲に保つことにより、培地ｐＨを２．７〜６程度に制御することが好ましい。場合により、グルコン酸に加えてアスコルビン酸も使用して、培養中の培地ｐＨを２．７〜６程度に保てばよい。アスコルビン酸は、培地中濃度が０．１％（ｗ／ｖ）以下になる範囲で使用することが好ましい。
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの回収
このようにして得られる培養液中には菌体から分泌生産されたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが含まれており、グルカンの粘性のために、培養液は高粘度になっている。従って、通常は、菌体ごとβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む培養液を回収すればよい。
【００４７】
この培養液を１５，０００〜２０，０００ｇ程度で１〜２０分間程度遠心分離して得られる上清に、例えば有機溶媒を添加することにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを沈殿物として得ることができる。
（Ｉ）第２の方法
本発明の第２のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法は、アスコルビン酸を含み、ｐＨが２．７〜６程度である培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む方法である。
【００４８】
好ましくは、アスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６程度に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む方法である。
【００４９】
培地ｐＨを２．７〜６程度に調整するのがより好ましい。培地中のアスコルビン酸濃度は０．２〜１％（ｗ／ｖ）程度が好ましい。また、培地中に含まれる酸は、実質的にアスコルビン酸だけであることが好ましい。アスコルビン酸を用いることにより、培地の透明度、ひいては生成するグルカンの透明度が高くなる。また、アスコルビン酸を除く炭素源は、特に限定されないが、スクロースであることが好ましい。培地組成のその他の点は、第１の方法で述べた通りである。
【００５０】
また、使用する微生物、培養方法、及びグルカンの回収については第１の方法で述べた通りである。
実施例
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５１】
適正ｐＨの検討
後掲の表１に示す組成を有する液体培地５ｍｌを、塩酸または水酸化ナトリウムを用いてｐＨ２〜１０に調整した後、試験管に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め試験管で７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）GM-NH-1A1株（FERM P-19285）の培養液を無菌的に１００μlずつ植菌し１３０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ、２７℃で４８時間振とう培養した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
〈菌体量の測定〉
４８時間後の培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−１１００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定し、菌体量を評価した。
〈多糖濃度測定〉
４８時間培養液を１ｍｌサンプリングし、菌体を１５，０００ｇで１０分間遠心分離することにより除去する。この除菌液１００μｌに最終濃度が６６％（ｗ／ｖ）になるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させた。（多糖が存在すると白色の沈殿物が見られる。）遠心分離機にかけて上清を捨て、そこに６６％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液１（ｍｌ）加えて攪拌後、多糖を洗浄した。遠心分離機にかけて上清を捨て、イオン交換水１（ｍｌ)加えて多糖を溶解させた。
【００５４】
試験管にこの溶液５０（μｌ)とイオン交換水４５０（μl）、５（％（ｗ／ｖ））フェノール溶液５００（μｌ)を入れ攪拌後、濃硫酸２．５（ｍｌ）を加えて攪拌した。室温で３０分放置冷却した溶液の吸光度（Ａｂｓ４９０ｎｍ）を測定し、グルコースを用いて作成した検量線より定量した（「糖質の化学」（朝倉書店）新家龍、南浦能至、北畑寿美雄、大西正健 編参照）。
〈１Ｈ−ＮＭＲによる多糖の同定〉
３０ｍｇの多糖を含む培養液を１５，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し上清を得た。この上清に最終濃度６６％（ｖ／ｖ）になるようにエタノールを加え、多糖を沈殿させた。得られた多糖にイオン水２ｍｌと１ＮのＮａＯＨ１ｍｌを加えて溶解させ、一晩凍結乾燥させた。これを重水１〜２ｍｌに溶解して得られる溶液を１Ｈ−ＮＭＲ（日本電子製500MHZ）に供することにより、多糖類に占めるβ−Ｄ−グルカンの比率を１Ｈ−ＮＭＲシグナルの積分比からから求めた。１Ｈ−ＮＭＲでは、４．７ｐｐｍのシグナルと４．５ｐｐｍのシグナルが観察されたが、他の多糖由来のピーク、例えばプルラン由来の５．２ｐｐｍなどは観測されなかった。このことから、多糖類中のβ−Ｄ−グルカン純度は１００％と判断した。
【００５５】
多糖濃度、及び菌液濁度の結果を以下の表２に示す。多糖濃度は、最も生産量が多かったｐＨ４における多糖濃度を１００として、それに対する相対値で示した。
【００５６】
【表２】
【００５７】
ｐＨ４に調整した液体培地において１．９５９ｍｇ／ｍｌの多糖濃度が得られた。またｐＨ３、ｐＨ５においてもそれぞれ１．００６ｍｇ／ｍｌ、１．２４０ｍｇ／ｍｌの多糖濃度が得られた。このことから、オーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株を培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産する場合の好適な培地ｐＨは３〜５であり、特に至適ｐＨは４であった。ｐＨ４では、菌体量に比して多糖生産量が多かった。
【実施例２】
【００５８】
炭素源の検討
表１の組成において、炭素源として、３．３％（ｗ／ｖ）スクロース、３．３％（ｗ／ｖ）グルコース、３．３％（ｗ／ｖ）フラクトース、及び１．１５％（ｗ／ｖ）グルコースと１．１５％（ｗ／ｖ）フラクトースとの混合物を用いた他は、表１と同様の組成の液体培地を調製した。
【００５９】
これらの培地の１００ｍｌをそれぞれｐＨ３．５に調整した後、坂口フラスコに入れ、１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌的に２ｍｌずつ植菌し、１３０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ、２７℃で９６時間培養した。
【００６０】
多糖濃度、及び菌液濁度を上記のようにして測定した。結果を以下の表３に示す。多糖濃度は、最も生産量が多かったフラクトース使用の場合を１００として、それに対する相対値で示した。
【００６１】
【表３】
【００６２】
炭素源としてフラクトースを用いた液体培地において4.60mg/mlの多糖が得られた。また、菌体量に比して多糖濃度が高かった。このことから、炭素源としてフラクトースを用いることによりβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できることが分かる。
【実施例３】
【００６３】
炭素源の確認
炭素源として、フラクトース、及びスクロースをそれぞれ用いて、培養時間３〜６時間後の多糖生産量を測定した。具体的には、表１の組成において、アスコルビン酸を除き、また炭素源として、それぞれスクロース、及びフラクトースを用いた他は表１と同様の組成の液体培地を作製した。さらにｐＨ３．５に調整した培地１Ｌを２Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌的に１０ｍｌずつ植菌し、０．３Ｌ／分間、４００ｒｐｍで通気撹拌しつつ、２７℃で６日間培養した。多糖濃度、及び菌液濁度を経時的に測定した結果を以下の表４に示す。
【００６４】
【表４】
【００６５】
６日間培養により、フラクトースを炭素源として用いた液体培地において11.02mg/mlの多糖が得られた。またスクロースを炭素源として用いた液体培地において6.596mg/mlの多糖が得られた。坂口フラスコを用いた１００ｍｌの培養も、通気撹拌ジャーを用いた１Ｌの培養も同様に、炭素源としてスクロースを用いるよりもフラクトースを用いることでβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できることが分かる。
【実施例４】
【００６６】
ｐＨ調製剤の検討
表１の組成において、アスコルビン酸を除き、また炭素源を５％（ｗ／ｖ）フラクトースに置き換えた培地を作製した。この液体培地を100mlずつ５つに分け、それぞれアスコルビン酸、グルコン酸、燐酸、クエン酸、及び塩酸を用いてｐＨ３．５に調整した。ｐＨ調整したこれらの液体培地を坂口フラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌的に２ｍｌずつ植菌し、１３０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ、２７℃で１４４時間培養した。
【００６７】
培養後の多糖濃度、及び培養液の濁度の結果を、以下の表５に示す。多糖濃度は、最も高いグルコン酸使用の場合を１００として、それに対する相対値として示した。
【００６８】
【表５】
【００６９】
グルコン酸を用いてｐＨを３．５に調整した液体培地において4.505mg/mlという最も高い多糖濃度が得られた。これよりｐＨ調整剤としてグルコン酸を用いることでβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できると判断される。
【実施例５】
【００７０】
ｐＨ調整剤の確認
表１の組成において、アスコルビン酸を除き、炭素源を５％（ｗ／ｖ）フラクトースに置き換えた培地を作製した。この液体培地を２つに分け、それぞれグルコン酸、及びアスコルビン酸を用いてｐＨ３．５に調整した。これらの液体培地の１Ｌを、それぞれ２Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌１０ｍｌずつ植菌し、０．３Ｌ／分間、４００ｒｐｍで通気撹拌培養しつつ、２７℃で７日間培養した。
【００７１】
多糖濃度、及び培養液の濁度を経時的に測定した結果を、以下の表６に示す。
【００７２】
【表６】
【００７３】
グルコン酸をｐＨ調整剤として用いた液体培地において７日間培養後に14.05 mg/mlの多糖濃度が得られた。これに対してアスコルビン酸をｐＨ調整剤として用いた液体培地においては5.81 mg/mlの多糖濃度が得られた。このことから、ｐＨ調整剤としてアスコルビン酸を用いるよりも、グルコン酸を用いる方がβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できることが確認された。
【実施例６】
【００７４】
ｐＨ調製剤の検討
表１の組成において、炭素源を５％（ｗ／ｖ）フラクトースに置き換え、またアスコルビン酸濃度を、それぞれ０、０．０５、０．１、０．３、及び０．６％（ｗ／ｖ）とした液体培地を調製した。これらをグルコン酸を用いてｐＨ３．５に調整した。アスコルビン酸濃度０．６％（ｗ／ｖ）の液体培地のｐＨは３．５であり、グルコン酸を加えなかった。
【００７５】
各培地を１００ｍｌずつ坂口フラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌的に２ｍｌずつ植菌し、１３０ｒｐｍで撹拌しつつ、２７℃で６日間培養した。
【００７６】
多糖濃度、及び培養液の濁度の結果を以下の表７に示す。多糖濃度はアスコルビン酸濃度０．０５％（ｗ／ｖ）の場合を１００とし、それに対する相対値で示した。
【００７７】
【表７】
【００７８】
アスコルビン酸を０、０．０５、０．１％(ｗ／ｖ)添加した液体培地において、それぞれ９．３ｍｇ／ｍｌ、９．４ｍｇ／ｍｌ、９．１ｍｇ／ｍｌの多糖濃度が得られた。このことから、グルコン酸に加えてアスコルビン酸を０〜０．１％（ｗ／ｖ））添加してｐＨを調整した液体培地を使用してオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株を培養する場合も、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できることが分かる。
【実施例７】
【００７９】
ｐＨ調整剤の確認
表１の組成において、炭素源を５％（ｗ/ｖ）スクロースに置き換えた培地を作製した。この培地を３つに分け、それぞれ0.6%(w/v)アスコルビン酸でｐＨ３．５に調整したもの、グルコン酸でｐＨ３．５に調整したもの、グルコン酸でｐＨ６に調整しさらにアスコルビン酸を加えてｐＨ３．５に調整したものを作製した。
【００８０】
各液体培地の１Ｌを２Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った。ここに、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌的に１０ｍｌずつ植菌し、０．３Ｌ／分間、４００ｒｐｍで通気攪拌しつつ、２７℃で５日間培養した。
【００８１】
多糖濃度、及び培養液の濁度の結果を、以下の表８に示す。
【００８２】
【表８】
【００８３】
アスコルビン酸とグルコン酸との両方を用いてｐＨを３．５に調整した培地において、最も高い12.94mg/mlの多糖濃度が得られた。このことから、グルコン酸、又はアスコルビン酸を単独で用いてｐＨを調整した培地よりもグルコン酸とアスコルビン酸との両方を用いてｐＨを調整した培地を用いる方が、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できることが分かる。
【実施例８】
【００８４】
グルコン酸濃度の検討
表１の組成において、アスコルビン酸を除き、炭素源を５％（ｗ／ｖ）フラクトースに置き換えた培地を作製した。液体培地を100mlずつ８つに分け、50%(w/v)グルコン酸溶液（扶桑化学工業株式会社製の食品添加物グルコン酸）を用いてそれぞれｐＨ２．５、３、３．５、４、５、６、７、８．３に調整した。ｐＨ８．３の液体培地はグルコン酸を加えなかった。
【００８５】
これらの培地の１００ｍｌをそれぞれ坂口フラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、予め坂口フラスコで７２時間培養したオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株の培養液を無菌的に２ｍｌずつ植菌し、１３０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ、２７℃で７日間培養した。
【００８６】
培養３日目、及び７日目の多糖濃度、及び菌液の濁度の結果を、以下の表９に示す。多糖濃度は、最も高いときの濃度を１００として、それに対する相対値で示した。また、培養液中のグルコン酸の最終濃度を表９に示す。
【００８７】
【表９】
【００８８】
培養３日目では、ｐＨ３．５〜４（グルコン酸濃度０．２５〜０．４２（％（ｗ／ｖ））で多糖濃度が高く、ｐＨ３．５（グルコン酸濃度０．４２（％（ｗ／ｖ））で最大であり、2.743mg/mlの多糖濃度が得られた。また培養７日目では、ｐＨ３〜３．５（グルコン酸濃度０．４２〜１．１（％（ｗ／ｖ））で多糖濃度が高く、ｐＨ３（グルコン酸濃度１．１（％（ｗ／ｖ））で最大であり、5.616mg/mlの多糖濃度が得られた。全体として、ｐＨ２．５付近で多糖濃度が急激に下がり、またｐＨ４を超えても顕著な多糖産生は見られない。
【００８９】
このことから、グルコン酸で培地ｐＨを調整する場合、ｐＨ３〜４（グルコン酸濃度０．２〜１．２％（ｗ／ｖ））にすることでβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産できることが分かる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法。
【請求項２】
グルコン酸に加えてアスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養開始時の培地中の酸が、実質的にグルコン酸、又はさらにアスコルビン酸のみである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
培養開始時の培地中の炭素源が、グルコン酸、又はさらにアスコルビン酸を除き、実質的にフラクトースのみである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
オーレオバシジウム・プルランスが、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ−ＮＨ−１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８５）である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
さらに、生産されたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを回収する工程を含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
アスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法。
【請求項８】
オーレオバシジウム・プルランスが、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ−ＮＨ−１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８５）である請求項７に記載の方法。
【請求項１】
グルコン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法。
【請求項２】
グルコン酸に加えてアスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養開始時の培地中の酸が、実質的にグルコン酸、又はさらにアスコルビン酸のみである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
培養開始時の培地中の炭素源が、グルコン酸、又はさらにアスコルビン酸を除き、実質的にフラクトースのみである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
オーレオバシジウム・プルランスが、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ−ＮＨ−１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８５）である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
さらに、生産されたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを回収する工程を含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
アスコルビン酸を用いて培地ｐＨを２．７〜６に調整する工程と、得られた培地中でオーレオバシジウム・プルランスを培養してβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる工程を含む、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法。
【請求項８】
オーレオバシジウム・プルランスが、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ−ＮＨ−１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８５）である請求項７に記載の方法。
【公開番号】特開２００７−２６７７２０（Ｐ２００７−２６７７２０Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１０１２５９（Ｐ２００６−１０１２５９）
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【出願人】（０００１０８９９３）ダイソー株式会社 (229)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【出願人】（０００１０８９９３）ダイソー株式会社 (229)
【Ｆターム（参考）】
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