βグルコシダーゼを発現する大腸菌
【課題】バイオマス分解酵素を発現する大腸菌を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む、βグルコシダーゼを発現する大腸菌。目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できるタンパク質、その遺伝子、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現用ベクター、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法、および目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む、βグルコシダーゼを発現する大腸菌。目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できるタンパク質、その遺伝子、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現用ベクター、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法、および目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマス分解酵素を発現する大腸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌は遺伝子組換えによる有用物質生産に好適に用いられるが、培養中の生育のためにグルコースを必要とする。近年、セルロースなどのバイオマスの有効利用が探索されているが、大腸菌は、このようなバイオマスを直接資化できない。大腸菌の培養にバイオマスを利用するためには、グルコースを得るために、予めセルロースを酵素により糖化する必要がある。大腸菌にバイオマス分解能を付与し、すなわち、バイオマス分解酵素を発現させることができれば、糖化工程を省略して直接バイオマスを炭素源として大腸菌を培養できると期待される。
【０００３】
しかし、酵母などの真核生物では、バイオマス分解酵素の発現例があるが、大腸菌などの細菌では、バイオマス分解酵素を発現させてバイオマスを分解したという報告例はない。
【０００４】
また、細胞表層提示技術は、酵素などをその細胞の表層に提示できる優れた技術である。細胞自体が固定化酵素触媒として利用できる上、提示されている酵素を細胞の回収と同時に回収できる。大腸菌などの細菌の表層に酵素を提示可能なアンカータンパク質としては、PgsAおよびOmpAなどが報告されている（PgsA：特許文献１および２、非特許文献１；およびOmpA：非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０３／０１４３６０号
【特許文献２】特開２００５−３１２４２６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006年, 70巻, 564-572頁
【非特許文献２】Protein Eng., 1996年, 9巻, 239-247頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、バイオマス分解酵素を発現する大腸菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、該（ａ）または（ｂ）のタンパク質を発現する大腸菌を提供する：
（ａ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつβグルコシダーゼ活性を有する、タンパク質。
【０００９】
１つの実施態様では、上記ポリヌクレオチドが、以下の（１）または（２）のタンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、上記大腸菌は、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質を表層提示する：
（１）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該（ａ）または（ｂ）のタンパク質を大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
【００１０】
別の実施態様では、上記大腸菌は、BW25113株またはJCM20137株である。
【００１１】
本発明は、以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質を提供する：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
【００１２】
本発明はさらに、以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする遺伝子を提供する：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
【００１３】
１つの実施態様では、上記遺伝子は、以下の（Ｉａ）または（IIａ）を含む：
（Ｉａ）配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択される塩基配列からなるＤＮＡ；
（IIａ）該（Ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【００１４】
本発明はさらに、上記（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする遺伝子または上記（Ｉａ）または（IIａ）を含む遺伝子を含む、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターを提供する。
【００１５】
１つの実施態様では、上記発現ベクターは、以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする核酸あるいは以下の（Ｉａ）または（IIａ）のＤＮＡを含み、該（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（Ｉａ）または（IIａ）のＤＮＡの下流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸が挿入されて用いる：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該目的のタンパク質またはぺプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質；
（Ｉａ）配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択される塩基配列からなるＤＮＡ；
（IIａ）該（Ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【００１６】
別の実施態様では、上記発現ベクターは、以下の（ｉ）または（ii）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（ｉａ）または（iiａ）のＤＮＡを含み、該（ｉ）または（ii）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（ｉａ）または（iiａ）のＤＮＡの上流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸が挿入されて用いる、請求項７に記載の発現ベクター：
（ｉ）配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ii）配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該目的のタンパク質またはぺプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質；
（ｉａ）配列番号７または配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ；
（iiａ）該（ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【００１７】
本発明はまた、目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターを提供する。
【００１８】
本発明はまた、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法を提供し、上記の目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターを大腸菌に導入する工程を含む。
【００１９】
本発明はさらに、上記目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法で製造された大腸菌を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、バイオマス分解酵素を発現する大腸菌が提供される。さらに、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる新規なタンパク質、その遺伝子、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現用ベクター、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法、および目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）で発現させた種々の候補タンパク質のβグルコシダーゼ活性を示すグラフである。
【図２】種々のβグルコシダーゼ候補タンパク質を表層提示させた大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。
【図３】大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）におけるBglAの表層提示のために種々のアンカー候補タンパク質を用いた形質転換大腸菌のβグルコシダーゼ活性を示すグラフである。
【図４】種々のアンカー候補タンパク質を用いてBglAを表層提示させた大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。
【図５】blcまたはhdeDのＣ末端側にTfu0937のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（blc-Tfu0937、hdeD-Tfu0937）あるいはslpまたはblcのＮ末端側にTfu0937のＣ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（Tfu0937-slp、Tfu0937-blc）を用いて形質転換した大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、βグルコシダーゼを発現する大腸菌を提供する。この大腸菌は、大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。
【００２３】
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質としては、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）のＹＸ株のBGL0937（単に「Tfu0937」という場合もある）およびクロストリジウム・セルロボランス（Clostridium cellulovorans）のBglAタンパク質（単に「BglA」という場合もある）が挙げられる。Tfu0937およびBglAの全長アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列で示される。
【００２４】
大腸菌で発現された際にβグルコシダーゼ活性が失われない程度に、アミノ酸変異（欠失、置換、付加）が起こっているタンパク質もまた用いられ得る。このような変異には、自然界において生じる変異の他に、人為的な変異も含まれる。人為的な変異を生じさせる手段としては、部位特異的突然変異誘発法（Nucleic Acids Res. 1982年, 10巻, 6487-6500頁）が挙げられるがこれに限定されるわけではない。変異（欠失、置換、付加）したアミノ酸の数は、βグルコシダーゼ活性が失われない限りその個数は制限されないが、好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内である。
【００２５】
また、βグルコシダーゼ活性が失われない程度に、配列番号２または４に対して相同性を有するタンパク質もまた挙げられる。相同性は、８０％以上が好ましく、９０％以上が特に好ましい。
【００２６】
本発明において「相同性」とは、２つのポリペプチドあるいはポリヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象のアミノ酸配列または塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。相同性の数値（％）は両方の（アミノ酸または塩基）配列に存在する同一のアミノ酸または塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸または塩基の総数で割り、得られた数値に100をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび相同性を得るためのアルゴリズムとしては当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど）が挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、例えばBLASTP、FASTAなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。塩基配列の相同性は、BLASTN、FASTAなどのソフトウェアを用いて決定される。
【００２７】
本明細書で用いる「ポリペプチド」という用語はアミノ酸の重合体を指し、便宜的に「タンパク質」なる語を比較的長いポリペプチド、「ペプチド」なる語を比較的短いポリペプチドを示すように用いているが、これらはアミノ酸残基の数を限定するわけではない。したがって、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、いずれもポリペプチドの定義内に含まれる。「タンパク質またはペプチド」はあらゆる長さのポリペプチドを包含する概念である。
【００２８】
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質をコードする遺伝子として、サーモビフィダ・フスカのＹＸ株のBGL0937「Tfu0937」をコードする遺伝子およびクロストリジウム・セルロボランスのBglAタンパク質「BglA」をコードする遺伝子が挙げられる。Tfu0937をコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示されるとおりである。この塩基配列は、サーモビフィダ・フスカのＹＸ株のゲノム配列に含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に由来し、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）にNCBI Reference Sequence：YP_003842858.1で登録されている。BglAをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号３に示される。この塩基配列は、クロストリジウム・セルロボランスのゲノム配列に含まれるＯＲＦに由来し、ＮＣＢＩにNCBI Reference Sequence：YP_288998.1で登録されている。
【００２９】
該遺伝子としては、配列番号１または３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ大腸菌で発現させた際に、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡもまた用いられ得る。
【００３０】
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、0.2×SSC、0.1%SDS、65℃程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるＤＮＡは、上記塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の高い相同性を有することが望ましく、さらに９０％以上の相同性を有することが好ましい。ここで「相同性」については上記のとおりである。
【００３１】
βグルコシダーゼ活性は、機能を確認すべきタンパク質を発現するためのベクター（好ましくは、アンカータンパク質を発現する表層提示用ベクター）を構築し、これを大腸菌に導入して発現させ、例えば、pNPG法により活性の有無を確認する。例えば、機能を確認すべきタンパク質を発現させた大腸菌の生菌体を基質p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）と接触させ、遊離したp-ニトロフェノール量を400nmで吸光度測定することによって、βグルコシダーゼ活性が確認され得る。βグルコシダーゼの表層提示は、生菌体との接触により基質ＰＮＰＧが分解されることで確認され得る。さらに、セロビオースを基質とする培地での培養による増殖能を調べることで、βグルコシダーゼの発現（好ましくは表層提示）が確認され得る。
【００３２】
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質をコードする遺伝子は、クロストリジウム・セルロボランスまたはサーモビフィダ・フスカを含む微生物のゲノム（例えば、それぞれアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より入手され得る；クロストリジウム・セルロボランスのゲノムＤＮＡはＡＴＣＣ３５２９６として、サーモビフィダ・フスカのゲノムＤＮＡはＡＴＣＣ２７７３０として入手可能である）から、当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはハイブリダイゼーション技術によって取得され得る。あるいはＤＮＡ合成機などを用いて人工的に合成してもよい。配列の決定は常套方法により配列決定機を用いて行われ得る。
【００３３】
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質をコードする遺伝子の大腸菌への導入は、発現ベクターの形態で宿主に導入されてもよく、あるいは宿主の遺伝子に挿入してまたは宿主の遺伝子との相同組換えで宿主の染色体に組み込まれてもよい。
【００３４】
βグルコシダーゼのような目的のタンパク質またはペプチドを大腸菌に表層提示させるために、アンカータンパク質が用いられ得る。大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質としては、大腸菌（Escherichia coli）由来のタンパク質slp、blc、およびhdeDが用いられ得る。これらのタンパク質は、膜に局在することが予測されていたのみであり、機能未知のタンパク質であった。slp、blc、およびhdeDのそれぞれの全長アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８、１０、および１２で示される。ストレプトマイセス・スブチリス（Streptomyces subtilis）のPgsA（特許文献１および２、非特許文献１）もまた用いられ得、PgsAは、プラスミドの形態で入手することができる（pHLA、非特許文献１）。PgsAの全長アミノ酸配列は、配列番号６に示される。これらのアンカータンパク質は、その末端（Ｃ末端またはＮ末端の少なくとも一方）に融合された目的のタンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる。
【００３５】
大腸菌で発現された際に、アンカー機能が失われない（例えば、その末端に融合されたβグルコシダーゼのような目的のタンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる）程度に、アミノ酸変異（欠失、置換、付加）が起こっているタンパク質もまた用いられ得る（このようなタンパク質を、「アンカー変異タンパク質」ともいう）。ここで、「変異」については上記の通りである。変異（欠失、置換、付加）したアミノ酸の数は、上記アンカータンパク質のアンカー機能が失われない限りその個数は制限されないが、好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内である。
【００３６】
また、上記アンカータンパク質のアンカー機能が失われない程度に、配列番号６、８、１０、または１２に対して相同性を有するタンパク質もまた用いられ得る。このような相同性タンパク質もまた、「アンカー変異タンパク質」に包含され得る。相同性は、８０％以上が好ましく、９０％以上が特に好ましい。ここで、「相同性」については上記の通りである。
【００３７】
大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質をコードする遺伝子として、大腸菌由来のタンパク質slp、blc、およびhdeDのそれぞれをコードする遺伝子およびストレプトマイセス・スブチリスのPgsAをコードする遺伝子が挙げられる。slp、blc、およびhdeDのそれぞれをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号７、９、および１１に示されるとおりである。これらの塩基配列は、大腸菌のゲノム配列に含まれるＯＲＦに由来し、それぞれNCBIに以下のNCBI Reference Sequenceで登録されている（Slp: YP_001732337.1、blc:YP_001732919.1、hdeD:YP_001732342.1）。PgsAをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号５に示される。
【００３８】
該遺伝子としては、配列番号５、７、９、および１１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ大腸菌で発現させた際にアンカー機能を有する（例えば、その末端に融合されたβグルコシダーゼのような目的のタンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる）タンパク質をコードする、ＤＮＡ（このようなＤＮＡを、「アンカータンパク質遺伝子変異体」ともいう）もまた用いられ得る。ここで、「ストリンジェントな条件」については上記の通りである。
【００３９】
大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、大腸菌またはストレプトマイセス・スブチリスを含む微生物のゲノムから、当業者に周知のＰＣＲまたはハイブリダイゼーション技術によって取得され得る。例えば、大腸菌株BW25113（国立遺伝学研究所より入手され得る）から当業者が通常用いる方法に従って調製した大腸菌のゲノムＤＮＡから、本明細書に記載した配列情報（特に、配列番号７、９または１１）に基づいて作製したプライマーまたはプローブを用いて、大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を調製し得る。あるいはＤＮＡ合成機などを用いて人工的に合成してもよい。配列の決定は常套方法により配列決定機を用いて行われ得る。
【００４０】
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質、および大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質は、大腸菌用発現カセットの構築に用いられ得る。このような発現カセットは、PgsA（配列番号６）、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２）のそれぞれのアンカータンパク質あるいは上述したようなアンカー変異タンパク質のＣ末端側に目的のタンパク質またはペプチド（例えば、βグルコシダーゼ）を融合させた融合タンパク質を発現するように構築され得る。また、slp（配列番号８）またはslc（配列番号１０）あるいは上述したようなアンカー変異タンパク質のＮ末端側に目的のタンパク質またはペプチド（例えば、βグルコシダーゼ）を融合させた融合タンパク質を発現するように構築することもできる。
【００４１】
目的タンパク質またはペプチドの大腸菌の表層提示のために、上記発現カセットは、分泌シグナル配列を含み得る。分泌シグナル配列とは、一般に細胞外（ペリプラズムも含む）に分泌されるタンパク質（分泌性タンパク質）のＮ末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むアミノ酸配列をいい、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去される。分泌シグナル配列は、発現カセットにおいてＮ末端側に配置され得る。発現産物を細胞膜へ導くことができる分泌シグナル配列であれば、どのような分泌シグナル配列でも用いられ得、起源は問わない。例えば、分泌シグナル配列は、大腸菌にて機能し得る分泌シグナル配列を添加しても、アンカータンパク質自身のものを利用しても、あるいは目的タンパク質またはペプチド自身のものを利用してもよい。アンカータンパク質（PgsA（配列番号６）、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２））は、これらのタンパク質自身に分泌シグナル配列を含むと考えられ、βグルコシダーゼタンパク質であるTfu0937（配列番号２）もまた、このタンパク質自身に分泌シグナル配列を含むと考えられる。アンカータンパク質に融合している目的タンパク質またはペプチドの活性に影響を及ぼさないのであれば、大腸菌で発現される際に、アンカータンパク質と目的タンパク質またはペプチドとの融合タンパク質における分泌シグナル配列の一部または全部が該融合タンパク質のＮ末端に残ってもよい。
【００４２】
本発明は、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌もまた提供する。このような大腸菌は、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２）のそれぞれのアンカータンパク質あるいは上述したようなアンカー変異タンパク質、および目的のタンパク質またはペプチドを発現し得る。目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌は、上記のような発現カセットを宿主大腸菌で発現させることによって作製され得る。また、例えば、以下に説明するような発現ベクターを、宿主大腸菌に導入することによって作製され得る。
【００４３】
本発明は、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターを提供する。この発現ベクターは、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２）のそれぞれのアンカータンパク質あるいは上述したようなアンカー変異タンパク質をコードする遺伝子（核酸）を含む。あるいは、slp（配列番号７）、blc（配列番号９）、およびhdeD（配列番号１１）のＤＮＡあるいは上述したようなアンカータンパク質遺伝子変異体を含む。目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターは、目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子（核酸）をさらに含み得る。目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターは、上述したような分泌シグナル配列をコードする遺伝子を含み得る。
【００４４】
１つの実施態様では、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターは、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２）または上記のアンカー変異タンパク質（以下、まとめて「Ｃ末端側アンカータンパク質」）のＣ末端側に該目的タンパク質またはペプチドを融合させた融合タンパク質を発現するように配置されればよく、好ましくは、Ｃ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の下流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）が挿入される形態である。「インフレーム」とは、アンカーと目的のタンパク質またはペプチドが一続きで読めればよく、間に数アミノ酸〜数十アミノ酸でなるスペーサーを介するように連結されてもよい。この発現ベクターは、Ｃ末端側アンカータンパク質をコードする核酸を含み、Ｃ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の下流に、インフレームにて目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）を挿入可能な、好適な制限酵素部位を有し得る。目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）を、該組換えベクター中のＣ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の下流（３’末端側）に、インフレームにて挿入して得られた構築物を大腸菌に導入し、発現させるとＣ末端側アンカータンパク質のＣ末端側に目的タンパク質またはペプチドが融合した融合タンパク質が発現し、その結果、目的タンパク質またはペプチドは大腸菌の表層に提示され得る。
【００４５】
別の実施態様では、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターは、slp（配列番号８）およびblc（配列番号１０）または上記のアンカー変異タンパク質（以下、まとめて「Ｎ末端側アンカータンパク質」）のＮ末端側に該目的タンパク質またはペプチドを融合させた融合タンパク質を発現するように配置されればよく、好ましくは、Ｎ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の上流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）が挿入される形態である。この発現ベクターは、Ｎ末端側アンカータンパク質をコードする核酸を含み、Ｎ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の上流に、インフレームにて目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）を挿入可能な、好適な制限酵素部位を有し得る。目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）を、該組換えベクター中のＮ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の上流（５’末端側）に、インフレームにて挿入して得られた構築物を大腸菌に導入し、発現させるとＮ末端側アンカータンパク質のＮ末端側に目的タンパク質またはペプチドが融合した融合タンパク質が発現し、その結果、目的タンパク質またはペプチドは大腸菌の表層に提示され得る。
【００４６】
各種ＤＮＡおよび組換えＤＮＡの合成、結合、および発現ベクターへの挿入は、当業者が通常用い得る技法で行われ得る。
【００４７】
発現ベクターとしては、宿主大腸菌内で自律的に複製可能なプラスミドまたはファージから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ベクターは、導入されるグラム陰性細菌に適合した複製開始起点、選択可能なマーカー、プロモーター等の発現制御配列、ターミネーターを含むのが好ましい。プラスミドベクターとしては、例えば大腸菌で発現させる場合は、pET系ベクター、pET15bが挙げられる。ファージベクターとしてはλファージベクターなどが挙げられる。
【００４８】
選択可能なマーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００４９】
発現ベクターは、発現制御配列を含むものが好ましい。発現制御配列とは、ＤＮＡ配列に適切に連結した場合、グラム陰性細菌において、そのＤＮＡ配列を発現させることが出来る配列を意味する。発現制御配列には少なくともプロモーターが含まれる。プロモーターは構成的プロモーターであっても誘導可能なプロモーターであってもよい。さらに該発現ベクターには転写終結シグナル、即ちターミネーター領域が好ましくは含まれる。
【００５０】
発現ベクターは、Ｃ末端側アンカータンパク質またはＮ末端側アンカータンパク質と目的タンパク質またはペプチドとの融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡの構築を容易にするために、Ｃ末端側アンカータンパク質またはＮ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することにより作製することができる。
【００５１】
目的のタンパク質またはペプチドとしては、特に限定されず、本来大腸菌の細胞表層に局在しないタンパク質であって、大腸菌の細胞表層に固定することを目的として配置されるタンパク質が好ましい。例えば、酵素（例えば、βグルコシダーゼ）、抗体、抗原、リガンドなどが挙げられる。
【００５２】
目的タンパク質またはペプチドの起源は宿主として用いる大腸菌に対して異種のものであってもよいし、宿主として用いる大腸菌由来のものであってもよい。
【００５３】
上述したように、上記のアンカータンパク質をコードする遺伝子（核酸）に加え、目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子（核酸）をさらに含む発現ベクターを作製し得る。このようなアンカータンパク質をコードする遺伝子（核酸）および目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子（核酸）を含む発現ベクターを大腸菌に導入することで、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造できる。
【００５４】
発現ベクターの大腸菌への導入には、当業者が通常用いる方法が用いられ得る。このような方法としては、例えば、塩化カルシウム法、コンピテント法、３親接合（triparental mating）法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。発現ベクターの大腸菌への導入により得られる大腸菌形質転換体は、必要に応じて、当業者が通常用いる方法でスクリーニングされ得る。
【００５５】
融合タンパク質を発現させる方法は遺伝子工学の常法に基づいて行うことができる。大腸菌に用いられるベクターの情報や外来遺伝子の導入、発現、形質転換体のスクリーニングなどの方法は多くの実験書に記載されている（例えば、Sambrook, J.et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd Edition, CSHL Press, 2001）。
【００５６】
用いる宿主は大腸菌であれば特に限定されない。好ましくは、BW25113（国立遺伝学研究所より入手され得る）およびJCM20137（理研BRC微生物材料開発室より入手され得る）が挙げられる。
【００５７】
形質転換体である宿主細菌の培養形態は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を適宜選択すればよく、通常液体培養で行われる。培地の炭素源としてはグルコース、グリセロールなどが挙げられるが、βグルコシダーゼを表層提示している場合はセロビオースを含んでもよい。窒素源としては硫酸アンモニウム、カザミノ酸などが挙げられる。その他、塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどを所望により使用できる。
【００５８】
培養温度は宿主大腸菌が生育し、目的タンパク質またはペプチドを提示する範囲で適宜変更できるが、一般に大腸菌の場合、温度37℃、12時間、pH7.2の培養条件でよい。
【００５９】
目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌は、表面に提示された目的タンパク質またはペプチドの種類に応じて利用することができる。目的タンパク質またはペプチドが酵素である場合、酵素を表層提示する大腸菌を含む酵素剤として提供され得る。酵素がβグルコシダーゼの場合は、バイオマス分解に用いられ得る。
【００６０】
βグルコシダーゼを発現する（好ましくは表層提示する）大腸菌は、βグルコシダーゼ活性を有する。さらにセロビオースを含む培地で増殖も可能である。本発明により、バイオマスを分解しながら増殖できる大腸菌が得られた。
【００６１】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
（実施例１：大腸菌で活性を持つβグルコシダーゼの探索）
大腸菌で活性を持つβグルコシダーゼを探索するために、表層提示用プラスミドベクターpHLA（非特許文献１）を用いた。pHLAは、大腸菌表層提示のためのアンカータンパク質であるストレプトマイセス・スブチリス（Streptomyces subtilis）のPgsAを含み、PgsAのＣ末端側に目的のタンパク質のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるためのものである。
【００６３】
クロストリジウム・セルロボランスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ３５２９６）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号１３）およびリバースプライマー（配列番号１４）を使用してＰＣＲを行い、クロストリジウム・セルロボランスのBglA（「BglA」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびSpeIで切断し、同じく切断したベクターpHLに連結し、BglA-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113（国立遺伝学研究所より入手）およびJCM20137（理研BRC微生物材料開発室より入手）のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００６４】
サーモビフィダ・フスカＹＸのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ２７７３０）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号１５）およびリバースプライマー（配列番号１６）を使用してＰＣＲを行い、サーモビフィダ・フスカＹＸのBGL0937（「Tfu0937」）の遺伝子断片を調製した。これをXhoIおよびHindIIIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、Tfu0937-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００６５】
サッカロファガス・デグラダンス（Saccharophagus degradans）２−４０のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ４３９６１）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号１７）およびリバースプライマー（配列番号１８）を使用してＰＣＲを行い、サッカロファガス・デグラダンス2-40 Sde0245（「Sde0245」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびXhoIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、Sde0245-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００６６】
サッカロファガス・デグラダンス２−４０のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号１９）およびリバースプライマー（配列番号２０）を使用してＰＣＲを行い、サッカロファガス・デグラダンス２−４０のSde2497（「Sde2497」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびXhoIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、Sde2497-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００６７】
サイトファガ・ハチンソニ（Cytophaga hutchinsonii）のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ３３４０６）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２１）およびリバースプライマー（配列番号２２）を使用してＰＣＲを行い、サイトファガ・ハチンソニのCHU2268（「CHU2268」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびXhoIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、CHU2268-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００６８】
ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ２７２１０）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２３）およびリバースプライマー（配列番号２４）を使用してＰＣＲを行い、ルミノコッカス・アルブスのR_BGL（「R.albus」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびXhoIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、R.albus-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００６９】
さらに、PgsAをコードする核酸を取り除いたpHLAにTfu0937を導入したベクターも作製した。このベクターはTfu0937のみを発現させるために作製した。サーモビフィダ・フスカＹＸのゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２５）およびリバースプライマー（配列番号２６）を使用してＰＣＲを行って得られた遺伝子断片をBglIIおよびHindIIIで切断し、BglIIおよびHindIIIで切断したpHLAに連結した。これにより、PgsAをコードする核酸が切り出されて除かれ、Tfu0937が導入されたベクターTfu0937ΔPgsA-pHLAを得た。このプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００７０】
これらの形質転換体をルリア−ベルタニ（ＬＢ）培地で３７℃にて２４時間培養して、菌体数を揃えて、培養後の液体を15000rpmにて５分間遠心して菌体と上清とを分離した後、培養上清および菌体のβグルコシダーゼ活性を測定した。βグルコシダーゼ活性の測定は、pNPG法で行った。菌体または培養上清を基質p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）と接触させ、遊離したp-ニトロフェノール量を400nmで吸光度測定した。この結果を図１に示す。
【００７１】
図１は、大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）で発現させた種々の候補タンパク質のβグルコシダーゼ活性を示すグラフである。図１の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は、βグルコシダーゼ活性（400nmでの吸光度）を示す。横軸の「BglA」、「Sde0245」、「CHU2268」、「R.albus」、および「Tfu0937」はそれぞれ、PgsAのＣ末端側にこれらのタンパク質のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現してこれらのタンパク質を表層提示する形質転換大腸菌の結果を表す。横軸の「Tfu0937ss」は、PgsAと融合させずにTfu0937のみを発現させた形質転換大腸菌の結果を表す。横軸の「pHLA」は、βグルコシダーゼ候補タンパク質なしでPgsAのみを導入したコントロール大腸菌の結果を表す。各結果とも、左側に菌体、右側に培養上清のβグルコシダーゼ活性を示す。
【００７２】
図１に示されるように、BglAおよびTfu0937で、高いβグルコシダーゼ活性が見られた。これらのタンパク質は、実験に用いた２種類の大腸菌ともに活性を示し、また菌体表層にも活性があることがわかった。また、Tfu0937を単独（アンカータンパク質なし）で発現させた大腸菌においても、菌体表層に活性を持つことが示された。
【００７３】
続いて、これらの菌体を初期光学濃度（OD）=0.01で、セロビオースを炭素源とする最小培地（K2HPO4 0.7%, KH2PO4 0.3%, (NH4)SO4 0.1%, MgSO4・7H2O 0.01%, セロビオース0.2%）に植菌し、３７℃で培養しながら、ODの経時変化をモニターし、形質転換大腸菌の増殖能を調べた。この結果を図２に示す。
【００７４】
図２は、種々のβグルコシダーゼ候補タンパク質を表層提示させた大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。図２の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は大腸菌数（ＯＤ値）、横軸は培養時間（時間）を示す。図２の（Ａ）および（Ｂ）とも、塗りつぶした菱形はpHLA、塗りつぶした四角はBglA-pHLA、白抜き三角はSde0245-pHLA、×はSde2497-pHLA、白抜き菱形はCHU2268-pHLA、白抜き丸はR.albus-pHLA、塗りつぶした丸はTfu0937-pHLAss、塗りつぶした三角はTfu0937-pHLAの発現ベクターを用いた場合の結果を示す。
【００７５】
図２に示されるように、セロビオースからの増殖においては、Tfu0937を用いた場合（「Tfu0937-pHLA」）に最も増殖がよかった。どちらの大腸菌においても同様の結果となった。Tfu0937単独（アンカータンパク質なし「Tfu0937-pHLAss」）発現の場合も増殖能は高かった。BglAを用いた場合（「BglA-pHLA」）も、コントロールのpHLAよりも増殖能が高められた。
【００７６】
（実施例２：大腸菌表層提示のためのアンカータンパク質の探索）
クロストリジウム・セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２７）およびリバースプライマー（配列番号２８）を使用してＰＣＲを行って、BglAの遺伝子断片を得た。このBglA遺伝子断片をXhoIおよびBamHIで切断し、XhoIで切断したpHLAに連結した。
【００７７】
以下のアンカー候補タンパク質をコードする遺伝子断片を調製した。大腸菌のゲノムＤＮＡは、国立遺伝学研究所より入手したBW25113株から調製したゲノムＤＮＡを用いた。
【００７８】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２９）およびリバースプライマー（配列番号３０）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌hdeD（「hdeD」）の遺伝子断片を調製した。
【００７９】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３１）およびリバースプライマー（配列番号３２）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌slp（「slp」）の遺伝子断片を調製した。
【００８０】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３３）およびリバースプライマー（配列番号３４）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌blc（「blc」）の遺伝子断片を調製した。
【００８１】
コリネ菌で表層提示アンカーとして報告のあるPorBの遺伝子断片（Applied Microbiology and Biotechnology, 2009年, 84巻, 733-739頁）もまた、候補アンカータンパク質として用いた。
【００８２】
得られた候補アンカータンパク質遺伝子断片をBglIIおよびBamHIで切断し、このBamHI側を上記のBglA遺伝子断片のBamHI側にそしてBglII側を、BglIIで切断したpHLAに連結した。これにより、PgsAの代わりにこれらのアンカー候補タンパク質のＣ末端側にBglAのＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（それぞれhdeD-BglA、slp-BglA、blc-BglA、およびPorB-BglA）を得た。形質転換大腸菌の調製およびβグルコシダーゼ活性および増殖能の測定は、実施例１と同様に行った。
【００８３】
図３は、大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）におけるBglAの表層提示のために種々のアンカー候補タンパク質を用いた形質転換大腸菌のβグルコシダーゼ活性を示すグラフである。図３の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は、βグルコシダーゼ活性（400nmでの吸光度）を示す。横軸の「pgsA」、「hdeD」、「slp」、「blc」、および「porB」はそれぞれ、これらのタンパク質のＣ末端側にBglAのＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させた形質転換大腸菌の結果を表す。各結果とも、左側に菌体、右側に培養上清のβグルコシダーゼ活性を示す。
【００８４】
図３に示されるように、hdeD、slp、およびblcで高いβグルコシダーゼ活性が見られた。既にコリネバクテリウムで表層提示アンカーとして報告のあるPorBを用いた場合、ほとんど活性を示さなかった。
【００８５】
図４は、種々のアンカー候補タンパク質を用いてBglAを表層提示させた大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。図２の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は大腸菌数（ＯＤ値）、横軸は培養時間（時間）を示す。図４の（Ａ）および（Ｂ）とも、塗りつぶした菱形はpgsA、塗りつぶした四角はhdeD、塗りつぶした三角はslp、白抜き丸はblc、塗りつぶした丸はporBを表層提示アンカーとして用いた場合の結果を示す。
【００８６】
図４に示されるように、hdeDおよびblcが特によい増殖を示し、これらは、pgsAを用いたときよりも２倍を上回る高い増殖を示した。Slpもまたよい増殖を示した。
【００８７】
（実施例３）
サーモビフィダ・フスカＹＸのゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３５）およびリバースプライマー（配列番号３６）を使用してＰＣＲを行い、サーモビフィダ・フスカＹＸ BGL0937（「Tfu0937」）の遺伝子断片を調製した。これをBglIIおよびHindIIIで切断し、HindIIIで切断したpHLAに連結した。
【００８８】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３７）およびリバースプライマー（配列番号３８）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌blc（「blc」）の遺伝子断片を調製した。
【００８９】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３９）およびリバースプライマー（配列番号４０）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌hdeD（「hdeD」）の遺伝子断片を調製した。
【００９０】
得られたblcまたはhdeDの遺伝子断片をBglIIおよびNotIで切断し、このBglII側を上記のTfu0937遺伝子断片のBglII側にそしてNotI側を、NotIで切断したpHLAに連結した。これにより、blcまたはhdeDのＣ末端側にTfu0937のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（blc-Tfu0937、hdeD-Tfu0937）を得た。形質転換大腸菌の調製およびβグルコシダーゼ活性および増殖能の測定は、実施例１と同様に行った。
【００９１】
（実施例４）
サーモビフィダ・フスカＹＸのゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号４１）およびリバースプライマー（配列番号４２）を使用してＰＣＲを行い、サーモビフィダ・フスカＹＸ BGL0937（「Tfu0937」）の遺伝子断片を調製した。これをBglIIおよびHindIIIで切断し、BglIIで切断したpHLAに連結した。
【００９２】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号４３）およびリバースプライマー（配列番号４４）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌slp（「slp」）の遺伝子断片を調製した。
【００９３】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号４５）およびリバースプライマー（配列番号４６）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌blc（「blc」）の遺伝子断片を調製した。
【００９４】
得られたslpまたはblcの遺伝子断片をXhoIおよびHindIIIで切断し、このHindIII側を上記のTfu0937遺伝子断片のHindIII側にそしてXhoI側を、XhoIで切断したpHLAに連結した。これにより、slpまたはblcのＮ末端側にTfu0937のＣ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（Tfu0937-slp、Tfu0937-blc）を得た。形質転換大腸菌の調製およびβグルコシダーゼ活性および増殖能の測定は、実施例１と同様に行った。
【００９５】
実施例３および４の形質転換大腸菌のセロビオース培地での増殖能の結果を図５に示す。
【００９６】
図５は、blcまたはhdeDのＣ末端側にTfu0937のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（blc-Tfu0937、hdeD-Tfu0937）あるいはslpまたはblcのＮ末端側にTfu0937のＣ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（Tfu0937-slp、Tfu0937-blc）を用いて形質転換した大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。PgsAのＣ末端側にTfu0937のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクターで形質転換した大腸菌の結果もまた併せて示す。図５の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は大腸菌数（ＯＤ値）、横軸は培養時間（時間）を示す。図５の（Ａ）および（Ｂ）とも、白抜き三角はPgsA-Tfu、塗りつぶした丸はTfu-blc、塗りつぶした三角はTfu-slp、塗りつぶした菱形はblc-Tfu、×はhdeD-Tfuを発現ベクターとして用いた場合の結果を示す。
【００９７】
図５に示されるように、fu0937-blc形質転換大腸菌およびblc-Tfu0937形質転換大腸菌は、セロビオース培地での増殖能に優れていた。blcは、提示したいタンパク質をそのN末端、C末端のどちらにも融合できる。Tfu0937-slp形質転換大腸菌もまた、セロビオース培地での増殖能が良好であった。Slpもまた、提示したいタンパク質をそのN末端、C末端のどちらにも融合できる。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によって、セロビオースを分解して増殖できる大腸菌の獲得に成功した。大腸菌の培養にバイオマスを利用できればバイオマスの糖化工程を省略でき、そして有用物質を生産するように組換え技術を利用した大腸菌を用いることで、バイオマスから直接有用物質を生産できるようになり、大幅なコストダウンにつながる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマス分解酵素を発現する大腸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌は遺伝子組換えによる有用物質生産に好適に用いられるが、培養中の生育のためにグルコースを必要とする。近年、セルロースなどのバイオマスの有効利用が探索されているが、大腸菌は、このようなバイオマスを直接資化できない。大腸菌の培養にバイオマスを利用するためには、グルコースを得るために、予めセルロースを酵素により糖化する必要がある。大腸菌にバイオマス分解能を付与し、すなわち、バイオマス分解酵素を発現させることができれば、糖化工程を省略して直接バイオマスを炭素源として大腸菌を培養できると期待される。
【０００３】
しかし、酵母などの真核生物では、バイオマス分解酵素の発現例があるが、大腸菌などの細菌では、バイオマス分解酵素を発現させてバイオマスを分解したという報告例はない。
【０００４】
また、細胞表層提示技術は、酵素などをその細胞の表層に提示できる優れた技術である。細胞自体が固定化酵素触媒として利用できる上、提示されている酵素を細胞の回収と同時に回収できる。大腸菌などの細菌の表層に酵素を提示可能なアンカータンパク質としては、PgsAおよびOmpAなどが報告されている（PgsA：特許文献１および２、非特許文献１；およびOmpA：非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０３／０１４３６０号
【特許文献２】特開２００５−３１２４２６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006年, 70巻, 564-572頁
【非特許文献２】Protein Eng., 1996年, 9巻, 239-247頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、バイオマス分解酵素を発現する大腸菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、該（ａ）または（ｂ）のタンパク質を発現する大腸菌を提供する：
（ａ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつβグルコシダーゼ活性を有する、タンパク質。
【０００９】
１つの実施態様では、上記ポリヌクレオチドが、以下の（１）または（２）のタンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、上記大腸菌は、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質を表層提示する：
（１）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該（ａ）または（ｂ）のタンパク質を大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
【００１０】
別の実施態様では、上記大腸菌は、BW25113株またはJCM20137株である。
【００１１】
本発明は、以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質を提供する：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
【００１２】
本発明はさらに、以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする遺伝子を提供する：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
【００１３】
１つの実施態様では、上記遺伝子は、以下の（Ｉａ）または（IIａ）を含む：
（Ｉａ）配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択される塩基配列からなるＤＮＡ；
（IIａ）該（Ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【００１４】
本発明はさらに、上記（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする遺伝子または上記（Ｉａ）または（IIａ）を含む遺伝子を含む、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターを提供する。
【００１５】
１つの実施態様では、上記発現ベクターは、以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする核酸あるいは以下の（Ｉａ）または（IIａ）のＤＮＡを含み、該（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（Ｉａ）または（IIａ）のＤＮＡの下流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸が挿入されて用いる：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該目的のタンパク質またはぺプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質；
（Ｉａ）配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択される塩基配列からなるＤＮＡ；
（IIａ）該（Ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【００１６】
別の実施態様では、上記発現ベクターは、以下の（ｉ）または（ii）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（ｉａ）または（iiａ）のＤＮＡを含み、該（ｉ）または（ii）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（ｉａ）または（iiａ）のＤＮＡの上流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸が挿入されて用いる、請求項７に記載の発現ベクター：
（ｉ）配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ii）配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該目的のタンパク質またはぺプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質；
（ｉａ）配列番号７または配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ；
（iiａ）該（ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【００１７】
本発明はまた、目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターを提供する。
【００１８】
本発明はまた、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法を提供し、上記の目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターを大腸菌に導入する工程を含む。
【００１９】
本発明はさらに、上記目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法で製造された大腸菌を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、バイオマス分解酵素を発現する大腸菌が提供される。さらに、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる新規なタンパク質、その遺伝子、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現用ベクター、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法、および目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）で発現させた種々の候補タンパク質のβグルコシダーゼ活性を示すグラフである。
【図２】種々のβグルコシダーゼ候補タンパク質を表層提示させた大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。
【図３】大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）におけるBglAの表層提示のために種々のアンカー候補タンパク質を用いた形質転換大腸菌のβグルコシダーゼ活性を示すグラフである。
【図４】種々のアンカー候補タンパク質を用いてBglAを表層提示させた大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。
【図５】blcまたはhdeDのＣ末端側にTfu0937のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（blc-Tfu0937、hdeD-Tfu0937）あるいはslpまたはblcのＮ末端側にTfu0937のＣ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（Tfu0937-slp、Tfu0937-blc）を用いて形質転換した大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、βグルコシダーゼを発現する大腸菌を提供する。この大腸菌は、大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。
【００２３】
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質としては、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）のＹＸ株のBGL0937（単に「Tfu0937」という場合もある）およびクロストリジウム・セルロボランス（Clostridium cellulovorans）のBglAタンパク質（単に「BglA」という場合もある）が挙げられる。Tfu0937およびBglAの全長アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列で示される。
【００２４】
大腸菌で発現された際にβグルコシダーゼ活性が失われない程度に、アミノ酸変異（欠失、置換、付加）が起こっているタンパク質もまた用いられ得る。このような変異には、自然界において生じる変異の他に、人為的な変異も含まれる。人為的な変異を生じさせる手段としては、部位特異的突然変異誘発法（Nucleic Acids Res. 1982年, 10巻, 6487-6500頁）が挙げられるがこれに限定されるわけではない。変異（欠失、置換、付加）したアミノ酸の数は、βグルコシダーゼ活性が失われない限りその個数は制限されないが、好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内である。
【００２５】
また、βグルコシダーゼ活性が失われない程度に、配列番号２または４に対して相同性を有するタンパク質もまた挙げられる。相同性は、８０％以上が好ましく、９０％以上が特に好ましい。
【００２６】
本発明において「相同性」とは、２つのポリペプチドあるいはポリヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象のアミノ酸配列または塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。相同性の数値（％）は両方の（アミノ酸または塩基）配列に存在する同一のアミノ酸または塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸または塩基の総数で割り、得られた数値に100をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび相同性を得るためのアルゴリズムとしては当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど）が挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、例えばBLASTP、FASTAなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。塩基配列の相同性は、BLASTN、FASTAなどのソフトウェアを用いて決定される。
【００２７】
本明細書で用いる「ポリペプチド」という用語はアミノ酸の重合体を指し、便宜的に「タンパク質」なる語を比較的長いポリペプチド、「ペプチド」なる語を比較的短いポリペプチドを示すように用いているが、これらはアミノ酸残基の数を限定するわけではない。したがって、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、いずれもポリペプチドの定義内に含まれる。「タンパク質またはペプチド」はあらゆる長さのポリペプチドを包含する概念である。
【００２８】
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質をコードする遺伝子として、サーモビフィダ・フスカのＹＸ株のBGL0937「Tfu0937」をコードする遺伝子およびクロストリジウム・セルロボランスのBglAタンパク質「BglA」をコードする遺伝子が挙げられる。Tfu0937をコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示されるとおりである。この塩基配列は、サーモビフィダ・フスカのＹＸ株のゲノム配列に含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に由来し、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）にNCBI Reference Sequence：YP_003842858.1で登録されている。BglAをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号３に示される。この塩基配列は、クロストリジウム・セルロボランスのゲノム配列に含まれるＯＲＦに由来し、ＮＣＢＩにNCBI Reference Sequence：YP_288998.1で登録されている。
【００２９】
該遺伝子としては、配列番号１または３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ大腸菌で発現させた際に、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡもまた用いられ得る。
【００３０】
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、0.2×SSC、0.1%SDS、65℃程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるＤＮＡは、上記塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の高い相同性を有することが望ましく、さらに９０％以上の相同性を有することが好ましい。ここで「相同性」については上記のとおりである。
【００３１】
βグルコシダーゼ活性は、機能を確認すべきタンパク質を発現するためのベクター（好ましくは、アンカータンパク質を発現する表層提示用ベクター）を構築し、これを大腸菌に導入して発現させ、例えば、pNPG法により活性の有無を確認する。例えば、機能を確認すべきタンパク質を発現させた大腸菌の生菌体を基質p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）と接触させ、遊離したp-ニトロフェノール量を400nmで吸光度測定することによって、βグルコシダーゼ活性が確認され得る。βグルコシダーゼの表層提示は、生菌体との接触により基質ＰＮＰＧが分解されることで確認され得る。さらに、セロビオースを基質とする培地での培養による増殖能を調べることで、βグルコシダーゼの発現（好ましくは表層提示）が確認され得る。
【００３２】
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質をコードする遺伝子は、クロストリジウム・セルロボランスまたはサーモビフィダ・フスカを含む微生物のゲノム（例えば、それぞれアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より入手され得る；クロストリジウム・セルロボランスのゲノムＤＮＡはＡＴＣＣ３５２９６として、サーモビフィダ・フスカのゲノムＤＮＡはＡＴＣＣ２７７３０として入手可能である）から、当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはハイブリダイゼーション技術によって取得され得る。あるいはＤＮＡ合成機などを用いて人工的に合成してもよい。配列の決定は常套方法により配列決定機を用いて行われ得る。
【００３３】
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質をコードする遺伝子の大腸菌への導入は、発現ベクターの形態で宿主に導入されてもよく、あるいは宿主の遺伝子に挿入してまたは宿主の遺伝子との相同組換えで宿主の染色体に組み込まれてもよい。
【００３４】
βグルコシダーゼのような目的のタンパク質またはペプチドを大腸菌に表層提示させるために、アンカータンパク質が用いられ得る。大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質としては、大腸菌（Escherichia coli）由来のタンパク質slp、blc、およびhdeDが用いられ得る。これらのタンパク質は、膜に局在することが予測されていたのみであり、機能未知のタンパク質であった。slp、blc、およびhdeDのそれぞれの全長アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８、１０、および１２で示される。ストレプトマイセス・スブチリス（Streptomyces subtilis）のPgsA（特許文献１および２、非特許文献１）もまた用いられ得、PgsAは、プラスミドの形態で入手することができる（pHLA、非特許文献１）。PgsAの全長アミノ酸配列は、配列番号６に示される。これらのアンカータンパク質は、その末端（Ｃ末端またはＮ末端の少なくとも一方）に融合された目的のタンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる。
【００３５】
大腸菌で発現された際に、アンカー機能が失われない（例えば、その末端に融合されたβグルコシダーゼのような目的のタンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる）程度に、アミノ酸変異（欠失、置換、付加）が起こっているタンパク質もまた用いられ得る（このようなタンパク質を、「アンカー変異タンパク質」ともいう）。ここで、「変異」については上記の通りである。変異（欠失、置換、付加）したアミノ酸の数は、上記アンカータンパク質のアンカー機能が失われない限りその個数は制限されないが、好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内である。
【００３６】
また、上記アンカータンパク質のアンカー機能が失われない程度に、配列番号６、８、１０、または１２に対して相同性を有するタンパク質もまた用いられ得る。このような相同性タンパク質もまた、「アンカー変異タンパク質」に包含され得る。相同性は、８０％以上が好ましく、９０％以上が特に好ましい。ここで、「相同性」については上記の通りである。
【００３７】
大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質をコードする遺伝子として、大腸菌由来のタンパク質slp、blc、およびhdeDのそれぞれをコードする遺伝子およびストレプトマイセス・スブチリスのPgsAをコードする遺伝子が挙げられる。slp、blc、およびhdeDのそれぞれをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号７、９、および１１に示されるとおりである。これらの塩基配列は、大腸菌のゲノム配列に含まれるＯＲＦに由来し、それぞれNCBIに以下のNCBI Reference Sequenceで登録されている（Slp: YP_001732337.1、blc:YP_001732919.1、hdeD:YP_001732342.1）。PgsAをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号５に示される。
【００３８】
該遺伝子としては、配列番号５、７、９、および１１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ大腸菌で発現させた際にアンカー機能を有する（例えば、その末端に融合されたβグルコシダーゼのような目的のタンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる）タンパク質をコードする、ＤＮＡ（このようなＤＮＡを、「アンカータンパク質遺伝子変異体」ともいう）もまた用いられ得る。ここで、「ストリンジェントな条件」については上記の通りである。
【００３９】
大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、大腸菌またはストレプトマイセス・スブチリスを含む微生物のゲノムから、当業者に周知のＰＣＲまたはハイブリダイゼーション技術によって取得され得る。例えば、大腸菌株BW25113（国立遺伝学研究所より入手され得る）から当業者が通常用いる方法に従って調製した大腸菌のゲノムＤＮＡから、本明細書に記載した配列情報（特に、配列番号７、９または１１）に基づいて作製したプライマーまたはプローブを用いて、大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を調製し得る。あるいはＤＮＡ合成機などを用いて人工的に合成してもよい。配列の決定は常套方法により配列決定機を用いて行われ得る。
【００４０】
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質、および大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質は、大腸菌用発現カセットの構築に用いられ得る。このような発現カセットは、PgsA（配列番号６）、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２）のそれぞれのアンカータンパク質あるいは上述したようなアンカー変異タンパク質のＣ末端側に目的のタンパク質またはペプチド（例えば、βグルコシダーゼ）を融合させた融合タンパク質を発現するように構築され得る。また、slp（配列番号８）またはslc（配列番号１０）あるいは上述したようなアンカー変異タンパク質のＮ末端側に目的のタンパク質またはペプチド（例えば、βグルコシダーゼ）を融合させた融合タンパク質を発現するように構築することもできる。
【００４１】
目的タンパク質またはペプチドの大腸菌の表層提示のために、上記発現カセットは、分泌シグナル配列を含み得る。分泌シグナル配列とは、一般に細胞外（ペリプラズムも含む）に分泌されるタンパク質（分泌性タンパク質）のＮ末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むアミノ酸配列をいい、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去される。分泌シグナル配列は、発現カセットにおいてＮ末端側に配置され得る。発現産物を細胞膜へ導くことができる分泌シグナル配列であれば、どのような分泌シグナル配列でも用いられ得、起源は問わない。例えば、分泌シグナル配列は、大腸菌にて機能し得る分泌シグナル配列を添加しても、アンカータンパク質自身のものを利用しても、あるいは目的タンパク質またはペプチド自身のものを利用してもよい。アンカータンパク質（PgsA（配列番号６）、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２））は、これらのタンパク質自身に分泌シグナル配列を含むと考えられ、βグルコシダーゼタンパク質であるTfu0937（配列番号２）もまた、このタンパク質自身に分泌シグナル配列を含むと考えられる。アンカータンパク質に融合している目的タンパク質またはペプチドの活性に影響を及ぼさないのであれば、大腸菌で発現される際に、アンカータンパク質と目的タンパク質またはペプチドとの融合タンパク質における分泌シグナル配列の一部または全部が該融合タンパク質のＮ末端に残ってもよい。
【００４２】
本発明は、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌もまた提供する。このような大腸菌は、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２）のそれぞれのアンカータンパク質あるいは上述したようなアンカー変異タンパク質、および目的のタンパク質またはペプチドを発現し得る。目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌は、上記のような発現カセットを宿主大腸菌で発現させることによって作製され得る。また、例えば、以下に説明するような発現ベクターを、宿主大腸菌に導入することによって作製され得る。
【００４３】
本発明は、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターを提供する。この発現ベクターは、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２）のそれぞれのアンカータンパク質あるいは上述したようなアンカー変異タンパク質をコードする遺伝子（核酸）を含む。あるいは、slp（配列番号７）、blc（配列番号９）、およびhdeD（配列番号１１）のＤＮＡあるいは上述したようなアンカータンパク質遺伝子変異体を含む。目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターは、目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子（核酸）をさらに含み得る。目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターは、上述したような分泌シグナル配列をコードする遺伝子を含み得る。
【００４４】
１つの実施態様では、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターは、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２）または上記のアンカー変異タンパク質（以下、まとめて「Ｃ末端側アンカータンパク質」）のＣ末端側に該目的タンパク質またはペプチドを融合させた融合タンパク質を発現するように配置されればよく、好ましくは、Ｃ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の下流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）が挿入される形態である。「インフレーム」とは、アンカーと目的のタンパク質またはペプチドが一続きで読めればよく、間に数アミノ酸〜数十アミノ酸でなるスペーサーを介するように連結されてもよい。この発現ベクターは、Ｃ末端側アンカータンパク質をコードする核酸を含み、Ｃ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の下流に、インフレームにて目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）を挿入可能な、好適な制限酵素部位を有し得る。目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）を、該組換えベクター中のＣ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の下流（３’末端側）に、インフレームにて挿入して得られた構築物を大腸菌に導入し、発現させるとＣ末端側アンカータンパク質のＣ末端側に目的タンパク質またはペプチドが融合した融合タンパク質が発現し、その結果、目的タンパク質またはペプチドは大腸菌の表層に提示され得る。
【００４５】
別の実施態様では、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターは、slp（配列番号８）およびblc（配列番号１０）または上記のアンカー変異タンパク質（以下、まとめて「Ｎ末端側アンカータンパク質」）のＮ末端側に該目的タンパク質またはペプチドを融合させた融合タンパク質を発現するように配置されればよく、好ましくは、Ｎ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の上流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）が挿入される形態である。この発現ベクターは、Ｎ末端側アンカータンパク質をコードする核酸を含み、Ｎ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の上流に、インフレームにて目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）を挿入可能な、好適な制限酵素部位を有し得る。目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）を、該組換えベクター中のＮ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の上流（５’末端側）に、インフレームにて挿入して得られた構築物を大腸菌に導入し、発現させるとＮ末端側アンカータンパク質のＮ末端側に目的タンパク質またはペプチドが融合した融合タンパク質が発現し、その結果、目的タンパク質またはペプチドは大腸菌の表層に提示され得る。
【００４６】
各種ＤＮＡおよび組換えＤＮＡの合成、結合、および発現ベクターへの挿入は、当業者が通常用い得る技法で行われ得る。
【００４７】
発現ベクターとしては、宿主大腸菌内で自律的に複製可能なプラスミドまたはファージから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ベクターは、導入されるグラム陰性細菌に適合した複製開始起点、選択可能なマーカー、プロモーター等の発現制御配列、ターミネーターを含むのが好ましい。プラスミドベクターとしては、例えば大腸菌で発現させる場合は、pET系ベクター、pET15bが挙げられる。ファージベクターとしてはλファージベクターなどが挙げられる。
【００４８】
選択可能なマーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００４９】
発現ベクターは、発現制御配列を含むものが好ましい。発現制御配列とは、ＤＮＡ配列に適切に連結した場合、グラム陰性細菌において、そのＤＮＡ配列を発現させることが出来る配列を意味する。発現制御配列には少なくともプロモーターが含まれる。プロモーターは構成的プロモーターであっても誘導可能なプロモーターであってもよい。さらに該発現ベクターには転写終結シグナル、即ちターミネーター領域が好ましくは含まれる。
【００５０】
発現ベクターは、Ｃ末端側アンカータンパク質またはＮ末端側アンカータンパク質と目的タンパク質またはペプチドとの融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡの構築を容易にするために、Ｃ末端側アンカータンパク質またはＮ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することにより作製することができる。
【００５１】
目的のタンパク質またはペプチドとしては、特に限定されず、本来大腸菌の細胞表層に局在しないタンパク質であって、大腸菌の細胞表層に固定することを目的として配置されるタンパク質が好ましい。例えば、酵素（例えば、βグルコシダーゼ）、抗体、抗原、リガンドなどが挙げられる。
【００５２】
目的タンパク質またはペプチドの起源は宿主として用いる大腸菌に対して異種のものであってもよいし、宿主として用いる大腸菌由来のものであってもよい。
【００５３】
上述したように、上記のアンカータンパク質をコードする遺伝子（核酸）に加え、目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子（核酸）をさらに含む発現ベクターを作製し得る。このようなアンカータンパク質をコードする遺伝子（核酸）および目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子（核酸）を含む発現ベクターを大腸菌に導入することで、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造できる。
【００５４】
発現ベクターの大腸菌への導入には、当業者が通常用いる方法が用いられ得る。このような方法としては、例えば、塩化カルシウム法、コンピテント法、３親接合（triparental mating）法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。発現ベクターの大腸菌への導入により得られる大腸菌形質転換体は、必要に応じて、当業者が通常用いる方法でスクリーニングされ得る。
【００５５】
融合タンパク質を発現させる方法は遺伝子工学の常法に基づいて行うことができる。大腸菌に用いられるベクターの情報や外来遺伝子の導入、発現、形質転換体のスクリーニングなどの方法は多くの実験書に記載されている（例えば、Sambrook, J.et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd Edition, CSHL Press, 2001）。
【００５６】
用いる宿主は大腸菌であれば特に限定されない。好ましくは、BW25113（国立遺伝学研究所より入手され得る）およびJCM20137（理研BRC微生物材料開発室より入手され得る）が挙げられる。
【００５７】
形質転換体である宿主細菌の培養形態は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を適宜選択すればよく、通常液体培養で行われる。培地の炭素源としてはグルコース、グリセロールなどが挙げられるが、βグルコシダーゼを表層提示している場合はセロビオースを含んでもよい。窒素源としては硫酸アンモニウム、カザミノ酸などが挙げられる。その他、塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどを所望により使用できる。
【００５８】
培養温度は宿主大腸菌が生育し、目的タンパク質またはペプチドを提示する範囲で適宜変更できるが、一般に大腸菌の場合、温度37℃、12時間、pH7.2の培養条件でよい。
【００５９】
目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌は、表面に提示された目的タンパク質またはペプチドの種類に応じて利用することができる。目的タンパク質またはペプチドが酵素である場合、酵素を表層提示する大腸菌を含む酵素剤として提供され得る。酵素がβグルコシダーゼの場合は、バイオマス分解に用いられ得る。
【００６０】
βグルコシダーゼを発現する（好ましくは表層提示する）大腸菌は、βグルコシダーゼ活性を有する。さらにセロビオースを含む培地で増殖も可能である。本発明により、バイオマスを分解しながら増殖できる大腸菌が得られた。
【００６１】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
（実施例１：大腸菌で活性を持つβグルコシダーゼの探索）
大腸菌で活性を持つβグルコシダーゼを探索するために、表層提示用プラスミドベクターpHLA（非特許文献１）を用いた。pHLAは、大腸菌表層提示のためのアンカータンパク質であるストレプトマイセス・スブチリス（Streptomyces subtilis）のPgsAを含み、PgsAのＣ末端側に目的のタンパク質のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるためのものである。
【００６３】
クロストリジウム・セルロボランスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ３５２９６）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号１３）およびリバースプライマー（配列番号１４）を使用してＰＣＲを行い、クロストリジウム・セルロボランスのBglA（「BglA」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびSpeIで切断し、同じく切断したベクターpHLに連結し、BglA-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113（国立遺伝学研究所より入手）およびJCM20137（理研BRC微生物材料開発室より入手）のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００６４】
サーモビフィダ・フスカＹＸのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ２７７３０）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号１５）およびリバースプライマー（配列番号１６）を使用してＰＣＲを行い、サーモビフィダ・フスカＹＸのBGL0937（「Tfu0937」）の遺伝子断片を調製した。これをXhoIおよびHindIIIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、Tfu0937-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００６５】
サッカロファガス・デグラダンス（Saccharophagus degradans）２−４０のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ４３９６１）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号１７）およびリバースプライマー（配列番号１８）を使用してＰＣＲを行い、サッカロファガス・デグラダンス2-40 Sde0245（「Sde0245」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびXhoIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、Sde0245-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００６６】
サッカロファガス・デグラダンス２−４０のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号１９）およびリバースプライマー（配列番号２０）を使用してＰＣＲを行い、サッカロファガス・デグラダンス２−４０のSde2497（「Sde2497」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびXhoIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、Sde2497-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００６７】
サイトファガ・ハチンソニ（Cytophaga hutchinsonii）のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ３３４０６）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２１）およびリバースプライマー（配列番号２２）を使用してＰＣＲを行い、サイトファガ・ハチンソニのCHU2268（「CHU2268」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびXhoIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、CHU2268-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００６８】
ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ２７２１０）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２３）およびリバースプライマー（配列番号２４）を使用してＰＣＲを行い、ルミノコッカス・アルブスのR_BGL（「R.albus」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびXhoIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、R.albus-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００６９】
さらに、PgsAをコードする核酸を取り除いたpHLAにTfu0937を導入したベクターも作製した。このベクターはTfu0937のみを発現させるために作製した。サーモビフィダ・フスカＹＸのゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２５）およびリバースプライマー（配列番号２６）を使用してＰＣＲを行って得られた遺伝子断片をBglIIおよびHindIIIで切断し、BglIIおよびHindIIIで切断したpHLAに連結した。これにより、PgsAをコードする核酸が切り出されて除かれ、Tfu0937が導入されたベクターTfu0937ΔPgsA-pHLAを得た。このプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。
【００７０】
これらの形質転換体をルリア−ベルタニ（ＬＢ）培地で３７℃にて２４時間培養して、菌体数を揃えて、培養後の液体を15000rpmにて５分間遠心して菌体と上清とを分離した後、培養上清および菌体のβグルコシダーゼ活性を測定した。βグルコシダーゼ活性の測定は、pNPG法で行った。菌体または培養上清を基質p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）と接触させ、遊離したp-ニトロフェノール量を400nmで吸光度測定した。この結果を図１に示す。
【００７１】
図１は、大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）で発現させた種々の候補タンパク質のβグルコシダーゼ活性を示すグラフである。図１の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は、βグルコシダーゼ活性（400nmでの吸光度）を示す。横軸の「BglA」、「Sde0245」、「CHU2268」、「R.albus」、および「Tfu0937」はそれぞれ、PgsAのＣ末端側にこれらのタンパク質のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現してこれらのタンパク質を表層提示する形質転換大腸菌の結果を表す。横軸の「Tfu0937ss」は、PgsAと融合させずにTfu0937のみを発現させた形質転換大腸菌の結果を表す。横軸の「pHLA」は、βグルコシダーゼ候補タンパク質なしでPgsAのみを導入したコントロール大腸菌の結果を表す。各結果とも、左側に菌体、右側に培養上清のβグルコシダーゼ活性を示す。
【００７２】
図１に示されるように、BglAおよびTfu0937で、高いβグルコシダーゼ活性が見られた。これらのタンパク質は、実験に用いた２種類の大腸菌ともに活性を示し、また菌体表層にも活性があることがわかった。また、Tfu0937を単独（アンカータンパク質なし）で発現させた大腸菌においても、菌体表層に活性を持つことが示された。
【００７３】
続いて、これらの菌体を初期光学濃度（OD）=0.01で、セロビオースを炭素源とする最小培地（K2HPO4 0.7%, KH2PO4 0.3%, (NH4)SO4 0.1%, MgSO4・7H2O 0.01%, セロビオース0.2%）に植菌し、３７℃で培養しながら、ODの経時変化をモニターし、形質転換大腸菌の増殖能を調べた。この結果を図２に示す。
【００７４】
図２は、種々のβグルコシダーゼ候補タンパク質を表層提示させた大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。図２の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は大腸菌数（ＯＤ値）、横軸は培養時間（時間）を示す。図２の（Ａ）および（Ｂ）とも、塗りつぶした菱形はpHLA、塗りつぶした四角はBglA-pHLA、白抜き三角はSde0245-pHLA、×はSde2497-pHLA、白抜き菱形はCHU2268-pHLA、白抜き丸はR.albus-pHLA、塗りつぶした丸はTfu0937-pHLAss、塗りつぶした三角はTfu0937-pHLAの発現ベクターを用いた場合の結果を示す。
【００７５】
図２に示されるように、セロビオースからの増殖においては、Tfu0937を用いた場合（「Tfu0937-pHLA」）に最も増殖がよかった。どちらの大腸菌においても同様の結果となった。Tfu0937単独（アンカータンパク質なし「Tfu0937-pHLAss」）発現の場合も増殖能は高かった。BglAを用いた場合（「BglA-pHLA」）も、コントロールのpHLAよりも増殖能が高められた。
【００７６】
（実施例２：大腸菌表層提示のためのアンカータンパク質の探索）
クロストリジウム・セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２７）およびリバースプライマー（配列番号２８）を使用してＰＣＲを行って、BglAの遺伝子断片を得た。このBglA遺伝子断片をXhoIおよびBamHIで切断し、XhoIで切断したpHLAに連結した。
【００７７】
以下のアンカー候補タンパク質をコードする遺伝子断片を調製した。大腸菌のゲノムＤＮＡは、国立遺伝学研究所より入手したBW25113株から調製したゲノムＤＮＡを用いた。
【００７８】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２９）およびリバースプライマー（配列番号３０）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌hdeD（「hdeD」）の遺伝子断片を調製した。
【００７９】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３１）およびリバースプライマー（配列番号３２）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌slp（「slp」）の遺伝子断片を調製した。
【００８０】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３３）およびリバースプライマー（配列番号３４）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌blc（「blc」）の遺伝子断片を調製した。
【００８１】
コリネ菌で表層提示アンカーとして報告のあるPorBの遺伝子断片（Applied Microbiology and Biotechnology, 2009年, 84巻, 733-739頁）もまた、候補アンカータンパク質として用いた。
【００８２】
得られた候補アンカータンパク質遺伝子断片をBglIIおよびBamHIで切断し、このBamHI側を上記のBglA遺伝子断片のBamHI側にそしてBglII側を、BglIIで切断したpHLAに連結した。これにより、PgsAの代わりにこれらのアンカー候補タンパク質のＣ末端側にBglAのＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（それぞれhdeD-BglA、slp-BglA、blc-BglA、およびPorB-BglA）を得た。形質転換大腸菌の調製およびβグルコシダーゼ活性および増殖能の測定は、実施例１と同様に行った。
【００８３】
図３は、大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）におけるBglAの表層提示のために種々のアンカー候補タンパク質を用いた形質転換大腸菌のβグルコシダーゼ活性を示すグラフである。図３の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は、βグルコシダーゼ活性（400nmでの吸光度）を示す。横軸の「pgsA」、「hdeD」、「slp」、「blc」、および「porB」はそれぞれ、これらのタンパク質のＣ末端側にBglAのＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させた形質転換大腸菌の結果を表す。各結果とも、左側に菌体、右側に培養上清のβグルコシダーゼ活性を示す。
【００８４】
図３に示されるように、hdeD、slp、およびblcで高いβグルコシダーゼ活性が見られた。既にコリネバクテリウムで表層提示アンカーとして報告のあるPorBを用いた場合、ほとんど活性を示さなかった。
【００８５】
図４は、種々のアンカー候補タンパク質を用いてBglAを表層提示させた大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。図２の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は大腸菌数（ＯＤ値）、横軸は培養時間（時間）を示す。図４の（Ａ）および（Ｂ）とも、塗りつぶした菱形はpgsA、塗りつぶした四角はhdeD、塗りつぶした三角はslp、白抜き丸はblc、塗りつぶした丸はporBを表層提示アンカーとして用いた場合の結果を示す。
【００８６】
図４に示されるように、hdeDおよびblcが特によい増殖を示し、これらは、pgsAを用いたときよりも２倍を上回る高い増殖を示した。Slpもまたよい増殖を示した。
【００８７】
（実施例３）
サーモビフィダ・フスカＹＸのゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３５）およびリバースプライマー（配列番号３６）を使用してＰＣＲを行い、サーモビフィダ・フスカＹＸ BGL0937（「Tfu0937」）の遺伝子断片を調製した。これをBglIIおよびHindIIIで切断し、HindIIIで切断したpHLAに連結した。
【００８８】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３７）およびリバースプライマー（配列番号３８）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌blc（「blc」）の遺伝子断片を調製した。
【００８９】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３９）およびリバースプライマー（配列番号４０）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌hdeD（「hdeD」）の遺伝子断片を調製した。
【００９０】
得られたblcまたはhdeDの遺伝子断片をBglIIおよびNotIで切断し、このBglII側を上記のTfu0937遺伝子断片のBglII側にそしてNotI側を、NotIで切断したpHLAに連結した。これにより、blcまたはhdeDのＣ末端側にTfu0937のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（blc-Tfu0937、hdeD-Tfu0937）を得た。形質転換大腸菌の調製およびβグルコシダーゼ活性および増殖能の測定は、実施例１と同様に行った。
【００９１】
（実施例４）
サーモビフィダ・フスカＹＸのゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号４１）およびリバースプライマー（配列番号４２）を使用してＰＣＲを行い、サーモビフィダ・フスカＹＸ BGL0937（「Tfu0937」）の遺伝子断片を調製した。これをBglIIおよびHindIIIで切断し、BglIIで切断したpHLAに連結した。
【００９２】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号４３）およびリバースプライマー（配列番号４４）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌slp（「slp」）の遺伝子断片を調製した。
【００９３】
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号４５）およびリバースプライマー（配列番号４６）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌blc（「blc」）の遺伝子断片を調製した。
【００９４】
得られたslpまたはblcの遺伝子断片をXhoIおよびHindIIIで切断し、このHindIII側を上記のTfu0937遺伝子断片のHindIII側にそしてXhoI側を、XhoIで切断したpHLAに連結した。これにより、slpまたはblcのＮ末端側にTfu0937のＣ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（Tfu0937-slp、Tfu0937-blc）を得た。形質転換大腸菌の調製およびβグルコシダーゼ活性および増殖能の測定は、実施例１と同様に行った。
【００９５】
実施例３および４の形質転換大腸菌のセロビオース培地での増殖能の結果を図５に示す。
【００９６】
図５は、blcまたはhdeDのＣ末端側にTfu0937のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（blc-Tfu0937、hdeD-Tfu0937）あるいはslpまたはblcのＮ末端側にTfu0937のＣ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（Tfu0937-slp、Tfu0937-blc）を用いて形質転換した大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。PgsAのＣ末端側にTfu0937のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクターで形質転換した大腸菌の結果もまた併せて示す。図５の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は大腸菌数（ＯＤ値）、横軸は培養時間（時間）を示す。図５の（Ａ）および（Ｂ）とも、白抜き三角はPgsA-Tfu、塗りつぶした丸はTfu-blc、塗りつぶした三角はTfu-slp、塗りつぶした菱形はblc-Tfu、×はhdeD-Tfuを発現ベクターとして用いた場合の結果を示す。
【００９７】
図５に示されるように、fu0937-blc形質転換大腸菌およびblc-Tfu0937形質転換大腸菌は、セロビオース培地での増殖能に優れていた。blcは、提示したいタンパク質をそのN末端、C末端のどちらにも融合できる。Tfu0937-slp形質転換大腸菌もまた、セロビオース培地での増殖能が良好であった。Slpもまた、提示したいタンパク質をそのN末端、C末端のどちらにも融合できる。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によって、セロビオースを分解して増殖できる大腸菌の獲得に成功した。大腸菌の培養にバイオマスを利用できればバイオマスの糖化工程を省略でき、そして有用物質を生産するように組換え技術を利用した大腸菌を用いることで、バイオマスから直接有用物質を生産できるようになり、大幅なコストダウンにつながる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、該（ａ）または（ｂ）のタンパク質を発現する大腸菌：
（ａ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつβグルコシダーゼ活性を有する、タンパク質。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、以下の（１）または（２）のタンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、前記（ａ）または（ｂ）のタンパク質を表層提示する、請求項１に記載の大腸菌：
（１）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該（ａ）または（ｂ）のタンパク質を大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
【請求項３】
BW25113株またはJCM20137株である、請求項１または２に記載の大腸菌。
【請求項４】
以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
【請求項５】
以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする遺伝子：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
【請求項６】
以下の（Ｉａ）または（IIａ）を含む、請求項５に記載の遺伝子：
（Ｉａ）配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択される塩基配列からなるＤＮＡ、
（IIａ）該（Ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５または６に記載の遺伝子を含む、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクター。
【請求項８】
前記発現ベクターが、以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする核酸あるいは以下の（Ｉａ）または（IIａ）のＤＮＡを含み、該（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（Ｉａ）または（IIａ）のＤＮＡの下流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸が挿入されて用いる、請求項７に記載の発現ベクター：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該目的のタンパク質またはぺプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質；
（Ｉａ）配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択される塩基配列からなるＤＮＡ；
（IIａ）該（Ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
前記発現ベクターが、以下の（ｉ）または（ii）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（ｉａ）または（iiａ）のＤＮＡを含み、該（ｉ）または（ii）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（ｉａ）または（iiａ）のＤＮＡの上流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸が挿入されて用いる、請求項７に記載の発現ベクター：
（ｉ）配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ii）配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該目的のタンパク質またはぺプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質；
（ｉａ）配列番号７または配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ；
（iiａ）該（ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項１０】
前記目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、請求項７から９のいずれかの項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法であって、
請求項１０に記載の発現ベクターを大腸菌に導入する工程を含む、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法で製造された大腸菌。
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、該（ａ）または（ｂ）のタンパク質を発現する大腸菌：
（ａ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつβグルコシダーゼ活性を有する、タンパク質。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、以下の（１）または（２）のタンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、前記（ａ）または（ｂ）のタンパク質を表層提示する、請求項１に記載の大腸菌：
（１）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該（ａ）または（ｂ）のタンパク質を大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
【請求項３】
BW25113株またはJCM20137株である、請求項１または２に記載の大腸菌。
【請求項４】
以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
【請求項５】
以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする遺伝子：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
【請求項６】
以下の（Ｉａ）または（IIａ）を含む、請求項５に記載の遺伝子：
（Ｉａ）配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択される塩基配列からなるＤＮＡ、
（IIａ）該（Ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５または６に記載の遺伝子を含む、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクター。
【請求項８】
前記発現ベクターが、以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする核酸あるいは以下の（Ｉａ）または（IIａ）のＤＮＡを含み、該（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（Ｉａ）または（IIａ）のＤＮＡの下流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸が挿入されて用いる、請求項７に記載の発現ベクター：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該目的のタンパク質またはぺプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質；
（Ｉａ）配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択される塩基配列からなるＤＮＡ；
（IIａ）該（Ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
前記発現ベクターが、以下の（ｉ）または（ii）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（ｉａ）または（iiａ）のＤＮＡを含み、該（ｉ）または（ii）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（ｉａ）または（iiａ）のＤＮＡの上流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸が挿入されて用いる、請求項７に記載の発現ベクター：
（ｉ）配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ii）配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該目的のタンパク質またはぺプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質；
（ｉａ）配列番号７または配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ；
（iiａ）該（ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項１０】
前記目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、請求項７から９のいずれかの項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法であって、
請求項１０に記載の発現ベクターを大腸菌に導入する工程を含む、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法で製造された大腸菌。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１０５６１１（Ｐ２０１２−１０５６１１Ａ）
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５８３６１（Ｐ２０１０−２５８３６１）
【出願日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 業務委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 業務委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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