γδＴ細胞の製造方法および医薬
【課題】ＨＴＬＶ−１感染細胞を含む末梢血単核球を細胞源として用いた場合であっても、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる、γδＴ細胞の製造方法を提供すること。
【解決手段】細胞源として用いる末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去する。次いで、残余の末梢血単核球を懸濁した細胞懸濁液に、ビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を増殖および活性化させる。以上の手順により、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。
【解決手段】細胞源として用いる末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去する。次いで、残余の末梢血単核球を懸濁した細胞懸濁液に、ビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を増殖および活性化させる。以上の手順により、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γδＴ細胞の製造方法およびγδＴ細胞を含有する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん（悪性腫瘍）は、１９８１年から日本における死亡原因のトップとなっている。がんの治療法としては、外科療法、化学療法、放射線療法の三大療法がよく知られているが、近年、第４の治療法として免疫細胞療法が注目されている。免疫細胞療法とは、患者の体外で増殖および活性化させた免疫細胞を患者に投与し、その免疫細胞にがん細胞を攻撃させる治療法である。免疫細胞療法は、三大療法に比べて副作用がほとんどないという利点を有している。
【０００３】
免疫細胞療法には様々な種類の治療法があるが、その一つとしてγδＴ細胞療法がある。γδＴ細胞は、自然免疫を担う細胞であり、がん細胞に対して細胞障害活性を有することが知られている。γδＴ細胞療法は、患者由来のγδＴ細胞を体外で増殖および活性化させた後、調製されたγδＴ細胞を患者の体内に戻す治療法である。
【０００４】
γδＴ細胞療法では、患者の末梢血から得られた末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cells；以下「ＰＢＭＣｓ」と略記する）を細胞源として、γδＴ細胞を増殖および活性化させる。しかしながら、γδＴ細胞は、末梢血中に１〜５％程度しか存在しないため、患者から少量の末梢血を採取しても、治療に十分な数のγδＴ細胞を調製できないおそれがある。したがって、γδＴ細胞療法では、ＰＢＭＣｓを細胞源として、γδＴ細胞を効率的に増殖および活性化させることができる培養方法を確立することが重要である。そのような培養方法としては、ビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２（Interleukin-2；以下「ＩＬ−２」と略記する）を培養液に添加する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
一方、現在、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（human T-cell leukemia virus type-1；以下「ＨＴＬＶ−１」と略記する）の感染者は、日本に約１００万人以上存在し、世界に２０００万人以上存在する。感染者の一部は、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症（HTLV-I associated myelopathy；以下「ＨＡＭ」と略記する）を発病する（発病率：約０.３％）。また、感染者の別の一部は、成人Ｔ細胞白血病（adult T-cell leukemia；以下「ＡＴＬ」と略記する）を発病する（発病率：約５％）。
【０００６】
ＨＡＭおよびＡＴＬは、体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数が増加すると発病しやすくなることが知られている。したがって、ＨＴＬＶ−１感染者（キャリア）の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬの発病を予防できると期待される。同様に、ＨＡＭ患者およびＡＴＬ患者の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療できると期待される。しかしながら、現在のところ、ＨＡＭおよびＡＴＬに対する有効な予防法および治療法は確立されておらず、一刻も早い予防法および治療法の開発が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００６／００６７２０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＨＴＬＶ−１感染者が、ＡＴＬ以外のがんまたは感染症に罹患した場合、がんまたは感染症を治療するために免疫細胞療法を実施することが考えられる。しかしながら、従来の免疫細胞の培養方法では、試験管内においてＨＴＬＶ−１の感染が拡大してしまうおそれがある。このようにして調製されたＨＴＬＶ−１感染細胞を含む細胞集団を患者（ＨＴＬＶ−１感染者）に戻すと、患者の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数が増加してしまうおそれがある。以上のことから、ＨＴＬＶ−１感染者に対しては、γδＴ細胞療法などの免疫細胞療法を実施することができなかった。
【０００９】
また、前述の通り、ＨＴＬＶ−１感染者の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防することができると期待される。ＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させる手法としては、上述の免疫細胞療法を実施することが考えられる。しかしながら、ＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させる免疫細胞療法は、まだ確立されていない。
【００１０】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源として用いた場合であっても、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる、γδＴ細胞の製造方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、ＨＴＬＶ−１の感染に起因するＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防するための医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、γδＴ細胞を増殖させる前に、細胞源となるＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去することで、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得られることを見出した。また、本発明者は、γδＴ細胞がＨＴＬＶ−１感染細胞（白血病細胞を含む）に対して細胞傷害活性を有することも見出した。本発明者は、これらの知見を基にしてさらに検討を加えて本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、本発明の第１は、以下のγδＴ細胞の製造方法に関する。
［１］末梢血単核球を準備するステップと；前記末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去するステップと；前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球を含む細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を培養するステップと；を含む、γδＴ細胞の製造方法。
［２］前記表面マーカーは、ＣＤ４である、［１］に記載のγδＴ細胞の製造方法。
［３］前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ−１の感染者の末梢血から得られたものである、［１］または［２］に記載のγδＴ細胞の製造方法。
［４］前記細胞懸濁液中における前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、０.０５〜１００μＭの範囲内であり；前記細胞懸濁液中における前記インターロイキン−２の濃度は、５０〜２０００Ｕ／ｍＬの範囲内である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のγδＴ細胞の製造方法。
［５］前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬は、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のγδＴ細胞の製造方法。
【００１５】
また、本発明の第２は、以下の医薬に関する。
［６］末梢血単核球を準備するステップと；前記末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去するステップと；前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球を含む細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を培養するステップと；を含むγδＴ細胞の製造方法により製造されたγδＴ細胞を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬。
［７］前記表面マーカーは、ＣＤ４である、［６］に記載の医薬。
［８］前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ−１の感染者の末梢血から得られたものである、［６］または［７］に記載の医薬。
［９］ＨＴＬＶ−１関連脊髄症または成人Ｔ細胞白血病を治療または予防するための医薬である、［８］に記載の医薬。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の製造方法によれば、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを用いた場合であっても、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。したがって、本発明の製造方法によれば、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬を製造することができる。本発明の医薬は、特に、ＨＴＬＶ−１感染者に対してγδＴ細胞療法を行う際に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、培養前の細胞中のＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ３およびＴＣＲ Ｖγ９の発現パターンを示す２パラメータドットプロットである。図１Ｂは、培養後の細胞中のＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ３およびＴＣＲ Ｖγ９の発現パターンを示す２パラメータドットプロットである。
【図２】ＨＴＬＶ−１感染細胞を含むＰＢＭＣｓを細胞源としてγδＴ細胞を培養したときの、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量の培養前後の変化を示すグラフである。
【図３】ＣＤ４＋細胞を除去したＰＢＭＣｓを細胞源としてγδＴ細胞を培養したときの、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量の培養前後の変化を示すグラフである。
【図４】図４Ａは、ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株に対するγδＴ細胞およびαβＴ細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。図４Ｂは、ＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株に対するγδＴ細胞およびαβＴ細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１．γδＴ細胞の製造方法
本発明のγδＴ細胞の製造方法は、１）末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を準備する第１のステップと、２）前記ＰＢＭＣｓから所定の表面マーカーを発現している細胞を除去する第２のステップと、３）残余のＰＢＭＣｓを懸濁した細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を添加して、γδＴ細胞を培養する第３のステップとを含む。
【００１９】
本発明のγδＴ細胞の製造方法は、第２のステップにおいて、ＰＢＭＣｓから所定の表面マーカーを発現している細胞を除去することを一つの特徴とする。以下、各ステップについて説明する。
【００２０】
第１のステップでは、γδＴ細胞の細胞源となる末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を準備する。ここで「末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）」とは、末梢血から分離された、リンパ球（ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞など）、単球および樹状細胞を含む細胞集団を意味する。ＰＢＭＣｓを準備する方法は、特に限定されない。たとえば、採血により得られた末梢血を密度勾配遠心することで、ＰＢＭＣｓを得ることができる。採血量は、γδＴ細胞療法を行う患者に応じて適宜設定すればよいが、例えば４５〜７５ｍＬ程度である。
【００２１】
第２のステップでは、第１のステップで準備したＰＢＭＣｓから、ＣＤ４、ＣＣＲ４（C-C chemokine receptor 4）、ＴＳＬＣ１（Tumor suppressor in lung cancer 1）およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去する。
【００２２】
ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５は、ＨＴＬＶ−１感染細胞において発現することが知られている表面マーカーである。したがって、これらの表面マーカーを発現している細胞を除去することで、仮にＰＢＭＣｓ中にＨＴＬＶ−１感染細胞が含まれていたとしても、ＰＢＭＣｓ中のＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんどすべて除去することができる（実施例参照）。これらの表面マーカーは、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。たとえば、ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞、ＣＣＲ４＋細胞またはＴＳＬＣ１＋細胞を除去してもよいし、ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を除去してもよい。
【００２３】
ＰＢＭＣｓから上記表面マーカーを発現している細胞を除去する方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択すればよい。ＰＢＭＣｓから上記表面マーカーを発現している細胞を除去する方法の例には、磁気細胞分離法、フローサイトメトリーなどが含まれる。
【００２４】
第３のステップでは、第２のステップにおいて所定の表面マーカーを発現している細胞を除去した後のＰＢＭＣｓを培養液（培地）に懸濁し、得られた細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を添加して、γδＴ細胞を培養する。ＰＢＭＣｓをビスホスホネート系骨代謝改善薬およびＩＬ−２の存在下で培養することにより、γδＴ細胞を選択的に増殖および活性化させて、活性化γδＴ細胞を高純度に含む細胞集団を調製することができる（特許文献１参照）。
【００２５】
ＰＢＭＣｓを懸濁させる培養液（培地）の種類は、γδＴ細胞を増殖させることができれば特に限定されない。そのような培養液の例には、ＡＩＭ−Ｖ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ培地が含まれる。これらの培養液には、必要に応じて血清を添加してもよい。添加される血清の例には、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ＡＢ血清、自己血漿が含まれる。
【００２６】
ビスホスホネート系骨代謝改善薬の種類は、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されているものであれば特に限定されない。ビスホスホネート系骨代謝改善薬の例には、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が含まれる。これらの中では、窒素原子を有するアミノビスホスホネートである、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が特に好ましい。市販されているビスホスホネート系骨代謝改善薬としては、例えば、パミドロン酸二ナトリウム五水和物（アレディア；ノバルティスファーマ株式会社）、ゾレドロン酸水和物（ゾメタ；ノバルティスファーマ株式会社）などが挙げられる。
【００２７】
細胞懸濁液中におけるビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、０.０５〜１００μＭの範囲内が好ましく、０.１〜３０μＭの範囲内がより好ましい。より具体的には、ビスホスホネート系骨代謝改善薬としてアレンドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、１〜３０μＭの範囲内が好ましい。また、ビスホスホネート系骨代謝改善薬としてゾレドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、０.１〜１０μＭの範囲内が好ましい。
【００２８】
細胞懸濁液中におけるＩＬ−２の濃度は、５０〜２０００Ｕ／ｍＬの範囲内が好ましく、４００〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲内がより好ましい。
【００２９】
ＰＢＭＣｓの培養条件は、γδＴ細胞を増殖および活性化させることができれば特に限定されない。通常は、３４〜３８℃（好ましくは３７℃）かつ２〜１０％（好ましくは５％）ＣＯ２存在下で、７〜１４日程度培養すればよい。
【００３０】
以上の手順により、γδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。得られた細胞集団は、後述するようにγδＴ細胞療法において患者に移植する細胞として利用することができる。
【００３１】
本発明のγδＴ細胞の製造方法では、第２のステップにおいてＨＴＬＶ−１感染細胞を除去することから、第１のステップにおいて準備するＰＢＭＣｓ中にＨＴＬＶ−１感染細胞が含まれていても特に問題とならない。したがって、本発明のγδＴ細胞の製造方法は、第１のステップにおいて準備するＰＢＭＣｓがＨＴＬＶ−１感染者の末梢血由来のものであってもよい。本発明のγδＴ細胞の製造方法を用いれば、ＨＴＬＶ−１感染者の末梢血由来のＰＢＭＣｓを用いてもＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を製造することができる。
【００３２】
２．γδＴ細胞を含む医薬
本発明の医薬は、上述の本発明のγδＴ細胞の製造方法により製造された細胞集団を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬である。
【００３３】
本発明の医薬は、例えば、本発明のγδＴ細胞の製造方法により製造された細胞集団を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させた注射剤（細胞懸濁液）である。この注射剤は、静脈内や皮内、皮下などに注射されてもよいし、病変部に直接注入されてもよいし、点滴として全身投与されてもよい。
【００３４】
本発明の医薬は、必須成分として本発明のγδＴ細胞の製造方法により製造された細胞集団を含むが、任意成分としてその他の成分を含んでいてもよい。たとえば、本発明の医薬をがんの治療または予防剤として使用する場合は、ＩＬ−２やＩＬ−１２などのサイトカインを添加してもよい。また、本発明の医薬をウイルス感染症の治療または予防剤として使用する場合は、インターフェロンなどを添加してもよい。
【００３５】
本発明の医薬に含まれるγδＴ細胞の数は、投与方法や疾患の種類、患者の症状などに応じて適宜設定されうる。通常は、１０８〜１０１２個／人（好ましくは１０９個／人）となるように設定すればよい。
【００３６】
本発明の医薬の製造方法は、特に限定されない。たとえば、本発明の医薬は、１）本発明のγδＴ細胞の製造方法により得られた細胞集団を遠心分離などにより回収し；２）回収した細胞集団を洗浄液（例えば、生理食塩水やＰＢＳなど）で洗浄し；３）洗浄した細胞集団を遠心分離などにより回収し；４）回収した細胞集団を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させることで製造されうる。
【００３７】
前述の通り、本発明のγδＴ細胞の製造方法により製造された細胞集団は、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源として用いた場合であっても、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む。よって、本発明の医薬は、ＨＴＬＶ−１感染者に投与しても、体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を増加させることはない。したがって、本発明の医薬は、ＨＴＬＶ−１感染者に対してγδＴ細胞療法を実施するための医薬として利用されうる。
【００３８】
また、後述する実施例に示されるように、γδＴ細胞は、ＨＴＬＶ−１感染細胞（ＡＴＬ患者の白血病細胞を含む）に対する細胞傷害活性を有する。このことは、本発明者らによって初めて見出されたことである。前述の通り、ＨＴＬＶ−１感染者の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防することができると期待される。したがって、本発明の医薬は、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防するための医薬として利用されうる。
【００３９】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００４０】
１．従来の方法によるγδＴ細胞の培養
はじめに、比較例として、従来の方法（ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去しない）によりγδＴ細胞を培養した例を示す。
【００４１】
（１）γδＴ細胞の培養
抗凝固剤としてヘパリンを使用して、ＨＴＬＶ−１感染者から新鮮血を採取した。得られた血液を遠心分離して、血球成分と血漿成分に分離した。血漿成分は、５６℃で６０分間非働化した後、−８０℃で一旦凍結させた。凍結した血漿を再度溶解させた後、遠心分離して上清を得た。得られた上清は、細胞培養時に自己血漿として用いた。一方、血球成分は、ＰＢＳ（−）で希釈した後、リンパ球分離溶液（ＬＳＭ；コスモ・バイオ株式会社）を用いてＰＢＭＣｓを分離した。分離したＰＢＭＣｓは、ＰＢＳ（−）で洗浄した。
【００４２】
洗浄したＰＢＭＣｓをリンパ球培養用培地（ＡＬｙＳ２０３；株式会社細胞科学研究所）に懸濁して細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を２×１０６ＰＢＭＣｓ／ウェルとなるように２４ウェルマイクロプレートに分注した。次いで、各ウェルに、ＩＬ−２（イムノテック社）、ゾレドロン酸水和物（ゾメタ；ノバルティスファーマ株式会社）および自己血漿を添加した。各成分の終濃度は、ＩＬ−２：１０００Ｕ／ｍＬ、ゾレドロン酸水和物：５μＭ、自己血漿：１０％である。
【００４３】
マイクロプレートをＣＯ２インキュベータ（温度：３７℃、ＣＯ２濃度：５％、湿度：過飽和）内に移し、ＰＢＭＣｓを１４日間培養した。培養期間中、細胞がコンフルエントになるたびに、ＩＬ−２を添加した培地を加えた。また、培地中の血漿濃度が１％を下回らないように、適宜自己血漿を加えた。
【００４４】
（２）フローサイトメトリー
培養前（ｄａｙ０）および培養後（ｄａｙ１４）の細胞に含まれるγδＴ細胞の割合をフローサイトメトリーを用いて測定した。今回の実験では、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＴＣＲ Ｖγ９＋の細胞をγδＴ細胞と判定した。
【００４５】
フローサイトメーターはＦＣ５００（ベックマン・コールター株式会社）を使用し、解析ソフトはＣＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）を使用した。また、抗ＣＤ４５抗体はＥＣＤ標識抗ヒトＣＤ４５抗体（ベックマン・コールター株式会社）を使用し、抗ＣＤ３抗体はＰＣ５標識抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマン・コールター株式会社）を使用し、抗ＴＣＲ Ｖγ９抗体はＦＩＴＣ標識抗ヒトＴＣＲ Ｖγ９抗体（ベックマン・コールター株式会社）を使用した。
【００４６】
図１Ａは、ｄａｙ０の細胞中のＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ３およびＴＣＲ Ｖγ９の発現パターンを示す２パラメータドットプロットである。図１Ｂは、ｄａｙ１４の細胞中のＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ３およびＴＣＲ Ｖγ９の発現パターンを示す２パラメータドットプロットである。これらの図に示されるように、ｄａｙ０の細胞中のγδＴ細胞の割合は３.５％であったのに対し（図１Ａ参照）、ｄａｙ１４の細胞中のγδＴ細胞の割合は６８.５％であった（図１Ｂ参照）。
【００４７】
これらの結果から、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源としても、ビスホスホネート系骨代謝改善薬およびＩＬ−２を添加した培地中で培養することで、γδＴ細胞を増殖および活性化させうることが示唆される。
【００４８】
（３）ＨＴＬＶ−１のプロウイルス量の測定
培養前の細胞（ｄａｙ０）および培養後の細胞（ｄａｙ１４）について、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量をリアルタイムＰＣＲ法により測定した。
【００４９】
測定対象の細胞集団（ｄａｙ０またはｄａｙ１４の細胞）を溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０），２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０.１Ｍ ＮａＣｌ，１％ＳＤＳ）に懸濁した。得られた細胞懸濁液にプロテイナーゼＫ（和光純薬工業株式会社）を終濃度が１５０μｇ／ｍＬとなるように添加し、５５℃で一晩振盪した後、フェノールクロロホルムを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＨＴＬＶ−１のｐＸ領域およびヒトβ−アクチンに対するＴａｑＭａｎプローブ−プライマーセットを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。標準検体を用いて検量線を作成してＨＴＬＶ−１のｐＸ領域およびヒトβ−アクチンの量を算出し、これらの値から１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量を算出した。
【００５０】
図２は、ｄａｙ０およびｄａｙ１４の細胞についての、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量を示すグラフである（ｎ＝４）。このグラフに示されるように、ｄａｙ０の細胞中の平均ウイルス量は３３.２４（コピー／１００細胞）であったのに対し、ｄａｙ１４の細胞中の平均ウイルス量は３.３７（コピー／１００細胞）であった。
【００５１】
この結果から、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源としてγδＴ細胞を培養すると、γδＴ細胞の増殖に伴いＨＴＬＶ−１感染細胞の割合がある程度減少することがわかる。しかしながら、ＨＴＬＶ−１感染細胞を３％も含む細胞集団は、生体内のウイルス感染細胞数を増加させるおそれがあるため、γδＴ細胞療法に使用することはできない。
【００５２】
２．本発明の方法によるγδＴ細胞の培養
次に、実施例として、本発明の方法（ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去する）によりγδＴ細胞を培養した例を示す。
【００５３】
（１）γδＴ細胞の培養
上記比較例と同様の手順で、ＨＴＬＶ−１感染者の新鮮血から自己血漿およびＰＢＭＣｓを得た。次いで、磁気細胞分離法により、得られたＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去して、ＣＤ４−の細胞集団を得た。具体的には、ＰＢＭＣｓを抗ＣＤ４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社）と反応させた後、反応物をＭＡＣシステムの分離カラム（ミルテニーバイオテク社）に通して、ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去した。
【００５４】
得られたＣＤ４−の細胞集団を上記比較例と同様の手順で１４日間培養した。その結果、比較例と同様に、γδＴ細胞を選択的に増殖および活性化させることができた（図１参照）。
【００５５】
（２）ＨＴＬＶ−１のプロウイルス量の測定
培養前の細胞（ｄａｙ０）および培養後の細胞（ｄａｙ１４）について、上記比較例と同様の手順で、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量を測定した。
【００５６】
図３は、ｄａｙ０およびｄａｙ１４の細胞についての、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量を示すグラフである（ｎ＝２）。このグラフに示されるように、ｄａｙ０の細胞中の平均ウイルス量は３０.９６５（コピー／１００細胞）であったのに対し、ｄａｙ１４の細胞中の平均ウイルス量は０.０９５（コピー／１００細胞）であった。
【００５７】
この結果から、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源とする場合であっても、ＣＤ４＋細胞を除去した後に培養すると、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほぼ完全に除去した状態でγδＴ細胞を増殖させうることがわかる。このようにＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まない細胞集団は、生体内のウイルス感染細胞数を増加させるおそれが低いため、γδＴ細胞療法に使用することができる。
【００５８】
３．ＨＴＬＶ−１感染細胞に対するγδＴ細胞の細胞傷害活性の測定
上記比較例で示したように、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源としてγδＴ細胞を増殖させたところ、ＨＴＬＶ−１感染細胞の割合がある程度減少した（図２参照）。このことは、γδＴ細胞がＨＴＬＶ−１感染細胞に対して傷害活性を有することを示唆している。そこで、γδＴ細胞がＨＴＬＶ−１感染細胞に対して傷害活性を有するかどうかを調べた。
【００５９】
ターゲット細胞としては、ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株「ＨＣＴ−４」およびＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株「ＫＫ−１」を使用した。これらの培養細胞を回収し、細胞膜標識用蛍光色素（ＰＫＨ２６；シグマアルドリッチジャパン株式会社）を用いて染色した。細胞密度は、いずれも２×１０５細胞／ｍＬに調整した。
【００６０】
エフェクター細胞としては、前述のγδＴ細胞の選択的培養（比較例）により得られた、培養１４日目の活性化γδＴ細胞（γδＴ−ＬＡＫ）を含む細胞集団を使用した。また、対照実験として、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−２を用いる培養方法（Takayama T. et al., Lancet, Vol.356, No.9232, pp.802-807.）により得られた、培養１４日目の活性化αβＴ細胞（αβＴ−ＬＡＫ）を含む細胞集団も使用した。細胞密度は、いずれも２×１０５細胞／ｍＬ、１×１０６細胞／ｍＬおよび５×１０６細胞／ｍＬに調整した。
【００６１】
エフェクター細胞の細胞懸濁液とターゲット細胞の細胞懸濁液を混合して共培養を行い、４時間後に細胞を回収した。エフェクター細胞とターゲット細胞との比率は、１：１、５：１または２５：１である。アポトーシス検出キット（ベックマン・コールター株式会社）に含まれるＦＩＴＣ−アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いて回収した細胞を染色した。そして、前述のフローサイトメーターを用いてアポトーシスを起こした細胞の割合を測定して、ＨＴＬＶ−１感染細胞に対するγδＴ細胞の細胞傷害活性を決定した。
【００６２】
図４Ａは、ＨＣＴ−４（ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株）に対するγδＴ細胞およびαβＴ細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。図４Ｂは、ＫＫ−１（ＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株）に対するγδＴ細胞およびαβＴ細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。「γδＴ−ＬＡＫ」はγδＴ細胞を示し、「αβＴ−ＬＡＫ」はαβＴ細胞を示す。また、「Ｅ／Ｔ」は、ターゲット細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の割合を意味する
【００６３】
図４Ａおよび図４Ｂのグラフから、γδＴ細胞は、ＨＴＬＶ−１感染細胞に対する細胞傷害活性がαβＴ細胞に比べて高いことがわかる。このことから、γδＴ細胞療法がＨＡＭおよびＡＬＴの治療および予防に有効であることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の製造方法は、例えば、ＨＴＬＶ−１の感染者に対してγδＴ細胞療法を実施する際のγδＴ細胞の培養方法として有用である。また、本発明の医薬は、例えばＨＴＬＶ−１感染者、ＨＡＭ患者およびＡＴＬ患者に対してγδＴ細胞療法を実施する際に用いられる医薬として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γδＴ細胞の製造方法およびγδＴ細胞を含有する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん（悪性腫瘍）は、１９８１年から日本における死亡原因のトップとなっている。がんの治療法としては、外科療法、化学療法、放射線療法の三大療法がよく知られているが、近年、第４の治療法として免疫細胞療法が注目されている。免疫細胞療法とは、患者の体外で増殖および活性化させた免疫細胞を患者に投与し、その免疫細胞にがん細胞を攻撃させる治療法である。免疫細胞療法は、三大療法に比べて副作用がほとんどないという利点を有している。
【０００３】
免疫細胞療法には様々な種類の治療法があるが、その一つとしてγδＴ細胞療法がある。γδＴ細胞は、自然免疫を担う細胞であり、がん細胞に対して細胞障害活性を有することが知られている。γδＴ細胞療法は、患者由来のγδＴ細胞を体外で増殖および活性化させた後、調製されたγδＴ細胞を患者の体内に戻す治療法である。
【０００４】
γδＴ細胞療法では、患者の末梢血から得られた末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cells；以下「ＰＢＭＣｓ」と略記する）を細胞源として、γδＴ細胞を増殖および活性化させる。しかしながら、γδＴ細胞は、末梢血中に１〜５％程度しか存在しないため、患者から少量の末梢血を採取しても、治療に十分な数のγδＴ細胞を調製できないおそれがある。したがって、γδＴ細胞療法では、ＰＢＭＣｓを細胞源として、γδＴ細胞を効率的に増殖および活性化させることができる培養方法を確立することが重要である。そのような培養方法としては、ビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２（Interleukin-2；以下「ＩＬ−２」と略記する）を培養液に添加する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
一方、現在、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（human T-cell leukemia virus type-1；以下「ＨＴＬＶ−１」と略記する）の感染者は、日本に約１００万人以上存在し、世界に２０００万人以上存在する。感染者の一部は、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症（HTLV-I associated myelopathy；以下「ＨＡＭ」と略記する）を発病する（発病率：約０.３％）。また、感染者の別の一部は、成人Ｔ細胞白血病（adult T-cell leukemia；以下「ＡＴＬ」と略記する）を発病する（発病率：約５％）。
【０００６】
ＨＡＭおよびＡＴＬは、体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数が増加すると発病しやすくなることが知られている。したがって、ＨＴＬＶ−１感染者（キャリア）の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬの発病を予防できると期待される。同様に、ＨＡＭ患者およびＡＴＬ患者の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療できると期待される。しかしながら、現在のところ、ＨＡＭおよびＡＴＬに対する有効な予防法および治療法は確立されておらず、一刻も早い予防法および治療法の開発が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００６／００６７２０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＨＴＬＶ−１感染者が、ＡＴＬ以外のがんまたは感染症に罹患した場合、がんまたは感染症を治療するために免疫細胞療法を実施することが考えられる。しかしながら、従来の免疫細胞の培養方法では、試験管内においてＨＴＬＶ−１の感染が拡大してしまうおそれがある。このようにして調製されたＨＴＬＶ−１感染細胞を含む細胞集団を患者（ＨＴＬＶ−１感染者）に戻すと、患者の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数が増加してしまうおそれがある。以上のことから、ＨＴＬＶ−１感染者に対しては、γδＴ細胞療法などの免疫細胞療法を実施することができなかった。
【０００９】
また、前述の通り、ＨＴＬＶ−１感染者の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防することができると期待される。ＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させる手法としては、上述の免疫細胞療法を実施することが考えられる。しかしながら、ＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させる免疫細胞療法は、まだ確立されていない。
【００１０】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源として用いた場合であっても、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる、γδＴ細胞の製造方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、ＨＴＬＶ−１の感染に起因するＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防するための医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、γδＴ細胞を増殖させる前に、細胞源となるＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去することで、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得られることを見出した。また、本発明者は、γδＴ細胞がＨＴＬＶ−１感染細胞（白血病細胞を含む）に対して細胞傷害活性を有することも見出した。本発明者は、これらの知見を基にしてさらに検討を加えて本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、本発明の第１は、以下のγδＴ細胞の製造方法に関する。
［１］末梢血単核球を準備するステップと；前記末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去するステップと；前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球を含む細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を培養するステップと；を含む、γδＴ細胞の製造方法。
［２］前記表面マーカーは、ＣＤ４である、［１］に記載のγδＴ細胞の製造方法。
［３］前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ−１の感染者の末梢血から得られたものである、［１］または［２］に記載のγδＴ細胞の製造方法。
［４］前記細胞懸濁液中における前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、０.０５〜１００μＭの範囲内であり；前記細胞懸濁液中における前記インターロイキン−２の濃度は、５０〜２０００Ｕ／ｍＬの範囲内である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のγδＴ細胞の製造方法。
［５］前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬は、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のγδＴ細胞の製造方法。
【００１５】
また、本発明の第２は、以下の医薬に関する。
［６］末梢血単核球を準備するステップと；前記末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去するステップと；前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球を含む細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を培養するステップと；を含むγδＴ細胞の製造方法により製造されたγδＴ細胞を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬。
［７］前記表面マーカーは、ＣＤ４である、［６］に記載の医薬。
［８］前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ−１の感染者の末梢血から得られたものである、［６］または［７］に記載の医薬。
［９］ＨＴＬＶ−１関連脊髄症または成人Ｔ細胞白血病を治療または予防するための医薬である、［８］に記載の医薬。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の製造方法によれば、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを用いた場合であっても、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。したがって、本発明の製造方法によれば、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬を製造することができる。本発明の医薬は、特に、ＨＴＬＶ−１感染者に対してγδＴ細胞療法を行う際に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、培養前の細胞中のＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ３およびＴＣＲ Ｖγ９の発現パターンを示す２パラメータドットプロットである。図１Ｂは、培養後の細胞中のＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ３およびＴＣＲ Ｖγ９の発現パターンを示す２パラメータドットプロットである。
【図２】ＨＴＬＶ−１感染細胞を含むＰＢＭＣｓを細胞源としてγδＴ細胞を培養したときの、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量の培養前後の変化を示すグラフである。
【図３】ＣＤ４＋細胞を除去したＰＢＭＣｓを細胞源としてγδＴ細胞を培養したときの、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量の培養前後の変化を示すグラフである。
【図４】図４Ａは、ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株に対するγδＴ細胞およびαβＴ細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。図４Ｂは、ＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株に対するγδＴ細胞およびαβＴ細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１．γδＴ細胞の製造方法
本発明のγδＴ細胞の製造方法は、１）末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を準備する第１のステップと、２）前記ＰＢＭＣｓから所定の表面マーカーを発現している細胞を除去する第２のステップと、３）残余のＰＢＭＣｓを懸濁した細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を添加して、γδＴ細胞を培養する第３のステップとを含む。
【００１９】
本発明のγδＴ細胞の製造方法は、第２のステップにおいて、ＰＢＭＣｓから所定の表面マーカーを発現している細胞を除去することを一つの特徴とする。以下、各ステップについて説明する。
【００２０】
第１のステップでは、γδＴ細胞の細胞源となる末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を準備する。ここで「末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）」とは、末梢血から分離された、リンパ球（ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞など）、単球および樹状細胞を含む細胞集団を意味する。ＰＢＭＣｓを準備する方法は、特に限定されない。たとえば、採血により得られた末梢血を密度勾配遠心することで、ＰＢＭＣｓを得ることができる。採血量は、γδＴ細胞療法を行う患者に応じて適宜設定すればよいが、例えば４５〜７５ｍＬ程度である。
【００２１】
第２のステップでは、第１のステップで準備したＰＢＭＣｓから、ＣＤ４、ＣＣＲ４（C-C chemokine receptor 4）、ＴＳＬＣ１（Tumor suppressor in lung cancer 1）およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去する。
【００２２】
ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５は、ＨＴＬＶ−１感染細胞において発現することが知られている表面マーカーである。したがって、これらの表面マーカーを発現している細胞を除去することで、仮にＰＢＭＣｓ中にＨＴＬＶ−１感染細胞が含まれていたとしても、ＰＢＭＣｓ中のＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんどすべて除去することができる（実施例参照）。これらの表面マーカーは、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。たとえば、ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞、ＣＣＲ４＋細胞またはＴＳＬＣ１＋細胞を除去してもよいし、ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を除去してもよい。
【００２３】
ＰＢＭＣｓから上記表面マーカーを発現している細胞を除去する方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択すればよい。ＰＢＭＣｓから上記表面マーカーを発現している細胞を除去する方法の例には、磁気細胞分離法、フローサイトメトリーなどが含まれる。
【００２４】
第３のステップでは、第２のステップにおいて所定の表面マーカーを発現している細胞を除去した後のＰＢＭＣｓを培養液（培地）に懸濁し、得られた細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を添加して、γδＴ細胞を培養する。ＰＢＭＣｓをビスホスホネート系骨代謝改善薬およびＩＬ−２の存在下で培養することにより、γδＴ細胞を選択的に増殖および活性化させて、活性化γδＴ細胞を高純度に含む細胞集団を調製することができる（特許文献１参照）。
【００２５】
ＰＢＭＣｓを懸濁させる培養液（培地）の種類は、γδＴ細胞を増殖させることができれば特に限定されない。そのような培養液の例には、ＡＩＭ−Ｖ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ培地が含まれる。これらの培養液には、必要に応じて血清を添加してもよい。添加される血清の例には、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ＡＢ血清、自己血漿が含まれる。
【００２６】
ビスホスホネート系骨代謝改善薬の種類は、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されているものであれば特に限定されない。ビスホスホネート系骨代謝改善薬の例には、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が含まれる。これらの中では、窒素原子を有するアミノビスホスホネートである、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が特に好ましい。市販されているビスホスホネート系骨代謝改善薬としては、例えば、パミドロン酸二ナトリウム五水和物（アレディア；ノバルティスファーマ株式会社）、ゾレドロン酸水和物（ゾメタ；ノバルティスファーマ株式会社）などが挙げられる。
【００２７】
細胞懸濁液中におけるビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、０.０５〜１００μＭの範囲内が好ましく、０.１〜３０μＭの範囲内がより好ましい。より具体的には、ビスホスホネート系骨代謝改善薬としてアレンドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、１〜３０μＭの範囲内が好ましい。また、ビスホスホネート系骨代謝改善薬としてゾレドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、０.１〜１０μＭの範囲内が好ましい。
【００２８】
細胞懸濁液中におけるＩＬ−２の濃度は、５０〜２０００Ｕ／ｍＬの範囲内が好ましく、４００〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲内がより好ましい。
【００２９】
ＰＢＭＣｓの培養条件は、γδＴ細胞を増殖および活性化させることができれば特に限定されない。通常は、３４〜３８℃（好ましくは３７℃）かつ２〜１０％（好ましくは５％）ＣＯ２存在下で、７〜１４日程度培養すればよい。
【００３０】
以上の手順により、γδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。得られた細胞集団は、後述するようにγδＴ細胞療法において患者に移植する細胞として利用することができる。
【００３１】
本発明のγδＴ細胞の製造方法では、第２のステップにおいてＨＴＬＶ−１感染細胞を除去することから、第１のステップにおいて準備するＰＢＭＣｓ中にＨＴＬＶ−１感染細胞が含まれていても特に問題とならない。したがって、本発明のγδＴ細胞の製造方法は、第１のステップにおいて準備するＰＢＭＣｓがＨＴＬＶ−１感染者の末梢血由来のものであってもよい。本発明のγδＴ細胞の製造方法を用いれば、ＨＴＬＶ−１感染者の末梢血由来のＰＢＭＣｓを用いてもＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を製造することができる。
【００３２】
２．γδＴ細胞を含む医薬
本発明の医薬は、上述の本発明のγδＴ細胞の製造方法により製造された細胞集団を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬である。
【００３３】
本発明の医薬は、例えば、本発明のγδＴ細胞の製造方法により製造された細胞集団を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させた注射剤（細胞懸濁液）である。この注射剤は、静脈内や皮内、皮下などに注射されてもよいし、病変部に直接注入されてもよいし、点滴として全身投与されてもよい。
【００３４】
本発明の医薬は、必須成分として本発明のγδＴ細胞の製造方法により製造された細胞集団を含むが、任意成分としてその他の成分を含んでいてもよい。たとえば、本発明の医薬をがんの治療または予防剤として使用する場合は、ＩＬ−２やＩＬ−１２などのサイトカインを添加してもよい。また、本発明の医薬をウイルス感染症の治療または予防剤として使用する場合は、インターフェロンなどを添加してもよい。
【００３５】
本発明の医薬に含まれるγδＴ細胞の数は、投与方法や疾患の種類、患者の症状などに応じて適宜設定されうる。通常は、１０８〜１０１２個／人（好ましくは１０９個／人）となるように設定すればよい。
【００３６】
本発明の医薬の製造方法は、特に限定されない。たとえば、本発明の医薬は、１）本発明のγδＴ細胞の製造方法により得られた細胞集団を遠心分離などにより回収し；２）回収した細胞集団を洗浄液（例えば、生理食塩水やＰＢＳなど）で洗浄し；３）洗浄した細胞集団を遠心分離などにより回収し；４）回収した細胞集団を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させることで製造されうる。
【００３７】
前述の通り、本発明のγδＴ細胞の製造方法により製造された細胞集団は、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源として用いた場合であっても、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む。よって、本発明の医薬は、ＨＴＬＶ−１感染者に投与しても、体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を増加させることはない。したがって、本発明の医薬は、ＨＴＬＶ−１感染者に対してγδＴ細胞療法を実施するための医薬として利用されうる。
【００３８】
また、後述する実施例に示されるように、γδＴ細胞は、ＨＴＬＶ−１感染細胞（ＡＴＬ患者の白血病細胞を含む）に対する細胞傷害活性を有する。このことは、本発明者らによって初めて見出されたことである。前述の通り、ＨＴＬＶ−１感染者の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防することができると期待される。したがって、本発明の医薬は、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防するための医薬として利用されうる。
【００３９】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００４０】
１．従来の方法によるγδＴ細胞の培養
はじめに、比較例として、従来の方法（ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去しない）によりγδＴ細胞を培養した例を示す。
【００４１】
（１）γδＴ細胞の培養
抗凝固剤としてヘパリンを使用して、ＨＴＬＶ−１感染者から新鮮血を採取した。得られた血液を遠心分離して、血球成分と血漿成分に分離した。血漿成分は、５６℃で６０分間非働化した後、−８０℃で一旦凍結させた。凍結した血漿を再度溶解させた後、遠心分離して上清を得た。得られた上清は、細胞培養時に自己血漿として用いた。一方、血球成分は、ＰＢＳ（−）で希釈した後、リンパ球分離溶液（ＬＳＭ；コスモ・バイオ株式会社）を用いてＰＢＭＣｓを分離した。分離したＰＢＭＣｓは、ＰＢＳ（−）で洗浄した。
【００４２】
洗浄したＰＢＭＣｓをリンパ球培養用培地（ＡＬｙＳ２０３；株式会社細胞科学研究所）に懸濁して細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を２×１０６ＰＢＭＣｓ／ウェルとなるように２４ウェルマイクロプレートに分注した。次いで、各ウェルに、ＩＬ−２（イムノテック社）、ゾレドロン酸水和物（ゾメタ；ノバルティスファーマ株式会社）および自己血漿を添加した。各成分の終濃度は、ＩＬ−２：１０００Ｕ／ｍＬ、ゾレドロン酸水和物：５μＭ、自己血漿：１０％である。
【００４３】
マイクロプレートをＣＯ２インキュベータ（温度：３７℃、ＣＯ２濃度：５％、湿度：過飽和）内に移し、ＰＢＭＣｓを１４日間培養した。培養期間中、細胞がコンフルエントになるたびに、ＩＬ−２を添加した培地を加えた。また、培地中の血漿濃度が１％を下回らないように、適宜自己血漿を加えた。
【００４４】
（２）フローサイトメトリー
培養前（ｄａｙ０）および培養後（ｄａｙ１４）の細胞に含まれるγδＴ細胞の割合をフローサイトメトリーを用いて測定した。今回の実験では、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＴＣＲ Ｖγ９＋の細胞をγδＴ細胞と判定した。
【００４５】
フローサイトメーターはＦＣ５００（ベックマン・コールター株式会社）を使用し、解析ソフトはＣＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）を使用した。また、抗ＣＤ４５抗体はＥＣＤ標識抗ヒトＣＤ４５抗体（ベックマン・コールター株式会社）を使用し、抗ＣＤ３抗体はＰＣ５標識抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマン・コールター株式会社）を使用し、抗ＴＣＲ Ｖγ９抗体はＦＩＴＣ標識抗ヒトＴＣＲ Ｖγ９抗体（ベックマン・コールター株式会社）を使用した。
【００４６】
図１Ａは、ｄａｙ０の細胞中のＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ３およびＴＣＲ Ｖγ９の発現パターンを示す２パラメータドットプロットである。図１Ｂは、ｄａｙ１４の細胞中のＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ３およびＴＣＲ Ｖγ９の発現パターンを示す２パラメータドットプロットである。これらの図に示されるように、ｄａｙ０の細胞中のγδＴ細胞の割合は３.５％であったのに対し（図１Ａ参照）、ｄａｙ１４の細胞中のγδＴ細胞の割合は６８.５％であった（図１Ｂ参照）。
【００４７】
これらの結果から、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源としても、ビスホスホネート系骨代謝改善薬およびＩＬ−２を添加した培地中で培養することで、γδＴ細胞を増殖および活性化させうることが示唆される。
【００４８】
（３）ＨＴＬＶ−１のプロウイルス量の測定
培養前の細胞（ｄａｙ０）および培養後の細胞（ｄａｙ１４）について、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量をリアルタイムＰＣＲ法により測定した。
【００４９】
測定対象の細胞集団（ｄａｙ０またはｄａｙ１４の細胞）を溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０），２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０.１Ｍ ＮａＣｌ，１％ＳＤＳ）に懸濁した。得られた細胞懸濁液にプロテイナーゼＫ（和光純薬工業株式会社）を終濃度が１５０μｇ／ｍＬとなるように添加し、５５℃で一晩振盪した後、フェノールクロロホルムを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＨＴＬＶ−１のｐＸ領域およびヒトβ−アクチンに対するＴａｑＭａｎプローブ−プライマーセットを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。標準検体を用いて検量線を作成してＨＴＬＶ−１のｐＸ領域およびヒトβ−アクチンの量を算出し、これらの値から１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量を算出した。
【００５０】
図２は、ｄａｙ０およびｄａｙ１４の細胞についての、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量を示すグラフである（ｎ＝４）。このグラフに示されるように、ｄａｙ０の細胞中の平均ウイルス量は３３.２４（コピー／１００細胞）であったのに対し、ｄａｙ１４の細胞中の平均ウイルス量は３.３７（コピー／１００細胞）であった。
【００５１】
この結果から、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源としてγδＴ細胞を培養すると、γδＴ細胞の増殖に伴いＨＴＬＶ−１感染細胞の割合がある程度減少することがわかる。しかしながら、ＨＴＬＶ−１感染細胞を３％も含む細胞集団は、生体内のウイルス感染細胞数を増加させるおそれがあるため、γδＴ細胞療法に使用することはできない。
【００５２】
２．本発明の方法によるγδＴ細胞の培養
次に、実施例として、本発明の方法（ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去する）によりγδＴ細胞を培養した例を示す。
【００５３】
（１）γδＴ細胞の培養
上記比較例と同様の手順で、ＨＴＬＶ−１感染者の新鮮血から自己血漿およびＰＢＭＣｓを得た。次いで、磁気細胞分離法により、得られたＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去して、ＣＤ４−の細胞集団を得た。具体的には、ＰＢＭＣｓを抗ＣＤ４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社）と反応させた後、反応物をＭＡＣシステムの分離カラム（ミルテニーバイオテク社）に通して、ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去した。
【００５４】
得られたＣＤ４−の細胞集団を上記比較例と同様の手順で１４日間培養した。その結果、比較例と同様に、γδＴ細胞を選択的に増殖および活性化させることができた（図１参照）。
【００５５】
（２）ＨＴＬＶ−１のプロウイルス量の測定
培養前の細胞（ｄａｙ０）および培養後の細胞（ｄａｙ１４）について、上記比較例と同様の手順で、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量を測定した。
【００５６】
図３は、ｄａｙ０およびｄａｙ１４の細胞についての、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量を示すグラフである（ｎ＝２）。このグラフに示されるように、ｄａｙ０の細胞中の平均ウイルス量は３０.９６５（コピー／１００細胞）であったのに対し、ｄａｙ１４の細胞中の平均ウイルス量は０.０９５（コピー／１００細胞）であった。
【００５７】
この結果から、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源とする場合であっても、ＣＤ４＋細胞を除去した後に培養すると、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほぼ完全に除去した状態でγδＴ細胞を増殖させうることがわかる。このようにＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まない細胞集団は、生体内のウイルス感染細胞数を増加させるおそれが低いため、γδＴ細胞療法に使用することができる。
【００５８】
３．ＨＴＬＶ−１感染細胞に対するγδＴ細胞の細胞傷害活性の測定
上記比較例で示したように、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源としてγδＴ細胞を増殖させたところ、ＨＴＬＶ−１感染細胞の割合がある程度減少した（図２参照）。このことは、γδＴ細胞がＨＴＬＶ−１感染細胞に対して傷害活性を有することを示唆している。そこで、γδＴ細胞がＨＴＬＶ−１感染細胞に対して傷害活性を有するかどうかを調べた。
【００５９】
ターゲット細胞としては、ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株「ＨＣＴ−４」およびＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株「ＫＫ−１」を使用した。これらの培養細胞を回収し、細胞膜標識用蛍光色素（ＰＫＨ２６；シグマアルドリッチジャパン株式会社）を用いて染色した。細胞密度は、いずれも２×１０５細胞／ｍＬに調整した。
【００６０】
エフェクター細胞としては、前述のγδＴ細胞の選択的培養（比較例）により得られた、培養１４日目の活性化γδＴ細胞（γδＴ−ＬＡＫ）を含む細胞集団を使用した。また、対照実験として、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−２を用いる培養方法（Takayama T. et al., Lancet, Vol.356, No.9232, pp.802-807.）により得られた、培養１４日目の活性化αβＴ細胞（αβＴ−ＬＡＫ）を含む細胞集団も使用した。細胞密度は、いずれも２×１０５細胞／ｍＬ、１×１０６細胞／ｍＬおよび５×１０６細胞／ｍＬに調整した。
【００６１】
エフェクター細胞の細胞懸濁液とターゲット細胞の細胞懸濁液を混合して共培養を行い、４時間後に細胞を回収した。エフェクター細胞とターゲット細胞との比率は、１：１、５：１または２５：１である。アポトーシス検出キット（ベックマン・コールター株式会社）に含まれるＦＩＴＣ−アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いて回収した細胞を染色した。そして、前述のフローサイトメーターを用いてアポトーシスを起こした細胞の割合を測定して、ＨＴＬＶ−１感染細胞に対するγδＴ細胞の細胞傷害活性を決定した。
【００６２】
図４Ａは、ＨＣＴ−４（ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株）に対するγδＴ細胞およびαβＴ細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。図４Ｂは、ＫＫ−１（ＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株）に対するγδＴ細胞およびαβＴ細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。「γδＴ−ＬＡＫ」はγδＴ細胞を示し、「αβＴ−ＬＡＫ」はαβＴ細胞を示す。また、「Ｅ／Ｔ」は、ターゲット細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の割合を意味する
【００６３】
図４Ａおよび図４Ｂのグラフから、γδＴ細胞は、ＨＴＬＶ−１感染細胞に対する細胞傷害活性がαβＴ細胞に比べて高いことがわかる。このことから、γδＴ細胞療法がＨＡＭおよびＡＬＴの治療および予防に有効であることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の製造方法は、例えば、ＨＴＬＶ−１の感染者に対してγδＴ細胞療法を実施する際のγδＴ細胞の培養方法として有用である。また、本発明の医薬は、例えばＨＴＬＶ−１感染者、ＨＡＭ患者およびＡＴＬ患者に対してγδＴ細胞療法を実施する際に用いられる医薬として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血単核球を準備するステップと、
前記末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去するステップと、
前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球を含む細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を培養するステップと、
を含む、γδＴ細胞の製造方法。
【請求項２】
前記表面マーカーは、ＣＤ４である、請求項１に記載のγδＴ細胞の製造方法。
【請求項３】
前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ−１の感染者の末梢血から得られたものである、請求項１に記載のγδＴ細胞の製造方法。
【請求項４】
前記細胞懸濁液中における前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、０.０５〜１００μＭの範囲内であり、
前記細胞懸濁液中における前記インターロイキン−２の濃度は、５０〜２０００Ｕ／ｍＬの範囲内である、
請求項１に記載のγδＴ細胞の製造方法。
【請求項５】
前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬は、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、請求項１に記載のγδＴ細胞の製造方法。
【請求項６】
末梢血単核球を準備するステップと、
前記末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去するステップと、
前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球を含む細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を培養するステップと、
を含むγδＴ細胞の製造方法により製造されたγδＴ細胞を含有する、
がんまたは感染症を治療または予防するための医薬。
【請求項７】
前記表面マーカーは、ＣＤ４である、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ−１の感染者の末梢血から得られたものである、請求項６に記載の医薬。
【請求項９】
ＨＴＬＶ−１関連脊髄症または成人Ｔ細胞白血病を治療または予防するための医薬である、請求項８に記載の医薬。
【請求項１】
末梢血単核球を準備するステップと、
前記末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去するステップと、
前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球を含む細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を培養するステップと、
を含む、γδＴ細胞の製造方法。
【請求項２】
前記表面マーカーは、ＣＤ４である、請求項１に記載のγδＴ細胞の製造方法。
【請求項３】
前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ−１の感染者の末梢血から得られたものである、請求項１に記載のγδＴ細胞の製造方法。
【請求項４】
前記細胞懸濁液中における前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、０.０５〜１００μＭの範囲内であり、
前記細胞懸濁液中における前記インターロイキン−２の濃度は、５０〜２０００Ｕ／ｍＬの範囲内である、
請求項１に記載のγδＴ細胞の製造方法。
【請求項５】
前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬は、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、請求項１に記載のγδＴ細胞の製造方法。
【請求項６】
末梢血単核球を準備するステップと、
前記末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去するステップと、
前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球を含む細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を培養するステップと、
を含むγδＴ細胞の製造方法により製造されたγδＴ細胞を含有する、
がんまたは感染症を治療または予防するための医薬。
【請求項７】
前記表面マーカーは、ＣＤ４である、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ−１の感染者の末梢血から得られたものである、請求項６に記載の医薬。
【請求項９】
ＨＴＬＶ−１関連脊髄症または成人Ｔ細胞白血病を治療または予防するための医薬である、請求項８に記載の医薬。
【図２】
【図３】
【図４】
【図１】
【図３】
【図４】
【図１】
【公開番号】特開２０１２−９０５７４（Ｐ２０１２−９０５７４Ａ）
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４０８６８（Ｐ２０１０−２４０８６８）
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【出願人】（５９６１６５５８９）学校法人 聖マリアンナ医科大学 (53)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【出願人】（５９６１６５５８９）学校法人 聖マリアンナ医科大学 (53)
【Ｆターム（参考）】
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