ψεＲＡＣＫペプチド組成物および虚血に起因する組織損傷に対する保護方法
【課題】虚血現象に起因する損傷から組織を保護する方法、虚血のプレコンディショニングの誘導のためにεＰＫＣペプチドアゴニストを投与する方法、虚血現象により引き起こされる組織に対する損傷を緩和する方法を提供すること。
【解決手段】虚血状態または低酸素状態に曝露されたインビボ器官への損傷を減少させる組成物であって、ψεＲＡＣＫペプチドおよび薬学的賦形剤を含む、組成物。虚血状態または低酸素状態に曝露されたインビボ器官の処置のための医薬の製造のための、ψεＲＡＣＫペプチドを含む組成物の、使用。
【解決手段】虚血状態または低酸素状態に曝露されたインビボ器官への損傷を減少させる組成物であって、ψεＲＡＣＫペプチドおよび薬学的賦形剤を含む、組成物。虚血状態または低酸素状態に曝露されたインビボ器官の処置のための医薬の製造のための、ψεＲＡＣＫペプチドを含む組成物の、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、虚血現象に起因する損傷から細胞および組織を保護する方法に関する。本発明の方法は、プロテインキナーゼＣのペプチドアゴニストを投与する工程、より詳細にはプソイド−イプシロンＲＡＣＫ（ψεＲＡＣＫ）ペプチドを投与する工程を包含する。
【背景技術】
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【表１】
（発明の背景）
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、細胞増殖、遺伝子発現の調節、およびイオンチャネル活性の調節を含む、種々の細胞機能に関与するシグナル伝達において重要な酵素である。ＰＫＣファミリーのアイソザイムとして、少なくとも１１の異なるプロテインキナーゼが挙げられ、これらはそれらの相同性およびアクチベーターに対する感受性に基づき少なくとも３つのサブファミリーのメンバーに分類され得る。古典的なサブファミリーつまりｃＰＫＣサブファミリー（α、βＩ、βＩＩ、およびγＰＫＣ）は、アイソザイム固有の領域（可変領域またはＶ領域）により間隔を空けられた４つの相同ドメイン（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４）を含み、活性化のためにカルシウム、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびジアシルグリセロール（ＤＧ）またはホルボールエステルを必要とする。新規のサブファミリーつまりｎＰＫＣサブファミリーのメンバー（δ、ε、η、およびθＰＫＣ）はＣ２相同ドメインを欠き、活性化のためにカルシウムを必要としない。最後に、変則的なサブファミリーつまりαＰＫＣサブファミリーのメンバー（ζおよびλ／ιＰＫＣ）はＣ２相同ドメインとＣ１相同ドメインの半分とを欠き、ＤＧ、ホルボールエステル、およびカルシウムに非感受性である。
【０００４】
ＰＫＣアイソザイムの細胞下分布に関する研究により、ＰＫＣの活性化が、細胞中でのその再分布を引き起こし（転位とも呼ばれる）、それによって、活性化されたＰＫＣアイソザイムが、原形質膜、細胞骨格エレメント、核、および他の細胞下画分と結合することが実証されている（Ｓａｉｔｏら、１９８９；ＰａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓおよびＨａｌｌ、１９８９；Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎら、１９９０）。
【０００５】
異なるＰＫＣアイソザイムの固有の細胞機能は、それらの細胞下での位置によって決定されるようである。例えば、活性化されたβＩＰＫＣは核の内部で見出され、活性化されたβＩＩＰＫＣは核周囲および心筋細胞の細胞末梢で見出される（Ｄｉｓａｔｎｉｋら、１９９４）。さらに、同じ細胞において、εＰＫＣは、活性化後または固定細胞への外因性活性化εＰＫＣの添加後に横紋構造（おそらく、収縮性エレメント）および細胞−細胞接触部に結合する（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎら、１９９０；Ｄｉｓａｔｎｉｋら、１９９４）。細胞の異なる領域への異なるＰＫＣアイソザイムの局在化は、活性化Ｃ−キナーゼに対するレセプター（ＲＡＣＫ）と呼ばれる特異的なアンカー分子への活性化アイソザイムの結合に起因するようである。
【０００６】
ＲＡＣＫは、活性化ＰＫＣアイソザイムをそれぞれの細胞下部位に選択的に固定することにより機能すると考えられている。ＲＡＣＫは完全に活性化したＰＫＣにのみ結合するが、ＲＡＣＫは必ずしもこの酵素の基質であるわけでなく、ＲＡＣＫへの結合が、必ずしもこのキナーゼの触媒ドメインを介して媒介されるわけでもない（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎら、１９９１）。ＰＫＣの転位は、細胞粒子画分に固定されたＲＡＣＫに対するこの活性化された酵素の結合を反映し、ＲＡＣＫへの結合は、ＰＫＣがその細胞応答を生じるのに必要とされる（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ、１９９５）。インビボでのＲＡＣＫへのＰＫＣ結合の阻害は、ＰＫＣの転位およびＰＫＣが媒介する機能を阻害する（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９６；Ｒｏｎら、１９９５；ＳｍｉｔｈおよびＭｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ、１９９２）。
【０００７】
ＲＡＣＫ１およびＲＡＣＫ２をコードするｃＤＮＡクローンが同定されている（米国特許第５，５１９，００３号；Ｒｏｎら、１９９４；Ｃｓｕｋａｉら、１９９５）。両者は、別の転位プロテインキナーゼ（β−アドレナリン作用性レセプターキナーゼ、βＡＲＫ）に対するレセプターである、Ｇタンパク質のβサブユニットのホモログである（Ｐｉｔｃｈｅｒら、１９９２）。Ｇβと同様に、ＲＡＣＫ１およびＲＡＣＫ２は、７つのＷＤ４０リピートを有する（Ｒｏｎら、１９９４；Ｃｓｕｋａｉら、１９９５）。近年のデータは、ＲＡＣＫ１がβＩＩＰＫＣ−特異的ＲＡＣＫであり（Ｓｔｅｂｂｉｎｓら、２００１）、ＲＡＣＫ２が活性化εＰＫＣに対して特異的である（Ｃｓｕｋａｉら、１９９７）ことを示唆する。
【０００８】
ＰＫＣの転位は、ＰＫＣアイソザイムの適切な機能に必要とされる。ＲＡＣＫ上のＰＫＣ結合部位（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ、１９９１ａ；Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ、１９９５）またはＰＫＣ上のＲＡＣＫ結合部位（Ｒｏｎら、１９９５；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９６）のいずれかを模倣するペプチドは、インビボでのこの酵素の機能を選択的に阻害するＰＫＣのアイソザイム特異的転位インヒビターである。例えば、εＰＫＣに由来する８アミノ酸のペプチド（ペプチドεＶ１−２；配列番号１、Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ）が、米国特許第６，１６５，９７７号に記載されている。このペプチドは、εＰＫＣ上のＲＡＣＫ結合部位の一部を含み、心筋細胞における特異的なεＰＫＣにより媒介される機能を選択的に阻害する。
【０００９】
近年、ＰＫＣ、より具体的にはεＰＣＫが、虚血性損傷に対する保護を提供するための心臓のプレコンディショニングに関与することが示されている。長期の虚血は、梗塞部位での細胞の死に主に起因する、不可逆的な心筋層の損傷を引き起こす。動物モデル、単離された心臓調製物および培養物中の単離された心筋細胞における研究により、短い期間の心筋の虚血が、その後の長期の虚血におけるこのような組織損傷を減少することが実証されている（Ｌｉｕ，Ｙ．ら、１９９５、１９９６；Ｈｕら、１９９５；Ｂｒｅｗら、１９９５；Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９９６）。この保護は、天然ではアンギナの後に生じそしてプレコンディショニングと呼ばれており、種々の非特異的ＰＫＣアゴニストにより模倣され得る（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９９３；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９９５；Ｍｕｒｒｙら、１９８６；Ｓｐｅｅｃｈｌｙ−Ｄｉｃｋら、１９９４）。δＰＫＣおよびεＰＫＣの両方の活性化は、プレコンディショニングの後に生じる（Ｇｒａｙら、１９９７）が、εＰＫＣ活性化は、虚血により誘導される細胞死からの心筋細胞の保護のために必要とされる（米国特許第６，１６５，９７７号）。
【００１０】
近年の研究において、εＰＫＣ選択的ペプチドアゴニストが、単離された新生児および成人の心筋細胞に細胞内投与された場合ならびにトランスジェニックマウスにおいてインビボで細胞内産生された場合に、虚血からの心臓保護を提供することが示された（Ｄｏｒｎ Ｇ．ら、１９９９）。この研究において、εＰＫＣペプチドアゴニストは、細胞レベルに適した実験技術または遺伝子トランスフェクションにより、インビトロで単離された細胞に細胞内投与された。残念ながら、これらの技術のいずれも、ヒトの治療に適切でないし、成功する可能性もない。さらに、この研究から、εＰＫＣが、インビボで全組織またはインタクトな器官に細胞外送達されて治療効果を達成し得るか否かは不明である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（発明の要旨）
従って、虚血現象に起因する損傷から組織を保護する方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１２】
虚血のプレコンディショニングの誘導のためにεＰＫＣペプチドアゴニストを投与する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１３】
虚血現象により引き起こされる組織に対する損傷を緩和する方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、１つの局面において、本発明は、ψεＲＡＣＫペプチドを細胞に投与することにより、虚血または低酸素状態に曝された細胞に対する損傷を低減する方法を包含する。１つの実施形態において、このペプチドは、細胞が虚血または低酸素状態に曝される前に投与される。例えば、このペプチドは、細胞が虚血または低酸素症に曝される前に、約１〜１８０分間の期間をかけて投与される。別の実施形態において、このペプチドは、細胞が虚血または低酸素状態に曝された後に投与される。例えば、このペプチドは、細胞が虚血または低酸素状態に曝された後に、約１〜１８０分の期間をかけて投与される。別の実施形態において、このペプチドは、虚血または低酸素症の間に細胞に投与される。
【００１５】
１つの実施形態において、ψεＲＡＣＫペプチドは配列番号２として同定された配列を有する。他の実施形態において、このペプチドは、配列番号６〜１８からなる群より選択される配列を有する。
【００１６】
なお別の実施形態において、ψεＲＡＣＫペプチドは、細胞膜を通過する輸送を容易にするのに効果的な部分（例えば、Ｔａｔ由来ペプチド（配列番号５）、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａキャリアペプチド（配列番号３）、またはポリアルギニンペプチド）と連結される。
【００１７】
このペプチドは、静脈内、非経口、皮下、吸入、鼻腔内、舌下、粘膜、および経皮からなる群より選択される経路により投与され得る。
【００１８】
別の局面において、本発明は、上記のように、ψεＲＡＣＫペプチドを組織に投与することにより、虚血または低酸素状態に曝された組織に対する損傷を低減する方法を包含する。
【００１９】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、εＰＫＣオクタペプチドの先行技術（米国特許第６，１６５，９７７号）である。
【００２０】
配列番号２は、ψεＲＡＣＫオクタペプチドである。
【００２１】
配列番号３は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン由来のキャリアペプチドである。
【００２２】
配列番号４は、スクランブルψεＲＡＣＫオクタペプチドである。
【００２３】
配列番号５は、Ｔａｔ由来のキャリアペプチドである。
【００２４】
配列番号６は、配列番号２の改変体である。
【００２５】
配列番号７は、配列番号２の改変体である。
【００２６】
配列番号８は、配列番号２の改変体である。
【００２７】
配列番号９は、配列番号２の改変体である。
【００２８】
配列番号１０は、配列番号２の改変体である。
【００２９】
配列番号１１は、配列番号２の改変体である。
【００３０】
配列番号１２は、配列番号２の改変体である。
【００３１】
配列番号１３は、配列番号２の改変体である。
【００３２】
配列番号１４は、配列番号２の改変体である。
【００３３】
配列番号１５は、配列番号２の改変体である。
【００３４】
配列番号１６は、配列番号２の改変体である。
【００３５】
配列番号１７は、配列番号２の改変体である。
【００３６】
配列番号１８は、配列番号２のフラグメントである。
・本出願はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１） 虚血状態または低酸素状態に曝露された細胞もしくは器官に対する損傷を減少させるための組成物であって、
ψεＲＡＣＫペプチド
を含む、組成物。
・（項目２） 項目１に記載の組成物であって、上記細胞もしくは器官が上記虚血状態または上記低酸素状態に曝露される前に、上記ψεＲＡＣＫペプチドが投与されることを特徴とする、組成物。
・（項目３） 項目１に記載の組成物であって、上記細胞もしくは器官が上記虚血状態または上記低酸素状態に曝露された後に、上記ψεＲＡＣＫペプチドが投与されることを特徴とする、組成物。
・（項目４） 項目２または項目３に記載の組成物であって、約１分間〜１８０分間の期間に、上記ψεＲＡＣＫペプチドが投与されることを特徴とする、組成物。
・（項目５） 項目１に記載の組成物であって、上記虚血状態または上記低酸素状態への上記細胞もしくは器官の曝露の間に、上記ψεＲＡＣＫペプチドが投与されることを特徴とする、組成物。
・（項目６） 項目１〜項目５のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、上記ペプチドが、配列番号２または配列番号６〜配列番号１８として同定された配列を有する、組成物。
・（項目７） 項目６に記載の組成物であって、上記ψεＲＡＣＫペプチドが、細胞膜を通過する輸送を容易にするために有効な部分に連結されている、組成物。
・（項目８） 項目７に記載の組成物であって、上記部分が、Ｔａｔ由来ペプチド（配列番号：５）、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａキャリアペプチド（配列番号：３）、またはポリアルギニンペプチドである、組成物。
・（項目９） 項目１〜項目８のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、上記ペプチドが、静脈内経路、非経口経路、皮下経路、吸入経路、鼻腔内経路、舌下経路、粘膜経路、および経皮経路からなる群より選択される経路によって投与されることを特徴とする、組成物。
・（項目１０） 項目１〜８のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、上記ペプチドが、器官全体である組織に対してエキソビボもしくはインビボにて投与されることを特徴とする、組成物。
・（項目１１） 項目１０に記載の組成物であって、上記器官が、心臓、肺、肝臓、脳、および腎臓より選択される、組成物。
・（項目１２） 項目１０に記載の組成物であって、上記ペプチドが、冠状動脈を通じてのインタクトな心臓への注入によって投与されることを特徴とする、組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】図１Ａは、虚血現象の前にψεＲＡＣＫ（○）またはスクランブルψεＲＡＣＫ（コントロール、□）で処置したエキソビボラット心臓における、逆灌流中の時間の関数としてのクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の放出を示す。処置された心臓を、コントロールとしての、虚血期間に供したが未処置のままだった心臓（▲）および酸素正常状態下で維持した心臓（虚血なし、ペプチド処置なし、■）と比較した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに記載される研究において、３０分間の再灌流中に放出されたＣＰＫの総量を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、全体虚血の前に、ψεＲＡＣＫを灌流した活動心臓（ｗｏｒｋｉｎｇ ｈｅａｒｔ）の機能的回復を示す（左心室発生圧（ＬＶＰ、ｍｍＨｇ）、その一次導関数（ｄＰ／ｄｔ、ｍｍＨｇ／秒）、および冠動脈灌流圧（ＰＰ、ｍｍＨｇ）を示す）。右パネルは、再灌流前（ベースライン）および後の同一トレースの拡大を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、虚血前にスクランブルψεＲＡＣＫを灌流した活動心臓についての、図２Ａと同様のスキャンである。
【図３Ａ】図３Ａは、最初の２０分間の再灌流の間にψεＲＡＣＫで処置したエキソビボラット心臓（〇）および虚血後に処置しなかった心臓（▲）における、虚血性傷害後の時間の関数としてのＣＰＫ放出を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、（ｉ）虚血性傷害後に２０分間、ψεＲＡＣＫでエキソビボ処置したラット心臓全体または（ｉｉ）処置しなかったラット心臓全体に対する虚血性傷害後の６０分間の再灌流の間の総ＣＰＫ放出を示す棒グラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、３０分間の虚血性傷害の最初の１０分間にψεＲＡＣＫを用いてインビボ処置した５日後のブタから採取したブタ心臓切片のコンピューターにより作成した写真である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、３０分間の虚血性傷害の最初の１０分間に、コントロールとしてスクランブルψεＲＡＣＫペプチドを用いてインビボ処置した５日後のブタから採取したブタ心臓切片のコンピューターにより作製された写真である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ψεＲＡＣＫペプチドまたはスクランブルψεＲＡＣＫペプチド（コントロール）で処置したブタについて、心臓組織のグラム数で測定された、危険な領域の割合としての総梗塞領域を示す棒グラフである。
【図５】図５は、３つの時点：（１）バルーンカテーテルによる左前下行動脈の閉塞前（閉塞前）；（２）ψεＲＡＣＫを用いた再灌流の直後（ψεＲＡＣＫ後）；および（３）処置５日後屠殺前（５日後）での、ブタの左心室造影により測定された駆出率を示すグラフである（ψεＲＡＣＫで処置した動物（▲）およびスクランブルしたペプチドで処置したコントロール動物（〇））。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書中で使用される場合、「組織」は、共通の機能を発揮する同様に専門化した細胞の群をいう。組織は、生存生物の器官および構造成分を構成する。本明細書中で使用される場合、組織は、所定の組織から構成される器官および、個々に又は集合的に、この組織を構成する細胞を含むことを意図する。
・「虚血」または「虚血現象」は、特定の細胞、組織、または器官への血液の不十分な供給をいう。減少した血液供給の結果は、器官または組織への不十分な酸素の供給である（低酸素症）。長期の低酸素血症は、罹患した器官または組織に対する損傷を引き起こし得る。
【００３９】
「無酸素症」は、器官または組織中での実質的に完全な酸素の欠乏をいい、長期的である場合、細胞、器官、または組織の死を引き起こし得る。
【００４０】
「低酸素症」または「低酸素状態」は、細胞、器官、または組織が不十分な酸素供給しか受けられない状態をいう。
【００４１】
「虚血性損傷」は、一定期間の虚血の結果としての、器官または組織または細胞に対する細胞性損傷および／または分子性損傷をいう。
【００４２】
「無酸素性損傷」は、一定期間の不十分な酸素供給に起因する、細胞、器官、または組織に対する損傷をいう。
【００４３】
「再灌流」は、流れがないかまたは流れが減少されていた一定期間の後の、組織への流体の流れの復帰をいう。例えば、心臓の再灌流においては、流体または血液供給に対する閉塞の除去の後に、流体または血液が、供給ライン（例えば、インビボでの冠動脈）を通って心臓に戻る。
【００４４】
「疾患を処置する」とは、その疾患の症状を低減するためにおよび／または疾患の重篤度を低下させるために効果的な治療物質を投与することをいう。
【００４５】
「保存的アミノ酸置換」は、選択されたポリペプチドの活性（例えば、εＰＫＣアゴニストまたはψεＲＡＣＫアゴニスト活性）または３次構造が有意に変化しない置換である。このような置換は、代表的に、選択されたアミノ酸残基の、それと同様の物理化学的特性を有する異なる残基による置き換えを含む。例えば、ＡｓｐからＧｌｕへの置換は、両者が類似する大きさの負に電荷したアミノ酸であるので、保存的置換であるとみなされる。物理化学的特性によるアミノ酸のグループ化は、当業者に公知である。
【００４６】
特定の配列に関して、「それらの保存的置換」は、１つ以上の位置に保存的アミノ酸置換を有することにより特定の配列とは異なる配列をいう。
【００４７】
「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用され、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基の鎖からなる化合物をいう。他に示されない限り、ペプチドの配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への順番で示される。
【００４８】
第１のペプチドまたはポリペプチドが、第２のペプチドまたはポリペプチドフラグメントに対して「対応する」または「相同である」と言われる場合、それは、このペプチドまたはフラグメントが、プログラムＡＬＩＧＮ（ミューテイションギャップマトリックスおよび６以上のギャップペナルティーを用いる）を用いて（標準偏差の単位において）５より大きいアラインメントスコアを有する場合にアミノ酸残基における類似性を有することを意味する（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、ＡＴＬＡＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＤ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ（１９７２）第５巻、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、１０１〜１１０頁、およびこの巻に対する補遺２、１〜１０頁）。より好ましくは、２つの配列（またはそれらの一部）は、それらのアミノ酸が、上記のＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に整列される場合に５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上同一である場合、相同である。
【００４９】
ポリペプチド配列またはフラグメントは、それが別の配列またはフラグメントの領域と同一のアミノ酸残基の配列を有する場合、その別のポリペプチド配列またはフラグメントに「由来」する。
【００５０】
「εＰＫＣアゴニストペプチド」または「εＰＫＣ特異的アゴニストペプチド」は、εＰＫＣ由来の約４と約３０との間、好ましくは約５と約１５との間のアミノ酸長のペプチドを意味すると理解される。１つの実施形態において、εＰＫＣアゴニストペプチドは、εＰＫＣのアミノ酸約７０と約１２０との間の領域、好ましくは、アミノ酸約８０と約１００との間の領域、より好ましくは、アミノ酸約８５と約９２との間の領域に由来する。
【００５１】
略語：「ＰＫＣ」、プロテインキナーゼＣ；「ＲＡＣＫ」、活性化Ｃ−キナーゼに対するレセプター。
【００５２】
アミノ酸残基の略語は、２０個の共通Ｌ−アミノ酸の１つを呼ぶために当該分野で使用される標準的な３文字および／または１文字記号である。
【００５３】
（ＩＩ．ψεＲＡＣＫペプチドアゴニストの投与）
１つの局面において、本発明は、同族のポリペプチド（例えば、レセプタータンパク質（ＲＡＣＫ））に結合することによりインビボで活性化されるシグナル伝達タンパク質（例えば、ＰＫＣ）を活性化し得るペプチドを投与することにより、虚血現象または低酸素状態に起因する損傷から細胞、組織、または器官を保護する方法を提供する。ＰＫＣシグナル伝達ペプチドとそのＲＡＣＫとの間で相同な領域は、「偽ＲＡＣＫ」配列（ψ−ＲＡＣＫ；Ｒｏｎら、１９９４、１９９５）と呼ばれ、そして代表的に、対応するＲＡＣＫのＰＫＣ−結合領域と類似の配列を有する。εＰＫＣ特異的アゴニストペプチドとして作用するψ−ＲＡＣＫ配列は、本明細書中で、配列番号２として同定される。このペプチド（本明細書中では、ψεＲＡＣＫと呼ばれている）は、εＲＡＣＫ特異的アゴニストペプチドでありεＰＫＣの転位を誘導する。これまでの研究は、ψεＲＡＣＫペプチド自体が、器官全体にインビボまたはエキソビボで投与されて、εＰＣＫの転位を誘導し、虚血からの保護を与え得るか否か知られていなかったので、ψεＲＡＣＫの作用を模倣する薬物およびペプチド模倣物を同定することに注目してきた。本発明を支持する上で実施される研究においては、虚血状態に曝す前後に、ψεＲＡＣＫをエキソビボおよびインビボで心臓全体に投与した。このペプチドは、本明細書に記載されるように、虚血性損傷の程度を低減させた。
【００５４】
（Ａ．虚血前のψεＲＡＣＫペプチドアゴニストの投与）
本明細書において配列番号２と同定された配列を有するペプチドを、方法の節に記載される通りに合成および精製した。スクランブルψεＲＡＣＫペプチド（配列番号４）もまた、ψεＲＡＣＫペプチドに対する比較またはネガティブコントロールとして利用するために調製した。いくつかの研究において、これらのペプチドをキャリアペプチド（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン（配列番号３））に結合させた。キャリアに結合させることにより修飾されていないペプチドであるネイティブのペプチドの投与もまた企図されることが認識される。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ以外のキャリアペプチドもまた企図され、そして他のキャリアペプチドの例として、Ｔａｔ由来のペプチド（配列番号５、Ｆａｗｅｌｌら、１９９４、Ｖｉｖｅｓら、１９９７）またはポリアルギニンペプチド（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、２０００；Ｒｏｌｈｂａｒｄら、２０００）、あるいは当該分野で記載されている他の類似のキャリア（Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、２０００；Ｓｃｈｗａｒｌｚｅら、２０００）が挙げられる。
【００５５】
実施例１に記載されるように、動物を麻酔し、そしてそれらの心臓をすばやく取り出し、そしてランゲンドルフ装置による灌流のためにカニューレを挿入した。血流力学パラメータを、安定化するまで（代表的に１０〜２０分間）モニターした。平衡化した後、ψεＲＡＣＫペプチド（配列番号２）またはスクランブルψεＲＡＣＫペプチド（配列番号４）を、０．５μＭのペプチドを用い、２０分間冠状動脈を介して心臓に送達した。
【００５６】
全体虚血を誘導するために、心臓への流れを４５分間妨害した。次いで、心臓を３０分間再灌流した。再灌流の間に、虚血により誘導される細胞損傷を、灌流中のクレアチンホスホキナーゼの活性（５２０ｎｍでの吸光度）を測定することにより決定した。クレアチンホスホキナーゼは、心筋細胞におけるサイトゾル酵素であり、灌流液におけるその存在は、虚血により損傷した心筋細胞の数に比例する。この結果を、図１Ａ〜１Ｂに示す。
【００５７】
図１Ａは、虚血現象前に５００ｎＭ（０．５μＭ）のψεＲＡＣＫ（〇）または０．５μＭのスクランブルψεＲＡＣＫ（□）により処置したエキソビボ心臓の、３０分間の再灌流の間の時間の関数としてのクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）放出を示す。コントロールとして、虚血期間に供されたがペプチドによる処置を行っていない心臓（▲）および酸素正常状態で維持した心臓（虚血なし、ペプチド処置なし；■）についてのＣＰＫ放出もまた示される。虚血前にψεＲＡＣＫで処置した心臓は、酸素正常状態で維持されたコントロール心臓に近いＣＰＫの放出を有する。対照的に、スクランブルψεＲＡＣＫで処置した心臓は、ＣＰＫの有意な放出を有し、これにより、有意な細胞損傷が示される。
【００５８】
図１Ｂは、ψεＲＡＣＫで処置した心臓およびスクランブルψεＲＡＣＫで処置した心臓についての再灌流期間の間の総ＣＰＫ放出を示す棒グラフである。虚血現象に曝されたが未処置のままの心臓からの総ＣＰＫ放出もまた示される。
【００５９】
図１Ａ〜１Ｂは、虚血現象の前にψεＲＡＣＫで処置した心臓が、その後の虚血現象から引き起こされる損傷からの保護を提供することを示す。従って、１つの実施形態においては、本発明は、ある量のψεＲＡＣＫアゴニストペプチドを組織に投与することにより、虚血または低酸素現象に曝された組織に対する損傷を低減または防止する方法を企図する。このペプチドは、虚血現象前１〜１８０分、より好ましくは虚血現象前の約１〜１２０分、より好ましくは虚血現象前の約１〜６０分に投与され得る。別の実施形態において、約１８０分未満、より好ましくは１２０分未満、さらにより好ましくは約６０分未満の期間が、ペプチド送達の休止と虚血現象との間を隔てている。
【００６０】
本発明を支持する別の研究において、実施例１に記載されるように、虚血現象の後のエキソビボ心臓の機能的回復を、一定の拍動（３．３Ｈｚ）および一定の冠状動脈流（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｆｌｏｗ）（１０ｍＬ／分）での定積左心室圧（ＬＶＰ）をモニターすることによって評価した。虚血現象の前に、この心臓を、５００ｎＭのψεＲＡＣＫ（配列番号２）またはスクランブルψεＲＡＣＫペプチド（配列番号４）で処置した。３０分間の全体虚血の後、この心臓を、３０分間の再灌流期間の間、モニターした。結果を、図２Ａ〜２Ｂに示す。
【００６１】
図２Ａは、全体虚血の前にψεＲＡＣＫペプチドで処置された心臓に対する結果を示し、そして図２Ｂは、虚血の前に、スクランブルψεＲＡＣＫで処置された心臓に対する結果を示す。処置された心臓および未処置の心臓の、ベースラインレベルと再灌流レベルとの比較において、虚血前のψεＲＡＣＫペプチドの投与による、虚血性損傷の有意な減少が見られる。これは特に、ψεＲＡＣＫで前処置された心臓における左心室発生圧力（ＬＶＰ）の回復と、スクランブルペプチドで前処置された心臓におけるそれらとを比較することにより示される。両方のＬＶＰの回復およびその１次導関数（ｄＰ／ｄｔ）の、４倍の向上を、ψεＲＡＣＫでの前処置によって達成した。さらに、ψεＲＡＣＫは、上昇するＬＶＰ目標拡張期圧および冠状動脈の灌流圧（ＰＰ）を減少させた。
【００６２】
従って、これらの研究（図１および２）は、虚血または低酸素に起因する、組織への細胞損傷が、虚血現象または低酸素現象の前にψεＲＡＣＫを投与することによって減少することを示す。本研究において、このψεＲＡＣＫは、虚血状態および／または低酸素状態への曝露の前の期間の間、冠状動脈を通じて器官に投与される。この期間、ならびに投与されるペプチドの用量は、以下でより詳細に考察されるように、かなり変動し得る。
【００６３】
（Ｂ．虚血に続くψεＲＡＣＫペプチドアゴニストの投与）
本発明を支持して行われた別の研究において、ψεＲＡＣＫを、延長された虚血期間の後、エキソビボ心臓に投与し、そしてψεＲＡＣＫは、虚血損傷からの保護を提供するために有効であった。実施例２に記載されるように、ラットの心臓全体を、ランゲンドルフ装置上で灌流した。３０分間の平衡化期間の後、液流を４５分間停止させることによって、全体虚血を誘導した。次いで、この心臓を、ψεＲＡＣＫペプチドを用いてかまたは用いずに、２０分間再灌流し、その後、ペプチドを用いずに４０分間灌流した。虚血に続く６０分間（２０分間のペプチド再灌流＋４０分間の灌流）の間に、この灌流液におけるＣＰＫ活性を分析した。結果を、図３Ａ〜３Ｂに示す。
【００６４】
図３Ａは、ψεＲＡＣＫで処置された心臓（〇）、および、虚血後に処置されなかった心臓（▲）についての、虚血後の時間の関数としてのＣＰＫ放出を示す。図３Ｂは、ペプチド処置されたエキソビボ心臓および未処置のエキソビボ心臓についての、６０分間の灌流の間の総ＣＰＫ放出を示す棒グラフである。これらのデータは、以前に虚血状態または低酸素状態に曝露された組織への、その後のψεＲＡＣＫペプチドの投与が、細胞損傷を減少させるために有効であることを示す。図３Ｂは、ψεＲＡＣＫペプチドで処置された組織に対して、約２分の１の総ＣＰＫ放出が存在することを示す。
【００６５】
（Ｃ．インビボでのψεＲＡＣＫペプチドの投与）
本発明を支持する別の研究において、ψεＲＡＣＫペプチドの、虚血現象または低酸素現象に起因する損傷から組織を保護する能力を、インビボでこのペプチドを投与することによって評価した。実施例３に詳述されるように、ψεＲＡＣＫペプチド（配列番号２）またはスクランブルψεＲＡＣＫペプチド（配列番号４）を、３０分間の虚血傷害のうちの最初の１０分間の間に、成体のブタに投与した。５日後、この心臓を、組織損傷について分析した。結果を、図４Ａ〜４Ｃに示す。
【００６６】
図４Ａ〜４Ｂは、ψεＲＡＣＫを用いて（図４Ａ）、または、コントロールとしてスクランブルψεＲＡＣＫペプチドを用いて（図４Ｂ）、インビボで処置されたブタから得られた、ブタ心臓切片のコンピューターにより作成した写真である。この心臓を、虚血性損傷の危険性がある部位（ａｒｅａ）（図４Ｂの、主に中央の壁における矢印内の部位）および梗塞性部位（図４Ｂの白色部位）の決定を可能にする、二重染色技術（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（実施例３）を用いて染色した。図４Ｂにおいて見られるように、スクランブルψεＲＡＣＫペプチドで処置されたコントロール心臓は、危険性部位内に、大きな梗塞性部位を有する（矢印で示される境界線）。対照的に、ψεＲＡＣＫペプチドを受け入れたブタ（図４Ａ）は、有意に減少した梗塞性部位を有する。表面積、領域（ｒｅｇｉｏｎ）の重量、ならびに、危険性領域および梗塞性領域の全組織重量の測定は、コントロール心臓が危険性部位中に平均３６．５±０．３％の梗塞を有し、それに対し、ψεＲＡＣＫペプチドで処置された心臓が危険性部位中に平均１４．９±．６％の梗塞を有することを示した（ｐ＜０．００５）。
【００６７】
図４Ｃは、心臓組織のグラムで測定された、危険性部位における割合として梗塞性部位を示す棒グラフである。見られるように、梗塞の割合は、ψＲＡＣＫで処置された動物に対して２分の１以上減少した。従って、虚血現象の前か、または虚血現象の間の、インビボでのψεＲＡＣＫペプチドの送達は、梗塞の割合を、少なくとも２分の１減少させるために有効である。
【００６８】
血液サンプルおよび肺、肝臓、脳、腸、腎臓などの組織サンプルを、動物から収集し、そして病理学研究室で分析した。全てのサンプルは正常であり、そして、炎症または組織異常性は認められなかった。
【００６９】
別の研究において、ブタ（ｎ＝５）の左心室造影（ＬＶＧ）を、６Ｆｒ．のピッグテール（ｐｉｇ−ｔａｉｌ）カテーテルを用いて、３つの時点で行った：（１）バルーンカテーテルによる、左前下行動脈の閉塞前（閉塞前）；（２）５μＭ／１０ｍＬのψεＲＡＣＫを用いた再灌流の直後（ψεＲＡＣＫ後）；および（３）５日後の屠殺前（５日後）。２つの視点（右斜め前および左斜め前）からＬＶＧを記録した。最大収縮の間、左心室に存在する全最大量に対する駆出率（ＥＦ）（拍動において駆出される血液の割合）を、ソフトウェア（Ｐｌｕｓ Ｐｌｕｓ（Ｓａｎｄｅｒｓ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ））によって分析し、そして２つの視点の平均値を評価した。左心室の容積に基づいて駆出率を計算した。結果を図５に示す。駆出率は、心臓がどの程度よく機能しているかの尺度であり、より高い駆出率は、よりよく機能する心臓を示す。短期間における５０％未満の駆出率は、心不全の状態への進行を示唆し得る。図５に見られるように、ψεＲＡＣＫで処置された動物（▲）は、閉塞後、スクランブルペプチドで処置されたコントロール動物（〇）と比較して、より高い駆出率を有し、このペプチドが、細胞および組織への、虚血に起因する損傷を減少または防止することを示唆した。これはまた、虚血および処置の５日後のデータ点（ψεＲＡＣＫで処置された動物は、虚血前に測定された駆出率と同等であり、そして未処置の動物よりも約１０％高い、駆出率を有した）からも明白である。従って、虚血後の、インビボでのψεＲＡＣＫペプチドの送達は、未処置の細胞または組織の駆出率より少なくとも１０％大きい駆出率によって示されるように、細胞損傷および組織損傷を減少させるために有効である。
【００７０】
（ＩＩＩ．ψεＲＡＣＫペプチド）
本明細書中で用いられる場合、「ψεＲＡＣＫペプチド」とは、配列番号２によって表されるペプチド、ならびに、このペプチドの誘導体およびフラグメントをいう。例示的な誘導体は配列番号６〜１８において与えられ、そしてこれらとして以下の配列が挙げられる：ＨＥＡＤＩＧＹＤ（配列番号６）；ＨＤＡＰＩＧＹＥ（配列番号７）；ＨＤＡＰＶＧＹＥ（配列番号８）；ＨＤＡＰＬＧＹＥ（配列番号９）；ＨＤＡＰＩＧＤＹ（配列番号１０）；ＨＤＡＰＩＧＥＹ（配列番号１１）；ＡＤＡＰＩＧＹＤ（配列番号１２）；ＨＤＧＰＩＧＹＤ（配列番号１３）；ＨＤＡＡＩＧＹＤ（配列番号１４）、およびこれらの改変体の組み合わせ。
【００７１】
１つの好ましい実施形態において、配列番号２中の配列「ＤＡＰＩＧ」（配列番号１８）は、いかなる残基においても、２つ以下の改変しか有さない。配列「ＤＡＰＩＧ」の外側の残基のうちの１つ、２つ、または３つ全ては改変され得る。例えば、ＡＥＡＰＶＧＥＹ（配列番号１５）は、「ＤＡＰＩＧ」（配列番号１８）配列の外側の全３残基および「ＤＡＰＩＧ」配列内の２つの残基が改変された、配列番号２の誘導体である。他の例として、ＨＥＡＰＩＧＤＮ（配列番号１６）およびＨＤＧＤＩＧＹＤ（配列番号１７）が挙げられる。
【００７２】
配列番号２および上記の改変体のフラグメントが適切であり得ることもまた、理解される。配列番号２の例示的なフラグメントはＤＡＰＩＧ（配列番号１８）である。
【００７３】
これらの例示的なペプチドは全て、（ｉ）化学的に合成され得るか、または（ｉｉ）例えば、前記のペプチドをコードするポリヌクレオチドフラグメントを含む発現ベクターを用いて、宿主細胞において組換え産生され得る（ここで、ポリヌクレオチドフラグメントは、宿主細胞におけるフラグメントからｍＲＮＡを発現し得るプロモーターに、作動可能に連結される）。
【００７４】
投与されるペプチドの用量は、処置される組織および患者の状態に依存して変動する。投薬量は、動物研究および人体研究に基づいて、当業者によって容易に決定される。代表的には、０．０５〜５μＭの間、より好ましくは、０．１〜２μＭの間、もっとも好ましくは、約０．１〜１μＭのペプチドが投与される。しかし、これらの範囲の上限および下限は単なる例示である。
【００７５】
このペプチドは、主な医療従事者によって決定されるような、任意の適切な経路によって投与され得る。例えば、静脈内、非経口、皮下、吸入、鼻腔内、舌下、粘膜、および経皮などによる投与が企図される。当然、投与の経路は、当業者に理解されるように、投与の用量およびタイミングに影響する。
【００７６】
このペプチドは、融合タンパク質または輸送タンパク質結合体の形態で投与され得る。代表的に、融合タンパク質を形成するために、このペプチドは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合以外の結合によって、別のペプチドと結合される。１つのペプチドのＣ末端から他のペプチドのＮ末端へのアミド結合は、融合タンパク質における結合の例である。δＰＫＣアゴニスト／アンタゴニストペプチドが結合された第２のペプチドは、治療目的または輸送目的のために選択される、実質的に任意のペプチドであり得る。例えば、ψεＲＡＣＫペプチドを、サイトカインまたは生物学的応答を誘発する他のペプチドに連結することは、おそらく望ましい。
【００７７】
このペプチドが結合体の一部である場合、このペプチドは、代表的に、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合によって、キャリアペプチド（例えば、Ｔａｔ由来輸送ポリペプチド（Ｖｉｖｅｓら、１９９７）、ポリアルギニン（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、２０００；Ｒｏｌｈｂａｒｄら、２０００）、またはＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａペプチド）に結合される。米国特許第５，８０４，６０４号を参照のこと。別の一般的な実施形態において、このペプチドは、キャリアまたはカプセル材料（例えば、リポソーム媒介送達におけるリポソーム）を用いて、細胞、組織、または器官全体に導入され得る。
【００７８】
ψεＲＡＣＫならびに同様の活性を有する任意の化合物が、本明細書中に記載される処置方法において用いられ得ることもまた、理解される。他の化合物（例えば、ペプチド模倣物、化学物質、または他のペプチド）は、例えば、米国特許第６，１６５，９７７号において開示されるスクリーニング方法によって同定され得、そして、この１４欄４５行〜１５欄５４行の部分は、本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、虚血から細胞または組織を保護するために有効な化合物を同定するための例として、δＰＫＣは、δＰＫＣを含む溶液をマルチウェルプレートに導入し、そしてδＰＫＣをプラスチックに結合することを可能にすることによって、マルチウェルプレートのウェル内に固定される。このウェルは、δＰＫＣの結合を増強する基質、および／または非特異的結合のレベルを減少させる基質で、予め被膜され得る。
【００７９】
次いで、このプレートは、ブロッキング溶液（例えば、ウシ血清アルブミンを含む）を用いてインキュベートされ、次いで、数回洗浄される。レポーター標識された（例えば、蛍光標識化によって放射標識化された）ペプチドψεＲＡＣＫ（配列番号２）および試験ウェルにおいて、コントロールウェルと対照的に、試験化合物を含む溶液が添加される。異なるウェルは、異なる試験化合物か、または異なる濃度の同一の試験化合物を含み得る。各濃度での各々の試験化合物は代表的に、２連で試験され、そして各々のアッセイは代表的に、ネガティブ（試験化合物を有さないウェル）コントロールならびにポジティブ（「試験化合物」が非標識化ペプチドであるウェル）コントロールとともに行われる。次いで、遊離ペプチドが洗い流され、そしてこのウェルにおける結合の程度が評価される。
【００８０】
試験化合物は、ペプチドの結合が減少する場合（すなわち、結合の程度に対する効果が閾値レベルよりも上である場合）、活性な試験化合物として同定される。より具体的には、結合の減少が、コントロールサンプルと実験サンプルとの間で数倍異なる場合、この化合物は、結合活性を有すると考えられ得る。代表的に、試験サンプルとコントロールサンプルとの間で、閾値の２倍または４倍の、結合の差異が求められる。
【００８１】
このようなアッセイにおいて有用な検出法として、抗体ベースの方法、ペプチドに導入されるレポーター部分（例えば、蛍光ラベル）の直接検出などが挙げられる。
【００８２】
他のペプチド、高分子、低分子、化学的混合物および／または生物学的混合物、真菌抽出物、細菌抽出物あるいは藻類抽出物を含む、種々の試験化合物がスクリーニングされ得る。これらの化合物は、生物学的または合成的に生じ得る。
【００８３】
（ＩＶ．投与の有用性および経路）
本発明は、例えば、生存する心臓麻痺患者の処置、ならびに、病院への入院後の心臓疾患によってただちに死亡する人物の処置における用途を有する。εＰＫＣ選択的ペプチドアゴニスト（ψεＲＡＣＫ）の送達は、これらの患者の管理において、急性的にも慢性的にも役立つ。
【００８４】
急性的には、切迫した梗塞を伴って病院に運ばれる患者において、医療は、伝統的に、血栓溶解またはカテーテル血管形成のどちらかによって、冠状動脈閉塞の原因を除去することに向けられている。しかし、損傷した部位の再灌流は、心筋細胞損傷の主要な機構の１つであり得る。心臓保護を誘導するために、血栓溶解または血管形成の直前またはそれらと同時に、カテーテルによって閉塞部位に送達されるか、または静脈内に注射される、ψεＲＡＣＫペプチドＰＫＣアゴニストの投与が、本発明によって企図される。
【００８５】
慢性的には、狭心症の患者において、現在の医療アプローチは、狭心症のプレコンディショニングの保護効果の置換せずに、狭心症の症状を停止することである。ＡεＰＫＣ選択的アゴニスト（例えば、ψεＲＡＣＫ）は、狭心症患者において、狭心症によって誘導されるプレコンディショニング効果を置換し、そして、より深刻な虚血の将来の発症の際に、より高速な心筋サルベージを提供する。
【００８６】
本発明のさらなる用途は、虚血のタイミングが医師によって制御される、臨床的状況である。このような場合、プレコンディショニング応答の薬理的な増強は、処置を受ける患者にとって有意な利点を提供し得る。具体的には、毎年、アメリカ合衆国においてだけでも、６００，０００人の成人および１２，０００の子供が心肺バイパスを利用する開胸手術を受けており、その間、心臓は、数分〜１時間をはるかに超える範囲に及ぶ期間の、制御された虚血に供される。心臓保護の進歩にも関わらず、手術直後の期間の間の心筋不全は依然として、これらの患者の罹病率および死亡率の主因である。虚血傷害の正確なタイミングは、患者に先んじて知られ、虚血の前のψεＲＡＣＫの投与を可能にする。ψεＲＡＣＫの投与は、手術前の数時間、または数日間、プレコンディショニング応答を誘導することによって、心筋損傷を減少させる。
【００８７】
同様の利点は、アメリカ合衆国において毎年約２５００件が存在する、心臓移植の分野において理解され得る。延長される移植片虚血は、このような心臓移植に対する、長距離ドナー器官の獲得を制限する要素の１つである。器官獲得時のψεＲＡＣＫペプチドの投与は、器官収集と器官移植との間の時間を延長し得、そして、手術後の心筋不全の危険性を減少させ得る。
【００８８】
もちろん、ψεＲＡＣＫペプチドが、心臓虚血に加えて、種々の虚血状態および低酸素状態の処置において用いられ得ることが理解される。例えば、ψεＲＡＣＫは、虚血現象または低酸素現象の前に、間に、または後に、多種多様な細胞および組織に投与され得る。例として、腎臓、血管内皮、肝臓、眼、ならびに、発作に起因して脳および他の中枢神経系組織への組織損傷が生じ得る、中枢神経系が挙げられるが、これらに限定する意図はない。
【００８９】
本明細書中に記載される研究によって示されるように、このペプチドは、虚血現象あるいは低酸素現象の前に、間に、または後に投与され得る。虚血傷害の前に送達される場合、このペプチドは、細胞損傷の程度を有効に減少させる。好ましくは、このペプチドは、虚血前に組織を越えるか、または通じて、約１〜１８０分間灌流され、より好ましくは、約１〜１２０分間灌流され、もっとも好ましくは、約１〜６０分灌流される。１つの実施形態において、約３時間以内の間、より好ましくは、約１２０分以内の間、そしてもっとも好ましくは、約６０分以内の間灌流される（ペプチド灌流の休止と、虚血現象または低酸素現象との間、隔てられる）。このペプチドは、１分間、２分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、またはより長い、虚血傷害に続く期間の間に送達され得る。
【００９０】
このポリペプチドが虚血現象に続いて送達される場合、好ましい実施形態において、約２時間以内、より好ましくは、１時間以内、そしてさらに好ましくは、３０分以内の期間が、虚血現象とこのペプチドの投与の開始との間、隔てられる。このペプチドは、１分間、２分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、またはより長い、虚血傷害に続く期間の間に送達され得る。
【００９１】
このペプチドはまた、虚血現象の間に投与され得る。具体的には、制御された虚血の時間の間（例えば、手術の間）、医療従事者は、虚血現象の開始の寸前またはそれと同時に、ψεＲＡＣＫの投与を開始し得る。
【実施例】
【００９２】
（ＩＶ．実施例）
以下の実施例は、本明細書中に記載される本発明をさらに説明し、そして本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
【００９３】
（方法）
（１．ペプチド調製）
Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙで、ψεＲＡＣＫ（ＨＤＡＰＩＧＹＤ、配列番号２）を合成および精製した（＞９５％）。同様に、スクランブルψεＲＡＣＫペプチド（ＰＤＹＨＤＡＧＩ、配列番号４）を調製した。いくつかの研究において、このペプチドを、キャリアペプチドを用いて、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディアホメオドメイン由来ペプチド（Ｃ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号３；Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｌ．ら、１９９５；Ｊｈｏｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら、１９９６ａ）との、Ｎ末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を介するか、または、Ｔａｔタンパク質由来ペプチド（Ｃ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号６）との、Ｎ末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を介する架橋によって、改変した。
【００９４】
（実施例１）
（虚血前のψεＲＡＣＫのエキソビボ投与）
マウスまたはラットを、ｉ．ｐ．アバーティン（ａｖｅｒｔｉｎ）で麻酔し、それらの心臓を迅速に取り出し、そしてこれらの心臓に、当該分野において記載されるように（Ｃｏｌｂｅｒｔら、１９９７）、再灌流のために、大動脈を介して挿管した。取り出してから９０秒以内にこれらの心臓を灌流するように注意した。左心室圧および実時間導関数（ｄＰ／ｄｔ）を、心室の尖端に配置されたカテーテルを介してモニターした。血流力学的パラメーターを、手順全体を通して、２０分ごとに記録した。酸素添加Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液（ＮａＣｌ １２０；ＫＣｌ ５．８；ＮａＨＣＯ３ ２５；ＮａＨ２Ｏ４ １．２；ＭｇＳＯ４ １．２；ＣａＣｌ２ １．０；および、ブドウ糖 １０（単位はｎｍｏｌ／Ｌ）で構成され、ｐＨ７．４、３７℃）を用いて、この心臓を灌流した。
【００９５】
１０〜２０分間の平衡化期間の後、この心臓を、ψεＲＡＣＫペプチド（配列番号２）またはスクランブルψεＲＡＣＫペプチド（配列番号４）で２０分間処置した。０．５μＭの適切なペプチドを含むＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液を用いて、一定の流動（１０ｍＬ／分）で灌流を維持した。用いられたランゲンドルフ法は、肺動脈をバイパスして、心室から大動脈および冠状動脈への逆行性の流動を用いた。
【００９６】
全体虚血を誘導するために、流動を４５分間中断した。虚血現象の後、この心臓を、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液を用いて３０〜１６０分間再灌流した。再灌流の間、虚血によって誘導された細胞損傷を、Ｓｉｇｍａキットを用いて、灌流液におけるクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の活性（５２０ｎｍでの吸収）を測定することにより、決定した。結果を、図１Ａ〜１Ｂに示す。
【００９７】
（実施例２）
（虚血後のψεＰＫＣのエキソビボ投与）
実施例１に記載されるように、ラットの心臓を調製した。３０分間の平衡化期間の後、液流を４５分間中断することによって全体虚血を誘導した。次いで、この心臓を、０．５μＭのψεＲＡＣＫペプチドを用いて２０分間灌流し、それに次いで、このペプチドを用いずに４０分間再灌流した。コントロールとして、いくつかの心臓を、虚血の後、未処置のまま放置した。虚血後の６０分の期間の間、虚血によって誘導された細胞損傷を、再灌流の間に収集された灌流液におけるクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）活性（５２０ｎｍでの吸収）をモニターすることによって決定した。結果を、図３Ａ〜３Ｂに示す。
【００９８】
（実施例３）
（虚血前のψεＰＫＣのインビボ投与）
若い成体雌ブタ（体重３５〜４０ｋｇ）を麻酔し、頚動脈を介して心臓にカテーテルを導入した。従来の処置心臓学的技術を用いて、カテーテルを介して、左前下行動脈（ＬＡＤ）へとワイヤーを配置した。このワイヤーを伝わせて、閉塞部位へバルーンを送達した。次いで、このバルーンを膨張させ、血流を３０分間ブロックした。虚血傷害の最初の１０分間に、コントロールであるスクランブルψεＲＡＣＫペプチド（配列番号４、ｎ＝５）または生物学的に活性なψεＲＡＣＫペプチド（配列番号２、ｎ＝５）のどちらかを、このバルーンを介する拡散により、閉塞の下流に直接送達した。約２０μｇのペプチド（約４００ｎｇ／ｋｇ体重）を投与した。
【００９９】
３０分の閉塞後、バルーンを除去し、そしてブタを放置して手術から回復させた。５日後、このブタを安楽死させ、そして心臓を収集した。心臓除去の後、ＬＡＤを閉塞した。閉塞を固定した状態で、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ色素（これは、梗塞の危険性がない全ての部位を青く染色するが、血流へのアクセスがない全ての部位を赤く残す）を注入した。次いで、心臓を切片に切り分け、そしてテトラゾリウム赤色色素（これは、全ての生存部位を赤く染色し、そして閉塞された死亡組織を白く染色する）を用いて染色した。各々の心臓は、虚血の危険性がある部位および梗塞部位がマークされた、特有の部位を有する複数の組織切片を有した。これを用いて、各々の切片および心臓全体に対する、危険性がある部位に対する梗塞の割合を決定した。結果を、図４Ａ〜４Ｃに示す。
【０１００】
本発明は、特定の実施形態に関して記述されているが、種々の変更および改変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に明白である。
【０１０１】
本発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴は、本発明の詳細な説明を添付の図面と組み合わせて読むと、より十分に認識される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、虚血現象に起因する損傷から細胞および組織を保護する方法に関する。本発明の方法は、プロテインキナーゼＣのペプチドアゴニストを投与する工程、より詳細にはプソイド−イプシロンＲＡＣＫ（ψεＲＡＣＫ）ペプチドを投与する工程を包含する。
【背景技術】
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【表１】
（発明の背景）
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、細胞増殖、遺伝子発現の調節、およびイオンチャネル活性の調節を含む、種々の細胞機能に関与するシグナル伝達において重要な酵素である。ＰＫＣファミリーのアイソザイムとして、少なくとも１１の異なるプロテインキナーゼが挙げられ、これらはそれらの相同性およびアクチベーターに対する感受性に基づき少なくとも３つのサブファミリーのメンバーに分類され得る。古典的なサブファミリーつまりｃＰＫＣサブファミリー（α、βＩ、βＩＩ、およびγＰＫＣ）は、アイソザイム固有の領域（可変領域またはＶ領域）により間隔を空けられた４つの相同ドメイン（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４）を含み、活性化のためにカルシウム、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびジアシルグリセロール（ＤＧ）またはホルボールエステルを必要とする。新規のサブファミリーつまりｎＰＫＣサブファミリーのメンバー（δ、ε、η、およびθＰＫＣ）はＣ２相同ドメインを欠き、活性化のためにカルシウムを必要としない。最後に、変則的なサブファミリーつまりαＰＫＣサブファミリーのメンバー（ζおよびλ／ιＰＫＣ）はＣ２相同ドメインとＣ１相同ドメインの半分とを欠き、ＤＧ、ホルボールエステル、およびカルシウムに非感受性である。
【０００４】
ＰＫＣアイソザイムの細胞下分布に関する研究により、ＰＫＣの活性化が、細胞中でのその再分布を引き起こし（転位とも呼ばれる）、それによって、活性化されたＰＫＣアイソザイムが、原形質膜、細胞骨格エレメント、核、および他の細胞下画分と結合することが実証されている（Ｓａｉｔｏら、１９８９；ＰａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓおよびＨａｌｌ、１９８９；Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎら、１９９０）。
【０００５】
異なるＰＫＣアイソザイムの固有の細胞機能は、それらの細胞下での位置によって決定されるようである。例えば、活性化されたβＩＰＫＣは核の内部で見出され、活性化されたβＩＩＰＫＣは核周囲および心筋細胞の細胞末梢で見出される（Ｄｉｓａｔｎｉｋら、１９９４）。さらに、同じ細胞において、εＰＫＣは、活性化後または固定細胞への外因性活性化εＰＫＣの添加後に横紋構造（おそらく、収縮性エレメント）および細胞−細胞接触部に結合する（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎら、１９９０；Ｄｉｓａｔｎｉｋら、１９９４）。細胞の異なる領域への異なるＰＫＣアイソザイムの局在化は、活性化Ｃ−キナーゼに対するレセプター（ＲＡＣＫ）と呼ばれる特異的なアンカー分子への活性化アイソザイムの結合に起因するようである。
【０００６】
ＲＡＣＫは、活性化ＰＫＣアイソザイムをそれぞれの細胞下部位に選択的に固定することにより機能すると考えられている。ＲＡＣＫは完全に活性化したＰＫＣにのみ結合するが、ＲＡＣＫは必ずしもこの酵素の基質であるわけでなく、ＲＡＣＫへの結合が、必ずしもこのキナーゼの触媒ドメインを介して媒介されるわけでもない（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎら、１９９１）。ＰＫＣの転位は、細胞粒子画分に固定されたＲＡＣＫに対するこの活性化された酵素の結合を反映し、ＲＡＣＫへの結合は、ＰＫＣがその細胞応答を生じるのに必要とされる（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ、１９９５）。インビボでのＲＡＣＫへのＰＫＣ結合の阻害は、ＰＫＣの転位およびＰＫＣが媒介する機能を阻害する（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９６；Ｒｏｎら、１９９５；ＳｍｉｔｈおよびＭｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ、１９９２）。
【０００７】
ＲＡＣＫ１およびＲＡＣＫ２をコードするｃＤＮＡクローンが同定されている（米国特許第５，５１９，００３号；Ｒｏｎら、１９９４；Ｃｓｕｋａｉら、１９９５）。両者は、別の転位プロテインキナーゼ（β−アドレナリン作用性レセプターキナーゼ、βＡＲＫ）に対するレセプターである、Ｇタンパク質のβサブユニットのホモログである（Ｐｉｔｃｈｅｒら、１９９２）。Ｇβと同様に、ＲＡＣＫ１およびＲＡＣＫ２は、７つのＷＤ４０リピートを有する（Ｒｏｎら、１９９４；Ｃｓｕｋａｉら、１９９５）。近年のデータは、ＲＡＣＫ１がβＩＩＰＫＣ−特異的ＲＡＣＫであり（Ｓｔｅｂｂｉｎｓら、２００１）、ＲＡＣＫ２が活性化εＰＫＣに対して特異的である（Ｃｓｕｋａｉら、１９９７）ことを示唆する。
【０００８】
ＰＫＣの転位は、ＰＫＣアイソザイムの適切な機能に必要とされる。ＲＡＣＫ上のＰＫＣ結合部位（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ、１９９１ａ；Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ、１９９５）またはＰＫＣ上のＲＡＣＫ結合部位（Ｒｏｎら、１９９５；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９６）のいずれかを模倣するペプチドは、インビボでのこの酵素の機能を選択的に阻害するＰＫＣのアイソザイム特異的転位インヒビターである。例えば、εＰＫＣに由来する８アミノ酸のペプチド（ペプチドεＶ１−２；配列番号１、Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ）が、米国特許第６，１６５，９７７号に記載されている。このペプチドは、εＰＫＣ上のＲＡＣＫ結合部位の一部を含み、心筋細胞における特異的なεＰＫＣにより媒介される機能を選択的に阻害する。
【０００９】
近年、ＰＫＣ、より具体的にはεＰＣＫが、虚血性損傷に対する保護を提供するための心臓のプレコンディショニングに関与することが示されている。長期の虚血は、梗塞部位での細胞の死に主に起因する、不可逆的な心筋層の損傷を引き起こす。動物モデル、単離された心臓調製物および培養物中の単離された心筋細胞における研究により、短い期間の心筋の虚血が、その後の長期の虚血におけるこのような組織損傷を減少することが実証されている（Ｌｉｕ，Ｙ．ら、１９９５、１９９６；Ｈｕら、１９９５；Ｂｒｅｗら、１９９５；Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９９６）。この保護は、天然ではアンギナの後に生じそしてプレコンディショニングと呼ばれており、種々の非特異的ＰＫＣアゴニストにより模倣され得る（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９９３；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９９５；Ｍｕｒｒｙら、１９８６；Ｓｐｅｅｃｈｌｙ−Ｄｉｃｋら、１９９４）。δＰＫＣおよびεＰＫＣの両方の活性化は、プレコンディショニングの後に生じる（Ｇｒａｙら、１９９７）が、εＰＫＣ活性化は、虚血により誘導される細胞死からの心筋細胞の保護のために必要とされる（米国特許第６，１６５，９７７号）。
【００１０】
近年の研究において、εＰＫＣ選択的ペプチドアゴニストが、単離された新生児および成人の心筋細胞に細胞内投与された場合ならびにトランスジェニックマウスにおいてインビボで細胞内産生された場合に、虚血からの心臓保護を提供することが示された（Ｄｏｒｎ Ｇ．ら、１９９９）。この研究において、εＰＫＣペプチドアゴニストは、細胞レベルに適した実験技術または遺伝子トランスフェクションにより、インビトロで単離された細胞に細胞内投与された。残念ながら、これらの技術のいずれも、ヒトの治療に適切でないし、成功する可能性もない。さらに、この研究から、εＰＫＣが、インビボで全組織またはインタクトな器官に細胞外送達されて治療効果を達成し得るか否かは不明である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（発明の要旨）
従って、虚血現象に起因する損傷から組織を保護する方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１２】
虚血のプレコンディショニングの誘導のためにεＰＫＣペプチドアゴニストを投与する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１３】
虚血現象により引き起こされる組織に対する損傷を緩和する方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、１つの局面において、本発明は、ψεＲＡＣＫペプチドを細胞に投与することにより、虚血または低酸素状態に曝された細胞に対する損傷を低減する方法を包含する。１つの実施形態において、このペプチドは、細胞が虚血または低酸素状態に曝される前に投与される。例えば、このペプチドは、細胞が虚血または低酸素症に曝される前に、約１〜１８０分間の期間をかけて投与される。別の実施形態において、このペプチドは、細胞が虚血または低酸素状態に曝された後に投与される。例えば、このペプチドは、細胞が虚血または低酸素状態に曝された後に、約１〜１８０分の期間をかけて投与される。別の実施形態において、このペプチドは、虚血または低酸素症の間に細胞に投与される。
【００１５】
１つの実施形態において、ψεＲＡＣＫペプチドは配列番号２として同定された配列を有する。他の実施形態において、このペプチドは、配列番号６〜１８からなる群より選択される配列を有する。
【００１６】
なお別の実施形態において、ψεＲＡＣＫペプチドは、細胞膜を通過する輸送を容易にするのに効果的な部分（例えば、Ｔａｔ由来ペプチド（配列番号５）、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａキャリアペプチド（配列番号３）、またはポリアルギニンペプチド）と連結される。
【００１７】
このペプチドは、静脈内、非経口、皮下、吸入、鼻腔内、舌下、粘膜、および経皮からなる群より選択される経路により投与され得る。
【００１８】
別の局面において、本発明は、上記のように、ψεＲＡＣＫペプチドを組織に投与することにより、虚血または低酸素状態に曝された組織に対する損傷を低減する方法を包含する。
【００１９】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、εＰＫＣオクタペプチドの先行技術（米国特許第６，１６５，９７７号）である。
【００２０】
配列番号２は、ψεＲＡＣＫオクタペプチドである。
【００２１】
配列番号３は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン由来のキャリアペプチドである。
【００２２】
配列番号４は、スクランブルψεＲＡＣＫオクタペプチドである。
【００２３】
配列番号５は、Ｔａｔ由来のキャリアペプチドである。
【００２４】
配列番号６は、配列番号２の改変体である。
【００２５】
配列番号７は、配列番号２の改変体である。
【００２６】
配列番号８は、配列番号２の改変体である。
【００２７】
配列番号９は、配列番号２の改変体である。
【００２８】
配列番号１０は、配列番号２の改変体である。
【００２９】
配列番号１１は、配列番号２の改変体である。
【００３０】
配列番号１２は、配列番号２の改変体である。
【００３１】
配列番号１３は、配列番号２の改変体である。
【００３２】
配列番号１４は、配列番号２の改変体である。
【００３３】
配列番号１５は、配列番号２の改変体である。
【００３４】
配列番号１６は、配列番号２の改変体である。
【００３５】
配列番号１７は、配列番号２の改変体である。
【００３６】
配列番号１８は、配列番号２のフラグメントである。
・本出願はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１） 虚血状態または低酸素状態に曝露された細胞もしくは器官に対する損傷を減少させるための組成物であって、
ψεＲＡＣＫペプチド
を含む、組成物。
・（項目２） 項目１に記載の組成物であって、上記細胞もしくは器官が上記虚血状態または上記低酸素状態に曝露される前に、上記ψεＲＡＣＫペプチドが投与されることを特徴とする、組成物。
・（項目３） 項目１に記載の組成物であって、上記細胞もしくは器官が上記虚血状態または上記低酸素状態に曝露された後に、上記ψεＲＡＣＫペプチドが投与されることを特徴とする、組成物。
・（項目４） 項目２または項目３に記載の組成物であって、約１分間〜１８０分間の期間に、上記ψεＲＡＣＫペプチドが投与されることを特徴とする、組成物。
・（項目５） 項目１に記載の組成物であって、上記虚血状態または上記低酸素状態への上記細胞もしくは器官の曝露の間に、上記ψεＲＡＣＫペプチドが投与されることを特徴とする、組成物。
・（項目６） 項目１〜項目５のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、上記ペプチドが、配列番号２または配列番号６〜配列番号１８として同定された配列を有する、組成物。
・（項目７） 項目６に記載の組成物であって、上記ψεＲＡＣＫペプチドが、細胞膜を通過する輸送を容易にするために有効な部分に連結されている、組成物。
・（項目８） 項目７に記載の組成物であって、上記部分が、Ｔａｔ由来ペプチド（配列番号：５）、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａキャリアペプチド（配列番号：３）、またはポリアルギニンペプチドである、組成物。
・（項目９） 項目１〜項目８のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、上記ペプチドが、静脈内経路、非経口経路、皮下経路、吸入経路、鼻腔内経路、舌下経路、粘膜経路、および経皮経路からなる群より選択される経路によって投与されることを特徴とする、組成物。
・（項目１０） 項目１〜８のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、上記ペプチドが、器官全体である組織に対してエキソビボもしくはインビボにて投与されることを特徴とする、組成物。
・（項目１１） 項目１０に記載の組成物であって、上記器官が、心臓、肺、肝臓、脳、および腎臓より選択される、組成物。
・（項目１２） 項目１０に記載の組成物であって、上記ペプチドが、冠状動脈を通じてのインタクトな心臓への注入によって投与されることを特徴とする、組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】図１Ａは、虚血現象の前にψεＲＡＣＫ（○）またはスクランブルψεＲＡＣＫ（コントロール、□）で処置したエキソビボラット心臓における、逆灌流中の時間の関数としてのクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の放出を示す。処置された心臓を、コントロールとしての、虚血期間に供したが未処置のままだった心臓（▲）および酸素正常状態下で維持した心臓（虚血なし、ペプチド処置なし、■）と比較した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに記載される研究において、３０分間の再灌流中に放出されたＣＰＫの総量を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、全体虚血の前に、ψεＲＡＣＫを灌流した活動心臓（ｗｏｒｋｉｎｇ ｈｅａｒｔ）の機能的回復を示す（左心室発生圧（ＬＶＰ、ｍｍＨｇ）、その一次導関数（ｄＰ／ｄｔ、ｍｍＨｇ／秒）、および冠動脈灌流圧（ＰＰ、ｍｍＨｇ）を示す）。右パネルは、再灌流前（ベースライン）および後の同一トレースの拡大を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、虚血前にスクランブルψεＲＡＣＫを灌流した活動心臓についての、図２Ａと同様のスキャンである。
【図３Ａ】図３Ａは、最初の２０分間の再灌流の間にψεＲＡＣＫで処置したエキソビボラット心臓（〇）および虚血後に処置しなかった心臓（▲）における、虚血性傷害後の時間の関数としてのＣＰＫ放出を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、（ｉ）虚血性傷害後に２０分間、ψεＲＡＣＫでエキソビボ処置したラット心臓全体または（ｉｉ）処置しなかったラット心臓全体に対する虚血性傷害後の６０分間の再灌流の間の総ＣＰＫ放出を示す棒グラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、３０分間の虚血性傷害の最初の１０分間にψεＲＡＣＫを用いてインビボ処置した５日後のブタから採取したブタ心臓切片のコンピューターにより作成した写真である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、３０分間の虚血性傷害の最初の１０分間に、コントロールとしてスクランブルψεＲＡＣＫペプチドを用いてインビボ処置した５日後のブタから採取したブタ心臓切片のコンピューターにより作製された写真である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ψεＲＡＣＫペプチドまたはスクランブルψεＲＡＣＫペプチド（コントロール）で処置したブタについて、心臓組織のグラム数で測定された、危険な領域の割合としての総梗塞領域を示す棒グラフである。
【図５】図５は、３つの時点：（１）バルーンカテーテルによる左前下行動脈の閉塞前（閉塞前）；（２）ψεＲＡＣＫを用いた再灌流の直後（ψεＲＡＣＫ後）；および（３）処置５日後屠殺前（５日後）での、ブタの左心室造影により測定された駆出率を示すグラフである（ψεＲＡＣＫで処置した動物（▲）およびスクランブルしたペプチドで処置したコントロール動物（〇））。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書中で使用される場合、「組織」は、共通の機能を発揮する同様に専門化した細胞の群をいう。組織は、生存生物の器官および構造成分を構成する。本明細書中で使用される場合、組織は、所定の組織から構成される器官および、個々に又は集合的に、この組織を構成する細胞を含むことを意図する。
・「虚血」または「虚血現象」は、特定の細胞、組織、または器官への血液の不十分な供給をいう。減少した血液供給の結果は、器官または組織への不十分な酸素の供給である（低酸素症）。長期の低酸素血症は、罹患した器官または組織に対する損傷を引き起こし得る。
【００３９】
「無酸素症」は、器官または組織中での実質的に完全な酸素の欠乏をいい、長期的である場合、細胞、器官、または組織の死を引き起こし得る。
【００４０】
「低酸素症」または「低酸素状態」は、細胞、器官、または組織が不十分な酸素供給しか受けられない状態をいう。
【００４１】
「虚血性損傷」は、一定期間の虚血の結果としての、器官または組織または細胞に対する細胞性損傷および／または分子性損傷をいう。
【００４２】
「無酸素性損傷」は、一定期間の不十分な酸素供給に起因する、細胞、器官、または組織に対する損傷をいう。
【００４３】
「再灌流」は、流れがないかまたは流れが減少されていた一定期間の後の、組織への流体の流れの復帰をいう。例えば、心臓の再灌流においては、流体または血液供給に対する閉塞の除去の後に、流体または血液が、供給ライン（例えば、インビボでの冠動脈）を通って心臓に戻る。
【００４４】
「疾患を処置する」とは、その疾患の症状を低減するためにおよび／または疾患の重篤度を低下させるために効果的な治療物質を投与することをいう。
【００４５】
「保存的アミノ酸置換」は、選択されたポリペプチドの活性（例えば、εＰＫＣアゴニストまたはψεＲＡＣＫアゴニスト活性）または３次構造が有意に変化しない置換である。このような置換は、代表的に、選択されたアミノ酸残基の、それと同様の物理化学的特性を有する異なる残基による置き換えを含む。例えば、ＡｓｐからＧｌｕへの置換は、両者が類似する大きさの負に電荷したアミノ酸であるので、保存的置換であるとみなされる。物理化学的特性によるアミノ酸のグループ化は、当業者に公知である。
【００４６】
特定の配列に関して、「それらの保存的置換」は、１つ以上の位置に保存的アミノ酸置換を有することにより特定の配列とは異なる配列をいう。
【００４７】
「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用され、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基の鎖からなる化合物をいう。他に示されない限り、ペプチドの配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への順番で示される。
【００４８】
第１のペプチドまたはポリペプチドが、第２のペプチドまたはポリペプチドフラグメントに対して「対応する」または「相同である」と言われる場合、それは、このペプチドまたはフラグメントが、プログラムＡＬＩＧＮ（ミューテイションギャップマトリックスおよび６以上のギャップペナルティーを用いる）を用いて（標準偏差の単位において）５より大きいアラインメントスコアを有する場合にアミノ酸残基における類似性を有することを意味する（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、ＡＴＬＡＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＤ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ（１９７２）第５巻、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、１０１〜１１０頁、およびこの巻に対する補遺２、１〜１０頁）。より好ましくは、２つの配列（またはそれらの一部）は、それらのアミノ酸が、上記のＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に整列される場合に５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上同一である場合、相同である。
【００４９】
ポリペプチド配列またはフラグメントは、それが別の配列またはフラグメントの領域と同一のアミノ酸残基の配列を有する場合、その別のポリペプチド配列またはフラグメントに「由来」する。
【００５０】
「εＰＫＣアゴニストペプチド」または「εＰＫＣ特異的アゴニストペプチド」は、εＰＫＣ由来の約４と約３０との間、好ましくは約５と約１５との間のアミノ酸長のペプチドを意味すると理解される。１つの実施形態において、εＰＫＣアゴニストペプチドは、εＰＫＣのアミノ酸約７０と約１２０との間の領域、好ましくは、アミノ酸約８０と約１００との間の領域、より好ましくは、アミノ酸約８５と約９２との間の領域に由来する。
【００５１】
略語：「ＰＫＣ」、プロテインキナーゼＣ；「ＲＡＣＫ」、活性化Ｃ−キナーゼに対するレセプター。
【００５２】
アミノ酸残基の略語は、２０個の共通Ｌ−アミノ酸の１つを呼ぶために当該分野で使用される標準的な３文字および／または１文字記号である。
【００５３】
（ＩＩ．ψεＲＡＣＫペプチドアゴニストの投与）
１つの局面において、本発明は、同族のポリペプチド（例えば、レセプタータンパク質（ＲＡＣＫ））に結合することによりインビボで活性化されるシグナル伝達タンパク質（例えば、ＰＫＣ）を活性化し得るペプチドを投与することにより、虚血現象または低酸素状態に起因する損傷から細胞、組織、または器官を保護する方法を提供する。ＰＫＣシグナル伝達ペプチドとそのＲＡＣＫとの間で相同な領域は、「偽ＲＡＣＫ」配列（ψ−ＲＡＣＫ；Ｒｏｎら、１９９４、１９９５）と呼ばれ、そして代表的に、対応するＲＡＣＫのＰＫＣ−結合領域と類似の配列を有する。εＰＫＣ特異的アゴニストペプチドとして作用するψ−ＲＡＣＫ配列は、本明細書中で、配列番号２として同定される。このペプチド（本明細書中では、ψεＲＡＣＫと呼ばれている）は、εＲＡＣＫ特異的アゴニストペプチドでありεＰＫＣの転位を誘導する。これまでの研究は、ψεＲＡＣＫペプチド自体が、器官全体にインビボまたはエキソビボで投与されて、εＰＣＫの転位を誘導し、虚血からの保護を与え得るか否か知られていなかったので、ψεＲＡＣＫの作用を模倣する薬物およびペプチド模倣物を同定することに注目してきた。本発明を支持する上で実施される研究においては、虚血状態に曝す前後に、ψεＲＡＣＫをエキソビボおよびインビボで心臓全体に投与した。このペプチドは、本明細書に記載されるように、虚血性損傷の程度を低減させた。
【００５４】
（Ａ．虚血前のψεＲＡＣＫペプチドアゴニストの投与）
本明細書において配列番号２と同定された配列を有するペプチドを、方法の節に記載される通りに合成および精製した。スクランブルψεＲＡＣＫペプチド（配列番号４）もまた、ψεＲＡＣＫペプチドに対する比較またはネガティブコントロールとして利用するために調製した。いくつかの研究において、これらのペプチドをキャリアペプチド（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン（配列番号３））に結合させた。キャリアに結合させることにより修飾されていないペプチドであるネイティブのペプチドの投与もまた企図されることが認識される。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ以外のキャリアペプチドもまた企図され、そして他のキャリアペプチドの例として、Ｔａｔ由来のペプチド（配列番号５、Ｆａｗｅｌｌら、１９９４、Ｖｉｖｅｓら、１９９７）またはポリアルギニンペプチド（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、２０００；Ｒｏｌｈｂａｒｄら、２０００）、あるいは当該分野で記載されている他の類似のキャリア（Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、２０００；Ｓｃｈｗａｒｌｚｅら、２０００）が挙げられる。
【００５５】
実施例１に記載されるように、動物を麻酔し、そしてそれらの心臓をすばやく取り出し、そしてランゲンドルフ装置による灌流のためにカニューレを挿入した。血流力学パラメータを、安定化するまで（代表的に１０〜２０分間）モニターした。平衡化した後、ψεＲＡＣＫペプチド（配列番号２）またはスクランブルψεＲＡＣＫペプチド（配列番号４）を、０．５μＭのペプチドを用い、２０分間冠状動脈を介して心臓に送達した。
【００５６】
全体虚血を誘導するために、心臓への流れを４５分間妨害した。次いで、心臓を３０分間再灌流した。再灌流の間に、虚血により誘導される細胞損傷を、灌流中のクレアチンホスホキナーゼの活性（５２０ｎｍでの吸光度）を測定することにより決定した。クレアチンホスホキナーゼは、心筋細胞におけるサイトゾル酵素であり、灌流液におけるその存在は、虚血により損傷した心筋細胞の数に比例する。この結果を、図１Ａ〜１Ｂに示す。
【００５７】
図１Ａは、虚血現象前に５００ｎＭ（０．５μＭ）のψεＲＡＣＫ（〇）または０．５μＭのスクランブルψεＲＡＣＫ（□）により処置したエキソビボ心臓の、３０分間の再灌流の間の時間の関数としてのクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）放出を示す。コントロールとして、虚血期間に供されたがペプチドによる処置を行っていない心臓（▲）および酸素正常状態で維持した心臓（虚血なし、ペプチド処置なし；■）についてのＣＰＫ放出もまた示される。虚血前にψεＲＡＣＫで処置した心臓は、酸素正常状態で維持されたコントロール心臓に近いＣＰＫの放出を有する。対照的に、スクランブルψεＲＡＣＫで処置した心臓は、ＣＰＫの有意な放出を有し、これにより、有意な細胞損傷が示される。
【００５８】
図１Ｂは、ψεＲＡＣＫで処置した心臓およびスクランブルψεＲＡＣＫで処置した心臓についての再灌流期間の間の総ＣＰＫ放出を示す棒グラフである。虚血現象に曝されたが未処置のままの心臓からの総ＣＰＫ放出もまた示される。
【００５９】
図１Ａ〜１Ｂは、虚血現象の前にψεＲＡＣＫで処置した心臓が、その後の虚血現象から引き起こされる損傷からの保護を提供することを示す。従って、１つの実施形態においては、本発明は、ある量のψεＲＡＣＫアゴニストペプチドを組織に投与することにより、虚血または低酸素現象に曝された組織に対する損傷を低減または防止する方法を企図する。このペプチドは、虚血現象前１〜１８０分、より好ましくは虚血現象前の約１〜１２０分、より好ましくは虚血現象前の約１〜６０分に投与され得る。別の実施形態において、約１８０分未満、より好ましくは１２０分未満、さらにより好ましくは約６０分未満の期間が、ペプチド送達の休止と虚血現象との間を隔てている。
【００６０】
本発明を支持する別の研究において、実施例１に記載されるように、虚血現象の後のエキソビボ心臓の機能的回復を、一定の拍動（３．３Ｈｚ）および一定の冠状動脈流（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｆｌｏｗ）（１０ｍＬ／分）での定積左心室圧（ＬＶＰ）をモニターすることによって評価した。虚血現象の前に、この心臓を、５００ｎＭのψεＲＡＣＫ（配列番号２）またはスクランブルψεＲＡＣＫペプチド（配列番号４）で処置した。３０分間の全体虚血の後、この心臓を、３０分間の再灌流期間の間、モニターした。結果を、図２Ａ〜２Ｂに示す。
【００６１】
図２Ａは、全体虚血の前にψεＲＡＣＫペプチドで処置された心臓に対する結果を示し、そして図２Ｂは、虚血の前に、スクランブルψεＲＡＣＫで処置された心臓に対する結果を示す。処置された心臓および未処置の心臓の、ベースラインレベルと再灌流レベルとの比較において、虚血前のψεＲＡＣＫペプチドの投与による、虚血性損傷の有意な減少が見られる。これは特に、ψεＲＡＣＫで前処置された心臓における左心室発生圧力（ＬＶＰ）の回復と、スクランブルペプチドで前処置された心臓におけるそれらとを比較することにより示される。両方のＬＶＰの回復およびその１次導関数（ｄＰ／ｄｔ）の、４倍の向上を、ψεＲＡＣＫでの前処置によって達成した。さらに、ψεＲＡＣＫは、上昇するＬＶＰ目標拡張期圧および冠状動脈の灌流圧（ＰＰ）を減少させた。
【００６２】
従って、これらの研究（図１および２）は、虚血または低酸素に起因する、組織への細胞損傷が、虚血現象または低酸素現象の前にψεＲＡＣＫを投与することによって減少することを示す。本研究において、このψεＲＡＣＫは、虚血状態および／または低酸素状態への曝露の前の期間の間、冠状動脈を通じて器官に投与される。この期間、ならびに投与されるペプチドの用量は、以下でより詳細に考察されるように、かなり変動し得る。
【００６３】
（Ｂ．虚血に続くψεＲＡＣＫペプチドアゴニストの投与）
本発明を支持して行われた別の研究において、ψεＲＡＣＫを、延長された虚血期間の後、エキソビボ心臓に投与し、そしてψεＲＡＣＫは、虚血損傷からの保護を提供するために有効であった。実施例２に記載されるように、ラットの心臓全体を、ランゲンドルフ装置上で灌流した。３０分間の平衡化期間の後、液流を４５分間停止させることによって、全体虚血を誘導した。次いで、この心臓を、ψεＲＡＣＫペプチドを用いてかまたは用いずに、２０分間再灌流し、その後、ペプチドを用いずに４０分間灌流した。虚血に続く６０分間（２０分間のペプチド再灌流＋４０分間の灌流）の間に、この灌流液におけるＣＰＫ活性を分析した。結果を、図３Ａ〜３Ｂに示す。
【００６４】
図３Ａは、ψεＲＡＣＫで処置された心臓（〇）、および、虚血後に処置されなかった心臓（▲）についての、虚血後の時間の関数としてのＣＰＫ放出を示す。図３Ｂは、ペプチド処置されたエキソビボ心臓および未処置のエキソビボ心臓についての、６０分間の灌流の間の総ＣＰＫ放出を示す棒グラフである。これらのデータは、以前に虚血状態または低酸素状態に曝露された組織への、その後のψεＲＡＣＫペプチドの投与が、細胞損傷を減少させるために有効であることを示す。図３Ｂは、ψεＲＡＣＫペプチドで処置された組織に対して、約２分の１の総ＣＰＫ放出が存在することを示す。
【００６５】
（Ｃ．インビボでのψεＲＡＣＫペプチドの投与）
本発明を支持する別の研究において、ψεＲＡＣＫペプチドの、虚血現象または低酸素現象に起因する損傷から組織を保護する能力を、インビボでこのペプチドを投与することによって評価した。実施例３に詳述されるように、ψεＲＡＣＫペプチド（配列番号２）またはスクランブルψεＲＡＣＫペプチド（配列番号４）を、３０分間の虚血傷害のうちの最初の１０分間の間に、成体のブタに投与した。５日後、この心臓を、組織損傷について分析した。結果を、図４Ａ〜４Ｃに示す。
【００６６】
図４Ａ〜４Ｂは、ψεＲＡＣＫを用いて（図４Ａ）、または、コントロールとしてスクランブルψεＲＡＣＫペプチドを用いて（図４Ｂ）、インビボで処置されたブタから得られた、ブタ心臓切片のコンピューターにより作成した写真である。この心臓を、虚血性損傷の危険性がある部位（ａｒｅａ）（図４Ｂの、主に中央の壁における矢印内の部位）および梗塞性部位（図４Ｂの白色部位）の決定を可能にする、二重染色技術（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（実施例３）を用いて染色した。図４Ｂにおいて見られるように、スクランブルψεＲＡＣＫペプチドで処置されたコントロール心臓は、危険性部位内に、大きな梗塞性部位を有する（矢印で示される境界線）。対照的に、ψεＲＡＣＫペプチドを受け入れたブタ（図４Ａ）は、有意に減少した梗塞性部位を有する。表面積、領域（ｒｅｇｉｏｎ）の重量、ならびに、危険性領域および梗塞性領域の全組織重量の測定は、コントロール心臓が危険性部位中に平均３６．５±０．３％の梗塞を有し、それに対し、ψεＲＡＣＫペプチドで処置された心臓が危険性部位中に平均１４．９±．６％の梗塞を有することを示した（ｐ＜０．００５）。
【００６７】
図４Ｃは、心臓組織のグラムで測定された、危険性部位における割合として梗塞性部位を示す棒グラフである。見られるように、梗塞の割合は、ψＲＡＣＫで処置された動物に対して２分の１以上減少した。従って、虚血現象の前か、または虚血現象の間の、インビボでのψεＲＡＣＫペプチドの送達は、梗塞の割合を、少なくとも２分の１減少させるために有効である。
【００６８】
血液サンプルおよび肺、肝臓、脳、腸、腎臓などの組織サンプルを、動物から収集し、そして病理学研究室で分析した。全てのサンプルは正常であり、そして、炎症または組織異常性は認められなかった。
【００６９】
別の研究において、ブタ（ｎ＝５）の左心室造影（ＬＶＧ）を、６Ｆｒ．のピッグテール（ｐｉｇ−ｔａｉｌ）カテーテルを用いて、３つの時点で行った：（１）バルーンカテーテルによる、左前下行動脈の閉塞前（閉塞前）；（２）５μＭ／１０ｍＬのψεＲＡＣＫを用いた再灌流の直後（ψεＲＡＣＫ後）；および（３）５日後の屠殺前（５日後）。２つの視点（右斜め前および左斜め前）からＬＶＧを記録した。最大収縮の間、左心室に存在する全最大量に対する駆出率（ＥＦ）（拍動において駆出される血液の割合）を、ソフトウェア（Ｐｌｕｓ Ｐｌｕｓ（Ｓａｎｄｅｒｓ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ））によって分析し、そして２つの視点の平均値を評価した。左心室の容積に基づいて駆出率を計算した。結果を図５に示す。駆出率は、心臓がどの程度よく機能しているかの尺度であり、より高い駆出率は、よりよく機能する心臓を示す。短期間における５０％未満の駆出率は、心不全の状態への進行を示唆し得る。図５に見られるように、ψεＲＡＣＫで処置された動物（▲）は、閉塞後、スクランブルペプチドで処置されたコントロール動物（〇）と比較して、より高い駆出率を有し、このペプチドが、細胞および組織への、虚血に起因する損傷を減少または防止することを示唆した。これはまた、虚血および処置の５日後のデータ点（ψεＲＡＣＫで処置された動物は、虚血前に測定された駆出率と同等であり、そして未処置の動物よりも約１０％高い、駆出率を有した）からも明白である。従って、虚血後の、インビボでのψεＲＡＣＫペプチドの送達は、未処置の細胞または組織の駆出率より少なくとも１０％大きい駆出率によって示されるように、細胞損傷および組織損傷を減少させるために有効である。
【００７０】
（ＩＩＩ．ψεＲＡＣＫペプチド）
本明細書中で用いられる場合、「ψεＲＡＣＫペプチド」とは、配列番号２によって表されるペプチド、ならびに、このペプチドの誘導体およびフラグメントをいう。例示的な誘導体は配列番号６〜１８において与えられ、そしてこれらとして以下の配列が挙げられる：ＨＥＡＤＩＧＹＤ（配列番号６）；ＨＤＡＰＩＧＹＥ（配列番号７）；ＨＤＡＰＶＧＹＥ（配列番号８）；ＨＤＡＰＬＧＹＥ（配列番号９）；ＨＤＡＰＩＧＤＹ（配列番号１０）；ＨＤＡＰＩＧＥＹ（配列番号１１）；ＡＤＡＰＩＧＹＤ（配列番号１２）；ＨＤＧＰＩＧＹＤ（配列番号１３）；ＨＤＡＡＩＧＹＤ（配列番号１４）、およびこれらの改変体の組み合わせ。
【００７１】
１つの好ましい実施形態において、配列番号２中の配列「ＤＡＰＩＧ」（配列番号１８）は、いかなる残基においても、２つ以下の改変しか有さない。配列「ＤＡＰＩＧ」の外側の残基のうちの１つ、２つ、または３つ全ては改変され得る。例えば、ＡＥＡＰＶＧＥＹ（配列番号１５）は、「ＤＡＰＩＧ」（配列番号１８）配列の外側の全３残基および「ＤＡＰＩＧ」配列内の２つの残基が改変された、配列番号２の誘導体である。他の例として、ＨＥＡＰＩＧＤＮ（配列番号１６）およびＨＤＧＤＩＧＹＤ（配列番号１７）が挙げられる。
【００７２】
配列番号２および上記の改変体のフラグメントが適切であり得ることもまた、理解される。配列番号２の例示的なフラグメントはＤＡＰＩＧ（配列番号１８）である。
【００７３】
これらの例示的なペプチドは全て、（ｉ）化学的に合成され得るか、または（ｉｉ）例えば、前記のペプチドをコードするポリヌクレオチドフラグメントを含む発現ベクターを用いて、宿主細胞において組換え産生され得る（ここで、ポリヌクレオチドフラグメントは、宿主細胞におけるフラグメントからｍＲＮＡを発現し得るプロモーターに、作動可能に連結される）。
【００７４】
投与されるペプチドの用量は、処置される組織および患者の状態に依存して変動する。投薬量は、動物研究および人体研究に基づいて、当業者によって容易に決定される。代表的には、０．０５〜５μＭの間、より好ましくは、０．１〜２μＭの間、もっとも好ましくは、約０．１〜１μＭのペプチドが投与される。しかし、これらの範囲の上限および下限は単なる例示である。
【００７５】
このペプチドは、主な医療従事者によって決定されるような、任意の適切な経路によって投与され得る。例えば、静脈内、非経口、皮下、吸入、鼻腔内、舌下、粘膜、および経皮などによる投与が企図される。当然、投与の経路は、当業者に理解されるように、投与の用量およびタイミングに影響する。
【００７６】
このペプチドは、融合タンパク質または輸送タンパク質結合体の形態で投与され得る。代表的に、融合タンパク質を形成するために、このペプチドは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合以外の結合によって、別のペプチドと結合される。１つのペプチドのＣ末端から他のペプチドのＮ末端へのアミド結合は、融合タンパク質における結合の例である。δＰＫＣアゴニスト／アンタゴニストペプチドが結合された第２のペプチドは、治療目的または輸送目的のために選択される、実質的に任意のペプチドであり得る。例えば、ψεＲＡＣＫペプチドを、サイトカインまたは生物学的応答を誘発する他のペプチドに連結することは、おそらく望ましい。
【００７７】
このペプチドが結合体の一部である場合、このペプチドは、代表的に、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合によって、キャリアペプチド（例えば、Ｔａｔ由来輸送ポリペプチド（Ｖｉｖｅｓら、１９９７）、ポリアルギニン（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、２０００；Ｒｏｌｈｂａｒｄら、２０００）、またはＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａペプチド）に結合される。米国特許第５，８０４，６０４号を参照のこと。別の一般的な実施形態において、このペプチドは、キャリアまたはカプセル材料（例えば、リポソーム媒介送達におけるリポソーム）を用いて、細胞、組織、または器官全体に導入され得る。
【００７８】
ψεＲＡＣＫならびに同様の活性を有する任意の化合物が、本明細書中に記載される処置方法において用いられ得ることもまた、理解される。他の化合物（例えば、ペプチド模倣物、化学物質、または他のペプチド）は、例えば、米国特許第６，１６５，９７７号において開示されるスクリーニング方法によって同定され得、そして、この１４欄４５行〜１５欄５４行の部分は、本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、虚血から細胞または組織を保護するために有効な化合物を同定するための例として、δＰＫＣは、δＰＫＣを含む溶液をマルチウェルプレートに導入し、そしてδＰＫＣをプラスチックに結合することを可能にすることによって、マルチウェルプレートのウェル内に固定される。このウェルは、δＰＫＣの結合を増強する基質、および／または非特異的結合のレベルを減少させる基質で、予め被膜され得る。
【００７９】
次いで、このプレートは、ブロッキング溶液（例えば、ウシ血清アルブミンを含む）を用いてインキュベートされ、次いで、数回洗浄される。レポーター標識された（例えば、蛍光標識化によって放射標識化された）ペプチドψεＲＡＣＫ（配列番号２）および試験ウェルにおいて、コントロールウェルと対照的に、試験化合物を含む溶液が添加される。異なるウェルは、異なる試験化合物か、または異なる濃度の同一の試験化合物を含み得る。各濃度での各々の試験化合物は代表的に、２連で試験され、そして各々のアッセイは代表的に、ネガティブ（試験化合物を有さないウェル）コントロールならびにポジティブ（「試験化合物」が非標識化ペプチドであるウェル）コントロールとともに行われる。次いで、遊離ペプチドが洗い流され、そしてこのウェルにおける結合の程度が評価される。
【００８０】
試験化合物は、ペプチドの結合が減少する場合（すなわち、結合の程度に対する効果が閾値レベルよりも上である場合）、活性な試験化合物として同定される。より具体的には、結合の減少が、コントロールサンプルと実験サンプルとの間で数倍異なる場合、この化合物は、結合活性を有すると考えられ得る。代表的に、試験サンプルとコントロールサンプルとの間で、閾値の２倍または４倍の、結合の差異が求められる。
【００８１】
このようなアッセイにおいて有用な検出法として、抗体ベースの方法、ペプチドに導入されるレポーター部分（例えば、蛍光ラベル）の直接検出などが挙げられる。
【００８２】
他のペプチド、高分子、低分子、化学的混合物および／または生物学的混合物、真菌抽出物、細菌抽出物あるいは藻類抽出物を含む、種々の試験化合物がスクリーニングされ得る。これらの化合物は、生物学的または合成的に生じ得る。
【００８３】
（ＩＶ．投与の有用性および経路）
本発明は、例えば、生存する心臓麻痺患者の処置、ならびに、病院への入院後の心臓疾患によってただちに死亡する人物の処置における用途を有する。εＰＫＣ選択的ペプチドアゴニスト（ψεＲＡＣＫ）の送達は、これらの患者の管理において、急性的にも慢性的にも役立つ。
【００８４】
急性的には、切迫した梗塞を伴って病院に運ばれる患者において、医療は、伝統的に、血栓溶解またはカテーテル血管形成のどちらかによって、冠状動脈閉塞の原因を除去することに向けられている。しかし、損傷した部位の再灌流は、心筋細胞損傷の主要な機構の１つであり得る。心臓保護を誘導するために、血栓溶解または血管形成の直前またはそれらと同時に、カテーテルによって閉塞部位に送達されるか、または静脈内に注射される、ψεＲＡＣＫペプチドＰＫＣアゴニストの投与が、本発明によって企図される。
【００８５】
慢性的には、狭心症の患者において、現在の医療アプローチは、狭心症のプレコンディショニングの保護効果の置換せずに、狭心症の症状を停止することである。ＡεＰＫＣ選択的アゴニスト（例えば、ψεＲＡＣＫ）は、狭心症患者において、狭心症によって誘導されるプレコンディショニング効果を置換し、そして、より深刻な虚血の将来の発症の際に、より高速な心筋サルベージを提供する。
【００８６】
本発明のさらなる用途は、虚血のタイミングが医師によって制御される、臨床的状況である。このような場合、プレコンディショニング応答の薬理的な増強は、処置を受ける患者にとって有意な利点を提供し得る。具体的には、毎年、アメリカ合衆国においてだけでも、６００，０００人の成人および１２，０００の子供が心肺バイパスを利用する開胸手術を受けており、その間、心臓は、数分〜１時間をはるかに超える範囲に及ぶ期間の、制御された虚血に供される。心臓保護の進歩にも関わらず、手術直後の期間の間の心筋不全は依然として、これらの患者の罹病率および死亡率の主因である。虚血傷害の正確なタイミングは、患者に先んじて知られ、虚血の前のψεＲＡＣＫの投与を可能にする。ψεＲＡＣＫの投与は、手術前の数時間、または数日間、プレコンディショニング応答を誘導することによって、心筋損傷を減少させる。
【００８７】
同様の利点は、アメリカ合衆国において毎年約２５００件が存在する、心臓移植の分野において理解され得る。延長される移植片虚血は、このような心臓移植に対する、長距離ドナー器官の獲得を制限する要素の１つである。器官獲得時のψεＲＡＣＫペプチドの投与は、器官収集と器官移植との間の時間を延長し得、そして、手術後の心筋不全の危険性を減少させ得る。
【００８８】
もちろん、ψεＲＡＣＫペプチドが、心臓虚血に加えて、種々の虚血状態および低酸素状態の処置において用いられ得ることが理解される。例えば、ψεＲＡＣＫは、虚血現象または低酸素現象の前に、間に、または後に、多種多様な細胞および組織に投与され得る。例として、腎臓、血管内皮、肝臓、眼、ならびに、発作に起因して脳および他の中枢神経系組織への組織損傷が生じ得る、中枢神経系が挙げられるが、これらに限定する意図はない。
【００８９】
本明細書中に記載される研究によって示されるように、このペプチドは、虚血現象あるいは低酸素現象の前に、間に、または後に投与され得る。虚血傷害の前に送達される場合、このペプチドは、細胞損傷の程度を有効に減少させる。好ましくは、このペプチドは、虚血前に組織を越えるか、または通じて、約１〜１８０分間灌流され、より好ましくは、約１〜１２０分間灌流され、もっとも好ましくは、約１〜６０分灌流される。１つの実施形態において、約３時間以内の間、より好ましくは、約１２０分以内の間、そしてもっとも好ましくは、約６０分以内の間灌流される（ペプチド灌流の休止と、虚血現象または低酸素現象との間、隔てられる）。このペプチドは、１分間、２分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、またはより長い、虚血傷害に続く期間の間に送達され得る。
【００９０】
このポリペプチドが虚血現象に続いて送達される場合、好ましい実施形態において、約２時間以内、より好ましくは、１時間以内、そしてさらに好ましくは、３０分以内の期間が、虚血現象とこのペプチドの投与の開始との間、隔てられる。このペプチドは、１分間、２分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、またはより長い、虚血傷害に続く期間の間に送達され得る。
【００９１】
このペプチドはまた、虚血現象の間に投与され得る。具体的には、制御された虚血の時間の間（例えば、手術の間）、医療従事者は、虚血現象の開始の寸前またはそれと同時に、ψεＲＡＣＫの投与を開始し得る。
【実施例】
【００９２】
（ＩＶ．実施例）
以下の実施例は、本明細書中に記載される本発明をさらに説明し、そして本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
【００９３】
（方法）
（１．ペプチド調製）
Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙで、ψεＲＡＣＫ（ＨＤＡＰＩＧＹＤ、配列番号２）を合成および精製した（＞９５％）。同様に、スクランブルψεＲＡＣＫペプチド（ＰＤＹＨＤＡＧＩ、配列番号４）を調製した。いくつかの研究において、このペプチドを、キャリアペプチドを用いて、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディアホメオドメイン由来ペプチド（Ｃ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号３；Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｌ．ら、１９９５；Ｊｈｏｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら、１９９６ａ）との、Ｎ末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を介するか、または、Ｔａｔタンパク質由来ペプチド（Ｃ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号６）との、Ｎ末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を介する架橋によって、改変した。
【００９４】
（実施例１）
（虚血前のψεＲＡＣＫのエキソビボ投与）
マウスまたはラットを、ｉ．ｐ．アバーティン（ａｖｅｒｔｉｎ）で麻酔し、それらの心臓を迅速に取り出し、そしてこれらの心臓に、当該分野において記載されるように（Ｃｏｌｂｅｒｔら、１９９７）、再灌流のために、大動脈を介して挿管した。取り出してから９０秒以内にこれらの心臓を灌流するように注意した。左心室圧および実時間導関数（ｄＰ／ｄｔ）を、心室の尖端に配置されたカテーテルを介してモニターした。血流力学的パラメーターを、手順全体を通して、２０分ごとに記録した。酸素添加Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液（ＮａＣｌ １２０；ＫＣｌ ５．８；ＮａＨＣＯ３ ２５；ＮａＨ２Ｏ４ １．２；ＭｇＳＯ４ １．２；ＣａＣｌ２ １．０；および、ブドウ糖 １０（単位はｎｍｏｌ／Ｌ）で構成され、ｐＨ７．４、３７℃）を用いて、この心臓を灌流した。
【００９５】
１０〜２０分間の平衡化期間の後、この心臓を、ψεＲＡＣＫペプチド（配列番号２）またはスクランブルψεＲＡＣＫペプチド（配列番号４）で２０分間処置した。０．５μＭの適切なペプチドを含むＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液を用いて、一定の流動（１０ｍＬ／分）で灌流を維持した。用いられたランゲンドルフ法は、肺動脈をバイパスして、心室から大動脈および冠状動脈への逆行性の流動を用いた。
【００９６】
全体虚血を誘導するために、流動を４５分間中断した。虚血現象の後、この心臓を、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液を用いて３０〜１６０分間再灌流した。再灌流の間、虚血によって誘導された細胞損傷を、Ｓｉｇｍａキットを用いて、灌流液におけるクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の活性（５２０ｎｍでの吸収）を測定することにより、決定した。結果を、図１Ａ〜１Ｂに示す。
【００９７】
（実施例２）
（虚血後のψεＰＫＣのエキソビボ投与）
実施例１に記載されるように、ラットの心臓を調製した。３０分間の平衡化期間の後、液流を４５分間中断することによって全体虚血を誘導した。次いで、この心臓を、０．５μＭのψεＲＡＣＫペプチドを用いて２０分間灌流し、それに次いで、このペプチドを用いずに４０分間再灌流した。コントロールとして、いくつかの心臓を、虚血の後、未処置のまま放置した。虚血後の６０分の期間の間、虚血によって誘導された細胞損傷を、再灌流の間に収集された灌流液におけるクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）活性（５２０ｎｍでの吸収）をモニターすることによって決定した。結果を、図３Ａ〜３Ｂに示す。
【００９８】
（実施例３）
（虚血前のψεＰＫＣのインビボ投与）
若い成体雌ブタ（体重３５〜４０ｋｇ）を麻酔し、頚動脈を介して心臓にカテーテルを導入した。従来の処置心臓学的技術を用いて、カテーテルを介して、左前下行動脈（ＬＡＤ）へとワイヤーを配置した。このワイヤーを伝わせて、閉塞部位へバルーンを送達した。次いで、このバルーンを膨張させ、血流を３０分間ブロックした。虚血傷害の最初の１０分間に、コントロールであるスクランブルψεＲＡＣＫペプチド（配列番号４、ｎ＝５）または生物学的に活性なψεＲＡＣＫペプチド（配列番号２、ｎ＝５）のどちらかを、このバルーンを介する拡散により、閉塞の下流に直接送達した。約２０μｇのペプチド（約４００ｎｇ／ｋｇ体重）を投与した。
【００９９】
３０分の閉塞後、バルーンを除去し、そしてブタを放置して手術から回復させた。５日後、このブタを安楽死させ、そして心臓を収集した。心臓除去の後、ＬＡＤを閉塞した。閉塞を固定した状態で、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ色素（これは、梗塞の危険性がない全ての部位を青く染色するが、血流へのアクセスがない全ての部位を赤く残す）を注入した。次いで、心臓を切片に切り分け、そしてテトラゾリウム赤色色素（これは、全ての生存部位を赤く染色し、そして閉塞された死亡組織を白く染色する）を用いて染色した。各々の心臓は、虚血の危険性がある部位および梗塞部位がマークされた、特有の部位を有する複数の組織切片を有した。これを用いて、各々の切片および心臓全体に対する、危険性がある部位に対する梗塞の割合を決定した。結果を、図４Ａ〜４Ｃに示す。
【０１００】
本発明は、特定の実施形態に関して記述されているが、種々の変更および改変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に明白である。
【０１０１】
本発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴は、本発明の詳細な説明を添付の図面と組み合わせて読むと、より十分に認識される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【公開番号】特開２０１３−１００３２６（Ｐ２０１３−１００３２６Ａ）
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１３−７０１３（Ｐ２０１３−７０１３）
【出願日】平成２５年１月１８日（２０１３．１．１８）
【分割の表示】特願２００８−１３１３７９（Ｐ２００８−１３１３７９）の分割
【原出願日】平成１３年１１月９日（２００１．１１．９）
【出願人】（５９１１６３１２２）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２５年１月１８日（２０１３．１．１８）
【分割の表示】特願２００８−１３１３７９（Ｐ２００８−１３１３７９）の分割
【原出願日】平成１３年１１月９日（２００１．１１．９）
【出願人】（５９１１６３１２２）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ (8)
【Ｆターム（参考）】
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