う食原性細菌による酸の産生を検出するための方法
【課題】プラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌を半定量的に測定するための方法を提供すること。
【解決手段】上記方法において、（ａ）プラークサンプルまたは唾液サンプルに含まれる微生物を必要に応じて濃縮する；（ｂ）上記微生物を炭素源と接触させ、ここで、この炭素源は、上記う食原性細菌によって酸に発酵される；（ｃ）上記微生物および上記炭素源を、上記う食原性細菌による選択的な酸の形成を可能にする条件下でインキュベートする；（ｄ）上記炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも一回ｐＨを決定する；ここで、上記サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定は、工程（ｄ）で決定されたｐＨと１つまたはそれより多くの参照値とを比較することによって実行される。
【解決手段】上記方法において、（ａ）プラークサンプルまたは唾液サンプルに含まれる微生物を必要に応じて濃縮する；（ｂ）上記微生物を炭素源と接触させ、ここで、この炭素源は、上記う食原性細菌によって酸に発酵される；（ｃ）上記微生物および上記炭素源を、上記う食原性細菌による選択的な酸の形成を可能にする条件下でインキュベートする；（ｄ）上記炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも一回ｐＨを決定する；ここで、上記サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定は、工程（ｄ）で決定されたｐＨと１つまたはそれより多くの参照値とを比較することによって実行される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、唾液サンプルおよび／またはプラークサンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定のための方法に関し、ここで、プラークサンプルまたは唾液サンプルに含まれる微生物を、炭素源と接触させる。この炭素源は、上記う食原性細菌によって酸に発酵される。次に、この微生物を、上記う食原性細菌による選択的な酸の形成を可能にする条件下でインキュベートする。次に、この酸の形成を、上記炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも一回ｐＨを決定することによって検出し、ここで、上記サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定は、上記ｐＨと少なくとも１つの参照値とを比較することによって実行される。さらに、本発明は、このような方法を実行するためのキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトの口腔には、通常、互いに天然の平衡状態にある８００種超の異なる微生物が集落形成している。しかしながら、実質的に細菌からなるこの微生物叢はまた、歯の健康に損傷を与え得る生物を含む。これは、特に、食事由来の炭水化物を有機酸に代謝することができる細菌に関する。この酸（特に、乳酸）は歯のエナメル質を攻撃し、このことは、まず歯の表面の鉱物質消失をもたらす。鉱物質消失した部位の連続的な集落形成のために、やがては、歯のエナメル質からぞうげ質および歯髄まで攻撃し得る病変をもたらす。
【０００３】
う食の原因となる乳酸の大半は、「ミュータンス連鎖球菌（ｍｕｔａｎｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）」の代謝活動に起因する；この群は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ種、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ種、Ｓ．ｒａｔｔｕｓ種およびＳ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ種を含む。さらに、乳酸杆菌属の群は、この状況において重要である。口腔に集落形成する種々の他の細菌種とともに、これらの細菌は、健康な状態においても安定した平衡状態で存在するが、特別な条件下において、ミュータンス連鎖球菌の増大した繁殖が起こり得、その結果として、う食の発生のリスクが顕著に増大する。ミュータンス連鎖球菌によって生じる酸の形成は、酸性環境をもたらし、それは、今度は、乳酸杆菌属の増殖をますます促進する。乳酸杆菌属の増大した増殖には、乳酸杆菌属による酸の産生に起因するｐＨのさらなる低下が付随し、これは、上記障害の進行を促進する。
【０００４】
口腔に集落形成する細菌の発酵活動に起因して、糖の溶液の供給後、数分以内で、プラーク内のｐＨが大幅に低下することが見出されている。しかしながら、臨床研究において、検出可能なう食を有する小児からのプラークサンプルと、う食を有さない小児からのプラークサンプルとが、口腔内のｐＨを低下させることに関して匹敵する可能性を有したことが見出されている（非特許文献１）。このことは、ヒト口腔において、連鎖球菌属および乳酸杆菌属に加えて、代謝副産物として酸を排出するが、う食の顕著なリスクを提示しない多くの他の微生物が存在することを示している。したがって、唾液中の全体の酸の産生を測定することは、う食原性細菌の数そして、したがって患者のう食のリスクを決定するのに適していない。むしろ、このリスクは、ミュータンス連鎖球菌および乳酸杆菌属の濃度によって明確に決定される。
【０００５】
プラークまたは唾液中のミュータンス連鎖球菌および／または乳酸杆菌属の定量的な測定または半定量的な測定は、患者のう食のリスクについて情報を与え得る。この理由のため、選択栄養培地上で微生物を平板培養することによってその微生物の濃度に関しての、プラークサンプルまたは唾液サンプルの調査を提供する、試験方法が開発されている。例えば、Ｉｖｏｃｌａｒ ＶｉｖａｄｅｎｔからＣＲＴ（登録商標）バクテリアとして取得可能な試験系は、普通寒天プレート上で唾液サンプルからのミュータンス連鎖球菌または乳酸杆菌属の選択的富化に基づく。唾液サンプルを、それぞれバシトラシン含有Ｍｉｔｉｓ Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ寒天培地（連鎖球菌属に関して選択的）、およびそれと並行してＲｏｇｏｓａ寒天培地（乳酸杆菌属に関して選択的）に画線する。２日間〜３日間、インキュベートした後、寒天平板上に形成されたコロニーを数えることによって、患者それぞれについてのう食のリスクについて報告（ｓｔａｔｅｍｅｎｔ）を作成することができる。同様な系はまた、Ｏｒｉｏｎ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＤｅｎｔｏｃｕｌｔおよびＯｒａｌＢｉｏｔｅｃｈからのＣａｒｉｃｕｌｔとして利用可能である。
【０００６】
しかしながら、栄養培地上で唾液サンプルを培養することは、時間を浪費する。習慣的に、これらの結果は、唾液サンプルを平板培養してからおよそ２日後〜３日後になるまで評価することができない。したがって、本発明の目的は、短時間で確実かつ再現性よくプラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌の数に関して報告を作成することができる方法を提供することである。この方法は、複雑な装置を使用せずに実行することができるはずであり、この結果は、可能ならば、数時間内に利用可能になるはずである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＭｉｎａｈおよびＬｏｅｓｃｈｅ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９７７）１７：４３〜５４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明にしたがって、上記目的は、特許請求の範囲の主題によって達成される。第一の局面において、本発明は、プラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌を半定量的に測定するための方法を提供し、ここで
（ａ）プラークサンプルまたは唾液サンプルに含まれる微生物を必要に応じて濃縮する；
（ｂ）上記微生物を炭素源と接触させ、ここで、この炭素源は、上記う食原性細菌によって酸に発酵される；
（ｃ）上記微生物および上記炭素源を、上記う食原性細菌による選択的な酸の形成を可能にする条件下でインキュベートする；
（ｄ）上記炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも一回ｐＨを決定する；
ここで、上記サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定は、工程（ｄ）で決定されたｐＨと１つまたはそれより多くの参照値とを比較することによって実行される。この参照値またはこれらの複数の参照値を、対応するう食原性細菌の既知濃度を使用することによって前もって決定した。
【０００９】
上記方法は、細菌の半定量的な測定に関し、この細菌は、その酸の形成によって、う食の発生に寄与する（う食原性細菌）。したがって、唾液またはプラーク中のこれらの細菌の定量化または半定量化（ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、う食を発生するリスクに関する報告を容易にする。この方法は、細菌による実質的に選択的な酸の形成に基づき、この酸の形成は、う食の発生および／または進行と相関する。対照的に、口の微生物叢の一部でもあるが、う食の発生または進行にほんのわずかしか影響を及ぼさないかまたは何の影響も及ぼさない他の細菌は、可能な限り酸の形成から排除すべきである。本発明の方法を使用して、その酸の形成に基づいて半定量的に検出されるべきである、特に好ましいう食原性細菌は、ミュータンス連鎖球菌および／または乳酸杆菌属である。これらの群の生物の各々について、本質的に選択的な酸の形成を促進する条件が、本明細書に開示される。
【００１０】
本発明の方法は、個体からのプラークサンプルまたは唾液サンプルを使用し、ここで、口腔内のそれぞれの細菌の数が半定量的に決定される。習慣的に、この個体はヒトであるが、獣医学の分野におけるこの方法の使用は排除されない。この方法は、任意の所望の年齢のヒトに対して実行され得る。しかしながら、本発明の特定の局面において、このヒト個体が小児、好ましくは、３歳未満、４歳未満、５歳未満、６歳未満または７歳未満の小児であることが好ましい。この年齢において、口腔衛生の確立は、この様式で有効にう食を予防するために、小児への各々のリスクに特につりあい得る。
【００１１】
唾液サンプルは、従来の方法を使用して取得され得る。習慣的に、この唾液サンプルの容積は、０．５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌまたは１５ｍｌである。好ましい実施形態において、この唾液サンプルは、０．５ｍｌ〜５ｍｌの容積を有するサンプルであり、これは、本発明にしたがう方法において希釈されずに使用される。さらに好ましい実施形態において、この唾液サンプルは、濃縮されたサンプルである、すなわち、例えば、細菌細胞のような唾液中に存在する固体は、濾過、遠心分離などの方法によって唾液の液体成分から分離され、より少ない容積の液体（例えば、バッファー）に移されている。
【００１２】
唾液を取得するための複数の方法およびデバイスが先行技術から公知である。単純な実施形態において、ドナーは、口腔から唾液をしたたらせ、ここで、この唾液は、適切なサンプル容器に収集される。これに対して代替的に、唾液はまた、アスピレーターを使用する吸引によって口腔から抽出され得る。比較的大容積の唾液が、本発明にしたがう方法を実行するために望ましい場合、唾液の形成を、好ましくは咀嚼する動作によって、力学的に刺激することができる。例えば、咀嚼される際に唾液の形成を促進するパラフィンペレットを、ドナーに投与し得る。唾液は、約０．５分〜約５分後に、例えば、２分後、３分後、４分後、または５分後に収集され得る。
【００１３】
ドナーから取得した唾液は、また、必要とされる場合、本発明の方法において希釈して使用され得る。例えば、唾液の過剰な粘度に起因して、濾過による濃縮が不可能であるか、またはそれが長すぎる時間を必要とする場合、唾液サンプルの希釈が必要とされ得る。希釈が所定の条件下で推奨される場合、微生物学の分野において慣習的である水（例えば、滅菌水）またはバッファーが使用され得、これらは、う食原性細菌の続いての発酵を有意には損ねない。適切なバッファーは、例えば、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファーまたはリン酸バッファーである。
【００１４】
さらに、本発明にしたがう方法はまた、試験下のドナーからのプラークサンプルを使用して実行され得る。この目的のために、フィルム（ｆｉｌｍ）が、剥離によって滅菌ブラシまたはへらを使用して歯の表面から取得され、これを適切なサンプル容器に移す。次に、プラークサンプルは、水または適切なバッファー（例えば、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファーまたはリン酸バッファー）に溶解され得る。次に、生じた細菌の懸濁物を、本発明にしたがう方法に直接使用し得る。
【００１５】
検出されるべきう食原性細菌に依存して、本発明にしたがう方法の最初の工程において、微生物に炭素源を添加する前に、プラークサンプルまたは唾液サンプル中に存在する微生物を最初に濃縮することが必要または好都合であり得る。このような濃縮は、例えば、ドナーから取得したプラークサンプルまたは唾液サンプルを遠心分離すること、続いて、より少ない容積の水またはバッファー（例えば、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファーまたはリン酸バッファー）中で、サンプル中に存在する固体を再懸濁することによって、達成され得る。この様式において、数ｍｌの唾液が、５００μｌまたはそれ未満の容積のバッファーまたは水に溶解され得る。上記を実行することにおいて、４００μｌ未満、３００μｌ未満、２００μｌ未満、１００μｌ未満、５０μｌ未満、２５μｌ未満、２０μｌ未満、１５μｌ未満、１０μｌ未満、５μｌ未満または１μｌ未満の容積が使用され得る。遠心分離後に取得された固体はまた、上清の一部に直接再懸濁され得る。
【００１６】
さらに、本発明にしたがって取得されたプラークサンプルまたは唾液サンプルはまた、濾過によって濃縮され得る。このプロセスにおいて、微生物学上の実施において公知であるフィルター（例えば、溶液の滅菌濾過に使用されるメンブレン）が使用され得る。これらのフィルターは、唾液サンプルから浸透液への細菌の通過を妨害するのに十分小さな孔径を有する。唾液中の連鎖球菌属が一般的にバイオフィルムの形態で増殖し、その結果、それらが細胞外多糖類のマトリクス内に存在することが注記されるべきである。この理由のために、連鎖球菌属はまた、約１５μｍまたはそれより大きな孔径を有するフィルターを使用して唾液から効率的に濾過して分けることができる。乳酸杆菌属に適切なフィルターは、好ましくは、２μｍ未満、１μｍ未満、０．５μｍ未満、０．３μｍ未満、例えば、０．２５μｍ未満の孔径を有する。本発明にしたがった特に好ましい実施形態において、唾液サンプルを濃縮するのに使用するためのフィルターは、０．２μｍ〜０．２２μｍの範囲の孔径を有する。そのように小さな孔径を有するフィルターは、濾過の間に圧力の適用を必要とする。この濾過が、吸収性マット（以下を参照のこと）上に配置されたフィルター材料を使用して実行される場合、またはこの濾過が重力によってのみ媒介される場合、対応してより大きな孔容積（ｐｏｒｅ ｖｏｌｕｍｅ）が選択されなければならない。適切な孔径は、１μｍ〜１０μｍ、好ましくは、２μｍ〜８μｍの範囲である。
【００１７】
本発明の状況における濾過のために、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルサルフォン（ＰＥＳ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）のようなポリマー材料から習慣的に構成されたフィルターが使用される。ナイロン、セルロース、ニトロセルロース、またはガラスファイバーもしくは石英ファイバーから作製されたフィルターもまた、液体から細菌細胞を分離することにおいて頻繁に使用される。適切なフィルターは、種々の製造者（例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｗｈａｔｍａｎ（Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、ＵＫ）またはＰａｌｌ ＧｍｂＨ（Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ））から取得可能である。特に好ましいフィルター材料は、Ｗｈａｔｍａｎからのガラスファイバーフィルター材料９３４−ＡＨである。
【００１８】
本発明の一実施形態において、上記濾過は、多層フィルター、好ましくは二重層フィルターを使用して実行される。それによって、種々のフィルターメンブレン（それらの各々は、この多層フィルターの一層を形成する）は、同一の孔径を有しても異なる孔径を有してもよい。好ましくは、種々の層は、それらの孔径に関して異なり、ここで、唾液サンプルと最初に接触するフィルターの層は、その下に配置されるフィルター層よりも大きな孔径を有する。フィルターメンブレンのこのような配置によって、前濾過（ｐｒｅｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）が達成され得る。例えば、二重層フィルターにおいて、例えば、０．４μｍ〜２０μｍの孔径を有する最初のメンブレンが提供され得、その下に、０．２μｍの孔径を有するさらなるメンブレンが配置される。必要とされる場合、これらのメンブレンの表面は、例えば、このメンブレンの親水性特性を改変するために、化学的に改変される。
【００１９】
上記濾過は、例えば、シリンジを使用して実行され得る。上記を実行することにおいて、適切なフィルターを備えるアタッチメントを使用し得、ここで、わずかな圧力をかけて、希釈されたまたは希釈されていない唾液サンプルが、フィルター材料を通過する。さらなる単純な実施形態において、吸収性マットが、このフィルターの下に配置され、このマットは、このフィルターと接触する。希釈されたまたは希釈されていない唾液サンプルがこのフィルター上に滴下された場合、例えば、細菌細胞のような、このサンプル中に含まれる固体は、このフィルター材料上に蓄積する一方、このサンプルの水性成分は、この吸収性マットを通過する。使用される吸収性マットは、特に、例えば、ＢＡＳＦから取得可能なＬＵＱＵＡＳＯＲＢポリマーのような高吸収性材料から作製され得る。例えば、ＢＡＳＦからのＬＵＱＵＡＦＬＥＥＣＥのように既にフリース形態にある高吸収性材料は特に適している。滴下によるサンプルの添加を容易にするために、プラスチックまたはパースペクスから製造されるテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を使用することができ、プラークサンプルまたは唾液サンプルの標的化した滴下を促進する。濾過を実行した後に、このフィルター材料を、続く工程のために、この吸収性マットから分離し得る。
【００２０】
上記フィルター材料上に残留する微生物（特に、う食原性細菌）を、このフィルター材料からすすぎ得、その後、ある容積の適切な液体（例えば、水、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、リン酸バッファー）を使用して炭素源とインキュベートする。上記を実行することにおいて、メンブレンから剥離させるために使用される容積は、唾液サンプルの最初の容積よりも少ない。続いて炭素源とのインキュベーションのために使用される細菌の懸濁物の容積は、その後の酸試験（ａｃｉｄ ｔｅｓｔ）（以下を参照のこと）のそれぞれの様式に本質的に左右される。例えば、炭素源とのインキュベーションおよび／または酸の形成の検出を、チューブまたはキュベット（例えば、ガラス製またはプラスチック製）内で実行する場合、この細菌の懸濁物の容積は、数ｍｌであり得る。炭素源とのインキュベーションおよび／または酸の形成の検出を、フィルターまたはメンブレン（例えば、本明細書の以下に記載される試験ストリップのうちの１つ）上で実行する場合、この細菌の懸濁物の容積は、一般的に０．５μｌ〜２０００μｌの範囲、例えば、約５μｌ、約１０μｌ、約２０μｌ、約５０μｌ、約６０μｌ、約７０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、約１００μｌ、約１５０μｌ、約２００μｌ、約２５０μｌ、約３００μｌ、約３５０μｌ、約４００μｌ、約４５０μｌまたは約５００μｌである。
【００２１】
本発明の特に好ましい実施形態において、上記微生物（特に、う食原性細菌）は、上記フィルター材料から除去されないが、濃縮に使用されたこのフィルター材料に残留し、その上で炭素源および／または対応する試験試薬（例えば、ｐＨ指示薬など）と直接接触させられる。この場合において酸の形成は、例えば、このフィルター材料上のｐＨ呈色指示薬（ｐＨ ｃｏｌｏｕｒ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）の変化に直接基づいて、炭素源および試験試薬の添加後に検出され得る。このフィルターの吸収能力は一般的に制限されるので、使用されるフィルターに依存して、炭素源および試験試薬は、このフィルターに小さな容積、好ましくは、約５μｌ、約１０μｌ、約２０μｌ、約５０μｌ、約６０μｌ、約７０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、約１００μｌ、約１５０μｌ、約２００μｌ、約２５０μｌ、約３００μｌ、約３５０μｌ、約４００μｌ、約４５０μｌまたは約５００μｌの容積で添加される。単位フィルター面積あたりの容積が、フィルター材料１ｍｍ２あたり約０．１μｌ〜約１５μｌ、好ましくはフィルター材料１ｍｍ２あたり０．５μｌ〜１０μｌの範囲であることが特に好ましい。この試験試薬の濃度は、各々添加される容積に関して調整される。
【００２２】
例えば、濾過による濃縮は、２０℃〜４０℃の温度で実行され得、これは、一般的に、特に、本発明にしたがう方法が、数時間以内に各々の生物の決定を可能にする迅速な試験として設計される場合（例えば、歯科試験の状況において）、室温（すなわち、約２０℃）で実行される。濃縮されたプラークサンプルまたは唾液サンプルに含まれるう食原性細菌を、それらの酸の形成に関して、続いての工程で調べるので、濃縮と炭素源の添加との間の時間が長すぎることがないことを確実にしなければならない。このことは、濃縮されたサンプルに含まれる細菌が生存可能でかつ代謝的に活性であることを確実にする。濃縮されたう食原性細菌が、酸の形成の続いての検査において数分のうちに使用されることが好ましい。好ましくは、酸の形成の検査は、唾液サンプルの濃縮の後、１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、６０分のうちに進行する。
【００２３】
プラークサンプルまたは唾液サンプルを濃縮することは、本発明にしたがう方法の必須の工程ではない。しかしながら、濃縮された細菌の懸濁物の使用は、評価までのこの方法の総所要時間に対して顕著な効果を与える。濃縮されたサンプルは、既に数時間後、好ましくは、３時間未満、２時間未満、１時間未満、例えば、５０分以内、４０分以内、または３０分以内またはそれより短いうちに、この方法の半定量的な評価を可能にする。特に好ましい実施形態において、この方法は、１時間のうちに唾液サンプル中のう食原性細菌の濃度の半定量的な測定を可能にする、迅速な試験として設計されている。これにより、歯科医の単回の診察の状況において、既にこのような測定が可能となる。
【００２４】
上記方法の次の工程において、希釈されたまたは希釈されていないプラークサンプルまたは唾液サンプルに含まれる微生物あるいは濃縮によって生成された細菌の懸濁物に含まれる微生物を、炭素源と接触させる。この炭素源は、定量化されるべきう食原性細菌によって酸に発酵され得る。本発明の方法は、検出されるべきう食原性細菌のみが本質的に酸を形成することができる条件を確立することに基づく。したがって、定量化されるべきう食原性細菌によって排他的に利用され得るか、または口の微生物叢の他の微生物よりも、これらの細菌によってより迅速に酸に発酵され得る炭素源を選択することが特に好ましい。本発明にしたがう方法が、例えば、１〜２時間のうちに実行されることが意図される場合、定量化されるべきう食原性細菌が、約１時間以内に既に検出可能な酸の形成を示している一方で、唾液サンプルに存在する他の細菌における酸の形成が、３時間またはそれより遅くまで開始しない、すなわち、その時点で、この方法は既に完了している場合、この方法は十分であることが証明され得る。
【００２５】
本発明の状況において、う食原性細菌による酸の形成に極めて有利な条件下において、ｐＨ低下の速度、すなわち、単位時間あたりのｐＨの低下は、唾液サンプル中のそれぞれのう食原性細菌の濃度と相関することが観察されている。したがって、これらの条件下において、炭素源の添加後の種々の時点において、ｐＨを測定することは、元のプラークサンプルまたは唾液サンプル中のリスクに関連するう食原性細菌の数についての情報を与える（実施例を参照のこと）。
【００２６】
本発明にしたがう方法に基づいてリスク評価に特に適したう食原性細菌は、いわゆる「ミュータンス連鎖球菌」の群を含み、次に、この群は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ種、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ種、Ｓ．ｒａｔｔｕｓ種およびＳ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ種を含む。これらの連鎖球菌属は、きれいにした歯の表面に新規に集落形成する最初の微生物のうちの１つである。さらに、これらは、食物残渣および唾液の成分に由来するポリマー性のスライムを形成することができ、このスライムで、これらは、歯の表面に付着する。これらの連鎖球菌属によって形成されたバイオフィルムはまたプラークと呼ばれる。これは、多糖類および糖タンパク質のマトリクスにおいて生きている微生物および死んだ微生物の構造化されたフィルムである。プラークは、咀嚼面の陥凹部、歯の間の領域、および歯肉の縁に特に容易に蓄積する。このバイオフィルムはまた、他の細菌が歯の表面に定着するようになることを可能にする。
【００２７】
唾液サンプル中のミュータンス連鎖球菌の数は、特定の様式において、う食のリスクについての情報を取得するために適切である。本発明の一実施形態において、選択された炭素源は、ミュータンス連鎖球菌の上述した種のうちの複数またはそれらの全てによって利用され得るが、唾液サンプル中に存在する他の細菌は、この炭素源を利用することができないか、または顕著に遅延してそれを利用することしかできない。このような炭素源の特に好ましい例は、グルコース、スクロース、マルトースおよびマルトトリオース（または、これらの混合物）であり、これらは、全てのミュータンス連鎖球菌によって迅速に代謝される。これらの糖はまた、唾液中の他の微生物によって変換されるが、これらは、顕著により遅く変換される（図１を参照のこと）。代替的な実施形態において、この炭素源は、本発明にしたがう方法が実行される規定の時間枠内で、ミュータンス連鎖球菌の群のうちの単一のメンバー（例えば、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）によってのみ利用される。例えば、スクロースを、反応バッチ中、２０％の濃度で炭素源として使用する場合、酸の形成は、１５分以内にＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓでのみ検出され得ることが、図１の表１から理解することができる。本発明にしたがう方法を、この炭素源を使用して実行する場合、この方法が、約１５分〜約２０分後に（すなわち、依然として、スクロースが、他のう食原性細菌または非う食原性細菌によって発酵される前に）終わるならば、この種によって唯一生じる酸の形成が検出され得る。
【００２８】
本発明の代替的な実施形態において、定量化されるべきう食原性細菌は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｌ．ｃａｓｅｉ種、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ種、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ種、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ種およびＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種を含む乳酸杆菌属の群である。乳酸杆菌属の細菌は、混合した酸の発酵をすることができ、さらに、口内の微生物によって形成される酸の大半の原因である。乳酸杆菌属は、特に、連鎖球菌属によって形成されたバイオフィルムに集落形成することができる。活動性う食の部位において、乳酸杆菌属の株は、常に同定され得る。上述の理由のために、唾液およびプラーク中の乳酸杆菌属の細菌の定量的な検出はまた、現在、予防に指向した実施および研究の中心をなす。乳酸杆菌属による選択的な酸の形成を検出するために使用され得る炭素源は、例えば、グルコース、ラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびマンノース（または、これらの混合物）を含む。
【００２９】
上記炭素源は、反応バッチ（唾液サンプルの微生物、炭素源およびさらなる必要に応じた成分から構成される）に、０．０５重量％〜６０重量％の量、例えば、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれより多くの量で添加され得る。例えば、試験溶液中のスクロース濃度を増加させることによって、特定のミュータンス連鎖球菌に対する特異性を改善することができることが、例えば見出されている。
【００３０】
プラークサンプルまたは唾液サンプルのう食原性細菌と、選択された炭素源との間の接触を、複数の方法でなすことができる。例えば、この炭素源を、例えば、水または生理学的に受容可能なバッファーに溶解させた溶液として提示することができる。この溶液は、規定の容積の希釈された、希釈されていないまたは濃縮された液体プラークサンプルまたは唾液サンプルと混合され得る。さらに、この炭素源はまた、希釈された、希釈されていないまたは濃縮された液体唾液サンプルに溶解される粉末または顆粒の形態で使用され得る。例えば、粉末形態での規定の量の炭素源を含む、例えば、チューブ、マイクロタイタープレートまたはキュベットが提供され得、液体唾液サンプルの添加に際して、う食原性細菌と炭素源との接触が確立される。例えば、マンノースのような適切な炭素源が、種々の提供者から粉末形態で利用可能である。
【００３１】
好ましい実施形態において、炭素源とのインキュベーション、および続いてのｐＨの決定も、液体反応バッチ（溶液または懸濁物）で実行される。上記方法で使用される細菌の懸濁物および試験試薬の容積に依存して、ガラスまたはプラスチックのチューブまたはキュベット（例えば、５ｍｌ〜１０ｍｌの容積を有するもの）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ反応チューブ（１ｍｌ〜２ｍｌの容積を有する）またはマイクロタイタープレートを使用し得る。
【００３２】
さらに好ましい実施形態において、上記炭素源および／または上記試験試薬は、フィルター材料（例えば、試験ストリップの表面）上で乾燥形態で固定化され得る。この場合に使用され得る試験ストリップは、濃縮に関連して上述されたフィルター材料（すなわち、フィルターであって、その孔径が、このフィルター材料に添加されたう食原性細菌の、浸透液への移動を妨害する、フィルター）である。希釈された、希釈されていないまたは濃縮された液体唾液サンプルを、このフィルター材料に滴下して加え、そこで、この固定化された炭素源を溶解し、それによってこのう食原性細菌に容易に接近されるようにする。炭素源の利用および生じた酸の形成は、例えば、ｐＨ呈色指示薬を使用することによって、このフィルター材料上で直接検出され得る。本発明の特に好ましい実施形態において、この炭素源は、マルトース、マルトトリオース、および／またはスクロースであり、試験ストリップ上に固定化されて存在する。このような試験ストリップは、ミュータンス連鎖球菌による酸の形成を決定するために使用され得る。代替的な実施形態において、この炭素源は、ラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはマンノースであり、試験ストリップ上に固定化されて存在する。このような試験ストリップは、乳酸杆菌属による酸の形成を決定するために使用され得る。
【００３３】
さらなる特に好ましい実施形態において、上記炭素源および／または上記試験試薬が乾燥形態で固定化される材料は、上記唾液サンプルを濃縮する目的のためにこの唾液サンプルを濾過するのに以前に使用された材料と同じ材料である。このことは、上記フィルター材料が、唾液サンプルを濾過することによってこの唾液からう食原性細菌を富化するために最初に使用されることを意味する。しかしながら、このような実施形態において、濾過において、固定化された炭素源および／または試験試薬は、このフィルター材料から剥離しないか、またはわずかな程度しか剥離しないことを確実にしなければならない。なぜなら、さもなければ、それらは、フィルターを通過して浸透液に入り、そして結果的にその後のフィルター上での酸反応の検出にもはや使用できなくなるからである。プラークサンプルまたは唾液サンプルの濃縮が完了した後でのみ、酸の形成がこのフィルター材料上で生じ得るように、フィルター上の炭素源および／または試験試薬の放出が起こるべきである。このことは、例えば、固定化された試薬の溶液への時間的に遅延した移動を確実にする手段によって達成され得る。したがって、乾燥形態の炭素源および／または試験試薬（例えば、呈色指示薬）をフィルター材料に塗布し、遅延した放出を引き起こすラッカーでコーティングすることが有利であることが実証されている。
【００３４】
この場合において、一方で、う食原性細菌による酸の形成のために十分な炭素源および／または試験試薬が存在するが、他方で、フィルターが詰まらないように、定量的な比を選択しなければならない。患者の唾液サンプルの濾過による細菌の富化を促進するために、炭素源の代謝の前に十分な時間が残っているように、フィルター上の炭素源および／または試験試薬の放出は、１分〜２分後でのみ生じなければならない。本発明にしたがう試験ストリップの最適な設計において、この炭素源および／または試験試薬は、唾液サンプルの添加から、約３分〜約１０分後、好ましくは、約５分〜約８分後でのみ放出される。したがって、例えば、１ｍｇ〜１０ｍｇの粉末化した試験試薬を、適切なテンプレートによってフィルターに塗布し得、１０μｌ〜５０μｌ、好ましくは２０μｌの、例えば、１重量％のヒドロキシプロピルセルロースのようなラッカーを使用してこのフィルターに固定し得る。これらのフィルターは、乾燥キャビネット内で乾燥させ得、使用するまで室温で乾燥状態で保存され得る。
【００３５】
固定に適切な他のラッカーは、例えば、キサンタン、キトサン、カラゲーナンのような多糖類；例えば、ＫｕｒａｒａｙからのＰｏｖａｌのようなポリビニルアルコール；例えば、ＢＡＳＦからのＫｏｌｌｉｃｏａｔ ＩＲのようなポリビニルアルコール−ＰＥＧコポリマー；例えば、ＩＳＰからのＰｌａｓｄｏｎｅのようなポリビニルピロリドン；例えば、ＢＡＳＦからのＬｕｖｉｓｋｏｌ ＶＡのようなビニルピロリドン−酢酸ビニルコポリマー；例えば、ＩＳＰからのＧａｎｔｒｅｚのような、ポリ（メチルビニルエーテル）マレイン酸無水物のアルキルエステルまたはマレイン酸コポリマー；例えば、ＢＡＳＦからのＬｕｖｉｓｋｏｌ Ｐｌｕｓのようなポリビニルカプロラクタム；例えば、ＥｖｏｎｉｋからのＥｕｄｒａｇｉｔまたはＢＡＳＦからのＬｕｖｉｍｅｒ １００Ｐのようなアクリラートコポリマー；例えば、ＢＡＳＦからのＬｕｖｉｓｅｔまたはＷａｃｋｅｒからのＶｉｎｎａｐａｓのようなポリ（酢酸ビニル−ｃｏ−クロトン酸）；例えば、ＩＳＰからのＡｄｖａｎｔａｇｅまたはＡｑｕａｆｌｅｘのようなビニルカプロラクタム−ビニルピロリドン−ジメチルアミノアルキルメタクリラートコポリマー；および第４級アンモニウム化合物を有するポリマーを含む。上記試薬を試験ストリップに固定するのに適切な他のポリマーは、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチル−セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびメチル−ヒドロキシエチルセルロースのようなセルロースエーテルを含む。さらに、上記化合物の任意の組み合わせが使用され得る。
【００３６】
上記唾液サンプルに含まれる微生物を、選択された炭素源と接触させた後、これらを、う食原性細菌による本質的に選択的な酸の形成を可能にする条件下で、この炭素源とともにインキュベートする。これに関連して、温度、ｐＨおよび容量オスモル濃度について、う食原性細菌による炭素源の特に迅速な代謝が生じ得る、この細菌に適切な条件が選択される。バッファーが使用される場合、バッファーが、６．５と９との間のｐＨ、好ましくは６．５と８．５との間のｐＨ（７．０と８．５との間のｐＨが特に好ましい（例えば、７．５））を提供するような様式で、これらが選択され得る。この酸の形成がｐＨ呈色指示薬の存在下で進行する場合、酸の形成が開始したとき、指示薬の色の完全な変化を確実にするように、インキュベーションの開始時に、溶液のｐＨが、指示薬のｐＫａよりも上になるような様式で、適切なバッファーを使用することによってｐＨを設定しなければならない。したがって、指示薬であるフェノールレッドが存在する溶液のｐＨは約８．５の領域にある。なぜなら、このｐＨよりも下で、約５．０のｐＨまでの色の変化が検出可能であるからである（表２を参照のこと）。
【００３７】
上記炭素源との上記微生物のインキュベーションの温度は、一般的に、２０℃と６０℃との間、好ましくは２５℃と５０℃との間、より好ましくは３０℃と４５℃との間であり得る。酸の形成は、一般的に、３５℃と４５℃との間の温度で最も迅速に進行する。
【００３８】
本発明にしたがって、上記炭素源および／または上記試験試薬が、１ｍＭと１０ｍＭとの間のホスフェート濃度を有することが特に好ましく、ここで、高い試験感度が所望されるとき、５ｍＭが特に好ましい。使用されるバッファーの濃度に基づいて、唾液中の比較的高い濃度のう食原性細菌を区別し得るために、試験感度はまた低減され得る。感度を段階分けするために、リン酸バッファーの濃度は、例えば、＞１０ｍＭ、＞２０ｍＭ、＞３０ｍＭ、＞４０ｍＭ、またはさらには＞５０ｍＭに増大することができる。緩衝化のために、例えば、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、トリスなどの他のバッファーも使用され得る。感度を設定するためのさらなる可能性は、適切な量のわずかに塩基性の塩またはポリマーを添加することである。
【００３９】
う食原性細菌（特に、ミュータンス連鎖球菌）に有利な増大した選択性は、アミノ酸および／またはアミノ酸含有ポリマーの添加によって達成され得る。口腔内の多くの酸産生細菌が、アミノ酸のアミノ基を酵素的に切断することができる。それによって、塩基性アミノ基の遊離は、これらの細菌によって産生された酸の部分的な中和または完全な中和をもたらす。他方、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのようなミュータンス連鎖球菌は、顕著な程度まで、アミノ酸からアミノ基を遊離させることができない。なぜなら、これらの生物は、通常、必要とされる酵素を欠くからである。例えば、Ｓ．ｍｕｔａｎｓもＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓもアルギニンデイミナーゼをもたない。したがって、アルギニンの添加は、ミュータンス連鎖球菌ではない細菌（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓ．ｅｑｕｉｎｕｓ、Ｓ．ｍｉｔｉｓ、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓなど）による酸の生成を中和するのに特に適している。
【００４０】
う食原性細菌の半定量的な測定のための上記に示された方法は、以下の点で改変される：アルギニンのようなアミノ酸および／またはアミノ酸含有ポリマーの存在下で、上記微生物が炭素源とともにインキュベートされ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの酸の産生が影響を受けない一方で、口腔の他の細菌による酸の産生が塩基性アミノ基の遊離によって抑制される。
【００４１】
本発明の方法の特に好ましい実施形態において、工程（ｂ）および／または工程（ｃ）は、それゆえ、１つもしくはそれより多くのアミノ酸（複数含む）および／または１つもしくはそれより多くのアミノ酸含有ポリマー（複数含む）の存在下で進行する。好ましくは、このアミノ酸は、反応バッチに遊離アミノ酸として添加される。非ミュータンス連鎖球菌の酸の産生を抑制する、特に好ましい遊離アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびセリンを含む。遊離アミノ酸としてのアルギニンの使用は、特に好ましい。あるいは、１つもしくはそれより多くのアミノ酸含有ポリマー（複数含む）もまた、反応バッチに添加され得る。アミノ酸含有ポリマーは、短いペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチド（例えば、＞１０、＞２０、＞３０、＞４０、＞５０またはそれより多いアミノ酸長を有する）を含む。遊離アミノ酸とアミノ酸含有ポリマーとの混合物も使用され得る。非ミュータンス連鎖球菌における酸の形成の有効な抑制を提供する、遊離アミノ酸およびアミノ酸含有ポリマーの適切な混合物は、例えば、ペプトンである。
【００４２】
さらなる好ましい実施形態において、上記に示された方法において、グルコースを炭素源として使用し、工程（ｂ）および／または工程（ｃ）は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸の存在下で実行され、ここで、アルギニンの添加は、特に好ましい。
【００４３】
上記に示された方法において、上記アミノ酸は、工程（ｂ）または工程（ｃ）で添加され得る。このアミノ酸は、反応バッチ（唾液サンプル、炭素源およびさらなる必要に応じた成分から構成される）に、０．０１重量％〜５重量％の量、例えば、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％またはそれより多い量で添加され得る。０．１重量％〜０．２重量％の量が特に好ましい。アミノ酸含有ポリマーを使用する場合、当業者は、上記の情報に基づいてそれぞれのポリマーの適切な量を容易に決定し得る。
【００４４】
う食原性細菌に有利な改善された選択性はまた、尿素の添加によって達成され得る。尿素の添加は、特に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる酸の形成の抑制を提供する。上記に記載された方法において、工程（ｂ）または工程（ｃ）はまた、それゆえ、尿素の存在下で進行することができる。特に好ましい実施形態において、上記に示された方法においてスクロースを炭素源として使用し、工程（ｂ）または工程（ｃ）は、尿素の存在下で進行する。
【００４５】
選択的な酸の形成のさらなる改善は、本発明にしたがう方法の状況において定量化されない細菌の増殖および／または代謝活動を阻害および／または停止することができる抗生物質を添加することによって達成され得、対照的に、ここでは、う食原性細菌の増殖および／または酸の形成は、有意には損なわれない。例えば、例えばバンコマイシン、カナマイシンまたはネオマイシンを上記炭素源および／または上記試験試薬に添加することによって、乳酸杆菌属に対する特に高い特異性が達成され得る。なぜなら、これらは、それらの増殖または代謝活動に関して、この抗生物質によってわずかしか阻害されない一方で、例えば、連鎖球菌属およびブドウ球菌属はかなり阻害されるからである。同様に、バシトラシンおよびメトロニダゾールを使用することによって、ミュータンス連鎖球菌による選択的な酸の形成に特に適した条件を作り出すことができる。適切な抗生物質を、この炭素源および／またはこの試験試薬に、０．０１重量％〜２重量％の量、好ましくは、０．１量％〜１重量％（例えば、０．２重量％）の量で添加し得る。乳酸杆菌属の細菌の増殖および／または代謝活動を阻害する、特に好ましい抗生物質は、例えば、バンコマイシン、クリンダマイシンおよびナイシンである。
【００４６】
表１は、指示薬であるブロモクレゾールパープルの存在下で、１％ グルコースとともにインキュベートされた種々のう食原性細菌および非う食原性細菌による酸の形成の、時間をわたっての進展に対する、抗生物質の添加の影響を示す。試験溶液の正確な組成を、表３に示す。
【００４７】
【表１】
本発明にしたがって選択された炭素源とともに微生物をインキュベートするために選択されるインキュベーション時間は、定量化されるべきう食原性細菌、そしてこの炭素源のタイプおよび濃度にも依存する。このインキュベーション時間は、一般的に、可能な限り最も強力な酸の形成が定量化されるべきう食原性細菌によって達成される一方で、非う食原性細菌による酸の形成が可能な限り排除されるべきであるように選択される。
【００４８】
上記炭素源とのインキュベーション後に、上記う食原性細菌による酸の形成に、この炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも１回、ｐＨを決定することが続く。その中で測定が実行される期間は、炭素源の添加後、最長１２時間まで延長されるが、しかしながら、この期間は、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、またはさらには１時間未満であることが好ましい。その中でｐＨが測定され、したがって、この方法の時間枠を形成する期間が、０．２５時間〜３時間を構成する場合に、この方法の特定の利点が生じる。このことは、歯科検査の状況において、う食原性細菌および関連するう食のリスクを決定することを可能にする。１回より多いｐＨの測定を、この期間内に行うことがさらに好ましい。好ましくは、この期間において、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれより多くの測定を実行する。したがって、例えば、１時間、２時間、３時間または４時間の期間にわたり、５分、１０分または１５分の一定の間隔で、測定を実行することができる。
【００４９】
本発明にしたがう方法を実行することにおいて、酵素カルボン酸アンヒドラーゼのインヒビター（例えば、アセタゾラミド、メタゾラミド、ドルゾラミドおよびトピラメート）の存在は、測定可能な酸の生成の速度に関して改善をもたらす。
【００５０】
最初に、調べられるべき個体から唾液サンプルを採取した後で、二酸化炭素が、このサンプルから遊離する。唾液は、プロトンを吸収することによって二酸化炭素および水と反応する炭酸水素塩を含む。この反応は、酵素カルボン酸アンヒドラーゼによって触媒される。この唾液サンプルのｐＨは、サンプリングの直後に、二酸化炭素の遊離によって、約７．４から約８．０またはそれより高くに上昇する。最初に、適切な炭素源のこのサンプルへの添加、そして酸の形成の開始の際に、反応所要時間を不必要に増大させる初期のｐＨ上昇は、相殺されなければならない。したがって、本発明の方法の工程（ｂ）または工程（ｃ）への、酵素カルボン酸アンヒドラーゼのインヒビター（アセタゾラミド、メタゾラミド、ドルゾラミドおよびトピラメートなど）の添加は、完全な方法の所要時間をかなり減少させ得る。
【００５１】
上記インヒビターは、反応バッチ（唾液サンプルの微生物、炭素源およびさらなる必要に応じた成分から構成される）に、０．０１重量％〜５重量％の量で、例えば、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％またはそれより多い量で添加され得る。０．１重量％の量が特に好ましい。
【００５２】
ｐＨは、ｐＨ電極によって上記の期間内に決定され得る。ｐＨ電極の使用は、プラークサンプルまたは唾液サンプルからの微生物が、水溶液中で炭素源とともにインキュベートされることを必要とする。低下の速度、すなわち、時間単位に関するｐＨにおける低下は、上述の条件下において、サンプル中のう食原性細菌の濃度と相関するので、最初のサンプルにおけるう食原性細菌の定量的な測定または半定量的な測定は、測定されたｐＨと参照値とを比較することによって行うことができ、この参照値は、反応の同じ時点において、かつ同じ条件下で、既知の数のそれぞれのう食原性細菌を有するサンプルに基づいて、事前に取得されている。好ましくは、１回より多くの測定が実行され、１回の測定がなされる時点の各々に関して、少なくとも１つの対応する参照値が利用可能である。例えば、ｐＨの測定は、全部で４時間の期間内で１時間後、２時間後、３時間後および４時間後に実行され得る（実施例を参照のこと）。習慣的に、ｐＨが測定される規定の時点の各々に関して、既知の濃度の対応するう食原性細菌を使用して取得された、複数の参照値が利用可能である。炭素源を測定された濃度のう食原性細菌に添加した後、規定の時点におけるｐＨをそれぞれ反映する、多くの参照値は、未知の濃度のサンプル中のう食原性細菌の、比較的正確な定量的な測定または半定量的な測定を容易にする。例えば、ミュータンス連鎖球菌の測定における参照値は、例えば、１０３ｃｆｕ、１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕおよび１０６ｃｆｕの濃度に対応し得る。
【００５３】
代替的な実施形態において、ｐＨは、酸の形成に際して色が変化するｐＨ指示薬を使用して決定される。このｐＨ指示薬は、好ましくは、例えば、試験ストリップ上でのｐＨ指示薬および炭素源の組み合わせた固定化（ｊｏｉｎｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）によってか、あるいは希釈された、希釈されていないまたは濃縮されたプラークサンプルまたは唾液サンプルへの、ｐＨ指示薬および炭素源の同時の添加（好ましくは、単一の溶液の形態で）によって、炭素源と一緒にう食原性細菌に添加される。種々のｐＨ指示薬が、本発明にしたがう方法を実行するのに有用であることが実証されている。これらは、例えば、指示薬ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、ｍ−クレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッドおよびクロロフェノールレッドを含む。表２は、ｐＨの関数としてのこれらの指示薬の色の変化を示す。色の変化を検出できるようになるまで適用されるべきであるインキュベーション時間は、使用された炭素源および試験試薬、そしてまた、それらの、互いに対する絶対的かつ定量的な比および相対的かつ定量的な比にも依存する。好ましい実施形態において、ｐＨ指示薬の色の変化までの期間は、細菌、炭素源および指示薬を混合した後、６０分未満、４５分未満、３０分未満、２０分未満または１５分未満である。
【００５４】
呈色反応の速度は、とりわけ、反応バッチ中のバッファーの濃度を介して制御され得る。例えば、指示薬フェノールレッドを含む溶液において、リン酸バッファーの濃度を、５ｍＭから５０ｍＭに増大させることによって、呈色反応を約３の因数だけ遅くしたことが見出されている。したがって、バッファーの濃度によって、このう食のリスクの試験の感度を設定することができる。
【００５５】
【表２】
指示薬によって引き起こされた色の変化を、既知の数のそれぞれのう食原性細菌を含むサンプルを使用して、同一の条件下で前もって取得された、色の標準と比較する。この色の標準との比較は、元のサンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定を可能にする。同様に、この色の標準は多段階である、すなわち、それが、ｐＨの測定が実行された規定の時点の各々について、元の唾液サンプル中の規定の濃度のう食原性細菌に割り当てられ得る、複数の色合い（ｓｈａｄｅ）を含むことが特に好ましい。好ましくは、この色の標準は、濃度に関する差が裸眼で（すなわち、技術的なデバイスを使用しないで）認識され得るものである。この標準の個々の段階は、例えば、細菌の濃度の１０を底とする対数であり得、ここで、この濃度は、コロニー形成単位（ｃｆｕ）で測定される。したがって、例えば、この色の標準（これによって、ミュータンス連鎖球菌の濃度が評価され得る）は、１０３ｃｆｕ、１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕおよび１０６ｃｆｕの濃度に対応する４つの段階を含み得る。本発明にしたがった試験法で取得された色の変化は、４つの所定の色の強度と比較され得る。一般的に、調べられたプラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌の濃度についての報告は、それによって取得され得る；例えば、試験の状況において取得された色の強度が、１０４ｃｆｕと１０５ｃｆｕとの間の範囲のミュータンス連鎖球菌の濃度に起因することが報告され得る。これは、う食のリスクが高いことを示す。
【００５６】
さらなる局面において、本発明はまた、上記の方法を実行するための試験ストリップに関し、ここで、この試験ストリップの表面上に、少なくとも１つの炭素源および１つのｐＨ指示薬が、この試験ストリップと細菌の懸濁物とを接触させた際に、これらが、この試験ストリップから放出され、液体の細菌の懸濁物に溶解するような様式で固定化されている。この炭素源は、これが、例えば、ミュータンス連鎖球菌または乳酸杆菌属のようなう食原性細菌によって選択的に酸に発酵されるような様式で、上記のように選択される。このｐＨ指示薬は、酸の形成の際に色が変化し得、ここで、この変化は、裸眼で感知可能であることが好ましい。この試験ストリップが、固定化された形態の、上述された２つの成分のうちの１つを含むことが十分条件である。その他のそれぞれの成分は、例えば、滴下することによって、この試験ストリップに添加され得る。好ましい実施形態において、この炭素源、そしてまたこの指示薬の両方は、この試験ストリップの表面上に固定化される。この炭素源および／またはこのｐＨ指示薬は、ラッカー（上記を参照のこと）によって、この試験ストリップ上に固定化され得る。
【００５７】
上記試験ストリップは、好ましくは、１μｍ〜１０μｍの範囲の孔径を有するフィルター材料をさらに含む（またはこのフィルター材料から構成される）。好ましい孔径は、２μｍ〜８μｍの範囲、例えば、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍまたは８μｍである。上記炭素源および／または上記ｐＨ指示薬は、このフィルター材料上に固定化される。これは、このフィルター材料が、う食原性細菌の富化に直接使用され得るという利点を有する。
【００５８】
本発明はまた、上述された方法を実行するための試験キットに関し、このキットは：
（ａ）う食原性細菌の群によって酸へ発酵される炭素源；
（ｂ）酸の形成の際に色が変化するｐＨ指示薬；
（ｃ）サンプル中のう食原性細菌の濃度の半定量的な測定を容易にする色の標準、
を備える。
【００５９】
好ましくは、上記色の標準は、上記のような多段階の標準であり、参照の働きをする。さらに、上記キットは、上記方法を実行するための指示書を備え得る。もちろん、このキットはまた、１つまたはそれより多い、上述の試験ストリップを備え得る。
【００６０】
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
プラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定のための方法であって、
（ａ）プラークサンプルまたは唾液サンプル中に含まれる微生物を、必要に応じて濃縮する；
（ｂ）該微生物を、該う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源と接触させる；
（ｃ）該微生物と該炭素源とを、該う食原性細菌による選択的な酸の形成を促進する条件下でインキュベートする；
（ｄ）該炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも１回、ｐＨを決定する；
ここで、該サンプル中の該う食原性細菌の該半定量的な測定は、工程（ｄ）において決定されたｐＨと少なくとも１つの参照値とを比較することによって実行される、方法。
（項目２）
上記ｐＨが、ｐＨ電極を使用して工程（ｄ）で決定される、上記項目に記載の方法。
（項目３）
上記ｐＨが、酸の形成の際にその色が変化するｐＨ指示薬を使用して工程（ｄ）で決定される、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目４）
上記ｐＨ指示薬が、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、ｍ−クレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッドおよびクロロフェノールレッドからなる群より選択される、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目５）
工程（ｃ）が、上記う食原性細菌の増殖および／または酸の形成を有意には損ねない１つまたはそれより多くの抗生物質の存在下で進行する、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目６）
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）が、１つもしくはそれより多くのアミノ酸および／または１つもしくはそれより多くのアミノ酸含有ポリマーの存在下で進行する、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目７）
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）が、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびセリンからなる群より選択される１つもしくはそれより多くのアミノ酸の存在下で進行する、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目８）
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）が、アルギニンの存在下で進行する、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目９）
上記う食原性細菌がミュータンス連鎖球菌である、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１０）
上記ミュータンス連鎖球菌によって酸へ発酵される上記炭素源が、スクロース、マルトースおよびマルトトリオースからなる群より選択される、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１１）
上記う食原性細菌が乳酸杆菌属である、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１２）
工程（ｃ）が、バンコマイシン、クリンダマイシンおよびナイシンからなる群より選択される１つもしくはそれより多くの抗生物質の存在下で進行する、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１３）
上記乳酸杆菌属によって酸へ発酵される上記炭素源が、マンノース、ラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１４）
上記項目のいずれか１つに記載の方法を実行するための試験ストリップであって、ここで、
う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源、および酸の形成の際に色が変化するｐＨ指示薬が、該試験ストリップと細菌の懸濁物とが接触した際に、該炭素源と該ｐＨ指示薬とが該試験ストリップから放出されるような様式で、該試験ストリップの表面上に固定化されている、試験ストリップ。
（項目１５）
上記試験ストリップが、２０μｍ未満の孔径を有するフィルター材料を備え、該フィルター材料上に、上記炭素源および上記ｐＨ指示薬が固定化される、上記項目のいずれか１つに記載の試験ストリップ。
（項目１６）
上記炭素源および／または上記ｐＨ指示薬が、ポリマーラッカーによって上記試験ストリップ上に固定化されている、上記項目のいずれか１つに記載の試験ストリップ。
（項目１７）
上記項目のいずれか１つに記載の方法を実行するための試験キットであって、該試験キットは：
（ａ）う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源；
（ｂ）酸の形成の際に色が変化するｐＨ指示薬；
（ｃ）サンプル中の該う食原性細菌の濃度の半定量的な測定を可能にする色の標準
を備える、試験キット。
（項目１８）
上記色の標準が多段階の標準である、上記項目のいずれか１つに記載の試験キット。
（項目１９）
上記キットは、上記項目のいずれか１つに記載の少なくとも１つの試験ストリップを備える、上記項目のいずれか１つに記載の試験キット。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、純粋な培養物による酸の形成の速度論を示す。文字Ａ〜Ｇは、酸の産生が、ｐＨ指示薬に基づいて最初に検出された時点を示す。数字０〜５は、１時間、２時間および４時間後の、ｐＨの低下の段階を示す。したがって、次のコードを適用する：＜色の変化の時点＞＜１時間後の色の段階＞＜２時間後の色の段階＞＜４時間後の色の段階＞。
【図２】図２は、ＣＲＴバクテリアの結果とミュータンス連鎖球菌について４時間後の試験溶液Ｎｏ．１３６を使用した本発明にしたがう方法の結果との相関を示す。＞１０５ｃｆｕ／ｍｌのリスク閾値が、約６．５未満へのｐＨの低下に相当することが見られ得る。
【図３】図３は、ＣＲＴバクテリアの結果と乳酸杆菌属について４時間後の試験溶液Ｎｏ．９８を使用した本発明にしたがう方法の結果との相関を示す。＞１０５ｃｆｕ／ｍｌのリスク閾値が、約６．０未満へのｐＨの低下に相当することが見られ得る。
【図４】図４は、ＣＲＴバクテリアの結果と、乳酸杆菌属（Ａ、Ｂ）およびミュータンス連鎖球菌（Ｃ、Ｄ）について３時間後の、小児（Ａ、Ｃ、Ｅ）および成人（Ｂ、Ｃ）における、試験溶液ｎｏ．９８（Ａ、Ｂ）、試験溶液ｎｏ．１３６（Ｃ、Ｄ）または試験溶液ｎｏ．３２３（Ｅ）を使用した本発明にしたがう方法の結果との相関を示す。Ｙ−軸上の数字０〜５は、ｐＨ低下のレベルを示す（図１と比較する）。ｐＨ低下のレベルが、ＣＲＴバクテリアの値（Ｘ−軸）が上昇するとともに上昇することが明らかである。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
実施例
細菌株
この実験のために選択された株の保存培養物を、−８０℃の温度でＣＲＹＯＢＡＮＫ（Ｍａｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，ＣＲＹＯ／Ｍ）セラミック支持体で保存した。培養のために、セラミックリングを、１０ｍｌの栄養培地に入れ、１４時間〜７２時間インキュベートした。この培養物を、継代０（Ｐ０）と指定した。次に、１００μｌの培養物を、１０ｍｌの新鮮な培地に接種し、２４時間インキュベートした。継代２の培養物を、酸の産生についての続いての実験のために使用した。この場合において、この培養物を、６５０ｎｍでの吸収が約０．６〜１．０になるまで希釈した。この細菌の懸濁物を、８０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。培養上清を除去し、ペレットを、同じ容積の水（１０ｍｌ、脱イオンした、滅菌）に再懸濁した。サンプルを、再度遠心分離し（８０００ｒｐｍ、５分間）、上清を除去した。続いて、ペレットを、１ｍｌ（これは、元の容積の１／１０に相当する）の脱イオン水に再懸濁した。
【００６３】
インビトロにおける酸の産生
酸の産生を測定するために、４０μｌの細菌の懸濁物を、９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートまたは１．５ｍｌ 微小遠心分離チューブ内の１００μｌの試験溶液に添加した。この試験溶液は、適切なｐＨ指示薬（例えば、フェノールレッドおよびブロモクレゾールパープル）の他に、発酵可能な炭素源、５ｍＭのホスフェートまたは５ ｍＭのトリス−ＨＣｌ、および必要に応じて抗生物質またはアルギニンのようなアミノ酸を含んだ。使用した試験溶液を、規定の開始ｐＨに調整した。試験溶液の作製において、成分を、所望の最終容積の７５％の容積の脱イオン水に溶解させた。次に、適切なｐＨに調整し、この混合物を、脱イオン水を使用して計算された容積まで満たした。作製された溶液を冷蔵庫で保存し、２週間以内に使用した。
【００６４】
上記細菌の懸濁物をそれぞれの試験溶液に添加した後、ｐＨ指示薬の色の変化を、一定の間隔で、参照サンプル（試験溶液のみ）に対して視覚的に評価した。それらの間、サンプルを、３７℃のインキュベーターに保存した。酸の形成を、試験溶液の色の変化によって視覚的に（光学測定デバイスによる補助を受けずに）記載した。この研究の結果を、図１に示す表に列挙する。
【００６５】
本発明の状況下で使用された試験溶液の組成を、以下の表３に記載する。
【００６６】
【表３−１】
【００６７】
【表３−２】
さらに、アミノ酸または尿素の添加が、指示薬フェノールレッドの色が完全に黄色に変わる期間に及ぼす影響を上記のように試験した（以下の表４を参照のこと）。
【００６８】
【表４−１】
唾液サンプルを使用した臨床調査
本発明の方法にしたがう、唾液サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定が、証明されたう食リスク試験ＣＲＴ（登録商標）バクテリアの結果と相関するか否かを調査するために、およそ８０個の唾液サンプルを、ＣＲＴ（登録商標）バクテリア試験、ならびに本発明の試験溶液１３６および試験溶液９８（表３を参照のこと）を使用して、並行して研究した。
【００６９】
被験者を指示して、パラフィンペレット（ＣＲＴ、Ｉｖｏｃｌａｒ Ｖｉｖａｄｅｎｔ ＡＧ、Ｓｃｈａａｎ、Ｌｉｅｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ）を３０秒間、咀嚼し、そして刺激された唾液を吐き出させた。次に、この被験者に、このパラフィンペレットをさらに５分間咀嚼するように指示し、唾液を、ネジ付き蓋（ｓｃｒｅｗ ｌｉｄ）を有する５０ｍｌ プラスチックチューブに収集した。ＣＲＴ（登録商標）バクテリア試験は、唾液中に存在するミュータンス連鎖球菌と乳酸杆菌属との並行した半定量的な検出、およびその被験体を４つの異なるリスク段階のうちの１つに分類することを可能にする。この試験を、以下のように実行した。
１．サンプルチューブから寒天培地の支持体を取り外す。
２．このチューブの底にＮａＨＣＯ３錠剤をおく。
３．寒天培地の両方の表面から保護フィルムを注意深く取り外す；この過程で、寒天培地の表面を触らない。
４．寒天培地の表面を引っ掻かずに、ピペットを使用して、各々の寒天培地の表面を５０μｌの唾液で完全に湿らす。
５．滴らせることによって過剰な唾液を排出する。
６．上記寒天培地の支持体をこのチューブに戻し、しっかりと閉める。
７．インキュベーションキャビネット（例えば、Ｃｕｌｔｕｒａ／Ｉｖｏｃｌａｒ Ｖｉｖａｄｅｎｔ）内で、３７℃、４８時間〜７２時間、このチューブを直立させて保管する。
８．インキュベーションキャビネットからこのチューブを取り出した後、各々の場合におけるミュータンス連鎖球菌または乳酸杆菌属のコロニー密度を、添付の標準の対応する写真と比較する。
【００７０】
段階ＣＲＴ ０〜１（約１０３ｃｆｕに相当する）、段階ＣＲＴ １〜２（約１０４ｃｆｕに相当する）、段階ＣＲＴ ２〜３（約１０５ｃｆｕに相当する）および段階ＣＲＴ ３（約１０５ｃｆｕに相当する）への分類を実行した。次に、同じ唾液サンプルの、各々の場合についての５０μｌのアリコートを、５０μｌの試験溶液１３６（ミュータンス連鎖球菌について）または試験溶液９８（乳酸杆菌属について）とインキュベートし、ｐＨ電極を使用するか、または指示薬の色の変化に基づいて、ｐＨを、各々の場合においてサンプルへの炭素源の添加から１時間後、２時間後、３時間後および４時間後に測定した。この結果を、本明細書の以下にまとめる。
【００７１】
【表４−２】
ＣＲＴバクテリアと測定されたｐＨとの間の相関が、統計的に有意であったことが見出された（図２および図３を参照のこと）。
【００７２】
本発明の方法にしたがう唾液サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定が、小児および成人において、確立されたう食リスク試験ＣＲＴ（登録商標）バクテリアの結果と相関するか否かを試験するために、成人の７０個の唾液サンプルおよび小児の１１１個の唾液サンプルを、ミュータンス連鎖球菌について試験改変物（ｔｅｓｔ ｖａｒｉａｎｔ）１３６および３２３、ならびに乳酸杆菌属について試験改変物９８、ならびに本発明にしたがう試験溶液を使用して調べた。
【００７３】
ＣＲＴ（登録商標）バクテリア試験および対応するレベルでの分類を、上記のように実行した（「唾液サンプルを使用した臨床調査」と比較すること）。ＣＲＴ（登録商標）バクテリア試験を実行した後、次に、同じ唾液サンプルのアリコートを、それぞれ試験溶液１３６または３２３（ミュータンス連鎖球菌について）および試験溶液９８（乳酸杆菌属について）とともに１：１でインキュベートし、ｐＨ値を、指示薬の色の変化の補助下で、サンプルへの炭素源の添加から３時間後に測定した。この結果を、図４に示す。試験溶液９８と一緒になった唾液サンプルにおける酸の形成のレベルが、乳酸杆菌属についてのＣＲＴ（登録商標）バクテリアの値と相関することは明らかである（図４Ａ、４Ｂ）。同様に、試験溶液１３６（図４Ｃ、４Ｄ）および試験溶液３２３（図４Ｅ）と一緒になった唾液サンプルの酸の形成のレベルが、ミュータンス連鎖球菌についてのＣＲＴ（登録商標）バクテリア試験から得られた結果と相関する。
【００７４】
統計分析の結果を、以下の表５にまとめる。
【００７５】
【表５】
唾液サンプルの濃縮についての調査
１回の試験に必要とされる時間を受動的濾過（ｐａｓｓｉｖｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって唾液サンプルを濃縮することによって短くすることができるか否かを確認するために、９つの濃縮した唾液サンプルおよび９つの濃縮していない唾液サンプル中のミュータンス連鎖球菌の検出を比較した。この目的のために、直径５ｍｍの孔を、プラスチックディスクに穿孔した。これらの孔を、下からフィルター材料（ガラスファイバー）で密封した。ディスクとフィルターとを、このプラスチックディスクと吸引フリース（セルロース）との間にこのフィルターが配置されるような様式でこの吸引フリースの上においた。６０μｌの唾液サンプルを、孔のうちの１つを通してこのフィルター上に添加した。続いて、２０μｌの試験溶液１３６を、このフィルターに添加した。濾過の完了後に、この吸引フリースを、このディスクおよびこのフィルターから分離し、このプラスチックディスクとこのフィルターを、３７℃で最長４時間インキュベートした。
【００７６】
比較の目的のために、６０μｌの唾液を、マイクロタイタープレート内で６０μｌの試験溶液１３６と混合し、３７℃で最長２４時間インキュベートした。プラスチックディスクおよびマイクロタイタープレートにおいて、ｐＨの低下のレベルを、３０分、４５分、６０分、１２０分および１８０分のインキュベーション時間の後に、指示薬の色の変化によって測定した。両方の方法を、互いに、そしてＣＲＴ（登録商標）バクテリア試験（ＣＲＴ ＳＭ）と比較した（以下の表における０〜５の色の微妙な差異を比較する）
【００７７】
【表６】
示された色の変化は、測定されたＣＲＴ値と相関する。したがって、フィルターを通して唾液サンプルを濃縮した後に、４５分後に生じた色の変化が、マイクロタイタープレートにおいて１２０分後に生じるものと匹敵するものであることが理解され得る。したがって、上述されたサンプルの濃縮は、かなり短い時間で本発明の方法を遂行することを可能にする。
【００７８】
摘要
本発明は、唾液および／またはプラークのサンプル中のう食原性細菌を半定量的に測定するための方法に関し、ここで、プラークまたは唾液のサンプルに含まれる微生物を、炭素源と接触させる。この炭素源は、上記う食原性細菌によって酸に発酵される。次に、この微生物を、上記う食原性細菌による選択的な酸の形成を可能にする条件下でインキュベートする。次に、この酸の形成を、この炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも一回ｐＨを決定することによって検出し、ここで、上記ｐＨと少なくとも１つの参照値とを比較することによって、上記サンプル中のう食原性細菌を半定量的に測定する。さらに、本発明は、このような方法を実行するためのキットを提供する。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、唾液サンプルおよび／またはプラークサンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定のための方法に関し、ここで、プラークサンプルまたは唾液サンプルに含まれる微生物を、炭素源と接触させる。この炭素源は、上記う食原性細菌によって酸に発酵される。次に、この微生物を、上記う食原性細菌による選択的な酸の形成を可能にする条件下でインキュベートする。次に、この酸の形成を、上記炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも一回ｐＨを決定することによって検出し、ここで、上記サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定は、上記ｐＨと少なくとも１つの参照値とを比較することによって実行される。さらに、本発明は、このような方法を実行するためのキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトの口腔には、通常、互いに天然の平衡状態にある８００種超の異なる微生物が集落形成している。しかしながら、実質的に細菌からなるこの微生物叢はまた、歯の健康に損傷を与え得る生物を含む。これは、特に、食事由来の炭水化物を有機酸に代謝することができる細菌に関する。この酸（特に、乳酸）は歯のエナメル質を攻撃し、このことは、まず歯の表面の鉱物質消失をもたらす。鉱物質消失した部位の連続的な集落形成のために、やがては、歯のエナメル質からぞうげ質および歯髄まで攻撃し得る病変をもたらす。
【０００３】
う食の原因となる乳酸の大半は、「ミュータンス連鎖球菌（ｍｕｔａｎｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）」の代謝活動に起因する；この群は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ種、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ種、Ｓ．ｒａｔｔｕｓ種およびＳ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ種を含む。さらに、乳酸杆菌属の群は、この状況において重要である。口腔に集落形成する種々の他の細菌種とともに、これらの細菌は、健康な状態においても安定した平衡状態で存在するが、特別な条件下において、ミュータンス連鎖球菌の増大した繁殖が起こり得、その結果として、う食の発生のリスクが顕著に増大する。ミュータンス連鎖球菌によって生じる酸の形成は、酸性環境をもたらし、それは、今度は、乳酸杆菌属の増殖をますます促進する。乳酸杆菌属の増大した増殖には、乳酸杆菌属による酸の産生に起因するｐＨのさらなる低下が付随し、これは、上記障害の進行を促進する。
【０００４】
口腔に集落形成する細菌の発酵活動に起因して、糖の溶液の供給後、数分以内で、プラーク内のｐＨが大幅に低下することが見出されている。しかしながら、臨床研究において、検出可能なう食を有する小児からのプラークサンプルと、う食を有さない小児からのプラークサンプルとが、口腔内のｐＨを低下させることに関して匹敵する可能性を有したことが見出されている（非特許文献１）。このことは、ヒト口腔において、連鎖球菌属および乳酸杆菌属に加えて、代謝副産物として酸を排出するが、う食の顕著なリスクを提示しない多くの他の微生物が存在することを示している。したがって、唾液中の全体の酸の産生を測定することは、う食原性細菌の数そして、したがって患者のう食のリスクを決定するのに適していない。むしろ、このリスクは、ミュータンス連鎖球菌および乳酸杆菌属の濃度によって明確に決定される。
【０００５】
プラークまたは唾液中のミュータンス連鎖球菌および／または乳酸杆菌属の定量的な測定または半定量的な測定は、患者のう食のリスクについて情報を与え得る。この理由のため、選択栄養培地上で微生物を平板培養することによってその微生物の濃度に関しての、プラークサンプルまたは唾液サンプルの調査を提供する、試験方法が開発されている。例えば、Ｉｖｏｃｌａｒ ＶｉｖａｄｅｎｔからＣＲＴ（登録商標）バクテリアとして取得可能な試験系は、普通寒天プレート上で唾液サンプルからのミュータンス連鎖球菌または乳酸杆菌属の選択的富化に基づく。唾液サンプルを、それぞれバシトラシン含有Ｍｉｔｉｓ Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ寒天培地（連鎖球菌属に関して選択的）、およびそれと並行してＲｏｇｏｓａ寒天培地（乳酸杆菌属に関して選択的）に画線する。２日間〜３日間、インキュベートした後、寒天平板上に形成されたコロニーを数えることによって、患者それぞれについてのう食のリスクについて報告（ｓｔａｔｅｍｅｎｔ）を作成することができる。同様な系はまた、Ｏｒｉｏｎ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＤｅｎｔｏｃｕｌｔおよびＯｒａｌＢｉｏｔｅｃｈからのＣａｒｉｃｕｌｔとして利用可能である。
【０００６】
しかしながら、栄養培地上で唾液サンプルを培養することは、時間を浪費する。習慣的に、これらの結果は、唾液サンプルを平板培養してからおよそ２日後〜３日後になるまで評価することができない。したがって、本発明の目的は、短時間で確実かつ再現性よくプラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌の数に関して報告を作成することができる方法を提供することである。この方法は、複雑な装置を使用せずに実行することができるはずであり、この結果は、可能ならば、数時間内に利用可能になるはずである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＭｉｎａｈおよびＬｏｅｓｃｈｅ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９７７）１７：４３〜５４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明にしたがって、上記目的は、特許請求の範囲の主題によって達成される。第一の局面において、本発明は、プラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌を半定量的に測定するための方法を提供し、ここで
（ａ）プラークサンプルまたは唾液サンプルに含まれる微生物を必要に応じて濃縮する；
（ｂ）上記微生物を炭素源と接触させ、ここで、この炭素源は、上記う食原性細菌によって酸に発酵される；
（ｃ）上記微生物および上記炭素源を、上記う食原性細菌による選択的な酸の形成を可能にする条件下でインキュベートする；
（ｄ）上記炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも一回ｐＨを決定する；
ここで、上記サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定は、工程（ｄ）で決定されたｐＨと１つまたはそれより多くの参照値とを比較することによって実行される。この参照値またはこれらの複数の参照値を、対応するう食原性細菌の既知濃度を使用することによって前もって決定した。
【０００９】
上記方法は、細菌の半定量的な測定に関し、この細菌は、その酸の形成によって、う食の発生に寄与する（う食原性細菌）。したがって、唾液またはプラーク中のこれらの細菌の定量化または半定量化（ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、う食を発生するリスクに関する報告を容易にする。この方法は、細菌による実質的に選択的な酸の形成に基づき、この酸の形成は、う食の発生および／または進行と相関する。対照的に、口の微生物叢の一部でもあるが、う食の発生または進行にほんのわずかしか影響を及ぼさないかまたは何の影響も及ぼさない他の細菌は、可能な限り酸の形成から排除すべきである。本発明の方法を使用して、その酸の形成に基づいて半定量的に検出されるべきである、特に好ましいう食原性細菌は、ミュータンス連鎖球菌および／または乳酸杆菌属である。これらの群の生物の各々について、本質的に選択的な酸の形成を促進する条件が、本明細書に開示される。
【００１０】
本発明の方法は、個体からのプラークサンプルまたは唾液サンプルを使用し、ここで、口腔内のそれぞれの細菌の数が半定量的に決定される。習慣的に、この個体はヒトであるが、獣医学の分野におけるこの方法の使用は排除されない。この方法は、任意の所望の年齢のヒトに対して実行され得る。しかしながら、本発明の特定の局面において、このヒト個体が小児、好ましくは、３歳未満、４歳未満、５歳未満、６歳未満または７歳未満の小児であることが好ましい。この年齢において、口腔衛生の確立は、この様式で有効にう食を予防するために、小児への各々のリスクに特につりあい得る。
【００１１】
唾液サンプルは、従来の方法を使用して取得され得る。習慣的に、この唾液サンプルの容積は、０．５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌまたは１５ｍｌである。好ましい実施形態において、この唾液サンプルは、０．５ｍｌ〜５ｍｌの容積を有するサンプルであり、これは、本発明にしたがう方法において希釈されずに使用される。さらに好ましい実施形態において、この唾液サンプルは、濃縮されたサンプルである、すなわち、例えば、細菌細胞のような唾液中に存在する固体は、濾過、遠心分離などの方法によって唾液の液体成分から分離され、より少ない容積の液体（例えば、バッファー）に移されている。
【００１２】
唾液を取得するための複数の方法およびデバイスが先行技術から公知である。単純な実施形態において、ドナーは、口腔から唾液をしたたらせ、ここで、この唾液は、適切なサンプル容器に収集される。これに対して代替的に、唾液はまた、アスピレーターを使用する吸引によって口腔から抽出され得る。比較的大容積の唾液が、本発明にしたがう方法を実行するために望ましい場合、唾液の形成を、好ましくは咀嚼する動作によって、力学的に刺激することができる。例えば、咀嚼される際に唾液の形成を促進するパラフィンペレットを、ドナーに投与し得る。唾液は、約０．５分〜約５分後に、例えば、２分後、３分後、４分後、または５分後に収集され得る。
【００１３】
ドナーから取得した唾液は、また、必要とされる場合、本発明の方法において希釈して使用され得る。例えば、唾液の過剰な粘度に起因して、濾過による濃縮が不可能であるか、またはそれが長すぎる時間を必要とする場合、唾液サンプルの希釈が必要とされ得る。希釈が所定の条件下で推奨される場合、微生物学の分野において慣習的である水（例えば、滅菌水）またはバッファーが使用され得、これらは、う食原性細菌の続いての発酵を有意には損ねない。適切なバッファーは、例えば、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファーまたはリン酸バッファーである。
【００１４】
さらに、本発明にしたがう方法はまた、試験下のドナーからのプラークサンプルを使用して実行され得る。この目的のために、フィルム（ｆｉｌｍ）が、剥離によって滅菌ブラシまたはへらを使用して歯の表面から取得され、これを適切なサンプル容器に移す。次に、プラークサンプルは、水または適切なバッファー（例えば、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファーまたはリン酸バッファー）に溶解され得る。次に、生じた細菌の懸濁物を、本発明にしたがう方法に直接使用し得る。
【００１５】
検出されるべきう食原性細菌に依存して、本発明にしたがう方法の最初の工程において、微生物に炭素源を添加する前に、プラークサンプルまたは唾液サンプル中に存在する微生物を最初に濃縮することが必要または好都合であり得る。このような濃縮は、例えば、ドナーから取得したプラークサンプルまたは唾液サンプルを遠心分離すること、続いて、より少ない容積の水またはバッファー（例えば、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファーまたはリン酸バッファー）中で、サンプル中に存在する固体を再懸濁することによって、達成され得る。この様式において、数ｍｌの唾液が、５００μｌまたはそれ未満の容積のバッファーまたは水に溶解され得る。上記を実行することにおいて、４００μｌ未満、３００μｌ未満、２００μｌ未満、１００μｌ未満、５０μｌ未満、２５μｌ未満、２０μｌ未満、１５μｌ未満、１０μｌ未満、５μｌ未満または１μｌ未満の容積が使用され得る。遠心分離後に取得された固体はまた、上清の一部に直接再懸濁され得る。
【００１６】
さらに、本発明にしたがって取得されたプラークサンプルまたは唾液サンプルはまた、濾過によって濃縮され得る。このプロセスにおいて、微生物学上の実施において公知であるフィルター（例えば、溶液の滅菌濾過に使用されるメンブレン）が使用され得る。これらのフィルターは、唾液サンプルから浸透液への細菌の通過を妨害するのに十分小さな孔径を有する。唾液中の連鎖球菌属が一般的にバイオフィルムの形態で増殖し、その結果、それらが細胞外多糖類のマトリクス内に存在することが注記されるべきである。この理由のために、連鎖球菌属はまた、約１５μｍまたはそれより大きな孔径を有するフィルターを使用して唾液から効率的に濾過して分けることができる。乳酸杆菌属に適切なフィルターは、好ましくは、２μｍ未満、１μｍ未満、０．５μｍ未満、０．３μｍ未満、例えば、０．２５μｍ未満の孔径を有する。本発明にしたがった特に好ましい実施形態において、唾液サンプルを濃縮するのに使用するためのフィルターは、０．２μｍ〜０．２２μｍの範囲の孔径を有する。そのように小さな孔径を有するフィルターは、濾過の間に圧力の適用を必要とする。この濾過が、吸収性マット（以下を参照のこと）上に配置されたフィルター材料を使用して実行される場合、またはこの濾過が重力によってのみ媒介される場合、対応してより大きな孔容積（ｐｏｒｅ ｖｏｌｕｍｅ）が選択されなければならない。適切な孔径は、１μｍ〜１０μｍ、好ましくは、２μｍ〜８μｍの範囲である。
【００１７】
本発明の状況における濾過のために、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルサルフォン（ＰＥＳ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）のようなポリマー材料から習慣的に構成されたフィルターが使用される。ナイロン、セルロース、ニトロセルロース、またはガラスファイバーもしくは石英ファイバーから作製されたフィルターもまた、液体から細菌細胞を分離することにおいて頻繁に使用される。適切なフィルターは、種々の製造者（例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｗｈａｔｍａｎ（Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、ＵＫ）またはＰａｌｌ ＧｍｂＨ（Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ））から取得可能である。特に好ましいフィルター材料は、Ｗｈａｔｍａｎからのガラスファイバーフィルター材料９３４−ＡＨである。
【００１８】
本発明の一実施形態において、上記濾過は、多層フィルター、好ましくは二重層フィルターを使用して実行される。それによって、種々のフィルターメンブレン（それらの各々は、この多層フィルターの一層を形成する）は、同一の孔径を有しても異なる孔径を有してもよい。好ましくは、種々の層は、それらの孔径に関して異なり、ここで、唾液サンプルと最初に接触するフィルターの層は、その下に配置されるフィルター層よりも大きな孔径を有する。フィルターメンブレンのこのような配置によって、前濾過（ｐｒｅｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）が達成され得る。例えば、二重層フィルターにおいて、例えば、０．４μｍ〜２０μｍの孔径を有する最初のメンブレンが提供され得、その下に、０．２μｍの孔径を有するさらなるメンブレンが配置される。必要とされる場合、これらのメンブレンの表面は、例えば、このメンブレンの親水性特性を改変するために、化学的に改変される。
【００１９】
上記濾過は、例えば、シリンジを使用して実行され得る。上記を実行することにおいて、適切なフィルターを備えるアタッチメントを使用し得、ここで、わずかな圧力をかけて、希釈されたまたは希釈されていない唾液サンプルが、フィルター材料を通過する。さらなる単純な実施形態において、吸収性マットが、このフィルターの下に配置され、このマットは、このフィルターと接触する。希釈されたまたは希釈されていない唾液サンプルがこのフィルター上に滴下された場合、例えば、細菌細胞のような、このサンプル中に含まれる固体は、このフィルター材料上に蓄積する一方、このサンプルの水性成分は、この吸収性マットを通過する。使用される吸収性マットは、特に、例えば、ＢＡＳＦから取得可能なＬＵＱＵＡＳＯＲＢポリマーのような高吸収性材料から作製され得る。例えば、ＢＡＳＦからのＬＵＱＵＡＦＬＥＥＣＥのように既にフリース形態にある高吸収性材料は特に適している。滴下によるサンプルの添加を容易にするために、プラスチックまたはパースペクスから製造されるテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を使用することができ、プラークサンプルまたは唾液サンプルの標的化した滴下を促進する。濾過を実行した後に、このフィルター材料を、続く工程のために、この吸収性マットから分離し得る。
【００２０】
上記フィルター材料上に残留する微生物（特に、う食原性細菌）を、このフィルター材料からすすぎ得、その後、ある容積の適切な液体（例えば、水、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、リン酸バッファー）を使用して炭素源とインキュベートする。上記を実行することにおいて、メンブレンから剥離させるために使用される容積は、唾液サンプルの最初の容積よりも少ない。続いて炭素源とのインキュベーションのために使用される細菌の懸濁物の容積は、その後の酸試験（ａｃｉｄ ｔｅｓｔ）（以下を参照のこと）のそれぞれの様式に本質的に左右される。例えば、炭素源とのインキュベーションおよび／または酸の形成の検出を、チューブまたはキュベット（例えば、ガラス製またはプラスチック製）内で実行する場合、この細菌の懸濁物の容積は、数ｍｌであり得る。炭素源とのインキュベーションおよび／または酸の形成の検出を、フィルターまたはメンブレン（例えば、本明細書の以下に記載される試験ストリップのうちの１つ）上で実行する場合、この細菌の懸濁物の容積は、一般的に０．５μｌ〜２０００μｌの範囲、例えば、約５μｌ、約１０μｌ、約２０μｌ、約５０μｌ、約６０μｌ、約７０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、約１００μｌ、約１５０μｌ、約２００μｌ、約２５０μｌ、約３００μｌ、約３５０μｌ、約４００μｌ、約４５０μｌまたは約５００μｌである。
【００２１】
本発明の特に好ましい実施形態において、上記微生物（特に、う食原性細菌）は、上記フィルター材料から除去されないが、濃縮に使用されたこのフィルター材料に残留し、その上で炭素源および／または対応する試験試薬（例えば、ｐＨ指示薬など）と直接接触させられる。この場合において酸の形成は、例えば、このフィルター材料上のｐＨ呈色指示薬（ｐＨ ｃｏｌｏｕｒ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）の変化に直接基づいて、炭素源および試験試薬の添加後に検出され得る。このフィルターの吸収能力は一般的に制限されるので、使用されるフィルターに依存して、炭素源および試験試薬は、このフィルターに小さな容積、好ましくは、約５μｌ、約１０μｌ、約２０μｌ、約５０μｌ、約６０μｌ、約７０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、約１００μｌ、約１５０μｌ、約２００μｌ、約２５０μｌ、約３００μｌ、約３５０μｌ、約４００μｌ、約４５０μｌまたは約５００μｌの容積で添加される。単位フィルター面積あたりの容積が、フィルター材料１ｍｍ２あたり約０．１μｌ〜約１５μｌ、好ましくはフィルター材料１ｍｍ２あたり０．５μｌ〜１０μｌの範囲であることが特に好ましい。この試験試薬の濃度は、各々添加される容積に関して調整される。
【００２２】
例えば、濾過による濃縮は、２０℃〜４０℃の温度で実行され得、これは、一般的に、特に、本発明にしたがう方法が、数時間以内に各々の生物の決定を可能にする迅速な試験として設計される場合（例えば、歯科試験の状況において）、室温（すなわち、約２０℃）で実行される。濃縮されたプラークサンプルまたは唾液サンプルに含まれるう食原性細菌を、それらの酸の形成に関して、続いての工程で調べるので、濃縮と炭素源の添加との間の時間が長すぎることがないことを確実にしなければならない。このことは、濃縮されたサンプルに含まれる細菌が生存可能でかつ代謝的に活性であることを確実にする。濃縮されたう食原性細菌が、酸の形成の続いての検査において数分のうちに使用されることが好ましい。好ましくは、酸の形成の検査は、唾液サンプルの濃縮の後、１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、６０分のうちに進行する。
【００２３】
プラークサンプルまたは唾液サンプルを濃縮することは、本発明にしたがう方法の必須の工程ではない。しかしながら、濃縮された細菌の懸濁物の使用は、評価までのこの方法の総所要時間に対して顕著な効果を与える。濃縮されたサンプルは、既に数時間後、好ましくは、３時間未満、２時間未満、１時間未満、例えば、５０分以内、４０分以内、または３０分以内またはそれより短いうちに、この方法の半定量的な評価を可能にする。特に好ましい実施形態において、この方法は、１時間のうちに唾液サンプル中のう食原性細菌の濃度の半定量的な測定を可能にする、迅速な試験として設計されている。これにより、歯科医の単回の診察の状況において、既にこのような測定が可能となる。
【００２４】
上記方法の次の工程において、希釈されたまたは希釈されていないプラークサンプルまたは唾液サンプルに含まれる微生物あるいは濃縮によって生成された細菌の懸濁物に含まれる微生物を、炭素源と接触させる。この炭素源は、定量化されるべきう食原性細菌によって酸に発酵され得る。本発明の方法は、検出されるべきう食原性細菌のみが本質的に酸を形成することができる条件を確立することに基づく。したがって、定量化されるべきう食原性細菌によって排他的に利用され得るか、または口の微生物叢の他の微生物よりも、これらの細菌によってより迅速に酸に発酵され得る炭素源を選択することが特に好ましい。本発明にしたがう方法が、例えば、１〜２時間のうちに実行されることが意図される場合、定量化されるべきう食原性細菌が、約１時間以内に既に検出可能な酸の形成を示している一方で、唾液サンプルに存在する他の細菌における酸の形成が、３時間またはそれより遅くまで開始しない、すなわち、その時点で、この方法は既に完了している場合、この方法は十分であることが証明され得る。
【００２５】
本発明の状況において、う食原性細菌による酸の形成に極めて有利な条件下において、ｐＨ低下の速度、すなわち、単位時間あたりのｐＨの低下は、唾液サンプル中のそれぞれのう食原性細菌の濃度と相関することが観察されている。したがって、これらの条件下において、炭素源の添加後の種々の時点において、ｐＨを測定することは、元のプラークサンプルまたは唾液サンプル中のリスクに関連するう食原性細菌の数についての情報を与える（実施例を参照のこと）。
【００２６】
本発明にしたがう方法に基づいてリスク評価に特に適したう食原性細菌は、いわゆる「ミュータンス連鎖球菌」の群を含み、次に、この群は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ種、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ種、Ｓ．ｒａｔｔｕｓ種およびＳ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ種を含む。これらの連鎖球菌属は、きれいにした歯の表面に新規に集落形成する最初の微生物のうちの１つである。さらに、これらは、食物残渣および唾液の成分に由来するポリマー性のスライムを形成することができ、このスライムで、これらは、歯の表面に付着する。これらの連鎖球菌属によって形成されたバイオフィルムはまたプラークと呼ばれる。これは、多糖類および糖タンパク質のマトリクスにおいて生きている微生物および死んだ微生物の構造化されたフィルムである。プラークは、咀嚼面の陥凹部、歯の間の領域、および歯肉の縁に特に容易に蓄積する。このバイオフィルムはまた、他の細菌が歯の表面に定着するようになることを可能にする。
【００２７】
唾液サンプル中のミュータンス連鎖球菌の数は、特定の様式において、う食のリスクについての情報を取得するために適切である。本発明の一実施形態において、選択された炭素源は、ミュータンス連鎖球菌の上述した種のうちの複数またはそれらの全てによって利用され得るが、唾液サンプル中に存在する他の細菌は、この炭素源を利用することができないか、または顕著に遅延してそれを利用することしかできない。このような炭素源の特に好ましい例は、グルコース、スクロース、マルトースおよびマルトトリオース（または、これらの混合物）であり、これらは、全てのミュータンス連鎖球菌によって迅速に代謝される。これらの糖はまた、唾液中の他の微生物によって変換されるが、これらは、顕著により遅く変換される（図１を参照のこと）。代替的な実施形態において、この炭素源は、本発明にしたがう方法が実行される規定の時間枠内で、ミュータンス連鎖球菌の群のうちの単一のメンバー（例えば、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）によってのみ利用される。例えば、スクロースを、反応バッチ中、２０％の濃度で炭素源として使用する場合、酸の形成は、１５分以内にＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓでのみ検出され得ることが、図１の表１から理解することができる。本発明にしたがう方法を、この炭素源を使用して実行する場合、この方法が、約１５分〜約２０分後に（すなわち、依然として、スクロースが、他のう食原性細菌または非う食原性細菌によって発酵される前に）終わるならば、この種によって唯一生じる酸の形成が検出され得る。
【００２８】
本発明の代替的な実施形態において、定量化されるべきう食原性細菌は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｌ．ｃａｓｅｉ種、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ種、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ種、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ種およびＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種を含む乳酸杆菌属の群である。乳酸杆菌属の細菌は、混合した酸の発酵をすることができ、さらに、口内の微生物によって形成される酸の大半の原因である。乳酸杆菌属は、特に、連鎖球菌属によって形成されたバイオフィルムに集落形成することができる。活動性う食の部位において、乳酸杆菌属の株は、常に同定され得る。上述の理由のために、唾液およびプラーク中の乳酸杆菌属の細菌の定量的な検出はまた、現在、予防に指向した実施および研究の中心をなす。乳酸杆菌属による選択的な酸の形成を検出するために使用され得る炭素源は、例えば、グルコース、ラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびマンノース（または、これらの混合物）を含む。
【００２９】
上記炭素源は、反応バッチ（唾液サンプルの微生物、炭素源およびさらなる必要に応じた成分から構成される）に、０．０５重量％〜６０重量％の量、例えば、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれより多くの量で添加され得る。例えば、試験溶液中のスクロース濃度を増加させることによって、特定のミュータンス連鎖球菌に対する特異性を改善することができることが、例えば見出されている。
【００３０】
プラークサンプルまたは唾液サンプルのう食原性細菌と、選択された炭素源との間の接触を、複数の方法でなすことができる。例えば、この炭素源を、例えば、水または生理学的に受容可能なバッファーに溶解させた溶液として提示することができる。この溶液は、規定の容積の希釈された、希釈されていないまたは濃縮された液体プラークサンプルまたは唾液サンプルと混合され得る。さらに、この炭素源はまた、希釈された、希釈されていないまたは濃縮された液体唾液サンプルに溶解される粉末または顆粒の形態で使用され得る。例えば、粉末形態での規定の量の炭素源を含む、例えば、チューブ、マイクロタイタープレートまたはキュベットが提供され得、液体唾液サンプルの添加に際して、う食原性細菌と炭素源との接触が確立される。例えば、マンノースのような適切な炭素源が、種々の提供者から粉末形態で利用可能である。
【００３１】
好ましい実施形態において、炭素源とのインキュベーション、および続いてのｐＨの決定も、液体反応バッチ（溶液または懸濁物）で実行される。上記方法で使用される細菌の懸濁物および試験試薬の容積に依存して、ガラスまたはプラスチックのチューブまたはキュベット（例えば、５ｍｌ〜１０ｍｌの容積を有するもの）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ反応チューブ（１ｍｌ〜２ｍｌの容積を有する）またはマイクロタイタープレートを使用し得る。
【００３２】
さらに好ましい実施形態において、上記炭素源および／または上記試験試薬は、フィルター材料（例えば、試験ストリップの表面）上で乾燥形態で固定化され得る。この場合に使用され得る試験ストリップは、濃縮に関連して上述されたフィルター材料（すなわち、フィルターであって、その孔径が、このフィルター材料に添加されたう食原性細菌の、浸透液への移動を妨害する、フィルター）である。希釈された、希釈されていないまたは濃縮された液体唾液サンプルを、このフィルター材料に滴下して加え、そこで、この固定化された炭素源を溶解し、それによってこのう食原性細菌に容易に接近されるようにする。炭素源の利用および生じた酸の形成は、例えば、ｐＨ呈色指示薬を使用することによって、このフィルター材料上で直接検出され得る。本発明の特に好ましい実施形態において、この炭素源は、マルトース、マルトトリオース、および／またはスクロースであり、試験ストリップ上に固定化されて存在する。このような試験ストリップは、ミュータンス連鎖球菌による酸の形成を決定するために使用され得る。代替的な実施形態において、この炭素源は、ラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはマンノースであり、試験ストリップ上に固定化されて存在する。このような試験ストリップは、乳酸杆菌属による酸の形成を決定するために使用され得る。
【００３３】
さらなる特に好ましい実施形態において、上記炭素源および／または上記試験試薬が乾燥形態で固定化される材料は、上記唾液サンプルを濃縮する目的のためにこの唾液サンプルを濾過するのに以前に使用された材料と同じ材料である。このことは、上記フィルター材料が、唾液サンプルを濾過することによってこの唾液からう食原性細菌を富化するために最初に使用されることを意味する。しかしながら、このような実施形態において、濾過において、固定化された炭素源および／または試験試薬は、このフィルター材料から剥離しないか、またはわずかな程度しか剥離しないことを確実にしなければならない。なぜなら、さもなければ、それらは、フィルターを通過して浸透液に入り、そして結果的にその後のフィルター上での酸反応の検出にもはや使用できなくなるからである。プラークサンプルまたは唾液サンプルの濃縮が完了した後でのみ、酸の形成がこのフィルター材料上で生じ得るように、フィルター上の炭素源および／または試験試薬の放出が起こるべきである。このことは、例えば、固定化された試薬の溶液への時間的に遅延した移動を確実にする手段によって達成され得る。したがって、乾燥形態の炭素源および／または試験試薬（例えば、呈色指示薬）をフィルター材料に塗布し、遅延した放出を引き起こすラッカーでコーティングすることが有利であることが実証されている。
【００３４】
この場合において、一方で、う食原性細菌による酸の形成のために十分な炭素源および／または試験試薬が存在するが、他方で、フィルターが詰まらないように、定量的な比を選択しなければならない。患者の唾液サンプルの濾過による細菌の富化を促進するために、炭素源の代謝の前に十分な時間が残っているように、フィルター上の炭素源および／または試験試薬の放出は、１分〜２分後でのみ生じなければならない。本発明にしたがう試験ストリップの最適な設計において、この炭素源および／または試験試薬は、唾液サンプルの添加から、約３分〜約１０分後、好ましくは、約５分〜約８分後でのみ放出される。したがって、例えば、１ｍｇ〜１０ｍｇの粉末化した試験試薬を、適切なテンプレートによってフィルターに塗布し得、１０μｌ〜５０μｌ、好ましくは２０μｌの、例えば、１重量％のヒドロキシプロピルセルロースのようなラッカーを使用してこのフィルターに固定し得る。これらのフィルターは、乾燥キャビネット内で乾燥させ得、使用するまで室温で乾燥状態で保存され得る。
【００３５】
固定に適切な他のラッカーは、例えば、キサンタン、キトサン、カラゲーナンのような多糖類；例えば、ＫｕｒａｒａｙからのＰｏｖａｌのようなポリビニルアルコール；例えば、ＢＡＳＦからのＫｏｌｌｉｃｏａｔ ＩＲのようなポリビニルアルコール−ＰＥＧコポリマー；例えば、ＩＳＰからのＰｌａｓｄｏｎｅのようなポリビニルピロリドン；例えば、ＢＡＳＦからのＬｕｖｉｓｋｏｌ ＶＡのようなビニルピロリドン−酢酸ビニルコポリマー；例えば、ＩＳＰからのＧａｎｔｒｅｚのような、ポリ（メチルビニルエーテル）マレイン酸無水物のアルキルエステルまたはマレイン酸コポリマー；例えば、ＢＡＳＦからのＬｕｖｉｓｋｏｌ Ｐｌｕｓのようなポリビニルカプロラクタム；例えば、ＥｖｏｎｉｋからのＥｕｄｒａｇｉｔまたはＢＡＳＦからのＬｕｖｉｍｅｒ １００Ｐのようなアクリラートコポリマー；例えば、ＢＡＳＦからのＬｕｖｉｓｅｔまたはＷａｃｋｅｒからのＶｉｎｎａｐａｓのようなポリ（酢酸ビニル−ｃｏ−クロトン酸）；例えば、ＩＳＰからのＡｄｖａｎｔａｇｅまたはＡｑｕａｆｌｅｘのようなビニルカプロラクタム−ビニルピロリドン−ジメチルアミノアルキルメタクリラートコポリマー；および第４級アンモニウム化合物を有するポリマーを含む。上記試薬を試験ストリップに固定するのに適切な他のポリマーは、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチル−セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびメチル−ヒドロキシエチルセルロースのようなセルロースエーテルを含む。さらに、上記化合物の任意の組み合わせが使用され得る。
【００３６】
上記唾液サンプルに含まれる微生物を、選択された炭素源と接触させた後、これらを、う食原性細菌による本質的に選択的な酸の形成を可能にする条件下で、この炭素源とともにインキュベートする。これに関連して、温度、ｐＨおよび容量オスモル濃度について、う食原性細菌による炭素源の特に迅速な代謝が生じ得る、この細菌に適切な条件が選択される。バッファーが使用される場合、バッファーが、６．５と９との間のｐＨ、好ましくは６．５と８．５との間のｐＨ（７．０と８．５との間のｐＨが特に好ましい（例えば、７．５））を提供するような様式で、これらが選択され得る。この酸の形成がｐＨ呈色指示薬の存在下で進行する場合、酸の形成が開始したとき、指示薬の色の完全な変化を確実にするように、インキュベーションの開始時に、溶液のｐＨが、指示薬のｐＫａよりも上になるような様式で、適切なバッファーを使用することによってｐＨを設定しなければならない。したがって、指示薬であるフェノールレッドが存在する溶液のｐＨは約８．５の領域にある。なぜなら、このｐＨよりも下で、約５．０のｐＨまでの色の変化が検出可能であるからである（表２を参照のこと）。
【００３７】
上記炭素源との上記微生物のインキュベーションの温度は、一般的に、２０℃と６０℃との間、好ましくは２５℃と５０℃との間、より好ましくは３０℃と４５℃との間であり得る。酸の形成は、一般的に、３５℃と４５℃との間の温度で最も迅速に進行する。
【００３８】
本発明にしたがって、上記炭素源および／または上記試験試薬が、１ｍＭと１０ｍＭとの間のホスフェート濃度を有することが特に好ましく、ここで、高い試験感度が所望されるとき、５ｍＭが特に好ましい。使用されるバッファーの濃度に基づいて、唾液中の比較的高い濃度のう食原性細菌を区別し得るために、試験感度はまた低減され得る。感度を段階分けするために、リン酸バッファーの濃度は、例えば、＞１０ｍＭ、＞２０ｍＭ、＞３０ｍＭ、＞４０ｍＭ、またはさらには＞５０ｍＭに増大することができる。緩衝化のために、例えば、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、トリスなどの他のバッファーも使用され得る。感度を設定するためのさらなる可能性は、適切な量のわずかに塩基性の塩またはポリマーを添加することである。
【００３９】
う食原性細菌（特に、ミュータンス連鎖球菌）に有利な増大した選択性は、アミノ酸および／またはアミノ酸含有ポリマーの添加によって達成され得る。口腔内の多くの酸産生細菌が、アミノ酸のアミノ基を酵素的に切断することができる。それによって、塩基性アミノ基の遊離は、これらの細菌によって産生された酸の部分的な中和または完全な中和をもたらす。他方、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのようなミュータンス連鎖球菌は、顕著な程度まで、アミノ酸からアミノ基を遊離させることができない。なぜなら、これらの生物は、通常、必要とされる酵素を欠くからである。例えば、Ｓ．ｍｕｔａｎｓもＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓもアルギニンデイミナーゼをもたない。したがって、アルギニンの添加は、ミュータンス連鎖球菌ではない細菌（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓ．ｅｑｕｉｎｕｓ、Ｓ．ｍｉｔｉｓ、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓなど）による酸の生成を中和するのに特に適している。
【００４０】
う食原性細菌の半定量的な測定のための上記に示された方法は、以下の点で改変される：アルギニンのようなアミノ酸および／またはアミノ酸含有ポリマーの存在下で、上記微生物が炭素源とともにインキュベートされ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの酸の産生が影響を受けない一方で、口腔の他の細菌による酸の産生が塩基性アミノ基の遊離によって抑制される。
【００４１】
本発明の方法の特に好ましい実施形態において、工程（ｂ）および／または工程（ｃ）は、それゆえ、１つもしくはそれより多くのアミノ酸（複数含む）および／または１つもしくはそれより多くのアミノ酸含有ポリマー（複数含む）の存在下で進行する。好ましくは、このアミノ酸は、反応バッチに遊離アミノ酸として添加される。非ミュータンス連鎖球菌の酸の産生を抑制する、特に好ましい遊離アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびセリンを含む。遊離アミノ酸としてのアルギニンの使用は、特に好ましい。あるいは、１つもしくはそれより多くのアミノ酸含有ポリマー（複数含む）もまた、反応バッチに添加され得る。アミノ酸含有ポリマーは、短いペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチド（例えば、＞１０、＞２０、＞３０、＞４０、＞５０またはそれより多いアミノ酸長を有する）を含む。遊離アミノ酸とアミノ酸含有ポリマーとの混合物も使用され得る。非ミュータンス連鎖球菌における酸の形成の有効な抑制を提供する、遊離アミノ酸およびアミノ酸含有ポリマーの適切な混合物は、例えば、ペプトンである。
【００４２】
さらなる好ましい実施形態において、上記に示された方法において、グルコースを炭素源として使用し、工程（ｂ）および／または工程（ｃ）は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸の存在下で実行され、ここで、アルギニンの添加は、特に好ましい。
【００４３】
上記に示された方法において、上記アミノ酸は、工程（ｂ）または工程（ｃ）で添加され得る。このアミノ酸は、反応バッチ（唾液サンプル、炭素源およびさらなる必要に応じた成分から構成される）に、０．０１重量％〜５重量％の量、例えば、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％またはそれより多い量で添加され得る。０．１重量％〜０．２重量％の量が特に好ましい。アミノ酸含有ポリマーを使用する場合、当業者は、上記の情報に基づいてそれぞれのポリマーの適切な量を容易に決定し得る。
【００４４】
う食原性細菌に有利な改善された選択性はまた、尿素の添加によって達成され得る。尿素の添加は、特に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる酸の形成の抑制を提供する。上記に記載された方法において、工程（ｂ）または工程（ｃ）はまた、それゆえ、尿素の存在下で進行することができる。特に好ましい実施形態において、上記に示された方法においてスクロースを炭素源として使用し、工程（ｂ）または工程（ｃ）は、尿素の存在下で進行する。
【００４５】
選択的な酸の形成のさらなる改善は、本発明にしたがう方法の状況において定量化されない細菌の増殖および／または代謝活動を阻害および／または停止することができる抗生物質を添加することによって達成され得、対照的に、ここでは、う食原性細菌の増殖および／または酸の形成は、有意には損なわれない。例えば、例えばバンコマイシン、カナマイシンまたはネオマイシンを上記炭素源および／または上記試験試薬に添加することによって、乳酸杆菌属に対する特に高い特異性が達成され得る。なぜなら、これらは、それらの増殖または代謝活動に関して、この抗生物質によってわずかしか阻害されない一方で、例えば、連鎖球菌属およびブドウ球菌属はかなり阻害されるからである。同様に、バシトラシンおよびメトロニダゾールを使用することによって、ミュータンス連鎖球菌による選択的な酸の形成に特に適した条件を作り出すことができる。適切な抗生物質を、この炭素源および／またはこの試験試薬に、０．０１重量％〜２重量％の量、好ましくは、０．１量％〜１重量％（例えば、０．２重量％）の量で添加し得る。乳酸杆菌属の細菌の増殖および／または代謝活動を阻害する、特に好ましい抗生物質は、例えば、バンコマイシン、クリンダマイシンおよびナイシンである。
【００４６】
表１は、指示薬であるブロモクレゾールパープルの存在下で、１％ グルコースとともにインキュベートされた種々のう食原性細菌および非う食原性細菌による酸の形成の、時間をわたっての進展に対する、抗生物質の添加の影響を示す。試験溶液の正確な組成を、表３に示す。
【００４７】
【表１】
本発明にしたがって選択された炭素源とともに微生物をインキュベートするために選択されるインキュベーション時間は、定量化されるべきう食原性細菌、そしてこの炭素源のタイプおよび濃度にも依存する。このインキュベーション時間は、一般的に、可能な限り最も強力な酸の形成が定量化されるべきう食原性細菌によって達成される一方で、非う食原性細菌による酸の形成が可能な限り排除されるべきであるように選択される。
【００４８】
上記炭素源とのインキュベーション後に、上記う食原性細菌による酸の形成に、この炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも１回、ｐＨを決定することが続く。その中で測定が実行される期間は、炭素源の添加後、最長１２時間まで延長されるが、しかしながら、この期間は、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、またはさらには１時間未満であることが好ましい。その中でｐＨが測定され、したがって、この方法の時間枠を形成する期間が、０．２５時間〜３時間を構成する場合に、この方法の特定の利点が生じる。このことは、歯科検査の状況において、う食原性細菌および関連するう食のリスクを決定することを可能にする。１回より多いｐＨの測定を、この期間内に行うことがさらに好ましい。好ましくは、この期間において、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれより多くの測定を実行する。したがって、例えば、１時間、２時間、３時間または４時間の期間にわたり、５分、１０分または１５分の一定の間隔で、測定を実行することができる。
【００４９】
本発明にしたがう方法を実行することにおいて、酵素カルボン酸アンヒドラーゼのインヒビター（例えば、アセタゾラミド、メタゾラミド、ドルゾラミドおよびトピラメート）の存在は、測定可能な酸の生成の速度に関して改善をもたらす。
【００５０】
最初に、調べられるべき個体から唾液サンプルを採取した後で、二酸化炭素が、このサンプルから遊離する。唾液は、プロトンを吸収することによって二酸化炭素および水と反応する炭酸水素塩を含む。この反応は、酵素カルボン酸アンヒドラーゼによって触媒される。この唾液サンプルのｐＨは、サンプリングの直後に、二酸化炭素の遊離によって、約７．４から約８．０またはそれより高くに上昇する。最初に、適切な炭素源のこのサンプルへの添加、そして酸の形成の開始の際に、反応所要時間を不必要に増大させる初期のｐＨ上昇は、相殺されなければならない。したがって、本発明の方法の工程（ｂ）または工程（ｃ）への、酵素カルボン酸アンヒドラーゼのインヒビター（アセタゾラミド、メタゾラミド、ドルゾラミドおよびトピラメートなど）の添加は、完全な方法の所要時間をかなり減少させ得る。
【００５１】
上記インヒビターは、反応バッチ（唾液サンプルの微生物、炭素源およびさらなる必要に応じた成分から構成される）に、０．０１重量％〜５重量％の量で、例えば、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％またはそれより多い量で添加され得る。０．１重量％の量が特に好ましい。
【００５２】
ｐＨは、ｐＨ電極によって上記の期間内に決定され得る。ｐＨ電極の使用は、プラークサンプルまたは唾液サンプルからの微生物が、水溶液中で炭素源とともにインキュベートされることを必要とする。低下の速度、すなわち、時間単位に関するｐＨにおける低下は、上述の条件下において、サンプル中のう食原性細菌の濃度と相関するので、最初のサンプルにおけるう食原性細菌の定量的な測定または半定量的な測定は、測定されたｐＨと参照値とを比較することによって行うことができ、この参照値は、反応の同じ時点において、かつ同じ条件下で、既知の数のそれぞれのう食原性細菌を有するサンプルに基づいて、事前に取得されている。好ましくは、１回より多くの測定が実行され、１回の測定がなされる時点の各々に関して、少なくとも１つの対応する参照値が利用可能である。例えば、ｐＨの測定は、全部で４時間の期間内で１時間後、２時間後、３時間後および４時間後に実行され得る（実施例を参照のこと）。習慣的に、ｐＨが測定される規定の時点の各々に関して、既知の濃度の対応するう食原性細菌を使用して取得された、複数の参照値が利用可能である。炭素源を測定された濃度のう食原性細菌に添加した後、規定の時点におけるｐＨをそれぞれ反映する、多くの参照値は、未知の濃度のサンプル中のう食原性細菌の、比較的正確な定量的な測定または半定量的な測定を容易にする。例えば、ミュータンス連鎖球菌の測定における参照値は、例えば、１０３ｃｆｕ、１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕおよび１０６ｃｆｕの濃度に対応し得る。
【００５３】
代替的な実施形態において、ｐＨは、酸の形成に際して色が変化するｐＨ指示薬を使用して決定される。このｐＨ指示薬は、好ましくは、例えば、試験ストリップ上でのｐＨ指示薬および炭素源の組み合わせた固定化（ｊｏｉｎｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）によってか、あるいは希釈された、希釈されていないまたは濃縮されたプラークサンプルまたは唾液サンプルへの、ｐＨ指示薬および炭素源の同時の添加（好ましくは、単一の溶液の形態で）によって、炭素源と一緒にう食原性細菌に添加される。種々のｐＨ指示薬が、本発明にしたがう方法を実行するのに有用であることが実証されている。これらは、例えば、指示薬ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、ｍ−クレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッドおよびクロロフェノールレッドを含む。表２は、ｐＨの関数としてのこれらの指示薬の色の変化を示す。色の変化を検出できるようになるまで適用されるべきであるインキュベーション時間は、使用された炭素源および試験試薬、そしてまた、それらの、互いに対する絶対的かつ定量的な比および相対的かつ定量的な比にも依存する。好ましい実施形態において、ｐＨ指示薬の色の変化までの期間は、細菌、炭素源および指示薬を混合した後、６０分未満、４５分未満、３０分未満、２０分未満または１５分未満である。
【００５４】
呈色反応の速度は、とりわけ、反応バッチ中のバッファーの濃度を介して制御され得る。例えば、指示薬フェノールレッドを含む溶液において、リン酸バッファーの濃度を、５ｍＭから５０ｍＭに増大させることによって、呈色反応を約３の因数だけ遅くしたことが見出されている。したがって、バッファーの濃度によって、このう食のリスクの試験の感度を設定することができる。
【００５５】
【表２】
指示薬によって引き起こされた色の変化を、既知の数のそれぞれのう食原性細菌を含むサンプルを使用して、同一の条件下で前もって取得された、色の標準と比較する。この色の標準との比較は、元のサンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定を可能にする。同様に、この色の標準は多段階である、すなわち、それが、ｐＨの測定が実行された規定の時点の各々について、元の唾液サンプル中の規定の濃度のう食原性細菌に割り当てられ得る、複数の色合い（ｓｈａｄｅ）を含むことが特に好ましい。好ましくは、この色の標準は、濃度に関する差が裸眼で（すなわち、技術的なデバイスを使用しないで）認識され得るものである。この標準の個々の段階は、例えば、細菌の濃度の１０を底とする対数であり得、ここで、この濃度は、コロニー形成単位（ｃｆｕ）で測定される。したがって、例えば、この色の標準（これによって、ミュータンス連鎖球菌の濃度が評価され得る）は、１０３ｃｆｕ、１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕおよび１０６ｃｆｕの濃度に対応する４つの段階を含み得る。本発明にしたがった試験法で取得された色の変化は、４つの所定の色の強度と比較され得る。一般的に、調べられたプラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌の濃度についての報告は、それによって取得され得る；例えば、試験の状況において取得された色の強度が、１０４ｃｆｕと１０５ｃｆｕとの間の範囲のミュータンス連鎖球菌の濃度に起因することが報告され得る。これは、う食のリスクが高いことを示す。
【００５６】
さらなる局面において、本発明はまた、上記の方法を実行するための試験ストリップに関し、ここで、この試験ストリップの表面上に、少なくとも１つの炭素源および１つのｐＨ指示薬が、この試験ストリップと細菌の懸濁物とを接触させた際に、これらが、この試験ストリップから放出され、液体の細菌の懸濁物に溶解するような様式で固定化されている。この炭素源は、これが、例えば、ミュータンス連鎖球菌または乳酸杆菌属のようなう食原性細菌によって選択的に酸に発酵されるような様式で、上記のように選択される。このｐＨ指示薬は、酸の形成の際に色が変化し得、ここで、この変化は、裸眼で感知可能であることが好ましい。この試験ストリップが、固定化された形態の、上述された２つの成分のうちの１つを含むことが十分条件である。その他のそれぞれの成分は、例えば、滴下することによって、この試験ストリップに添加され得る。好ましい実施形態において、この炭素源、そしてまたこの指示薬の両方は、この試験ストリップの表面上に固定化される。この炭素源および／またはこのｐＨ指示薬は、ラッカー（上記を参照のこと）によって、この試験ストリップ上に固定化され得る。
【００５７】
上記試験ストリップは、好ましくは、１μｍ〜１０μｍの範囲の孔径を有するフィルター材料をさらに含む（またはこのフィルター材料から構成される）。好ましい孔径は、２μｍ〜８μｍの範囲、例えば、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍまたは８μｍである。上記炭素源および／または上記ｐＨ指示薬は、このフィルター材料上に固定化される。これは、このフィルター材料が、う食原性細菌の富化に直接使用され得るという利点を有する。
【００５８】
本発明はまた、上述された方法を実行するための試験キットに関し、このキットは：
（ａ）う食原性細菌の群によって酸へ発酵される炭素源；
（ｂ）酸の形成の際に色が変化するｐＨ指示薬；
（ｃ）サンプル中のう食原性細菌の濃度の半定量的な測定を容易にする色の標準、
を備える。
【００５９】
好ましくは、上記色の標準は、上記のような多段階の標準であり、参照の働きをする。さらに、上記キットは、上記方法を実行するための指示書を備え得る。もちろん、このキットはまた、１つまたはそれより多い、上述の試験ストリップを備え得る。
【００６０】
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
プラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定のための方法であって、
（ａ）プラークサンプルまたは唾液サンプル中に含まれる微生物を、必要に応じて濃縮する；
（ｂ）該微生物を、該う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源と接触させる；
（ｃ）該微生物と該炭素源とを、該う食原性細菌による選択的な酸の形成を促進する条件下でインキュベートする；
（ｄ）該炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも１回、ｐＨを決定する；
ここで、該サンプル中の該う食原性細菌の該半定量的な測定は、工程（ｄ）において決定されたｐＨと少なくとも１つの参照値とを比較することによって実行される、方法。
（項目２）
上記ｐＨが、ｐＨ電極を使用して工程（ｄ）で決定される、上記項目に記載の方法。
（項目３）
上記ｐＨが、酸の形成の際にその色が変化するｐＨ指示薬を使用して工程（ｄ）で決定される、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目４）
上記ｐＨ指示薬が、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、ｍ−クレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッドおよびクロロフェノールレッドからなる群より選択される、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目５）
工程（ｃ）が、上記う食原性細菌の増殖および／または酸の形成を有意には損ねない１つまたはそれより多くの抗生物質の存在下で進行する、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目６）
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）が、１つもしくはそれより多くのアミノ酸および／または１つもしくはそれより多くのアミノ酸含有ポリマーの存在下で進行する、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目７）
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）が、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびセリンからなる群より選択される１つもしくはそれより多くのアミノ酸の存在下で進行する、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目８）
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）が、アルギニンの存在下で進行する、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目９）
上記う食原性細菌がミュータンス連鎖球菌である、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１０）
上記ミュータンス連鎖球菌によって酸へ発酵される上記炭素源が、スクロース、マルトースおよびマルトトリオースからなる群より選択される、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１１）
上記う食原性細菌が乳酸杆菌属である、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１２）
工程（ｃ）が、バンコマイシン、クリンダマイシンおよびナイシンからなる群より選択される１つもしくはそれより多くの抗生物質の存在下で進行する、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１３）
上記乳酸杆菌属によって酸へ発酵される上記炭素源が、マンノース、ラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される、上記項目のいずれか１つに記載の方法。
（項目１４）
上記項目のいずれか１つに記載の方法を実行するための試験ストリップであって、ここで、
う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源、および酸の形成の際に色が変化するｐＨ指示薬が、該試験ストリップと細菌の懸濁物とが接触した際に、該炭素源と該ｐＨ指示薬とが該試験ストリップから放出されるような様式で、該試験ストリップの表面上に固定化されている、試験ストリップ。
（項目１５）
上記試験ストリップが、２０μｍ未満の孔径を有するフィルター材料を備え、該フィルター材料上に、上記炭素源および上記ｐＨ指示薬が固定化される、上記項目のいずれか１つに記載の試験ストリップ。
（項目１６）
上記炭素源および／または上記ｐＨ指示薬が、ポリマーラッカーによって上記試験ストリップ上に固定化されている、上記項目のいずれか１つに記載の試験ストリップ。
（項目１７）
上記項目のいずれか１つに記載の方法を実行するための試験キットであって、該試験キットは：
（ａ）う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源；
（ｂ）酸の形成の際に色が変化するｐＨ指示薬；
（ｃ）サンプル中の該う食原性細菌の濃度の半定量的な測定を可能にする色の標準
を備える、試験キット。
（項目１８）
上記色の標準が多段階の標準である、上記項目のいずれか１つに記載の試験キット。
（項目１９）
上記キットは、上記項目のいずれか１つに記載の少なくとも１つの試験ストリップを備える、上記項目のいずれか１つに記載の試験キット。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、純粋な培養物による酸の形成の速度論を示す。文字Ａ〜Ｇは、酸の産生が、ｐＨ指示薬に基づいて最初に検出された時点を示す。数字０〜５は、１時間、２時間および４時間後の、ｐＨの低下の段階を示す。したがって、次のコードを適用する：＜色の変化の時点＞＜１時間後の色の段階＞＜２時間後の色の段階＞＜４時間後の色の段階＞。
【図２】図２は、ＣＲＴバクテリアの結果とミュータンス連鎖球菌について４時間後の試験溶液Ｎｏ．１３６を使用した本発明にしたがう方法の結果との相関を示す。＞１０５ｃｆｕ／ｍｌのリスク閾値が、約６．５未満へのｐＨの低下に相当することが見られ得る。
【図３】図３は、ＣＲＴバクテリアの結果と乳酸杆菌属について４時間後の試験溶液Ｎｏ．９８を使用した本発明にしたがう方法の結果との相関を示す。＞１０５ｃｆｕ／ｍｌのリスク閾値が、約６．０未満へのｐＨの低下に相当することが見られ得る。
【図４】図４は、ＣＲＴバクテリアの結果と、乳酸杆菌属（Ａ、Ｂ）およびミュータンス連鎖球菌（Ｃ、Ｄ）について３時間後の、小児（Ａ、Ｃ、Ｅ）および成人（Ｂ、Ｃ）における、試験溶液ｎｏ．９８（Ａ、Ｂ）、試験溶液ｎｏ．１３６（Ｃ、Ｄ）または試験溶液ｎｏ．３２３（Ｅ）を使用した本発明にしたがう方法の結果との相関を示す。Ｙ−軸上の数字０〜５は、ｐＨ低下のレベルを示す（図１と比較する）。ｐＨ低下のレベルが、ＣＲＴバクテリアの値（Ｘ−軸）が上昇するとともに上昇することが明らかである。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
実施例
細菌株
この実験のために選択された株の保存培養物を、−８０℃の温度でＣＲＹＯＢＡＮＫ（Ｍａｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，ＣＲＹＯ／Ｍ）セラミック支持体で保存した。培養のために、セラミックリングを、１０ｍｌの栄養培地に入れ、１４時間〜７２時間インキュベートした。この培養物を、継代０（Ｐ０）と指定した。次に、１００μｌの培養物を、１０ｍｌの新鮮な培地に接種し、２４時間インキュベートした。継代２の培養物を、酸の産生についての続いての実験のために使用した。この場合において、この培養物を、６５０ｎｍでの吸収が約０．６〜１．０になるまで希釈した。この細菌の懸濁物を、８０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。培養上清を除去し、ペレットを、同じ容積の水（１０ｍｌ、脱イオンした、滅菌）に再懸濁した。サンプルを、再度遠心分離し（８０００ｒｐｍ、５分間）、上清を除去した。続いて、ペレットを、１ｍｌ（これは、元の容積の１／１０に相当する）の脱イオン水に再懸濁した。
【００６３】
インビトロにおける酸の産生
酸の産生を測定するために、４０μｌの細菌の懸濁物を、９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートまたは１．５ｍｌ 微小遠心分離チューブ内の１００μｌの試験溶液に添加した。この試験溶液は、適切なｐＨ指示薬（例えば、フェノールレッドおよびブロモクレゾールパープル）の他に、発酵可能な炭素源、５ｍＭのホスフェートまたは５ ｍＭのトリス−ＨＣｌ、および必要に応じて抗生物質またはアルギニンのようなアミノ酸を含んだ。使用した試験溶液を、規定の開始ｐＨに調整した。試験溶液の作製において、成分を、所望の最終容積の７５％の容積の脱イオン水に溶解させた。次に、適切なｐＨに調整し、この混合物を、脱イオン水を使用して計算された容積まで満たした。作製された溶液を冷蔵庫で保存し、２週間以内に使用した。
【００６４】
上記細菌の懸濁物をそれぞれの試験溶液に添加した後、ｐＨ指示薬の色の変化を、一定の間隔で、参照サンプル（試験溶液のみ）に対して視覚的に評価した。それらの間、サンプルを、３７℃のインキュベーターに保存した。酸の形成を、試験溶液の色の変化によって視覚的に（光学測定デバイスによる補助を受けずに）記載した。この研究の結果を、図１に示す表に列挙する。
【００６５】
本発明の状況下で使用された試験溶液の組成を、以下の表３に記載する。
【００６６】
【表３−１】
【００６７】
【表３−２】
さらに、アミノ酸または尿素の添加が、指示薬フェノールレッドの色が完全に黄色に変わる期間に及ぼす影響を上記のように試験した（以下の表４を参照のこと）。
【００６８】
【表４−１】
唾液サンプルを使用した臨床調査
本発明の方法にしたがう、唾液サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定が、証明されたう食リスク試験ＣＲＴ（登録商標）バクテリアの結果と相関するか否かを調査するために、およそ８０個の唾液サンプルを、ＣＲＴ（登録商標）バクテリア試験、ならびに本発明の試験溶液１３６および試験溶液９８（表３を参照のこと）を使用して、並行して研究した。
【００６９】
被験者を指示して、パラフィンペレット（ＣＲＴ、Ｉｖｏｃｌａｒ Ｖｉｖａｄｅｎｔ ＡＧ、Ｓｃｈａａｎ、Ｌｉｅｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ）を３０秒間、咀嚼し、そして刺激された唾液を吐き出させた。次に、この被験者に、このパラフィンペレットをさらに５分間咀嚼するように指示し、唾液を、ネジ付き蓋（ｓｃｒｅｗ ｌｉｄ）を有する５０ｍｌ プラスチックチューブに収集した。ＣＲＴ（登録商標）バクテリア試験は、唾液中に存在するミュータンス連鎖球菌と乳酸杆菌属との並行した半定量的な検出、およびその被験体を４つの異なるリスク段階のうちの１つに分類することを可能にする。この試験を、以下のように実行した。
１．サンプルチューブから寒天培地の支持体を取り外す。
２．このチューブの底にＮａＨＣＯ３錠剤をおく。
３．寒天培地の両方の表面から保護フィルムを注意深く取り外す；この過程で、寒天培地の表面を触らない。
４．寒天培地の表面を引っ掻かずに、ピペットを使用して、各々の寒天培地の表面を５０μｌの唾液で完全に湿らす。
５．滴らせることによって過剰な唾液を排出する。
６．上記寒天培地の支持体をこのチューブに戻し、しっかりと閉める。
７．インキュベーションキャビネット（例えば、Ｃｕｌｔｕｒａ／Ｉｖｏｃｌａｒ Ｖｉｖａｄｅｎｔ）内で、３７℃、４８時間〜７２時間、このチューブを直立させて保管する。
８．インキュベーションキャビネットからこのチューブを取り出した後、各々の場合におけるミュータンス連鎖球菌または乳酸杆菌属のコロニー密度を、添付の標準の対応する写真と比較する。
【００７０】
段階ＣＲＴ ０〜１（約１０３ｃｆｕに相当する）、段階ＣＲＴ １〜２（約１０４ｃｆｕに相当する）、段階ＣＲＴ ２〜３（約１０５ｃｆｕに相当する）および段階ＣＲＴ ３（約１０５ｃｆｕに相当する）への分類を実行した。次に、同じ唾液サンプルの、各々の場合についての５０μｌのアリコートを、５０μｌの試験溶液１３６（ミュータンス連鎖球菌について）または試験溶液９８（乳酸杆菌属について）とインキュベートし、ｐＨ電極を使用するか、または指示薬の色の変化に基づいて、ｐＨを、各々の場合においてサンプルへの炭素源の添加から１時間後、２時間後、３時間後および４時間後に測定した。この結果を、本明細書の以下にまとめる。
【００７１】
【表４−２】
ＣＲＴバクテリアと測定されたｐＨとの間の相関が、統計的に有意であったことが見出された（図２および図３を参照のこと）。
【００７２】
本発明の方法にしたがう唾液サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定が、小児および成人において、確立されたう食リスク試験ＣＲＴ（登録商標）バクテリアの結果と相関するか否かを試験するために、成人の７０個の唾液サンプルおよび小児の１１１個の唾液サンプルを、ミュータンス連鎖球菌について試験改変物（ｔｅｓｔ ｖａｒｉａｎｔ）１３６および３２３、ならびに乳酸杆菌属について試験改変物９８、ならびに本発明にしたがう試験溶液を使用して調べた。
【００７３】
ＣＲＴ（登録商標）バクテリア試験および対応するレベルでの分類を、上記のように実行した（「唾液サンプルを使用した臨床調査」と比較すること）。ＣＲＴ（登録商標）バクテリア試験を実行した後、次に、同じ唾液サンプルのアリコートを、それぞれ試験溶液１３６または３２３（ミュータンス連鎖球菌について）および試験溶液９８（乳酸杆菌属について）とともに１：１でインキュベートし、ｐＨ値を、指示薬の色の変化の補助下で、サンプルへの炭素源の添加から３時間後に測定した。この結果を、図４に示す。試験溶液９８と一緒になった唾液サンプルにおける酸の形成のレベルが、乳酸杆菌属についてのＣＲＴ（登録商標）バクテリアの値と相関することは明らかである（図４Ａ、４Ｂ）。同様に、試験溶液１３６（図４Ｃ、４Ｄ）および試験溶液３２３（図４Ｅ）と一緒になった唾液サンプルの酸の形成のレベルが、ミュータンス連鎖球菌についてのＣＲＴ（登録商標）バクテリア試験から得られた結果と相関する。
【００７４】
統計分析の結果を、以下の表５にまとめる。
【００７５】
【表５】
唾液サンプルの濃縮についての調査
１回の試験に必要とされる時間を受動的濾過（ｐａｓｓｉｖｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって唾液サンプルを濃縮することによって短くすることができるか否かを確認するために、９つの濃縮した唾液サンプルおよび９つの濃縮していない唾液サンプル中のミュータンス連鎖球菌の検出を比較した。この目的のために、直径５ｍｍの孔を、プラスチックディスクに穿孔した。これらの孔を、下からフィルター材料（ガラスファイバー）で密封した。ディスクとフィルターとを、このプラスチックディスクと吸引フリース（セルロース）との間にこのフィルターが配置されるような様式でこの吸引フリースの上においた。６０μｌの唾液サンプルを、孔のうちの１つを通してこのフィルター上に添加した。続いて、２０μｌの試験溶液１３６を、このフィルターに添加した。濾過の完了後に、この吸引フリースを、このディスクおよびこのフィルターから分離し、このプラスチックディスクとこのフィルターを、３７℃で最長４時間インキュベートした。
【００７６】
比較の目的のために、６０μｌの唾液を、マイクロタイタープレート内で６０μｌの試験溶液１３６と混合し、３７℃で最長２４時間インキュベートした。プラスチックディスクおよびマイクロタイタープレートにおいて、ｐＨの低下のレベルを、３０分、４５分、６０分、１２０分および１８０分のインキュベーション時間の後に、指示薬の色の変化によって測定した。両方の方法を、互いに、そしてＣＲＴ（登録商標）バクテリア試験（ＣＲＴ ＳＭ）と比較した（以下の表における０〜５の色の微妙な差異を比較する）
【００７７】
【表６】
示された色の変化は、測定されたＣＲＴ値と相関する。したがって、フィルターを通して唾液サンプルを濃縮した後に、４５分後に生じた色の変化が、マイクロタイタープレートにおいて１２０分後に生じるものと匹敵するものであることが理解され得る。したがって、上述されたサンプルの濃縮は、かなり短い時間で本発明の方法を遂行することを可能にする。
【００７８】
摘要
本発明は、唾液および／またはプラークのサンプル中のう食原性細菌を半定量的に測定するための方法に関し、ここで、プラークまたは唾液のサンプルに含まれる微生物を、炭素源と接触させる。この炭素源は、上記う食原性細菌によって酸に発酵される。次に、この微生物を、上記う食原性細菌による選択的な酸の形成を可能にする条件下でインキュベートする。次に、この酸の形成を、この炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも一回ｐＨを決定することによって検出し、ここで、上記ｐＨと少なくとも１つの参照値とを比較することによって、上記サンプル中のう食原性細菌を半定量的に測定する。さらに、本発明は、このような方法を実行するためのキットを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定のための方法であって、
（ａ）プラークサンプルまたは唾液サンプル中に含まれる微生物を、必要に応じて濃縮する；
（ｂ）該微生物を、該う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源と接触させる；
（ｃ）該微生物と該炭素源とを、該う食原性細菌による選択的な酸の形成を促進する条件下でインキュベートする；
（ｄ）該炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも１回、ｐＨを決定する；
ここで、該サンプル中の該う食原性細菌の該半定量的な測定は、工程（ｄ）において決定されたｐＨと少なくとも１つの参照値とを比較することによって実行される、方法。
【請求項２】
前記ｐＨが、ｐＨ電極を使用して工程（ｄ）で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐＨが、酸の形成の際にその色が変化するｐＨ指示薬を使用して工程（ｄ）で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨ指示薬が、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、ｍ−クレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッドおよびクロロフェノールレッドからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）が、前記う食原性細菌の増殖および／または酸の形成を有意には損ねない１つまたはそれより多くの抗生物質の存在下で進行する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）が、１つもしくはそれより多くのアミノ酸および／または１つもしくはそれより多くのアミノ酸含有ポリマーの存在下で進行する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）が、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびセリンからなる群より選択される１つもしくはそれより多くのアミノ酸の存在下で進行する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）が、アルギニンの存在下で進行する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記う食原性細菌がミュータンス連鎖球菌である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ミュータンス連鎖球菌によって酸へ発酵される前記炭素源が、スクロース、マルトースおよびマルトトリオースからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記う食原性細菌が乳酸杆菌属である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）が、バンコマイシン、クリンダマイシンおよびナイシンからなる群より選択される１つもしくはそれより多くの抗生物質の存在下で進行する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記乳酸杆菌属によって酸へ発酵される前記炭素源が、マンノース、ラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項３〜１３のいずれか一項に記載の方法を実行するための試験ストリップであって、ここで、
う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源、および酸の形成の際に色が変化するｐＨ指示薬が、該試験ストリップと細菌の懸濁物とが接触した際に、該炭素源と該ｐＨ指示薬とが該試験ストリップから放出されるような様式で、該試験ストリップの表面上に固定化されている、試験ストリップ。
【請求項１５】
前記試験ストリップが、２０μｍ未満の孔径を有するフィルター材料を備え、該フィルター材料上に、前記炭素源および前記ｐＨ指示薬が固定化される、請求項１４に記載の試験ストリップ。
【請求項１６】
前記炭素源および／または前記ｐＨ指示薬が、ポリマーラッカーによって前記試験ストリップ上に固定化されている、請求項１４または１５に記載の試験ストリップ。
【請求項１７】
請求項３〜１３のいずれか一項に記載の方法を実行するための試験キットであって、該試験キットは：
（ａ）う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源；
（ｂ）酸の形成の際に色が変化するｐＨ指示薬；
（ｃ）サンプル中の該う食原性細菌の濃度の半定量的な測定を可能にする色の標準
を備える、試験キット。
【請求項１８】
前記色の標準が多段階の標準である、請求項１７に記載の試験キット。
【請求項１９】
前記キットは、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの試験ストリップを備える、請求項１７または１８に記載の試験キット。
【請求項１】
プラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定のための方法であって、
（ａ）プラークサンプルまたは唾液サンプル中に含まれる微生物を、必要に応じて濃縮する；
（ｂ）該微生物を、該う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源と接触させる；
（ｃ）該微生物と該炭素源とを、該う食原性細菌による選択的な酸の形成を促進する条件下でインキュベートする；
（ｄ）該炭素源の添加後、１２時間の期間内で少なくとも１回、ｐＨを決定する；
ここで、該サンプル中の該う食原性細菌の該半定量的な測定は、工程（ｄ）において決定されたｐＨと少なくとも１つの参照値とを比較することによって実行される、方法。
【請求項２】
前記ｐＨが、ｐＨ電極を使用して工程（ｄ）で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐＨが、酸の形成の際にその色が変化するｐＨ指示薬を使用して工程（ｄ）で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨ指示薬が、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、ｍ−クレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッドおよびクロロフェノールレッドからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）が、前記う食原性細菌の増殖および／または酸の形成を有意には損ねない１つまたはそれより多くの抗生物質の存在下で進行する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）が、１つもしくはそれより多くのアミノ酸および／または１つもしくはそれより多くのアミノ酸含有ポリマーの存在下で進行する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）が、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびセリンからなる群より選択される１つもしくはそれより多くのアミノ酸の存在下で進行する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）が、アルギニンの存在下で進行する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記う食原性細菌がミュータンス連鎖球菌である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ミュータンス連鎖球菌によって酸へ発酵される前記炭素源が、スクロース、マルトースおよびマルトトリオースからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記う食原性細菌が乳酸杆菌属である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）が、バンコマイシン、クリンダマイシンおよびナイシンからなる群より選択される１つもしくはそれより多くの抗生物質の存在下で進行する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記乳酸杆菌属によって酸へ発酵される前記炭素源が、マンノース、ラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項３〜１３のいずれか一項に記載の方法を実行するための試験ストリップであって、ここで、
う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源、および酸の形成の際に色が変化するｐＨ指示薬が、該試験ストリップと細菌の懸濁物とが接触した際に、該炭素源と該ｐＨ指示薬とが該試験ストリップから放出されるような様式で、該試験ストリップの表面上に固定化されている、試験ストリップ。
【請求項１５】
前記試験ストリップが、２０μｍ未満の孔径を有するフィルター材料を備え、該フィルター材料上に、前記炭素源および前記ｐＨ指示薬が固定化される、請求項１４に記載の試験ストリップ。
【請求項１６】
前記炭素源および／または前記ｐＨ指示薬が、ポリマーラッカーによって前記試験ストリップ上に固定化されている、請求項１４または１５に記載の試験ストリップ。
【請求項１７】
請求項３〜１３のいずれか一項に記載の方法を実行するための試験キットであって、該試験キットは：
（ａ）う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源；
（ｂ）酸の形成の際に色が変化するｐＨ指示薬；
（ｃ）サンプル中の該う食原性細菌の濃度の半定量的な測定を可能にする色の標準
を備える、試験キット。
【請求項１８】
前記色の標準が多段階の標準である、請求項１７に記載の試験キット。
【請求項１９】
前記キットは、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの試験ストリップを備える、請求項１７または１８に記載の試験キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−２４０８５（Ｐ２０１２−２４０８５Ａ）
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５６７４６（Ｐ２０１１−１５６７４６）
【出願日】平成２３年７月１５日（２０１１．７．１５）
【出願人】（５０１１５１５３９）イフォクレール ヴィヴァデント アクチェンゲゼルシャフト (54)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｖｏｃｌａｒ Ｖｉｖａｄｅｎｔ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｂｅｎｄｅｒｅｒｓｔｒ．２ ＦＬ−９４９４ Ｓｃｈａａｎ Ｌｉｅｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１５日（２０１１．７．１５）
【出願人】（５０１１５１５３９）イフォクレール ヴィヴァデント アクチェンゲゼルシャフト (54)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｖｏｃｌａｒ Ｖｉｖａｄｅｎｔ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｂｅｎｄｅｒｅｒｓｔｒ．２ ＦＬ−９４９４ Ｓｃｈａａｎ Ｌｉｅｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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