がん、特に、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんを発症する素因を診断するための客観的方法を、本明細書において記載する。一態様において、診断法は、ＰＲＭＴ１遺伝子の発現レベルを決定する工程を含む。本発明は、がん等の、例えば、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がん等のＰＲＭＴ１関連疾患の治療において有用な治療剤をスクリーニングする方法をさらに提供する。本発明は、細胞増殖を阻害して、ＰＲＭＴ１関連疾患の症状を治療または軽減する方法をさらに提供する。本発明はまた、二本鎖分子およびそれをコードするベクターを含む生成物、ならびにそれらを含む組成物も特色とする。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本願は、２００８年８月２７日付で出願された米国特許仮出願第６１／１９０，４１６号の恩典を主張するものである。その内容全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、がん、特に、膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんを検出する方法、ならびにそれらを発症する素因を診断する方法に関する。本発明は、ＰＲＭＴ１の過剰発現を伴うがん、特に、膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんの治療および予防のための候補化合物をスクリーニングする方法にも関する。さらに、本発明は、ＰＲＭＴ１遺伝子発現を低下させる二本鎖分子およびその使用に関する。特に、本発明は、ＰＲＭＴ１に関する。
【背景技術】
【０００３】
真核生物のゲノムは、ヌクレオソームが連なったものであるクロマチンへと収納されており、各ヌクレオソーム内では、１４６塩基対（ｂｐ）のＤＮＡが、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４などのコアヒストンタンパク質の八量体に巻き付いている（非特許文献１）。クロマチンは、遺伝材料への調節因子の接近を調整する動的な構造である。それゆえに、ＤＮＡへの接近を必要とする転写およびその他の細胞プロセスは、クロマチン構造によって調節されており、したがって、これらの細胞プロセスが正常に機能するためには、クロマチン開閉の際の諸イベントの正確な協調および組織化が極めて重要である。ヒストンのメチル化は、遺伝子調節のための重要なプラットフォームとして浮上している。ヒストンＨ３またはＨ４の特定のリジンは、モノメチル化、ジメチル化、またはトリメチル化を受けることがあり、この調節モードをさらに一層複雑にしている（非特許文献２）。さらに、これらの修飾は、遺伝子発現の活性化（Ｈ３Ｋ４、Ｈ３Ｋ３６、およびＨ３Ｋ７９）、またはサイレンシング（Ｈ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ２７、およびＨ４Ｋ２０）のいずれかのシグナル伝達を行うことができる（非特許文献３〜４）。転写調節に対するこれらの効果は、細胞分化からＸ染色体不活性化にわたる生物学的影響を有する（非特許文献３、５〜６）。歴史的には、ヒストンのメチル化は永続的な修飾と見なされていた。しかしながら、過去の数年の間に、幾つかのグループが、ヒストン脱メチル化酵素が存在する証拠を提供した（非特許文献７〜１０）。したがって、この修飾は、細胞の生理学的機能を動的にかつ様々に調節し得ると想定されている。
【０００４】
がん等の疾患におけるヒストンメチル化システムの生物学的重要性が、これらの修飾に関与する酵素の機能分析によって、より明らかになっている。ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）が、これらの修飾を担う酵素であり、リジン残基またはアルギニン残基のいずれかに特異的である。アルギニンメチル化は、ＨＭＴａｓｅのＰＲＭＴ／ＣＡＲＭファミリーによって触媒され、リジンメチル化は、ＳＥＴドメインを含むＨＭＴａｓｅによって行われる。ヒストンおよびその他の核タンパク質のアルギニンメチル化は、ヒトでは９つのメンバーを含むＰＲＭＴ（タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ）のファミリーによって行われる（非特許文献１１〜１２）。ＰＲＭＴは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性のメチル化を用いて、１個または２個のメチル基を付加することによりアルギニン側鎖のグアニジノ窒素を修飾する（非特許文献１３）。脱メチル化生成物に関して、ＰＲＭＴは、非対称性ＮＧ，ＮＧ−ジメチルアルギニンを触媒するＩ型酵素と、ＰＲＭＴ５、ＰＲＭＴ７、およびＰＲＭＴ９からなり、対称性ＮＧ，ＮＧ−ジメチル化をもたらすＩＩ型酵素とに分類される（非特許文献１２〜１３）。その他のヒストン修飾と同様に、ヒストンアルギニンメチル化は、転写調節に寄与しており、ファミリーメンバーのサブセットによって触媒される：ＰＲＭＴ１はＨ４／Ｈ２ＡをＲ３でメチル化し（非特許文献１４）、ＰＲＭＴ４／ＣＡＲＭ１（コアクチベーター関連アルギニンメチルトランスフェラーゼ１）はＨ３をＲ１７／Ｒ２６でメチル化し（非特許文献１５〜１６）、ＰＲＭＴ５はＨ３をＲ８で、Ｈ４／Ｈ２ＡをＲ３でメチル化する（非特許文献１７）。ヒストンを修飾するＰＲＭＴは、転写因子との相互作用によってクロマチンへとリクルートされ、遺伝子の活性化および抑制を調節する（非特許文献１２）。
【０００５】
ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＳＭＹＤ３は、そのメチルトランスフェラーゼ活性によって、細胞の増殖を刺激し、ヒトの発がんにおいて重要な役割を果たすことが、以前に示された（非特許文献１８〜２４）。さらにまた、幾つかのヒストンメチルトランスフェラーゼも、ヒト細胞の悪性化に関係し得ることが示された（非特許文献２５〜２７）。この種の証拠によると、ヒストンメチルトランスフェラーゼの機能障害は、ヒトの発がんに正に寄与する可能性があるが、ヒストンメチル化異常とがんとの間の関係の一般的な理解は、未だ明確にはなっていない。本発明はこれらおよびその他の必要性に応えるものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Luger K, et al., Nature 1997;389:251-260
【非特許文献２】Strahl BD, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:14967-14972
【非特許文献３】Martin C and Zhang Y, Nat Rev Mol Cell Biol 2005;6:838-849
【非特許文献４】Sims RJ, 3rd, et al., Trends Genet 2003;19:629-639
【非特許文献５】Kouzarides T, Curr Opin Genet Dev 2002;12:198-209
【非特許文献６】Margueron R, et al., Curr Opin Genet Dev 2005;15:163-176
【非特許文献７】Tsukada Y, et al., Nature 2006;439:811-816
【非特許文献８】Shi Y, Lan F, et al., Cell 2004;119:941-953
【非特許文献９】Klose RJ, et al., Nature 2006;442:312-316
【非特許文献１０】Cloos PA, et al., Nature 2006;442:307-311
【非特許文献１１】Boisvert FM, et al., Sci STKE 2005;2005:re2
【非特許文献１２】Cook JR, et al., Biochem Biophys Res Commun 2006;342:472-481
【非特許文献１３】Bedford MT and Richard S, Mol Cell 2005;18:263-272
【非特許文献１４】Wang H, et al., Science 2001;293:853-857
【非特許文献１５】Schurter BT, et al., Biochemistry 2001;40:5747-5756
【非特許文献１６】Bauer UM, et al., EMBO Rep 2002;3:39-44
【非特許文献１７】Pal S, et al., Mol Cell Biol 2004;24:9630-9645
【非特許文献１８】Tsuge M, et al., Nat Genet 2005;37:1104-1107
【非特許文献１９】Liu C, et al., Cancer Res 2007;67:2626-2631
【非特許文献２０】Hamamoto R, et al., Cancer Sci 2006;97:113-118
【非特許文献２１】Hamamoto R, et al., Nat Cell Biol 2004;6:731-740
【非特許文献２２】Chen LB, et al., World J Gastroenterol 2007;13:5718-5724
【非特許文献２３】Kunizaki M, et al., Cancer Res 2007;67:10759-10765
【非特許文献２４】Silva FP, et al., Oncogene 2008;27:2686-2692
【非特許文献２５】Sparmann A and van Lohuizen M, Nat Rev Cancer 2006;6:846-856
【非特許文献２６】Takeshita F, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:12177-12182
【非特許文献２７】Schneider R, et al., Trends Biochem Sci 2002;27:396-402
【発明の概要】
【０００７】
本発明において、ヒトの発がんに寄与することができるメチルトランスフェラーゼを同定することを目的として、臨床組織におけるＰＲＭＴファミリーメンバーの発現プロファイルが確認された。
【０００８】
本発明において、ＰＲＭＴ１が数種類のがん細胞において過剰発現されていることが、ＲＴ−ＰＣＲによって同定された。ＰＲＭＴ１は、成人正常器官にはほとんど発現していなかったことから、有害作用が最小限である新規治療アプローチのための適切で有望な分子標的である。機能的には、がん細胞株におけるｓｉＲＮＡによる内在性ＰＲＭＴ１のノックダウンが、がん細胞増殖の劇的な抑制をもたらし、このことは、がん細胞の生存能の維持における必須の役割を実証している。
【０００９】
したがって、本発明は、生検材料などの対象由来の生物学的試料におけるＰＲＭＴ１の発現レベルを決定することにより、対象におけるがん、特に、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんを診断またはその素因を決定する方法を特色とする。正常対照レベルと比較したＰＲＭＴ１の発現のレベルの増加は、対象が、がん、特に、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんに罹患しているか、またはそれらを発症するリスクを有することを示す。該方法においては、ＰＲＭＴ１遺伝子を適切なプローブによって検出してもよく、またはＰＲＭＴ１タンパク質を抗ＰＲＭＴ１抗体によって検出してもよい。
【００１０】
本発明は、ＰＲＭＴ１遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を阻害する剤を同定する方法をさらに提供する。さらに、本発明は、がん等の、例えば、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がん等のＰＲＭＴ１関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤、またはＰＲＭＴ１遺伝子を過剰発現している細胞の増殖を阻害する候補剤を同定する方法を提供する。該方法はインビトロまたはインビボで実施され得る。試験剤の非存在下の場合と比較した、ＰＲＭＴ１遺伝子の発現レベルおよび／またはその遺伝子産物の生物学的活性における減少は、その試験剤が、ＰＲＭＴ１の阻害剤であること、ならびに例えば、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんにおけるがん性細胞等の、ＰＲＭＴ１遺伝子を過剰発現している細胞の増殖を阻害するために使用され得ることを示す。
【００１１】
別の局面において、本発明は、ＰＲＭＴ１の発現および／またはＰＲＭＴ１タンパク質の機能を阻害する剤を投与することにより、ＰＲＭＴ１を過剰発現しているがん性細胞の増殖を阻害する方法を提供する。好ましくは、剤は阻害性の核酸（例えば、アンチセンス、リボザイム、二本鎖分子）である。剤は、二本鎖分子を提供するための核酸分子またはベクターであり得る。ＰＲＭＴ１遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の二本鎖分子を、標的細胞へ導入することによって、遺伝子の発現を阻害することができる。本発明は、対象におけるＰＲＭＴ１を過剰発現しているがん性細胞の増殖を阻害する方法も提供する。該方法は、がん、特に、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんを治療または予防するために有用である。別の局面において、本発明は、活性成分としての二本鎖分子またはそれをコードするベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む、がんを治療または予防するための薬学的組成物に関する。本発明において提供される二本鎖分子は、細胞に導入された場合に、ＰＲＭＴ１遺伝子の発現を阻害し、かつＰＲＭＴ１を過剰発現しているがん性細胞の増殖を阻害する特性を有する。例えば、そのような分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の８０３〜８２１位に対応する配列を標的とする。本発明の分子は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は標的配列を含む配列を含み、アンチセンス鎖はセンス鎖に相補的な配列を含む。分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した膀胱組織におけるＰＲＭＴ１遺伝子発現の定量分析およびＰＲＭＴ１タンパク質の細胞内局在を示す。Ａ：ＰＲＭＴ１の発現プロファイル。膀胱がんのコホートおよび正常膀胱試料における遺伝子発現を研究するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した。比較定量化の変法であるＰｆａｆｆｌの方法を使用して、相対的な遺伝子発現を評価した。Ｂ：正常組織および腫瘍組織におけるＰＲＭＴ１遺伝子発現を箱髭図によって示す。Ｐ値はマンホイットニーＵ検定を使用して算出した。Ｃ：Ｔ−ＲＥｘ２９３−ＰＲＭＴ１細胞において外因的に発現させたＶ５タグ付きＰＲＭＴ１タンパク質のウェスタンブロット分析。Ｔ−ＲＥｘ−２９３（モック）およびＴ−ＲＥｘ−ＣＡＴを陰性対照として使用した。Ｄ：Ｖ５タグ付きＰＲＭＴ１タンパク質を、Ｆｌｐ−Ｉｎ Ｔ−ＲＥｘ細胞内に外因的に発現させ、抗Ｖ５モノクローナル抗体により染色した。該タンパク質を、Ａｌｅｘａ５４６結合型二次抗マウスＩｇＧ抗体によって可視化した（左パネル）。核を、ＤＡＰＩにより対比染色した（中央パネル）。Ａｌｅｘａ５４６およびＤＡＰＩのマージ像（右パネル）。
【図２】ｃＤＮＡマイクロアレイ分析に基づく２９種の正常組織におけるＰＲＭＴ１の相対的な遺伝子発現を示す。個々の組織に由来するポリ（Ａ）＋ＲＮＡの１２．５μｇ分量、および２９種の組織全てに由来する汎用対照としての等量のポリ（Ａ）＋ＲＮＡの混合物を、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ色素およびＣｙ３−ｄＣＴＰ色素によりそれぞれ標識した。ＨＥＡ：心臓、ＬＵＮ：肺、ＬＩＶ：肝臓、ＫＩＤ：腎臓、ＡＤＩ：腸間膜脂肪、ＢＭ：骨髄、ＢＲＡ：脳、ＣＯＬ：結腸、ＦＢＲＡ：胎児脳、ＦＫＩＤ：胎児腎臓、ＦＬＩＶ：胎児肝臓、ＦＬＵＮ：胎児肺、ＬＮ：リンパ節、ＭＧ：乳腺、ＯＶＡ：卵巣、ＰＡＮ：膵臓、ＰＬＡ：胎盤、ＰＲＯ：前立腺、ＳＣ：脊髄、ＳＧ：脊髄神経節、ＳＩ：小腸、ＳＫＭ：骨格筋、ＳＰＬ：脾臓、ＳＴＯ：胃、ＴＥＳ：精巣、ＴＨＹＭ：胸腺、ＴＨＹＲ：甲状腺、ＴＲＡ：気管、ＵＴＥ：子宮。
【図３】膀胱がん細胞および肺がん細胞の増殖に対するＰＲＭＴ１の関与を示す。Ａ：ＳＷ７８０膀胱がん細胞におけるＰＲＭＴ１発現に対するＰＲＭＴ１−ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＲＭＴ１＃２）および対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＰ）の効果。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖をトランスフェクトした細胞から抽出されたＲＮＡを使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｂ：肺がん細胞（Ａ５４９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＬＣ３１９、ＳＢＣ５）および膀胱がん細胞（ＳＷ７８０、ＳＣａＢＥＲ）の増殖に対するｓｉＲＮＡの効果をｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ ８により分析した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
態様の説明
定義
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、本明細書で使用される場合、特に指定のない限り、「少なくとも１つの」を意味する。
【００１４】
ｃＤＮＡ分子などの「単離された」または「精製された」核酸分子は、組換え技術によって作製された場合には、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まないものであり得、または、化学合成された場合には、前駆化学物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。好ましい態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は、単離または精製されている。
【００１５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをさすために、互換可能に本明細書中で使用される。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーのみならず、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣体などの天然には存在しない残基である、アミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００１６】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸をさし、かつ、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体をさす。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされたもの、ならびに細胞内で翻訳後に修飾されたもの（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造（水素に結合したα炭素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をさす。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸と異なる構造を有するが、類似した機能を有する化学物質をさす。
【００１７】
アミノ酸は、本明細書中、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨された、それらの一般的に公知の３文字記号または１文字記号により言及される場合もある。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、特に指定のない限り、互換可能に使用され、アミノ酸と同様に、それらの一般的に認められている１文字表記により言及される。アミノ酸と同様に、それらには、天然に存在する核酸ポリマーおよび天然には存在しない核酸ポリマーの両方が包含される。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、または核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから構成され得る。
【００１９】
ＰＲＭＴ１遺伝子またはＰＲＭＴ１タンパク質
本発明は、ＰＲＭＴ１をコードする遺伝子が、非がん性組織と比較して、数種類のがんにおいて過剰発現されているという発見に一部基づく。ＰＲＭＴ１のｃＤＮＡは１１３１ヌクレオチド長である。ＰＲＭＴ１の核酸配列およびポリペプチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２にそれぞれ示されているものに限定されるとはみなされない。配列データはまた、以下のアクセッション番号を介して入手可能である。
ＰＲＭＴ１：ＢＣ１０９２８３、ＮＭ＿００１５３６、ＮＭ＿１９８３１９またはＮＭ＿１９８３１８（これらの開示全体が参照により本明細書に組み入れられる）
【００２０】
本発明の一局面によると、機能的等価物も「ＰＲＭＴ１ポリペプチド」であると見なされる。本明細書において、タンパク質（例えば、ＰＲＭＴ１ポリペプチド）の「機能的等価物」とは、そのタンパク質と等価な生物学的活性を有するポリペプチドである。すなわち、ＰＲＭＴ１タンパク質の生物学的能力を保持している任意のポリペプチドが、本発明において、そのような機能的等価物として使用され得る。そのような機能的等価物には、ＰＲＭＴ１タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列と比べて、１つまたは複数のアミノ酸が置換されているか、欠失しているか、付加されているか、または挿入されているものが含まれる。あるいは、該ポリペプチドは、それぞれのタンパク質の配列に対して少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも呼ばれる）、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％の相同性、多くの場合は約９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有するアミノ酸配列から構成されていてもよい。他の態様において、該ポリペプチドは、ＰＲＭＴ１遺伝子の天然に存在するヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされていてもよい。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、それを作製するために使用された細胞もしくは宿主、または利用された精製法に依って、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態における変動を有していてもよい。にもかかわらず、本発明のヒトＰＲＭＴ１タンパク質のものと等価な機能を有する限り、それは本発明の範囲内である。
【００２２】
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、核酸分子が、典型的には核酸の複合混合物中において、その標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とは検出可能にハイブリダイズしない条件をさす。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下では異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍとは、平衡状態で、標的に相補的なプローブの５０％が、標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、核濃度での）温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡時に、プローブの５０％が占有される）。ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても、ストリンジェントな条件を達成することができる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、以下のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーションと、５０℃での０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳによる洗浄。
【００２３】
本発明との関連において、ヒトＰＲＭＴ１タンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件を、当業者は規定どおりに選択することができる。例えば、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ ｂｕｆｆｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ）を使用して、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを実施し、標識されたプローブを添加し、６８℃で１時間以上加熱することにより、ハイブリダイゼーションを実施することができる。例えば、低ストリンジェントな条件においては、以下の洗浄工程を実施することができる。例示的な低ストリンジェントな条件には、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが含まれ得る。多くの場合、高ストリンジェンシー条件が好んで使用される。例示的な高ストリンジェンシー条件には、２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳで２０分間、室温での３回の洗浄、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分間、３７℃での３回の洗浄、および１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分間、５０℃での２回の洗浄が含まれ得る。しかしながら、温度および塩濃度などの幾つかの因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす場合があり、当業者は、必要なストリンジェンシーを達成するために適切に因子を選択することができる。
【００２４】
一般的に、タンパク質内の１つまたは複数のアミノ酸の改変は、タンパク質の機能に影響を与えないことが知られている。実際に、変異したタンパク質または改変されたタンパク質、あるアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入、および／または付加することにより改変されているアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物学的活性を保持することが公知である（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6 （1984）；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10：6487-500 （1982）；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13 （1982））。したがって、タンパク質の変化が類似の機能を有するタンパク質をもたらす場合、単一のアミノ酸、もしくは少ない比率のアミノ酸を変えるアミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、または「保存的改変」であるとみなされるものが、本発明との関連において許容可能であることを、当業者は認識するであろう。
【００２５】
タンパク質の活性が維持される限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかしながら、アミノ酸配列の５％以下を変えることが一般的に好ましい。したがって、好ましい一態様において、そのような変異体において変異させるべきアミノ酸の数は、一般的には、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１０アミノ酸以下、より好ましくは６アミノ酸以下、さらに好ましくは３アミノ酸以下である。
【００２６】
変異されるアミノ酸残基は、好ましくは、アミノ酸側鎖の特性が保存される異なるアミノ酸に変異される（保存的アミノ酸置換として公知のプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および以下の官能基または特徴を共通に有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含有している側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含有している側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含有している側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含有している側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族を含有している側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。例えば、以下の８つの群は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有している：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
【００２７】
そのような保存的に改変されたポリペプチドは、本ＰＲＭＴ１タンパク質に含まれる。しかしながら、本発明は、これらに限定されず、ＰＲＭＴ１タンパク質は、ＰＲＭＴ１タンパク質の生物学的活性が少なくとも１つ保持される限り、非保存的改変を含む。さらに、改変されたタンパク質は、多型バリアント、種間相同体、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるものを除外しない。
【００２８】
さらに、本発明のＰＲＭＴ１遺伝子には、ＰＲＭＴ１タンパク質のそのような機能的等価物をコードするポリヌクレオチドが包含される。ＰＲＭＴ１タンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するためには、ハイブリダイゼーションに加えて、タンパク質をコードするＤＮＡの配列情報（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に基づき合成されたプライマーを使用した、遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。ヒトＰＲＭＴ１遺伝子およびヒトＰＲＭＴ１タンパク質と機能的に等価なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、それぞれ、通常、元のヌクレオチド配列またはそのアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは、典型的には４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％〜９５％以上の相同性をさす。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」のアルゴリズムに従い、決定され得る。
【００２９】
がんを診断するための方法
ＰＲＭＴ１の発現は、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんにおいて特異的に上昇することが見出された（図１および表３）。したがって、本明細書中で同定されるＰＲＭＴ１遺伝子、ならびにその転写産物および翻訳産物は、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がん等のがんのマーカーとして、および試料中のＰＲＭＴ１の発現を測定することにより、診断における有用性が見出される。対象由来の試料と正常試料との間でＰＲＭＴ１の発現レベルを比較することにより、それらのがんを診断または検出することが可能である。特に、本発明は、対象におけるＰＲＭＴ１の発現レベルを決定することにより、がんを診断または検出するための方法を提供する。本発明において、がんとは、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんを示し、本方法によって診断可能な肺がんには、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣが含まれる。さらに、肺腺がんおよび肺扁平上皮細胞がん（ＳＣＣ）を含むＮＳＣＬＣも、本発明によって診断または検出することができる。
【００３０】
あるいは、本発明は、対象由来の生物学的試料におけるＰＲＭＴ１遺伝子の発現レベルを決定する工程を含む、対象由来の膵臓組織試料におけるがん細胞を検出または同定するための方法を提供し、前記遺伝子の正常対照レベルと比較した前記発現レベルの上昇は、組織にがん細胞が存在する、または組織にがん細胞が存在する疑いがあることを示す。
【００３１】
本発明によれば、対象の状態を検査するための中間的な結果を提供することができる。そのような中間的な結果は、医師、看護師、またはその他の実務者が、対象が疾患に罹患していることを診断するのを補助するために、付加的な情報と組み合わせてもよい。あるいは、本発明を、対象由来の組織におけるがん性細胞を検出するために使用することができ、かつ本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するために有用な情報を、医師に提供することができる。
【００３２】
例えば、本発明によれば、対象から入手された組織におけるがん細胞の存在に関して疑いがある場合、組織病理学、公知の血中腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過等を含む、疾患の異なる局面に加えて、ＰＲＭＴ１遺伝子の発現レベルを考慮することにより、臨床的な決定に到達することができる。例えば、幾つかの周知の血中診断用膵臓がんマーカーは、ＡＣＴ、ＡＦＰ、ＢＣＡ２２５、ＢＦＰ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＣＡ１２５、ＣＡ１３０、ＣＡ６０２、ＣＥＡ、ＤＵＰＡＮ−２、ＩＡＰ、ＫＭＯ−１、αマクログロブリン、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＮＳＥ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＳＣＣ、ｓＩＣＡＭ−１、ＳＬＸ、ＳＰ１、ＳＯＤ、Ｓｐａｎ−１、ＳＴＮ、ＴＫ活性、ＴＰＡ、ＹＨ−２０６、エラスターゼＩ、サイトケラチン−１９フラグメント、およびＣＹＦＲＡ２１−１を含む。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現分析の結果は、対象の疾患状態のさらなる診断のための中間的な結果として役立つ。
【００３３】
具体的には、本発明は、以下の［１］〜［１０］の方法を提供する：
［１］対象由来の生物学的試料におけるＰＲＭＴ１の発現レベルを決定する工程を含む、対象におけるがんを検出または診断する方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増加が、該対象ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクを有することを示す、方法；
［２］発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも１０％大きい、［１］に記載の方法；
［３］発現レベルが、
（ａ）ＰＲＭＴ１の配列を含むｍＲＮＡを検出する方法、
（ｂ）ＰＲＭＴ１のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する方法、および
（ｃ）ＰＲＭＴ１のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物学的活性を検出する方法
の中から選択される方法によって検出される、［１］に記載の方法；
［４］がんが膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんである、［１］に記載の方法；
［５］発現レベルが、前記遺伝子の遺伝子転写物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより決定される、［３］に記載の方法；
［６］発現レベルが、遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体の結合を、該遺伝子の発現レベルとして検出することにより決定される、［３］に記載の方法；
［７］生物学的試料が生検材料、痰、または血液を含む、［１］に記載の方法；
［８］対象由来の生物学的試料が上皮細胞を含む、［１］に記載の方法；
［９］対象由来の生物学的試料ががん細胞を含む、［１］に記載の方法；ならびに
［１０］対象由来の生物学的試料ががん性上皮細胞を含む、［１］に記載の方法。
【００３４】
がんを診断する方法を、以下に、より詳細に説明する。
【００３５】
本方法によって診断される対象は、好ましくは、哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
診断を実施するためには、診断すべき対象から生物学的試料を採取することが好ましい。ＰＲＭＴ１の目的の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生物学的材料を、決定のための生物学的試料として使用することができる。生物学的試料には、がんを診断することが望まれるかまたはがんに罹患していることが疑われる体組織、ならびに生検材料、血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、生物学的試料は、上皮細胞、より好ましくは、がん性上皮細胞、またはがん性であることが疑われる組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含有している。さらに、必要であれば、得られた体組織および体液から細胞を精製し、次いで、それを生物学的試料として使用してもよい。
【００３７】
本発明によると、対象由来の生物学的試料におけるＰＲＭＴ１の発現レベルが決定される。当技術分野で公知の方法を使用して、転写（核酸）産物レベルで、発現レベルを決定することができる。例えば、ＰＲＭＴ１のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを使用して定量することができる。検出は、チップ上またはアレイ上で実施されてもよい。アレイの使用は、ＰＲＭＴ１を含む複数の遺伝子（例えば、様々ながんに特異的な遺伝子）の発現レベルを検出するために好ましい。当業者は、ＰＲＭＴ１の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＰＲＭＴ１のｃＤＮＡをプローブとして使用することができる。必要であれば、色素、蛍光、および同位体などの好適な標識によりプローブを標識し、ハイブリダイズした標識の強度として、遺伝子の発現レベルを検出してもよい。
【００３８】
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により、プライマーを使用して、ＰＲＭＴ１の転写産物を定量することもできる。そのようなプライマーも、利用可能な遺伝子の配列情報に基づき調製され得る。例えば、実施例で使用されるプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７および８、または９および１０）が、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによる検出のために利用され得るが、本発明はそれらに限定されない。
【００３９】
特に、本発明の方法のために使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、または低ストリンジェントな条件の下で、ＰＲＭＴ１のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーが、その標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件をさす。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的なハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高い温度で観察される。一般的に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。Ｔｍとは、平衡時に、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。概して標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡時に、プローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合には少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合には少なくとも約６０℃である条件である。ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても、ストリンジェントな条件を達成することができる。
【００４０】
あるいは、本発明の診断のために、翻訳産物を検出することもできる。例えば、ＰＲＭＴ１タンパク質の量を決定することができる。翻訳産物として該タンパク質の量を決定する方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルであってもよく、またはポリクローナルであってもよい。さらに、断片がＰＲＭＴ１タンパク質との結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を、検出のために使用することができる。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野で周知であり、本発明においては、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するために、任意の方法を利用することができる。
【００４１】
翻訳産物に基づきＰＲＭＴ１遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、ＰＲＭＴ１タンパク質に対する抗体を使用した免疫組織化学分析を介して染色の強度を観察することができる。すなわち、強い染色の観察は、増加したタンパク質の存在を示し、同時に、ＰＲＭＴ１遺伝子の高い発現レベルを示す。
【００４２】
さらに、診断の正確性を改善するために、ＰＲＭＴ１遺伝子の発現レベルに加えて、他のがん関連遺伝子、例えば、がんにおいて異なって発現されることが公知の遺伝子の発現レベルも決定することができる。
【００４３】
生物学的試料におけるＰＲＭＴ１遺伝子を含むがんマーカー遺伝子の発現レベルは、対応するがんマーカー遺伝子の対照レベルから、例えば、１０％、２５％、もしくは５０％増加している場合；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上に増加している場合、増加していると見なされ得る。
【００４４】
疾患状態（がん性であるか非がん性であるか）が既知である対象から以前に採取され保存されていた試料を使用することによって、試験生物学的試料と同時に対照レベルを決定することができる。あるいは、疾患状態が既知である対象由来の試料において以前に決定されたＰＲＭＴ１遺伝子の発現レベルを分析することによって得られた結果に基づき、統計的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞からの発現パターンのデータベースであってもよい。さらに、本発明の一局面によると、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと、生物学的試料におけるＰＲＭＴ１遺伝子の発現レベルを比較してもよい。患者由来の生物学的試料のものと類似した組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患状態が既知である集団におけるＰＲＭＴ１遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は、当技術分野で公知の任意の方法によって入手され得る。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を、標準値として使用することができる。
【００４５】
本発明との関連において、がん性ではないことが既知の生物学的試料から決定された対照レベルは、「正常対照レベル」と呼ばれる。他方、対照レベルががん性生物学的試料から決定される場合、それは「がん性対照レベル」と呼ばれる。
【００４６】
ＰＲＭＴ１遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して増加しているか、またはがん性対照レベルと類似している場合、対象は、がんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有すると診断され得る。さらに、複数のがん関連遺伝子の発現レベルが比較される場合、試料とがん性である参照との間の遺伝子発現パターンの類似性は、対象が、がんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有することを示す。
【００４７】
試験生物学的試料の発現レベルと対照レベルとの間の差は、細胞のがん性状態または非がん性状態によって発現レベルが異ならないことが既知の対照核酸、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して標準化され得る。例示的な対照遺伝子には、βアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
がんを診断するためのキット
本発明は、がんを診断するためのキットを提供する。好ましくは、がんは膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、または精巣がんである。具体的には、キットは、以下の群から選択され得る、対象由来の生物学的試料におけるＰＲＭＴ１遺伝子の発現を検出するための試薬を少なくとも１つ含む：
（ａ）ＰＲＭＴ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＰＲＭＴ１タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＰＲＭＴ１タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【００４９】
ＰＲＭＴ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するための好適な試薬には、ＰＲＭＴ１のｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、ＰＲＭＴ１のｍＲＮＡに特異的に結合するかまたはＰＲＭＴ１のｍＲＮＡを特異的に同定する核酸が含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドの例は、ＰＲＭＴ１のｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブである。当技術分野で周知の方法に基づき、これらの種類のオリゴヌクレオチドを調製することができる。必要であれば、ＰＲＭＴ１のｍＲＮＡを検出するための試薬を、固体マトリックス上に固定化してもよい。さらに、ＰＲＭＴ１のｍＲＮＡを検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【００５０】
他方、ＰＲＭＴ１タンパク質を検出するための好適な試薬には、ＰＲＭＴ１タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルであってもよく、またはポリクローナルであってもよい。さらに、断片がＰＲＭＴ１タンパク質との結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を、試薬として使用することができる。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野で周知であり、本発明においては、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するために、任意の方法を利用することができる。さらに、直接結合または間接標識技術を介して、シグナル生成分子によって抗体を標識してもよい。標識、および抗体を標識して抗体とその標的との結合を検出する方法は、当技術分野で周知であり、任意の標識および方法を本発明のために利用することができる。さらに、ＰＲＭＴ１タンパク質を検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【００５１】
さらに、生物学的試料において、例えば、発現されたＰＲＭＴ１タンパク質による細胞増殖活性を測定することによって、生物学的活性を決定してもよい。例えば、細胞を、対象由来の生物学的試料の存在下で培養し、次いで、増殖のスピードを検出するか、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、生物学的試料の細胞増殖活性を決定することができる。必要であれば、ＰＲＭＴ１のｍＲＮＡを検出するための試薬を、固体マトリックス上に固定化してもよい。さらに、ＰＲＭＴ１タンパク質の生物学的活性を検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【００５２】
キットは、前記試薬を複数含有していてもよい。さらに、キットは、ＰＲＭＴ１遺伝子に対するプローブまたはＰＲＭＴ１タンパク質に対する抗体を結合させるための固体マトリックスおよび試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性の対照試薬、ならびにＰＲＭＴ１タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含んでいてもよい。例えば、がんに罹患しているかまたは罹患していない対象から入手された組織試料が、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用のための説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の材料をさらに含んでいてもよい。これらの試薬等は、ラベルを有する容器に含まれ得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラス、またはプラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。
【００５３】
本発明の一態様として、試薬がＰＲＭＴ１のｍＲＮＡに対するプローブである場合、少なくとも１つの検出部位が形成されるよう、該試薬を多孔質ストリップなどの固体マトリックスの上に固定化することができる。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、各々が１つの核酸（プローブ）を含有している複数の部位を含んでいてもよい。テストストリップは、陰性対照および／または陽性対照のための部位も含んでいてもよい。あるいは、対照部位は、テストストリップから分離されたストリップの上に位置していてもよい。任意で、異なる検出部位は、固定化された核酸を、異なる量、含有していてもよい。すなわち、第１の検出部位に、より高い量を含有し、その後の部位に、より少ない量を含有していてもよい。試験試料の添加時、検出可能シグナルを示す部位の数が、試料中に存在するＰＲＭＴ１のｍＲＮＡの量の定量的な指標を提供する。検出部位は、任意の適切に検出可能な形状で配置され得、典型的には、テストストリップ幅にわたるバーまたはドットの形状である。
【００５４】
本発明のキットは、さらに、陽性対照試料またはＰＲＭＴ１標準試料を含んでいてもよい。ＰＲＭＴ１陽性試料を採取することにより本発明の陽性対照試料を調製してもよく、次いで、これらのＰＲＭＴ１レベルをアッセイする。陽性対照試料のＰＲＭＴ１レベルは、例えば、カットオフ値より大きい。
【００５５】
抗がん化合物のスクリーニング
本発明との関連において、本スクリーニング法により同定される剤は、任意の化合物、または幾つかの化合物を含む組成物であり得る。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験剤は、単一の化合物であっても、または化合物の組み合わせであってもよい。化合物の組み合わせを前記方法において使用する場合には、化合物を逐次的に接触させてもよく、または同時に接触させてもよい。
【００５６】
任意の試験剤、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製されたタンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマーなどの核酸構築物を含む）、および天然化合物を、本発明のスクリーニング法において使用することができる。本発明の試験剤は、（１）生物学的ライブラリ、（２）空間的にアドレス可能なパラレルな固相または液相のライブラリ、（３）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、および（５）アフィニティクロマトグラフィ選択を使用する合成ライブラリ法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法の多数のアプローチのいずれかを使用して入手され得る。アフィニティクロマトグラフィ選択を使用する生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリに適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12：145-67）。分子ライブラリの合成法の例は、当技術分野で見い出され得る（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90：6909-13；Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91：11422-6；Zuckermann et al., J Med Chem 37：2678-85, 1994；Cho et al., Science 1993, 261：1303-5；Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33：2059；Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33：2061；Gallop et al., J Med Chem 1994, 37：1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13：412-21を参照されたい）、またはビーズ上（Lam, Nature 1991, 354：82-4）、チップ上（Fodor, Nature 1993, 364：555-6）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（米国特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号、および第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89：1865-9）、もしくはファージ上（Scott and Smith, Science 1990, 249：386-90；Devlin, Science 1990, 249：404-6；Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87：6378-82；Felici, J Mol Biol 1991, 222：301-10；米国特許出願第２００２１０３３６０号）に提示され得る。
【００５７】
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングされた化合物の構造の一部が、付加、欠失、および／または置換により変換された化合物は、本発明のスクリーニング法によって入手される剤に含まれる。
【００５８】
さらに、スクリーニングされた試験剤がタンパク質である場合、タンパク質をコードするＤＮＡを入手するためには、タンパク質の全アミノ酸配列を決定して、タンパク質をコードする核酸配列を推定することもできるし、または入手されたタンパク質の部分アミノ酸配列を分析して、その配列に基づきオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、そのプローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを入手することもできる。入手されたＤＮＡは、がんを治療または予防するための候補である試験剤の調製における有用性に関して確認される。
【００５９】
本明細書に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験剤は、ＰＲＭＴ１タンパク質に特異的に結合する抗体であってもよく、またはインビボで元のタンパク質の生物学的活性を欠くＰＲＭＴ１タンパク質の部分ペプチドに特異的に結合する抗体であってもよい。
【００６０】
試験剤ライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、本スクリーニング法のための試験剤の同定およびそのような剤のライブラリの構築に関するさらなる指針を以下に提供する。
【００６１】
（ｉ）分子モデリング
試験剤ライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知の化合物の分子構造、および／またはＰＲＭＴ１の分子構造の知識により容易になる。さらなる評価に適した試験剤を予備スクリーニングするための１つのアプローチは、試験剤とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
【００６２】
コンピュータモデリング技術により、選択された分子の三次元原子構造の可視化、およびその分子と相互作用する新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元構築物は、典型的には、選択された分子のＸ線結晶学的分析またはＮＭＲイメージングからのデータに依存する。分子動力学は力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測可能にし、結合特異性を完全にするための化合物および標的分子の構造の実験的操作を可能にする。一方または両方に軽微な変化が加えられた場合に、分子−化合物相互作用がどのようになるかを予測するには、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型コンピュータが必要とされ、それらは、通常、分子設計プログラムと使用者との間のユーザーフレンドリーなメニュー方式のインターフェースと連結される。
【００６３】
上記に概説された分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓが含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学の機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、相互作用的構築、改変、可視化、および分子の互いの挙動の分析を可能にする。
【００６４】
例えば、Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97：159-66；Ripka, New Scientist 1988, 54-8；McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29：111-22；Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291：189-93；Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236：125-40, 141-62；および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111：1082-90など、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングについては多数の論文に総説されている。
【００６５】
化学物質をスクリーニングし図示するその他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.（Pasadena，Calif.）、Allelix, Inc.（Mississauga，Ontario，Canada）、およびHypercube, Inc.（Cambridge，Ontario）などの会社から入手可能である。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31：722-9；Meng et al., J Computer Chem 1992, 13：505-24；Meng et al., Proteins 1993, 17：266-78；Shoichet et al., Science 1993, 259：1445-50を参照されたい。
【００６６】
推定の阻害剤が同定されたならば、以下に詳述されるように、同定された推定の阻害剤の化学構造に基づき、多数のバリアントを構築するため、コンビナトリアルケミストリー技術を利用することができる。その結果得られた推定の阻害剤または「試験剤」のライブラリは、膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がん等のがんを治療または予防する試験剤の同定のために、本発明の方法を使用してスクリーニングされ得る。
【００６７】
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成
試験剤のコンビナトリアルライブラリは、既知の阻害剤に存在しているコア構造の知識を含む、合理的薬物設計プログラムの一部として作製され得る。このアプローチにより、ハイスループットスクリーニングを容易にする適度のサイズにライブラリを維持することが可能になる。あるいは、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を簡便に合成することにより、単純な、特に短い、重合体分子ライブラリを構築することもできる。この後者のアプローチの一例は、６アミノ酸長の全ペプチドのライブラリである。そのようなペプチドライブラリは、６アミノ酸配列のあらゆる順列を含み得る。この種類のライブラリは、線形コンビナトリアルケミカルライブラリと称される。
【００６８】
コンビナトリアルケミカルライブラリの調製は、当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれかにより作製され得る。コンビナトリアルケミカルライブラリには、ペプチドライブラリ（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号；Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37：487-93；Houghten et al., Nature 1991, 354：84-6を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作製するためのその他の化学を使用することもできる。そのような化学には、ペプチド（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えば、ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー（diversomers）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90：6909-13）、ビニロガス（vinylogous）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114：6568）、グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114：9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116：2661）、オリゴカルバメート（Cho et al., Science 1993, 261：1303）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59：658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement；Sambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14（3）：309-14およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照されたい）、炭水化物ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274：1520-22；米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1； 6（6）：624-31.；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号等を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
コンビナトリアルライブラリの調製のための装置は市販されている（例えば、３５７ ＭＰＳ、３９０ ＭＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ， Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｒａｉｎｉｎ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）、４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）、９０５０ Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を参照されたい）。さらに、コンビナトリアルライブラリ自体も多数市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， Ｎ．Ｊ．、Ｔｒｉｐｏｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ、３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｅｘｔｏｎ， ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｏｌｕｍｂｉａ， ＭＤ等を参照されたい）。
【００７０】
（ｉｉｉ）その他の候補
別のアプローチは、ライブラリを作製するために組換えバクテリオファージを使用する。「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249：386-90；Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87：6378-82；Devlin et al., Science 1990, 249：404-6）を使用すれば、極めて大きいライブラリを構築することができる（例えば、１０６〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用し、Ｇｅｙｓｅｎの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23：709-15；Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102：259-74）；およびＦｏｄｏｒらの方法（Science 1991, 251：767-73）がその例である。Ｆｕｒｋａら（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR：013； Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37：487-93）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびＲｕｔｔｅｒら（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験され得るペプチドの混合物を作製する方法を記載している。
【００７１】
アプタマーは、特定の分子標的に強固に結合する核酸から構成された巨大分子である。ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（Science. 249：505-510 （1990））は、アプタマーの選択のためのＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を開示している。ＳＥＬＥＸ法においては、核酸分子の大きなライブラリ（例えば、１０^１５個の異なる分子）をスクリーニングに使用することができる。
【００７２】
ＰＲＭＴ１と結合する化合物のスクリーニング
本発明において、正常器官では発現が見られないにもかかわらず、膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんにおいてＰＲＭＴ１の過剰発現が検出された（図１、２、および表３）。したがって、ＰＲＭＴ１遺伝子、およびその遺伝子によりコードされるタンパク質を使用して、ＰＲＭＴ１と結合する化合物をスクリーニングする方法を、本発明は提供する。がんにおけるＰＲＭＴ１の発現のため、ＰＲＭＴ１と結合する化合物は、がん細胞の増殖を抑制することが期待され、したがって、がんを治療または予防するのに有用である。したがって、本発明は、ＰＲＭＴ１ポリペプチドを使用して、がん細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングするための方法、およびがんを治療または予防するための化合物をスクリーニングするための方法を提供する。具体的には、このスクリーニング法の一態様は、以下の工程を含む：
（ａ）試験化合物を、ＰＲＭＴ１のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）前記ポリペプチドと試験化合物との間の結合活性を検出する工程；および
（ｃ）前記ポリペプチドと結合する試験化合物を選択する工程。
【００７３】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。
【００７４】
スクリーニングに使用されるＰＲＭＴ１ポリペプチドは、組換えポリペプチドもしくは自然界由来のタンパク質、またはそれらの部分ペプチドであり得る。試験化合物と接触させるポリペプチドは、例えば、精製されたポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
【００７５】
タンパク質、例えば、ＰＲＭＴ１ポリペプチドに結合するタンパク質を、ＰＲＭＴ１ポリペプチドを使用してスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。そのようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により、特に、以下のように実施され得る。ＰＲＭＴ１ポリペプチドをコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、およびｐＣＤ８などの外来遺伝子の発現ベクターに挿入することにより、宿主（例えば、動物）細胞等において発現させる。
【００７６】
発現に使用されるプロモーターは、一般に使用され得る任意のプロモーターであってよく、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson （ed.）, Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 （1982））、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91：217-23 （1990））、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108：193 （1991））、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152：684-704 （1987））、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8：466 （1988））、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84：3365-9 （1987））、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1：385-94 （1982））、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9：946 （1989））、ＨＳＶ ＴＫプロモーター等を含み得る。
【００７７】
外来遺伝子を発現させるための宿主細胞への遺伝子の導入は、任意の方法、例えば、エレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15：1311-26 （1987））、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7：2745-52 （1987））、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12：5707-17 （1984）；Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4：1641-3 （1984））、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76：1025-37 （1994）；Lamb et al., Nature Genetics 5：22-30 （1993）：Rabindran et al., Science 259：230-4 （1993））等に従い実施され得る。
【００７８】
ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、特異性が明らかなモノクローナル抗体のエピトープを導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質として、ＰＲＭＴ１遺伝子によりコードされるポリペプチドを発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを使用することができる（Experimental Medicine 13：85-90 （1995））。マルチクローニング部位の使用により、例えば、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現し得るベクターが、市販されている。また、融合によりＰＲＭＴ１ポリペプチドの特性が変化しないよう、数個〜十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することにより調製された融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）、インフルエンザ凝集ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−タグ）、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープと、これらを認識するモノクローナル抗体とを、ＰＲＭＴ１ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13：85-90 （1995））。
【００７９】
免疫沈降においては、適切な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物に、これらの抗体を添加することにより、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ＰＲＭＴ１ポリペプチド、該ポリペプチドとの結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。免疫沈降は、上記エピトープに対する抗体を使用する以外に、ＰＲＭＴ１ポリペプチドに対する、上記のように調製され得る抗体を使用して実施されてもよい。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えば、プロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースにより、免疫複合体を沈降させることができる。ＰＲＭＴ１遺伝子によりコードされるポリペプチドが、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製される場合には、グルタチオン−セファロース４Ｂなどのこれらのエピトープと特異的に結合する物質を使用して、ＰＲＭＴ１ポリペプチドに対する抗体を使用する場合と同様に免疫複合体を形成させることができる。
【００８０】
免疫沈降は、例えば、文献中の方法に従ってまたは準じて実施され得る（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York （1988））。
【００８１】
免疫沈降したタンパク質の分析には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般に使用され、結合したタンパク質は、適切な濃度を有するゲルを使用して、タンパク質の分子量により分析され得る。ＰＲＭＴ１ポリペプチドに結合したタンパク質は、クーマシー染色または銀染色などの一般の染色法によって検出することが困難であるため、細胞を、放射性同位体^３５Ｓ−メチオニンまたは^３５Ｓ−システインを含有している培養培地中で培養し、細胞内のタンパク質を標識し、タンパク質を検出することにより、タンパク質の検出感度を改善することができる。タンパク質の分子量が明らかである場合には、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製し、その配列を決定することができる。
【００８２】
ＰＲＭＴ１ポリペプチドに結合するタンパク質を、該ポリペプチドを使用してスクリーニングする方法として、例えば、ウエストウエスタンブロット分析（Skolnik et al., Cell 65：83-90 （1991））を使用することができる。具体的には、ＰＲＭＴ１ポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると予想される培養細胞から、ｃＤＮＡライブラリを、ファージベクター（例えば、ＺＡＰ）を使用して調製し、ＬＢ−アガロース上でタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質をフィルタ上に固定し、精製され標識されたＰＲＭＴ１ポリペプチドを上記フィルタと反応させ、ＰＲＭＴ１ポリペプチドに結合したタンパク質を発現しているプラークを標識によって検出することにより、ＰＲＭＴ１ポリペプチドに結合するタンパク質を入手することができる。ＰＲＭＴ１ポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの間の結合を利用するか、またはＰＲＭＴ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体、もしくはＰＲＭＴ１ポリペプチドと融合されるペプチドもしくはポリペプチド（例えば、ＧＳＴ）を利用することにより、標識され得る。放射性同位体または蛍光等を使用する方法も、使用することができる。
【００８３】
あるいは、本発明のスクリーニング法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton and Treisman, Cell 68：597-612 （1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10：286-92 （1994）」）。
【００８４】
ツーハイブリッドシステムにおいては、ＰＲＭＴ１ポリペプチドをＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合させ、酵母細胞において発現させる。ＰＲＭＴ１ポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると予想される細胞からのｃＤＮＡライブラリを、ライブラリが、発現された場合にＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域に融合するよう、調製する。次いで、ｃＤＮＡライブラリを上記酵母細胞に導入し、ライブラリに由来するｃＤＮＡを、検出された陽性クローンから単離する（本発明のポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞において発現される場合、その２つの結合がレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンを検出可能にする）。上記の単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入し、タンパク質を発現させることにより、ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を調製することができる。レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子に加えて、例えば、Ａｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等も使用することができる。
【００８５】
アフィニティクロマトグラフィを使用して、ＰＲＭＴ１遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する化合物をスクリーニングすることもできる。例えば、ＰＲＭＴ１ポリペプチドをアフィニティカラムの担体上に固定化し、本発明のポリペプチドに結合可能なタンパク質を含有している試験化合物をカラムに適用することができる。本明細書中の試験化合物は、例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験化合物を負荷した後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドに結合した化合物を調製することができる。試験化合物がタンパク質である場合には、入手されたタンパク質のアミノ酸配列を分析し、配列に基づきオリゴＤＮＡを合成し、オリゴＤＮＡをプローブとして使用してｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを入手する。
【００８６】
本発明においては、結合した化合物を検出または定量化する手段として、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを使用してもよい。そのようなバイオセンサーを使用した場合、極微量のポリペプチドのみを使用して、標識することなく、ＰＲＭＴ１ポリペプチドと試験化合物との間の相互作用を、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサーを使用して、本発明のポリペプチドと試験化合物との間の結合を評価することが可能である。
【００８７】
タンパク質だけでなくＰＲＭＴ１タンパク質に結合する化学化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、固定化されたＰＲＭＴ１ポリペプチドを合成化学化合物または天然物質バンクもしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、およびコンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットを使用したスクリーニング法（Wrighton et al., Science 273：458-64 （1996）；Verdine, Nature 384：11-13 （1996）；Hogan, Nature 384：17-9 （1996））が当業者に周知である。
【００８８】
ＰＲＭＴ１の生物学的活性を抑制する化合物のスクリーニング
本発明において、ＰＲＭＴ１タンパク質は、がん細胞の細胞増殖を促進する活性を有する（図３）。さらに、ヒストンおよびその他の核タンパク質のアルギニンメチル化は、ＰＲＭＴ（タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ）のファミリーによって行われる。ＰＲＭＴは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性のメチル化を用いて、１個または２個のメチル基を付加ことによりアルギニン側鎖のグアニジノ窒素を修飾する（Bedford MT and Richard S, Mol Cell 2005;18:263-272）。ＰＲＭＴ１は、ＰＲＭＴファミリーのメンバーのうちの１つであり、これもまた、メチルトランスフェラーゼ活性、特に、Ｈ４／Ｈ２Ａをアルギニン３でメチル化する能力を有することが実証されている（Wang H. et al, Science 2001; 293: 853-857）。これらの生物学的活性を使用して、本発明は、ＰＲＭＴ１を発現しているがん細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングするための方法、ならびにがんを治療または予防するための候補化合物をスクリーニングするための方法を提供し、そのようながんには、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんが含まれる。したがって、本発明は、以下の工程を含む、ＰＲＭＴ１遺伝子によりコードされるポリペプチドを使用して、がんを治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験化合物を、ＰＲＭＴ１のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する工程；および
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出されるポリペプチドの生物学的活性と比較して、ＰＲＭＴ１のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験化合物を選択する工程。
【００８９】
本発明によると、ＰＲＭＴ１の生物学的活性（例えば、細胞増殖活性またはメチルトランスフェラーゼ活性）の抑制に関する試験化合物、またはがんを治療もしくは予防するための候補化合物の治療効果を、評価することができる。したがって、本発明は、以下の工程を含む、ＰＲＭＴ１ポリペプチドまたはその断片を使用して、ＰＲＭＴ１の生物学的活性を抑制するための候補化合物、またはがんを治療もしくは予防するための候補化合物をスクリーニングする方法も提供する：
（ａ）試験化合物を、ＰＲＭＴ１ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる工程；および
（ｂ）工程（ａ）のポリペプチドまたは断片の生物学的活性を検出する工程；および
（ｃ）（ｂ）の生物学的活性を試験化合物の治療効果と相関させる工程。
【００９０】
そのようながんには、膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんが含まれる。本発明において、治療効果は、ＰＲＭＴ１ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性と相関し得る。例えば、試験化合物が、試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、ＰＲＭＴ１ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制または阻害する場合には、その試験化合物を、治療効果を有する候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験化合物が、試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、ＰＲＭＴ１ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制または阻害しない場合には、その試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
【００９１】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。
【００９２】
ＰＲＭＴ１タンパク質の生物学的活性を含む限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに使用することができる。そのような生物学的活性には、ＰＲＭＴ１タンパク質の細胞増殖活性またはメチルトランスフェラーゼ活性が含まれる。例えば、ＰＲＭＴ１タンパク質を使用することができ、これらのタンパク質と機能的に等価なポリペプチドも使用することができる。そのようなポリペプチドは、細胞により内因的にまたは外因的に発現され得る。
【００９３】
このスクリーニングにより単離される化合物は、ＰＲＭＴ１遺伝子によりコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することにより、その機能を阻害する分子をさす。この用語は、ＰＲＭＴ１をコードする遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害する分子もさす。さらに、このスクリーニングにより単離される化合物は、ＰＲＭＴ１ポリペプチドと分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）とのインビボ相互作用を阻害する化合物の候補である。
【００９４】
本方法において検出される生物学的活性が細胞増殖である場合、それは、例えば、ＰＲＭＴ１ポリペプチドを発現している細胞を調製し、試験化合物の存在下で細胞を培養し、細胞周期等を測定する、細胞増殖のスピードを決定することにより、および、例えば図３に示される生存細胞またはコロニー形成活性を測定することにより、検出され得る。ＰＲＭＴ１を発現している細胞の増殖のスピードを低下させる化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する。
【００９５】
より具体的には、方法は、以下の工程を含む：
（ａ）試験化合物を、ＰＲＭＴ１を過剰発現している細胞と接触させる工程；
（ｂ）細胞増殖活性を測定する工程；および
（ｃ）試験化合物の非存在下での細胞増殖活性と比較して、細胞増殖活性を低下させる試験化合物を選択する工程。
好ましい態様において、本発明の方法は、以下の工程をさらに含みうる：
（ｄ）ＰＲＭＴ１を全くまたはほとんど発現していない細胞に対して効果を及ぼさない試験化合物を選択する工程。
【００９６】
本方法において検出される生物学的活性がメチルトランスフェラーゼ活性である場合、メチルトランスフェラーゼ活性は、基質のメチル化に適した条件の下で、基質（例えば、ヒストンＨ４／Ｈ２Ａ、またはアルギニン３を含むそれらの断片）および補因子（例えば、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）とポリペプチドとを接触させ、かつ基質のメチル化レベルを検出することにより決定され得る。
【００９７】
より具体的には、方法は、以下の工程を含む：
［１］以下の工程を含む、ＰＲＭＴ１のメチルトランスフェラーゼ活性を測定する方法；
（ａ）ＰＲＭＴ１のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを接触させる工程；
（ｂ）基質のメチル化レベルを検出する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）のメチル化レベルをメチルトランスフェラーゼ活性と相関させることにより、メチルトランスフェラーゼ活性を測定する工程。
［２］基質がヒストンであるか、または少なくとも１つのメチル化領域を含むその断片である、［１］に記載の方法。
［３］基質がヒストンＨ４もしくはＨ２Ａであるか、または少なくとも１つのメチル化領域を含むそれらの断片である、［２］に記載の方法。
［４］メチル化領域がアルギニン３である、［３］に記載の方法。
［４］補因子がＳ−アデノシルメチオニンである、［１］に記載の方法。
［６］ポリペプチドを、メチル化増強剤の存在下で基質および補因子と接触させる、［１］に記載の方法。
［７］メチル化増強剤がＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）である、［１］に記載の方法。
【００９８】
本発明において、ＰＲＭＴ１ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性は、当技術分野で公知の方法によって決定され得る。例えば、ＰＲＭＴ１および基質を、好適なアッセイ条件の下で、標識されたメチルドナーと共にインキュベートすることができる。ヒストンＨ４ペプチドまたはヒストンＨ２Ａペプチド、およびＳ−アデノシル−［メチル−^１４Ｃ］−Ｌ−メチオニンまたはＳ−アデノシル−［メチル−^３Ｈ］−Ｌ−メチオニンを、好ましくは、それぞれ、基質およびメチルドナーとして使用することができる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびフルオログラフィーによって、ヒストンＨ４ペプチドまたはヒストンＨ２Ａペプチドへの放射標識の転移を検出することができる。あるいは、反応の後、ヒストンＨ４ペプチドまたはヒストンＨ２Ａペプチドを濾過によってメチルドナーから分離し、フィルター上に保持された放射標識の量をシンチレーション計数によって定量化してもよい。発色標識および蛍光標識等の、メチルドナーに付着させることができるその他の好適な標識、ならびにヒストンおよびヒストンペプチドへのこれらの標識の転移を検出する方法は、当技術分野で公知である。
【００９９】
あるいは、未標識のメチルドナー（例えば、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）、およびメチル化されたヒストンまたはヒストンペプチドを選択的に認識する試薬を使用して、ＰＲＭＴ１のメチルトランスフェラーゼ活性を決定することもできる。例えば、基質のメチル化が可能な条件の下で、メチル化されるＰＲＭＴ１基質およびメチルドナーをインキュベートした後、メチル化された基質を免疫学的な方法によって検出することができる。メチル化された基質を認識する抗体を使用した任意の免疫学的技術を、検出のために使用することができる。例えば、メチル化されたヒストンに対する抗体が市販されている（ａｂｃａｍ Ｌｔｄ．）。メチル化されたヒストンを認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡまたはイムノブロッティングを、本発明のために使用することができる。
【０１００】
本発明において、物質のメチル化を増強する剤を使用することができる。ＳＡＨＨまたはその機能的等価物が、好ましいメチル化増強剤のうちの１つである。剤は、物質のメチル化を増強し、それにより、より高い感度でメチルトランスフェラーゼ活性を決定することが可能となる。増強剤の存在下で、ＰＲＭＴ１を基質および補因子と接触させることができる。
【０１０１】
さらに、メチルトランスフェラーゼ活性を検出する本方法は、ＰＲＭＴ１ポリペプチドを発現する細胞を調製し、試験化合物の存在下で細胞を培養し、かつヒストンのメチル化レベルを、例えば、メチル化領域に特異的に結合する抗体を使用して決定することにより、実施されてもよい。
【０１０２】
より具体的には、方法は、以下の工程を含む：
［１］試験化合物を、ＰＲＭＴ１を発現している細胞と接触させる工程；
［２］ヒストンＨ４またはＨ２Ａアルギニン３のメチル化レベルを検出する工程；および
［３］試験化合物の非存在下でのメチル化レベルと比較して、メチル化レベルを低下させる試験化合物を選択する工程。
【０１０３】
本明細書中で定義される「生物学的活性を抑制する」とは、化合物の非存在下と比較した、ＰＲＭＴ１の生物学的活性の、好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、および最も好ましくは９０％の抑制である。
【０１０４】
ＰＲＭＴ１の発現を変える化合物のスクリーニング
本発明において、ｓｉＲＮＡによるＰＲＭＴ１の発現の減少は、がん細胞増殖の阻害をもたらす（図３および表４）。したがって、本発明は、ＰＲＭＴ１の発現を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。ＰＲＭＴ１の発現を阻害する化合物は、がん細胞の増殖を抑制すると予想され、したがって、がんを治療または予防するのに有用であり、そのようながんには、膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんが含まれる。したがって、本発明は、がん細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングするための方法、およびがんを治療または予防するための化合物をスクリーニングするための方法も提供する。本発明との関連において、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の工程を含み得る：
（ａ）候補化合物を、ＰＲＭＴ１を発現している細胞と接触させる工程；および
（ｂ）対照と比較して、ＰＲＭＴ１の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する工程。
【０１０５】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。
【０１０６】
ＰＲＭＴ１を発現している細胞には、例えば、膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、または精巣がんから樹立された細胞株が含まれ；そのような細胞を、本発明の上記スクリーニングのために使用することができる。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびフローサイトメトリー分析により推定され得る。本明細書中で定義される「発現レベルを低下させる」とは、ＰＲＭＴ１の発現レベルの、化合物の非存在下での発現レベルと比較した、好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％低下したレベル、および最も好ましくは少なくとも９５％低下したレベルである。本明細書中の化合物には、化学化合物、二本鎖ヌクレオチド等が含まれる。二本鎖ヌクレオチドの調製は前記説明にある。スクリーニング法において、ＰＲＭＴ１の発現レベルを低下させる化合物を、がんの治療または予防に使用される候補化合物として選択することができる。
【０１０７】
あるいは、本発明のスクリーニング法は、以下の工程を含み得る：
（ａ）ＰＲＭＴ１の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞に、候補化合物を接触させる工程；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現または活性を測定する工程；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる候補化合物を選択する工程。
【０１０８】
好適なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ディスコソマ種（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）であり、宿主細胞は、ＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＰＲＭＴ１の転写調節領域と接続することにより調製され得る。本明細書中のＰＲＭＴ１の転写調節領域は、転写開始部位から少なくとも５００ｂｐ上流、好ましくは１０００ｂｐ、より好ましくは５０００ｂｐまたは１００００ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含有しているヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離されてもよく、またはＰＣＲによって増幅されてもよい。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をこれらの遺伝子のいずれか１つの転写調節領域と接続することにより調製され得る。転写調節領域を同定するための方法、およびアッセイプロトコルも周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０１０９】
レポーター構築物を含有しているベクターを、宿主細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により（例えば、ルミノメーター、吸光度計、フローサイトメーター等を使用して）検出する。本明細書中で定義される「発現または活性を低下させる」とは、レポーター遺伝子の発現または活性の、化合物の非存在下と比較した、好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、および最も好ましくは少なくとも９５％の低下である。
【０１１０】
（ｉ）ＰＲＭＴ１ポリペプチドに結合する候補化合物；（ｉｉ）ＰＲＭＴ１ポリペプチドの生物学的活性（例えば、細胞増殖活性またはメチルトランスフェラーゼ活性）を抑制する／低下させる候補化合物；（ｉｉｉ）ＰＲＭＴ１の発現レベルを低下させる候補化合物をスクリーニングすることによって、がん（例えば、膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がん）を治療または予防する可能性を有する候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物が、がんを治療または予防する可能性は、がん治療剤を同定するための第２のスクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価されてもよい。例えば、ＰＲＭＴ１ポリペプチドに結合する化合物が前記のがんの活動を阻害する場合、このような化合物はＰＲＭＴ１特異的な治療効果を有すると結論付けることができる。
【０１１１】
二本鎖分子
本明細書で使用される場合、「単離された二本鎖分子」という用語は標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を意味し、例えば短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および短鎖干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ、例えばＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡとの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げる二本鎖ＲＮＡ分子をさす。ＤＮＡが、ＲＮＡが転写される鋳型である技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＲＮＡは、ＰＲＭＴ１のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＰＲＭＴ１のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方を含む。単一の転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方を有するように（例えばヘアピン）、ｓｉＲＮＡを構築してもよい。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれであってもよい。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列から構成され、かつその相補的な配列を介して共にアニーリングして二本鎖ＲＮＡ分子を形成している、２つのＲＮＡ分子の構築物をさす。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含み得る。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに相補的である第１および第２の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される、ステム−ループ構造を有するｓｉＲＮＡをさす。該領域の相補性および配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１および第２の領域はループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠如によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成される二本鎖ポリヌクレオチド分子を意味し、ＲＮＡおよびＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げる。本明細書において、ハイブリッドは、ＤＮＡから構成されるポリヌクレオチドとＲＮＡから構成されるポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、キメラは、二本鎖分子を含む鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含有し得ることを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、ＰＲＭＴ１のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＰＲＭＴ１のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方を含む。単一の転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方を有するように（例えばヘアピン）、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築してもよい。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれであってもよい。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列から構成され、かつ該相補的な配列を介して共にアニーリングして二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成している、２つの分子の構築物をさす。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方が、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成されるか（キメラ分子）、またはもう一つの選択肢として分子の一方がＲＮＡから構成され、もう一方がＤＮＡから構成される（ハイブリッド二本鎖）。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的である第１および第２の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される、ステム−ループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡをさす。該領域の相補性および配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１および第２の領域はループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠如によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「単離された核酸」は、その元の環境（例えば、天然物の場合は自然環境）から取り出した核酸であり、したがって、その自然状態から合成的に変化させた核酸である。本発明において、単離された核酸の例としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその誘導体が挙げられる。
【０１１９】
標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする、ＰＲＭＴ１に対する二本鎖分子は、遺伝子の通常一本鎖であるｍＲＮＡ転写物と結合し、それにより、翻訳に干渉し、したがって、タンパク質の発現を阻害することにより、ＰＲＭＴ１遺伝子によってコードされるＰＲＭＴ１タンパク質の産生を減少させるかまたは阻害する。本明細書中で実証されている通り、数種類のがん細胞株におけるＰＲＭＴ１の発現はｄｓＲＮＡによって阻害された（図３）。したがって、本発明は、ＰＲＭＴ１遺伝子を発現している細胞に導入された場合に、ＰＲＭＴ１遺伝子の発現を阻害することができる単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、後述されるものなどのｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムによって設計され得る。
【０１２０】
ＰＲＭＴ１標的配列には、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド８０３〜８２１位）のヌクレオチドが含まれる。
【０１２１】
具体的には、本発明は、以下の［１］〜［１８］の二本鎖分子を提供する：
［１］互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成され、細胞に導入された場合にＰＲＭＴ１のインビボ発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子；
［２］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド８０３〜８２１位）の標的配列に一致するｍＲＮＡに対して作用する、［１］に記載の二本鎖分子；
［３］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応する配列を含有している、［２］に記載の二本鎖分子；
［４］約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［３］に記載の二本鎖分子；
［５］約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［４］に記載の二本鎖分子；
［６］約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［５］に記載の二本鎖分子；
［７］約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［６］に記載の二本鎖分子；
［８］約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、［７］に記載の二本鎖分子；
［９］介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドから構成される、［１］に記載の二本鎖分子；
［１０］一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する二本鎖分子であって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、３〜２３ヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］と相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［９］に記載の二本鎖分子；
［１１］ＲＮＡから構成される、［１］に記載の二本鎖分子；
［１２］ＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成される、［１］に記載の二本鎖分子；
［１３］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１２］に記載の二本鎖分子；
［１４］センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１３］に記載の二本鎖分子；
［１５］ＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１２］に記載の二本鎖分子；
［１６］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５'末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方がＲＮＡである、［１５］に記載の二本鎖分子；
［１７］隣接領域が９〜１３ヌクレオチドから構成される、［１６］に記載の二本鎖分子；ならびに
［１８］３’オーバーハングを含有する、［２］に記載の二本鎖分子。
【０１２２】
本発明の二本鎖分子は以下でより詳細に説明される。
【０１２３】
細胞において標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖分子を設計する方法が知られている（例えば米国特許第６，５０６，５５９号（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい）。例えば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、Ａｍｂｉｏｎのウェブサイトから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）。
【０１２４】
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
【０１２５】
標的部位の選択
１．転写産物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、それぞれのＡＡの存在とその３’側に隣接した１９ヌクレオチドとを記録する。Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．は、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）および開始コドン近くの領域（７５塩基以内）に対してｓｉＲＮＡを設計することを避けることを推奨している。これは、これらの領域に調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体が、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
【０１２６】
２．潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）とを比較し、他のコード配列との相同性が大きい任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でのＮＣＢＩサーバーにあるＢＬＡＳＴを用いる（Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25（17）:3389-402）。
【０１２７】
３．合成のために適格である標的配列を選択する。評価するために、遺伝子の長さに沿って標的配列を幾つか選択するのが一般的である。
【０１２８】
上記のプロトコルを使用して、本発明の単離された二本鎖分子の標的配列を、ＰＲＭＴ１遺伝子に関して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７として設計した。
【０１２９】
上述の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、標的遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力について調査した。したがって、本発明は、ＰＲＭＴ１遺伝子に関して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド８０３〜８２１位）の配列を標的とする二本鎖分子を提供する。
【０１３０】
本発明の二本鎖分子は単一の標的ＰＲＭＴ１遺伝子配列を対象としてもよく、または複数の標的ＰＲＭＴ１遺伝子配列を対象としてもよい。
【０１３１】
上述のＰＲＭＴ１遺伝子の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子は、標的配列の核酸配列および／または該標的配列に相補的な配列を含有する単離されたポリヌクレオチドを含む。ＰＲＭＴ１遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例としては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の配列、および／またはこれらのヌクレオチドに相補的な配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。しかしながら、本発明はこの例に限定されず、上述の核酸配列における軽微な改変は、改変された分子がＰＲＭＴ１遺伝子の発現を抑制する能力を保持する限りは許容可能である。本明細書において、核酸配列と関連して使用される「軽微な改変」という句は、配列に対する核酸の１つ、２つ、または幾つかの置換、欠失、付加、または挿入を示す。
【０１３２】
本発明との関連において、核酸の置換、欠失、付加、および／または挿入に対し適用される「幾つか」という用語は、３〜７個、好ましくは３〜５個、さらに好ましくは３〜４個、さらに好ましくは３個の核酸残基を意味し得る。
【０１３３】
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例で利用される方法を用いて、その能力に関して試験することができる。本明細書の以下の実施例では、ＰＲＭＴ１遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖、またはそれに対して相補的なアンチセンス鎖から構成される二本鎖分子を、標準的な方法に従って、がん細胞株におけるＰＲＭＴ１遺伝子産物の産生を低減させる能力に関して、インビトロで試験した。さらに、例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞に比べた、候補二本鎖分子と接触させた細胞におけるＰＲＭＴ１遺伝子産物の低減は、例えば、実施例１における「定量的ＲＴ−ＰＣＲ」の項で述べられたＰＲＭＴ１のｍＲＮＡに対するプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより検出することができる。インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいてＰＲＭＴ１遺伝子産物の産生を低減する配列は、続いて、細胞増殖に及ぼすその阻害効果に関して試験することができる。インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列は、続いて、ＰＲＭＴ１遺伝子産物の産生の低減およびがん細胞増殖の低減を確認するために、がんを有する動物、例えばヌードマウス異種移植片モデルを用いて、これらのインビボ能力に関して試験することができる。
【０１３４】
単離されたポリヌクレオチドがＲＮＡまたはそれらの誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用される場合、「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチドユニット間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対合を表し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが改変ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合することができる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含有しない安定二本鎖を形成する。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。好ましい態様において、このような二本鎖は１０個のマッチ毎にわずか１個のミスマッチしか含有していない。特に好ましい態様では、二本鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二本鎖はミスマッチを含有しない。
【０１３５】
ポリヌクレオチドは好ましくは、ＰＲＭＴ１では１１３１ヌクレオチド長未満である。例えば、ポリヌクレオチドは、全ての遺伝子に関して、５００ヌクレオチド長未満、２００ヌクレオチド長未満、１００ヌクレオチド長未満、７５ヌクレオチド長未満、５０ヌクレオチド長未満、または２５ヌクレオチド長未満である。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＰＲＭＴ１遺伝子に対する二本鎖分子を形成するのに、または該二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するのに有用である。ポリヌクレオチドが二本鎖分子の形成に使用される場合、ポリヌクレオチドは１９ヌクレオチドより長く、好ましくは２１ヌクレオチドより長くてもよく、およびより好ましくは、約１９〜２５ヌクレオチドの長さを有する。あるいは、本発明の二本鎖分子は、センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、５００ヌクレオチド対未満、２００ヌクレオチド対未満、１００ヌクレオチド対未満、７５ヌクレオチド対未満、５０ヌクレオチド対未満、または２５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、二本鎖分子であってもよい。好ましくは、二本鎖分子は、約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する。さらに、二本鎖分子のセンス鎖は、好ましくは、５００ヌクレオチド未満、２００ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、７５ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、２８ヌクレオチド未満、２７ヌクレオチド未満、２６ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満を含み得、より好ましくは、約１９〜約２５ヌクレオチドを含み得る。
【０１３６】
本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含有し得る。当技術分野において公知の化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性、および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に取り込むことができる他の種類の化学修飾にも気づくであろう（ＷＯ０３／０７０７４４、ＷＯ２００５／０４５０３７）。一態様では、分解耐性の改善または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、非限定的に、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ塩基残基の組み込みが挙げられる（米国特許出願第２００６０１２２１３７号）。
【０１３７】
別の態様では、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的指向化効率を増大させるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、非限定的に、二本鎖分子の２つの相補鎖間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３’または５’末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチド、ならびに２’−デオキシリボヌクレオチドが挙げられる（ＷＯ２００４／０２９２１２）。別の態様では、標的ｍＲＮＡにおける、および／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性の増減に修飾を用いることができる（ＷＯ２００５／０４４９７６）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンに置換することができる。別の態様では、二本鎖分子が３’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３’末端のヌクレオチドオーバーハングヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置き換えることができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらに詳細には、公開文献、例えば米国特許出願第２００６０２３４９７０号が利用可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られた分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持していれば、任意の公知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に利用することができる。
【０１３８】
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合物、すなわちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）およびＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）から構成されるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方または両方上でＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成することができる。
【０１３９】
ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に該標的遺伝子の発現を阻害することが可能であれば、センス鎖がＤＮＡであり、アンチセンス鎖がＲＮＡであるか、またはその反対のいずれであってもよい。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドがＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドがＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に該標的遺伝子の発現を阻害する活性があれば、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるか、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるか、のいずれであってもよい。二本鎖分子の安定性を向上するためには、分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有する事が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、分子は発現の十分な阻害を誘導する範囲内でＲＮＡである事が必要である。
【０１４０】
キメラ型二本鎖分子の好ましい例では、二本鎖分子の上流部分領域（すなわちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）はＲＮＡである。好ましくは、上流部分領域は、センス鎖の５’側（５’末端）およびアンチセンス鎖の３’側（３’末端）を示す。あるいは、センス鎖の５’末端および／またはアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域が、上流部分領域と称される。すなわち、好ましい態様では、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方がＲＮＡから構成される。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型の二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：
５’−［−−−ＤＮＡ−−−］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’
：アンチセンス鎖、
センス鎖：
５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’
：アンチセンス鎖、および
センス鎖：
５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（−−−ＲＮＡ−−−）−５’
：アンチセンス鎖。
【０１４１】
上流部分領域は、好ましくは、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて９〜１３ヌクレオチドから構成されるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の好ましい例としては、ポリヌクレオチドの少なくとも上流半分の領域（センス鎖では５’側領域およびアンチセンス鎖では３’側領域）がＲＮＡであり、もう半分がＤＮＡである、１９〜２１ヌクレオチド鎖長を有するものが挙げられる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現阻害効果が非常に高くなる（米国特許出願第２００５０００４０６４号）。
【０１４２】
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えば低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびＤＮＡおよびＲＮＡからなる低分子のヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成することができる。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる、タイトなヘアピンターン（ｔｉｇｈｔ ｈａｉｒｐｉｎ ｔｕｒｎ）を作る、ＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分けられる。一般的に、ヘアピン構造は、細胞機構によってｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡに切断され、続いてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に適合するｍＲＮＡと結合してこれを切断する。
【０１４３】
任意のヌクレオチド配列から構成されるループ配列は、ヘアピンループ構造を形成するために、センス配列とアンチセンス配列との間に位置し得る。したがって、本発明は、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する二本鎖分子も提供し、式中、［Ａ］は標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である。標的配列は、例えば、ＰＲＭＴ１に関して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のヌクレオチドの中から選択され得る。
【０１４４】
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、二本鎖分子が標的となるＰＲＭＴ１遺伝子の発現を抑制する能力を保持していれば、これらの例から改変された配列であってもよい。［Ａ］領域は［Ａ’］領域とハイブリダイズし、［Ｂ］領域から構成されるループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、すなわちループ配列は、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列の中から選択することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｂ／ｔｂ＿５０６．ｈｔｍｌ）。さらに、２３ヌクレオチドからなるループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；および
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
【０１４５】
ヘアピンループ構造を有する本発明の好ましい二本鎖分子の例は以下に示される。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣ、およびＵＵＣＡＡＧＡＧＡの中から選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ＧＡＧＵＵＣＡＣＡＣＧＣＵＧＣＣＡＣＡ−［Ｂ］− ＵＧＵＧＧＣＡＧＣＧＵＧＵＧＡＡＣＵＣ（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に関する）。
【０１４６】
さらに、二本鎖分子の阻害活性を増強するために、標的配列のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端に、３’オーバーハングとして数ヌクレオチドが付加されてもよい。３’オーバーハングを構成するヌクレオチドの好ましい例には「ｔ」および「ｕ」が含まれるが、これに限定されない。付加されるヌクレオチドの数は、少なくとも２個、一般的には２〜１０個、好ましくは２〜５個である。付加されるヌクレオチドは、二本鎖分子のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端で一本鎖を形成する。二本鎖分子が、ヘアピンループ構造を形成する単一のポリヌクレオチドからなる場合、３’オーバーハング配列は単一のポリヌクレオチドの３’末端に付加され得る。
【０１４７】
二本鎖分子を調製するための方法は特に限定されないが、当技術分野で公知の化学合成方法を使用するのが好ましい。化学合成方法に従って、センスおよびアンチセンスの一本鎖ポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングの具体的な例では、合成一本鎖ポリヌクレオチドは好ましくは少なくとも約３：７、より好ましくは約４：６、最も好ましくは実質的に等モル量（すなわち約５：５のモル比）のモル比で混合される。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の通常利用される方法によって精製することができる。精製方法の例としては、アガロースゲル電気泳動を利用するか、または残存一本鎖ポリヌクレオチドが、例えば適当な酵素による分解によって任意で取り除かれる方法が挙げられる。
【０１４８】
ＰＲＭＴ１配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよく、このためこれらの発現は独立に、または時間的もしくは空間的様式で調節することができる。二本鎖分子は、ＰＲＭＴ１遺伝子鋳型を、例えば低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１ ＲＮＡプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって細胞内で転写することができる。
【０１４９】
本発明の二本鎖分子を含有するベクター
本明細書に記載の二本鎖分子を１つまたは複数含有するベクター、および該ベクターを含有する細胞も本発明に包含される。
【０１５０】
具体的には、本発明は、以下の［１］〜［１０］のベクターを提供する：
［１］互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖とから構成され、細胞に導入された場合にＰＲＭＴ１のインビボ発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子をコードするベクター；
［２］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド８０３〜８２１位）の標的配列に一致するｍＲＮＡに対して作用する二本鎖分子をコードする、［１］に記載のベクター；
［３］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応する配列を含有している、［１］に記載のベクター；
［４］約１００ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする［３］に記載のベクター；
［５］約７５ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする［４］に記載のベクター；
［６］約５０ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする［５］に記載のベクター；
［７］約２５ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする［６］に記載のベクター；
［８］約１９〜約２５ヌクレオチド長である二本鎖分子をコードする［７］に記載のベクター；
［９］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］に記載のベクター；
［１０］一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有する二本鎖分子をコードするベクターであって、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［９］に記載のベクター。
【０１５１】
本発明のベクターは、好ましくは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入された場合に、ベクターが前記分子を発現することを示す。好ましい態様では、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節要素を含む。そのような本発明のベクターは、本発明の二本鎖分子を生成するのに使用でき、またはがんを治療するための活性成分として直接使用することができる。
【０１５２】
本発明のベクターは、例えば、両方の鎖が（ＤＮＡ分子の転写によって）発現されるような方法で制御配列がＰＲＭＴ１配列と機能的に連結するように、ＰＲＭＴ１配列を発現ベクターにクローニングすることによって生成することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングされたＤＮＡの３’末端と隣接するプロモーター配列）によって転写され、ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えばクローニングされたＤＮＡの５’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズし、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。あるいは、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物が、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ発現した後、二本鎖分子構築物を形成するために利用される。さらに、クローニングされた配列は二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、すなわち標的遺伝子のセンス配列および相補的なアンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
【０１５３】
本発明のベクターは、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するためにそのようなものを具備することもできる（例えば相同的な組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，６７９，６４７号、およびＷＯ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡベースの送達技術の例としては、「ネイキッドＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が挙げられる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【０１５４】
本発明のベクターは例えば、ウイルスベクターまたは細菌ベクターを含む。発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主、例えばワクシニアまたは鶏痘が挙げられる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。標的遺伝子を発現する細胞に導入すると、組換えワクシニアウイルスは前記分子を発現し、それにより細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例としてはカルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin）（ＢＣＧ）が挙げられる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例としては、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０１５５】
本発明の二本鎖分子を使用して、がん細胞の増殖を阻害するかもしくは低下させる、またはがんを治療する方法
本発明において、ＰＲＭＴ１についてのｄｓＲＮＡを、細胞増殖を阻害する能力について試験した。数種類のがん細胞株における遺伝子の発現を効果的にノックダウンした、ＰＲＭＴ１についてのｄｓＲＮＡ（図３）は、細胞増殖の抑制と一致した。
【０１５６】
したがって、本発明は、ＰＲＭＴ１の発現の阻害を介して、ＰＲＭＴ１遺伝子の機能障害を誘導することにより、細胞増殖、すなわち、膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんを阻害するための方法を提供する。ＰＲＭＴ１遺伝子の発現は、ＰＲＭＴ１遺伝子を特異的に標的とする本発明の前記二本鎖分子のいずれかによって阻害され得る。
【０１５７】
本二本鎖分子および本ベクターの、がん性細胞の細胞増殖を阻害するそのような能力は、それらが、膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がん等のがんを治療するための方法に使用され得ることを示す。したがって、ＰＲＭＴ１遺伝子は正常器官では最小限しか検出されなかったため（図２）、本発明は、有害作用なしに、ＰＲＭＴ１遺伝子に対する二本鎖分子、または該分子を発現するベクターを投与することによって、がんを有する患者を治療する方法を提供する。
【０１５８】
具体的には、本発明は、以下の［１］〜［３２］の方法を提供する：
［１］互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成され、かつＰＲＭＴ１遺伝子を過剰発現している細胞におけるＰＲＭＴ１の発現および細胞増殖を阻害する単離された二本鎖分子を、少なくとも１つ投与する工程を含む、がん細胞の増殖を阻害してがんを治療するための方法であって、該がん細胞またはがんがＰＲＭＴ１遺伝子を発現している、方法；
［２］二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のヌクレオチド８０３〜８２１位）の標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［１］に記載の方法；
［３］前記センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応する配列を含有している、［２］に記載の方法；
［４］治療されるがんが膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんである、［１］に記載の方法；
［５］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］に記載の方法；
［６］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［５］に記載の方法；
［７］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［６］に記載の方法；
［８］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［７］に記載の方法；
［９］二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［８］に記載の方法；
［１０］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］に記載の方法；
［１１］二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有し、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［１０］に記載の方法；
［１２］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］に記載の方法；
［１３］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含有している、［１］に記載の方法；
［１４］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１３］に記載の方法；
［１５］センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１４］に記載の方法；
［１６］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、［１３］に記載の方法；
［１７］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡから構成される、［１６］に記載の方法；
［１８］隣接領域が９〜１３ヌクレオチドから構成される、［１７］に記載の方法；
［１９］二本鎖分子が３’オーバーハングを含有している、［１］に記載の方法；
［２０］二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤と薬学的に許容可能な担体とを含む組成物に含有されている、［１］に記載の方法；
［２１］二本鎖分子がベクターによりコードされる、［１］に記載の方法；
［２２］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド８０３〜８２１位）の標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［２１］に記載の方法；
［２３］ベクターによりコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、［２２］に記載の方法；
［２４］治療されるがんが膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんである、［２１］に記載の方法；
［２５］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［２３］に記載の方法；
［２６］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［２５］に記載の方法；
［２７］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［２６］に記載の方法；
［２８］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［２７］に記載の方法；
［２９］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［２８］に記載の方法；
［３０］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［２１］に記載の方法；
［３１］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有し、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［３０］に記載の方法；ならびに
［３２］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤と薬学的に許容可能な担体とを含む組成物に含有されている、［２１］に記載の方法。
【０１５９】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。
【０１６０】
ＰＲＭＴ１遺伝子を発現している細胞の増殖は、ＰＲＭＴ１遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはそれらを含有している組成物と、細胞を接触させることにより阻害され得る。さらに、細胞をトランスフェクション剤と接触させることもできる。好適なトランスフェクション剤は当技術分野で公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、その細胞が、分子に曝露されていない細胞と比較して、より低い速度で増殖するか、または減少した生存能を有することを示す。細胞増殖は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ＭＴＴ細胞増殖アッセイを使用して、測定され得る。
【０１６１】
細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現または過剰発現している限り、任意の種類の細胞の増殖を、本方法によって抑制することができる。例示的な細胞には、膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんが含まれる。
【０１６２】
したがって、ＰＲＭＴ１に関連した疾患に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有する患者を、本二本鎖分子、該分子を発現している少なくとも１つのベクター、または該分子を含有している組成物の投与によって治療することができる。例えば、がん患者が、本方法によって治療され得る。がんの種類は、診断される腫瘍の特定の種類によって、標準的な方法により同定され得る。より好ましくは、本発明の方法によって治療される患者は、ＲＴ−ＰＣＲまたはイムノアッセイによって、患者由来の生検材料におけるＰＲＭＴ１の発現を検出することにより選択される。好ましくは、本発明の治療の前に、対象由来の生検試料を、当技術分野で公知の方法、例えば、免疫組織化学分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、ＰＲＭＴ１遺伝子の過剰発現について確認する。
【０１６３】
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子は、該分子と対応するｍＲＮＡ転写産物との結合を達成する形態で、細胞に直接導入することができる。あるいは、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡは、ベクターとして細胞に導入することができる。二本鎖分子およびベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｅｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｗａｋｏ ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を利用することができる。
【０１６４】
治療は、臨床的利点、例えばＰＲＭＴ１遺伝子の発現の低減、または対象におけるがんのサイズ、有病率、もしくは転移能の減少をもたらす場合に、「有効」とみなされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、治療ががんの形成を遅らせるもしくは防ぐか、またはがんの臨床症状を防ぐかもしくは緩和するという意味である。有効性（Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓｎｅｓｓ）は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法に関連して求められる。
【０１６５】
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量でＰＲＭＴ１のｍＲＮＡを分解することが理解される。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、本発明の二本鎖分子によって、触媒的様式で標的ｍＲＮＡの分解が起こると考えられている。したがって、標準的ながん治療に比べて、治療効果を発揮するためにがん部位またはその近くへの送達が必要とされる二本鎖分子は有意に少ない。
【０１６６】
当業者は、例えば対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状、および他の状態；投与経路；ならびに投与が局所的または全身的のいずれであるかなどの因子を考慮して、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を容易に求めることができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、がん部位またはその近くにおいて約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭである細胞内濃度である。より多くのまたはより少ない量の二本鎖分子を投与することができることが意図される。特定の状況において必要とされる正確な用量は、当業者により容易にかつ規定どおりに決定され得る。
【０１６７】
本方法は、少なくとも１つのＰＲＭＴ１を発現しているがん、例えば、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんの増殖または転移を阻害するために使用され得る。特に、ＰＲＭＴ１の標的配列（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）を含有している二本鎖分子が、がんの治療のために特に好ましい。
【０１６８】
がんを治療するために、本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子とは異なる薬剤と併用して対象に投与することもできる。あるいは、本発明の二本鎖分子は、がんを治療するために設計された別の治療法と併用して対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、がんを治療するまたはがん転移を予防するのに現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術、および化学療法剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェンを用いた治療）と併用して投与することができる。
【０１６９】
本方法において、二本鎖分子は、送達試薬と共にネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとしてのいずれかで対象に投与することができる。
【０１７０】
本発明の二本鎖分子と共に投与するのに好適な送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリジン）、またはリポソームが挙げられる。好ましい送達試薬はリポソームである。
【０１７１】
リポソームは、特定の組織、例えば肺の腫瘍組織への二本鎖分子の送達に役立ち、二本鎖分子の血液半減期も増大させ得る。本発明における使用に好適なリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、概してこれには、中性または負に帯電したリン脂質およびステロール、例えばコレステロールが含まれる。一般的には、所望のリポソームサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの因子を考慮して、脂質の選択が導かれる。リポソームを調製するのに、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号（その開示全体が参照により本明細書に引用される）で記載されるような様々な方法が知られている。
【０１７２】
好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、リポソームをがん部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または血管内皮細胞に広まった受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【０１７３】
特に好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを避けるように改変される。一態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０１７４】
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用される場合、オプソニン化阻害部分は、例えば脂質−可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、膜と化学的にまたは物理的に接着する場合に、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えば米国特許第４，９２０，０１６号（その開示全体は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分を用いて改変されたリポソームは、非改変リポソームよりも非常に長く循環中に留まる。この理由から、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
【０１７５】
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性（leaky）」微小血管系によって送り込まれる組織中で集積することが知られている。したがって、そのような微小血管系の欠陥を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍は、効率的にこれらのリポソームを集積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減が、肝臓および脾臓における有意な集積を防ぐことによって、ステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分を用いて改変された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
【０１７６】
リポソームを改変するのに好適なオプソニン化阻害部分は、好ましくは、分子量が約５００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの水溶性ポリマーであり得る。そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびＰＥＧまたはＰＰＧステアレート；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖、分岐、または樹状のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えばカルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド、例えばガングリオシドＧＭ_１が挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、もしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖状または分岐状）；または、例えばカルボン酸基の結果として生じた連結を有するカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
【０１７７】
好ましくは、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を用いて改変したリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
【０１７８】
オプソニン化阻害部分は、多くの公知の技術のいずれか１つによってリポソーム膜と結合することができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、６０℃でＮａ（ＣＮ）ＢＨ_３および溶媒混合物、例えば３０：１２の比のテトラヒドロフランおよび水を用いて、還元アミノ化によってステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０１７９】
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で検討されている。少なくとも１つの本発明の二本鎖分子を発現するそのようなベクターもまた、直接、またはＭｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例えばポリリジン）、またはリポソームを含む好適な送達試薬と共に、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達する方法は当技術分野の技術範囲内である。
【０１８０】
本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子をがん部位に送達するのに好適な任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば、二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
【０１８１】
好適な腸内投与経路としては、経口、直腸、または鼻腔内送達が挙げられる。
【０１８２】
好適な非経口投与経路としては、血管内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管系へのカテーテル点滴注入）；周囲組織および組織内への注射（例えば腫瘍周囲および腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによって）；例えばカテーテルもしくは他の留置装置（例えば、多孔性、非孔性、またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント）による、がん部位の領域またはその近くの領域への直接適用；ならびに吸入が挙げられる。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がんの部位でまたはその近くで行われることが好ましい。
【０１８３】
本発明の二本鎖分子は、単回投与または複数回の投与で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入によるものである場合、注入は、単回の持続投与で行うか、または複数回の注入によって送達することができる。剤の注射は、がん部位の組織、またはがん部位の近くの組織に直接行うことが好ましい。がん部位の組織にまたはがん部位の近くの組織に剤を複数回注射することが特に好ましい。
【０１８４】
当業者は容易に、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するのに適当な投与計画を決定することもできる。例えば、二本鎖分子は、例えばがん部位でのまたはその近くでの単回注射または沈着として、対象に１回で投与することができる。あるいは、二本鎖分子は、約３日〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の間、１日１回または２回、対象に投与することができる。好ましい投与計画では、二本鎖分子は１日１回７日間、がん部位にまたはその近くに注射される。投与計画に複数回の投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与計画全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことが理解される。
【０１８５】
本発明の二本鎖分子を含有している組成物
上記に加えて、本発明は、本二本鎖分子または該分子をコードするベクターを含む薬学的組成物も提供する。具体的には、本発明は、以下の［１］〜［３２］の組成物を提供する：
［１］ＰＲＭＴ１の発現および細胞増殖を阻害する単離された二本鎖分子を含む、ＰＲＭＴ１遺伝子を発現しているがん細胞の増殖を阻害してＰＲＭＴ１遺伝子を発現しているがんを治療するための組成物であって、該分子が、互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成される、組成物；
［２］二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド８０３〜８２１位）の標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［１］に記載の組成物；
［３］二本鎖分子、センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応する配列を含有している、［２］に記載の組成物；
［４］治療されるがんが膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんである、［１］に記載の組成物；
［５］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］に記載の組成物；
［６］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［５］に記載の組成物；
［７］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［６］に記載の組成物；
［８］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［７］に記載の組成物；
［９］二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［８］に記載の組成物；
［１０］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］に記載の組成物；
［１１］二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有し、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［１０］に記載の組成物；
［１２］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］に記載の組成物；
［１３］二本鎖分子がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである、［１］に記載の組成物；
［１４］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１３］に記載の組成物；
［１５］センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１４］に記載の組成物；
［１６］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、［１３］に記載の組成物；
［１７］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡから構成される、［１４］に記載の組成物；
［１８］隣接領域が９〜１３ヌクレオチドから構成される、［１７］に記載の組成物；
［１９］二本鎖分子が３’オーバーハングを含有している、［１］に記載の組成物；
［２０］トランスフェクション増強剤と薬学的に許容可能な担体とを含む、［１］に記載の組成物；
［２１］二本鎖分子がベクターによりコードされ、かつ組成物に含有されている、［１］に記載の組成物；
［２２］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド８０３〜８２１位）の標的配列に一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［２１］に記載の組成物；
［２３］ベクターによりコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応する配列を含有している、［２２］に記載の組成物；
［２４］治療されるがんが膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんである、［２１］に記載の組成物；
［２５］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［２３］に記載の組成物；
［２６］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［２５］に記載の組成物；
［２７］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［２６］に記載の組成物；
［２８］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［２７］に記載の組成物；
［２９］ベクターによりコードされる二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［２８］に記載の組成物；
［３０］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［２１］に記載の組成物；
［３１］二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’を有し、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、［３０］に記載の組成物；ならびに
［３２］トランスフェクション増強剤と薬学的に許容可能な担体とを含む、［２１］に記載の組成物。
【０１８６】
本発明の好適な組成物は以下でより詳細に説明される。
【０１８７】
本発明の二本鎖分子は、好ましくは、当技術分野で公知の技術に従って、対象に投与する前に薬学的組成物として調合することができる。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌でありかつパイロジェンを含まないことを特徴とする。本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」は、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤を含む。本発明の薬学的組成物を調製する方法は、例えばRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.（1985）（その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載のように当技術分野の技術範囲内である。
【０１８８】
本発明の薬学的組成物は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合して、本発明の二本鎖分子もしくはこれをコードするベクター（例えば０．１重量％〜９０重量％）、または該分子の生理学的に許容可能な塩を含有する。好ましい生理学的に許容可能な担体媒体は、水、緩衝水、通常の生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０１８９】
さらに、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含有され得る。リポソームの詳細に関しては、「二本鎖分子を使用してがんを治療する方法」の項を参照されたい。
【０１９０】
本発明の薬学的組成物は、従来の薬学的賦形剤および／または添加剤も含み得る。好適な薬学的賦形剤としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、およびｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性がある緩衝剤（例えば塩酸トロメタミン）、キレート剤（ｃｈｅｌａｎｔ）の添加物（例えばＤＴＰＡもしくはＤＴＰＡ−ビスアミド）もしくはカルシウムキレート錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、または任意でカルシウム塩もしくはナトリウム塩の添加物（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、もしくは乳酸カルシウム）が挙げられる。本発明の薬学的組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、または凍結乾燥されていてもよい。
【０１９１】
固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
【０１９２】
例えば、経口投与用の固体薬学的組成物は、上記で列挙された担体および賦形剤のいずれかと、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子とを含み得る。エアロゾル（吸入）投与用の薬学的組成物は、上記のようにリポソームに封入された０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含み得る。所望に応じて、担体、例えば鼻腔内送達ではレシチンが含まれ得る。
【０１９３】
上記に加えて、本発明の組成物は、本二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的に活性のある成分を含有することができる。例えば組成物は、がんを治療するのに従来使用される化学療法剤を含有することができる。
【０１９４】
別の態様において、本発明は、ＰＲＭＴ１の発現を特徴とするがんの治療用の薬学的組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば、本発明は、ＰＲＭＴ１を発現しているがんの治療用の薬学的組成物の製造のための、細胞におけるＰＲＭＴ１遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用に関し、該分子は、互いにハイブリダイズすることで二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とを含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の配列を標的とする。
【０１９５】
あるいは、本発明は、ＰＲＭＴ１遺伝子を過剰発現している細胞におけるＰＲＭＴ１の発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に薬学的または生理学的に許容可能な担体を調合する工程を含む、ＰＲＭＴ１の発現を特徴とするがんの治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスをさらに提供し、該分子は、活性成分として、互いにハイブリダイズすることで二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とを含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の配列を標的とする。
【０１９６】
別の態様において、本発明は、活性成分を薬学的または生理学的に許容可能な担体と混和する工程を含む、ＰＲＭＴ１の発現を特徴とするがんの治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスも提供し、該活性成分は、ＰＲＭＴ１遺伝子を過剰発現している細胞におけるＰＲＭＴ１の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子は、互いにハイブリダイズすることで二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とを含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の配列を標的とする。
【０１９７】
本発明を以下、実施例に関して詳細に説明する。しかし、下記の材料、方法、および例は本発明の局面を例証するだけであり、これらは本発明の範囲を限定する意図は少しもない。したがって、本明細書に記載のものと同様または等価の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができる。
【０１９８】
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下で説明する。本明細書において言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾が生じた場合には、定義を含めて本明細書に照らし合わせるものとする。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図していない。
【実施例】
【０１９９】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【０２００】
実施例１：一般的方法
組織試料およびＲＮＡ調製
膀胱切除または経尿道的切除のいずれかの際に、原発性尿路上皮細胞がんの外科的試料１２６個を採取し、液体窒素中で急速凍結させた。正常膀胱尿路上皮の試料３４個を、尿路上皮悪性病変の所見がない患者の肉眼上正常な尿路上皮の区域から採取した。計３０個の３０μｍ（マイクロメートル）の切片を、ＲＮＡ抽出用にホモジナイズし、ＲＮＡ抽出に使用された組織に隣接する２つの７μｍの「サンドイッチ」切片を切り出し、染色し、独立したコンサルタントである泌尿組織病理学者が細胞性および腫瘍悪性度について査定した。さらに、切片は、炎症性細胞浸潤の程度（低、中、および高）に従って類別した。高度の炎症性細胞浸潤を示す試料は除外した（Wallard MJ, et al., Br J Cancer 2006;94:569-577）。
【０２０１】
製造業者のプロトコルに従い、ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（商標）（Ｓｉｇｍａ， Ｄｏｒｓｅｔ， ＵＫ）を使用して、全ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ工程を含め、ＲＮＥａｓｙ Ｍｉｎｉｋｉｔｓ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｒａｗｌｅｙ， ＵＫ）を使用して、ＲＮＡ純度を最適化した。Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００（商標）の全ＲＮＡ生物分析を実施した。各試料に由来する再懸濁ＲＮＡ １μｌをＲＮＡ ６０００ ＮａｎｏＬａｂＣｈｉｐ（商標）に適用し、製造業者の指示に従い処理した。全てのチップおよび試薬を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（Ｗｅｓｔ Ｌｏｔｈｉａｎ， ＵＫ）から調達された。
【０２０２】
逆転写
全ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）ＮＤ１０００分光光度計（Ｎｙｘｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用して決定した。製造業者の説明書に従って、２０μｌ（マイクロリットル）の反応物中、２μｇ（マイクログラム）のランダム六量体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）を用いて、１マイクログラムの全ＲＮＡを逆転写した。次いで、ｃＤＮＡをＰＣＲグレード水で１００倍希釈し、−２０℃で保存した。
【０２０３】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応用に、ヒトＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ヒトＳＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ヒトＯＭＤ、およびヒトＰＲＥＬＰについて特異的なプライマーを設計した（表１）。１８Ｓ増幅用に、ＴａｑＭａｎ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲｅａｇｅｎｔｓをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＵＫ）から購入した。ＰＣＲ反応は、製造業者のプロトコルに従い、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＵＫ）を使用して行った。１８Ｓ分析のための反応は、逆転写されたＲＮＡの１ｎｇ相当分、ＵＮＧを含まない５０％ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＵＫ）、各２００ｎＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマー、ならびに１００ｎＭのプローブを含有している１０μｌのＰＣＲ容量で実施した。増幅条件は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、次いで、１サイクルが９５℃１５秒間および６０℃１分間からなる４０サイクルであった。標的遺伝子増幅のための反応条件は上記の通り、逆転写されたＲＮＡの５ｎｇ相当分を各反応において使用した。
【０２０４】
（表１）定量的ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー配列

【０２０５】
試料内の相対ＲＮＡレベルを決定するために、１８Ｓ反応については２〜０．６２５ｎｇのＲＮＡ、全ての標的遺伝子については２０〜０．５ｎｇのＲＮＡの範囲をカバーするｃＤＮＡの２倍段階希釈列から、ＰＣＲ反応の標準曲線を作成した。ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ７７００により、４０サイクルのＰＣＲ反応全体を通して蛍光レベルの変化を測定し、増幅が対数期に入る点に相関するサイクル閾値（Ｃｔ）を各試料について得た。この値を、出発鋳型の量の指標として使用した；したがって、より低いＣｔ値は、初期の完全ｃＤＮＡの量がより多いことを示した。
【０２０６】
レーザーキャプチャー・マイクロダイセクション
レーザーキャプチャー・マイクロダイセクション用の組織を、上に概説した手順に従って、予め採取した。厚さ７μｍの５個の連続切片を各組織から切り取り、製造業者のプロトコルに従い、Ｈｉｓｔｏｇｅｎｅ（商標）染色溶液（Ａｒｃｔｕｒｕｓ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）を使用して染色した。次いで、スライドを、Ｐｉｘ Ｃｅｌｌ ＩＩレーザーキャプチャー顕微鏡（Ａｒｃｔｕｒｕｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用したマイクロダイセクションに直ちに移した。この技術は、関心対象の細胞の上にある熱可塑性フィルムを融解し、それに細胞を接着させるために、低出力の赤外レーザーを利用する。
【０２０７】
各組織内の間質コンパートメントおよび上皮／腫瘍コンパートメントの両方から、およそ１００００個の細胞をマイクロダイセクションした。ＲＮＡをＲＮＥａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｒａｗｌｅｙ， ＵＫ）を使用して抽出した。高度の炎症性細胞浸潤を含有している腫瘍または間質の高度炎症性区域を含有しているがんまたは間質の区域は、夾雑を防止するために回避した。
【０２０８】
上記の通り、全ＲＮＡを逆転写し、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。そのような少量の試料からのＲＮＡの収量は低いため、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）定量化は実施しなかったが、内在性１８Ｓ ＣＴ値による補正を、出発の完全ＲＮＡの量の正確な基準として使用した。転写物分析をＰＲＭＴ１遺伝子について実施した。
【０２０９】
マイクロダイセクションの正確性を確証するために、ビメンチンおよびウロプラキン用のプライマーおよびプローブを調達し、製造業者の説明書（Ａｓｓａｙｓ ｏｎ ｄｅｍａｎｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＵＫ））に従いｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ビメンチンは、間葉系由来細胞に主に発現しており、間質マーカーとして使用された。ウロプラキンは、尿路上皮分化のマーカーであり、９０％もの上皮由来腫瘍で保存されている（Olsburgh J, et al., J Pathol 2003;199:41-49）。
【０２１０】
ｃＤＮＡマイクロアレイ
ゲノムワイドｃＤＮＡマイクロアレイを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＵｎｉＧｅｎｅデータベースから選択された３６８６４種のｃＤＮＡを用いて製作した。このマイクロアレイシステムは、本質的には以前に記載された通りに構築された（Ono K, et al., Cancer Res 2000;60:5007-5011）。簡単に説明すると、様々なヒト器官から単離されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として使用したＲＴ−ＰＣＲによって、ｃＤＮＡを増幅した；アンプリコンの長さは、反復配列またはポリ（Ａ）配列は含めずに、２００〜１１００ｂｐの範囲であった。
【０２１１】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
ヒトＰＲＭＴ１転写物を標的とするためのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖、または対照ｓｉＲＮＡとしてのＥＧＦＰおよびＦＦＬｕｃの転写物を標的とするためのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖を、ＳＩＧＭＡ Ｇｅｎｏｓｙｓから購入した。ｓｉＲＮＡ配列を表２に記載する。ｓｉＲＮＡ二重鎖（１００ｎＭ最終濃度）を、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、４８時間、膀胱がん細胞株および肺がん細胞株にトランスフェクトし、ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ ８（同仁化学研究所）を使用して、細胞生存能を確認した。
【０２１２】
（表２）ｓｉＲＮＡ配列

【０２１３】
実施例２：臨床がん組織におけるＰＲＭＴ１の発現レベルおよびＰＲＭＴ１タンパク質の細胞内局在
少数の臨床膀胱試料を使用して、幾つかのＰＲＭＴ１ファミリー遺伝子の発現レベルを比較した手始めの結果は、正常組織と腫瘍組織との間のＰＲＭＴ１発現の有意な差を示した（データは示していない）。したがって、ＰＲＭＴ１の転写物レベルを定量的に測定するために、より多数の臨床試料のさらなる分析を実施した。膀胱がん試料１２１個および正常対照試料２４個を分析した（図１ＡおよびＢ）。ＰＲＭＴ１の発現レベルは、正常組織と比較して腫瘍では有意に高いことが見出された（Ｐ＜０．０００１）。日本人の対象由来の多数の臨床試料を使用して、多くの種類のがんにおけるＰＲＭＴ１の発現プロファイルもまた、ｃＤＮＡマイクロアレイにより確認した（表３）。ＰＲＭＴ１の発現レベルは、対応する非腫瘍性組織と比較して、びまん性胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、小細胞肺がん、リンパ腫、非小細胞肺がん、膵臓がん、および精巣がんにおいて有意に上方制御されている。
【０２１４】
（表３）がん組織におけるＰＲＭＴ１の遺伝子発現プロファイル

【０２１５】
これらの遺伝子の発現レベルはｃＤＮＡマイクロアレイによって分析した。ＰＲＭＴ１のシグナル強度は、腫瘍組織を、同一患者に由来する対応する非腫瘍性組織と比較することにより作成した。
【０２１６】
さらに、Ｖ５タグ付きＰＲＭＴ１を発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＰＲＭＴ１）を調製し、ゲノム内にＦｌｐ組換え標的（ＦＲＴ）部位を含有しているＦｌｐ−Ｉｎ Ｔ−ＲＥｘ２９３細胞にトランスフェクトした。Ｆｌｐ−Ｉｎ Ｔ−ＲＥｘ２９３からの抽出物を使用したイムノブロット分析は、タグ付きＰＲＭＴ１タンパク質に対応する４０ｋＤａのバンドを示した（図１Ｃ）。Ｔ−ＲＥｘ２９３−ＰＲＭＴ１細胞の免疫細胞化学染色によって、タグ付きＰＲＭＴ１タンパク質が細胞質および核の両方に存在することが明らかになった（図１Ｄ）。
【０２１７】
実施例３：ヒト正常組織におけるＰＲＭＴ１の発現レベル
アレイ上の３６８６４種の遺伝子の各々の相対発現比（Ｃｙ５／Ｃｙ３）を算出するために、２９種の組織全てに由来するポリ（Ａ）^＋ＲＮＡの混合物を対照として使用して、ｃＤＮＡマイクロアレイ上で、２５種の成人ヒト組織および４種の胎児ヒト組織におけるＰＲＭＴ１の遺伝子発現プロファイルを分析した。各ハイブリダイゼーションシグナルの強度を、Ａｒｒａｙ Ｖｉｓｉｏｎコンピュータプログラムによって測光法により算出し、バックグラウンド強度を差し引いた。Ｃｙ３およびＣｙ５の各蛍光強度の標準化は、５２種のハウスキーピング遺伝子からの平均シグナルを使用して行った。詳細な分析結果は、全ての確認された正常組織において、ＰＲＭＴ１の発現レベルが、ＧＡＰＤＨの発現レベルと比較して有意に低いことを示した（図２）。全ての正常組織におけるＰＲＭＴ１の平均シグナル強度はほぼ１００００であったので、この値は３６８６４種の遺伝子の中で相対的に低かった。したがって、ＰＲＭＴ１はがん治療の良好な候補と見なされた。
【０２１８】
実施例４：がん細胞の生存能に対するＰＲＭＴ１抑制の効果
ＰＲＭＴ１の上昇した発現が、がん細胞の増殖において重大な役割を果たすか否かを試験するために、ＰＲＭＴ１の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖（ｓｉＰＲＭＴ１＃２）を、２つの対照（ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＦＦＬｕｃ）と共に調製し、ＰＲＭＴ１を多量に発現している数種類の肺がん細胞株および膀胱がん細胞株にトランスフェクトした。図３Ａに示されるように、ｓｉＰＲＭＴ１＃２は、対照としてのｓｉＥＧＦＰと比較して、ＰＲＭＴ１の発現を有意に抑制した。その後、ＰＲＭＴ１の抑制が増殖遅滞および／または細胞死をもたらすか否かを試験するために、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖をがん細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞の増殖を細胞計数キットシステムによって調べた（図３Ｂ）。重要なことに、４種の肺がん細胞株（Ａ５４９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＬＣ３１９、およびＳＢＣ５）ならびに２種の膀胱がん細胞株（ＳＷ７８０およびＳＣａＢＥＲ）へのｓｉＰＲＭＴ１＃２のトランスフェクションは、ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＦＦＬｕｃをトランスフェクトした細胞と比較して、それらの能力を低下させた。さらに、ＳＷ７８０膀胱がん細胞を使用した細胞周期分析のデータは、ｓｉＰＲＭＴ１＃２による処理の後、Ｓ期の細胞が有意に減少し、Ｇｏ期およびＧ１期の細胞が同時に増加することを示した（表４）。これらのデータは、ＰＲＭＴ１が肺がん細胞および膀胱がん細胞の増殖または生存において必須の役割を果たし得ることを示唆している。
【０２１９】
（表４）ｓｉＲＮＡ処理後のＳＷ７８０細胞の細胞周期分析

^＊１：ｐ＝０．０１７３、^＊２：ｐ＝０．０１１０、^＊３：ｐ＝０．０１０７、^＊４：ｐ＝０．００２２；ｐ値はスチューデントｔ検定によって算出した。
【０２２０】
産業上の利用可能性
本発明者らは、ＰＲＭＴ１遺伝子を特異的に標的とする二本鎖核酸分子によって、細胞増殖が抑制されることを示した。したがって、この二本鎖核酸分子は抗がん剤の開発に有用である。例えば、ＰＲＭＴ１タンパク質の発現を阻止するか、またはその活性を妨げる剤は、抗がん剤として、特に膀胱がん、胃がん、直腸結腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、または精巣がんの治療のための抗がん剤として治療における有用性を示す可能性がある。
【０２２１】
本発明はその特定の態様を参照して詳細に記載されているが、ここにおいて、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更および改変がなされる可能性があることは、当業者にとって明白であろう。本明細書において言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾が生じた場合には、定義を含めて本明細書に照らし合わせるものとする。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図していない。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象由来の生物学的試料におけるＰＲＭＴ１遺伝子の発現レベルを決定する工程を含む、対象におけるがんを検出または診断する方法であって、前記遺伝子の正常対照レベルと比較した前記レベルの増加が、前記対象ががんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有することを示し、前記発現レベルが、以下からなる群より選択される任意の１つの方法によって決定される、方法：
（ａ）ＰＲＭＴ１のｍＲＮＡを検出する方法、
（ｂ）ＰＲＭＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質を検出する方法、および
（ｃ）ＰＲＭＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出する方法。
【請求項２】
前記増加が正常対照レベルより少なくとも１０％大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象由来の生物学的試料が生検材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
がんが膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
以下からなる群より選択される試薬を含む、がんを診断するためのキット：
（ａ）ＰＲＭＴ１のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＰＲＭＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＰＲＭＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【請求項６】
試薬がＰＲＭＴ１の遺伝子転写物に対するプローブである、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
試薬がＰＲＭＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体である、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
以下の工程を含む、がんを治療もしくは予防するための、またはがん細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法：
（ａ）試験化合物を、ＰＲＭＴ１遺伝子によってコードされるポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）ポリペプチドと試験化合物との間の結合活性を検出する工程；および
（ｃ）ポリペプチドに結合する化合物を選択する工程。
【請求項９】
以下の工程を含む、がんを治療もしくは予防するための、またはがん細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法：
（ａ）試験化合物を、ＰＲＭＴ１遺伝子を発現している細胞と接触させる工程；および
（ｂ）試験化合物の非存在下での発現レベルと比較して、ＰＲＭＴ１遺伝子の発現レベルを低下させる試験化合物を選択する工程。
【請求項１０】
以下の工程を含む、がんを治療もしくは予防するための、またはがん細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法：
（ａ）試験化合物を、ＰＲＭＴ１遺伝子によってコードされるポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する工程；および
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出された生物学的活性と比較して、ポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験化合物を選択する工程。
【請求項１１】
生物学的活性が細胞増殖活性またはメチルトランスフェラーゼ活性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程を含む、がんを治療もしくは予防するための、またはがん細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法：
（ａ）ＰＲＭＴ１遺伝子の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている細胞に、試験化合物を接触させる工程；
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現または活性を測定する工程；および
（ｃ）試験化合物の非存在下でのレベルと比較して、前記レポーター遺伝子の発現または活性のレベルを低下させる試験化合物を選択する工程。
【請求項１３】
がんが膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんからなる群より選択される、請求項８、９、１０、および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、かつＰＲＭＴ１遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子であって、前記センス鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７からなる標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が前記センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、二本鎖分子。
【請求項１５】
約１９〜約２５ヌクレオチド長である、請求項１４に記載の二本鎖分子。
【請求項１６】
一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のポリヌクレオチド分子である、請求項１４に記載の二本鎖分子。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドが下記一般式を有する、請求項１６に記載の二本鎖分子：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項１８】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせの各々または両方をコードし、かつＰＲＭＴ１遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害するベクターであって、前記センス鎖核酸がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が前記センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖の転写物と前記アンチセンス鎖の転写物とが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、ベクター。
【請求項１９】
ポリヌクレオチドが約１９〜約２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
ベクターによってコードされる二本鎖分子が、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一の転写物分子である、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドが下記一般式を有する、請求項２０に記載のベクター：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項２２】
薬学的に有効な量の、ＰＲＭＴ１遺伝子に対する二本鎖分子、またはそれをコードするベクターと、薬学的に許容可能な担体とを対象に投与する工程を含む、対象におけるがんを治療または予防する方法であって、二本鎖分子が、ＰＲＭＴ１遺伝子を発現している細胞に導入された場合に細胞増殖およびＰＲＭＴ１遺伝子の発現を阻害する、方法。
【請求項２３】
二本鎖分子が請求項１４に記載の二本鎖分子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ベクターが請求項１８に記載のベクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
がんが膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
薬学的に有効な量の、ＰＲＭＴ１遺伝子に対する二本鎖分子、またはそれをコードするベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む、がんを治療または予防するための組成物であって、二本鎖分子が、ＰＲＭＴ１遺伝子を発現している細胞に導入された場合に細胞増殖およびＰＲＭＴ１遺伝子の発現を阻害する、組成物。
【請求項２７】
二本鎖分子が請求項１４に記載の二本鎖分子である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
ベクターが請求項１８に記載のベクターである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
がんが膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、食道がん、肺がん、リンパ腫、膵臓がん、および精巣がんからなる群より選択される、請求項２６に記載の組成物。

【図１】

【図２】

【図３】

【公表番号】特表２０１２−５０１１６４（Ｐ２０１２−５０１１６４Ａ）
【公表日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０９３３２（Ｐ２０１１−５０９３３２）
【出願日】平成２１年８月２５日（２００９．８．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００４０９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２３８７７
【国際公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】