がんワクチン
【課題】 がんの予防および治療に用いるがんワクチンを提供すること。
【解決手段】 配列番号１（ＫＭＨＩＲＳＨＴＬ）または配列番号２（ＲＴＦＳＲＭＳＬＬ）からなるがん免疫を効率的に誘導できるペプチド、そのペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞、この抗原提示細胞によって誘導されたＴ細胞、および、これらのペプチド、これらのペプチドを発現する発現ベクター、これらのペプチドを提示した抗原提示細胞、またはその抗原提示細胞によって誘導されたＴ細胞を含有するがんワクチン、そして、そのがんワクチンを用いたがんの治療・予防方法を提供することができる。
【解決手段】 配列番号１（ＫＭＨＩＲＳＨＴＬ）または配列番号２（ＲＴＦＳＲＭＳＬＬ）からなるがん免疫を効率的に誘導できるペプチド、そのペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞、この抗原提示細胞によって誘導されたＴ細胞、および、これらのペプチド、これらのペプチドを発現する発現ベクター、これらのペプチドを提示した抗原提示細胞、またはその抗原提示細胞によって誘導されたＴ細胞を含有するがんワクチン、そして、そのがんワクチンを用いたがんの治療・予防方法を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの予防および治療に用いるがんワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がん免疫学において、免疫細胞によるがん抗原認識機構がかなり解明されてきた。それによると、まず、抗原提示細胞である樹状細胞（dendritic cells または ＤＣ）は、細胞内で、がんが発現するタンパク質を分解する際に生じた８〜１０個のアミノ酸からなる抗原ペプチドを、主要組織適合性抗原複合体（major histocompatibility complex または ＭＨＣ；ヒトでは、human leukocyte antigen または ＨＬＡ）と共に細胞表面に提示する。細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocyte または ＣＴＬ）は、樹状細胞表面のＨＬＡクラスＩに結合した抗原ペプチドを認識し、活性化・増殖し、腫瘍内に侵入し、抗原ペプチドが由来するタンパク質を有するがん細胞に対し細胞傷害を生じる（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
この機構を利用して、がんの治療方法としてがんワクチンが開発されてきた。例えば、がん特異的タンパク質由来の抗原ペプチドを細胞表面に提示する樹状細胞をin vitroで作製し、増殖させ、がん患者に投与したり、その樹状細胞によって教育された細胞傷害性Ｔ細胞を投与したりすることにより、がん患者の体内でがん免疫を誘導させる。あるいは、がん特異的タンパク質をがん患者に投与し、患者の体内で、がん免疫機構の全過程を誘導させるのである（例えば、非特許文献２〜７参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．（１９９０）１２６：２００−２０５
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：１６４３−１６４７；
【非特許文献３】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８３：１１８５−１１９２；
【非特許文献４】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：４９９４−５００４；
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：４３２−４３６
【非特許文献６】Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２６９：１２８１−１２８４
【非特許文献７】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７）１８６：７８５−７９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、がん免疫を効率的に誘導することのできるがん特異的タンパク質は、一部のがんにおいて、ほんの少数の例が知られているだけである。
【０００６】
そこで、本発明は、がん免疫を効率的に誘導できるペプチド、そのペプチドを含有する組成物、そのペプチドを提示した抗原提示細胞、この抗原提示細胞によって刺激されたＴ細胞、およびこれらのペプチドや細胞を利用したがんワクチン、及びそれらを用いたがん患者の治療方法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係るペプチドは、ＫＭＨＩＲＳＨＴＬ（配列番号１）またはＲＴＦＳＲＭＳＬＬ（配列番号２）の配列からなる。これらのペプチドを提示した抗原提示細胞、およびこの抗原提示細胞によって誘導され、ｓｎａｉｌ抗原を発現するがん細胞を認識するＴ細胞も、本発明の技術範囲に属する。このＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞であることが好ましい。また、ｓｎａｉｌ抗原を発現するがん細胞は、膵臓癌細胞、メラノーマ細胞、白血病細胞、または大腸癌細胞であることが好ましい。
【０００８】
本発明に係るがんワクチンは、配列番号１または配列番号２からなるペプチドのいずれかまたは両方のペプチド、配列番号１または２のペプチドを発現する発現ベクター、配列番号１または２の配列からなるペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞、あるいは、上記Ｔ細胞のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする。
【０００９】
また、本発明に係る、配列番号１または配列番号２からなるペプチドのいずれかまたは両方のペプチドを含むがんワクチンは、これらのペプチド以外のがん抗原ペプチドを含有していてもよい。
【００１０】
さらに、本発明に係るがんワクチンは、ｓｎａｉｌタンパク質を発現するがん細胞に対するがんワクチンであることが好ましい。
【００１１】
本発明に係るがんの治療・予防方法は、ヒトおよびヒト以外の脊椎動物に対し、本発明に係るがんワクチンを用いることを特徴とする。
【００１２】
ここで、本明細書で「がん」という用語は、上皮細胞由来の癌、非上皮細胞由来の腫瘍、血液のがんなどの新生物（neoplasm）を意味するものであり、がんの由来は問わない。
【００１３】
また、本明細書では、アクセッション番号ＮＭ＿００５９８５（配列番号３）の遺伝子をヒトｓｎａｉｌ遺伝子と称し、動物種の限定なくｓｎａｉｌ遺伝子と記載されている場合は、ヒト遺伝子に限らず、他の動物種のホモログやオーソログも含むものとする。そして、アクセッション番号ＮＰ＿００５９７６（配列番号４）のタンパク質をヒトｓｎａｉｌタンパク質と称し、動物種の限定なくｓｎａｉｌタンパク質と記載されている場合は、ヒトタンパク質に限らず、他の動物種のホモログやオーソログも含むものとする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって、がん免疫を効率的に誘導できるペプチド、そのペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞、この抗原提示細胞によって誘導されたＴ細胞、および、これらのペプチド、これらのペプチドを発現する発現ベクター、これらのペプチドを提示した抗原提示細胞、またはその抗原提示細胞によって誘導されたＴ細胞を含有するがんワクチン、そして、そのがんワクチンを用いたがんの治療・予防方法を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施例において、健常人の正常組織におけるｓｎａｉｌ遺伝子の発現（Ａ）、および、大腸癌患者の癌組織と同患者の正常組織におけるｓｎａｉｌ遺伝子の発現（Ｂ）を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、ヒト膵臓癌細胞株、ヒトメラノーマ細胞株、ヒト白血病細胞株、ヒト大腸癌細胞株におけるｓｎａｉｌ遺伝子の発現を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人末梢血単核球をｓｎａｉｌ １、２、３およびＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖ、ＮＹ−ＥＳＯ−１の各ペプチドで刺激培養して得られたＣＴＬを、０．１、１、あるいは１０μｇ／ｍｌの各ペプチドの存在下でＨＬＡ−Ａ２４陽性抗原提示細胞と共培養したときの、ＣＴＬによるガンマ・インターフェロン産生量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施例において、ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人末梢血単核球をｓｎａｉｌ ３あるいはＮＹ−ＥＳＯ−１で刺激培養して得られたＣＴＬに、ｓｎａｉｌを発現する腫瘍細胞を接触させたときの腫瘍特異的傷害率を測定した結果を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施例において、ＨＬＡ−Ａ０２陽性健常人末梢血単核球をｓｎａｉｌ １、２、３およびＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖ、ＮＹ−ＥＳＯ−１の各ペプチドで刺激培養して得られたＣＴＬを、１０μｇ／ｍｌの各ペプチドの存在下でＨＬＡ−Ａ０２陽性抗原提示細胞と共培養したときの、ＣＴＬによるガンマ・インターフェロン産生量を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されない。
【００１７】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１８】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１９】
＝＝がんワクチン＝＝
ｓｎａｉｌタンパク質の有するアミノ酸配列の一部である配列番号１または２からなるペプチドを抗原提示細胞である樹状細胞に添加したとき、ＨＬＡクラスＩ分子に結合することにより、細胞表面に提示され、細胞傷害性Ｔ細胞に認識されることで、ｓｎａｉｌを認識する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できる。また、各ペプチドの刺激により樹立された細胞傷害性Ｔ細胞がｓｎａｉｌタンパク質を発現するがん細胞を効率よく認識することから、配列番号１および２の両方又はいずれか一つのペプチド、そのペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞、および、抗原提示細胞によって誘導され、ｓｎａｉｌ抗原を発現しているがん細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞は、がんワクチンとして、がんの治療・予防に利用することができる。
【００２０】
＝＝がんワクチンの投与方法＝＝
現在、がんワクチンとして、腫瘍特異的がん抗原、がん抗原提示抗原提示細胞、または、がん抗原反応性細胞傷害性Ｔ細胞をがん患者に投与する方法が開発されている。ｓｎａｉｌタンパク質の部分ペプチドを用いたがんワクチンの、治療または予防対象となるがんは、ｓｎａｉｌタンパク質を発現しているがんであれば特に限定されず、神経腫、腎癌、肝癌、膵臓癌、肉腫、大腸癌、メラノーマ、肺癌、食道癌、子宮癌、精巣癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫など、固形がんでも血液のがんでも構わないが、膵臓癌、メラノーマ、白血病、大腸癌であることが好ましい。
【００２１】
本発明に係るがんワクチンによるがんの治療・予防の対象は、このようながんに罹患している脊椎動物であれば制限されず、ヒトであってもヒト以外であってもよい。
【００２２】
なお、以下に説明するがんワクチンは、それぞれ単独で投与しても、共投与しても、あるいは、ここに記載した以外のがんワクチンと共投与してもよい。
【００２３】
[ペプチドを含有するがんワクチン]
本発明のがんワクチンは、配列番号１および２のペプチドの両方またはいずれか一つを含有してもよい。この場合、あらかじめ患者のＨＬＡクラスＩのタイプを調べるのが好ましい。ここでは、患者のＨＬＡクラスＩタイプがＡ２４である場合に、配列番号１および２のペプチドの両方又はいずれか一つを投与することが好ましい。一方、ＨＬＡクラスＩタイプがＡ０２である場合には、配列番号１のペプチドを投与することが好ましい。このがんワクチンは、配列番号１および配列番号２のペプチド以外に、治療対象であるがん細胞の発現している他種のがん抗原ペプチドを含有していてもよい。また、投与する際には、免疫誘導能を高めるアジュバンドなどと共にペプチドを投与してもよい。また、投与されるペプチドは、生体内で分解されにくくするような修飾が施されていてもよい。さらには、ペプチドそのものではなく、これらのペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターなどを用い、ＤＮＡワクチンとして投与してもよい。
【００２４】
投与部位に関しては、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、腹腔内投与などが考えられ、特に限定されることはない。
【００２５】
ここで、配列番号１および２のペプチドの取得方法は特に制限されず、ペプチドを発現する細胞から単離・精製されたペプチドであっても、遺伝子組み換え技術を用いて製造された組換えペプチドであっても、または周知の方法で化学合成したペプチドであってもよい。
【００２６】
[抗原提示細胞を含有するがんワクチン]
配列番号１または２からなるペプチドを提示した抗原提示細胞も、がんワクチンとして使用することができる。ここで、細胞表面に提示されているペプチドは、無修飾であっても、糖やリン酸などで修飾されてもよい。抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｂ７や４−１ＢＢＬなどのＴ細胞刺激因子などを遺伝子導入等で強制的に発現させた腫瘍細胞（偽抗原提示細胞）等が例示できるが、抗原提示能の高さなどを考慮すると、樹状細胞が好ましい。以下、樹状細胞の単離方法の例を記載するが、他の細胞も公知の方法で容易に取得できる。
【００２７】
まず、脊椎動物個体の末梢血から単核球（以下、ＰＢＭＣとも称する）を単離し、ＨＬＡクラスＩタイプを調べてＡ２４またはＡ０２であることを確認する。このＰＢＭＣは、治療対象となる個体自身から分離することが好ましいが、他の個体から単離してもよい。また、このＰＢＭＣはＣＤ１４陽性またはＣＤ１１ｃ陽性であることが好ましい。ＰＢＭＣの単離方法は特に制限されず、単離したいＰＢＭＣの種類によって当業者が適宜決定できる。例えば、フィコール遠心分離法等によりＰＢＭＣ全体（ＰＢＭＣ分画）を単離でき、抗体結合磁気ビーズ分離法等によりＣＤ１４陽性ＰＢＭＣやＣＤ１１ｃ陽性ＰＢＭＣを単離できる。単離したＰＢＭＣを、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を添加した培地で５〜７日間培養することにより、樹状細胞前駆細胞に分化誘導することができる。このようにして分化誘導した樹状細胞前駆細胞のＨＬＡクラスＩタイプがＡ２４である場合には、配列番号１または２のペプチドを添加する。一方、ＨＬＡクラスＩタイプがＡ０２である場合には、配列番号１のペプチドを添加する。こうして得られた樹状細胞は、配列１または２のペプチドを提示した抗原提示細胞であり、これを、がんに罹患する個体に投与する。
【００２８】
投与部位は、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、リンパ節投与、腹腔内投与などが考えられ、特に限定されない。ただし、生理的な樹状細胞の抗原提示を含む生理的な抗がん免疫反応が、がん組織内並びに樹状細胞投与部位の所属リンパ節近傍で行われることを考慮すると、がん組織内またはリンパ節内への直接投与が好ましい。
【００２９】
[Ｔ細胞を含有するがんワクチン]
また、配列番号１または２からなるペプチドを提示した抗原提示細胞の刺激によって樹立されたＴ細胞もまた、がんワクチンとして使用できる。このＴ細胞は、配列番号１または２からなるペプチドを提示した抗原提示細胞と共に、血清の存在下でナイーブＴ細胞を共培養し、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）またはＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞などへと分化させることによって得られる。このようにして樹立されたＴ細胞をがんに罹患する個体に投与してもよい。
【００３０】
なお、ナイーブＴ細胞の由来は特に限定されず、例えば、脊椎動物の末梢血由来であってもよい。用いるナイーブＴ細胞は、ＰＢＭＣ分画から単離されたＣＤ８陽性細胞やＣＤ４陽性細胞であってもよいが、ＣＴＬの誘導効率を考慮すると、ＰＢＭＣ分画から単離されておらず、他種の細胞や成分と混在した状態のＣＤ８陽性細胞やＣＤ４陽性細胞であることが好ましい。例えば、ＰＢＭＣ分画の細胞を配列１または２からなるペプチドと血清が添加された培地で培養すると、ＰＢＭＣが樹状細胞前駆細胞に分化し、樹状細胞前駆細胞はさらにペプチドと結合することで樹状細胞へと分化し、このペプチドを提示する抗原提示細胞になる。この抗原提示細胞がＰＢＭＣに含まれるＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激し、ＣＴＬに分化誘導する。こうして、添加したペプチドを認識するＣＴＬを得ることができる。この際、培養時間はＣＴＬが得られる範囲で当業者が適宜設定できるが、３７℃において４〜１０日間であることが好ましく、６日間であることがより好ましい。
【００３１】
このようにして得られたＣＴＬは、単離した後、そのままがんワクチンとして使用してもよいが、ＩＬ−２等のインターロイキン、抗原提示細胞、および配列１または２からなるペプチドの存在下でさらに培養した後にがんワクチンとして使用してもよい。この操作によって、ＣＴＬの細胞傷害性を高めることができる。
【００３２】
投与部位は、内皮投与、皮下投与、静脈内投与、腫瘍内投与などが例示でき、特に限定されないが、細胞傷害性Ｔ細胞の場合、抗原を発現する細胞を直接攻撃できるため、腫瘍内投与が好ましい。
【実施例】
【００３３】
[実施例１] ｓｎａｉｌ遺伝子の発現
本実施例では、ｓｎａｉｌ遺伝子が正常組織にほとんど発現していないが、がん細胞株およびがん組織では発現が高いことを示す。
【００３４】
＝＝ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析法＝＝
ＲＮｅａｓｙｋｉｔ(Qiagen 社)を用いて、健常人正常組織、大腸癌患者の癌組織と肉眼的に判定して得られた大腸正常部位、および種々のヒト腫瘍細胞株（膵臓癌、メラノーマ、白血病、大腸癌）（図１、２参照）からＲＮＡを抽出し、ＡＭＶで逆転写してｃＤＮＡを得た。次に、下記のプライマーを用いてｉＣｙｃｌｅｒ（Biorad 社)で遺伝子を増幅し、電気泳動にて遺伝子発現を検出した。なお、内部標準として、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を用いた。
Ｓｎａｉｌ用プライマー：
Forward 5'-CAGATGAGGACAGTGGGAAAGG -3'（配列番号５）
Reverse 5'-ACTCTTGGTGCTTGTGGAGCAG -3'（配列番号６）
ＧＡＰＤＨ用プライマー：
Forward 5'- GTCAACGGATTTGGTCGTATT -3'（配列番号７）
Reverse 5'- ATCACTGCCACCCAGAAGACT -3'（配列番号８）
【００３５】
図１Ａに示すように、健常人正常組織においては、胎盤（Placenta）、精巣（Testis）メラニン細胞（Melanocyte）、および大腸（colon）で弱いｓｎａｉｌ遺伝子の発現が検出できたが、脳（Brain）、心臓（Heart）、腎臓（Kidney）、脾臓（Spleen）、肝臓（Liver）、膵臓（Pancreas）、胸腺（Thymus）、骨格筋（Muscle）、骨髄（Bone marrow）、末梢血単核球（PBMC）では発現が検出できなかった。
【００３６】
また、進行度の異なる大腸癌患者から採取した大腸癌の癌組織（Ｔｕ）および、同患者の大腸の正常組織（目視で判断）（Ｎ）におけるｓｎａｉｌ遺伝子発現を図１Ｂに示す。世界中で汎用されている「米国対がん合同委員会（ＡＪＣＣ）」で規定されているがん病期診断基準に基づいて分類された、ステージＩ、ステージＩＩＢ、ステージＩＩＩＢの全ての進行度の大腸癌組織において、正常組織に比較して高いｓｎａｉｌ遺伝子発現が検出された。
【００３７】
さらに、図２に示すように、膵臓癌、メラノーマ、白血病、および大腸癌の各細胞株においては、それぞれ正常膵臓組織、メラニン細胞、末梢血単核球、および大腸組織と比較してｓｎａｉｌ遺伝子発現が低かった。
【００３８】
このように、ｓｎａｉｌ遺伝子はがん組織特異的に発現している。従って、ｓｎａｉｌ遺伝子の発現をがんの診断に利用できるのと同時に、ｓｎａｉｌをがん抗原として標的とした治療法は、各種臓器に対する副作用が少なく、広範ながん種の患者に対して適用できる。
【００３９】
[実施例２] ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人ＰＢＭＣを用いたＣＴＬの誘導
本実施例では、ｓｎａｉｌ １及びｓｎａｉｌ ３ペプチドを用いることにより、健常人のＨＬＡ−Ａ２４陽性ＰＢＭＣから、各ペプチドを認識して活性化するＣＴＬの誘導が可能であることを示す。
【００４０】
まず、ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人（Ａ、Ｂ）から、以下のようにＰＢＭＣを分離した。まず、採取した末梢血に１／１０量の４％クエン酸ナトリウムを加え、Ficoll-Paque（Amersham 社）に重層して遠心した（１５００ｒｐｍ、２０分、室温）。ＰＢＭＣが含まれる中間層をＰＢＭＣ分画として分離した。２．５ｘ１０７個のＰＢＭＣを、２０ ｍｌの１０％ウシ胎児血清 （ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地 (Invitrogen 社製)に浮遊させ、下記ｓｎａｉｌ １〜３の各ペプチド１０μｇ／ｍｌを加えて、３７℃、５％ＣＯ２環境下で６日間刺激培養した。この刺激培養により、各抗原ペプチドに反応するＣＴＬが分化する。Myltenyi 社の抗体結合ＭＡＣＳ磁気ビーズ法によって、そのＣＴＬを分離した。
【００４１】
なお、ＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチド（配列番号１０）およびＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド（配列番号１１）を、陽性対照として用いた。ＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチドとＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性抗原提示細胞に提示されてＣＤ８陽性Ｔ細胞からＣＴＬを誘導すること、および、そのＣＴＬはＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチド、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを認識してガンマ・インターフェロンを産生することが既に知られている。
ｓｎａｉｌ １：ＫＭＨＩＲＳＨＴＬ（配列番号１）
ｓｎａｉｌ ２：ＫＡＦＳＲＰＷＬＬ（配列番号９）
ｓｎａｉｌ ３：ＲＴＦＳＲＭＳＬＬ（配列番号２）
ＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖ：ＳＹＬＨＨＴＩＮＬ（配列番号１０）
ＮＹ−ＥＳＯ−１：ＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号１１）
【００４２】
刺激培養により得られたＣＴＬ １ｘ１０６個を、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ、Peprotech 社）およびＣＴＬの分化誘導に用いたのと同一のペプチド（０．１、１、または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で抗原提示細胞と共培養することにより、ＣＴＬをペプチドで刺激した。抗原提示細胞は、ＣＴＬの分化誘導に用いたのと同一の健常人から得たＰＢＭＣ（全細胞）を、１０μｇ/ｍｌのマイトマイシンＣを添加した１０ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２時間浮遊培養（３７℃、５％ＣＯ２）して不活性化し、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄することにより調製した。各ぺプチドを提示した抗原提示細胞がＨＬＡ−Ａ２４拘束的にＣＴＬを刺激すると、ＣＴＬはガンマ・インターフェロンを産生する。培養上清中に含まれるガンマ・インターフェロン値をヒトＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙキット（BD Biosciences 社）を用いて測定し、ＣＴＬが抗原提示細胞に提示されたペプチドを認識できるかどうか調べた。
【００４３】
図３に、０．１〜１０μｇ／ｍｌの各濃度のペプチドを添加してＣＴＬと抗原提示細胞とを共培養した場合の、健常人ＡおよびＢのＣＴＬによるガンマ・インターフェロン産生量を示す。なお、健常人Ａのグラフにおいて最左点は、いずれのペプチドも添加しない無添加群であり、健常人Ｂのグラフにおいて最左点は、１０μｇ／ｍｌの陰性対照ペプチド（ＫＳＰＷＦＴＴＬ、マウスレトロウイルス抗原 p15e ペプチド、配列番号１２）を添加した陰性対照群である。無添加群および陰性対照群では、ガンマ・インターフェロンは１００〜５００ ｐｇ／ｍｌ程度しか産生されなかった。一方、ｓｎａｉｌ １ペプチド、ｓｎａｉｌ ３ペプチド、陽性対照であるＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチドおよびＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドで刺激した群では、ペプチド濃度の上昇に伴ってガンマ・インターフェロン産生量が有意に増加した（ｐ＜０．０１、ｔ検定）。
【００４４】
図３に示すように、ガンマ・インターフェロンの産生量は、ペプチド濃度が１０μｇ／ｍｌの場合に最高値を示した。健常人ＡまたはＢにおけるガンマ・インターフェロン産生量は、ｓｎａｉｌ １ペプチドあるいはｓｎａｉｌ ３ペプチドを１０μｇ／ｍｌ添加した群では、無添加群あるいは陰性対照と比較して有意に高く（ｐ＜０．０１、ｔ検定）、陽性対照であるＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチドおよびＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドと比較して同程度、あるいは、より高いことが明らかである。
【００４５】
このように、健常人のＨＬＡ−Ａ２４陽性ＰＭＢＣを用いてｓｎａｉｌ １ペプチド（配列番号１）またはｓｎａｉｌ ３ペプチド（配列番号２）を細胞表面に提示した抗原提示細胞が得られる。また、この抗原提示細胞でＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激することで、ＨＬＡ−Ａ２４陽性抗原提示細胞に提示された各ペプチドを認識するＣＴＬが分化誘導される。
【００４６】
[実施例３] ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬの腫瘍細胞傷害活性
本実施例では、ｓｎａｉｌ ３ペプチドを用いてＰＭＢＣを刺激培養することにより得られたＣＴＬが、ＨＬＡ依存的にｓｎａｉｌ抗原陽性の腫瘍細胞に対する傷害活性を有することを示す。
【００４７】
ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人の血液から採取したＰＢＭＣをｓｎａｉｌ ３ペプチドで刺激培養して調製したＣＴＬ（実施例２参照、ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬ）と、標的細胞としてのヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ３２０（ＨＬＡ−Ａ２４陽性、ｓｎａｉｌ陽性、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性）とを、ＣＴＬ：ＣＯＬＯ３２０＝６．２５：１、１２．５：１、２５：１、あるいは５０：１の割合で混合し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培養液中で６時間、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。Immunocyto Cytotoxity Detection Kit (MBL 社)を用いて殺傷された腫瘍細胞を検出し、添付プロトコールに準じて腫瘍特異的傷害率を算出した。なお、本実施例では、陽性対照として、ｓｎａｉｌ ３ペプチドの代わりにＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを用いてＰＭＢＣの刺激培養を行った。
【００４８】
図４に示すように、ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬによる腫瘍特異的傷害率は、陽性対照であるＮＹ−ＥＳＯ−１認識ＣＴＬと同程度であった。また、その腫瘍特異的傷害率は、ＣＴＬの混合率が増えるに従い増加した。このように、ｓｎａｉｌ ３ペプチドを用いてＰＭＢＣを刺激培養することにより得られたＣＴＬは、ｓｎａｉｌを発現する腫瘍細胞に対して傷害活性を示す（図４Ａ、Ｂ、白丸のグラフ参照）。
【００４９】
また、ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬによる、腫瘍細胞上のｓｎａｉｌ抗原の認識はＨＬＡ依存的であることを示すため、抗ＨＬＡ抗体（ＨＬＡ中和抗体、BioLegend 社、最終濃度１０μｇ／ｍｌの存在下で、ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬとＣＯＬＯ３２０細胞との共培養を行った。
【００５０】
図４に示すように、抗ＨＬＡ抗体非添加の場合（図４Ａ、Ｂ、白丸のグラフ参照）に比較し、抗ＨＬＡ抗体を添加した群では、ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬによる腫瘍特異的傷害率が顕著に低下した（図４Ａ、Ｂ、黒丸のグラフ参照）。この結果は、ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬによる腫瘍特異的傷害は、ＨＬＡ依存的に腫瘍細胞上のｓｎａｉｌ抗原を認識していることを示している。
【００５１】
これらの結果は、健常人のＨＬＡ−Ａ２４陽性のＰＭＢＣをｓｎａｉｌ ３ペプチドを用いて刺激することにより、ｓｎａｉｌ抗原陽性の標的細胞に対する細胞傷害性を有するＣＴＬが誘導されること、さらに、このＣＴＬによる標的細胞のｓｎａｉｌ抗原認識はＨＬＡ依存的であることを示している。
【００５２】
[実施例４] ＨＬＡ−Ａ０２陽性健常人ＰＢＭＣを用いたＣＴＬの分化誘導
本実施例では、ｓｎａｉｌ １ペプチドを用いて分化誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ０２依存的にｓｎａｉｌ １ペプチドを提示している細胞を認識することができることを示す。
【００５３】
まず、実施例２に記載の方法に従って、ＨＬＡ−Ａ０２陽性健常人（Ｄ、Ｅ）から採血してＰＢＭＣを分離し、ｓｎａｉｌ １ペプチドを用いて一次刺激培養を行った。本実施例では、陽性対照としてＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチドを用い、陰性対照としてＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを用いた。なお、ＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチドは、ＨＬＡ−Ａ０２陽性抗原提示細胞に提示されてＣＤ８陽性Ｔ細胞からＣＴＬを誘導し、そのＣＴＬがＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチドを認識してガンマ・インターフェロンを産生することが既に知られている。また、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドはＨＬＡ−Ａ０２陽性抗原提示細胞に結合せず、ＣＴＬの誘導が生じないことが知られている。このようにして得られたＣＴＬを、実施例２と同様に調製したＨＬＡ−Ａ０２陽性抗原提示細胞およびＩＬ−２の存在下で、各ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間刺激した。ペプチドを提示した抗原提示細胞がＨＬＡ−Ａ０２拘束的にＣＴＬを刺激すると、ＣＴＬはガンマ・インターフェロンを産生する。培養上清に含まれるガンマ・インターフェロン値をヒトＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙキット（BD Biosciences 社）を用いて測定し、ＣＴＬがペプチドを提示した抗原提示細胞を認識できるかどうか調べた。
【００５４】
健常人Ｄ、ＥのＰＢＭＣから調製したＣＴＬによるガンマ・インターフェロン産生量を図５に示す。健常人ＤおよびＥにおいて、ｓｎａｉｌ １ペプチドおよびＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチド（陽性対照）で刺激した群では、陰性対照であるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドで刺激した群よりも有意に高いガンマ・インターフェロン産生が見られた（ｐ＜０．０１、ｔ検定）。一方、ｓｎａｉｌ ２ペプチドあるいはｓｎａｉｌ ３ペプチドで刺激した群では、陰性対照よりもガンマ・インターフェロン産生量が低かった。
【００５５】
このように、ｓｎａｉｌ １ペプチド（配列番号１）は、健常人のＨＬＡ−Ａ０２陽性ＰＢＭＣ由来の抗原提示細胞に提示され、ＣＤ８陽性Ｔ細胞から、ペプチドを認識するＣＴＬを誘導する。さらに、このＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ０２陽性提示細胞上のｓｎａｉｌ １ペプチドを認識することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの予防および治療に用いるがんワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がん免疫学において、免疫細胞によるがん抗原認識機構がかなり解明されてきた。それによると、まず、抗原提示細胞である樹状細胞（dendritic cells または ＤＣ）は、細胞内で、がんが発現するタンパク質を分解する際に生じた８〜１０個のアミノ酸からなる抗原ペプチドを、主要組織適合性抗原複合体（major histocompatibility complex または ＭＨＣ；ヒトでは、human leukocyte antigen または ＨＬＡ）と共に細胞表面に提示する。細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocyte または ＣＴＬ）は、樹状細胞表面のＨＬＡクラスＩに結合した抗原ペプチドを認識し、活性化・増殖し、腫瘍内に侵入し、抗原ペプチドが由来するタンパク質を有するがん細胞に対し細胞傷害を生じる（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
この機構を利用して、がんの治療方法としてがんワクチンが開発されてきた。例えば、がん特異的タンパク質由来の抗原ペプチドを細胞表面に提示する樹状細胞をin vitroで作製し、増殖させ、がん患者に投与したり、その樹状細胞によって教育された細胞傷害性Ｔ細胞を投与したりすることにより、がん患者の体内でがん免疫を誘導させる。あるいは、がん特異的タンパク質をがん患者に投与し、患者の体内で、がん免疫機構の全過程を誘導させるのである（例えば、非特許文献２〜７参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．（１９９０）１２６：２００−２０５
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：１６４３−１６４７；
【非特許文献３】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８３：１１８５−１１９２；
【非特許文献４】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：４９９４−５００４；
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：４３２−４３６
【非特許文献６】Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２６９：１２８１−１２８４
【非特許文献７】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７）１８６：７８５−７９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、がん免疫を効率的に誘導することのできるがん特異的タンパク質は、一部のがんにおいて、ほんの少数の例が知られているだけである。
【０００６】
そこで、本発明は、がん免疫を効率的に誘導できるペプチド、そのペプチドを含有する組成物、そのペプチドを提示した抗原提示細胞、この抗原提示細胞によって刺激されたＴ細胞、およびこれらのペプチドや細胞を利用したがんワクチン、及びそれらを用いたがん患者の治療方法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係るペプチドは、ＫＭＨＩＲＳＨＴＬ（配列番号１）またはＲＴＦＳＲＭＳＬＬ（配列番号２）の配列からなる。これらのペプチドを提示した抗原提示細胞、およびこの抗原提示細胞によって誘導され、ｓｎａｉｌ抗原を発現するがん細胞を認識するＴ細胞も、本発明の技術範囲に属する。このＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞であることが好ましい。また、ｓｎａｉｌ抗原を発現するがん細胞は、膵臓癌細胞、メラノーマ細胞、白血病細胞、または大腸癌細胞であることが好ましい。
【０００８】
本発明に係るがんワクチンは、配列番号１または配列番号２からなるペプチドのいずれかまたは両方のペプチド、配列番号１または２のペプチドを発現する発現ベクター、配列番号１または２の配列からなるペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞、あるいは、上記Ｔ細胞のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする。
【０００９】
また、本発明に係る、配列番号１または配列番号２からなるペプチドのいずれかまたは両方のペプチドを含むがんワクチンは、これらのペプチド以外のがん抗原ペプチドを含有していてもよい。
【００１０】
さらに、本発明に係るがんワクチンは、ｓｎａｉｌタンパク質を発現するがん細胞に対するがんワクチンであることが好ましい。
【００１１】
本発明に係るがんの治療・予防方法は、ヒトおよびヒト以外の脊椎動物に対し、本発明に係るがんワクチンを用いることを特徴とする。
【００１２】
ここで、本明細書で「がん」という用語は、上皮細胞由来の癌、非上皮細胞由来の腫瘍、血液のがんなどの新生物（neoplasm）を意味するものであり、がんの由来は問わない。
【００１３】
また、本明細書では、アクセッション番号ＮＭ＿００５９８５（配列番号３）の遺伝子をヒトｓｎａｉｌ遺伝子と称し、動物種の限定なくｓｎａｉｌ遺伝子と記載されている場合は、ヒト遺伝子に限らず、他の動物種のホモログやオーソログも含むものとする。そして、アクセッション番号ＮＰ＿００５９７６（配列番号４）のタンパク質をヒトｓｎａｉｌタンパク質と称し、動物種の限定なくｓｎａｉｌタンパク質と記載されている場合は、ヒトタンパク質に限らず、他の動物種のホモログやオーソログも含むものとする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって、がん免疫を効率的に誘導できるペプチド、そのペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞、この抗原提示細胞によって誘導されたＴ細胞、および、これらのペプチド、これらのペプチドを発現する発現ベクター、これらのペプチドを提示した抗原提示細胞、またはその抗原提示細胞によって誘導されたＴ細胞を含有するがんワクチン、そして、そのがんワクチンを用いたがんの治療・予防方法を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施例において、健常人の正常組織におけるｓｎａｉｌ遺伝子の発現（Ａ）、および、大腸癌患者の癌組織と同患者の正常組織におけるｓｎａｉｌ遺伝子の発現（Ｂ）を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、ヒト膵臓癌細胞株、ヒトメラノーマ細胞株、ヒト白血病細胞株、ヒト大腸癌細胞株におけるｓｎａｉｌ遺伝子の発現を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人末梢血単核球をｓｎａｉｌ １、２、３およびＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖ、ＮＹ−ＥＳＯ−１の各ペプチドで刺激培養して得られたＣＴＬを、０．１、１、あるいは１０μｇ／ｍｌの各ペプチドの存在下でＨＬＡ−Ａ２４陽性抗原提示細胞と共培養したときの、ＣＴＬによるガンマ・インターフェロン産生量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施例において、ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人末梢血単核球をｓｎａｉｌ ３あるいはＮＹ−ＥＳＯ−１で刺激培養して得られたＣＴＬに、ｓｎａｉｌを発現する腫瘍細胞を接触させたときの腫瘍特異的傷害率を測定した結果を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施例において、ＨＬＡ−Ａ０２陽性健常人末梢血単核球をｓｎａｉｌ １、２、３およびＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖ、ＮＹ−ＥＳＯ−１の各ペプチドで刺激培養して得られたＣＴＬを、１０μｇ／ｍｌの各ペプチドの存在下でＨＬＡ−Ａ０２陽性抗原提示細胞と共培養したときの、ＣＴＬによるガンマ・インターフェロン産生量を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されない。
【００１７】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１８】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１９】
＝＝がんワクチン＝＝
ｓｎａｉｌタンパク質の有するアミノ酸配列の一部である配列番号１または２からなるペプチドを抗原提示細胞である樹状細胞に添加したとき、ＨＬＡクラスＩ分子に結合することにより、細胞表面に提示され、細胞傷害性Ｔ細胞に認識されることで、ｓｎａｉｌを認識する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できる。また、各ペプチドの刺激により樹立された細胞傷害性Ｔ細胞がｓｎａｉｌタンパク質を発現するがん細胞を効率よく認識することから、配列番号１および２の両方又はいずれか一つのペプチド、そのペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞、および、抗原提示細胞によって誘導され、ｓｎａｉｌ抗原を発現しているがん細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞は、がんワクチンとして、がんの治療・予防に利用することができる。
【００２０】
＝＝がんワクチンの投与方法＝＝
現在、がんワクチンとして、腫瘍特異的がん抗原、がん抗原提示抗原提示細胞、または、がん抗原反応性細胞傷害性Ｔ細胞をがん患者に投与する方法が開発されている。ｓｎａｉｌタンパク質の部分ペプチドを用いたがんワクチンの、治療または予防対象となるがんは、ｓｎａｉｌタンパク質を発現しているがんであれば特に限定されず、神経腫、腎癌、肝癌、膵臓癌、肉腫、大腸癌、メラノーマ、肺癌、食道癌、子宮癌、精巣癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫など、固形がんでも血液のがんでも構わないが、膵臓癌、メラノーマ、白血病、大腸癌であることが好ましい。
【００２１】
本発明に係るがんワクチンによるがんの治療・予防の対象は、このようながんに罹患している脊椎動物であれば制限されず、ヒトであってもヒト以外であってもよい。
【００２２】
なお、以下に説明するがんワクチンは、それぞれ単独で投与しても、共投与しても、あるいは、ここに記載した以外のがんワクチンと共投与してもよい。
【００２３】
[ペプチドを含有するがんワクチン]
本発明のがんワクチンは、配列番号１および２のペプチドの両方またはいずれか一つを含有してもよい。この場合、あらかじめ患者のＨＬＡクラスＩのタイプを調べるのが好ましい。ここでは、患者のＨＬＡクラスＩタイプがＡ２４である場合に、配列番号１および２のペプチドの両方又はいずれか一つを投与することが好ましい。一方、ＨＬＡクラスＩタイプがＡ０２である場合には、配列番号１のペプチドを投与することが好ましい。このがんワクチンは、配列番号１および配列番号２のペプチド以外に、治療対象であるがん細胞の発現している他種のがん抗原ペプチドを含有していてもよい。また、投与する際には、免疫誘導能を高めるアジュバンドなどと共にペプチドを投与してもよい。また、投与されるペプチドは、生体内で分解されにくくするような修飾が施されていてもよい。さらには、ペプチドそのものではなく、これらのペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターなどを用い、ＤＮＡワクチンとして投与してもよい。
【００２４】
投与部位に関しては、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、腹腔内投与などが考えられ、特に限定されることはない。
【００２５】
ここで、配列番号１および２のペプチドの取得方法は特に制限されず、ペプチドを発現する細胞から単離・精製されたペプチドであっても、遺伝子組み換え技術を用いて製造された組換えペプチドであっても、または周知の方法で化学合成したペプチドであってもよい。
【００２６】
[抗原提示細胞を含有するがんワクチン]
配列番号１または２からなるペプチドを提示した抗原提示細胞も、がんワクチンとして使用することができる。ここで、細胞表面に提示されているペプチドは、無修飾であっても、糖やリン酸などで修飾されてもよい。抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｂ７や４−１ＢＢＬなどのＴ細胞刺激因子などを遺伝子導入等で強制的に発現させた腫瘍細胞（偽抗原提示細胞）等が例示できるが、抗原提示能の高さなどを考慮すると、樹状細胞が好ましい。以下、樹状細胞の単離方法の例を記載するが、他の細胞も公知の方法で容易に取得できる。
【００２７】
まず、脊椎動物個体の末梢血から単核球（以下、ＰＢＭＣとも称する）を単離し、ＨＬＡクラスＩタイプを調べてＡ２４またはＡ０２であることを確認する。このＰＢＭＣは、治療対象となる個体自身から分離することが好ましいが、他の個体から単離してもよい。また、このＰＢＭＣはＣＤ１４陽性またはＣＤ１１ｃ陽性であることが好ましい。ＰＢＭＣの単離方法は特に制限されず、単離したいＰＢＭＣの種類によって当業者が適宜決定できる。例えば、フィコール遠心分離法等によりＰＢＭＣ全体（ＰＢＭＣ分画）を単離でき、抗体結合磁気ビーズ分離法等によりＣＤ１４陽性ＰＢＭＣやＣＤ１１ｃ陽性ＰＢＭＣを単離できる。単離したＰＢＭＣを、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を添加した培地で５〜７日間培養することにより、樹状細胞前駆細胞に分化誘導することができる。このようにして分化誘導した樹状細胞前駆細胞のＨＬＡクラスＩタイプがＡ２４である場合には、配列番号１または２のペプチドを添加する。一方、ＨＬＡクラスＩタイプがＡ０２である場合には、配列番号１のペプチドを添加する。こうして得られた樹状細胞は、配列１または２のペプチドを提示した抗原提示細胞であり、これを、がんに罹患する個体に投与する。
【００２８】
投与部位は、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、リンパ節投与、腹腔内投与などが考えられ、特に限定されない。ただし、生理的な樹状細胞の抗原提示を含む生理的な抗がん免疫反応が、がん組織内並びに樹状細胞投与部位の所属リンパ節近傍で行われることを考慮すると、がん組織内またはリンパ節内への直接投与が好ましい。
【００２９】
[Ｔ細胞を含有するがんワクチン]
また、配列番号１または２からなるペプチドを提示した抗原提示細胞の刺激によって樹立されたＴ細胞もまた、がんワクチンとして使用できる。このＴ細胞は、配列番号１または２からなるペプチドを提示した抗原提示細胞と共に、血清の存在下でナイーブＴ細胞を共培養し、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）またはＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞などへと分化させることによって得られる。このようにして樹立されたＴ細胞をがんに罹患する個体に投与してもよい。
【００３０】
なお、ナイーブＴ細胞の由来は特に限定されず、例えば、脊椎動物の末梢血由来であってもよい。用いるナイーブＴ細胞は、ＰＢＭＣ分画から単離されたＣＤ８陽性細胞やＣＤ４陽性細胞であってもよいが、ＣＴＬの誘導効率を考慮すると、ＰＢＭＣ分画から単離されておらず、他種の細胞や成分と混在した状態のＣＤ８陽性細胞やＣＤ４陽性細胞であることが好ましい。例えば、ＰＢＭＣ分画の細胞を配列１または２からなるペプチドと血清が添加された培地で培養すると、ＰＢＭＣが樹状細胞前駆細胞に分化し、樹状細胞前駆細胞はさらにペプチドと結合することで樹状細胞へと分化し、このペプチドを提示する抗原提示細胞になる。この抗原提示細胞がＰＢＭＣに含まれるＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激し、ＣＴＬに分化誘導する。こうして、添加したペプチドを認識するＣＴＬを得ることができる。この際、培養時間はＣＴＬが得られる範囲で当業者が適宜設定できるが、３７℃において４〜１０日間であることが好ましく、６日間であることがより好ましい。
【００３１】
このようにして得られたＣＴＬは、単離した後、そのままがんワクチンとして使用してもよいが、ＩＬ−２等のインターロイキン、抗原提示細胞、および配列１または２からなるペプチドの存在下でさらに培養した後にがんワクチンとして使用してもよい。この操作によって、ＣＴＬの細胞傷害性を高めることができる。
【００３２】
投与部位は、内皮投与、皮下投与、静脈内投与、腫瘍内投与などが例示でき、特に限定されないが、細胞傷害性Ｔ細胞の場合、抗原を発現する細胞を直接攻撃できるため、腫瘍内投与が好ましい。
【実施例】
【００３３】
[実施例１] ｓｎａｉｌ遺伝子の発現
本実施例では、ｓｎａｉｌ遺伝子が正常組織にほとんど発現していないが、がん細胞株およびがん組織では発現が高いことを示す。
【００３４】
＝＝ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析法＝＝
ＲＮｅａｓｙｋｉｔ(Qiagen 社)を用いて、健常人正常組織、大腸癌患者の癌組織と肉眼的に判定して得られた大腸正常部位、および種々のヒト腫瘍細胞株（膵臓癌、メラノーマ、白血病、大腸癌）（図１、２参照）からＲＮＡを抽出し、ＡＭＶで逆転写してｃＤＮＡを得た。次に、下記のプライマーを用いてｉＣｙｃｌｅｒ（Biorad 社)で遺伝子を増幅し、電気泳動にて遺伝子発現を検出した。なお、内部標準として、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を用いた。
Ｓｎａｉｌ用プライマー：
Forward 5'-CAGATGAGGACAGTGGGAAAGG -3'（配列番号５）
Reverse 5'-ACTCTTGGTGCTTGTGGAGCAG -3'（配列番号６）
ＧＡＰＤＨ用プライマー：
Forward 5'- GTCAACGGATTTGGTCGTATT -3'（配列番号７）
Reverse 5'- ATCACTGCCACCCAGAAGACT -3'（配列番号８）
【００３５】
図１Ａに示すように、健常人正常組織においては、胎盤（Placenta）、精巣（Testis）メラニン細胞（Melanocyte）、および大腸（colon）で弱いｓｎａｉｌ遺伝子の発現が検出できたが、脳（Brain）、心臓（Heart）、腎臓（Kidney）、脾臓（Spleen）、肝臓（Liver）、膵臓（Pancreas）、胸腺（Thymus）、骨格筋（Muscle）、骨髄（Bone marrow）、末梢血単核球（PBMC）では発現が検出できなかった。
【００３６】
また、進行度の異なる大腸癌患者から採取した大腸癌の癌組織（Ｔｕ）および、同患者の大腸の正常組織（目視で判断）（Ｎ）におけるｓｎａｉｌ遺伝子発現を図１Ｂに示す。世界中で汎用されている「米国対がん合同委員会（ＡＪＣＣ）」で規定されているがん病期診断基準に基づいて分類された、ステージＩ、ステージＩＩＢ、ステージＩＩＩＢの全ての進行度の大腸癌組織において、正常組織に比較して高いｓｎａｉｌ遺伝子発現が検出された。
【００３７】
さらに、図２に示すように、膵臓癌、メラノーマ、白血病、および大腸癌の各細胞株においては、それぞれ正常膵臓組織、メラニン細胞、末梢血単核球、および大腸組織と比較してｓｎａｉｌ遺伝子発現が低かった。
【００３８】
このように、ｓｎａｉｌ遺伝子はがん組織特異的に発現している。従って、ｓｎａｉｌ遺伝子の発現をがんの診断に利用できるのと同時に、ｓｎａｉｌをがん抗原として標的とした治療法は、各種臓器に対する副作用が少なく、広範ながん種の患者に対して適用できる。
【００３９】
[実施例２] ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人ＰＢＭＣを用いたＣＴＬの誘導
本実施例では、ｓｎａｉｌ １及びｓｎａｉｌ ３ペプチドを用いることにより、健常人のＨＬＡ−Ａ２４陽性ＰＢＭＣから、各ペプチドを認識して活性化するＣＴＬの誘導が可能であることを示す。
【００４０】
まず、ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人（Ａ、Ｂ）から、以下のようにＰＢＭＣを分離した。まず、採取した末梢血に１／１０量の４％クエン酸ナトリウムを加え、Ficoll-Paque（Amersham 社）に重層して遠心した（１５００ｒｐｍ、２０分、室温）。ＰＢＭＣが含まれる中間層をＰＢＭＣ分画として分離した。２．５ｘ１０７個のＰＢＭＣを、２０ ｍｌの１０％ウシ胎児血清 （ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地 (Invitrogen 社製)に浮遊させ、下記ｓｎａｉｌ １〜３の各ペプチド１０μｇ／ｍｌを加えて、３７℃、５％ＣＯ２環境下で６日間刺激培養した。この刺激培養により、各抗原ペプチドに反応するＣＴＬが分化する。Myltenyi 社の抗体結合ＭＡＣＳ磁気ビーズ法によって、そのＣＴＬを分離した。
【００４１】
なお、ＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチド（配列番号１０）およびＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド（配列番号１１）を、陽性対照として用いた。ＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチドとＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性抗原提示細胞に提示されてＣＤ８陽性Ｔ細胞からＣＴＬを誘導すること、および、そのＣＴＬはＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチド、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを認識してガンマ・インターフェロンを産生することが既に知られている。
ｓｎａｉｌ １：ＫＭＨＩＲＳＨＴＬ（配列番号１）
ｓｎａｉｌ ２：ＫＡＦＳＲＰＷＬＬ（配列番号９）
ｓｎａｉｌ ３：ＲＴＦＳＲＭＳＬＬ（配列番号２）
ＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖ：ＳＹＬＨＨＴＩＮＬ（配列番号１０）
ＮＹ−ＥＳＯ−１：ＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号１１）
【００４２】
刺激培養により得られたＣＴＬ １ｘ１０６個を、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ、Peprotech 社）およびＣＴＬの分化誘導に用いたのと同一のペプチド（０．１、１、または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で抗原提示細胞と共培養することにより、ＣＴＬをペプチドで刺激した。抗原提示細胞は、ＣＴＬの分化誘導に用いたのと同一の健常人から得たＰＢＭＣ（全細胞）を、１０μｇ/ｍｌのマイトマイシンＣを添加した１０ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２時間浮遊培養（３７℃、５％ＣＯ２）して不活性化し、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄することにより調製した。各ぺプチドを提示した抗原提示細胞がＨＬＡ−Ａ２４拘束的にＣＴＬを刺激すると、ＣＴＬはガンマ・インターフェロンを産生する。培養上清中に含まれるガンマ・インターフェロン値をヒトＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙキット（BD Biosciences 社）を用いて測定し、ＣＴＬが抗原提示細胞に提示されたペプチドを認識できるかどうか調べた。
【００４３】
図３に、０．１〜１０μｇ／ｍｌの各濃度のペプチドを添加してＣＴＬと抗原提示細胞とを共培養した場合の、健常人ＡおよびＢのＣＴＬによるガンマ・インターフェロン産生量を示す。なお、健常人Ａのグラフにおいて最左点は、いずれのペプチドも添加しない無添加群であり、健常人Ｂのグラフにおいて最左点は、１０μｇ／ｍｌの陰性対照ペプチド（ＫＳＰＷＦＴＴＬ、マウスレトロウイルス抗原 p15e ペプチド、配列番号１２）を添加した陰性対照群である。無添加群および陰性対照群では、ガンマ・インターフェロンは１００〜５００ ｐｇ／ｍｌ程度しか産生されなかった。一方、ｓｎａｉｌ １ペプチド、ｓｎａｉｌ ３ペプチド、陽性対照であるＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチドおよびＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドで刺激した群では、ペプチド濃度の上昇に伴ってガンマ・インターフェロン産生量が有意に増加した（ｐ＜０．０１、ｔ検定）。
【００４４】
図３に示すように、ガンマ・インターフェロンの産生量は、ペプチド濃度が１０μｇ／ｍｌの場合に最高値を示した。健常人ＡまたはＢにおけるガンマ・インターフェロン産生量は、ｓｎａｉｌ １ペプチドあるいはｓｎａｉｌ ３ペプチドを１０μｇ／ｍｌ添加した群では、無添加群あるいは陰性対照と比較して有意に高く（ｐ＜０．０１、ｔ検定）、陽性対照であるＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチドおよびＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドと比較して同程度、あるいは、より高いことが明らかである。
【００４５】
このように、健常人のＨＬＡ−Ａ２４陽性ＰＭＢＣを用いてｓｎａｉｌ １ペプチド（配列番号１）またはｓｎａｉｌ ３ペプチド（配列番号２）を細胞表面に提示した抗原提示細胞が得られる。また、この抗原提示細胞でＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激することで、ＨＬＡ−Ａ２４陽性抗原提示細胞に提示された各ペプチドを認識するＣＴＬが分化誘導される。
【００４６】
[実施例３] ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬの腫瘍細胞傷害活性
本実施例では、ｓｎａｉｌ ３ペプチドを用いてＰＭＢＣを刺激培養することにより得られたＣＴＬが、ＨＬＡ依存的にｓｎａｉｌ抗原陽性の腫瘍細胞に対する傷害活性を有することを示す。
【００４７】
ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人の血液から採取したＰＢＭＣをｓｎａｉｌ ３ペプチドで刺激培養して調製したＣＴＬ（実施例２参照、ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬ）と、標的細胞としてのヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ３２０（ＨＬＡ−Ａ２４陽性、ｓｎａｉｌ陽性、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性）とを、ＣＴＬ：ＣＯＬＯ３２０＝６．２５：１、１２．５：１、２５：１、あるいは５０：１の割合で混合し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培養液中で６時間、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。Immunocyto Cytotoxity Detection Kit (MBL 社)を用いて殺傷された腫瘍細胞を検出し、添付プロトコールに準じて腫瘍特異的傷害率を算出した。なお、本実施例では、陽性対照として、ｓｎａｉｌ ３ペプチドの代わりにＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを用いてＰＭＢＣの刺激培養を行った。
【００４８】
図４に示すように、ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬによる腫瘍特異的傷害率は、陽性対照であるＮＹ−ＥＳＯ−１認識ＣＴＬと同程度であった。また、その腫瘍特異的傷害率は、ＣＴＬの混合率が増えるに従い増加した。このように、ｓｎａｉｌ ３ペプチドを用いてＰＭＢＣを刺激培養することにより得られたＣＴＬは、ｓｎａｉｌを発現する腫瘍細胞に対して傷害活性を示す（図４Ａ、Ｂ、白丸のグラフ参照）。
【００４９】
また、ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬによる、腫瘍細胞上のｓｎａｉｌ抗原の認識はＨＬＡ依存的であることを示すため、抗ＨＬＡ抗体（ＨＬＡ中和抗体、BioLegend 社、最終濃度１０μｇ／ｍｌの存在下で、ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬとＣＯＬＯ３２０細胞との共培養を行った。
【００５０】
図４に示すように、抗ＨＬＡ抗体非添加の場合（図４Ａ、Ｂ、白丸のグラフ参照）に比較し、抗ＨＬＡ抗体を添加した群では、ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬによる腫瘍特異的傷害率が顕著に低下した（図４Ａ、Ｂ、黒丸のグラフ参照）。この結果は、ｓｎａｉｌ ３認識ＣＴＬによる腫瘍特異的傷害は、ＨＬＡ依存的に腫瘍細胞上のｓｎａｉｌ抗原を認識していることを示している。
【００５１】
これらの結果は、健常人のＨＬＡ−Ａ２４陽性のＰＭＢＣをｓｎａｉｌ ３ペプチドを用いて刺激することにより、ｓｎａｉｌ抗原陽性の標的細胞に対する細胞傷害性を有するＣＴＬが誘導されること、さらに、このＣＴＬによる標的細胞のｓｎａｉｌ抗原認識はＨＬＡ依存的であることを示している。
【００５２】
[実施例４] ＨＬＡ−Ａ０２陽性健常人ＰＢＭＣを用いたＣＴＬの分化誘導
本実施例では、ｓｎａｉｌ １ペプチドを用いて分化誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ０２依存的にｓｎａｉｌ １ペプチドを提示している細胞を認識することができることを示す。
【００５３】
まず、実施例２に記載の方法に従って、ＨＬＡ−Ａ０２陽性健常人（Ｄ、Ｅ）から採血してＰＢＭＣを分離し、ｓｎａｉｌ １ペプチドを用いて一次刺激培養を行った。本実施例では、陽性対照としてＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチドを用い、陰性対照としてＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを用いた。なお、ＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチドは、ＨＬＡ−Ａ０２陽性抗原提示細胞に提示されてＣＤ８陽性Ｔ細胞からＣＴＬを誘導し、そのＣＴＬがＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチドを認識してガンマ・インターフェロンを産生することが既に知られている。また、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドはＨＬＡ−Ａ０２陽性抗原提示細胞に結合せず、ＣＴＬの誘導が生じないことが知られている。このようにして得られたＣＴＬを、実施例２と同様に調製したＨＬＡ−Ａ０２陽性抗原提示細胞およびＩＬ−２の存在下で、各ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間刺激した。ペプチドを提示した抗原提示細胞がＨＬＡ−Ａ０２拘束的にＣＴＬを刺激すると、ＣＴＬはガンマ・インターフェロンを産生する。培養上清に含まれるガンマ・インターフェロン値をヒトＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙキット（BD Biosciences 社）を用いて測定し、ＣＴＬがペプチドを提示した抗原提示細胞を認識できるかどうか調べた。
【００５４】
健常人Ｄ、ＥのＰＢＭＣから調製したＣＴＬによるガンマ・インターフェロン産生量を図５に示す。健常人ＤおよびＥにおいて、ｓｎａｉｌ １ペプチドおよびＨＥＲＶ−Ｈ ｅｎｖペプチド（陽性対照）で刺激した群では、陰性対照であるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドで刺激した群よりも有意に高いガンマ・インターフェロン産生が見られた（ｐ＜０．０１、ｔ検定）。一方、ｓｎａｉｌ ２ペプチドあるいはｓｎａｉｌ ３ペプチドで刺激した群では、陰性対照よりもガンマ・インターフェロン産生量が低かった。
【００５５】
このように、ｓｎａｉｌ １ペプチド（配列番号１）は、健常人のＨＬＡ−Ａ０２陽性ＰＢＭＣ由来の抗原提示細胞に提示され、ＣＤ８陽性Ｔ細胞から、ペプチドを認識するＣＴＬを誘導する。さらに、このＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ０２陽性提示細胞上のｓｎａｉｌ １ペプチドを認識することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１（ＫＭＨＩＲＳＨＴＬ）または配列番号２(ＲＴＦＳＲＭＳＬＬ)の配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列番号１または２の配列からなるペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞。
【請求項３】
請求項２に記載の抗原提示細胞によって誘導され、ｓｎａｉｌ抗原を発現しているがん細胞を認識するＴ細胞。
【請求項４】
細胞傷害性Ｔ細胞であることを特徴とする請求項３に記載のＴ細胞。
【請求項５】
前記がん細胞が、膵臓癌細胞、メラノーマ細胞、白血病細胞、あるいは大腸癌細胞であることを特徴とする、請求項３または４に記載のＴ細胞。
【請求項６】
配列番号１、２から選択される一つ以上のペプチド、前記ペプチドを発現する発現ベクター、請求項２に記載の抗原提示細胞、または、請求項３〜５のいずれかに記載のＴ細胞を含有するがんワクチン。
【請求項７】
Ｓｎａｉｌタンパク質を発現するがん細胞に対するがんワクチンであることを特徴とする請求項６に記載のがんワクチン。
【請求項８】
前記がんが、膵臓癌、メラノーマ、白血病、または大腸癌であることを特徴とする、請求項６または７に記載のがんワクチン。
【請求項９】
ヒト以外の脊椎動物に対する、請求項８に記載のがんワクチンを用いたがんの治療・予防方法。
【請求項１】
配列番号１（ＫＭＨＩＲＳＨＴＬ）または配列番号２(ＲＴＦＳＲＭＳＬＬ)の配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列番号１または２の配列からなるペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞。
【請求項３】
請求項２に記載の抗原提示細胞によって誘導され、ｓｎａｉｌ抗原を発現しているがん細胞を認識するＴ細胞。
【請求項４】
細胞傷害性Ｔ細胞であることを特徴とする請求項３に記載のＴ細胞。
【請求項５】
前記がん細胞が、膵臓癌細胞、メラノーマ細胞、白血病細胞、あるいは大腸癌細胞であることを特徴とする、請求項３または４に記載のＴ細胞。
【請求項６】
配列番号１、２から選択される一つ以上のペプチド、前記ペプチドを発現する発現ベクター、請求項２に記載の抗原提示細胞、または、請求項３〜５のいずれかに記載のＴ細胞を含有するがんワクチン。
【請求項７】
Ｓｎａｉｌタンパク質を発現するがん細胞に対するがんワクチンであることを特徴とする請求項６に記載のがんワクチン。
【請求項８】
前記がんが、膵臓癌、メラノーマ、白血病、または大腸癌であることを特徴とする、請求項６または７に記載のがんワクチン。
【請求項９】
ヒト以外の脊椎動物に対する、請求項８に記載のがんワクチンを用いたがんの治療・予防方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２０７８３２（Ｐ２０１１−２０７８３２Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７８６２５（Ｐ２０１０−７８６２５）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
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