がん性表現型を反転させるためのメラノーマ分化関連遺伝子（ｍｄａ７）の使用
【課題】がん細胞のがん性表現型を反転させるための、および腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するための方法の提供。
【解決手段】がん細胞のがん性表現型を反転させるために、または腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するためにメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む一定量の核酸を使用するもので、該核酸がアデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群より選択されるベクターに含まれる。
【解決手段】がん細胞のがん性表現型を反転させるために、または腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するためにメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む一定量の核酸を使用するもので、該核酸がアデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群より選択されるベクターに含まれる。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、1996年６月16日に出願されたＵ.Ｓ.シリアルＮｏ.０８/６９６,５７３の一部継続出願であり、原出願の内容は、参照により本願の開示内容の一部とする。
【０００２】
ここに開示された本発明は、保健社会福祉省（the Department Health and Human Services）からのＮＣＩ/ＮＩＨ助成金Ｎｏ.ＣＡ３５６７５の下、政府援助によりなされた。それ故、米国政府が本発明の一部権利をもっている。
【０００３】
本願を通して、種々の参照文献がかっこ内に引用されている。これら出版物の全開示は、本発明の属する技術分野の状況をより完全に記載するため、参照により本願の開示内容の一部とする。これら参照文献の完全な書誌的引用は、一連の実験の最後に見ることができる。
【発明の背景】
【０００４】
がんは、腫瘍形成の正の制御因子および負の制御因子として機能する複数の遺伝子の相互に関連した発現および抑制が関与する、複雑な多因子および多段階のプロセスである（１−５）。形質転換または腫瘍形成の優性表現型の導入に基づく直接的クローニングストラテジーにより、正に作用するがん遺伝子が同定された（６−９）。対照的に、がんの表現型を抑制する遺伝子の検出およびクローニングは、より困難で捕らえにくいことが分かった（10−15）。増殖および分化の制御に直接的に関与する遺伝子を単離するための直接的アプローチには、活発に増殖するがん細胞から構築されたｃＤＮＡライブラリーと不可逆的に増殖能を失い且つ最終分化するように誘導されたがん細胞から構築されたｃＤＮＡライブラリーとの差引き（subtraction）ハイブリダイゼーションが必要である（13、14）。この実験ストラテジーは、ヒトのメラノーマ細胞に適用されており、組換えヒトインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）およびメゼライン（mezerein）（ＭＥＺ）を用いた処理により最終分化を誘導して、ＤＮＡデータベースに以前に記載のない新規メラノーマ分化関連（mda）遺伝子のクローニングに至った（13、14）。増殖および細胞周期の制御を仲介する際の特定のmda遺伝子の直接的な役割は、mda-６の同定およびクローニングにより明らかであり（13−16）、これはサイクリン依存性キナーゼｐ２１の普遍的な阻害剤と同一である（17）。増殖制御におけるｐ２１の重要性は充分記載され、この遺伝子は、種々のアプローチを用いて幾つかの研究室により、ＷＡＦ−１、ＣＩＰ−１、およびＳＤＩ−１として、個々に単離された（18−20）。これらの研究により、増殖制御に関与する特定遺伝子が誘導され、ヒトのがん細胞における増殖停止および最終分化のプロセスに関与し得ることが示唆される。
【０００５】
mda-７遺伝子が、分化誘導剤（ＩＦＮ−βプラスＭＥＺ）で処理されたヒト・メラノーマ（Ｈ０−１）の差引きライブラリーからクローニングされた（13、14）。完全長のmda-７のｃＤＮＡは、1718ヌクレオチドであり、その主要なオープンリーディングフレームは、Ｍｒが23.8ｋＤａである206アミノ酸の新規タンパク質をコードしている（21）。以前の研究により、mda-７はヒト・メラノーマ細胞において増殖停止および最終分化誘導の役割として誘導されることが示唆される（14、21）。また、mda-７の発現はメラノーマの進行とは逆の関連性がある。即ち、活発に増殖する正常なヒトのメラニン細胞は、転移性ヒト・メラノーマ細胞よりもmda-７をより多く発現する（21）。その上、mda-７は、一過性のトランスフェクションアッセイにおいて、およびデキサメタゾン（ＤＥＸ）誘導性mda-７遺伝子を含む安定な形質転換細胞において、ヒト・メラノーマ細胞の増殖を抑制する（21）。これらの研究は、mda-７がヒトのメラニン細胞およびメラノーマの生理学に貢献し得ることを示しており、また、この遺伝子はヒト・メラノーマ細胞で過剰発現したときに増殖抑制特性を有することを示している。
【０００６】
mda-７遺伝子は、また、国際特許協力条約出願Ｎｏ．ＰＣＴ/ＵＳ９４/１２１６０（国際出願日1994年10月24日、国際公開Ｎｏ．ＷＯ９５/１１９８６）に記載されており、この内容は、参照により本願の開示内容の一部とする。
【０００７】
本発明は、mda-７が種々の起源（胸部、中枢神経系、子宮頸部、結腸、前立腺および結合組織など）のがん細胞において有効な増殖抑制遺伝子であることを報告する。コロニー形成の抑制は、ｐ５３および／または網膜芽細胞腫（ＲＢ）遺伝子に欠陥を有するがん細胞、またはｐ５３およびＲＢの発現を欠損しているがん細胞で起こる。対照的に、正常なヒト乳房の上皮細胞、ヒト皮膚の繊維芽細胞およびラット胚の繊維芽細胞におけるmda-７の発現は、定量的に、がん細胞ほどは増殖抑制を誘導しない。mda-７は、ヒト子宮頸部のがん腫（HeLa）および前立腺のがん腫（ＤＵ−145）細胞で安定に発現すると、増殖およびトランスフォーメーション関連特性に対して負の効果を示す。HeLa細胞に対するmda-７の効果は、アンチセンスmda-７遺伝子を発現する遺伝的に改変されたＡｄ５ベクターの感染により、ＭＤＡ-７タンパク質の存在しなくなった後には反転可能である。これらの観察により、mda-７は、種々の遺伝的欠陥を示すヒトのがんにおいて、広範囲の抑制作用を有する新規増殖抑制遺伝子であることが示唆される。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記遺伝子の発現可能な条件下でがん細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させる方法を提供する。本発明は、また、上記核酸を被検者のがん性細胞に導入することにより、被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法を提供する。
【０００９】
本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物をがん細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させる方法を提供する。本発明は、また、上記遺伝子産物を被検者のがん性細胞に導入することにより、被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法を提供する。
【００１０】
本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む一定量の核酸と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効な上記遺伝子の一定量の遺伝子産物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む薬学的組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】HeLa細胞における、ハイグロマイシン耐性コロニーの形成に対するmda-７発現の効果。HeLa細胞に、10μｇのｐＲＥＰ４ベクター（ＲＳＶベクター）、ｐＲＥＰ４ベクターにアンチセンス配向でクローニングされたmda-７（ＲＳＶ−ＭＤＡ−７−アンチセンス）、またはｐＲＥＰ４ベクターにセンス配向でクローニングされたmda-７（ＲＳＶ−ＭＤＡ−７−センス）をトランスフェクションし、100μｇのハイグロマイシンを含有する培地で選択した。
【図２】ｐＲＥＰ４ベクター HeLa cl １細胞およびmda-７（Ｓ）を発現しているHeLa cl ２細胞の単層増殖に対するアンチセンスmda-７の効果。HeLa cl １（ｐＲＥＰ４ベクターで形質転換されたHeLaクローン）細胞およびHeLa cl ２（mda-７を発現するHeLaクローン）細胞を、アンチセンスmda-７を発現する組み換えタイプ５アデノウイルス（Ａｄ５）［Ａｄ.mda-７（ＡＳ）］の１０プラーク形成ユニット/細胞での感染後に、または感染させないで、増殖させた。結果は、＜１０％の差がある３サンプルの平均細胞数である。
【図３】HeLa、HeLa cl １およびHeLa cl ２細胞における、高分子量−ＭＤＡ-７複合（ＨＭＣ）タンパク質、ＭＤＡ-７タンパク質、アクチンタンパク質に対するアンチセンスmda-７の効果。HeLa細胞およびHeLa cl １細胞（ｐＲＥＰ４ベクターで形質転換されたHeLaクローン）を、［35Ｓ］メチオニンでラベルした１０プラーク形成ユニット/細胞のＡｄ.mda-７（ＡＳ）で９６時間感染させるか（＋）または感染させないで（−）、ＨＭＣ、ＭＤＡ-７およびアクチンタンパク質のレベルを免疫沈降解析により測定した。HeLa cl ２（mda-７を発現するHeLaクローン）に関しては、１０プラーク形成ユニット/ｍＬのＡｄ.mda-７（ＡＳ）による感染のタンパク質レベルに対する効果を、＋24、＋48、＋72および＋96時間後に［35Ｓ］メチオニンラベルの細胞溶解物を免疫沈降解析することにより、測定した。HeLa cl ２細胞のコントロール突然変異体Ａｄ５（Ｈ５dl 434）による感染の効果を、１０プラーク形成ユニット/細胞での感染の96時間後に、［35Ｓ］メチオニンラベルの細胞溶解物を免疫沈降解析することにより測定した。
【図４】ＤＥＸ誘導性mda-７遺伝子を含むＤＵ-145クローンにおけるmda-７ＲＮＡおよびタンパク質の合成。 図４Ａ．１０-6Ｍ ＤＥＸの存在下または非存在下で、96時間細胞を増殖させ、全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロッティングを行い、mda-７、ネオマイシン耐性（NeoR）遺伝子およびＧＡＰＤＨをプローブを用いて検出した。 図４Ｂ．１０-6Ｍ ＤＥＸの存在下または非存在下で、96時間細胞を増殖させ、細胞性タンパク質を［35Ｓ］メチオニンでラベルし、ＭＤＡ-７およびアクチンタンパク質を認識する抗体を用いて免疫沈降させた。
【図５】無胸腺のヌードマウスにおける、株化ヒト子宮頸部がん（HeLa）異種移植片の増殖抑制。
【図６】HeLa腫瘍体積比に対するＡｄ.mda-７ Ｓの効果。結果は、Ａｄ.mda-７ Ｓがヌードマウスにおいてin vivoで腫瘍の進行を抑制できることを示している。
【発明の詳細な説明】
【００１２】
後述する実験の詳細な説明部分を理解し易くするため、ある程度頻繁に出てくる方法および／または用語は、Sambrookら（45）に説明がある。
【００１３】
本発明は、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記遺伝子の発現可能な条件下でがん細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法を提供する。
【００１４】
本発明は、また、被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸分子を、被検者の細胞内で前記遺伝子の発現が可能な条件下において被検者のがん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法を提供する。
【００１５】
核酸分子を細胞に導入する方法は、当該分野で周知である。裸の（naked）核酸分子を直接的形質転換により細胞に導入することができる。或いは、核酸分子をリポソーム中に埋め込むことができる。それ故、本発明は、裸のＤＮＡ技術、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、リポソーム、抗体で被覆したリポソーム、または機械的もしくは電気的手段により核酸分子を細胞に導入する上記方法を提供する。上記列挙した方法は、核酸分子を細胞に導入する実行可能な手段の例として挙げたにすぎない。公知の他の方法を、本発明で使用することもできる。
【００１６】
上記方法の一態様において、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）は、その発現が調節配列の制御下にあるように調節配列に連結されている。さらに別の態様において、調節配列は誘導的であるか、または構成的である。誘導プロモーターのような誘導的調節配列は、当該分野で公知である。構成的発現を指示することができるプロモーターのような調節配列も、当該分野で公知である。
【００１７】
別の態様において、調節配列は、組織特異的な調節配列である。このとき、mda-７遺伝子の発現は、組織特異的になるであろう。
【００１８】
上記方法の別の態様において、前記がん細胞は、がん細胞内に欠陥性の腫瘍抑制遺伝子が存在することにより特徴づけられる。欠陥性の腫瘍抑制遺伝子には、ｐ５３、網膜芽細胞腫（ＲＢ）またはｐ１６ink4a遺伝子が含まれるが、これに限定されない。
【００１９】
上記方法の一態様において、前記がん細胞は、がん細胞内に優性作用的（dominant acting）がん遺伝子が存在することにより特徴づけられる。特に、優性作用的がん遺伝子は、Ha-ras、突然変異体ｐ５３またはヒトパピローマウイルス遺伝子であり得る。Ha-rasは、Harveyウイルスのrasがん遺伝子である。
【００２０】
上記方法の一態様において、前記核酸はベクターを含む。該ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターを含むが、これに限定されない。好ましい態様において、アデノウイルスベクターは、mda-７を発現する複製欠陥性アデノウイルスベクターであり、Ａｄ.mda-７ Ｓと称される。別の態様において、アデノウイルスベクターは、複製コンピテントアデノウイルスベクターである。
【００２１】
本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物をがん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法を提供する。
【００２２】
本発明は、さらに、被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物を被検者のがん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法を提供する。
【００２３】
上記方法の一態様において、前記がん細胞は、胸部、子宮頸部、結腸、前立腺、鼻咽頭、肺、結合組織または中枢神経系の細胞を含むが、これに限定されない。前記がん細胞には、さらに、多形膠芽腫、リンパ腫および白血病由来の細胞が含まれる。
【００２４】
本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む一定量の核酸と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物を提供する。
【００２５】
ここで使用する「薬学的に許容可能なキャリア」という用語は、何れの標準的な薬学的キャリアをも包含する。この薬学的組成物は、選択した投薬方法にとって適切な如何なる形態にも構成され得る。経口投薬に適切な組成物は、固形形態（丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、および粉剤など）並びに液体形態（溶剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤など）を含む。非経口投薬に有効な形態は、滅菌溶剤、乳剤、および懸濁剤などである。
【００２６】
ある態様において、前記核酸はベクターを含む。ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶウイルス、レトロウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターを含むが、これに限定されない。好ましい態様において、アデノウイルスベクターは、mda-７を発現している複製欠陥性アデノウイルスベクターであり、Ａｄ.mda-７ Ｓ.と称される。別の態様において、アデノウイルスは、複製コンピテントアデノウイルスベクターである。
【００２７】
本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効な一定量のメラノーマ分化関連子（mda-７）の遺伝子産物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む薬学的組成物を提供する。
【００２８】
上記方法の一態様において、前記がん細胞は、胸部、子宮頸部、結腸、前立腺、鼻咽頭、肺、結合組織および中枢神経系の細胞を含むが、これに限定されない。前記がん細胞には、さらに、多形膠芽腫、リンパ腫および白血病由来の細胞が含まれる。
【００２９】
本発明は、以下の実験の詳細な説明によりさらに理解されるであろう。しかし、当業者なら、特定の方法および議論されている結果は、後述する請求の範囲で完全に説明された本発明の単なる例示であることを容易に認識するであろう。
【実験の詳細な説明】
【００３０】
がんは、増殖制御の欠陥により特徴づけられる病気であり、腫瘍細胞は、しばしば細胞分化の異常パターンを示す。組み換えヒト繊維芽細胞インターフェロンと抗白血病薬剤メゼライン（mezerein）との組み合わせは、ヒト・メラノーマ培養細胞のこれらの異常を直し、その結果、不可逆的な増殖停止および最終分化に至る。差引きハイブリダイゼーションにより、増殖停止し且つ最終分化したヒト・メラノーマ細胞において、発現が高まったメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）が同定される。mda-７が、異なる起源で複数の遺伝的欠陥を有するヒト腫瘍細胞にトランスフェクションされると、コロニー形成は減少する。対照的に、正常細胞（ヒト乳房上皮細胞、ヒト皮膚の繊維芽細胞およびラット胚の繊維芽細胞）を用いた一過性のトランスフェクションアッセイにおいて、増殖およびコロニー形成に対するmda-７の効果は、がん細胞を使って見出された効果より量的に少ない。mda-７の発現が高まった腫瘍細胞は、単層増殖および足場非依存性において抑制を示す。アンチセンスmda-７を発現している組み換えタイプ５のアデノウイルスを用いた感染により、インビトロにおける増殖および形質転換された表現型のmda-７による抑制は除去される。網膜芽細胞腫（ＲＢ）およびｐ５３遺伝子の両方を発現していないか、またはこれら両方に欠陥を有するがん細胞において増殖を抑制するmda-７の能力は、mda-７−誘導性の増殖抑制を仲介する際に、これら重要な腫瘍抑制因子が関与していないことを示している。mda-７が以前に記載された増殖抑制遺伝子とタンパク質ホモロジーがないこと、および正常細胞／がん細胞に対するこの遺伝子の分化的効果により、mda-７は新しいクラスのがん増殖抑制遺伝子に相当することが示唆される。
【００３１】
材料および方法
細胞系統および培養条件
ヒトがん腫細胞系統、例えばＭＣＦ-７およびＴ４７Ｄ（胸部）、ＬＳ１７４ＴおよびＳＷ４８０（結腸直腸）、HeLa（子宮頸部）、ＤＵ-１４５（前立腺）、並びにＨＯＮＥ−１（鼻咽頭）（９、22−25）を、１０％のウシ胎仔血清（ＤＭＥＭ-10）を補充したダルベッコ（Dulbecco）の改良イーグル（Eagle）培地中で、３７℃、５％ＣＯ2／９５％空気−加湿インキュベーターで増殖させた。別のヒト細胞タイプ、例えばＨＢＬ−１００（正常乳房上皮）、Ｈ０−１およびＣ８１６１（メラノーマ）、ＧＢＭ−１８およびＴ９８Ｇ（多形膠芽腫）、並びにSaos-２（ヒト骨肉腫）を同様の条件下で維持した。初期継代の正常なヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ；継代10−12）を、Clonetics Corporation（サンディエゴ、ＣＡ）から入手した。ＨＭＥＣ細胞を、Clonetics Corporationにより説明されたように無血清培地中で維持した。ＣＲＥＦ−Trans ６（クローン化したフィッシャー（Fischer）ラット胚の繊維芽細胞）（９、26）およびＣＲＥＦ Ha-ras（Ha-ras（Ｔ２４）がん遺伝子により形質転換されたＣＲＥＦ細胞）（27）を、ＤＭＥＭ-５中で培養した。HeLa cl １は、ハイグロマイシン耐性（HygR）のラウス肉腫ウイルスＲＳＶベクター（ｐＲＥＰ４）（Invitrogen）により形質転換されたHeLaクローンである。HeLa cl ２は、HygRのmda-７を発現するHeLaクローンである。HeLa cl １およびHeLa cl ２細胞を文献の記載どおりに構築し（12、21）、100μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有するＤＭＥＭ−１０中で維持した。ＤＵ-１４５ cl ６およびＤＵ-１４５ cl ７細胞は、（ｐＭＡＭneoベクターにクローニングされた）ＤＥＸ-誘導性mda-７遺伝子（Clontech）を含み（21）、200μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ-10中で維持した。
【００３２】
差引きハイブリダイゼーション、プラスミド、発現ベクター構築物、およびノーザンハイブリダイゼーション
差引きハイブリダイゼーションによるmda-７の同定およびクローニングは、文献の記載どおりに達成された（13）。完全長のmda-７のｃＤＮＡを、組み換えＩＦＮ−βプラスＭＥＺで処理されたＨ０−１のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし（13）、文献の記載どおりにｃＤＮＡ末端迅速増幅法を用いることにより（15）単離した。オープンリーディングフレームを含むmda-７のｃＤＮＡ断片（ヌクレオチド位置176−960）をＰＣＲで増幅し、ＴＡクローニングによりｐＣＲIITM（Invitrogen）にクローニングした。ベクター中の挿入物の配向を、制限マッピングにより決定した。ヒト細胞発現の構築物は、KpnＩ−XhoＩ断片をＰＣＲTMベクターからｐＲＥＰ４ベクター（Invitrogen）にセンス［mda-７（Ｓ）］またはアンチセンス［mda-７（ＡＳ）］配向で、ＲＳＶプロモーターの下流にクローニングすることにより作成された。別途、mda-７遺伝子の断片を、センスおよびアンチセンス配向でｐＭＡＭneo（Clontech）ベクターにクローニングした。ＲＮＡの単離およびノーザンブロッティングを記載どおりに行った（９,12,13,21)。
【００３３】
単層増殖、足場非依存性およびＤＮＡ−トランスフェクションアッセイ
単層増殖および足場非依存性増殖アッセイを、以前に文献に記載されたとおりに行った（８,12,26）。単層コロニー形成に対するmda-７の効果を調査するため、挿入物のないベクター、またはmda-７（Ｓ）もしくはmda-７（ＡＳ）発現構築物を含むベクター［ｐＲＥＰ４（ＲＳＶ）］を、リポフェクション法（ＧＩＢＣＯ/ＢＲＬ）により種々の細胞タイプにトランスフェクションし、ハイグロマイシン中でのハイグロマイシン耐性コロニー形成または細胞増殖を測定した（12,21）。
【００３４】
アンチセンス−mda-７ アデノウイルスベクターの構築
組み換え型の複製欠陥性Ａｄ.mda-７（ＡＳ）を２段階で作成した。第一に、mda-７遺伝子のコード配列を、改良型のＡｄ発現ベクターｐＡｄ.CMVにクローニングした（28）。これは、順に、Ａｄゲノムの左端に由来する355ｂｐ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、スプライス供与部位および受容部位をコードするＤＮＡ、所望の遺伝子（この場合mda-７）のためのクローニング部位、βグロビン遺伝子由来のポリＡシグナル配列をコードするＤＮＡ、およびＥ１Ｂコード領域内から延びる約３kbpのアデノウイルス配列を含む。この配列は、クローニングされた配列のＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターによる高レベルの発現、およびＲＮＡプロセッシングを可能にする（28）。組み換えウイルスは、mda-７含有ベクターとプラスミドＪＭ17との間の相同的組み換えにより293細胞内でin vivoで作成され（29）、これは、改良型ｐＢＲ322にクローニングされたＡｄゲノム全体を含んでいる（30）。ＪＭ17は、in vivoでＡｄゲノムを生じるが、Ａｄゲノムは大きすぎて組み込むことができない。この制約からは、選択遺伝子を含んだ組み込み可能なゲノムを作成するためのベクターとの組み換えにより解放される（30）。組み換えウイルスは、293細胞以外のヒト細胞において複製欠陥があり、これはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する。二つのプラスミドのトランスフェクションの後、感染ウイルスを回収し、ゲノムを分析して組み換え構造を確認し、次いでウイルスをプラーク精製した。全て標準手法により行った（31）。
【００３５】
ペプチド抗体の産生および免疫沈降法解析
ペプチド抗体は、文献の記載どおりにＰＳＱＥＮＥＭＦＳＩＲＤに対して調製した（21）。対数的に増殖するHeLa、HeLa Cl １（HygRのｐＲＥＰ４ベクターコントロールHeLaクローン）およびHeLa cl ２［ｐＲＥＰ４-mda-７（Ｓ）によりトランスフェクションされたHygRのmda-７発現HeLaクローン］細胞を、未処理にするか、または１０プラーク形成ユニットのコントロールアデノウイルス（Ｈ５dl434）（32）もしくはmda-７（ＡＳ）を発現する組み換えアデノウイルス［Ad.mda-７（ＡＳ）］で感染させた。感染後、さまざまな時間において、培養物をメチオニンなしの培地中において３７℃で１時間、メチオニン飢餓にし、細胞を沈殿させることにより濃縮し、100μCi（１Ci＝３７GBq）の35Ｓ（NEN；Express 35Ｓ）を用いて１ｍＬの同培地中で４時間３７℃で標識した。２μｇのＭＤＡ-７ペプチドのウサギポリクローナル抗体またはアクチンモノクローナル抗体（Oncogene Sciences）を用いた免疫沈降法解析は、文献の記載どおりに行った（15,21）。
【００３６】
実験結果
ヒトがん細胞およびHa-ras-形質転換されたラット胚の繊維芽細胞におけるmda-７の増殖抑制特性の増大
ＤＮＡトランスフェクションアッセイを行って、細胞増殖に対するmda-７発現増大の効果を評価した。ヒトの子宮頸部癌腫（HeLa）細胞にmda-７（Ｓ）構築物をトランスフェクトさせると、mda-７（Ｓ）構築物は、ｐＲＥＰ４ベクターおよびmda-７（ＡＳ）構築物によりトランスフェクションされた培養物と比べて、HygRコロニーが１０〜１５倍減少する（図１および表１）。
【表１】
【００３７】
a 対数的に増殖する細胞を、100-mmプレートあたり１×106で播き、挿入物なしのベクター、またはmda-７（Ｓ）もしくはmda-７（ＡＳ）を含む10μｇのベクターでトランスフェクションした。24時間後、細胞を100μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有する培地に、100-mmプレートあたり約２×105細胞で再度播いた。培地を３日または４日ごとに交換し、１４日目または２１日目にプレートをホルムアミドで固定しギムザ染色をした。50以上の細胞を含むコロニーを数え上げた。表示の値は、４または５プレートで形成された平均HygRコロニー±S.D.である。
b かっこ内の値は、ＲＳＶ-mda-７（ＡＳ）によりトランスフェクションされた細胞と比較したときのコロニー形成の低下倍数を示している。
c ＭＣＦ-７、Ｔ４７Ｄ、HeLa、ＬＳ１７４Ｔ、ＤＵ-１４５およびＨＯＮＥ-１は、表示の構造部位から単離したヒトがん腫（Ｃａ）細胞系統である。Ｔ９８Ｇは、ヒト多形膠芽腫の細胞系統である。ＣＲＥＦ-rasは、Ha-ras（Ｔ２４）がん遺伝子により形質転換されたＣＲＥＦクローンである。
【００３８】
より少ないコロニー形成に加えて、mda-７（Ｓ）コロニーは、一般に、ｐＲＥＰ４ベクターまたはmda-７（ＡＳ）構築物でのトランスフェクション後に得られた対応するHygRコロニーよりサイズが小さい（図１）。mda-７（Ｓ）構築物を別のヒトがん細胞系統にトランスフェクションすると、HygRコロニー形成を３ないし１０倍低下させる（表１）。これらには、ヒト胸部がん腫（ＭＣＦ-７およびＴ４７Ｄ）、結腸がん腫（ＬＳ１７４ＴおよびＳＷ４８０）、鼻咽頭がん腫（ＨＯＮＥ-１）、前立腺がん腫（ＤＵ-１４５）、メラノーマ（Ｈ０-１およびＣ８１６１）、多形膠芽腫（ＧＢＭ-１８およびＴ９８Ｇ）並びに骨肉腫（Saos-２）が含まれる。HeLa細胞で観察されたとおり、mda-７（Ｓ）構築物でトランスフェクション後に形成されるHygRコロニーの平均サイズは、空のｐＲＥＰ４ベクターまたはmda-７（ＡＳ）構築物でのトランスフェクション後に形成されたものより小さい。これらの結果は、mda-７が広範囲の組織学的に異なるヒトのがんにおいて過剰発現すると、効力のある増殖抑制遺伝子であることを実証している。
【００３９】
mda-７が正常細胞の増殖を抑制するかどうか、およびこの効果がヒトがん細胞で観察された効果と定量的に同一であるかどうかを測定するため、一過性のＤＮＡトランスフェクションアッセイを、継代10ないし12の正常なヒト乳房上皮（ＨＭＥＣ）細胞、正常な胸部上皮細胞系統ＨＢＬ-100、正常なヒト皮膚繊維芽細胞（継代21）およびクローニングされた正常なラット胚の繊維芽細胞系統（ＣＲＥＦ-Trans６）を用いて行った（７，８）。ＨＭＥＣ、ＨＢＬ-100および正常なヒト皮膚繊維芽細胞は、フィーダー層を用いたときでさえ、高頻度に明確なコロニーを形成しないので、異なるＲＳＶ構築物を用いてトランスフェクションし、ハイグロマイシン中で２〜３週間増殖させた後の全細胞数に対する効果を測定した。このアプローチを用いて、mda-７（ＡＳ）またはｐＲＥＰ４ベクターでトランスフェクトされた正常細胞に対してmda-７（Ｓ）において、ＨＭＥＣでは約1.1ないし1.6倍の減少、ＨＢＬ-100では1.1ないし1.2倍の減少、正常なヒト皮膚繊維芽細胞数では1.3ないし2.1倍の減少が（各細胞タイプを用いた３回の独立実験で）各々観察された。対照的に、同様の実験プロトコールを用いたＴ４７Ｄヒト胸部がん腫細胞に関しては、ベクターおよびアンチセンスでトランスフェクトされた細胞と比較して、mda-７（Ｓ）構築物でのトランスフェクション後に、約3.2ないし5.2倍増殖は抑制された。ＣＲＥＦ-Trans６細胞の場合、６回の独立トランスフェクションアッセイに関するHygRコロニー形成において、mda-７（ＡＳ）およびベクタートランスフェクトされた細胞に対するmda-７（Ｓ）との間の違いは、0.5から2.8倍まで及んでいる（表１）。対照的に、mda-７（Ｓ）構築物のHa-ras形質転換ＣＲＥＦ細胞へのトランスフェクションは、コロニー形成を６〜８倍低下させた（表１）。これらの結果は、ヒトがん細胞およびHa-ras形質転換されたラット胚細胞ほど、正常なヒト細胞および正常な齧歯類細胞において、mda-７が、増殖およびコロニー形成を低下させるのに定量的に有効でないことを示している。
【００４０】
安定かつ誘導的なmda-７発現の細胞増殖に対する効果、およびmda-７発現のアンチセンス阻害の細胞増殖に対する効果、並びに形質転換された表現型
mda-７（Ｓ）遺伝子でのトランスフェクション後に低頻度にHeLa細胞が生存する理由を決定するため、mda-７（Ｓ）構築物でのトランスフェクション後に、１０個の独立したHygRコロニーを単離した。ノーザンブロッティングによりmda-７発現について解析した１０クローンのうち、７クローンは検出可能なmda-７のｍＲＮＡを発現しておらず、２クローンは低レベルのmda-７のｍＲＮＡを発現しており、１クローン（名称HeLa cl ２）は、高レベルのmda-７のｍＲＮＡを発現していた。対照的に、このクローンの全てが、HygRおよびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の匹敵するレベルの発現を示した。親のHeLa細胞またはｐＲＥＰ４ベクターHeLaクローン（名称HeLa cl １）と比較すると、HeLa cl ２（mda-７発現）細胞は低速度で増殖した（図２）。寒天で増殖させると、クローニングされていないHeLaおよびHeLa cl １細胞は、約４２％の効率で増殖したが、HeLa cl ２（mda-７発現）細胞は、約２５％の効率で増殖し、コロニーの平均サイズは、親のHeLaおよびｐＲＥＰ４ベクターHeLa cl １細胞について観察されたよりも小さかった。これらの結果より、mda-７でのトランスフェクションした後のHeLaの生存は、主として、mda-７発現の欠損または低レベルのmda-７発現に起因して起こることが示される。しかし、mda-７を安定に高レベルで発現しているHeLa細胞において、単層培養および足場非依存性における増殖は低下する。
【００４１】
HeLa cl ２（mda-７発現）において観察されたin vitroでの増殖の低下および形質転換抑制が、mda-７発現の直接的な結果であるかどうかを決定するため、mda-７発現を直接的に抑制するためにアンチセンスストラテジーを使用した。アンチセンス配向にクローニングされたmda-７遺伝子を含む組み換えＡｄ５ベクター［Ａｄ.mda-７（ＡＳ）］を構築した。Ａｄ.mda-７（ＡＳ）によるHeLa cl ２（mda-７発現）の感染は、増殖速度および寒天クローニング効率を（約25％から約44％に）増加させるが、HeLa cl １（ｐＲＥＰ４ベクター、mda-７発現せず）または親のHeLaはそうではない（図２）。対照的に、mda-７遺伝子を含有しないコントロールの突然変異体Ａｄ５ベクター（Ｈ５dl434）は、親のHeLa、HeLa cl １またはHeLa cl ２細胞の単層増殖または寒天増殖に影響を及ぼさない（データ示さず）。
【００４２】
ウサギで生産したmda-７特異的ペプチド抗体および免疫沈降法解析を使用したところ、HeLa cl ２（mda-７発現）細胞では、約２４ｋＤａタンパク質のＭＤＡ-７および約９０ないし110ｋＤａの高分子量複合（ＨＭＣ）タンパク質のレベルが増大している（図３）。Ａｄ.mda-７（ＡＳ）での感染は、２４ｋＤａのＭＤＡ-７タンパク質およびＨＭＣタンパク質両方の一時的な低下を引き起こすが、Ｈ５dl434コントロールのmda-７非発現ウイルスではそうではない（21）（図３）。両タンパク質の低下したレベルは、Ａｄ.mda-７（ＡＳ）での感染後48時間後に見られ、96時間にわたって抑制されたままである。対照的に、アクチンレベルは、ウイルス感染後も未変化のままである。これらの観察は、HeLa cl ２（mda-７発現）におけるＭＤＡ-７タンパク質発現のアンチセンス阻害が、mda-７誘導による増殖抑制および足場非依存性増殖の抑制を直接消滅させ得ることを示している。
【００４３】
mda-７の細胞増殖に対する抑制効果を確認するため、ＤＵ-145ヒト前立腺がん細胞を、ＤＥＸ誘導性mda-７遺伝子を発現するように操作した。［ＤＥＸ誘導性mda-７（Ｓ）遺伝子を含む］ＤＵ-145 cl ６またはcl７細胞を、10-6Ｍ ＤＥＸの存在下で２４〜９６時間増殖させると、mda-７のｍＲＮＡおよび（ＨＭＣタンパク質を含む）タンパク質が誘導されるが、親のＤＵ-145細胞ではそうではない（図４）。対照的に、ＤＥＸは、ＤＵ-145 cl ６およびcl ７細胞においてネオマイシン耐性（NeoR）遺伝子の発現を変化させず、または試験された細胞全てにおいてＧＡＰＤＨの発現を変化させない（図４）。ＤＵ-145 cl ６およびcl ７細胞において、10-6Ｍ ＤＥＸ中の増殖によるmda-７発現の誘導は、ＤＥＸの非存在下の増殖と比べて、９６時間後の細胞数を約５０％低下させる。対照的に、親のＤＵ-145またはｐＭＡＭneoベクター形質転換ＤＵ-145細胞を、１０-6Ｍ ＤＥＸを含む培地中で９６時間増殖させても、有意な増殖抑制は起こらない（データ示さず）。これらのデータは、mda-７の異所性発現が、前立腺がん細胞において細胞増殖を直接変化させ得ることを示している。
【００４４】
実験の考察
差引きハイブリダイゼーションにより、増殖停止し且つ最終分化したヒト・メラノーマ細胞において、発現の増大したmda遺伝子が同定された（13、14、21）。これらmda遺伝子の機能を決定することは、ヒト・メラノーマおよび他の細胞タイプにおける増殖制御および最終分化の分子的根拠を規定する際に重要であろう。mda-７遺伝子（14、21）は、広範囲のヒトがん細胞系統において一過性または安定に発現すると、普遍的な増殖抑制遺伝子であることが今日示されている。この発見は、ヒト・メラノーマ細胞におけるＭＤＡ-７タンパク質の増殖抑制特性を示す以前の観察を拡張するものである（21）。がん細胞に対するその効果に対して、正常なヒト乳房上皮、正常なヒト皮膚繊維芽細胞および正常なラット胚繊維芽細胞へのmda-７のトランスフェクションは、定量的により低い増殖抑制を生じさせる。別のmda遺伝子であるmda-６（ｐ21）と同様に、mda-７の発現もメラノーマの進行と逆の関連があり、mda-６（ｐ21）およびmda-７両方のレベルの増大は、転移性ヒト・メラノーマ細胞と比べて正常なヒトメラニン細胞に存在する（14-16、21）。メラノーマ細胞に対して低下した速度ではあるが、正常なメラニン細胞はなお増殖能を保持しているため、mda-６（ｐ21）およびmda-７の両方が、メラニン細胞／メラノーマ直系細胞においてメラノーマ進行の負のレギュレーターとして機能することが可能である（14-16、21）。その上、最終分化をし且つ不可逆的に増殖停止したヒト・メラノーマ細胞において、mda-６（ｐ21）およびmda-７両方の発現が増大することにより、これらの遺伝子が最終分化表現型の重要なレギュレーターであることが示唆され得る（13-16、21）。
【００４５】
mda-７がヒトがん細胞に対してその増殖抑制効果を引き出すメカニズムは、現在知られていない。mda-７の構造は、潜在的な作用モードを示唆する配列モチーフが存在しないため、潜在的な機能に対する識見を提供してくれない。細胞増殖に対するmda-７の効果は、広範囲にわたって研究された腫瘍抑制遺伝子ｐ５３と区別することができる（33、34）。突然変異体ｐ５３を含むヒト胸部のがん腫細胞系統Ｔ４７Ｄにおけるｐ５３の一過性発現は、増殖抑制を引き起こすが、野生型ｐ５３を含むヒト胸部のがん腫細胞系統ＭＣＦ-７に野生型ｐ５３遺伝子をトランスフェクションしても、増殖抑制を引き起こさない（34）。対照的に、mda-７は、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ−７細胞の両方において同様の増殖抑制を引き起こす（表１）。mda-７による増殖抑制は、網膜芽細胞腫遺伝子（ｐＲＢ）、ｐＲｂ関連のｐ１０７遺伝子および推定腫瘍抑制遺伝子ｐ１６ink4について観察されたものと切り離して考えることもできる（25、35）。ｐＲｂおよびｐ107の過剰発現は、特定の細胞タイプにおいて細胞周期に依存した方法で細胞増殖を抑制する（35-37）。明らかに正常なＲＢ遺伝子を含むヒトグリア芽細胞腫の細胞系統Ｔ９８Ｇに対してｐＲｂまたはｐ１０７をトランスフェクションすること（25）によっては増殖抑制は引き起こされないが（35、37）、mda-７（Ｓ）の一過性発現は、Ｔ９８Ｇコロニー形成を低下させる（表１）。現時点で、mda-７の増殖抑制効果は、ＲＢファミリーメンバーｐ１３０／ｐＲｂ２（これはＴ９８Ｇ細胞においても増殖を抑制する）により誘導される増殖抑制と区別することができない（25）。ｐ１６ink4遺伝子は、機能的なＲＢ遺伝子を含む細胞において増殖停止を引き起こすが（35、37）、mda-７の増殖抑制は、正常、異常、または非機能的なＲＢ遺伝子を含む細胞において起こる。突然変異したＲＢ遺伝子を含むヒト前立腺がん腫の細胞系統ＤＵ-145（38）およびＲＢ（または野生型ｐ５３）を発現しないヒト骨肉腫細胞Saos-２にmda-７をトランスフェクションすることによって、コロニー形成の抑制が引き起こされる（表１）。同様に、安定なＤＥＸ-誘導性mda-７により形質転換されたＤＵ-145クローンにおけるmda-７発現の誘導は、増殖抑制を引き起こす。これらの発見
により、mda-７による増殖抑制に関しては、機能的ＲＢ遺伝子に対する依存性がないことが示される。これらの研究を総合的に考えると、mda-７の抑制効果は、二つの最も広く研究された腫瘍抑制遺伝子であるｐ53およびｐＲＢ、並びに推定腫瘍抑制遺伝子ｐ１６ink4の作用様式とは異なるメカニズムにより起こることが説明される。
【００４６】
ほ乳類細胞における増殖の停止またはＤＮＡ損傷の関数として発現の増大を示す、幾つかの遺伝子が同定された（39,40）。増殖の停止およびＤＮＡの損傷を誘導する３つの（gadd）遺伝子（gadd45、gadd153およびgadd34）、密接に関連した骨髄分化初期応答（MyD118）遺伝子（41）、並びに野生型ｐ５３の抑制遺伝子mdm-２（42）は、ＤＮＡ損傷剤メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）での処理により細胞内でアップレギュレートされる（40）。gadd45および増殖停止特異的遺伝子（gas１）（43,44）は、細胞を集密状態に維持することにより、血清飢餓細胞により、または低血清で細胞を増殖させることより誘導される（40,43,44）。対照的に、mda-７のｍＲＮＡ発現は、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）による処理後、または細胞を集密状態に維持した後、ヒト・メラノーマ細胞において誘導されない（21）。その上、９６時間の無血清培地での増殖後、Ｈ０−１ヒト・メラノーマ細胞において、mda-７のｍＲＮＡ発現にはわずかな増大しか起こらない（21）。gadd、MyD118およびgas-1遺伝子と比べたmda-７の調節における違いにより、mda-７が新規クラスの増殖停止遺伝子の典型であり得ることが示される。
【００４７】
要約すると、正常および突然変異のｐ５３遺伝子並びにＲＢ遺伝子の両方を含むヒトがん細胞において増殖抑制を誘導する、負の増殖レギュレーター、即ちmda-７が説明されている。mda-７のゲノム構造の特性決定は、この遺伝子が腫瘍抑制遺伝子として正常に機能するかどうか、および正常細胞と腫瘍細胞との比較においてこの遺伝子に変異が存在するかどうかを決定する際に重要となるであろう。mda-７のプロモーター領域の同定は、更に、この遺伝子が特定の細胞タイプにおいて特異的に発現し、且つＩＦＮ−βプラスＭＥＺにより誘導的であるメカニズムの解析を可能にするであろう。mda-７が正常細胞よりもがん細胞および形質転換細胞に対して増殖抑制的であるという発見は、潜在的に重要であり且つ研究の発展を保証するものである。この観点において、特定のヒト悪性疾患の治療における効能について野生型ｐ５３遺伝子が現在試験されているのと類似の方法で、mda-７が、がん治療のための遺伝子ベースの治療ストラテジーの一部として有効であることが証明されるであろう。
【参照文献】
【００４８】
実験の第二シリーズ
組み換えアデノウイルスにおけるメラノーマ分化関連遺伝子−７（mda-７）は、ヌードマウスの株化ヒト腫瘍の増殖を抑制する。
【００４９】
単層培養におけるコロニー形成の低下により示されたように、種々の起源のヒト腫瘍細胞におけるmda-７の異所性発現が増殖を抑制することが、以前の研究により文書で示されている（Jiangら、ＰＮＡＳ、93：9190-9165、1996）。対照的に、mda-７は、正常なヒト上皮細胞または繊維芽細胞の増殖を顕著には変えない。これらの観察は、mda-７が普遍的ながん増殖抑制遺伝子であるという仮説を支持している。
【００５０】
がん細胞の増殖を選択的に抑制するmda-７の能力は、この遺伝子がヒトのガン治療において治療上の利益をもたらすことを示唆している。この可能性を詳しく調べるため、複製欠陥性のmda-７を発現するアデノウイルスを作成した。そのプロトコールは、アンチセンスmda-７を発現するアデノウイルス（Ａｄ.mda-７ ＡＳ）を構築するために使用したものと類似している（Jiangら、ＰＮＡＳ、93：9160-9165、1996）。組み換え複製欠陥性Ａｄ.mda-７ Ｓは、２段階で作成した。第一に、mda-７遺伝子を改良型Ａｄ発現ベクターｐＡｄ.ＣＭＶにセンス配向でクローニングした。このウイルスは、順に、Ａｄゲノムの左端に由来する355ｂｐ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、βグロビン遺伝子由来のポリＡシグナル配列をコードするＤＮＡ、およびＥ１Ｂコード領域内から延びる約３ｋｂｐのアデノウイルス配列を含む。この配列は、ＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターによりクローニング配列の高レベルの発現を、および適切なＲＮＡプロセシングを可能にする。この組み換えウイルスは、mda-７含有ベクターとＪＭ１７との間の相同的組み換えにより、293細胞内でin vivoで作成され、これは、改良型ｐＢＲ３２２にクローニングされたＡｄゲノム全体を含んでいる。ＪＭ１７は、in vivoでＡｄゲノムを生じるが、大きすぎて詰め込むことができない。この制約からは、選択遺伝子を含んだ組み込み可能なゲノムを作成するためのベクターとの組み換えにより解放される。組み換えウイルスは、293を除くヒト細胞において複製欠陥であり、これはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する。二つのプラスミドのトランスフェクションの後、全て標準手法により、感染性ウイルスを回収し、ゲノムを解析して組み換え構造を確認し、次いでウイルスをプラーク精製した。
【００５１】
mda-７でのトランスフェクションで観察されたように、種々のヒトがん細胞系統のＡｄ.mda-７ Ｓでの感染は増殖を抑制するが、正常な細胞系統では抑制しない。これらの結果は、このウイルスがmda-７プラスミド構築物で観察される特性を保持していることを証明する。多くのがん細胞、例えば、胸部がん腫（ＭＣＦ-７およびＴ４７Ｄ）、グリア芽細胞腫（ＧＢＭ-１８およびＴ９８Ｇ）並びにメラノーマ（Ｈ０-１およびＣ8161）などにおいて、Ａｄ.mda-７ Ｓでの感染は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）の誘導を引き起こす。この効果は、Ａｄ.mda-７ Ｓでの多数の感染（100pfu/細胞）後でさえ、正常細胞において引き出されなかった。他のがん細胞タイプにおいて、（単層培養におけるコロニー形成の抑制により示されるような）増殖抑制は、核の形態的変化、ヌクレオソームラダー（ladder）の形成または陽性ＴＵＮＥＬ反応により示されるように、アポトーシスの兆候がなくとも明らかである。これらの結果は、Ａｄ.mda-７ Ｓウイルスが in vitroでヒトがん細胞の増殖を選択的に抑制できることを示している。その上、特定のがん細胞タイプにおいて、増殖抑制は、アポトーシスの誘導と関連している。これらの観察は、mda-７により誘導されるがん増殖の抑制が複数の経路によって起こり得ることが示唆される。
【００５２】
ヌードマウスヒト腫瘍異種移植モデルを使用して、Ａｄ.mda-７ Ｓがin vivoでヒトがん細胞の増殖を抑制できるかどうかを決定した。Taconic Labsから入手した無胸腺ヌードマウスに、マトリゲル（matrigel）と混合したＰＢＳ中の100万個のヒト子宮頸部がん腫（HeLa）細胞を皮下注射した（最終体積0.4ｍＬ；マトリゲル対ＰＢＳの比１：１）。腫瘍を平均体積100ないし200ｍｍ3（接種後10ないし21日目）に達するまで増殖させた。その後、マウスを無作為に２グループに分けた：グループ１：mda-７遺伝子を欠損している複製欠陥性Ａｄ；ヌル（null）ウイルス（ヌル）；およびグループ２：Ａｄ.mda-７ Ｓ。処理は、４週間の間、週に３回、ヌルまたはＡｄ.mda-７ Ｓの腫瘍内注射（４箇所に100μＬ/注射）から成る。腫瘍を週に２ないし３回カリパスで測定した。腫瘍体積を一般式を用いて計算した：pi/６×大きい直径×（小さい直径）2。治療の４週間後、動物をもう１週間観察し、屠殺した。最初の腫瘍体積で割った最終腫瘍体積は、がん進行の指標として規定された腫瘍体積比に相当する。
【００５３】
Ａｄ.mda-７ Ｓで処理された株化HeLa異種移植は、研究の間を通じて増殖を抑制したが、ヌルウイルスで処理された腫瘍は、進行して増殖し続けた（図５および６）。mda-７の抑制効果は、ｐ値＜0.05で有意であった。本研究は反復して行い、同じ結果が得られた。このデータから、mda-７の異所性発現がヒトのがん治療に治療上利益をもたらし得ることが示唆される。実験は、株化ヒト胸部がん腫瘍、ＭＣＦ-７およびＴ４７Ｄを用いてヌードマウスで今日進行中である。
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、1996年６月16日に出願されたＵ.Ｓ.シリアルＮｏ.０８/６９６,５７３の一部継続出願であり、原出願の内容は、参照により本願の開示内容の一部とする。
【０００２】
ここに開示された本発明は、保健社会福祉省（the Department Health and Human Services）からのＮＣＩ/ＮＩＨ助成金Ｎｏ.ＣＡ３５６７５の下、政府援助によりなされた。それ故、米国政府が本発明の一部権利をもっている。
【０００３】
本願を通して、種々の参照文献がかっこ内に引用されている。これら出版物の全開示は、本発明の属する技術分野の状況をより完全に記載するため、参照により本願の開示内容の一部とする。これら参照文献の完全な書誌的引用は、一連の実験の最後に見ることができる。
【発明の背景】
【０００４】
がんは、腫瘍形成の正の制御因子および負の制御因子として機能する複数の遺伝子の相互に関連した発現および抑制が関与する、複雑な多因子および多段階のプロセスである（１−５）。形質転換または腫瘍形成の優性表現型の導入に基づく直接的クローニングストラテジーにより、正に作用するがん遺伝子が同定された（６−９）。対照的に、がんの表現型を抑制する遺伝子の検出およびクローニングは、より困難で捕らえにくいことが分かった（10−15）。増殖および分化の制御に直接的に関与する遺伝子を単離するための直接的アプローチには、活発に増殖するがん細胞から構築されたｃＤＮＡライブラリーと不可逆的に増殖能を失い且つ最終分化するように誘導されたがん細胞から構築されたｃＤＮＡライブラリーとの差引き（subtraction）ハイブリダイゼーションが必要である（13、14）。この実験ストラテジーは、ヒトのメラノーマ細胞に適用されており、組換えヒトインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）およびメゼライン（mezerein）（ＭＥＺ）を用いた処理により最終分化を誘導して、ＤＮＡデータベースに以前に記載のない新規メラノーマ分化関連（mda）遺伝子のクローニングに至った（13、14）。増殖および細胞周期の制御を仲介する際の特定のmda遺伝子の直接的な役割は、mda-６の同定およびクローニングにより明らかであり（13−16）、これはサイクリン依存性キナーゼｐ２１の普遍的な阻害剤と同一である（17）。増殖制御におけるｐ２１の重要性は充分記載され、この遺伝子は、種々のアプローチを用いて幾つかの研究室により、ＷＡＦ−１、ＣＩＰ−１、およびＳＤＩ−１として、個々に単離された（18−20）。これらの研究により、増殖制御に関与する特定遺伝子が誘導され、ヒトのがん細胞における増殖停止および最終分化のプロセスに関与し得ることが示唆される。
【０００５】
mda-７遺伝子が、分化誘導剤（ＩＦＮ−βプラスＭＥＺ）で処理されたヒト・メラノーマ（Ｈ０−１）の差引きライブラリーからクローニングされた（13、14）。完全長のmda-７のｃＤＮＡは、1718ヌクレオチドであり、その主要なオープンリーディングフレームは、Ｍｒが23.8ｋＤａである206アミノ酸の新規タンパク質をコードしている（21）。以前の研究により、mda-７はヒト・メラノーマ細胞において増殖停止および最終分化誘導の役割として誘導されることが示唆される（14、21）。また、mda-７の発現はメラノーマの進行とは逆の関連性がある。即ち、活発に増殖する正常なヒトのメラニン細胞は、転移性ヒト・メラノーマ細胞よりもmda-７をより多く発現する（21）。その上、mda-７は、一過性のトランスフェクションアッセイにおいて、およびデキサメタゾン（ＤＥＸ）誘導性mda-７遺伝子を含む安定な形質転換細胞において、ヒト・メラノーマ細胞の増殖を抑制する（21）。これらの研究は、mda-７がヒトのメラニン細胞およびメラノーマの生理学に貢献し得ることを示しており、また、この遺伝子はヒト・メラノーマ細胞で過剰発現したときに増殖抑制特性を有することを示している。
【０００６】
mda-７遺伝子は、また、国際特許協力条約出願Ｎｏ．ＰＣＴ/ＵＳ９４/１２１６０（国際出願日1994年10月24日、国際公開Ｎｏ．ＷＯ９５/１１９８６）に記載されており、この内容は、参照により本願の開示内容の一部とする。
【０００７】
本発明は、mda-７が種々の起源（胸部、中枢神経系、子宮頸部、結腸、前立腺および結合組織など）のがん細胞において有効な増殖抑制遺伝子であることを報告する。コロニー形成の抑制は、ｐ５３および／または網膜芽細胞腫（ＲＢ）遺伝子に欠陥を有するがん細胞、またはｐ５３およびＲＢの発現を欠損しているがん細胞で起こる。対照的に、正常なヒト乳房の上皮細胞、ヒト皮膚の繊維芽細胞およびラット胚の繊維芽細胞におけるmda-７の発現は、定量的に、がん細胞ほどは増殖抑制を誘導しない。mda-７は、ヒト子宮頸部のがん腫（HeLa）および前立腺のがん腫（ＤＵ−145）細胞で安定に発現すると、増殖およびトランスフォーメーション関連特性に対して負の効果を示す。HeLa細胞に対するmda-７の効果は、アンチセンスmda-７遺伝子を発現する遺伝的に改変されたＡｄ５ベクターの感染により、ＭＤＡ-７タンパク質の存在しなくなった後には反転可能である。これらの観察により、mda-７は、種々の遺伝的欠陥を示すヒトのがんにおいて、広範囲の抑制作用を有する新規増殖抑制遺伝子であることが示唆される。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記遺伝子の発現可能な条件下でがん細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させる方法を提供する。本発明は、また、上記核酸を被検者のがん性細胞に導入することにより、被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法を提供する。
【０００９】
本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物をがん細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させる方法を提供する。本発明は、また、上記遺伝子産物を被検者のがん性細胞に導入することにより、被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法を提供する。
【００１０】
本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む一定量の核酸と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効な上記遺伝子の一定量の遺伝子産物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む薬学的組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】HeLa細胞における、ハイグロマイシン耐性コロニーの形成に対するmda-７発現の効果。HeLa細胞に、10μｇのｐＲＥＰ４ベクター（ＲＳＶベクター）、ｐＲＥＰ４ベクターにアンチセンス配向でクローニングされたmda-７（ＲＳＶ−ＭＤＡ−７−アンチセンス）、またはｐＲＥＰ４ベクターにセンス配向でクローニングされたmda-７（ＲＳＶ−ＭＤＡ−７−センス）をトランスフェクションし、100μｇのハイグロマイシンを含有する培地で選択した。
【図２】ｐＲＥＰ４ベクター HeLa cl １細胞およびmda-７（Ｓ）を発現しているHeLa cl ２細胞の単層増殖に対するアンチセンスmda-７の効果。HeLa cl １（ｐＲＥＰ４ベクターで形質転換されたHeLaクローン）細胞およびHeLa cl ２（mda-７を発現するHeLaクローン）細胞を、アンチセンスmda-７を発現する組み換えタイプ５アデノウイルス（Ａｄ５）［Ａｄ.mda-７（ＡＳ）］の１０プラーク形成ユニット/細胞での感染後に、または感染させないで、増殖させた。結果は、＜１０％の差がある３サンプルの平均細胞数である。
【図３】HeLa、HeLa cl １およびHeLa cl ２細胞における、高分子量−ＭＤＡ-７複合（ＨＭＣ）タンパク質、ＭＤＡ-７タンパク質、アクチンタンパク質に対するアンチセンスmda-７の効果。HeLa細胞およびHeLa cl １細胞（ｐＲＥＰ４ベクターで形質転換されたHeLaクローン）を、［35Ｓ］メチオニンでラベルした１０プラーク形成ユニット/細胞のＡｄ.mda-７（ＡＳ）で９６時間感染させるか（＋）または感染させないで（−）、ＨＭＣ、ＭＤＡ-７およびアクチンタンパク質のレベルを免疫沈降解析により測定した。HeLa cl ２（mda-７を発現するHeLaクローン）に関しては、１０プラーク形成ユニット/ｍＬのＡｄ.mda-７（ＡＳ）による感染のタンパク質レベルに対する効果を、＋24、＋48、＋72および＋96時間後に［35Ｓ］メチオニンラベルの細胞溶解物を免疫沈降解析することにより、測定した。HeLa cl ２細胞のコントロール突然変異体Ａｄ５（Ｈ５dl 434）による感染の効果を、１０プラーク形成ユニット/細胞での感染の96時間後に、［35Ｓ］メチオニンラベルの細胞溶解物を免疫沈降解析することにより測定した。
【図４】ＤＥＸ誘導性mda-７遺伝子を含むＤＵ-145クローンにおけるmda-７ＲＮＡおよびタンパク質の合成。 図４Ａ．１０-6Ｍ ＤＥＸの存在下または非存在下で、96時間細胞を増殖させ、全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロッティングを行い、mda-７、ネオマイシン耐性（NeoR）遺伝子およびＧＡＰＤＨをプローブを用いて検出した。 図４Ｂ．１０-6Ｍ ＤＥＸの存在下または非存在下で、96時間細胞を増殖させ、細胞性タンパク質を［35Ｓ］メチオニンでラベルし、ＭＤＡ-７およびアクチンタンパク質を認識する抗体を用いて免疫沈降させた。
【図５】無胸腺のヌードマウスにおける、株化ヒト子宮頸部がん（HeLa）異種移植片の増殖抑制。
【図６】HeLa腫瘍体積比に対するＡｄ.mda-７ Ｓの効果。結果は、Ａｄ.mda-７ Ｓがヌードマウスにおいてin vivoで腫瘍の進行を抑制できることを示している。
【発明の詳細な説明】
【００１２】
後述する実験の詳細な説明部分を理解し易くするため、ある程度頻繁に出てくる方法および／または用語は、Sambrookら（45）に説明がある。
【００１３】
本発明は、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記遺伝子の発現可能な条件下でがん細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法を提供する。
【００１４】
本発明は、また、被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸分子を、被検者の細胞内で前記遺伝子の発現が可能な条件下において被検者のがん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法を提供する。
【００１５】
核酸分子を細胞に導入する方法は、当該分野で周知である。裸の（naked）核酸分子を直接的形質転換により細胞に導入することができる。或いは、核酸分子をリポソーム中に埋め込むことができる。それ故、本発明は、裸のＤＮＡ技術、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、リポソーム、抗体で被覆したリポソーム、または機械的もしくは電気的手段により核酸分子を細胞に導入する上記方法を提供する。上記列挙した方法は、核酸分子を細胞に導入する実行可能な手段の例として挙げたにすぎない。公知の他の方法を、本発明で使用することもできる。
【００１６】
上記方法の一態様において、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）は、その発現が調節配列の制御下にあるように調節配列に連結されている。さらに別の態様において、調節配列は誘導的であるか、または構成的である。誘導プロモーターのような誘導的調節配列は、当該分野で公知である。構成的発現を指示することができるプロモーターのような調節配列も、当該分野で公知である。
【００１７】
別の態様において、調節配列は、組織特異的な調節配列である。このとき、mda-７遺伝子の発現は、組織特異的になるであろう。
【００１８】
上記方法の別の態様において、前記がん細胞は、がん細胞内に欠陥性の腫瘍抑制遺伝子が存在することにより特徴づけられる。欠陥性の腫瘍抑制遺伝子には、ｐ５３、網膜芽細胞腫（ＲＢ）またはｐ１６ink4a遺伝子が含まれるが、これに限定されない。
【００１９】
上記方法の一態様において、前記がん細胞は、がん細胞内に優性作用的（dominant acting）がん遺伝子が存在することにより特徴づけられる。特に、優性作用的がん遺伝子は、Ha-ras、突然変異体ｐ５３またはヒトパピローマウイルス遺伝子であり得る。Ha-rasは、Harveyウイルスのrasがん遺伝子である。
【００２０】
上記方法の一態様において、前記核酸はベクターを含む。該ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターを含むが、これに限定されない。好ましい態様において、アデノウイルスベクターは、mda-７を発現する複製欠陥性アデノウイルスベクターであり、Ａｄ.mda-７ Ｓと称される。別の態様において、アデノウイルスベクターは、複製コンピテントアデノウイルスベクターである。
【００２１】
本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物をがん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法を提供する。
【００２２】
本発明は、さらに、被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物を被検者のがん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法を提供する。
【００２３】
上記方法の一態様において、前記がん細胞は、胸部、子宮頸部、結腸、前立腺、鼻咽頭、肺、結合組織または中枢神経系の細胞を含むが、これに限定されない。前記がん細胞には、さらに、多形膠芽腫、リンパ腫および白血病由来の細胞が含まれる。
【００２４】
本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む一定量の核酸と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物を提供する。
【００２５】
ここで使用する「薬学的に許容可能なキャリア」という用語は、何れの標準的な薬学的キャリアをも包含する。この薬学的組成物は、選択した投薬方法にとって適切な如何なる形態にも構成され得る。経口投薬に適切な組成物は、固形形態（丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、および粉剤など）並びに液体形態（溶剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤など）を含む。非経口投薬に有効な形態は、滅菌溶剤、乳剤、および懸濁剤などである。
【００２６】
ある態様において、前記核酸はベクターを含む。ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶウイルス、レトロウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターを含むが、これに限定されない。好ましい態様において、アデノウイルスベクターは、mda-７を発現している複製欠陥性アデノウイルスベクターであり、Ａｄ.mda-７ Ｓ.と称される。別の態様において、アデノウイルスは、複製コンピテントアデノウイルスベクターである。
【００２７】
本発明は、また、がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効な一定量のメラノーマ分化関連子（mda-７）の遺伝子産物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む薬学的組成物を提供する。
【００２８】
上記方法の一態様において、前記がん細胞は、胸部、子宮頸部、結腸、前立腺、鼻咽頭、肺、結合組織および中枢神経系の細胞を含むが、これに限定されない。前記がん細胞には、さらに、多形膠芽腫、リンパ腫および白血病由来の細胞が含まれる。
【００２９】
本発明は、以下の実験の詳細な説明によりさらに理解されるであろう。しかし、当業者なら、特定の方法および議論されている結果は、後述する請求の範囲で完全に説明された本発明の単なる例示であることを容易に認識するであろう。
【実験の詳細な説明】
【００３０】
がんは、増殖制御の欠陥により特徴づけられる病気であり、腫瘍細胞は、しばしば細胞分化の異常パターンを示す。組み換えヒト繊維芽細胞インターフェロンと抗白血病薬剤メゼライン（mezerein）との組み合わせは、ヒト・メラノーマ培養細胞のこれらの異常を直し、その結果、不可逆的な増殖停止および最終分化に至る。差引きハイブリダイゼーションにより、増殖停止し且つ最終分化したヒト・メラノーマ細胞において、発現が高まったメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）が同定される。mda-７が、異なる起源で複数の遺伝的欠陥を有するヒト腫瘍細胞にトランスフェクションされると、コロニー形成は減少する。対照的に、正常細胞（ヒト乳房上皮細胞、ヒト皮膚の繊維芽細胞およびラット胚の繊維芽細胞）を用いた一過性のトランスフェクションアッセイにおいて、増殖およびコロニー形成に対するmda-７の効果は、がん細胞を使って見出された効果より量的に少ない。mda-７の発現が高まった腫瘍細胞は、単層増殖および足場非依存性において抑制を示す。アンチセンスmda-７を発現している組み換えタイプ５のアデノウイルスを用いた感染により、インビトロにおける増殖および形質転換された表現型のmda-７による抑制は除去される。網膜芽細胞腫（ＲＢ）およびｐ５３遺伝子の両方を発現していないか、またはこれら両方に欠陥を有するがん細胞において増殖を抑制するmda-７の能力は、mda-７−誘導性の増殖抑制を仲介する際に、これら重要な腫瘍抑制因子が関与していないことを示している。mda-７が以前に記載された増殖抑制遺伝子とタンパク質ホモロジーがないこと、および正常細胞／がん細胞に対するこの遺伝子の分化的効果により、mda-７は新しいクラスのがん増殖抑制遺伝子に相当することが示唆される。
【００３１】
材料および方法
細胞系統および培養条件
ヒトがん腫細胞系統、例えばＭＣＦ-７およびＴ４７Ｄ（胸部）、ＬＳ１７４ＴおよびＳＷ４８０（結腸直腸）、HeLa（子宮頸部）、ＤＵ-１４５（前立腺）、並びにＨＯＮＥ−１（鼻咽頭）（９、22−25）を、１０％のウシ胎仔血清（ＤＭＥＭ-10）を補充したダルベッコ（Dulbecco）の改良イーグル（Eagle）培地中で、３７℃、５％ＣＯ2／９５％空気−加湿インキュベーターで増殖させた。別のヒト細胞タイプ、例えばＨＢＬ−１００（正常乳房上皮）、Ｈ０−１およびＣ８１６１（メラノーマ）、ＧＢＭ−１８およびＴ９８Ｇ（多形膠芽腫）、並びにSaos-２（ヒト骨肉腫）を同様の条件下で維持した。初期継代の正常なヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ；継代10−12）を、Clonetics Corporation（サンディエゴ、ＣＡ）から入手した。ＨＭＥＣ細胞を、Clonetics Corporationにより説明されたように無血清培地中で維持した。ＣＲＥＦ−Trans ６（クローン化したフィッシャー（Fischer）ラット胚の繊維芽細胞）（９、26）およびＣＲＥＦ Ha-ras（Ha-ras（Ｔ２４）がん遺伝子により形質転換されたＣＲＥＦ細胞）（27）を、ＤＭＥＭ-５中で培養した。HeLa cl １は、ハイグロマイシン耐性（HygR）のラウス肉腫ウイルスＲＳＶベクター（ｐＲＥＰ４）（Invitrogen）により形質転換されたHeLaクローンである。HeLa cl ２は、HygRのmda-７を発現するHeLaクローンである。HeLa cl １およびHeLa cl ２細胞を文献の記載どおりに構築し（12、21）、100μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有するＤＭＥＭ−１０中で維持した。ＤＵ-１４５ cl ６およびＤＵ-１４５ cl ７細胞は、（ｐＭＡＭneoベクターにクローニングされた）ＤＥＸ-誘導性mda-７遺伝子（Clontech）を含み（21）、200μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ-10中で維持した。
【００３２】
差引きハイブリダイゼーション、プラスミド、発現ベクター構築物、およびノーザンハイブリダイゼーション
差引きハイブリダイゼーションによるmda-７の同定およびクローニングは、文献の記載どおりに達成された（13）。完全長のmda-７のｃＤＮＡを、組み換えＩＦＮ−βプラスＭＥＺで処理されたＨ０−１のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし（13）、文献の記載どおりにｃＤＮＡ末端迅速増幅法を用いることにより（15）単離した。オープンリーディングフレームを含むmda-７のｃＤＮＡ断片（ヌクレオチド位置176−960）をＰＣＲで増幅し、ＴＡクローニングによりｐＣＲIITM（Invitrogen）にクローニングした。ベクター中の挿入物の配向を、制限マッピングにより決定した。ヒト細胞発現の構築物は、KpnＩ−XhoＩ断片をＰＣＲTMベクターからｐＲＥＰ４ベクター（Invitrogen）にセンス［mda-７（Ｓ）］またはアンチセンス［mda-７（ＡＳ）］配向で、ＲＳＶプロモーターの下流にクローニングすることにより作成された。別途、mda-７遺伝子の断片を、センスおよびアンチセンス配向でｐＭＡＭneo（Clontech）ベクターにクローニングした。ＲＮＡの単離およびノーザンブロッティングを記載どおりに行った（９,12,13,21)。
【００３３】
単層増殖、足場非依存性およびＤＮＡ−トランスフェクションアッセイ
単層増殖および足場非依存性増殖アッセイを、以前に文献に記載されたとおりに行った（８,12,26）。単層コロニー形成に対するmda-７の効果を調査するため、挿入物のないベクター、またはmda-７（Ｓ）もしくはmda-７（ＡＳ）発現構築物を含むベクター［ｐＲＥＰ４（ＲＳＶ）］を、リポフェクション法（ＧＩＢＣＯ/ＢＲＬ）により種々の細胞タイプにトランスフェクションし、ハイグロマイシン中でのハイグロマイシン耐性コロニー形成または細胞増殖を測定した（12,21）。
【００３４】
アンチセンス−mda-７ アデノウイルスベクターの構築
組み換え型の複製欠陥性Ａｄ.mda-７（ＡＳ）を２段階で作成した。第一に、mda-７遺伝子のコード配列を、改良型のＡｄ発現ベクターｐＡｄ.CMVにクローニングした（28）。これは、順に、Ａｄゲノムの左端に由来する355ｂｐ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、スプライス供与部位および受容部位をコードするＤＮＡ、所望の遺伝子（この場合mda-７）のためのクローニング部位、βグロビン遺伝子由来のポリＡシグナル配列をコードするＤＮＡ、およびＥ１Ｂコード領域内から延びる約３kbpのアデノウイルス配列を含む。この配列は、クローニングされた配列のＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターによる高レベルの発現、およびＲＮＡプロセッシングを可能にする（28）。組み換えウイルスは、mda-７含有ベクターとプラスミドＪＭ17との間の相同的組み換えにより293細胞内でin vivoで作成され（29）、これは、改良型ｐＢＲ322にクローニングされたＡｄゲノム全体を含んでいる（30）。ＪＭ17は、in vivoでＡｄゲノムを生じるが、Ａｄゲノムは大きすぎて組み込むことができない。この制約からは、選択遺伝子を含んだ組み込み可能なゲノムを作成するためのベクターとの組み換えにより解放される（30）。組み換えウイルスは、293細胞以外のヒト細胞において複製欠陥があり、これはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する。二つのプラスミドのトランスフェクションの後、感染ウイルスを回収し、ゲノムを分析して組み換え構造を確認し、次いでウイルスをプラーク精製した。全て標準手法により行った（31）。
【００３５】
ペプチド抗体の産生および免疫沈降法解析
ペプチド抗体は、文献の記載どおりにＰＳＱＥＮＥＭＦＳＩＲＤに対して調製した（21）。対数的に増殖するHeLa、HeLa Cl １（HygRのｐＲＥＰ４ベクターコントロールHeLaクローン）およびHeLa cl ２［ｐＲＥＰ４-mda-７（Ｓ）によりトランスフェクションされたHygRのmda-７発現HeLaクローン］細胞を、未処理にするか、または１０プラーク形成ユニットのコントロールアデノウイルス（Ｈ５dl434）（32）もしくはmda-７（ＡＳ）を発現する組み換えアデノウイルス［Ad.mda-７（ＡＳ）］で感染させた。感染後、さまざまな時間において、培養物をメチオニンなしの培地中において３７℃で１時間、メチオニン飢餓にし、細胞を沈殿させることにより濃縮し、100μCi（１Ci＝３７GBq）の35Ｓ（NEN；Express 35Ｓ）を用いて１ｍＬの同培地中で４時間３７℃で標識した。２μｇのＭＤＡ-７ペプチドのウサギポリクローナル抗体またはアクチンモノクローナル抗体（Oncogene Sciences）を用いた免疫沈降法解析は、文献の記載どおりに行った（15,21）。
【００３６】
実験結果
ヒトがん細胞およびHa-ras-形質転換されたラット胚の繊維芽細胞におけるmda-７の増殖抑制特性の増大
ＤＮＡトランスフェクションアッセイを行って、細胞増殖に対するmda-７発現増大の効果を評価した。ヒトの子宮頸部癌腫（HeLa）細胞にmda-７（Ｓ）構築物をトランスフェクトさせると、mda-７（Ｓ）構築物は、ｐＲＥＰ４ベクターおよびmda-７（ＡＳ）構築物によりトランスフェクションされた培養物と比べて、HygRコロニーが１０〜１５倍減少する（図１および表１）。
【表１】
【００３７】
a 対数的に増殖する細胞を、100-mmプレートあたり１×106で播き、挿入物なしのベクター、またはmda-７（Ｓ）もしくはmda-７（ＡＳ）を含む10μｇのベクターでトランスフェクションした。24時間後、細胞を100μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有する培地に、100-mmプレートあたり約２×105細胞で再度播いた。培地を３日または４日ごとに交換し、１４日目または２１日目にプレートをホルムアミドで固定しギムザ染色をした。50以上の細胞を含むコロニーを数え上げた。表示の値は、４または５プレートで形成された平均HygRコロニー±S.D.である。
b かっこ内の値は、ＲＳＶ-mda-７（ＡＳ）によりトランスフェクションされた細胞と比較したときのコロニー形成の低下倍数を示している。
c ＭＣＦ-７、Ｔ４７Ｄ、HeLa、ＬＳ１７４Ｔ、ＤＵ-１４５およびＨＯＮＥ-１は、表示の構造部位から単離したヒトがん腫（Ｃａ）細胞系統である。Ｔ９８Ｇは、ヒト多形膠芽腫の細胞系統である。ＣＲＥＦ-rasは、Ha-ras（Ｔ２４）がん遺伝子により形質転換されたＣＲＥＦクローンである。
【００３８】
より少ないコロニー形成に加えて、mda-７（Ｓ）コロニーは、一般に、ｐＲＥＰ４ベクターまたはmda-７（ＡＳ）構築物でのトランスフェクション後に得られた対応するHygRコロニーよりサイズが小さい（図１）。mda-７（Ｓ）構築物を別のヒトがん細胞系統にトランスフェクションすると、HygRコロニー形成を３ないし１０倍低下させる（表１）。これらには、ヒト胸部がん腫（ＭＣＦ-７およびＴ４７Ｄ）、結腸がん腫（ＬＳ１７４ＴおよびＳＷ４８０）、鼻咽頭がん腫（ＨＯＮＥ-１）、前立腺がん腫（ＤＵ-１４５）、メラノーマ（Ｈ０-１およびＣ８１６１）、多形膠芽腫（ＧＢＭ-１８およびＴ９８Ｇ）並びに骨肉腫（Saos-２）が含まれる。HeLa細胞で観察されたとおり、mda-７（Ｓ）構築物でトランスフェクション後に形成されるHygRコロニーの平均サイズは、空のｐＲＥＰ４ベクターまたはmda-７（ＡＳ）構築物でのトランスフェクション後に形成されたものより小さい。これらの結果は、mda-７が広範囲の組織学的に異なるヒトのがんにおいて過剰発現すると、効力のある増殖抑制遺伝子であることを実証している。
【００３９】
mda-７が正常細胞の増殖を抑制するかどうか、およびこの効果がヒトがん細胞で観察された効果と定量的に同一であるかどうかを測定するため、一過性のＤＮＡトランスフェクションアッセイを、継代10ないし12の正常なヒト乳房上皮（ＨＭＥＣ）細胞、正常な胸部上皮細胞系統ＨＢＬ-100、正常なヒト皮膚繊維芽細胞（継代21）およびクローニングされた正常なラット胚の繊維芽細胞系統（ＣＲＥＦ-Trans６）を用いて行った（７，８）。ＨＭＥＣ、ＨＢＬ-100および正常なヒト皮膚繊維芽細胞は、フィーダー層を用いたときでさえ、高頻度に明確なコロニーを形成しないので、異なるＲＳＶ構築物を用いてトランスフェクションし、ハイグロマイシン中で２〜３週間増殖させた後の全細胞数に対する効果を測定した。このアプローチを用いて、mda-７（ＡＳ）またはｐＲＥＰ４ベクターでトランスフェクトされた正常細胞に対してmda-７（Ｓ）において、ＨＭＥＣでは約1.1ないし1.6倍の減少、ＨＢＬ-100では1.1ないし1.2倍の減少、正常なヒト皮膚繊維芽細胞数では1.3ないし2.1倍の減少が（各細胞タイプを用いた３回の独立実験で）各々観察された。対照的に、同様の実験プロトコールを用いたＴ４７Ｄヒト胸部がん腫細胞に関しては、ベクターおよびアンチセンスでトランスフェクトされた細胞と比較して、mda-７（Ｓ）構築物でのトランスフェクション後に、約3.2ないし5.2倍増殖は抑制された。ＣＲＥＦ-Trans６細胞の場合、６回の独立トランスフェクションアッセイに関するHygRコロニー形成において、mda-７（ＡＳ）およびベクタートランスフェクトされた細胞に対するmda-７（Ｓ）との間の違いは、0.5から2.8倍まで及んでいる（表１）。対照的に、mda-７（Ｓ）構築物のHa-ras形質転換ＣＲＥＦ細胞へのトランスフェクションは、コロニー形成を６〜８倍低下させた（表１）。これらの結果は、ヒトがん細胞およびHa-ras形質転換されたラット胚細胞ほど、正常なヒト細胞および正常な齧歯類細胞において、mda-７が、増殖およびコロニー形成を低下させるのに定量的に有効でないことを示している。
【００４０】
安定かつ誘導的なmda-７発現の細胞増殖に対する効果、およびmda-７発現のアンチセンス阻害の細胞増殖に対する効果、並びに形質転換された表現型
mda-７（Ｓ）遺伝子でのトランスフェクション後に低頻度にHeLa細胞が生存する理由を決定するため、mda-７（Ｓ）構築物でのトランスフェクション後に、１０個の独立したHygRコロニーを単離した。ノーザンブロッティングによりmda-７発現について解析した１０クローンのうち、７クローンは検出可能なmda-７のｍＲＮＡを発現しておらず、２クローンは低レベルのmda-７のｍＲＮＡを発現しており、１クローン（名称HeLa cl ２）は、高レベルのmda-７のｍＲＮＡを発現していた。対照的に、このクローンの全てが、HygRおよびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の匹敵するレベルの発現を示した。親のHeLa細胞またはｐＲＥＰ４ベクターHeLaクローン（名称HeLa cl １）と比較すると、HeLa cl ２（mda-７発現）細胞は低速度で増殖した（図２）。寒天で増殖させると、クローニングされていないHeLaおよびHeLa cl １細胞は、約４２％の効率で増殖したが、HeLa cl ２（mda-７発現）細胞は、約２５％の効率で増殖し、コロニーの平均サイズは、親のHeLaおよびｐＲＥＰ４ベクターHeLa cl １細胞について観察されたよりも小さかった。これらの結果より、mda-７でのトランスフェクションした後のHeLaの生存は、主として、mda-７発現の欠損または低レベルのmda-７発現に起因して起こることが示される。しかし、mda-７を安定に高レベルで発現しているHeLa細胞において、単層培養および足場非依存性における増殖は低下する。
【００４１】
HeLa cl ２（mda-７発現）において観察されたin vitroでの増殖の低下および形質転換抑制が、mda-７発現の直接的な結果であるかどうかを決定するため、mda-７発現を直接的に抑制するためにアンチセンスストラテジーを使用した。アンチセンス配向にクローニングされたmda-７遺伝子を含む組み換えＡｄ５ベクター［Ａｄ.mda-７（ＡＳ）］を構築した。Ａｄ.mda-７（ＡＳ）によるHeLa cl ２（mda-７発現）の感染は、増殖速度および寒天クローニング効率を（約25％から約44％に）増加させるが、HeLa cl １（ｐＲＥＰ４ベクター、mda-７発現せず）または親のHeLaはそうではない（図２）。対照的に、mda-７遺伝子を含有しないコントロールの突然変異体Ａｄ５ベクター（Ｈ５dl434）は、親のHeLa、HeLa cl １またはHeLa cl ２細胞の単層増殖または寒天増殖に影響を及ぼさない（データ示さず）。
【００４２】
ウサギで生産したmda-７特異的ペプチド抗体および免疫沈降法解析を使用したところ、HeLa cl ２（mda-７発現）細胞では、約２４ｋＤａタンパク質のＭＤＡ-７および約９０ないし110ｋＤａの高分子量複合（ＨＭＣ）タンパク質のレベルが増大している（図３）。Ａｄ.mda-７（ＡＳ）での感染は、２４ｋＤａのＭＤＡ-７タンパク質およびＨＭＣタンパク質両方の一時的な低下を引き起こすが、Ｈ５dl434コントロールのmda-７非発現ウイルスではそうではない（21）（図３）。両タンパク質の低下したレベルは、Ａｄ.mda-７（ＡＳ）での感染後48時間後に見られ、96時間にわたって抑制されたままである。対照的に、アクチンレベルは、ウイルス感染後も未変化のままである。これらの観察は、HeLa cl ２（mda-７発現）におけるＭＤＡ-７タンパク質発現のアンチセンス阻害が、mda-７誘導による増殖抑制および足場非依存性増殖の抑制を直接消滅させ得ることを示している。
【００４３】
mda-７の細胞増殖に対する抑制効果を確認するため、ＤＵ-145ヒト前立腺がん細胞を、ＤＥＸ誘導性mda-７遺伝子を発現するように操作した。［ＤＥＸ誘導性mda-７（Ｓ）遺伝子を含む］ＤＵ-145 cl ６またはcl７細胞を、10-6Ｍ ＤＥＸの存在下で２４〜９６時間増殖させると、mda-７のｍＲＮＡおよび（ＨＭＣタンパク質を含む）タンパク質が誘導されるが、親のＤＵ-145細胞ではそうではない（図４）。対照的に、ＤＥＸは、ＤＵ-145 cl ６およびcl ７細胞においてネオマイシン耐性（NeoR）遺伝子の発現を変化させず、または試験された細胞全てにおいてＧＡＰＤＨの発現を変化させない（図４）。ＤＵ-145 cl ６およびcl ７細胞において、10-6Ｍ ＤＥＸ中の増殖によるmda-７発現の誘導は、ＤＥＸの非存在下の増殖と比べて、９６時間後の細胞数を約５０％低下させる。対照的に、親のＤＵ-145またはｐＭＡＭneoベクター形質転換ＤＵ-145細胞を、１０-6Ｍ ＤＥＸを含む培地中で９６時間増殖させても、有意な増殖抑制は起こらない（データ示さず）。これらのデータは、mda-７の異所性発現が、前立腺がん細胞において細胞増殖を直接変化させ得ることを示している。
【００４４】
実験の考察
差引きハイブリダイゼーションにより、増殖停止し且つ最終分化したヒト・メラノーマ細胞において、発現の増大したmda遺伝子が同定された（13、14、21）。これらmda遺伝子の機能を決定することは、ヒト・メラノーマおよび他の細胞タイプにおける増殖制御および最終分化の分子的根拠を規定する際に重要であろう。mda-７遺伝子（14、21）は、広範囲のヒトがん細胞系統において一過性または安定に発現すると、普遍的な増殖抑制遺伝子であることが今日示されている。この発見は、ヒト・メラノーマ細胞におけるＭＤＡ-７タンパク質の増殖抑制特性を示す以前の観察を拡張するものである（21）。がん細胞に対するその効果に対して、正常なヒト乳房上皮、正常なヒト皮膚繊維芽細胞および正常なラット胚繊維芽細胞へのmda-７のトランスフェクションは、定量的により低い増殖抑制を生じさせる。別のmda遺伝子であるmda-６（ｐ21）と同様に、mda-７の発現もメラノーマの進行と逆の関連があり、mda-６（ｐ21）およびmda-７両方のレベルの増大は、転移性ヒト・メラノーマ細胞と比べて正常なヒトメラニン細胞に存在する（14-16、21）。メラノーマ細胞に対して低下した速度ではあるが、正常なメラニン細胞はなお増殖能を保持しているため、mda-６（ｐ21）およびmda-７の両方が、メラニン細胞／メラノーマ直系細胞においてメラノーマ進行の負のレギュレーターとして機能することが可能である（14-16、21）。その上、最終分化をし且つ不可逆的に増殖停止したヒト・メラノーマ細胞において、mda-６（ｐ21）およびmda-７両方の発現が増大することにより、これらの遺伝子が最終分化表現型の重要なレギュレーターであることが示唆され得る（13-16、21）。
【００４５】
mda-７がヒトがん細胞に対してその増殖抑制効果を引き出すメカニズムは、現在知られていない。mda-７の構造は、潜在的な作用モードを示唆する配列モチーフが存在しないため、潜在的な機能に対する識見を提供してくれない。細胞増殖に対するmda-７の効果は、広範囲にわたって研究された腫瘍抑制遺伝子ｐ５３と区別することができる（33、34）。突然変異体ｐ５３を含むヒト胸部のがん腫細胞系統Ｔ４７Ｄにおけるｐ５３の一過性発現は、増殖抑制を引き起こすが、野生型ｐ５３を含むヒト胸部のがん腫細胞系統ＭＣＦ-７に野生型ｐ５３遺伝子をトランスフェクションしても、増殖抑制を引き起こさない（34）。対照的に、mda-７は、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ−７細胞の両方において同様の増殖抑制を引き起こす（表１）。mda-７による増殖抑制は、網膜芽細胞腫遺伝子（ｐＲＢ）、ｐＲｂ関連のｐ１０７遺伝子および推定腫瘍抑制遺伝子ｐ１６ink4について観察されたものと切り離して考えることもできる（25、35）。ｐＲｂおよびｐ107の過剰発現は、特定の細胞タイプにおいて細胞周期に依存した方法で細胞増殖を抑制する（35-37）。明らかに正常なＲＢ遺伝子を含むヒトグリア芽細胞腫の細胞系統Ｔ９８Ｇに対してｐＲｂまたはｐ１０７をトランスフェクションすること（25）によっては増殖抑制は引き起こされないが（35、37）、mda-７（Ｓ）の一過性発現は、Ｔ９８Ｇコロニー形成を低下させる（表１）。現時点で、mda-７の増殖抑制効果は、ＲＢファミリーメンバーｐ１３０／ｐＲｂ２（これはＴ９８Ｇ細胞においても増殖を抑制する）により誘導される増殖抑制と区別することができない（25）。ｐ１６ink4遺伝子は、機能的なＲＢ遺伝子を含む細胞において増殖停止を引き起こすが（35、37）、mda-７の増殖抑制は、正常、異常、または非機能的なＲＢ遺伝子を含む細胞において起こる。突然変異したＲＢ遺伝子を含むヒト前立腺がん腫の細胞系統ＤＵ-145（38）およびＲＢ（または野生型ｐ５３）を発現しないヒト骨肉腫細胞Saos-２にmda-７をトランスフェクションすることによって、コロニー形成の抑制が引き起こされる（表１）。同様に、安定なＤＥＸ-誘導性mda-７により形質転換されたＤＵ-145クローンにおけるmda-７発現の誘導は、増殖抑制を引き起こす。これらの発見
により、mda-７による増殖抑制に関しては、機能的ＲＢ遺伝子に対する依存性がないことが示される。これらの研究を総合的に考えると、mda-７の抑制効果は、二つの最も広く研究された腫瘍抑制遺伝子であるｐ53およびｐＲＢ、並びに推定腫瘍抑制遺伝子ｐ１６ink4の作用様式とは異なるメカニズムにより起こることが説明される。
【００４６】
ほ乳類細胞における増殖の停止またはＤＮＡ損傷の関数として発現の増大を示す、幾つかの遺伝子が同定された（39,40）。増殖の停止およびＤＮＡの損傷を誘導する３つの（gadd）遺伝子（gadd45、gadd153およびgadd34）、密接に関連した骨髄分化初期応答（MyD118）遺伝子（41）、並びに野生型ｐ５３の抑制遺伝子mdm-２（42）は、ＤＮＡ損傷剤メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）での処理により細胞内でアップレギュレートされる（40）。gadd45および増殖停止特異的遺伝子（gas１）（43,44）は、細胞を集密状態に維持することにより、血清飢餓細胞により、または低血清で細胞を増殖させることより誘導される（40,43,44）。対照的に、mda-７のｍＲＮＡ発現は、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）による処理後、または細胞を集密状態に維持した後、ヒト・メラノーマ細胞において誘導されない（21）。その上、９６時間の無血清培地での増殖後、Ｈ０−１ヒト・メラノーマ細胞において、mda-７のｍＲＮＡ発現にはわずかな増大しか起こらない（21）。gadd、MyD118およびgas-1遺伝子と比べたmda-７の調節における違いにより、mda-７が新規クラスの増殖停止遺伝子の典型であり得ることが示される。
【００４７】
要約すると、正常および突然変異のｐ５３遺伝子並びにＲＢ遺伝子の両方を含むヒトがん細胞において増殖抑制を誘導する、負の増殖レギュレーター、即ちmda-７が説明されている。mda-７のゲノム構造の特性決定は、この遺伝子が腫瘍抑制遺伝子として正常に機能するかどうか、および正常細胞と腫瘍細胞との比較においてこの遺伝子に変異が存在するかどうかを決定する際に重要となるであろう。mda-７のプロモーター領域の同定は、更に、この遺伝子が特定の細胞タイプにおいて特異的に発現し、且つＩＦＮ−βプラスＭＥＺにより誘導的であるメカニズムの解析を可能にするであろう。mda-７が正常細胞よりもがん細胞および形質転換細胞に対して増殖抑制的であるという発見は、潜在的に重要であり且つ研究の発展を保証するものである。この観点において、特定のヒト悪性疾患の治療における効能について野生型ｐ５３遺伝子が現在試験されているのと類似の方法で、mda-７が、がん治療のための遺伝子ベースの治療ストラテジーの一部として有効であることが証明されるであろう。
【参照文献】
【００４８】
実験の第二シリーズ
組み換えアデノウイルスにおけるメラノーマ分化関連遺伝子−７（mda-７）は、ヌードマウスの株化ヒト腫瘍の増殖を抑制する。
【００４９】
単層培養におけるコロニー形成の低下により示されたように、種々の起源のヒト腫瘍細胞におけるmda-７の異所性発現が増殖を抑制することが、以前の研究により文書で示されている（Jiangら、ＰＮＡＳ、93：9190-9165、1996）。対照的に、mda-７は、正常なヒト上皮細胞または繊維芽細胞の増殖を顕著には変えない。これらの観察は、mda-７が普遍的ながん増殖抑制遺伝子であるという仮説を支持している。
【００５０】
がん細胞の増殖を選択的に抑制するmda-７の能力は、この遺伝子がヒトのガン治療において治療上の利益をもたらすことを示唆している。この可能性を詳しく調べるため、複製欠陥性のmda-７を発現するアデノウイルスを作成した。そのプロトコールは、アンチセンスmda-７を発現するアデノウイルス（Ａｄ.mda-７ ＡＳ）を構築するために使用したものと類似している（Jiangら、ＰＮＡＳ、93：9160-9165、1996）。組み換え複製欠陥性Ａｄ.mda-７ Ｓは、２段階で作成した。第一に、mda-７遺伝子を改良型Ａｄ発現ベクターｐＡｄ.ＣＭＶにセンス配向でクローニングした。このウイルスは、順に、Ａｄゲノムの左端に由来する355ｂｐ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、βグロビン遺伝子由来のポリＡシグナル配列をコードするＤＮＡ、およびＥ１Ｂコード領域内から延びる約３ｋｂｐのアデノウイルス配列を含む。この配列は、ＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターによりクローニング配列の高レベルの発現を、および適切なＲＮＡプロセシングを可能にする。この組み換えウイルスは、mda-７含有ベクターとＪＭ１７との間の相同的組み換えにより、293細胞内でin vivoで作成され、これは、改良型ｐＢＲ３２２にクローニングされたＡｄゲノム全体を含んでいる。ＪＭ１７は、in vivoでＡｄゲノムを生じるが、大きすぎて詰め込むことができない。この制約からは、選択遺伝子を含んだ組み込み可能なゲノムを作成するためのベクターとの組み換えにより解放される。組み換えウイルスは、293を除くヒト細胞において複製欠陥であり、これはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する。二つのプラスミドのトランスフェクションの後、全て標準手法により、感染性ウイルスを回収し、ゲノムを解析して組み換え構造を確認し、次いでウイルスをプラーク精製した。
【００５１】
mda-７でのトランスフェクションで観察されたように、種々のヒトがん細胞系統のＡｄ.mda-７ Ｓでの感染は増殖を抑制するが、正常な細胞系統では抑制しない。これらの結果は、このウイルスがmda-７プラスミド構築物で観察される特性を保持していることを証明する。多くのがん細胞、例えば、胸部がん腫（ＭＣＦ-７およびＴ４７Ｄ）、グリア芽細胞腫（ＧＢＭ-１８およびＴ９８Ｇ）並びにメラノーマ（Ｈ０-１およびＣ8161）などにおいて、Ａｄ.mda-７ Ｓでの感染は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）の誘導を引き起こす。この効果は、Ａｄ.mda-７ Ｓでの多数の感染（100pfu/細胞）後でさえ、正常細胞において引き出されなかった。他のがん細胞タイプにおいて、（単層培養におけるコロニー形成の抑制により示されるような）増殖抑制は、核の形態的変化、ヌクレオソームラダー（ladder）の形成または陽性ＴＵＮＥＬ反応により示されるように、アポトーシスの兆候がなくとも明らかである。これらの結果は、Ａｄ.mda-７ Ｓウイルスが in vitroでヒトがん細胞の増殖を選択的に抑制できることを示している。その上、特定のがん細胞タイプにおいて、増殖抑制は、アポトーシスの誘導と関連している。これらの観察は、mda-７により誘導されるがん増殖の抑制が複数の経路によって起こり得ることが示唆される。
【００５２】
ヌードマウスヒト腫瘍異種移植モデルを使用して、Ａｄ.mda-７ Ｓがin vivoでヒトがん細胞の増殖を抑制できるかどうかを決定した。Taconic Labsから入手した無胸腺ヌードマウスに、マトリゲル（matrigel）と混合したＰＢＳ中の100万個のヒト子宮頸部がん腫（HeLa）細胞を皮下注射した（最終体積0.4ｍＬ；マトリゲル対ＰＢＳの比１：１）。腫瘍を平均体積100ないし200ｍｍ3（接種後10ないし21日目）に達するまで増殖させた。その後、マウスを無作為に２グループに分けた：グループ１：mda-７遺伝子を欠損している複製欠陥性Ａｄ；ヌル（null）ウイルス（ヌル）；およびグループ２：Ａｄ.mda-７ Ｓ。処理は、４週間の間、週に３回、ヌルまたはＡｄ.mda-７ Ｓの腫瘍内注射（４箇所に100μＬ/注射）から成る。腫瘍を週に２ないし３回カリパスで測定した。腫瘍体積を一般式を用いて計算した：pi/６×大きい直径×（小さい直径）2。治療の４週間後、動物をもう１週間観察し、屠殺した。最初の腫瘍体積で割った最終腫瘍体積は、がん進行の指標として規定された腫瘍体積比に相当する。
【００５３】
Ａｄ.mda-７ Ｓで処理された株化HeLa異種移植は、研究の間を通じて増殖を抑制したが、ヌルウイルスで処理された腫瘍は、進行して増殖し続けた（図５および６）。mda-７の抑制効果は、ｐ値＜0.05で有意であった。本研究は反復して行い、同じ結果が得られた。このデータから、mda-７の異所性発現がヒトのがん治療に治療上利益をもたらし得ることが示唆される。実験は、株化ヒト胸部がん腫瘍、ＭＣＦ-７およびＴ４７Ｄを用いてヌードマウスで今日進行中である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記遺伝子の発現可能な条件下で前記がん細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法。
【請求項２】
被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記被検者の細胞内で前記遺伝子の発現が可能な条件下において前記被検者のがん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法。
【請求項３】
前記核酸がベクターを含む請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
請求項１または２記載の方法であって、前記メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）が、当該遺伝子の発現が調節配列の制御下にあるように調節配列に連結している方法。
【請求項５】
前記調節配列が誘導的または構成的である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記調節配列が組織特異的調節配列である請求項４記載の方法。
【請求項７】
請求項１ないし６記載の方法であって、前記核酸が、裸のＤＮＡ技術、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、リポソーム、抗体で被覆したリポソーム、または機械的もしくは電気的手段により、前記がん細胞に導入される方法。
【請求項８】
請求項１ないし７記載の方法であって、前記がん細胞が、当該がん細胞内に欠陥性腫瘍抑制遺伝子が存在することにより特徴付けられる方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法であって、前記腫瘍抑制遺伝子がｐ５３、網膜芽細胞腫（ＲＢ）またはｐ１６ink4a遺伝子である方法。
【請求項１０】
請求項１ないし７記載の方法であって、前記がん細胞が、当該がん細胞内に優性作用的がん遺伝子が存在することにより特徴付けられる方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法であって、前記優性作用的がん遺伝子が、Ha-ras、突然変異体ｐ５３またはヒトパピローマウイルス遺伝子である方法。
【請求項１２】
請求項３記載の方法であって、前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイルスベクターまたはワクシニアウイルスベクターである方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法であって、前記アデノウイルスベクターが、mda-７を発現する複製欠陥性アデノウイルスベクター（名称 Ａｄ.mda-７ Ｓ）である方法。
【請求項１４】
がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物を前記がん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法。
【請求項１５】
被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物を前記被検者のがん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１５記載の方法であって、前記がん細胞が、胸部、子宮頸部、結腸、前立腺、鼻咽頭、肺、多形膠芽腫、リンパ腫、白血病、結合組織または神経系の細胞である方法。
【請求項１７】
がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む一定量の核酸と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物。
【請求項１８】
前記核酸がベクターを含む請求項１７記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項１８記載の薬学的組成物であって、前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイルスベクターまたはワクシニアウイルスベクターである薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１９記載の薬学的組成物であって、前記アデノウイルスベクターが、mda-７を発現する複製欠陥性アデノウイルスベクター（名称 Ａｄ.mda-７ Ｓ）である薬学的組成物。
【請求項２１】
がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の一定量の遺伝子産物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項１７ないし２１記載の薬学的組成物であって、前記がん細胞が、胸部、子宮頸部、結腸、前立腺、鼻咽頭、肺、多形膠芽腫、リンパ腫、白血病、結合組織または神経系の細胞である薬学的組成物。
【請求項１】
がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記遺伝子の発現可能な条件下で前記がん細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法。
【請求項２】
被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む核酸を、前記被検者の細胞内で前記遺伝子の発現が可能な条件下において前記被検者のがん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法。
【請求項３】
前記核酸がベクターを含む請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
請求項１または２記載の方法であって、前記メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）が、当該遺伝子の発現が調節配列の制御下にあるように調節配列に連結している方法。
【請求項５】
前記調節配列が誘導的または構成的である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記調節配列が組織特異的調節配列である請求項４記載の方法。
【請求項７】
請求項１ないし６記載の方法であって、前記核酸が、裸のＤＮＡ技術、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、リポソーム、抗体で被覆したリポソーム、または機械的もしくは電気的手段により、前記がん細胞に導入される方法。
【請求項８】
請求項１ないし７記載の方法であって、前記がん細胞が、当該がん細胞内に欠陥性腫瘍抑制遺伝子が存在することにより特徴付けられる方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法であって、前記腫瘍抑制遺伝子がｐ５３、網膜芽細胞腫（ＲＢ）またはｐ１６ink4a遺伝子である方法。
【請求項１０】
請求項１ないし７記載の方法であって、前記がん細胞が、当該がん細胞内に優性作用的がん遺伝子が存在することにより特徴付けられる方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法であって、前記優性作用的がん遺伝子が、Ha-ras、突然変異体ｐ５３またはヒトパピローマウイルス遺伝子である方法。
【請求項１２】
請求項３記載の方法であって、前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイルスベクターまたはワクシニアウイルスベクターである方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法であって、前記アデノウイルスベクターが、mda-７を発現する複製欠陥性アデノウイルスベクター（名称 Ａｄ.mda-７ Ｓ）である方法。
【請求項１４】
がん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物を前記がん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法。
【請求項１５】
被検者におけるがん細胞のがん性表現型を反転させるための方法であって、メラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の遺伝子産物を前記被検者のがん性細胞に導入することにより、前記がん細胞のがん性表現型を反転させることを具備した方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１５記載の方法であって、前記がん細胞が、胸部、子宮頸部、結腸、前立腺、鼻咽頭、肺、多形膠芽腫、リンパ腫、白血病、結合組織または神経系の細胞である方法。
【請求項１７】
がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）を含む一定量の核酸と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物。
【請求項１８】
前記核酸がベクターを含む請求項１７記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項１８記載の薬学的組成物であって、前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、弱毒ＨＩＶベクター、レトロウイルスベクターまたはワクシニアウイルスベクターである薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１９記載の薬学的組成物であって、前記アデノウイルスベクターが、mda-７を発現する複製欠陥性アデノウイルスベクター（名称 Ａｄ.mda-７ Ｓ）である薬学的組成物。
【請求項２１】
がん細胞のがん性表現型を反転させるために有効なメラノーマ分化関連遺伝子（mda-７）の一定量の遺伝子産物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項１７ないし２１記載の薬学的組成物であって、前記がん細胞が、胸部、子宮頸部、結腸、前立腺、鼻咽頭、肺、多形膠芽腫、リンパ腫、白血病、結合組織または神経系の細胞である薬学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−５１９０９（Ｐ２０１２−５１９０９Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２２１０９４（Ｐ２０１１−２２１０９４）
【出願日】平成２３年１０月５日（２０１１．１０．５）
【分割の表示】特願平１０−５１０１０２の分割
【原出願日】平成９年８月１５日（１９９７．８．１５）
【出願人】（５９２１０４７８２）ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク (21)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＴＲＵＳＴＥＥＳ ＯＦ ＣＯＬＵＭＢＩＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮ ＴＨＥ ＣＩＴＹ ＯＦ ＮＥＷ ＹＯＲＫ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２１０９４（Ｐ２０１１−２２１０９４）
【出願日】平成２３年１０月５日（２０１１．１０．５）
【分割の表示】特願平１０−５１０１０２の分割
【原出願日】平成９年８月１５日（１９９７．８．１５）
【出願人】（５９２１０４７８２）ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク (21)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＴＲＵＳＴＥＥＳ ＯＦ ＣＯＬＵＭＢＩＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮ ＴＨＥ ＣＩＴＹ ＯＦ ＮＥＷ ＹＯＲＫ
【Ｆターム（参考）】
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