ごぼう由来抽出物の抽出方法、二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤および免疫賦活食品
【課題】二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進および免疫の賦活を行うことのできるごぼう由来抽出物を抽出するためのごぼう由来抽出物の抽出方法、二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤および免疫賦活食品を提供する。
【解決手段】本発明に係るごぼう由来抽出物の抽出方法は、ごぼうをブランチングし、ブランチングした前記ごぼうの皮むきを行ない、皮むきを行った前記ごぼうをカットし、カットした前記ごぼうを３０〜７０℃で乾燥し、乾燥した前記ごぼうを１３２〜２４０℃で焙煎し、焙煎した前記ごぼうを熱水に浸けてごぼう由来抽出物を抽出するものである。また、かかるごぼう由来抽出物の抽出方法により抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤、または免疫賦活食品とした。
【解決手段】本発明に係るごぼう由来抽出物の抽出方法は、ごぼうをブランチングし、ブランチングした前記ごぼうの皮むきを行ない、皮むきを行った前記ごぼうをカットし、カットした前記ごぼうを３０〜７０℃で乾燥し、乾燥した前記ごぼうを１３２〜２４０℃で焙煎し、焙煎した前記ごぼうを熱水に浸けてごぼう由来抽出物を抽出するものである。また、かかるごぼう由来抽出物の抽出方法により抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤、または免疫賦活食品とした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ごぼうから抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする製剤に関し、より具体的には、ごぼう由来抽出物の抽出方法、これにより抽出されたごぼう由来抽出物を有効成分とする二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤および免疫賦活食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の食生活は欧米化が進み、高脂肪・低食物繊維食の傾向が強くなっている。それに伴って肥満などの生活習慣病の増加が問題になっている。また、近年、このような食事の欧米化により、大腸がんや炎症性腸疾患などの大腸疾病の発症率も年々増加しており、その原因の一つとして高脂肪食が指摘されている。
【０００３】
高脂肪食を摂取すると胆汁酸の分泌量が増加し、胆汁酸が化学変化した二次胆汁酸の分泌量も増加する。図４は、一次胆汁酸から二次胆汁酸への代謝を説明するフロー図であるが、この図４を参照して大腸がんや炎症性腸疾患などの大腸疾病となる１つのモデルについて説明する。
高脂肪食を摂取すると、これを消化して吸収するために小腸に胆汁が分泌される。この胆汁に含まれる胆汁酸の一部が大腸へ移行し、図４に示すように、腸（Intestine）内の悪玉菌（Intestinal bacteria）によって二次胆汁酸（Secondary bile acids）に変換される。この二次胆汁酸には強い毒性があり、腸粘膜の炎症をもたらすことやＤＮＡに損傷を与えること、がん細胞の増殖を促進し、大腸がんや大腸炎などの疾病を引き起こすことなどが報告されている。また、二次胆汁酸の中ではリトコール酸の毒性が最も高いこと、二次胆汁酸の引き起こす影響は大腸がんだけではなく、肝がん、すい臓がん、および胆管がんの発症を促進することも報告されている。そのため、大腸疾病を予防するために、二次胆汁酸の抑制が重要であると考えられている。
【０００４】
そのような中、最近、広島大学のHanらは、クルクミン、カフェ酸、カテキン、ルチンなどのポリフェノールが大腸内の二次胆汁酸を抑制させることを明らかにし、ポリフェノールによる大腸疾病予防の可能性を指摘している（非特許文献１）。
【０００５】
また、最近、（株）あじかんの井上らはごぼうを焙煎することにより、抗酸化指標であるＯＲＡＣ（Oxygen Radical Absorbance Capacity：活性酸素吸収能力）値が増大することを報告している（非特許文献２）。この非特許文献２には、国内産ごぼうを、蒸気加熱（ブランチング）後にカットし、乾燥した後、さらに１３０〜１８０℃で焙煎を行う旨が記載されている。かかる方法によって焙煎されたごぼうのＯＲＡＣ値は、計算上、３０１００であったのに対し、生のままのごぼうのＯＲＡＣ値は２１７０、ブランチングしたのみの段階では５７８０、焙煎前の乾燥した段階では２０７００であったと報告されている。また、かかる方法によって焙煎したごぼうを用いて淹れた茶外の茶には、イヌリンやフラクトオリゴ糖などの食物繊維も含まれることが報告されている。なお、茶外の茶とは、茶の木（Camellia sinensis）の葉ではないものから作られる茶をいう。
【０００６】
大腸がんや炎症性腸疾患などの大腸疾病の原因は二次胆汁酸だけではない。ウィルス、細菌、寄生虫、病原性抗原、食物抗原などの多くの物質も原因となり得る。ヒトは、これらの物質を摂取した場合であっても、腸内における物理的なバリアー機能による腸管内への侵入防止と、腸管内に侵入された場合であっても生物的なバリアー機能による排除と、によって健康を維持している。腸内の物理的なバリアー機能にはムチンと呼ばれる糖タンパク質を主成分とする粘液が大きく関与し、生物的なバリアー機能にはＩｇＡなどの免疫機能が大きく関与している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Han Y, Haraguchi T, Iwanaga S, Tomotake H, Okazaki Y, Mineo S, Moriyama A, Inoue J, Kato N. Consumpiton of some polyphenols reduces fecal deoxycholic acid and lithocholic acid, the secondary bile acids of risk factors of colon caner. J Agric Food Chem. Vol. 57: P. 8587-8590, 2009
【非特許文献２】井上ら、日本調理科学会大会研究発表要旨集 Vol. 21: P. 1086, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進、つまり免疫の賦活は、大腸がんや炎症性腸疾患などの大腸疾病の予防や治療に大いに役立つと考えられるが、これらを食餌によりコントロールするのは容易ではないという問題がある。
【０００９】
本発明は前記問題点に鑑みてなされたものであり、二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進および免疫の賦活を行うことのできるごぼう由来抽出物を抽出するごぼう由来抽出物の抽出方法と、これにより抽出されたごぼう由来抽出物を有効成分とする二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤および免疫賦活食品とを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者は、高脂肪食条件下、ごぼうから抽出したごぼう由来抽出物を含有するごぼう抽出液をラットに摂取させ、糞中胆汁酸の分析をした結果、特定の条件で抽出したごぼう抽出液の摂取がＩｇＡやムチンを増加させ、大腸がんの危険因子であるリトコール酸（二次胆汁酸）を減少させ、前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
前記課題を解決した請求項１に記載の発明は、ごぼうをブランチングし、ブランチングした前記ごぼうの皮むきを行ない、皮むきを行った前記ごぼうをカットし、カットした前記ごぼうを３０〜７０℃で乾燥し、乾燥した前記ごぼうを１３２〜２４０℃で焙煎し、焙煎した前記ごぼうを熱水に浸けてごぼう由来抽出物を抽出することを特徴とする。
【００１２】
このように、ブランチングと皮むきとカットとを行ったごぼうに対して３０〜７０℃で乾燥を行ない、さらに、１３２〜２４０℃で焙煎を行ったごぼうを用いて熱水に浸すことにより、ごぼうに含まれている糖質、フラクトオリゴ糖を含んだ水溶性食物繊維、ポリフェノールなどの成分を、抽出物（ごぼう由来抽出物）として抽出することができる。
【００１３】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする二次胆汁酸抑制剤である。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とするＩｇＡ産生促進剤である。
【００１５】
請求項４に記載の発明は、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とするムチン産生促進剤である。
【００１６】
請求項５に記載の発明は、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする免疫賦活食品である。
【発明の効果】
【００１７】
請求項１に記載の発明によれば、ブランチングと皮むきとカットとを行った後、３０〜７０℃で乾燥し、さらに１３２〜２４０℃で焙煎し、熱水に浸すことによりごぼう由来抽出物を抽出することができる。そして、このごぼう由来抽出物により二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進および免疫の賦活を行うことができる。
【００１８】
また、請求項１に記載の発明によれば、３０〜７０℃で乾燥するため、早期にごぼう中の水分を除去することができ、その結果、ポリフェノールオキシダーゼによるポリフェノール成分の酸化減少を抑制することができる。また、乾燥温度が適切であるので、色、味、風味といった官能を優れたものとすることができる。さらに、請求項１に記載の発明によれば、１３２〜２４０℃で焙煎するので、土臭さ、泥臭さ、苦味がなく、甘さ、香ばしさに富むものとすることができる。
したがって、請求項１に記載の発明は、ブランチングと皮むきとカットとを行い、前記した条件で乾燥と焙煎を行ったごぼうを用いて茶外の茶（ごぼう茶）として淹れた場合に、二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進および免疫の賦活といった作用を奏することができるとともに、ごぼう茶として飲食したときに味、風味、色、などの官能に優れたものとすることができる。
【００１９】
請求項２に記載の発明によれば、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分として含んでいるので、二次胆汁酸を抑制することができる。
【００２０】
請求項３に記載の発明によれば、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分として含んでいるので、ＩｇＡの産生を促進させることができる。
【００２１】
請求項４に記載の発明によれば、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分として含んでいるので、ムチンの産生を促進させることができる。
【００２２】
請求項５に記載の発明によれば、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分として含んでいるので、免疫を賦活することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】表３に記載した各群間における最終体重（Final body wt (g)）を示すグラフである。
【図２】（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、表６に示した糞中パラメーターのうち、各群間における糞の重量（Fecal wet wt (g/3 d)）、糞中の水分（Fecal water (%)）、糞中のＩｇＡ量（Fecal IgA (mg/3 d)）、および糞中のムチン量（Fecal Mucin (mg/3 d)）をグラフ化したものである。
【図３】（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、表８に示した糞中胆汁酸組成のうち、各群間におけるリトコール酸（Lithocholic acid）量（μmol/g）、デオキシコール酸（Deoxycholic acid）量（μmol/g）、ヒオデオキシコール酸（Hyodeoxycholic acid）量（μmol/g）、およびコール酸（Cholic acid）量（μmol/g）をグラフ化したものである。
【図４】一次胆汁酸から二次胆汁酸への代謝を説明するフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の一実施形態に係るごぼう由来抽出物の抽出方法、二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤および免疫賦活食品について詳細に説明する。
【００２５】
本発明の一実施形態に係るごぼう由来抽出物の抽出方法は、ごぼうをブランチングし、ブランチングした前記ごぼうの皮むきを行ない、皮むきを行った前記ごぼうをカットし、カットした前記ごぼうを３０〜７０℃で乾燥し、乾燥した前記ごぼうを１３２〜２４０℃で焙煎し、焙煎した前記ごぼうを熱水に浸けてごぼう由来抽出物、つまり、ごぼう由来の抽出成分を抽出するものである。
【００２６】
ブランチングは、ごぼうに含まれる多糖類を分解し、フルクトースやイヌリン、フラクトオリゴ糖などを得るために行うものである。
ブランチングは、蒸すことにより行うことができるがこれに限定されるものではない。例えば、焙焼、湯浴、焙煎、温蔵庫や蒸し庫で加熱することなどによっても行うことができる。
また、ブランチングの処理温度および処理時間は、甘みの強弱など消費者の嗜好に合わせて任意に設定することができる。
【００２７】
例えば、ブランチングの処理温度を３５℃とした場合は処理時間を１８０分間などとし、ブランチングの処理温度を９５℃とした場合は処理時間を５分間などとすることができる。
ブランチングの処理温度が低く、処理時間を短くすると、多糖類の分解があまり行われないため、フルクトースの生成量が少なくなり、甘みが弱くなる。一方、ブランチングの処理温度が高く、処理時間が長くなると、多糖類の分解が多く行われるため、フルクトースの生成量が多くなり、甘みが強くなる。
なお、ブランチングの処理温度と処理時間は、処理量と設備によっても異なるが、大型の蒸し庫であれば処理温度を４０〜９０℃とするのが好ましく、７５〜９０℃とするのがより好ましい。処理時間は１０〜１８０分間とするのが好ましい。
【００２８】
ごぼうの皮むきおよびカットは、ごぼうの乾燥と焙煎を行い易くするとともに、熱水による抽出を容易とするために必要な工程である。
ごぼうの皮むきおよびカットは、市販の自動野菜加工機、例えば、ごぼう皮むき機や電動ごぼう切り機などで行うことができる。ごぼうの皮むきは、ごぼうの外皮を除去できればよく、ごぼうのカットは、薄切り、輪切り、半月切り、いちょう切り、短冊切り、斜め切り、ささがきなどとすることができればよい。これらはもちろん、作業員の手によって行うこともできる。
【００２９】
次いで行うごぼうの乾燥は、ポリフェノールオキシダーゼによるポリフェノール成分の酸化減少を抑制し、ＯＲＡＣ値を高く維持するためと、色、味、風味といった官能を優れたものにするために行うものである。
ごぼうの乾燥は、前記したように３０〜７０℃で行う。乾燥は、天日干し、熱風乾燥など適宜の方法により行うことができる。ここで、乾燥温度が３０℃未満であると、乾燥が不十分となるおそれがあり、ごぼうに含まれるポリフェノールオキシダーゼによるポリフェノール成分の酸化減少が促進するので好ましくない。また、黒っぽい褐色を呈し、酸味が強く、風味は生臭くなるため、官能の点で好ましくない。一方、乾燥温度が７０℃を超えると乾燥し過ぎてしまい、メイラード反応が促進して黒っぽい褐色を呈し、えぐみと酸味が強くなる傾向にあり、官能の点で好ましくない。また、ポリフェノール成分の酸化による減少が促進されるので好ましくない。なお、乾燥温度は４０〜６０℃とするのがより好ましく、５０℃程度とすると明るい褐色を呈し、甘みおよび香りもよく、ポリフェノール成分の含有量が高くなるのでさらに好ましい。
【００３０】
乾燥時間は、前記した温度範囲であれば、例えば、３０分間から８時間、より好ましくは５〜６時間行えばよいが、所望の効果を奏するようにごぼうを乾燥することができれば特にこれに限定されるものではない。ただし、時間がかかるほどごぼうの酸化が進み、酸味が強くなる傾向にあるため、なるべく短時間で行った方がよい。
【００３１】
なお、ごぼうの乾燥は、水分率が２〜１５％になるまで行うのがよい。水分率がこの範囲にあればポリフェノールオキシダーゼによるポリフェノール成分の酸化減少を抑制することや、ＯＲＡＣ値を高く維持すること、色、味、風味といった官能を優れたものとすることが可能である。一方、水分率が１５％を超えると、乾燥が不十分となるおそれがあり、ごぼうに含まれるポリフェノールオキシダーゼによるポリフェノール成分の酸化減少が促進するので好ましくない。また、色は黒っぽい褐色を呈し、酸味が強く、風味は生臭くなるため、官能の点で好ましくない。
【００３２】
次いで行うごぼうの焙煎は、土臭さ、泥臭さ、甘さ、苦味、香ばしさなどの官能を優れたものとするために行うものである。つまり、土臭さ、泥臭さ、苦味がなく、甘さ、香ばしさに富むものとするために行うものである。
ごぼうの焙煎は、前記したように１３２〜２４０℃で行う。焙煎は、例えばガス式焙煎機（ニチモウ（株）製ＲＣ−１）などにより行うことができる。ここで、焙煎温度が１３２℃未満であると、焙煎が不十分となり、焙煎香（ロースト香）が得られず、ごぼうの生臭み（土臭さ、泥臭さ）が残ってしまうので好ましくない。一方、焙煎温度が２４０℃を超えると乾燥し過ぎてしまい、コゲ臭の発生と、炭化が進むため苦味が強くなり過ぎてしまう。また、クロロゲン酸などのポリフェノール成分や総食物繊維、オリゴ糖などが高温により減少するので好ましくない。なお、ＯＲＡＣ値を高く維持する点および官能の点から、焙煎温度は１８０℃を超え２４０℃以下とするのがより好ましい。
【００３３】
焙煎時間は、前記した温度範囲であれば、５〜１５分間程度行えばよいが、所望の効果を奏するようにごぼうを焙煎することができれば特にこれに限定されるものではない。なお、ごぼうの焙煎は、香り、風味がより増強され、水分が５％以下となればよい。
【００３４】
次いで行う熱水によるごぼう由来抽出物の抽出は、例えば、８５〜９５℃の熱水を用いて行うことができる。抽出時間は、５〜１０分間程度とすることができるが、適宜にこれよりも長くしたり、短くしたりしてもよい。
【００３５】
このようにして抽出されるごぼう由来抽出物としては、例えば、果糖、ブドウ糖、ショ糖などの糖質、アルギニンなどのアミノ酸、１−ケストース、ニストース、フラクトフラノシルニストースなどのフラクトオリゴ糖、食物繊維（イヌリン、オリゴ糖、リグナン）などが挙げられる。また、カフェ酸、クエルセチン、リグナンなどのポリフェノールおよびこれらの誘導体も含有され得る。なお、カフェ酸の誘導体としては、例えば、クロロゲン酸、ネオクロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、イソクロロゲン酸、トリカフェオイルキナ酸、ロスマリン酸などを挙げることができる。クエルセチンの誘導体は、配糖体としてクエルシトリン、イソクエルシトリン、クエルシメリトリン、アビクラリン、ヒペリン、レイノウトリン、クエルシツロン、ルチン等がある。リグナンの誘導体は、アルクチゲニンやジアルクチゲニン、アルクチイン、lappaol A〜F、isolappaol Cなどがある。
なお、前記したもの以外にも、ブランチング、皮むき、カット、乾燥、焙煎および熱水での抽出のうちの少なくとも１つの工程により生成し、または増加した成分がごぼう由来抽出物として含有され、かかる成分により二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進、免疫の賦活といった効果を奏している可能性もある。
【００３６】
ごぼう由来抽出物は熱水にて抽出した後、必要に応じて当該熱水をろ紙やろ過フィルターなどを用いてろ過してもよい。このようにすれば、ごぼう由来抽出物を含有し、かつ濁りがなく清らかな溶液を得ることができる。さらに、熱水にて抽出したごぼう由来抽出物は、ろ過しないまま、または、ろ過した後に、加温したり、乾燥条件下や減圧条件下においたりして水分を除去し、固形物や粉末物、結晶物などとしてもよい。
【００３７】
このようにして熱水中に抽出されたごぼう由来抽出物は、後記する［実施例］で説明するように、二次胆汁酸の産生を抑制する効果と、ムチンの産生を促進する効果とを有するとともにＩｇＡの産生を促進する効果を有している。そのため、免疫を賦活化する効果を有しているといえる。
したがって、前記した抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする薬剤や機能性飲食料品は、前記した効果を奏することが期待できる。
【００３８】
このような薬剤としては、二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤、免疫賦活剤を挙げることができる。これらの薬剤は、前記した抽出方法でごぼう由来抽出物を抽出した熱水を必要に応じてろ過や乾燥等した後、適宜の形態に製剤し、任意の投与形態で投与することができる。投与形態としては、経口、経腸、経粘膜、注射などが挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などが挙げられる。非経口投与としては、静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
【００３９】
また、かかる薬剤では、二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤、若しくは免疫賦活剤を単独で、または他の薬学的に許容される担体と組み合わせて使用することができる。かかる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤などが挙げられる。
【００４０】
前記した機能性飲食料品としては、二次胆汁酸抑食品、ＩｇＡ産生促進食品、ムチン産生促進食品、免疫賦活食品を挙げることができる。機能性飲食料品は、飲料品（機能性飲料品）であってもよく、また、食料品（機能性食料品）であってもよい。飲料品としては、前記した抽出方法でごぼう由来抽出物を抽出した熱水（ごぼう抽出液）をそのまま飲用するごぼう茶や、かかる熱水を必要に応じてろ過等し、ボトリングしたペットボトル飲料、缶飲料、あるいはスープなどを挙げることができる。また、食料品としては、前記した抽出方法でごぼう由来抽出物を抽出した熱水をそのまま、あるいは必要に応じて乾燥等して得た固形物や粉末物とした上で混合したパン、菓子、惣菜などを挙げることができる。
【実施例】
【００４１】
次に、本発明のごぼう由来抽出物の抽出方法、二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤および免疫賦活食品について実施例を示して具体的に説明する。
【００４２】
＜第１実施例＞
［ごぼう由来抽出物の抽出］
ごぼう由来抽出物を抽出して実験動物に投与するため、当該ごぼう由来抽出物を含有する飲料としてごぼう抽出液を製造した。
ごぼう抽出液は、ごぼうを水洗いした後、５０℃で１５分間のブランチングを行い、ごぼうを水冷した後、皮むきとカット（２ｍｍ×２ｍｍ×２０ｍｍ）を行った。次いで、カットしたごぼうを熱風乾燥機にて５０℃で８時間熱風乾燥し、１８０℃で１３分間焙煎した。
そして焙煎したごぼうを、２．８％（ｗ／ｖ）の濃度で、９０℃、１０分間の熱水抽出を行い、ろ過したものを供試サンプルとした。
【００４３】
製造したごぼう抽出液の食物繊維およびフラクトオリゴ糖の成分分析を行った。食物繊維の成分分析は日本食品分析センターに依頼し、酵素−ＨＰＬＣ法にて分析してもらった。フラクトオリゴ糖については、ＨＰＬＣ法により、１−ケストース（ＧＦ２）、ニストース（ＧＦ３）、フラクトフラノシルニストース（ＧＦ４）について分析した。製造したごぼう抽出液の食物繊維およびフラクトオリゴ糖の成分の分析結果を下記表１に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
表１に示すとおり、製造したごぼう抽出液は、１００ｍｌ当たり１．３ｇの食物繊維を含み、フラクトオリゴ糖である１−ケストース、ニストース、フラクトフラノシルニストースを含有していた。また、総ポリフェノール量がクロロゲン酸当量で１００ｍｌ当たり０．１５７ｇ含んでいた。
【００４６】
［動物飼育］
実験動物としてＳＤ（Sprague-Dawley）系雄ラット（３週齢、初体重４０−５０ｇ、Charles River Japan Inc.社製）を用いた。実験動物の飼育は、広島大学の実験動物取扱規程に準じて行った。具体的には、ステンレス製ケージに１匹ずつ入れ、１２時間明暗交代（８：００〜２０：００明、２０：００〜翌朝８：００暗）の恒温環境（２４℃±１℃）で飼育した。予備飼育期間は７日間とし、市販の固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母社製）、および脱イオン水を自由に摂取させた。予備飼育後、ラットは３群（８匹／１群）に分け、３０％牛脂の高脂肪食の条件下で一定量の制限食（下記表２参照）とし、脱イオン水、ごぼう抽出液、およびごぼうからのポリフェノール抽出物（以下、「ごぼうポリフェノール」と略）（ごぼう抽出液相当量：０．１５７％）を自由に摂取させて、２１日間飼育した。実験食は、１日目に９ｇ、２−４日目に１０ｇ、５−７日目に１２ｇ、８−１３日目に１４ｇ、および１４−２１日目に１５ｇを毎日定刻（１９：００）にラットに与えた。いずれも翌朝までに食べきる量を与えた。体重は毎朝定刻（１０：００）に測った。飼育最後の３日間に糞を採取した。糞の湿重量を測定し、１２時間凍結乾燥後、乳鉢を用いて磨り潰した。乾燥糞は、−３０℃で冷凍保存し、糞中ＩｇＡおよび糞中ムチンの分析を行った。
飼育終了日の午前（８：００）に餌を抜き取り、１２時頃に体重を測り、午後（１３：００〜１５：００）にジエチルエーテル麻酔下で断頭屠殺を行い、血液、肝臓、および盲腸内容物を速やかに採取した。盲腸内容物の一部からは、ＤＮＡ抽出を行った。血液は採取後、氷の中で２〜３時間放置した後に４℃で２０００×ｇ、２０分間遠心分離し、得られた血清を−８０℃で冷凍保存した。
【００４７】
【表２】
【００４８】
［分析方法］
（１）糞中ＩｇＡ測定方法
糞中ＩｇＡの測定は、Sharmaらの方法（Sharma A, Honma K, Evans RT, Hruby DE, Genco RJ. Oral Immunization with Recombinant Streptococcus gordoni Expressing Porphyromonas gingivalis FimA Domains. Infection and Immunity. 69: 2928-2934, 2001）に従って以下のようにして行った。
【００４９】
（ＩｇＡの抽出）
乾燥糞（０．１ｇ）に４０倍量のトリプシンインヒビター（０．１ｍｇ／ｍｌ、大豆由来、和光純薬社製）、ＥＤＴＡ（５０ｍＭ）、フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ、１ｍＭ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）を加えた。試験管ミキサーで１分間攪拌後、４℃で一晩静置した。その後、４℃、９０００×ｇで１０分遠心分離し、上清を回収し、ＩｇＡ測定用サンプルとした。得られたサンプルは、測定まで−３０℃で冷凍保存した。
【００５０】
（ＩｇＡ量の測定）
ＩｇＡ量の測定は、Rat IgA ELISA Quantitation Kit（BETHYL社製）を用いたＥＬＩＳＡ法によって行った。抗原としてヤギ抗ラットＩｇＡ抗体を使用し、０．０５Ｍ 炭酸カルシウム緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｌ抗原原液／０．１ｍｌ濃度となるように希釈した。この希釈溶液を９６穴プレートの各ウェルに１００μｌ入れ、４℃で一晩静置させて抗原処理を行った。翌日、各ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で３回洗浄し、各ウェルに、１％ＢＳＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、０．１４Ｍ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ８．０）２００μｌを加え、マイクロプレートミキサーで攪拌後、室温（２０℃−２５℃）で３０分間ブロッキングした。サンプルまたはラットＩｇＡ抗体の標準液を、希釈液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液−０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で希釈した。各ウェルを洗浄液で３回洗浄後、サンプルおよびラットＩｇＡ抗体の標準品１００μｌを加え、マイクロプレートミキサーで攪拌後、室温（２０〜２５℃）で１時間インキュベートした。各ウェルを洗浄液で５回洗浄後、２次抗体として、希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ラットＩｇＡ抗体液を１００μｌ加え、マイクロプレートミキサーで攪拌後、室温（２０〜２５℃）で１時間インキュベートした。各ウェルを洗浄液で５回洗浄後、０．４ｍｇ／ｍｌ濃度のＯＰＤ（和光純薬社製）と０．０２６％Ｈ2Ｏ2を含む０．１Ｍ クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えアルミホイルで遮光しながら室温（２０〜２５℃）で１５分間反応させた。反応後、２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を１００μｌ加えて反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定した。
【００５１】
（２）糞中ムチン測定方法
（糞中ムチンの抽出その加水分解）
糞中ムチンの抽出はBovee-Oudenhovenらの方法（Bovee-Oudenhoven IM, Termont DS, Heidt PJ, Van der Meer R. Increasing the intestinal resistance of rats to the invasive pathogen Salmonella enteritidis: additive effects of dietary lactulose and calcium. Gut. 40: 497-504, 1997）に従って次のように行った。
【００５２】
乾燥糞０．１０ｇをマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に採取し、１．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水を加え、試験管ミキサーで１分間攪拌した。その後、腸内細菌のグリコシダーゼを失活させるため９５℃で１０分加温し、ムチンを可溶化させるため、さらに３７℃で９０分間インキュベーションした。インキュベーション後、４℃、２００００×ｇで１５分間遠心分離し、上澄み０．２ｍｌをマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に採取し、０．４Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．７５）を上澄みと同容量加えた。さらに１０μｌのアミログルコシダーゼ液（Sigma社製）を加え、５０℃で２０分間インキュベーションし、可溶性デンプンを完全に加水分解した。その後、混合物を冷却し、６０％（ｖ／ｖ）の氷冷エタノール液を加え、−３０℃で一晩放置した。放置後、４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離し、沈殿物を約２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水に溶かし、ムチン測定用サンプルとした。
【００５３】
糞中ムチンの測定は、Crowtherらの方法（Crowther RS, Wetmore RF. Fluorimetric assay of o-linked glycoproteins by reaction with 2-cyanoacetamide. Anal Biochem. 163: 170-174, 1987）に従って次のように行った。
【００５４】
ムチン測定用サンプルを１００μｌ採取し、１２０μｌの０．６Ｍ ＣＮＡ：０．１５Ｍ ＮａＯＨ（１：５，ｖ／ｖ）混合溶液を加え、１００℃で３０分間インキュベーションした。その後、０．６Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１ｍｌ加え、溶液を室温まで冷却し、島津分光光度計（励起波長３３６ｎｍ、測定波長３８３ｎｍ）を用いてムチンを定量した。糞中ムチンは、この操作過程でムチンから遊離したＯ−結合性オリゴ糖の量として定量し、標準溶液にはＮ−アセチルガラクトサミンを用いた。
【００５５】
（３）腸内細菌の遺伝子解析
腸内細菌の遺伝子解析は、Ｔ−ＲＦＬＰ（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism）法（Liu W-T, Marsh T, Cheng H, Forney LJ. Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 63: 4516-4522, 1997））により行った。
なお、Ｔ−ＲＦＬＰ法とは、末端を蛍光標識したプライマーセットで鋳型ＤＮＡをＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）にて増幅し、制限酵素による消化後、フラグメント解析を行い、塩基配列の違いから制限酵素切断部位が異なることを利用し、検出ピークの強度、位置、数により評価・比較する断片多型性解析である。
【００５６】
（盲腸内容物中の腸内細菌ＤＮＡの抽出）
腸内細菌叢の解析には、市販のキット（UltraCleanTM Fecal DNA Kit、Mo BIO Laboratories, Inc.社製）を用いて行った。このキットの原理は、ビーズ−フェノール法を用いて盲腸内容物のＤＮＡを抽出するものである。まず、チューブのなかにサンプルとビーズを入れて振動させてビーズがサンプルにぶつかることで物理的に細菌の細胞壁を破壊し、さらに溶菌バッファーを加えて菌体を破砕する。次に、フェノール・クロロホルム抽出による不要なタンパク質を除去し、イソプロパノール沈殿を行った後、エタノールでリンスし、ＴＥバッファーにＤＮＡを溶解させることにより、盲腸内容物サンプルからＤＮＡを抽出した。
【００５７】
（盲腸内容物中の腸内細菌１６ＳｒＤＮＡの解析）
前記したＤＮＡの抽出の操作によって得られた盲腸内容物中の腸内細菌ＤＮＡ抽出物を前記したＴ−ＲＦＬＰ法を用いて解析した。Ｔ−ＲＦＬＰ法による腸内細菌叢の解析は、細菌の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子が標的となる。まず、末端を蛍光標識した共通のプライマーを用いて盲腸内容物中のＤＮＡを増幅し、得られた１６ＳｒＤＮＡを制限酵素で消化した後、キャピラリー電気泳動法を用いたＤＮＡシークエンサーによって蛍光標識された末端を含むＤＮＡ断片（Terminal Restriction Fragment：Ｔ−ＲＦ）のみを検出する方法である。腸内フローラの構成菌種は１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が異なるため、制限酵素による切断部位は菌種固有のものとなる。これらの処理によって得られるＴ−ＲＦに対応したピークの位置（断片長）、面積（菌数）および数（菌種の多様性）を解析することで糞便中の構成菌種およびその割合を推定する方法である。本発明では、各サンプルの細菌叢に由来する１６ＳｒＤＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）部分塩基配列のＴ−ＲＦＬＰ解析を行い、得られたデータに基づいてサンプル中の主要な分類群の推定およびクラスター解析によるサンプル間の比較を行った。
【００５８】
Ｔ−ＲＦＬＰ解析の主な方法は長島らの方法およびCollinsらの方法（Nagashima K, Hisada T, Satou M, Mochizuki J. Application of New Prmer-Enzyme Combination to Terminal Restricition Fragment Length Polymorphism Profiling of Bacterial Populations in Human Feces. Appl. Environ. Micobiol. 69: 1251-1262, 2003、Nagashima K, Mochizuki J, Hisada T, Suzuti S, Shimomura K. Phylogenetic analysis of 16S ribosomal RNA gene sequences from Human fecal microbiota and improved utility of terminal restriction fragment length polymorphism profiling. Bioscience Microflora. 25: 99-107, 2006、Collins MD, Lawson PA, Willems A, Cordoba JJ, Fernandez-Garayzabal J, Garcia P, Cai J, Hippe H, Farrow JAE. The Phylogeny of the Genus Clostridium:Proposal of Five New Genera and Eleven New Species Combinations. Int. J. Syst. Bacteriol. 44: 812-826, 1994）に基づいて行った。
【００５９】
なお、フラグメント解析にはABI PRISM 3130xl DNA Sequencer（Applied Biosystem, CA, USA）およびGeneMapper（Applied Biosystems, CA, USA）を使用した。各フラグメントの長さはoperational taxonomic unit（以下ＯＵＴと省略）で判断した。クラスター解析は、解析ソフトGene Maths（Applied Biosystems, CA, USA）を使用した。クラスタリングの方法は、Pearson correlation、UPGMA（非加重結合法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean）を選択した。
【００６０】
（４）盲腸内有機酸
盲腸内容物の有機酸（コハク酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸）の分析は、ＨＰＬＣ法で測定した。
【００６１】
サンプル調製方法とＨＰＬＣ分析条件は以下のとおりである。盲腸内容物２００〜３００ｍｇを２．０ｍｌマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に精秤し、１０ｍＭ クロトン酸（１０ｍＭ ＮａＯＨに溶解）を１．０ｍｌ加え、ホモジネート攪拌混合した。
【００６２】
１５０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心分離して得られた上清を２．０ｍｌマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に分取した後、０．８ｍｌのクロロホルムを加え、３０秒間振とうした。１００００ｒｐｍ、４℃の条件で１５分間遠心分離を行い、上層５００μｌを１．５ｍｌマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に分取した。
そして、除たんぱく処理のため、１０％過塩素酸を５０μｌ添加して混合し、ＨＰＬＣ分析まで−３０℃で凍結させた。
【００６３】
ＨＰＬＣインジェクトの前に解凍し、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清をフィルター付きマイクロテストチューブ（Ultrafree-MC，エッペンドルフ社製）に採取し、０．２２μｍフィルターで遠心ろ過（５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）し、１０μｌをインジェクトした。
【００６４】
〔ＨＰＬＣ条件〕
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＣＲ−１０２Ｈ（８．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ）
ガードカラム：ＳＣＲ−１０２Ｈ
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸水溶液
流量：０．８ ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
（検出条件）
試薬：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸水溶液および１００μＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ水溶液
検出：電気伝導度検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＣＤＤ−１０Ａ）
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ（ＬＣ−２０Ａシリーズ）
【００６５】
得られた測定値は平均値±標準誤差（ＳＥ）で表した。統計的有意性は、スチューデントのＴ検定により評価し、Ｐ＜０．０５の場合有意差有りとした。
【００６６】
（５）血清グルコース測定法
血清グルコースの定量には、市販キット（グルコースＣII−テストワコー、和光純薬社製）を用いて行った。このキットの測定方法は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）法である。試料に発色試液を作用させると、試料中のグルコースは発色試液中に含まれるムタロターゼの作用によりα型からβ形へすみやかに変換する。β−Ｄ−グルコースは、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）の作用を受けて酸化され、同時に過酸化水素を生じる。生成した過酸化水素は、共存するペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用により発色試液中のフェノールと４−アミノアンチピリンを定量的に酸化縮合させ、赤色の色素を生成させる。この赤色の色素を５０５ｎｍで比色定量し、得られた吸光度よりグルコース濃度を計算した。
【００６７】
（６）血清トリグリセライド測定法
血清トリグリセライドの定量は、市販のキット（トリグリセライドＥ−テストワコー、和光純薬社製）を用いて行った。このキットの測定方法は、３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２´−ヒドロキシ−３´−スルホプロピル）−アニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）法である。
試料中のトリグリセライドは、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）の作用によりグリセリンと脂肪酸に分解される。生成したグリセリンは、ＡＴＰの存在下でグリセロールキナーゼ（ＧＫ）の作用でグリセロール−３−リン酸になる。生成したグリセロール−３−リン酸は、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）の作用を受けて酸化され、同時に過酸化水素を生じる。生成した過酸化水素は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用によりＤＡＯＳと４−アミノアンチピリンを定量的に酸化縮合させ、青色の色素を生成させる。この青色の色素を６００ｎｍで比色定量し、得られた吸光度よりトリグリセライド濃度を計算した。
【００６８】
（７）血清コレステロール測定法
血清コレステロールの定量には、市販キット（コレステロールＥ−テストワコー、和光純薬社製）を用いて行った。このキットの測定方法は、３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２´−ハイドロキシ−３´−スルホプロピル）−アニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）法である。
試料に発色試液を作用させると、試料中のコレステロールエステル類は、コレステロールエステラーゼの作用により遊離のコレステロールと脂肪酸に分解される。生成したコレステロールは、既存の遊離型コレステロールと共にコレステロールオキシダーゼの作用を受けて酸化され、同時に過酸化水素を生じる。生成した過酸化水素は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用によりＤＡＯＳと４−アミノアンチピリンを定量的に酸化縮合させ青色の色素を生成させる。この青色の色素を６００ｎｍで比色定量し、得られた吸光度より総コレステロール濃度を計算した。
【００６９】
（８）肝臓コレステロール測定法
肝臓脂質の定量にはFolchらの方法（Folch J, Lees M, Sloane S G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226: 497-509, 1957）に従って次のようにして行った。
約１ｇの肝臓に４倍量の０．１４Ｍ 塩化カリウム溶液を加え、ポッターエルビーエム型ホモジナイザーを用いて氷冷下でホモジナイズ（２０００ｒｐｍ、３０〜６０秒）した。このホモジネート液０．５ｍｌを１５ｍｌファルコンチューブに採取し、クロロホルム：メタノール（２：１，ｖ／ｖ）混合溶液を８ｍｌの標線まで加えて４℃で一晩放置した。放置後、ろ紙を用いてろ過し、ろ液３．５ｍｌを遠心管に採取し、０．０４％塩化カルシウム溶液を０．７５ｍｌ加え、遠心（４℃、２０００×ｇ、１０分）した。上清をパスツールピペットで注意深く除去した。続いて、クロロホルム：メタノール：水（３：４８：４７，ｖ／ｖ／ｖ）混合溶液を０．７５ｍｌ加え、遠心（４℃、２０００×ｇ、１０分）した。遠心分離後、上述と同様に上清を除去し、メタノールを０．２ｍｌ加えて一層にした。そして、クロロホルム：メタノール（２：１，ｖ／ｖ）混合溶液を用いて、５ｍｌにメスアップした。これを肝臓中総コレステロール測定用として０．２ｍｌ試験管に採取し、６０℃でドライアップした。血清中の総コレステロールと同様に市販キット（コレステロール−テストワコー、和光純薬社製）を用いて測定した。
【００７０】
（９）肝臓トリグリセライド測定法
肝臓脂質の定量にはFolchらの方法（Folch J, Lees M, Sloane S G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226: 497-509, 1957）に従って次のようにして行った。
約１ｇの肝臓に４倍量の０．１４Ｍ 塩化カリウム溶液を加え、ポッターエルビーエム型ホモジナイザーを用いて氷冷下でホモジナイズ（２０００ｒｐｍ、３０〜６０秒）した。このホモジネート液０．５ｍｌを１５ｍｌファルコンチューブに採取し、クロロホルム：メタノール（２：１，ｖ／ｖ）混合溶液を８ｍｌの標線まで加えて４℃で一晩放置した。放置後、ろ紙を用いてろ過し、ろ液３．５ｍｌを遠心管に採取し、０．０４％塩化カルシウム溶液を０．７５ｍｌ加え、遠心（４℃、２０００×ｇ、１０分）した。上清をパスツールピペットで注意深く除去した。続いて、クロロホルム：メタノール：水（３：４８：４７，ｖ／ｖ／ｖ）混合溶液を０．７５ｍｌ加え、遠心（４℃、２０００×ｇ、１０分）した。遠心分離後、上述と同様に上清を除去し、メタノールを０．２ｍｌ加えて一層にした。そして、クロロホルム：メタノール（２：１，ｖ／ｖ）混合溶液を用いて、５ｍｌにメスアップした。これを肝臓中中性脂肪測定用として０．２ｍｌ試験管に採取し、６０℃でドライアップした。続いて、メタノール：トリトンｘ−１００（１：１，ｖ／ｖ）混合液６０μｌと第３ブチルアルコール９０μｌを添加した。血清中のトリグリセライドと同様に市販キット（トリグリセライドＥ−テストワコー、和光純薬社製）を用いて測定した。
【００７１】
（１０）糞中胆汁酸分析法
（糞中胆汁酸抽出法）
乾燥させた糞を乳鉢で粉末になるまで細かく砕いた後、約０．６ｇ採取し、次いで０．５％（ｗ／ｗ）となるようにクルクミンとヘスペリジンをそれぞれ添加し、混合した。次いで、９倍量の蒸留水を加えてホモジナイズを行い、一晩凍結乾燥した。凍結乾燥終了後、再び糞を乳鉢で粉砕し、サンプルとした。
【００７２】
（糞中胆汁酸組成の分析法）
糞中の胆汁酸測定は、ガスクロマトグラフィーを用いて、Suganoらの方法（Sugano M, Ryu K, Ide, T. Cholesterol dynamics in rats fed cis- and trans- octadecenoate in the form of triglyceride. J. Lipid Res. 25: 474-485, 1984）に従って次のようにして行った。
ラットから採取した糞便は凍結乾燥した後、エタノールを加えてホモジナイズを行った。糞中の胆汁酸は、エタノールで２回処理して抽出した。胆汁酸のアルカリ加水分解は１１０℃で１８時間行い、その後、１２０℃で１時間加熱した。加熱後、塩酸でｐＨ１に酸性化し、５ｍｌのジエチルエーテル処理を２回行い、胆汁酸を抽出した。抽出した胆汁酸は、アルカリ加水分解後に塩酸でｐＨ１まで低下させ、エチルエーテルで胆汁酸を抽出した。得られた胆汁酸のメチル化、およびトリメチルシリル誘導体への変換は、市販の誘導体化試薬（GL Science）を用いて行った。
前記したガスクロマトグラフィーによる糞中の胆汁酸の分析は、GL Science GC-380を用いて行った。測定条件として、TC-1 column（３０ｍ×０．２５ｍｍ）を用い、温度を２５０℃から２９０℃まで上昇させて分析を行った。なお、試料の抽出の段階から、一定量のノルデオキシコール酸を加え、内部標準とした。胆汁酸量は、ガスクロマトグラフィー分析を行った結果を基に、コール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、およびヒオデオキシコール酸の濃度値を求めた。
【００７３】
（１１）統計処理方法
実験により得られた各群のデータは、平均±標準誤差で示し、一元配置の分散分析を行った後、各群の有意差の判定はFisher’s multiple - range testを用いて行った（Ｐ＜０．０５）。
【００７４】
[結果]
ごぼう由来抽出物を含有する飲料であるごぼう抽出液の摂取による腸内環境に及ぼす影響は次のようになった。
（１）体重、食餌摂取量、飲水量、肝臓重量
下記表３に最終体重、飲水量、食餌摂取量、および肝臓重量を示した。
表３に示すように、最終体重（Final body wt (g)）、飲水量（Drinking water (ml/3d)）、食餌摂取量（Food intake (g/3 wk)）、肝臓重量（Liver wt (g)、Liver wt (%)）は、各群間で有意な差はみられなかった（ｐ＞０．０５）。また、肝臓重量の体重比においても各群間で差はみられなかった（ｐ＞０．０５）。
【００７５】
【表３】
【００７６】
ここで、図１は、表３に記載した各群間における最終体重（Final body wt (g)）を示すグラフである。図１のグラフからも分かるように、最終体重は各群間で有意な差はみられなかった。
【００７７】
（２）血清中のグルコース、血清、および肝臓中の脂質
下記表４に血清中のグルコース、血清、および肝臓中の脂質濃度を示した。表４に示すように、血清中のトリグリセリド（Serum triglyceride (mg/100 ml)）、コレステロール（Serum cholesterol (mg/100 ml)）、グルコース（Serum glucose (mg/100 ml)）、肝臓中のトリグリセリド（Liver triglyceride (mg/g)）、およびコレステロール（Liver cholesterol (mg/g)）において、各群間で有意差はみられなかった（ｐ＞０．０５）。
【００７８】
【表４】
【００７９】
（３）盲腸内容物の有機酸濃度、および糞中パラメーター
下記表５に盲腸内容物の有機酸濃度、および下記表６に糞中パラメーターを示した。
表５に示すように、盲腸内容物である盲腸内有機酸量（μmol / cecum contents）は、酢酸（Acetic acid）が若干増加したが、その他の有機酸については大きな変化はみられなかった。
また、表６に示すように、糞の重量（Fecal wet wt (g/3 d)、Fecal dry wt (g/3 d)）、糞中の水分（Fecal water (%)）において、各群間で有意差はみられなかった（ｐ＞０．０５）。糞中のＩｇＡ量（Fecal IgA (μg/g dry feces)、Fecal IgA (mg/3 d)）については、３日間の総排泄量で表すと、ごぼう抽出液群（Burdock extraction liquid）の摂取群はコントロール群（Control）と比較して、１７４％の顕著な増加がみられた（ｐ＜０．０５）。ただし、ごぼうポリフェノール群（Burdock polyphenols）では、増加はみられなかった。また、ごぼう抽出液の摂取群で糞中のムチン量（Fecal Mucin (μg/g dry feces)、Fecal Mucin (mg/3 d)）も６８％の有意な増加がみられた（ｐ＜０．０５）。
【００８０】
【表５】
【００８１】
ここで、図２（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、表６に示した糞中パラメーターのうち、各群間における糞の重量（Fecal wet wt (g/3 d)）、糞中の水分（Fecal water (%)）、糞中のＩｇＡ量（Fecal IgA (mg/3 d)）、および糞中のムチン量（Fecal Mucin (mg/3 d)）をグラフ化したものである。
図２の（ａ）および（ｂ）のグラフから、表６に示すとおり、糞の重量および糞中の水分については各群間で有意な差はみられないことが分かる。一方で、図２の（ｃ）および（ｄ）のグラフから、表６に示すとおり、ごぼう抽出液群における糞中のＩｇＡ量および糞中のムチン量が有意に増加することが分かる。
【００８２】
【表６】
【００８３】
（４）盲腸内容物のミクロフローラ
下記表７に盲腸内容物のミクロフローラ（腸内細菌）の分布を示した。表７に示すように、ごぼう抽出液群（Burdock extraction liquid）のBifidobacteriumが増加傾向（Ｐ＝０．１３）を示した。他の腸内細菌叢には変動はみられなかった（ｐ＞０．０５）。
【００８４】
【表７】
【００８５】
（５）糞中胆汁酸組成分析
下記表８に糞中胆汁酸組成を分析した結果を示した。表８に示すように、二次胆汁酸であるリトコール酸（Lithocholic acid）は著しく低下していた（ｐ＜０．０５）。もう一つの二次胆汁酸であるデオキシコール酸（Deoxycholic acid）については各群間で有意差はみられないが（ｐ＞０．０５）、減少する傾向にあった。一次胆汁酸であるコール酸（Cholic acid）については、各群間で有意差はみられないが（ｐ＞０．０５）、増加する傾向にあった。また、ヒオデオキシコール酸（Hyodeoxycholic acid）についても各群間で有意差はみられないが（ｐ＞０．０５）、減少する傾向にあった。３日間の総排泄量で表しても同様の結果であった（データ未掲載）。
【００８６】
【表８】
【００８７】
ここで、図３（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、表８に示した糞中胆汁酸組成のうち、各群間におけるリトコール酸（Lithocholic acid）量（μmol/g）、デオキシコール酸（Deoxycholic acid）量（μmol/g）、ヒオデオキシコール酸（Hyodeoxycholic acid）量（μmol/g）、およびコール酸（Cholic acid）量（μmol/g）をグラフ化したものである。
図３の（ａ）のグラフおよび表８に示すとおり、ごぼう抽出液群における糞中のリトコール酸量が著しく減少していることが分かる。また、図３の（ｃ）のグラフおよび表８に示すとおり、ごぼう抽出液群における糞中のヒオデオキシコール酸量が減少する傾向にあることが分かる。一方で、図３の（ｂ）および（ｄ）のグラフからは、表８に示すとおり、ごぼう抽出液群における糞中のデオキシコール酸量およびコール酸量は有意に減少しないことが分かる。
【００８８】
［考察］
前記結果から、ごぼう由来抽出物を含有する飲料であるごぼう抽出液（ごぼう茶）の摂取による腸内環境に及ぼす影響について次のように考察される。
【００８９】
腸管における免疫反応（腸管免疫）は、病原菌やウィルスをはじめとする外敵から身を守る防御機構の最前線として機能している。その防御因子の一部がＩｇＡであり、その量は腸管免疫の代表的な指標とされている。
【００９０】
前記［結果］の（３）に記載したように、ごぼう抽出液群の糞中へのＩｇＡおよびムチンの排泄が著しく増加していることが明らかとなった。このことは、ごぼう由来抽出物（ごぼう抽出液）の機能性として生物的なバリアー機能（腸管免疫）や物理的なバリアー機能を改善できることを示唆している。
【００９１】
さらに、大腸がんの危険因子とされる二次胆汁酸について、前記［結果］の（５）に記載したように、糞中のリトコール酸を有意に減少させていることから、大腸がんを予防する可能性が示唆される。
【００９２】
生体が外界と接する境面である皮膚および粘膜、特に、腸管粘膜などの消化管粘膜は、ウィルス、細菌、寄生虫、病原性抗原、食物抗原などの多くの物質と接触している。哺乳動物は、これら異物の体内への侵入を防止するために、粘膜面に腸管粘膜免疫システムを有し、生体を防御している。粘膜面に分泌型ＩｇＡの産生を誘導し、粘膜免疫システムを増強させることができれば、抗原の侵入を抑制することができ、粘膜免疫機能の低下に起因して起こる感染症や炎症性腸疾患、あるいはアレルギー疾患など様々な疾患を予防することができると解される。
【００９３】
ＩｇＡ分泌を増加させる食餌因子としては、動物実験ではレジスタントスターチ、幼児に対してはガラクトオリゴ糖やフラクトオリゴ糖、培養細胞実験ではビタミンＡが知られているが、ポリフェノールの一種であるクルクミンによる増加も広島大学の研究グループによって報告されている（Okazaki Y, Han Y, Kayahara M, Watanabe T, Arishige H, Kato N. Consumption of Curcumin Elevates Fecal Immunoglobulin A, an Index of Intestinal Immune Function, in Rats Fed a High-Fat Diet. J Nutr Sci Viyaminol (in press), 2010）。イヌリンやオリゴ糖は糞中への分泌型ＩｇＡの増加を促進し、腸管免疫やバリアー機能を改善し、大腸腫瘍を改善することが報告されている（Petra AMJ S, Philippe A, Marc R, Martine S, Alles H K, Guenther B, Leon MJ K, Jan K, Yvan V. Fecal secretory Immunoglobulin A is increased in healthy infants who receive a formula with short-chain galacto-oligosaccharides and long-chain fructo-oligosaccharides. J. Nutr. 138: 1141-1147, 2008、Stephanie S, Bernhard W. Inulin and oligofructose: Review of experimental data on immune modulation. J. Nutr. 137: 2563S-2567S, 2007、Sandra JM Ten Bruggencate, Ingeborg MJ Bovee-Oudenhoven, Mischa LG Lettink-Wissink, Martijn B Katan, Roelof van der Meer. Dietary fructooligosacch-arides affect intestinal barrier function in healthy men. J. Nutr. 136: 70-74, 2006、Fabrice P, Pascale P, Mactine C, Francis B, Khaled M, Jean M. Short-Chain Fructo-oligosaccharides Reduce the Occurrence of Colon Tumors and Develop Gut-associated Lymphoid Tissue in Min Mice. Cancer Research. 57: 225-228, 1997、Yoshida N, Sato W, Hate S, Takeda Y, Onodera S, Ando K, Shiomi N. Effect of 1-kestose and nystose on the intestinal microorganisms and immune system in mice. J. Appl. Glycosci. 53: 175-180, 2006、Monika Roller, Gerhard Rechkemmer, Bernhard Watzl. Prebiotic Inulin Enriched withOligofructose in Combination with the Probiotics Lactobacillus rhamnosus and Bifidobacterium lactis Modulates Intestinal Immune Functions in Rats1. J. Nutr. 134: 153-156, 2004）。
【００９４】
ここで、前記［結果］の（３）に記載したように、ごぼうポリフェノール群（Burdock polyphenols）では糞中のＩｇＡ量が増加しなかったため、ごぼうのポリフェノールによりＩｇＡの分泌が増加するという可能性は否定されたと解される。
一方で、本発明の要件を満たす抽出方法によって抽出して得たごぼう抽出液は、分泌型ＩｇＡの増加促進が確認された。かかるごぼう抽出液の成分分析（（株）あじかん）の結果から、ポリフェノール以外にもオリゴ糖やイヌリンが多量に含まれていることがわかっている（前記表１参照）。そのため、前記知見にもあるように、かかるごぼう抽出液における分泌型ＩｇＡの増加促進効果は、オリゴ糖やイヌリンなどのポリフェノール以外の抽出物が作用している可能性が高いと解される。そして、前記したごぼう抽出液は、分泌型ＩｇＡの増加促進効果を有するため、腸管免疫やバリアー機能の改善、大腸腫瘍の改善といった効果を奏する可能性がある。
【００９５】
イヌリンの摂取は、ハムスターの糞中の二次胆汁酸と一次胆汁酸の割合を減少させることが報告されており（Elke A, Trautwein, Dorte Rieckhoff, Helmut F Erbersdobler. Dietary Inulin Lowers Plasma Cholesterol and Triacylglycerol and Alters Biliary Bile Acid Profile in Hamsters. J. Nutr. 128: 1937-1943, 1998）、また、オリゴ糖は、糞中の二次胆汁酸のデオキシコール酸を減少させることも報告されている（Sung H, Choi Y, Cho S, Yun J. Fructooligosaccharides alter profiles of fecal short-chain fatty acids and bile acids in rats. Food. Sci. Biotechnol. 15: 51-56, 2006）。従って、ごぼう抽出液のイヌリンやオリゴ糖によりリトコール酸が減少した可能性もある。
【００９６】
そして、前記［結果］の（１）、（２）に記載したように、最終体重、飲水量、食餌摂取量、肝臓重量、血清中のグルコース、血清および肝臓中の脂質濃度については、各群間で差異はみられなかったことから、本発明に係るごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出されたごぼう由来抽出物を投与した場合であっても、被投与体に対して大きな影響を与えるものではないこと、つまり、副作用などがなく安全であることが示唆された。
【００９７】
なお、＜第１実施例＞で分析した成分以外にも、ブランチング、皮むき、カット、乾燥、焙煎および熱水での抽出のうちの少なくとも１つの工程により生成し、または増加した成分であって前記した分析法によっては検出されていない成分が、ごぼう由来抽出物として含有されている可能性は十分に考えられる。そして、かかる成分によって二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進および免疫の賦活といった効果のうちの少なくとも１つの効果が奏されている可能性も十分に考えられる。
【００９８】
＜第２実施例＞
＜第２実施例＞では、ごぼう由来抽出物の抽出方法におけるごぼうのブランチングの影響について調べた。
まず、ブランチングを行わないで皮むきとカットを行なったサンプル１と、４０℃で２時間のブランチングを行った後に皮むきとカットを行なったサンプル２と、４０℃で２．５時間のブランチングを行った後に皮むきとカットを行なったサンプル３と、４０℃で３時間のブランチングを行った後に皮むきとカットを行なったサンプル４と、を用意した。
【００９９】
そして、用意したサンプル１〜４をそれぞれＴＥＳＣＯＭ社製ＴＭ２４型ミル＆ミキサーを使用して２０分間処理して微粉砕し、３．８０ｇを精秤して１００ｍＬの純粋を加え、４０℃で６０分間Bransonic Ultrasonic Cleaner model 8200を使用して超音波を付与し、サンプル１〜４に係る抽出液を得た。
【０１００】
得られたサンプル１〜４に係る抽出液を、５Ａのろ紙を用いてろ過し、ミリポアフィルターで精密ろ過してＨＰＬＣ用のサンプルを作製した。作製したＨＰＬＣ用のサンプルをＳＨＩＭＡＺＵ製Ｃ−Ｒ４Ａ型ＣＨＲＯＭＡＴＰＡＣに供して、ＨＰＬＣ法によりフルクトースの含有量を測定した。ＨＰＬＣ法の条件は、次のとおりである。
カラム：ＫＳ８０１（８０℃）
サイズ：直径φ８ｍｍ×長さ３００ｍｍ
移動相：０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、３０℃）
流量 ：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＲＩ
標準液：和光純薬社製フルクトース（濃度０．０５％、２０μＬ）
【０１０１】
前記したＨＰＬＣ法によるフルクトースの含有量の測定結果は、サンプル１が１７ｍｇ／ｇであり、サンプル２が１８ｍｇ／ｇであり、サンプル３が２０ｍｇ／ｇであり、サンプル４が２９ｍｇ／ｇであった。
したがって、ブランチングを長く行うほどフルクトースの含有量を増やすことができ、甘さを強くすることができることがわかった。また、この結果から、ブランチングの温度を高く（例えば９０℃）して行っても同様に甘さを強くすることができることが示唆された。
【０１０２】
＜第３実施例＞
＜第３実施例＞では、ごぼう由来抽出物の抽出方法におけるごぼうの乾燥温度の影響について調べた。
（１）乾燥したごぼうの水分、ポリフェノール成分の含有量および色について
＜第１実施例＞と同様の条件でブランチングと皮むきとカットとを行ったごぼうを、乾燥機を用いて下記表９に示す各条件（乾燥温度（℃）および乾燥時間（時間））で乾燥した。
そして、乾燥したごぼうについて、水分（％）およびポリフェノール成分の含有量（ｇ／１００ｇ）を分析した。なお、ポリフェノール成分の含有量は、Folin-Ciocalteu法（（＋）−カテキン当量）にて定量した。なお、Folin-Ciocalteu法は、George S, Brat P, Alter P, Amiot M-J. “Rapid Determination of Polyphenols and Vitamin C in Plant-Derived Products.” J. Agric. Food Chem., 2005, 53 (5), pp 1370-1373に従って行った。
【０１０３】
（２）味、風味について
次いで、前記乾燥したごぼうを１８０℃で１３分間焙煎した後、焙煎したごぼうを熱水に浸けてごぼう由来抽出物を抽出し、ごぼう茶（ごぼう抽出液）として得た。
そして、得られたごぼう抽出液の味、風味を評価した。
【０１０４】
表９に、ごぼうの乾燥条件（乾燥温度（℃）および乾燥時間（時間））と、乾燥したごぼうの水分（％）、ポリフェノール成分の含有量（ｇ／１００ｇ）および色と、表９に示す条件で乾燥したごぼうを焙煎した後、熱水に浸けてごぼう由来抽出物を抽出して得たごぼう抽出液の味、風味の評価と、を併せて示す。
【０１０５】
【表９】
【０１０６】
表９に示すように、３０℃未満（送風のみ）では、乾燥に時間がかかり、酸化が進むため酸味が強くなる傾向があった。また、酸化により黒っぽい褐色を呈するとともに、風味も生臭くなる傾向にあった。さらに、ポリフェノールオキシダーゼの働きを抑制することができなかったためか、ポリフェノール成分の酸化減少が見受けられた。
一方、乾燥温度が高くなるとメイラード反応によって色が黒っぽくなり、えぐみと酸味が強くなる傾向にあった。
乾燥温度は、５０℃で色、味、風味ともに優れているとともに、ポリフェノール成分の含有量が高い結果となった。
【０１０７】
以上、＜第３実施例＞の（１）、（２）を総合的に評価すると、乾燥は、短時間で行う方がよく、時間がかかるほどごぼうの酸化が進み、酸味が強くなることがわかった。また、乾燥温度が高いほど、メイラード反応が促進され、えぐみと酸味が強くなる傾向にあることがわかった。
熱風乾燥機では、時間と温度の両方を考慮した場合、５０℃で５〜６時間程度で行うと、ポリフェノール含有量、つまり機能の観点、および色、味、風味といった官能の観点から好ましいことがわかった。
【０１０８】
＜第４実施例＞
＜第４実施例＞では、ごぼう由来抽出物の抽出方法におけるごぼうの焙煎温度の影響について調べた。
（１）総食物繊維とクロロゲン酸
＜第１実施例＞と同様の条件でブランチングと皮むきとカットとを行ったごぼうを５０℃で乾燥した後、さらに下記表１０に示す各条件で焙煎し、焙煎したごぼうの総食物繊維とクロロゲン酸を分析した。分析は、日本食品分析センターに依頼した。なお、総食物繊維は酵素−ＨＰＬＣ法によって分析し、クロロゲン酸はＨＰＬＣ法によって分析した。
【０１０９】
【表１０】
【０１１０】
表１０に示すように、１８０℃を超え２４０℃以下で焙煎したものは、総食物繊維が６５．４ｇ／１００ｇ、クロロゲン酸が１３０ｍｇ／１００ｇであったのに対し、２４０℃を超える温度で焙煎したものは、総食物繊維が４９．０ｇ／１００ｇ、クロロゲン酸が４２ｍｇ／１００ｇであった。つまり、２４０℃を超える温度で焙煎すると、総食物繊維とクロロゲン酸は、ともに含有量が大幅に減少してしまうことがわかった。
【０１１１】
（２）ＯＲＡＣ値
カットしたごぼうを５０℃で乾燥した後、さらに下記表１１に示す各条件で８〜１５分間焙煎した。焙煎したごぼうを２．５ｇ使用して２５０ｍｌの熱水（８０〜９０℃）で３０秒間浸けてごぼう由来抽出物を抽出し、これを含有するサンプル（いわゆるごぼう茶）を得た。
かかるサンプルのＯＲＡＣ値（μｍｏｌトロロックス当量／ｍｌ）を測定した。ＯＲＡＣ値を表１１に併せて示す。
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
表１１に示すように、１７０℃を超え１８０℃以下の条件で焙煎するよりも、１８０℃を超え２２０℃以下の条件や２２０℃を超え２４０℃以下の条件で焙煎した方が、抗酸化能の指標となるＯＲＡＣ値が高かった。したがって、より高いＯＲＡＣ値を得るためには１８０℃を超え２２０℃以下の温度や２２０℃を超え２４０℃以下の温度、つまり、１８０℃を超え２４０℃以下の温度で焙煎する方が好ましいことがわかった。なお、ＯＲＡＣ値を高くする必要がない場合は、１８０℃以下の温度で焙煎してもよいことがわかった。
【０１１４】
（３）官能試験
パネリスト１２名により、前記（２）ＯＲＡＣ値と同じ条件で抽出したサンプルの官能試験を行った。
評価項目は、土臭さ、泥臭さ；甘み；苦味；香ばしさの４つとし、各評価項目について、以下の評価基準により５段階評価で採点した。
土臭さ、泥臭さは、臭い（５点）、やや臭い（４点）、並（３点）、あまり臭くない（２点）、臭くない（１点）で評価した。
甘みは、甘い（５点）、やや甘い（４点）、並（３点）、あまり甘くない（２点）、甘くない（１点）で評価した。
苦味は、苦い（５点）、やや苦い（４点）、並（３点）、あまり苦くない（２点）、苦くない（１点）で評価した。
香ばしさは、香ばしい（５点）、やや香ばしい（４点）、並（３点）、あまり香ばしくない（２点）、香ばしくない（１点）で評価した。
評価結果を下記表１２に示す。
【０１１５】
【表１２】
【０１１６】
表１２に示すように、焙煎温度が高いほどごぼうの土臭さ、泥臭さが低減する傾向があった。また、焙煎温度が高いほど甘みが低減する傾向があった。さらに、焙煎温度が高いほど苦味と香ばしさが増加する傾向があった。なお、２４０℃を超える温度で焙煎するとこげ臭と苦味が強くなり過ぎてしまい、官能面で評価が低くなった。
なお、焙煎温度が１３２℃であるごぼうについても同様に官能評価を行ったところ、香ばしさ（ロースト香）を得ることができず、ごぼうの生臭みが残ってしまい、よい評価を受けることはできなかった。
【０１１７】
以上、＜第４実施例＞の（１）〜（３）を総合的に評価すると、総食物繊維、クロロゲン酸、ＯＲＡＣ値といった機能の観点からは、１８０℃を超え２４０℃以下の温度で焙煎するのが好ましいことがわかった。また、官能の観点からは、甘みを強くしたい場合は２２０℃以下の焙煎温度とし、土臭さや泥臭さを少なくしたい場合や、苦味や香ばしさを増したい場合は、２２０℃を超え２４０℃以下の焙煎温度とするとよいことがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ごぼうから抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする製剤に関し、より具体的には、ごぼう由来抽出物の抽出方法、これにより抽出されたごぼう由来抽出物を有効成分とする二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤および免疫賦活食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の食生活は欧米化が進み、高脂肪・低食物繊維食の傾向が強くなっている。それに伴って肥満などの生活習慣病の増加が問題になっている。また、近年、このような食事の欧米化により、大腸がんや炎症性腸疾患などの大腸疾病の発症率も年々増加しており、その原因の一つとして高脂肪食が指摘されている。
【０００３】
高脂肪食を摂取すると胆汁酸の分泌量が増加し、胆汁酸が化学変化した二次胆汁酸の分泌量も増加する。図４は、一次胆汁酸から二次胆汁酸への代謝を説明するフロー図であるが、この図４を参照して大腸がんや炎症性腸疾患などの大腸疾病となる１つのモデルについて説明する。
高脂肪食を摂取すると、これを消化して吸収するために小腸に胆汁が分泌される。この胆汁に含まれる胆汁酸の一部が大腸へ移行し、図４に示すように、腸（Intestine）内の悪玉菌（Intestinal bacteria）によって二次胆汁酸（Secondary bile acids）に変換される。この二次胆汁酸には強い毒性があり、腸粘膜の炎症をもたらすことやＤＮＡに損傷を与えること、がん細胞の増殖を促進し、大腸がんや大腸炎などの疾病を引き起こすことなどが報告されている。また、二次胆汁酸の中ではリトコール酸の毒性が最も高いこと、二次胆汁酸の引き起こす影響は大腸がんだけではなく、肝がん、すい臓がん、および胆管がんの発症を促進することも報告されている。そのため、大腸疾病を予防するために、二次胆汁酸の抑制が重要であると考えられている。
【０００４】
そのような中、最近、広島大学のHanらは、クルクミン、カフェ酸、カテキン、ルチンなどのポリフェノールが大腸内の二次胆汁酸を抑制させることを明らかにし、ポリフェノールによる大腸疾病予防の可能性を指摘している（非特許文献１）。
【０００５】
また、最近、（株）あじかんの井上らはごぼうを焙煎することにより、抗酸化指標であるＯＲＡＣ（Oxygen Radical Absorbance Capacity：活性酸素吸収能力）値が増大することを報告している（非特許文献２）。この非特許文献２には、国内産ごぼうを、蒸気加熱（ブランチング）後にカットし、乾燥した後、さらに１３０〜１８０℃で焙煎を行う旨が記載されている。かかる方法によって焙煎されたごぼうのＯＲＡＣ値は、計算上、３０１００であったのに対し、生のままのごぼうのＯＲＡＣ値は２１７０、ブランチングしたのみの段階では５７８０、焙煎前の乾燥した段階では２０７００であったと報告されている。また、かかる方法によって焙煎したごぼうを用いて淹れた茶外の茶には、イヌリンやフラクトオリゴ糖などの食物繊維も含まれることが報告されている。なお、茶外の茶とは、茶の木（Camellia sinensis）の葉ではないものから作られる茶をいう。
【０００６】
大腸がんや炎症性腸疾患などの大腸疾病の原因は二次胆汁酸だけではない。ウィルス、細菌、寄生虫、病原性抗原、食物抗原などの多くの物質も原因となり得る。ヒトは、これらの物質を摂取した場合であっても、腸内における物理的なバリアー機能による腸管内への侵入防止と、腸管内に侵入された場合であっても生物的なバリアー機能による排除と、によって健康を維持している。腸内の物理的なバリアー機能にはムチンと呼ばれる糖タンパク質を主成分とする粘液が大きく関与し、生物的なバリアー機能にはＩｇＡなどの免疫機能が大きく関与している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Han Y, Haraguchi T, Iwanaga S, Tomotake H, Okazaki Y, Mineo S, Moriyama A, Inoue J, Kato N. Consumpiton of some polyphenols reduces fecal deoxycholic acid and lithocholic acid, the secondary bile acids of risk factors of colon caner. J Agric Food Chem. Vol. 57: P. 8587-8590, 2009
【非特許文献２】井上ら、日本調理科学会大会研究発表要旨集 Vol. 21: P. 1086, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進、つまり免疫の賦活は、大腸がんや炎症性腸疾患などの大腸疾病の予防や治療に大いに役立つと考えられるが、これらを食餌によりコントロールするのは容易ではないという問題がある。
【０００９】
本発明は前記問題点に鑑みてなされたものであり、二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進および免疫の賦活を行うことのできるごぼう由来抽出物を抽出するごぼう由来抽出物の抽出方法と、これにより抽出されたごぼう由来抽出物を有効成分とする二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤および免疫賦活食品とを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者は、高脂肪食条件下、ごぼうから抽出したごぼう由来抽出物を含有するごぼう抽出液をラットに摂取させ、糞中胆汁酸の分析をした結果、特定の条件で抽出したごぼう抽出液の摂取がＩｇＡやムチンを増加させ、大腸がんの危険因子であるリトコール酸（二次胆汁酸）を減少させ、前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
前記課題を解決した請求項１に記載の発明は、ごぼうをブランチングし、ブランチングした前記ごぼうの皮むきを行ない、皮むきを行った前記ごぼうをカットし、カットした前記ごぼうを３０〜７０℃で乾燥し、乾燥した前記ごぼうを１３２〜２４０℃で焙煎し、焙煎した前記ごぼうを熱水に浸けてごぼう由来抽出物を抽出することを特徴とする。
【００１２】
このように、ブランチングと皮むきとカットとを行ったごぼうに対して３０〜７０℃で乾燥を行ない、さらに、１３２〜２４０℃で焙煎を行ったごぼうを用いて熱水に浸すことにより、ごぼうに含まれている糖質、フラクトオリゴ糖を含んだ水溶性食物繊維、ポリフェノールなどの成分を、抽出物（ごぼう由来抽出物）として抽出することができる。
【００１３】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする二次胆汁酸抑制剤である。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とするＩｇＡ産生促進剤である。
【００１５】
請求項４に記載の発明は、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とするムチン産生促進剤である。
【００１６】
請求項５に記載の発明は、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする免疫賦活食品である。
【発明の効果】
【００１７】
請求項１に記載の発明によれば、ブランチングと皮むきとカットとを行った後、３０〜７０℃で乾燥し、さらに１３２〜２４０℃で焙煎し、熱水に浸すことによりごぼう由来抽出物を抽出することができる。そして、このごぼう由来抽出物により二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進および免疫の賦活を行うことができる。
【００１８】
また、請求項１に記載の発明によれば、３０〜７０℃で乾燥するため、早期にごぼう中の水分を除去することができ、その結果、ポリフェノールオキシダーゼによるポリフェノール成分の酸化減少を抑制することができる。また、乾燥温度が適切であるので、色、味、風味といった官能を優れたものとすることができる。さらに、請求項１に記載の発明によれば、１３２〜２４０℃で焙煎するので、土臭さ、泥臭さ、苦味がなく、甘さ、香ばしさに富むものとすることができる。
したがって、請求項１に記載の発明は、ブランチングと皮むきとカットとを行い、前記した条件で乾燥と焙煎を行ったごぼうを用いて茶外の茶（ごぼう茶）として淹れた場合に、二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進および免疫の賦活といった作用を奏することができるとともに、ごぼう茶として飲食したときに味、風味、色、などの官能に優れたものとすることができる。
【００１９】
請求項２に記載の発明によれば、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分として含んでいるので、二次胆汁酸を抑制することができる。
【００２０】
請求項３に記載の発明によれば、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分として含んでいるので、ＩｇＡの産生を促進させることができる。
【００２１】
請求項４に記載の発明によれば、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分として含んでいるので、ムチンの産生を促進させることができる。
【００２２】
請求項５に記載の発明によれば、請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分として含んでいるので、免疫を賦活することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】表３に記載した各群間における最終体重（Final body wt (g)）を示すグラフである。
【図２】（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、表６に示した糞中パラメーターのうち、各群間における糞の重量（Fecal wet wt (g/3 d)）、糞中の水分（Fecal water (%)）、糞中のＩｇＡ量（Fecal IgA (mg/3 d)）、および糞中のムチン量（Fecal Mucin (mg/3 d)）をグラフ化したものである。
【図３】（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、表８に示した糞中胆汁酸組成のうち、各群間におけるリトコール酸（Lithocholic acid）量（μmol/g）、デオキシコール酸（Deoxycholic acid）量（μmol/g）、ヒオデオキシコール酸（Hyodeoxycholic acid）量（μmol/g）、およびコール酸（Cholic acid）量（μmol/g）をグラフ化したものである。
【図４】一次胆汁酸から二次胆汁酸への代謝を説明するフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の一実施形態に係るごぼう由来抽出物の抽出方法、二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤および免疫賦活食品について詳細に説明する。
【００２５】
本発明の一実施形態に係るごぼう由来抽出物の抽出方法は、ごぼうをブランチングし、ブランチングした前記ごぼうの皮むきを行ない、皮むきを行った前記ごぼうをカットし、カットした前記ごぼうを３０〜７０℃で乾燥し、乾燥した前記ごぼうを１３２〜２４０℃で焙煎し、焙煎した前記ごぼうを熱水に浸けてごぼう由来抽出物、つまり、ごぼう由来の抽出成分を抽出するものである。
【００２６】
ブランチングは、ごぼうに含まれる多糖類を分解し、フルクトースやイヌリン、フラクトオリゴ糖などを得るために行うものである。
ブランチングは、蒸すことにより行うことができるがこれに限定されるものではない。例えば、焙焼、湯浴、焙煎、温蔵庫や蒸し庫で加熱することなどによっても行うことができる。
また、ブランチングの処理温度および処理時間は、甘みの強弱など消費者の嗜好に合わせて任意に設定することができる。
【００２７】
例えば、ブランチングの処理温度を３５℃とした場合は処理時間を１８０分間などとし、ブランチングの処理温度を９５℃とした場合は処理時間を５分間などとすることができる。
ブランチングの処理温度が低く、処理時間を短くすると、多糖類の分解があまり行われないため、フルクトースの生成量が少なくなり、甘みが弱くなる。一方、ブランチングの処理温度が高く、処理時間が長くなると、多糖類の分解が多く行われるため、フルクトースの生成量が多くなり、甘みが強くなる。
なお、ブランチングの処理温度と処理時間は、処理量と設備によっても異なるが、大型の蒸し庫であれば処理温度を４０〜９０℃とするのが好ましく、７５〜９０℃とするのがより好ましい。処理時間は１０〜１８０分間とするのが好ましい。
【００２８】
ごぼうの皮むきおよびカットは、ごぼうの乾燥と焙煎を行い易くするとともに、熱水による抽出を容易とするために必要な工程である。
ごぼうの皮むきおよびカットは、市販の自動野菜加工機、例えば、ごぼう皮むき機や電動ごぼう切り機などで行うことができる。ごぼうの皮むきは、ごぼうの外皮を除去できればよく、ごぼうのカットは、薄切り、輪切り、半月切り、いちょう切り、短冊切り、斜め切り、ささがきなどとすることができればよい。これらはもちろん、作業員の手によって行うこともできる。
【００２９】
次いで行うごぼうの乾燥は、ポリフェノールオキシダーゼによるポリフェノール成分の酸化減少を抑制し、ＯＲＡＣ値を高く維持するためと、色、味、風味といった官能を優れたものにするために行うものである。
ごぼうの乾燥は、前記したように３０〜７０℃で行う。乾燥は、天日干し、熱風乾燥など適宜の方法により行うことができる。ここで、乾燥温度が３０℃未満であると、乾燥が不十分となるおそれがあり、ごぼうに含まれるポリフェノールオキシダーゼによるポリフェノール成分の酸化減少が促進するので好ましくない。また、黒っぽい褐色を呈し、酸味が強く、風味は生臭くなるため、官能の点で好ましくない。一方、乾燥温度が７０℃を超えると乾燥し過ぎてしまい、メイラード反応が促進して黒っぽい褐色を呈し、えぐみと酸味が強くなる傾向にあり、官能の点で好ましくない。また、ポリフェノール成分の酸化による減少が促進されるので好ましくない。なお、乾燥温度は４０〜６０℃とするのがより好ましく、５０℃程度とすると明るい褐色を呈し、甘みおよび香りもよく、ポリフェノール成分の含有量が高くなるのでさらに好ましい。
【００３０】
乾燥時間は、前記した温度範囲であれば、例えば、３０分間から８時間、より好ましくは５〜６時間行えばよいが、所望の効果を奏するようにごぼうを乾燥することができれば特にこれに限定されるものではない。ただし、時間がかかるほどごぼうの酸化が進み、酸味が強くなる傾向にあるため、なるべく短時間で行った方がよい。
【００３１】
なお、ごぼうの乾燥は、水分率が２〜１５％になるまで行うのがよい。水分率がこの範囲にあればポリフェノールオキシダーゼによるポリフェノール成分の酸化減少を抑制することや、ＯＲＡＣ値を高く維持すること、色、味、風味といった官能を優れたものとすることが可能である。一方、水分率が１５％を超えると、乾燥が不十分となるおそれがあり、ごぼうに含まれるポリフェノールオキシダーゼによるポリフェノール成分の酸化減少が促進するので好ましくない。また、色は黒っぽい褐色を呈し、酸味が強く、風味は生臭くなるため、官能の点で好ましくない。
【００３２】
次いで行うごぼうの焙煎は、土臭さ、泥臭さ、甘さ、苦味、香ばしさなどの官能を優れたものとするために行うものである。つまり、土臭さ、泥臭さ、苦味がなく、甘さ、香ばしさに富むものとするために行うものである。
ごぼうの焙煎は、前記したように１３２〜２４０℃で行う。焙煎は、例えばガス式焙煎機（ニチモウ（株）製ＲＣ−１）などにより行うことができる。ここで、焙煎温度が１３２℃未満であると、焙煎が不十分となり、焙煎香（ロースト香）が得られず、ごぼうの生臭み（土臭さ、泥臭さ）が残ってしまうので好ましくない。一方、焙煎温度が２４０℃を超えると乾燥し過ぎてしまい、コゲ臭の発生と、炭化が進むため苦味が強くなり過ぎてしまう。また、クロロゲン酸などのポリフェノール成分や総食物繊維、オリゴ糖などが高温により減少するので好ましくない。なお、ＯＲＡＣ値を高く維持する点および官能の点から、焙煎温度は１８０℃を超え２４０℃以下とするのがより好ましい。
【００３３】
焙煎時間は、前記した温度範囲であれば、５〜１５分間程度行えばよいが、所望の効果を奏するようにごぼうを焙煎することができれば特にこれに限定されるものではない。なお、ごぼうの焙煎は、香り、風味がより増強され、水分が５％以下となればよい。
【００３４】
次いで行う熱水によるごぼう由来抽出物の抽出は、例えば、８５〜９５℃の熱水を用いて行うことができる。抽出時間は、５〜１０分間程度とすることができるが、適宜にこれよりも長くしたり、短くしたりしてもよい。
【００３５】
このようにして抽出されるごぼう由来抽出物としては、例えば、果糖、ブドウ糖、ショ糖などの糖質、アルギニンなどのアミノ酸、１−ケストース、ニストース、フラクトフラノシルニストースなどのフラクトオリゴ糖、食物繊維（イヌリン、オリゴ糖、リグナン）などが挙げられる。また、カフェ酸、クエルセチン、リグナンなどのポリフェノールおよびこれらの誘導体も含有され得る。なお、カフェ酸の誘導体としては、例えば、クロロゲン酸、ネオクロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、イソクロロゲン酸、トリカフェオイルキナ酸、ロスマリン酸などを挙げることができる。クエルセチンの誘導体は、配糖体としてクエルシトリン、イソクエルシトリン、クエルシメリトリン、アビクラリン、ヒペリン、レイノウトリン、クエルシツロン、ルチン等がある。リグナンの誘導体は、アルクチゲニンやジアルクチゲニン、アルクチイン、lappaol A〜F、isolappaol Cなどがある。
なお、前記したもの以外にも、ブランチング、皮むき、カット、乾燥、焙煎および熱水での抽出のうちの少なくとも１つの工程により生成し、または増加した成分がごぼう由来抽出物として含有され、かかる成分により二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進、免疫の賦活といった効果を奏している可能性もある。
【００３６】
ごぼう由来抽出物は熱水にて抽出した後、必要に応じて当該熱水をろ紙やろ過フィルターなどを用いてろ過してもよい。このようにすれば、ごぼう由来抽出物を含有し、かつ濁りがなく清らかな溶液を得ることができる。さらに、熱水にて抽出したごぼう由来抽出物は、ろ過しないまま、または、ろ過した後に、加温したり、乾燥条件下や減圧条件下においたりして水分を除去し、固形物や粉末物、結晶物などとしてもよい。
【００３７】
このようにして熱水中に抽出されたごぼう由来抽出物は、後記する［実施例］で説明するように、二次胆汁酸の産生を抑制する効果と、ムチンの産生を促進する効果とを有するとともにＩｇＡの産生を促進する効果を有している。そのため、免疫を賦活化する効果を有しているといえる。
したがって、前記した抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする薬剤や機能性飲食料品は、前記した効果を奏することが期待できる。
【００３８】
このような薬剤としては、二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤、免疫賦活剤を挙げることができる。これらの薬剤は、前記した抽出方法でごぼう由来抽出物を抽出した熱水を必要に応じてろ過や乾燥等した後、適宜の形態に製剤し、任意の投与形態で投与することができる。投与形態としては、経口、経腸、経粘膜、注射などが挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などが挙げられる。非経口投与としては、静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
【００３９】
また、かかる薬剤では、二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤、若しくは免疫賦活剤を単独で、または他の薬学的に許容される担体と組み合わせて使用することができる。かかる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤などが挙げられる。
【００４０】
前記した機能性飲食料品としては、二次胆汁酸抑食品、ＩｇＡ産生促進食品、ムチン産生促進食品、免疫賦活食品を挙げることができる。機能性飲食料品は、飲料品（機能性飲料品）であってもよく、また、食料品（機能性食料品）であってもよい。飲料品としては、前記した抽出方法でごぼう由来抽出物を抽出した熱水（ごぼう抽出液）をそのまま飲用するごぼう茶や、かかる熱水を必要に応じてろ過等し、ボトリングしたペットボトル飲料、缶飲料、あるいはスープなどを挙げることができる。また、食料品としては、前記した抽出方法でごぼう由来抽出物を抽出した熱水をそのまま、あるいは必要に応じて乾燥等して得た固形物や粉末物とした上で混合したパン、菓子、惣菜などを挙げることができる。
【実施例】
【００４１】
次に、本発明のごぼう由来抽出物の抽出方法、二次胆汁酸抑制剤、ＩｇＡ産生促進剤、ムチン産生促進剤および免疫賦活食品について実施例を示して具体的に説明する。
【００４２】
＜第１実施例＞
［ごぼう由来抽出物の抽出］
ごぼう由来抽出物を抽出して実験動物に投与するため、当該ごぼう由来抽出物を含有する飲料としてごぼう抽出液を製造した。
ごぼう抽出液は、ごぼうを水洗いした後、５０℃で１５分間のブランチングを行い、ごぼうを水冷した後、皮むきとカット（２ｍｍ×２ｍｍ×２０ｍｍ）を行った。次いで、カットしたごぼうを熱風乾燥機にて５０℃で８時間熱風乾燥し、１８０℃で１３分間焙煎した。
そして焙煎したごぼうを、２．８％（ｗ／ｖ）の濃度で、９０℃、１０分間の熱水抽出を行い、ろ過したものを供試サンプルとした。
【００４３】
製造したごぼう抽出液の食物繊維およびフラクトオリゴ糖の成分分析を行った。食物繊維の成分分析は日本食品分析センターに依頼し、酵素−ＨＰＬＣ法にて分析してもらった。フラクトオリゴ糖については、ＨＰＬＣ法により、１−ケストース（ＧＦ２）、ニストース（ＧＦ３）、フラクトフラノシルニストース（ＧＦ４）について分析した。製造したごぼう抽出液の食物繊維およびフラクトオリゴ糖の成分の分析結果を下記表１に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
表１に示すとおり、製造したごぼう抽出液は、１００ｍｌ当たり１．３ｇの食物繊維を含み、フラクトオリゴ糖である１−ケストース、ニストース、フラクトフラノシルニストースを含有していた。また、総ポリフェノール量がクロロゲン酸当量で１００ｍｌ当たり０．１５７ｇ含んでいた。
【００４６】
［動物飼育］
実験動物としてＳＤ（Sprague-Dawley）系雄ラット（３週齢、初体重４０−５０ｇ、Charles River Japan Inc.社製）を用いた。実験動物の飼育は、広島大学の実験動物取扱規程に準じて行った。具体的には、ステンレス製ケージに１匹ずつ入れ、１２時間明暗交代（８：００〜２０：００明、２０：００〜翌朝８：００暗）の恒温環境（２４℃±１℃）で飼育した。予備飼育期間は７日間とし、市販の固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母社製）、および脱イオン水を自由に摂取させた。予備飼育後、ラットは３群（８匹／１群）に分け、３０％牛脂の高脂肪食の条件下で一定量の制限食（下記表２参照）とし、脱イオン水、ごぼう抽出液、およびごぼうからのポリフェノール抽出物（以下、「ごぼうポリフェノール」と略）（ごぼう抽出液相当量：０．１５７％）を自由に摂取させて、２１日間飼育した。実験食は、１日目に９ｇ、２−４日目に１０ｇ、５−７日目に１２ｇ、８−１３日目に１４ｇ、および１４−２１日目に１５ｇを毎日定刻（１９：００）にラットに与えた。いずれも翌朝までに食べきる量を与えた。体重は毎朝定刻（１０：００）に測った。飼育最後の３日間に糞を採取した。糞の湿重量を測定し、１２時間凍結乾燥後、乳鉢を用いて磨り潰した。乾燥糞は、−３０℃で冷凍保存し、糞中ＩｇＡおよび糞中ムチンの分析を行った。
飼育終了日の午前（８：００）に餌を抜き取り、１２時頃に体重を測り、午後（１３：００〜１５：００）にジエチルエーテル麻酔下で断頭屠殺を行い、血液、肝臓、および盲腸内容物を速やかに採取した。盲腸内容物の一部からは、ＤＮＡ抽出を行った。血液は採取後、氷の中で２〜３時間放置した後に４℃で２０００×ｇ、２０分間遠心分離し、得られた血清を−８０℃で冷凍保存した。
【００４７】
【表２】
【００４８】
［分析方法］
（１）糞中ＩｇＡ測定方法
糞中ＩｇＡの測定は、Sharmaらの方法（Sharma A, Honma K, Evans RT, Hruby DE, Genco RJ. Oral Immunization with Recombinant Streptococcus gordoni Expressing Porphyromonas gingivalis FimA Domains. Infection and Immunity. 69: 2928-2934, 2001）に従って以下のようにして行った。
【００４９】
（ＩｇＡの抽出）
乾燥糞（０．１ｇ）に４０倍量のトリプシンインヒビター（０．１ｍｇ／ｍｌ、大豆由来、和光純薬社製）、ＥＤＴＡ（５０ｍＭ）、フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ、１ｍＭ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）を加えた。試験管ミキサーで１分間攪拌後、４℃で一晩静置した。その後、４℃、９０００×ｇで１０分遠心分離し、上清を回収し、ＩｇＡ測定用サンプルとした。得られたサンプルは、測定まで−３０℃で冷凍保存した。
【００５０】
（ＩｇＡ量の測定）
ＩｇＡ量の測定は、Rat IgA ELISA Quantitation Kit（BETHYL社製）を用いたＥＬＩＳＡ法によって行った。抗原としてヤギ抗ラットＩｇＡ抗体を使用し、０．０５Ｍ 炭酸カルシウム緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｌ抗原原液／０．１ｍｌ濃度となるように希釈した。この希釈溶液を９６穴プレートの各ウェルに１００μｌ入れ、４℃で一晩静置させて抗原処理を行った。翌日、各ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で３回洗浄し、各ウェルに、１％ＢＳＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、０．１４Ｍ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ８．０）２００μｌを加え、マイクロプレートミキサーで攪拌後、室温（２０℃−２５℃）で３０分間ブロッキングした。サンプルまたはラットＩｇＡ抗体の標準液を、希釈液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液−０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で希釈した。各ウェルを洗浄液で３回洗浄後、サンプルおよびラットＩｇＡ抗体の標準品１００μｌを加え、マイクロプレートミキサーで攪拌後、室温（２０〜２５℃）で１時間インキュベートした。各ウェルを洗浄液で５回洗浄後、２次抗体として、希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ラットＩｇＡ抗体液を１００μｌ加え、マイクロプレートミキサーで攪拌後、室温（２０〜２５℃）で１時間インキュベートした。各ウェルを洗浄液で５回洗浄後、０．４ｍｇ／ｍｌ濃度のＯＰＤ（和光純薬社製）と０．０２６％Ｈ2Ｏ2を含む０．１Ｍ クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えアルミホイルで遮光しながら室温（２０〜２５℃）で１５分間反応させた。反応後、２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を１００μｌ加えて反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定した。
【００５１】
（２）糞中ムチン測定方法
（糞中ムチンの抽出その加水分解）
糞中ムチンの抽出はBovee-Oudenhovenらの方法（Bovee-Oudenhoven IM, Termont DS, Heidt PJ, Van der Meer R. Increasing the intestinal resistance of rats to the invasive pathogen Salmonella enteritidis: additive effects of dietary lactulose and calcium. Gut. 40: 497-504, 1997）に従って次のように行った。
【００５２】
乾燥糞０．１０ｇをマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に採取し、１．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水を加え、試験管ミキサーで１分間攪拌した。その後、腸内細菌のグリコシダーゼを失活させるため９５℃で１０分加温し、ムチンを可溶化させるため、さらに３７℃で９０分間インキュベーションした。インキュベーション後、４℃、２００００×ｇで１５分間遠心分離し、上澄み０．２ｍｌをマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に採取し、０．４Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．７５）を上澄みと同容量加えた。さらに１０μｌのアミログルコシダーゼ液（Sigma社製）を加え、５０℃で２０分間インキュベーションし、可溶性デンプンを完全に加水分解した。その後、混合物を冷却し、６０％（ｖ／ｖ）の氷冷エタノール液を加え、−３０℃で一晩放置した。放置後、４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離し、沈殿物を約２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水に溶かし、ムチン測定用サンプルとした。
【００５３】
糞中ムチンの測定は、Crowtherらの方法（Crowther RS, Wetmore RF. Fluorimetric assay of o-linked glycoproteins by reaction with 2-cyanoacetamide. Anal Biochem. 163: 170-174, 1987）に従って次のように行った。
【００５４】
ムチン測定用サンプルを１００μｌ採取し、１２０μｌの０．６Ｍ ＣＮＡ：０．１５Ｍ ＮａＯＨ（１：５，ｖ／ｖ）混合溶液を加え、１００℃で３０分間インキュベーションした。その後、０．６Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１ｍｌ加え、溶液を室温まで冷却し、島津分光光度計（励起波長３３６ｎｍ、測定波長３８３ｎｍ）を用いてムチンを定量した。糞中ムチンは、この操作過程でムチンから遊離したＯ−結合性オリゴ糖の量として定量し、標準溶液にはＮ−アセチルガラクトサミンを用いた。
【００５５】
（３）腸内細菌の遺伝子解析
腸内細菌の遺伝子解析は、Ｔ−ＲＦＬＰ（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism）法（Liu W-T, Marsh T, Cheng H, Forney LJ. Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 63: 4516-4522, 1997））により行った。
なお、Ｔ−ＲＦＬＰ法とは、末端を蛍光標識したプライマーセットで鋳型ＤＮＡをＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）にて増幅し、制限酵素による消化後、フラグメント解析を行い、塩基配列の違いから制限酵素切断部位が異なることを利用し、検出ピークの強度、位置、数により評価・比較する断片多型性解析である。
【００５６】
（盲腸内容物中の腸内細菌ＤＮＡの抽出）
腸内細菌叢の解析には、市販のキット（UltraCleanTM Fecal DNA Kit、Mo BIO Laboratories, Inc.社製）を用いて行った。このキットの原理は、ビーズ−フェノール法を用いて盲腸内容物のＤＮＡを抽出するものである。まず、チューブのなかにサンプルとビーズを入れて振動させてビーズがサンプルにぶつかることで物理的に細菌の細胞壁を破壊し、さらに溶菌バッファーを加えて菌体を破砕する。次に、フェノール・クロロホルム抽出による不要なタンパク質を除去し、イソプロパノール沈殿を行った後、エタノールでリンスし、ＴＥバッファーにＤＮＡを溶解させることにより、盲腸内容物サンプルからＤＮＡを抽出した。
【００５７】
（盲腸内容物中の腸内細菌１６ＳｒＤＮＡの解析）
前記したＤＮＡの抽出の操作によって得られた盲腸内容物中の腸内細菌ＤＮＡ抽出物を前記したＴ−ＲＦＬＰ法を用いて解析した。Ｔ−ＲＦＬＰ法による腸内細菌叢の解析は、細菌の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子が標的となる。まず、末端を蛍光標識した共通のプライマーを用いて盲腸内容物中のＤＮＡを増幅し、得られた１６ＳｒＤＮＡを制限酵素で消化した後、キャピラリー電気泳動法を用いたＤＮＡシークエンサーによって蛍光標識された末端を含むＤＮＡ断片（Terminal Restriction Fragment：Ｔ−ＲＦ）のみを検出する方法である。腸内フローラの構成菌種は１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が異なるため、制限酵素による切断部位は菌種固有のものとなる。これらの処理によって得られるＴ−ＲＦに対応したピークの位置（断片長）、面積（菌数）および数（菌種の多様性）を解析することで糞便中の構成菌種およびその割合を推定する方法である。本発明では、各サンプルの細菌叢に由来する１６ＳｒＤＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）部分塩基配列のＴ−ＲＦＬＰ解析を行い、得られたデータに基づいてサンプル中の主要な分類群の推定およびクラスター解析によるサンプル間の比較を行った。
【００５８】
Ｔ−ＲＦＬＰ解析の主な方法は長島らの方法およびCollinsらの方法（Nagashima K, Hisada T, Satou M, Mochizuki J. Application of New Prmer-Enzyme Combination to Terminal Restricition Fragment Length Polymorphism Profiling of Bacterial Populations in Human Feces. Appl. Environ. Micobiol. 69: 1251-1262, 2003、Nagashima K, Mochizuki J, Hisada T, Suzuti S, Shimomura K. Phylogenetic analysis of 16S ribosomal RNA gene sequences from Human fecal microbiota and improved utility of terminal restriction fragment length polymorphism profiling. Bioscience Microflora. 25: 99-107, 2006、Collins MD, Lawson PA, Willems A, Cordoba JJ, Fernandez-Garayzabal J, Garcia P, Cai J, Hippe H, Farrow JAE. The Phylogeny of the Genus Clostridium:Proposal of Five New Genera and Eleven New Species Combinations. Int. J. Syst. Bacteriol. 44: 812-826, 1994）に基づいて行った。
【００５９】
なお、フラグメント解析にはABI PRISM 3130xl DNA Sequencer（Applied Biosystem, CA, USA）およびGeneMapper（Applied Biosystems, CA, USA）を使用した。各フラグメントの長さはoperational taxonomic unit（以下ＯＵＴと省略）で判断した。クラスター解析は、解析ソフトGene Maths（Applied Biosystems, CA, USA）を使用した。クラスタリングの方法は、Pearson correlation、UPGMA（非加重結合法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean）を選択した。
【００６０】
（４）盲腸内有機酸
盲腸内容物の有機酸（コハク酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸）の分析は、ＨＰＬＣ法で測定した。
【００６１】
サンプル調製方法とＨＰＬＣ分析条件は以下のとおりである。盲腸内容物２００〜３００ｍｇを２．０ｍｌマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に精秤し、１０ｍＭ クロトン酸（１０ｍＭ ＮａＯＨに溶解）を１．０ｍｌ加え、ホモジネート攪拌混合した。
【００６２】
１５０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心分離して得られた上清を２．０ｍｌマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に分取した後、０．８ｍｌのクロロホルムを加え、３０秒間振とうした。１００００ｒｐｍ、４℃の条件で１５分間遠心分離を行い、上層５００μｌを１．５ｍｌマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に分取した。
そして、除たんぱく処理のため、１０％過塩素酸を５０μｌ添加して混合し、ＨＰＬＣ分析まで−３０℃で凍結させた。
【００６３】
ＨＰＬＣインジェクトの前に解凍し、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清をフィルター付きマイクロテストチューブ（Ultrafree-MC，エッペンドルフ社製）に採取し、０．２２μｍフィルターで遠心ろ過（５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）し、１０μｌをインジェクトした。
【００６４】
〔ＨＰＬＣ条件〕
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＣＲ−１０２Ｈ（８．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ）
ガードカラム：ＳＣＲ−１０２Ｈ
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸水溶液
流量：０．８ ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
（検出条件）
試薬：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸水溶液および１００μＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ水溶液
検出：電気伝導度検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＣＤＤ−１０Ａ）
ポンプ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ（ＬＣ−２０Ａシリーズ）
【００６５】
得られた測定値は平均値±標準誤差（ＳＥ）で表した。統計的有意性は、スチューデントのＴ検定により評価し、Ｐ＜０．０５の場合有意差有りとした。
【００６６】
（５）血清グルコース測定法
血清グルコースの定量には、市販キット（グルコースＣII−テストワコー、和光純薬社製）を用いて行った。このキットの測定方法は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）法である。試料に発色試液を作用させると、試料中のグルコースは発色試液中に含まれるムタロターゼの作用によりα型からβ形へすみやかに変換する。β−Ｄ−グルコースは、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）の作用を受けて酸化され、同時に過酸化水素を生じる。生成した過酸化水素は、共存するペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用により発色試液中のフェノールと４−アミノアンチピリンを定量的に酸化縮合させ、赤色の色素を生成させる。この赤色の色素を５０５ｎｍで比色定量し、得られた吸光度よりグルコース濃度を計算した。
【００６７】
（６）血清トリグリセライド測定法
血清トリグリセライドの定量は、市販のキット（トリグリセライドＥ−テストワコー、和光純薬社製）を用いて行った。このキットの測定方法は、３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２´−ヒドロキシ−３´−スルホプロピル）−アニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）法である。
試料中のトリグリセライドは、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）の作用によりグリセリンと脂肪酸に分解される。生成したグリセリンは、ＡＴＰの存在下でグリセロールキナーゼ（ＧＫ）の作用でグリセロール−３−リン酸になる。生成したグリセロール−３−リン酸は、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）の作用を受けて酸化され、同時に過酸化水素を生じる。生成した過酸化水素は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用によりＤＡＯＳと４−アミノアンチピリンを定量的に酸化縮合させ、青色の色素を生成させる。この青色の色素を６００ｎｍで比色定量し、得られた吸光度よりトリグリセライド濃度を計算した。
【００６８】
（７）血清コレステロール測定法
血清コレステロールの定量には、市販キット（コレステロールＥ−テストワコー、和光純薬社製）を用いて行った。このキットの測定方法は、３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２´−ハイドロキシ−３´−スルホプロピル）−アニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）法である。
試料に発色試液を作用させると、試料中のコレステロールエステル類は、コレステロールエステラーゼの作用により遊離のコレステロールと脂肪酸に分解される。生成したコレステロールは、既存の遊離型コレステロールと共にコレステロールオキシダーゼの作用を受けて酸化され、同時に過酸化水素を生じる。生成した過酸化水素は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用によりＤＡＯＳと４−アミノアンチピリンを定量的に酸化縮合させ青色の色素を生成させる。この青色の色素を６００ｎｍで比色定量し、得られた吸光度より総コレステロール濃度を計算した。
【００６９】
（８）肝臓コレステロール測定法
肝臓脂質の定量にはFolchらの方法（Folch J, Lees M, Sloane S G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226: 497-509, 1957）に従って次のようにして行った。
約１ｇの肝臓に４倍量の０．１４Ｍ 塩化カリウム溶液を加え、ポッターエルビーエム型ホモジナイザーを用いて氷冷下でホモジナイズ（２０００ｒｐｍ、３０〜６０秒）した。このホモジネート液０．５ｍｌを１５ｍｌファルコンチューブに採取し、クロロホルム：メタノール（２：１，ｖ／ｖ）混合溶液を８ｍｌの標線まで加えて４℃で一晩放置した。放置後、ろ紙を用いてろ過し、ろ液３．５ｍｌを遠心管に採取し、０．０４％塩化カルシウム溶液を０．７５ｍｌ加え、遠心（４℃、２０００×ｇ、１０分）した。上清をパスツールピペットで注意深く除去した。続いて、クロロホルム：メタノール：水（３：４８：４７，ｖ／ｖ／ｖ）混合溶液を０．７５ｍｌ加え、遠心（４℃、２０００×ｇ、１０分）した。遠心分離後、上述と同様に上清を除去し、メタノールを０．２ｍｌ加えて一層にした。そして、クロロホルム：メタノール（２：１，ｖ／ｖ）混合溶液を用いて、５ｍｌにメスアップした。これを肝臓中総コレステロール測定用として０．２ｍｌ試験管に採取し、６０℃でドライアップした。血清中の総コレステロールと同様に市販キット（コレステロール−テストワコー、和光純薬社製）を用いて測定した。
【００７０】
（９）肝臓トリグリセライド測定法
肝臓脂質の定量にはFolchらの方法（Folch J, Lees M, Sloane S G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226: 497-509, 1957）に従って次のようにして行った。
約１ｇの肝臓に４倍量の０．１４Ｍ 塩化カリウム溶液を加え、ポッターエルビーエム型ホモジナイザーを用いて氷冷下でホモジナイズ（２０００ｒｐｍ、３０〜６０秒）した。このホモジネート液０．５ｍｌを１５ｍｌファルコンチューブに採取し、クロロホルム：メタノール（２：１，ｖ／ｖ）混合溶液を８ｍｌの標線まで加えて４℃で一晩放置した。放置後、ろ紙を用いてろ過し、ろ液３．５ｍｌを遠心管に採取し、０．０４％塩化カルシウム溶液を０．７５ｍｌ加え、遠心（４℃、２０００×ｇ、１０分）した。上清をパスツールピペットで注意深く除去した。続いて、クロロホルム：メタノール：水（３：４８：４７，ｖ／ｖ／ｖ）混合溶液を０．７５ｍｌ加え、遠心（４℃、２０００×ｇ、１０分）した。遠心分離後、上述と同様に上清を除去し、メタノールを０．２ｍｌ加えて一層にした。そして、クロロホルム：メタノール（２：１，ｖ／ｖ）混合溶液を用いて、５ｍｌにメスアップした。これを肝臓中中性脂肪測定用として０．２ｍｌ試験管に採取し、６０℃でドライアップした。続いて、メタノール：トリトンｘ−１００（１：１，ｖ／ｖ）混合液６０μｌと第３ブチルアルコール９０μｌを添加した。血清中のトリグリセライドと同様に市販キット（トリグリセライドＥ−テストワコー、和光純薬社製）を用いて測定した。
【００７１】
（１０）糞中胆汁酸分析法
（糞中胆汁酸抽出法）
乾燥させた糞を乳鉢で粉末になるまで細かく砕いた後、約０．６ｇ採取し、次いで０．５％（ｗ／ｗ）となるようにクルクミンとヘスペリジンをそれぞれ添加し、混合した。次いで、９倍量の蒸留水を加えてホモジナイズを行い、一晩凍結乾燥した。凍結乾燥終了後、再び糞を乳鉢で粉砕し、サンプルとした。
【００７２】
（糞中胆汁酸組成の分析法）
糞中の胆汁酸測定は、ガスクロマトグラフィーを用いて、Suganoらの方法（Sugano M, Ryu K, Ide, T. Cholesterol dynamics in rats fed cis- and trans- octadecenoate in the form of triglyceride. J. Lipid Res. 25: 474-485, 1984）に従って次のようにして行った。
ラットから採取した糞便は凍結乾燥した後、エタノールを加えてホモジナイズを行った。糞中の胆汁酸は、エタノールで２回処理して抽出した。胆汁酸のアルカリ加水分解は１１０℃で１８時間行い、その後、１２０℃で１時間加熱した。加熱後、塩酸でｐＨ１に酸性化し、５ｍｌのジエチルエーテル処理を２回行い、胆汁酸を抽出した。抽出した胆汁酸は、アルカリ加水分解後に塩酸でｐＨ１まで低下させ、エチルエーテルで胆汁酸を抽出した。得られた胆汁酸のメチル化、およびトリメチルシリル誘導体への変換は、市販の誘導体化試薬（GL Science）を用いて行った。
前記したガスクロマトグラフィーによる糞中の胆汁酸の分析は、GL Science GC-380を用いて行った。測定条件として、TC-1 column（３０ｍ×０．２５ｍｍ）を用い、温度を２５０℃から２９０℃まで上昇させて分析を行った。なお、試料の抽出の段階から、一定量のノルデオキシコール酸を加え、内部標準とした。胆汁酸量は、ガスクロマトグラフィー分析を行った結果を基に、コール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、およびヒオデオキシコール酸の濃度値を求めた。
【００７３】
（１１）統計処理方法
実験により得られた各群のデータは、平均±標準誤差で示し、一元配置の分散分析を行った後、各群の有意差の判定はFisher’s multiple - range testを用いて行った（Ｐ＜０．０５）。
【００７４】
[結果]
ごぼう由来抽出物を含有する飲料であるごぼう抽出液の摂取による腸内環境に及ぼす影響は次のようになった。
（１）体重、食餌摂取量、飲水量、肝臓重量
下記表３に最終体重、飲水量、食餌摂取量、および肝臓重量を示した。
表３に示すように、最終体重（Final body wt (g)）、飲水量（Drinking water (ml/3d)）、食餌摂取量（Food intake (g/3 wk)）、肝臓重量（Liver wt (g)、Liver wt (%)）は、各群間で有意な差はみられなかった（ｐ＞０．０５）。また、肝臓重量の体重比においても各群間で差はみられなかった（ｐ＞０．０５）。
【００７５】
【表３】
【００７６】
ここで、図１は、表３に記載した各群間における最終体重（Final body wt (g)）を示すグラフである。図１のグラフからも分かるように、最終体重は各群間で有意な差はみられなかった。
【００７７】
（２）血清中のグルコース、血清、および肝臓中の脂質
下記表４に血清中のグルコース、血清、および肝臓中の脂質濃度を示した。表４に示すように、血清中のトリグリセリド（Serum triglyceride (mg/100 ml)）、コレステロール（Serum cholesterol (mg/100 ml)）、グルコース（Serum glucose (mg/100 ml)）、肝臓中のトリグリセリド（Liver triglyceride (mg/g)）、およびコレステロール（Liver cholesterol (mg/g)）において、各群間で有意差はみられなかった（ｐ＞０．０５）。
【００７８】
【表４】
【００７９】
（３）盲腸内容物の有機酸濃度、および糞中パラメーター
下記表５に盲腸内容物の有機酸濃度、および下記表６に糞中パラメーターを示した。
表５に示すように、盲腸内容物である盲腸内有機酸量（μmol / cecum contents）は、酢酸（Acetic acid）が若干増加したが、その他の有機酸については大きな変化はみられなかった。
また、表６に示すように、糞の重量（Fecal wet wt (g/3 d)、Fecal dry wt (g/3 d)）、糞中の水分（Fecal water (%)）において、各群間で有意差はみられなかった（ｐ＞０．０５）。糞中のＩｇＡ量（Fecal IgA (μg/g dry feces)、Fecal IgA (mg/3 d)）については、３日間の総排泄量で表すと、ごぼう抽出液群（Burdock extraction liquid）の摂取群はコントロール群（Control）と比較して、１７４％の顕著な増加がみられた（ｐ＜０．０５）。ただし、ごぼうポリフェノール群（Burdock polyphenols）では、増加はみられなかった。また、ごぼう抽出液の摂取群で糞中のムチン量（Fecal Mucin (μg/g dry feces)、Fecal Mucin (mg/3 d)）も６８％の有意な増加がみられた（ｐ＜０．０５）。
【００８０】
【表５】
【００８１】
ここで、図２（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、表６に示した糞中パラメーターのうち、各群間における糞の重量（Fecal wet wt (g/3 d)）、糞中の水分（Fecal water (%)）、糞中のＩｇＡ量（Fecal IgA (mg/3 d)）、および糞中のムチン量（Fecal Mucin (mg/3 d)）をグラフ化したものである。
図２の（ａ）および（ｂ）のグラフから、表６に示すとおり、糞の重量および糞中の水分については各群間で有意な差はみられないことが分かる。一方で、図２の（ｃ）および（ｄ）のグラフから、表６に示すとおり、ごぼう抽出液群における糞中のＩｇＡ量および糞中のムチン量が有意に増加することが分かる。
【００８２】
【表６】
【００８３】
（４）盲腸内容物のミクロフローラ
下記表７に盲腸内容物のミクロフローラ（腸内細菌）の分布を示した。表７に示すように、ごぼう抽出液群（Burdock extraction liquid）のBifidobacteriumが増加傾向（Ｐ＝０．１３）を示した。他の腸内細菌叢には変動はみられなかった（ｐ＞０．０５）。
【００８４】
【表７】
【００８５】
（５）糞中胆汁酸組成分析
下記表８に糞中胆汁酸組成を分析した結果を示した。表８に示すように、二次胆汁酸であるリトコール酸（Lithocholic acid）は著しく低下していた（ｐ＜０．０５）。もう一つの二次胆汁酸であるデオキシコール酸（Deoxycholic acid）については各群間で有意差はみられないが（ｐ＞０．０５）、減少する傾向にあった。一次胆汁酸であるコール酸（Cholic acid）については、各群間で有意差はみられないが（ｐ＞０．０５）、増加する傾向にあった。また、ヒオデオキシコール酸（Hyodeoxycholic acid）についても各群間で有意差はみられないが（ｐ＞０．０５）、減少する傾向にあった。３日間の総排泄量で表しても同様の結果であった（データ未掲載）。
【００８６】
【表８】
【００８７】
ここで、図３（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、表８に示した糞中胆汁酸組成のうち、各群間におけるリトコール酸（Lithocholic acid）量（μmol/g）、デオキシコール酸（Deoxycholic acid）量（μmol/g）、ヒオデオキシコール酸（Hyodeoxycholic acid）量（μmol/g）、およびコール酸（Cholic acid）量（μmol/g）をグラフ化したものである。
図３の（ａ）のグラフおよび表８に示すとおり、ごぼう抽出液群における糞中のリトコール酸量が著しく減少していることが分かる。また、図３の（ｃ）のグラフおよび表８に示すとおり、ごぼう抽出液群における糞中のヒオデオキシコール酸量が減少する傾向にあることが分かる。一方で、図３の（ｂ）および（ｄ）のグラフからは、表８に示すとおり、ごぼう抽出液群における糞中のデオキシコール酸量およびコール酸量は有意に減少しないことが分かる。
【００８８】
［考察］
前記結果から、ごぼう由来抽出物を含有する飲料であるごぼう抽出液（ごぼう茶）の摂取による腸内環境に及ぼす影響について次のように考察される。
【００８９】
腸管における免疫反応（腸管免疫）は、病原菌やウィルスをはじめとする外敵から身を守る防御機構の最前線として機能している。その防御因子の一部がＩｇＡであり、その量は腸管免疫の代表的な指標とされている。
【００９０】
前記［結果］の（３）に記載したように、ごぼう抽出液群の糞中へのＩｇＡおよびムチンの排泄が著しく増加していることが明らかとなった。このことは、ごぼう由来抽出物（ごぼう抽出液）の機能性として生物的なバリアー機能（腸管免疫）や物理的なバリアー機能を改善できることを示唆している。
【００９１】
さらに、大腸がんの危険因子とされる二次胆汁酸について、前記［結果］の（５）に記載したように、糞中のリトコール酸を有意に減少させていることから、大腸がんを予防する可能性が示唆される。
【００９２】
生体が外界と接する境面である皮膚および粘膜、特に、腸管粘膜などの消化管粘膜は、ウィルス、細菌、寄生虫、病原性抗原、食物抗原などの多くの物質と接触している。哺乳動物は、これら異物の体内への侵入を防止するために、粘膜面に腸管粘膜免疫システムを有し、生体を防御している。粘膜面に分泌型ＩｇＡの産生を誘導し、粘膜免疫システムを増強させることができれば、抗原の侵入を抑制することができ、粘膜免疫機能の低下に起因して起こる感染症や炎症性腸疾患、あるいはアレルギー疾患など様々な疾患を予防することができると解される。
【００９３】
ＩｇＡ分泌を増加させる食餌因子としては、動物実験ではレジスタントスターチ、幼児に対してはガラクトオリゴ糖やフラクトオリゴ糖、培養細胞実験ではビタミンＡが知られているが、ポリフェノールの一種であるクルクミンによる増加も広島大学の研究グループによって報告されている（Okazaki Y, Han Y, Kayahara M, Watanabe T, Arishige H, Kato N. Consumption of Curcumin Elevates Fecal Immunoglobulin A, an Index of Intestinal Immune Function, in Rats Fed a High-Fat Diet. J Nutr Sci Viyaminol (in press), 2010）。イヌリンやオリゴ糖は糞中への分泌型ＩｇＡの増加を促進し、腸管免疫やバリアー機能を改善し、大腸腫瘍を改善することが報告されている（Petra AMJ S, Philippe A, Marc R, Martine S, Alles H K, Guenther B, Leon MJ K, Jan K, Yvan V. Fecal secretory Immunoglobulin A is increased in healthy infants who receive a formula with short-chain galacto-oligosaccharides and long-chain fructo-oligosaccharides. J. Nutr. 138: 1141-1147, 2008、Stephanie S, Bernhard W. Inulin and oligofructose: Review of experimental data on immune modulation. J. Nutr. 137: 2563S-2567S, 2007、Sandra JM Ten Bruggencate, Ingeborg MJ Bovee-Oudenhoven, Mischa LG Lettink-Wissink, Martijn B Katan, Roelof van der Meer. Dietary fructooligosacch-arides affect intestinal barrier function in healthy men. J. Nutr. 136: 70-74, 2006、Fabrice P, Pascale P, Mactine C, Francis B, Khaled M, Jean M. Short-Chain Fructo-oligosaccharides Reduce the Occurrence of Colon Tumors and Develop Gut-associated Lymphoid Tissue in Min Mice. Cancer Research. 57: 225-228, 1997、Yoshida N, Sato W, Hate S, Takeda Y, Onodera S, Ando K, Shiomi N. Effect of 1-kestose and nystose on the intestinal microorganisms and immune system in mice. J. Appl. Glycosci. 53: 175-180, 2006、Monika Roller, Gerhard Rechkemmer, Bernhard Watzl. Prebiotic Inulin Enriched withOligofructose in Combination with the Probiotics Lactobacillus rhamnosus and Bifidobacterium lactis Modulates Intestinal Immune Functions in Rats1. J. Nutr. 134: 153-156, 2004）。
【００９４】
ここで、前記［結果］の（３）に記載したように、ごぼうポリフェノール群（Burdock polyphenols）では糞中のＩｇＡ量が増加しなかったため、ごぼうのポリフェノールによりＩｇＡの分泌が増加するという可能性は否定されたと解される。
一方で、本発明の要件を満たす抽出方法によって抽出して得たごぼう抽出液は、分泌型ＩｇＡの増加促進が確認された。かかるごぼう抽出液の成分分析（（株）あじかん）の結果から、ポリフェノール以外にもオリゴ糖やイヌリンが多量に含まれていることがわかっている（前記表１参照）。そのため、前記知見にもあるように、かかるごぼう抽出液における分泌型ＩｇＡの増加促進効果は、オリゴ糖やイヌリンなどのポリフェノール以外の抽出物が作用している可能性が高いと解される。そして、前記したごぼう抽出液は、分泌型ＩｇＡの増加促進効果を有するため、腸管免疫やバリアー機能の改善、大腸腫瘍の改善といった効果を奏する可能性がある。
【００９５】
イヌリンの摂取は、ハムスターの糞中の二次胆汁酸と一次胆汁酸の割合を減少させることが報告されており（Elke A, Trautwein, Dorte Rieckhoff, Helmut F Erbersdobler. Dietary Inulin Lowers Plasma Cholesterol and Triacylglycerol and Alters Biliary Bile Acid Profile in Hamsters. J. Nutr. 128: 1937-1943, 1998）、また、オリゴ糖は、糞中の二次胆汁酸のデオキシコール酸を減少させることも報告されている（Sung H, Choi Y, Cho S, Yun J. Fructooligosaccharides alter profiles of fecal short-chain fatty acids and bile acids in rats. Food. Sci. Biotechnol. 15: 51-56, 2006）。従って、ごぼう抽出液のイヌリンやオリゴ糖によりリトコール酸が減少した可能性もある。
【００９６】
そして、前記［結果］の（１）、（２）に記載したように、最終体重、飲水量、食餌摂取量、肝臓重量、血清中のグルコース、血清および肝臓中の脂質濃度については、各群間で差異はみられなかったことから、本発明に係るごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出されたごぼう由来抽出物を投与した場合であっても、被投与体に対して大きな影響を与えるものではないこと、つまり、副作用などがなく安全であることが示唆された。
【００９７】
なお、＜第１実施例＞で分析した成分以外にも、ブランチング、皮むき、カット、乾燥、焙煎および熱水での抽出のうちの少なくとも１つの工程により生成し、または増加した成分であって前記した分析法によっては検出されていない成分が、ごぼう由来抽出物として含有されている可能性は十分に考えられる。そして、かかる成分によって二次胆汁酸の抑制、ムチンの産生促進、ＩｇＡの産生促進および免疫の賦活といった効果のうちの少なくとも１つの効果が奏されている可能性も十分に考えられる。
【００９８】
＜第２実施例＞
＜第２実施例＞では、ごぼう由来抽出物の抽出方法におけるごぼうのブランチングの影響について調べた。
まず、ブランチングを行わないで皮むきとカットを行なったサンプル１と、４０℃で２時間のブランチングを行った後に皮むきとカットを行なったサンプル２と、４０℃で２．５時間のブランチングを行った後に皮むきとカットを行なったサンプル３と、４０℃で３時間のブランチングを行った後に皮むきとカットを行なったサンプル４と、を用意した。
【００９９】
そして、用意したサンプル１〜４をそれぞれＴＥＳＣＯＭ社製ＴＭ２４型ミル＆ミキサーを使用して２０分間処理して微粉砕し、３．８０ｇを精秤して１００ｍＬの純粋を加え、４０℃で６０分間Bransonic Ultrasonic Cleaner model 8200を使用して超音波を付与し、サンプル１〜４に係る抽出液を得た。
【０１００】
得られたサンプル１〜４に係る抽出液を、５Ａのろ紙を用いてろ過し、ミリポアフィルターで精密ろ過してＨＰＬＣ用のサンプルを作製した。作製したＨＰＬＣ用のサンプルをＳＨＩＭＡＺＵ製Ｃ−Ｒ４Ａ型ＣＨＲＯＭＡＴＰＡＣに供して、ＨＰＬＣ法によりフルクトースの含有量を測定した。ＨＰＬＣ法の条件は、次のとおりである。
カラム：ＫＳ８０１（８０℃）
サイズ：直径φ８ｍｍ×長さ３００ｍｍ
移動相：０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、３０℃）
流量 ：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＲＩ
標準液：和光純薬社製フルクトース（濃度０．０５％、２０μＬ）
【０１０１】
前記したＨＰＬＣ法によるフルクトースの含有量の測定結果は、サンプル１が１７ｍｇ／ｇであり、サンプル２が１８ｍｇ／ｇであり、サンプル３が２０ｍｇ／ｇであり、サンプル４が２９ｍｇ／ｇであった。
したがって、ブランチングを長く行うほどフルクトースの含有量を増やすことができ、甘さを強くすることができることがわかった。また、この結果から、ブランチングの温度を高く（例えば９０℃）して行っても同様に甘さを強くすることができることが示唆された。
【０１０２】
＜第３実施例＞
＜第３実施例＞では、ごぼう由来抽出物の抽出方法におけるごぼうの乾燥温度の影響について調べた。
（１）乾燥したごぼうの水分、ポリフェノール成分の含有量および色について
＜第１実施例＞と同様の条件でブランチングと皮むきとカットとを行ったごぼうを、乾燥機を用いて下記表９に示す各条件（乾燥温度（℃）および乾燥時間（時間））で乾燥した。
そして、乾燥したごぼうについて、水分（％）およびポリフェノール成分の含有量（ｇ／１００ｇ）を分析した。なお、ポリフェノール成分の含有量は、Folin-Ciocalteu法（（＋）−カテキン当量）にて定量した。なお、Folin-Ciocalteu法は、George S, Brat P, Alter P, Amiot M-J. “Rapid Determination of Polyphenols and Vitamin C in Plant-Derived Products.” J. Agric. Food Chem., 2005, 53 (5), pp 1370-1373に従って行った。
【０１０３】
（２）味、風味について
次いで、前記乾燥したごぼうを１８０℃で１３分間焙煎した後、焙煎したごぼうを熱水に浸けてごぼう由来抽出物を抽出し、ごぼう茶（ごぼう抽出液）として得た。
そして、得られたごぼう抽出液の味、風味を評価した。
【０１０４】
表９に、ごぼうの乾燥条件（乾燥温度（℃）および乾燥時間（時間））と、乾燥したごぼうの水分（％）、ポリフェノール成分の含有量（ｇ／１００ｇ）および色と、表９に示す条件で乾燥したごぼうを焙煎した後、熱水に浸けてごぼう由来抽出物を抽出して得たごぼう抽出液の味、風味の評価と、を併せて示す。
【０１０５】
【表９】
【０１０６】
表９に示すように、３０℃未満（送風のみ）では、乾燥に時間がかかり、酸化が進むため酸味が強くなる傾向があった。また、酸化により黒っぽい褐色を呈するとともに、風味も生臭くなる傾向にあった。さらに、ポリフェノールオキシダーゼの働きを抑制することができなかったためか、ポリフェノール成分の酸化減少が見受けられた。
一方、乾燥温度が高くなるとメイラード反応によって色が黒っぽくなり、えぐみと酸味が強くなる傾向にあった。
乾燥温度は、５０℃で色、味、風味ともに優れているとともに、ポリフェノール成分の含有量が高い結果となった。
【０１０７】
以上、＜第３実施例＞の（１）、（２）を総合的に評価すると、乾燥は、短時間で行う方がよく、時間がかかるほどごぼうの酸化が進み、酸味が強くなることがわかった。また、乾燥温度が高いほど、メイラード反応が促進され、えぐみと酸味が強くなる傾向にあることがわかった。
熱風乾燥機では、時間と温度の両方を考慮した場合、５０℃で５〜６時間程度で行うと、ポリフェノール含有量、つまり機能の観点、および色、味、風味といった官能の観点から好ましいことがわかった。
【０１０８】
＜第４実施例＞
＜第４実施例＞では、ごぼう由来抽出物の抽出方法におけるごぼうの焙煎温度の影響について調べた。
（１）総食物繊維とクロロゲン酸
＜第１実施例＞と同様の条件でブランチングと皮むきとカットとを行ったごぼうを５０℃で乾燥した後、さらに下記表１０に示す各条件で焙煎し、焙煎したごぼうの総食物繊維とクロロゲン酸を分析した。分析は、日本食品分析センターに依頼した。なお、総食物繊維は酵素−ＨＰＬＣ法によって分析し、クロロゲン酸はＨＰＬＣ法によって分析した。
【０１０９】
【表１０】
【０１１０】
表１０に示すように、１８０℃を超え２４０℃以下で焙煎したものは、総食物繊維が６５．４ｇ／１００ｇ、クロロゲン酸が１３０ｍｇ／１００ｇであったのに対し、２４０℃を超える温度で焙煎したものは、総食物繊維が４９．０ｇ／１００ｇ、クロロゲン酸が４２ｍｇ／１００ｇであった。つまり、２４０℃を超える温度で焙煎すると、総食物繊維とクロロゲン酸は、ともに含有量が大幅に減少してしまうことがわかった。
【０１１１】
（２）ＯＲＡＣ値
カットしたごぼうを５０℃で乾燥した後、さらに下記表１１に示す各条件で８〜１５分間焙煎した。焙煎したごぼうを２．５ｇ使用して２５０ｍｌの熱水（８０〜９０℃）で３０秒間浸けてごぼう由来抽出物を抽出し、これを含有するサンプル（いわゆるごぼう茶）を得た。
かかるサンプルのＯＲＡＣ値（μｍｏｌトロロックス当量／ｍｌ）を測定した。ＯＲＡＣ値を表１１に併せて示す。
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
表１１に示すように、１７０℃を超え１８０℃以下の条件で焙煎するよりも、１８０℃を超え２２０℃以下の条件や２２０℃を超え２４０℃以下の条件で焙煎した方が、抗酸化能の指標となるＯＲＡＣ値が高かった。したがって、より高いＯＲＡＣ値を得るためには１８０℃を超え２２０℃以下の温度や２２０℃を超え２４０℃以下の温度、つまり、１８０℃を超え２４０℃以下の温度で焙煎する方が好ましいことがわかった。なお、ＯＲＡＣ値を高くする必要がない場合は、１８０℃以下の温度で焙煎してもよいことがわかった。
【０１１４】
（３）官能試験
パネリスト１２名により、前記（２）ＯＲＡＣ値と同じ条件で抽出したサンプルの官能試験を行った。
評価項目は、土臭さ、泥臭さ；甘み；苦味；香ばしさの４つとし、各評価項目について、以下の評価基準により５段階評価で採点した。
土臭さ、泥臭さは、臭い（５点）、やや臭い（４点）、並（３点）、あまり臭くない（２点）、臭くない（１点）で評価した。
甘みは、甘い（５点）、やや甘い（４点）、並（３点）、あまり甘くない（２点）、甘くない（１点）で評価した。
苦味は、苦い（５点）、やや苦い（４点）、並（３点）、あまり苦くない（２点）、苦くない（１点）で評価した。
香ばしさは、香ばしい（５点）、やや香ばしい（４点）、並（３点）、あまり香ばしくない（２点）、香ばしくない（１点）で評価した。
評価結果を下記表１２に示す。
【０１１５】
【表１２】
【０１１６】
表１２に示すように、焙煎温度が高いほどごぼうの土臭さ、泥臭さが低減する傾向があった。また、焙煎温度が高いほど甘みが低減する傾向があった。さらに、焙煎温度が高いほど苦味と香ばしさが増加する傾向があった。なお、２４０℃を超える温度で焙煎するとこげ臭と苦味が強くなり過ぎてしまい、官能面で評価が低くなった。
なお、焙煎温度が１３２℃であるごぼうについても同様に官能評価を行ったところ、香ばしさ（ロースト香）を得ることができず、ごぼうの生臭みが残ってしまい、よい評価を受けることはできなかった。
【０１１７】
以上、＜第４実施例＞の（１）〜（３）を総合的に評価すると、総食物繊維、クロロゲン酸、ＯＲＡＣ値といった機能の観点からは、１８０℃を超え２４０℃以下の温度で焙煎するのが好ましいことがわかった。また、官能の観点からは、甘みを強くしたい場合は２２０℃以下の焙煎温度とし、土臭さや泥臭さを少なくしたい場合や、苦味や香ばしさを増したい場合は、２２０℃を超え２４０℃以下の焙煎温度とするとよいことがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ごぼうをブランチングし、ブランチングした前記ごぼうの皮むきを行ない、皮むきを行った前記ごぼうをカットし、カットした前記ごぼうを３０〜７０℃で乾燥し、乾燥した前記ごぼうを１３２〜２４０℃で焙煎し、焙煎した前記ごぼうを熱水に浸けてごぼう由来抽出物を抽出することを特徴とするごぼう由来抽出物の抽出方法。
【請求項２】
請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする二次胆汁酸抑制剤。
【請求項３】
請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とするＩｇＡ産生促進剤。
【請求項４】
請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とするムチン産生促進剤。
【請求項５】
請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする免疫賦活食品。
【請求項１】
ごぼうをブランチングし、ブランチングした前記ごぼうの皮むきを行ない、皮むきを行った前記ごぼうをカットし、カットした前記ごぼうを３０〜７０℃で乾燥し、乾燥した前記ごぼうを１３２〜２４０℃で焙煎し、焙煎した前記ごぼうを熱水に浸けてごぼう由来抽出物を抽出することを特徴とするごぼう由来抽出物の抽出方法。
【請求項２】
請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする二次胆汁酸抑制剤。
【請求項３】
請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とするＩｇＡ産生促進剤。
【請求項４】
請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とするムチン産生促進剤。
【請求項５】
請求項１に記載のごぼう由来抽出物の抽出方法によって抽出したごぼう由来抽出物を有効成分とする免疫賦活食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−２５６９１（Ｐ２０１２−２５６９１Ａ）
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６５３９６（Ｐ２０１０−１６５３９６）
【出願日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）平成２２年３月５日社団法人日本農芸化学会発行の「大会講演要旨集 ２０１０年度（平成２２年度）大会［東京］」に発表 （２）平成２２年３月２９日社団法人日本農芸化学会が開催する「日本農芸化学会２０１０年度（平成２２年度）大会［東京］」において文書をもって発表
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（０００１２５９１２）株式会社あじかん (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）平成２２年３月５日社団法人日本農芸化学会発行の「大会講演要旨集 ２０１０年度（平成２２年度）大会［東京］」に発表 （２）平成２２年３月２９日社団法人日本農芸化学会が開催する「日本農芸化学会２０１０年度（平成２２年度）大会［東京］」において文書をもって発表
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（０００１２５９１２）株式会社あじかん (12)
【Ｆターム（参考）】
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