てんかんの治療におけるフィトカンナビノイドの１つ又は組合せの使用
本発明は、てんかんの治療における１つ又は複数のカンナビノイドの使用に、より具体的には全般発作又は部分発作の治療におけるカンナビノイドの１つ又は組合せの使用に関する。一実施形態では、本発明は、純粋な若しくは単離された化合物としての、又は天然に存在する相当量のいずれかのＴＨＣが選択的に除去された植物抽出物としてのカンナビノイドＴＨＣＶの使用に関する。別の実施形態では、フィトカンナビノイドはＣＢＤである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、てんかんの治療におけるフィトカンナビノイドの１つ又は組合せの使用、より具体的には全般発作の治療におけるテトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）の使用、並びに／又は全般発作及び／若しくは部分発作（側頭葉発作と対照的に）におけるカンナビジオール（ＣＢＤ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
てんかんは、世界中でおよそ５千万人の人々が罹患している、広い疾患領域を示す慢性的な神経障害である（非特許文献１）。体内の「内在性カンナビノイド」系に関する理解の進歩により、幾つかの大麻ベースの医薬が、中枢神経系におけるこの過剰興奮性の障害を治療する可能性を有し得るという示唆がもたらされた（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。
【０００３】
大麻は、痙攣促進（pro-convulsant）効果（非特許文献５）及び抗痙攣効果の両方を有するとされている。したがって、カンナビノイドがまだ明らかな（unmasked）治療上の抗痙攣薬であるか、又は逆に、大麻の娯楽としての及び医薬としての使用者に対する潜在的なリスク因子であるかは、依然として決定されていない（非特許文献６）。
【０００４】
１９７５年に非特許文献７により、標準的な治療（フェノバルビタール及びフェニトイン）ではその発作が制御されない若年男性の症例が記載された。この男性が付き合い程度に大麻を吸い始めると、その発作がなくなった。しかしながら、この男性が大麻のみを摂取すると、発作が再発した。非特許文献７は、「マリファナがヒトのてんかんにおける抗痙攣効果を有し得る」と結論付けた。
【０００５】
非特許文献８による研究は、最初の発作の後に入院した３０８人のてんかん患者の大集団に関するものであった。この患者を、発作を起こしたことがない２９４人の患者からなる対照集団と比較し、大麻の使用により発作を有する可能性が低減すると考えられることが見出された。しかしながら、この研究には入院前の健康状態の尺度が含まれておらず、逆に患者の健康状態の差異が薬剤の使用に影響を及ぼした可能性があるため、この研究では「弱い」と主張する非特許文献９において、批判された。
【０００６】
特許文献１において、カンナビノイドであるカンナビジオール（ＣＢＤ）の抗てんかん効果に言及が為されている。
【０００７】
特許文献２は、広範な疾患の中でもてんかんを治療するためのＴＨＣＶの使用の可能性に言及している。
【０００８】
特許文献３は、ＴＨＣＶ及びＣＢＤを含有する配合物を開示している。
【０００９】
３つの対照臨床試験により、カンナビジオールの抗てんかん能が調査された。各試験において、大発作（全般性強直間代発作）又は部分発作の患者に対して、カンナビジオールが経口形態で投与された。
【００１０】
非特許文献１０は、従来の薬物療法では回復しない１６人の大発作患者に対する研究について報告した。この患者は、各自の通常の薬物療法、及び２００ｍｇ〜３００ｍｇのカンナビジオール又はプラセボの投与を受けた。ＣＢＤの投与を受けた患者のうち、３人は完全な改善、２人は部分的な改善、２人は僅かな改善を示したが、１人は変化しないままであった。唯一の望ましくない効果は軽度の鎮静であった。プラセボの投与を受けた患者のうち、１人は改善したが７人は変化しないままであった。
【００１１】
非特許文献１１は上手くいかなかった研究について報告したが、この研究では１２人のてんかん患者が、標準的な抗てんかん剤に加えて１日当たり２００ｍｇ〜３００ｍｇのカンナビジオールの投与を受けた。発作頻度の有意な改善は存在しないようであった。
【００１２】
非特許文献１２は、１日当たり９００ｍｇ〜１２００ｍｇのカンナビジオールの投与を１０月間受けた単一の患者による非盲検試験（open trial）を報告している。この試験により、この患者において発作頻度が顕著に低減することが示された。
【００１３】
これらの試験以来約２０年間更なる進展がないことは、おそらく重大なことである。これは、大麻に基づく医薬に対する一般的な偏見を含む多数の因子に起因すると考えられる。臨床試験に使用された用量レベルが最適でなかった可能性もあり、本出願人は、カンナビノイドがベル形の用量応答曲線を生じる可能性があると判断した。
【００１４】
ＣＢＤが有益であり得ることを示唆する開示に加えて、標準的な治療（フェノバルビタール及びフェニトイン）に応答しない５人の入院中の児童にテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）を投与したという報告がある（非特許文献１３）。１人は発作が完全になくなり、１人は発作がほぼ完全になくなり、その他の３人も以前より悪くはならなかった。
【００１５】
しかしながら、患者ごとに異なる発作感受性に部分的に起因する、４０種類を超える認識可能なてんかん症候群が存在し（非特許文献１４、非特許文献１５）、課題は、これらの種々の種類の症候群に対して効果的な薬剤を見出すことである。
【００１６】
神経細胞の活動は、適切な脳機能のための必要条件である。しかしながら、神経細胞の活動の興奮−抑制の平衡を妨害することにより、てんかん発作が誘導され得る。これらのてんかん発作は、部分発作及び全般発作という２つの基本的なカテゴリーにグループ分けすることができる。部分発作は特定の脳領域において起こり、通常は側頭葉（海馬を含有する）に局在したままであるが、全般発作は、部分発作の二次的な全般化として大脳皮質全体に現れる（非特許文献１４、非特許文献１５）。部分発作及び全般発作の分類に関するこの考え方は、１９６９年に国際抗てんかん連盟がてんかん発作の分類体系を発表するまで、常識となってはいなかった（非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）。
【００１７】
国際抗てんかん連盟は部分発作を更に分類し、意識状態の存在又は障害に応じて、部分発作を単純部分発作及び複雑部分発作に分けた（非特許文献１８）。
【００１８】
連盟は、全般発作も多数の臨床発作タイプへとカテゴリー分けしたが、そのうち幾つかの例を以下に概説する：
【００１９】
欠神発作は頻繁に起こり、進行中の活動の突然の開始及び中断を伴う。加えて、ほんの数秒続く発作に伴い発話が遅くなる、又は妨げられる（非特許文献１８）。
【００２０】
「大発作」としてよく知られる強直間代発作は、全般発作の中で最も頻繁に起こるものである（非特許文献１８）。この発作タイプは、２つの段階を含む：強直性の筋収縮の後、痙攣性運動の間代段階に移行する。患者は、発作中を通じて、またその後不定期間、意識不明のままとなる。
【００２１】
「転倒発作」として知られる脱力発作は、身体における特定の筋肉、筋肉群、又は全ての筋肉の筋緊張の突然の喪失により生じるものである（非特許文献１８）。
【００２２】
てんかん発作の開始は生命を脅かす場合があり、患者は長期間の健康上の影響も受ける（非特許文献１５）。これらの影響は多くの形をとり得る：
精神衛生上の問題（例えば、幼少期における正常なグルタミン酸作動性シナプスの発達の阻害）、
認知機能障害（例えば、学習し記憶を蓄えるための海馬中の神経回路の能力の減弱）、
形態上の変化（例えば、興奮毒性の結果として内側側頭葉てんかんを示す患者の海馬のＣＡ１領域及びＣＡ３領域中の神経細胞の選択的喪失）（非特許文献１９、非特許文献２０）。
【００２３】
てんかんが患者の生活様式にも大きな影響を及ぼす、すなわち患者が、大発作により起こる結果としての損傷（例えば頭部損傷）の恐怖の中で、又は日々の仕事を行うことができない、若しくは長い無発作期間をおかない限り車を運転することができないという中で生活する可能性があることは注目に値する（非特許文献２１）。
【００２４】
てんかんを有する者が患った発作において現れる神経細胞の活動、及び結果として起こる身体症状を模倣する、３種類の十分に確立され広範に使用される急性発作のｉｎ ｖｉｖｏモデルは、以下のものである：
ペンチレンテトラゾール誘導性の全般発作モデル（非特許文献２２、非特許文献２３）、
ピロカルピン誘導性の側頭葉（すなわち海馬）発作モデル（非特許文献２４）、及び
ペニシリン誘導性の部分発作モデル（非特許文献２５）。
【００２５】
これらは、ヒトにおける治療の研究に必要不可欠な広範な発作及びてんかんのモデルを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】国際公開第０２／０６４１０９号
【特許文献２】国際公開第２００６／０５４０５７号
【特許文献３】国際公開第２００９／００７６９７号
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Sander, 2003
【非特許文献２】Mackie, 2006
【非特許文献３】Wingerchuk, 2004
【非特許文献４】Alger, 2006
【非特許文献５】Brust et al., 1992
【非特許文献６】Ferdinand et al., 2005
【非特許文献７】Consroe et al., 1975
【非特許文献８】Ng (1990)
【非特許文献９】Institute of Medicine report (1999)
【非特許文献１０】Cunha et al (1980)
【非特許文献１１】Ames (1986)
【非特許文献１２】Trembly et al (1990)
【非特許文献１３】Davis & Ramsey
【非特許文献１４】McCormick and Contreras, 2001
【非特許文献１５】Lutz, 2004
【非特許文献１６】Merlis, 1970
【非特許文献１７】Gastaut, 1970
【非特許文献１８】Dreifuss et al., 1981
【非特許文献１９】Swann, 2004
【非特許文献２０】Avoli et al., 2005
【非特許文献２１】Fisher et al., 2000
【非特許文献２２】Obay et al., 2007
【非特許文献２３】Rauca et al., 2004
【非特許文献２４】Pereira et al., 2007
【非特許文献２５】Bostanci and Bagirici, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
てんかんと関連する特定の形態の発作を治療する際に有用なフィトカンナビノイド、又はフィトカンナビノイドの組合せを特定することが、本発明の目的の一つである。
【００２９】
効果的であることが分かる可能性が高い用量範囲を決定すること、及びその作用メカニズムの考え得る差異に基づき、より有益であることが分かる可能性が高い（種々の大麻の化学変種又は変種（varieties）中に存在し得るような）カンナビノイドの組合せを特定することが、本発明の別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明の第１の態様によれば、全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）及びカンナビジオール（ＣＢＤ）からなる群から選択される１つ又は複数のフィトカンナビノイドが提供される。
【００３１】
好ましくは、前記薬物は、間代発作及び／又は強直発作を治療するためのものである。
【００３２】
ＴＨＣＶの好ましい１日量は、少なくとも１．５ｍｇ、より好ましくは少なくとも５ｍｇ、１０ｍｇ〜１５ｍｇ以上である。
【００３３】
好ましくはＴＨＣＶを、少なくとも第２の治療上有効なカンナビノイド、好ましくはＣＢＤと組み合わせて使用する。
【００３４】
ＣＢＤは好ましくは、少なくとも４００ｍｇの、より好ましくは少なくとも６００ｍｇの、及び８００ｍｇ以上もの、ただし好ましくは１２００ｍｇ未満の１日量をもたらす量で存在する。
【００３５】
カンナビノイドは、純粋な若しくは単離されたカンナビノイドとして、又は植物抽出物の形態で存在し得る。植物抽出物を使用する場合、ＴＨＣ含有量が、総カンナビノイドの５重量％未満、より好ましくは４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満及び１重量％未満であることが好ましい。クロマトグラフィ等の技法を使用して、ＴＨＣを抽出物から選択的に除去することができる。
【００３６】
本発明は、特定の形態のてんかんを治療するための薬物の製造においてフィトカンナビノイドを使用することにも及ぶ。
【００３７】
本発明の第２の態様によれば、ＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤを含む、全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための組成物が提供される。
【００３８】
前記組成物は好ましくは、１つ又は複数のフィトカンナビノイド、及び１つ又は複数の添加剤を含有する植物抽出物の形態をとる。
【００３９】
本発明の第３の態様によれば、全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための薬物の製造において使用するための、ＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤが提供される。
【００４０】
本発明の第４の態様によれば、有効量のＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤを含む薬物を患者に投与することを含む、全般発作及び／又は部分発作を治療する方法が提供される。
【００４１】
組合せによる使用は、種々の動物モデルにおいて種々の用量で観察された種々の結果を考慮して、明らかに異なる作用メカニズムを前提としている。
【００４２】
本発明の実施形態を、以下の添付の図面を参照して以下に更に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】初期及び後期の発作の重症度までの潜時（latencies）を示す図である。ビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ、及び７０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺに関して、第一ミオクローヌス反射（ＦＭＪ）及びスコア３．５までの平均潜時±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。ｎ＝８〜１０。
【図２】発作の持続時間、及び死ぬまでの時間を示す図である。ビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ、及び７０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺに関して、生存した動物における発作の平均持続時間±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、及び死んだ動物における最初の発作の徴候から死ぬまでの時間±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。実験群内の死んだ動物の割合に応じてｎ＝３〜１０。∫＝ビヒクル群は死ななかったため、ここでは値を示していない。
【図３】重症度スコアの中央値を示す図である。７０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの前にビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳにより処理した動物の群に関する重症度スコアの中央値。全ての群に関してｎ＝１０。
【図４】致死率を示す図である。ビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ、及び７０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺにより処理した動物に関して、致死率を百分率として表す。全ての群に関してｎ＝１０。∫＝ビヒクル群は死ななかったため、値を示していない。
【図５】初期及び後期の発作の重症度までの潜時を示す図である。ビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ、及び８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺに関して、第一ミオクローヌス反射（ＦＭＪ）及びスコア３．５までの平均潜時±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。ｎ＝７〜１０。
【図６】発作の持続時間、及び死ぬまでの時間を示す図である。ビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ、及び８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺに関して、生存した動物における発作の平均持続時間±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、及び死んだ動物における最初の発作の徴候から死ぬまでの時間±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。実験群内の死んだ動物の割合に応じてｎ＝３〜７。
【図７】重症度スコアの中央値を示す図である。８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの前にビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳにより処理した動物の群に関する重症度スコアの中央値。全ての群に関してｎ＝１０。
【図８】致死率を示す図である。ビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ、及び８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺにより処理した動物に関して、致死率を百分率として表す。全ての群に関してｎ＝１０。
【図９Ａ】純粋なＴＨＣＶを用いた場合の、ＰＴＺにより誘導される発作の発生を示す図である。図９Ａは、ビヒクル群及びＴＨＣＶ投与群に関して、８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの注射から発作の最初の徴候までの平均潜時（秒）を示す。特定の群内の各マーカーの発生率に応じてｎ＝５〜１６。全て値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、＊は、ビヒクル群からの有意差（Ｐ＜０．０５；マンホイットニーのＵ検定）を示す。
【図９Ｂ】純粋なＴＨＣＶを用いた場合の、ＰＴＺにより誘導される発作の発生を示す図である。図９Ｂは、ビヒクル群及びＴＨＣＶ投与群に関して、８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの注射からミオクローヌス発作の発生までの平均潜時（秒）を示す。特定の群内の各マーカーの発生率に応じてｎ＝５〜１６。全て値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、＊は、ビヒクル群からの有意差（Ｐ＜０．０５；マンホイットニーのＵ検定）を示す。
【図９Ｃ】純粋なＴＨＣＶを用いた場合の、ＰＴＺにより誘導される発作の発生を示す図である。図９Ｃは、ビヒクル群及びＴＨＣＶ投与群に関して、８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの注射から全強直間代発作までの平均潜時（秒）を示す。特定の群内の各マーカーの発生率に応じてｎ＝５〜１６。全て値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、＊は、ビヒクル群からの有意差（Ｐ＜０．０５；マンホイットニーのＵ検定）を示す。
【図９Ｄ】純粋なＴＨＣＶを用いた場合の、ＰＴＺにより誘導される発作の持続時間を示す図である。図９Ｄは、発作後生存した動物における発作の平均持続時間（秒）を示す。全て値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、＊は、ビヒクル群からの有意差（Ｐ＜０．０５；マンホイットニーのＵ検定）を示す。
【図１０Ａ】ＰＴＺにより誘導される発作に対するＣＢＤの効果を示す図である。ビヒクル及びＣＢＤ（１ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ、１０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ）を投与した動物（全ての群に関してｎ＝１５）において、８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺのＩＰ注射の結果として得られた致死率（％）。＊は、有意な結果（ｐ＜０．０１）を示す。
【図１０Ｂ】ＰＴＺにより誘導される発作に対するＣＢＤの効果を示す図である。８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺのＩＰ注射の結果として強直間代発作を起こした、ビヒクル及びＣＢＤ（１ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ、１０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ）を投与した動物の％。＊は、有意な結果（ｐ＜０．０１）を示す。
【図１１】致死率（百分率）に対してＴＨＣＶの効果がないことを示す図である。対照との比較により二項検定を使用して有意性を評価し、Ｐ＜０．０５で有意性を認めた。いずれの用量でも対照に対する有意差は見出されなかった。
【図１２】発作の平均最大重症度に対してＴＨＣＶの効果がないことを示す図である。チューキーの事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡにより有意性を評価した。対照に対する全ての比較に関してＰ＞０．５。
【図１３】ＴＨＣＶで処理した場合に特定の発作状態に到達した動物の各群における百分率を示す図である。対照に対する有意差を、二項検定を使用して評価した。Ｐ≦０．０５。
【図１４】致死率（百分率）に対するＣＢＤの効果を示す図である。有意性を、二項検定により評価した。＊は、致死率の有意な増大（Ｐ＜０．０５）を示す。この効果が１０ｍｇ／ｋｇでのみ現れ、１００ｍｇ／ｋｇでは消失し、二相効果を示唆したことに留意されたい。
【図１５】発作の平均最大重症度を示す図である。チューキーの事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡにより有意性を評価した。対照に対する全ての比較に関してＰ＞０．５。
【図１６】特定の発作状態に到達した動物の各群における百分率を説明する図である。対照に対する有意差を、二項検定を使用して評価した。Ｐ≦０．０５（＊）。Ｐ≦０．００１（＊＊＊）。
【図１７】強直−間代発作の平均頻度に対するＣＢＤの効果を示す図である。チューキーの事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを使用して有意性を評価した。Ｐ≦０．０５（＊）。Ｐ≦０．０１（＊＊）。
【図１８】発作期間の総持続時間と比較した強直間代状態に費やされた持続時間（百分率）を説明する図である。チューキーの事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを使用して有意性を評価した。Ｐ≦０．０５（＊）。
【図１９Ａ】姿勢制御を失った（without postural control）強直間代発作に対するＣＢＤの効果を説明する図である。姿勢制御を失った強直間代発作を起こした動物の％。統計的二項検定。＊＊＊及び＃は、それぞれｐ≦０．００１及びｐ≦０．１を示す。
【図１９Ｂ】姿勢制御を失った強直間代発作に対するＣＢＤの効果を説明する図である。２時間の記録期間中に（又は死ぬまでに）、姿勢制御を失った強直間代発作を動物が示した頻度。一方向ＡＮＯＶＡの後にチューキー検定。＊＊及び＃は、それぞれｐ≦０．０１及びｐ≦０．１を示す。
【図２０Ａ】ペニシリンにより誘導される発作の重症度に対するＣＢＤの効果を説明する図である。発作の重症度の中央値（灰色の線）。第一四分位数及び第三四分位数（黒色の横線）並びに最大値及び最小値（それぞれ、上方及び下方の誤差バー）も示す。一方向ＡＮＯＶＡの後にチューキー検定。＊は、ｐ≦０．０５を示す。
【図２０Ｂ】ペニシリンにより誘導される発作に対するＣＢＤの効果を説明する図である。全過程で無発作のままであった動物の百分率。統計的二項検定。＊＊＊は、ｐ≦０．００１を示す。
【図２０Ｃ】ペニシリンにより誘導される発作の致死率に対するＣＢＤの効果を説明する図である。致死率（百分率）。統計的二項検定。＃は、ｐ≦０．１を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４４】
詳細な説明
ＰＴＺモデル−実施例１〜実施例３
ＰＴＺモデルに関する一般手法
動物
雄性ウイスターラット（Ｐ２４−２９、７５ｇ〜１１０ｇ）を使用して、全般発作を有するＰＴＺモデルに対するカンナビノイド（ＴＨＣＶ（ＢＤＳ及び純粋）及びＣＢＤ）の効果を評価した。実験の前に、試験環境、ケージ、注射プロトコル、取り扱いに動物を慣らした。動物を、２１℃、１２時間の明暗サイクル（０９００に明るくする）、湿度５０％の部屋に収容し、飼料及び水を自由に摂取できる状態にした。
【００４５】
実験設定
５個の６Ｌ容蓋付パースペクス製タンクを、タンクの間に仕切りを設けた単一のベンチ上に配置した。ラットの挙動を観察するために、その仕切り上に閉回路テレビ（ＣＣＴＶ）カメラを取り付けた。Sony Topica ＣＣＤカメラ（Bluecherry, USA）を、ＢＮＣケーブルを介して、Brooktree デジタルキャプチャカード（Bluecherry, USA）を用いる低ノイズＰＣと接続した。Zoneminder（http://www.zoneminder.com）のソフトウェアを使用して、ラットをモニタリングし、録画を開始及び終了させ、ビデオファイルを管理した。組織内（In-house）Ｌｉｎｕｘ（登録商標）スクリプトを使用して、ビデオファイルを、Ｔｈｅ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ（Noldus Technologies）を使用する更なるオフライン解析に好適な形式へとエンコードした。
【００４６】
用量
広範な用量のＰＴＺ（体重１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜１００ｍｇ）を使用して、発作の誘導に最良の用量を決定した（以下を参照されたい）。結果として、腹腔内に（ＩＰ；０．９％の生理食塩水中５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液）注射する７０ｍｇ／ｋｇ及び８０ｍｇ／ｋｇの用量を、カンナビノイドをスクリーニングするために使用した。
【００４７】
実験プロトコル
試験日に、動物に、カンナビノイド（低用量、中用量又は高用量）、又は陰性対照群の役割を果たす同体積のカンナビノイドビヒクル（エタノール：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ：０．９％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ溶液＝１：１：１８）のＩＰ注射を行った。それから動物を３０分間観察し、その後動物に７０ｍｇ／ｋｇ又は８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺのＩＰ注射を行った。陰性ビヒクル対照の実験を、カンナビノイドを投与した被験体と並行して行った。ＰＴＺを投与した後、動物を観察しビデオ録画して、発作の重症度、及び複数の発作挙動タイプまでの潜時を決定した（以下のｉｎ ｖｉｖｏ解析を参照されたい）。動物を、発作の最後の徴候の後３０分間フィルムに収め（filmed）、それからそれぞれのケージに戻した。
【００４８】
Ｉｎ ｖｉｖｏ解析
実験手順中に動物を観察したが、全ての解析は、Ｔｈｅ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ挙動解析ソフトウェア（Noldus, Netherlands）を使用して、録画したビデオファイルによりオフラインで行った。発作の重症度のスコア化システムを使用して、被験体が経験した発作のレベルを決定した（Pohl & Mares, 1987）。全ての動物に関して、発作の全ての徴候を詳細に記載した。
【００４９】
【表１】
【００５０】
ＰＴＺの注射から発作の発生の特定の指標までの潜時：
ＰＴＺの注射から第一ミオクローヌス反射（ＦＭＪ；スコア１）までの、及び動物が「強直性要素及び身体のねじれを伴う前肢間代」（スコア３．５）に到達するまでの潜時（単位：秒）を記録した。ＦＭＪは、発作活動の開始の指標であるが、９０％を超える動物がスコア３．５を生じるため、より重度の発作の発生の良好なマーカーである。データを、実験群内の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。
【００５１】
発作の最大重症度：
これは、以下のスコア化尺度に基づき、各実験群に関する中央値として示す。
【００５２】
致死率（％）：
ＰＴＺにより誘導される発作の結果として死んだ動物の実験群内における百分率。ＴＨＣＶ（ＢＤＳ）研究において強直間代発作（スコア４及びスコア５）を発生した動物の大部分が結果的に死んだこと、及びスコア６（致死）は動物が強直間代発作も経験したことを自動的に示すことに留意されたい。
【００５３】
発作の持続時間：
発作の最初の徴候（通常はＦＭＪ）から（生存した動物と生存しなかった動物とに分けて）発作の最後の徴候までの時間、又は死んだ被験体の場合には死んだ時間までの時間（単位：秒）。これは、各実験群に関して平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。
【００５４】
統計：
潜時及び持続時間の差異を、チューキーの事後検定を伴う一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）により評価した。Ｐ≦０．０５を有意とみなした。
【００５５】
実施例１−ＴＨＣＶ（ＢＤＳ）
ＴＨＣＶ ＢＤＳは、ＴＨＣＶが優勢なカンナビノイドである（すなわち、ＴＨＣＶが、総カンナビノイド含有量の８０重量％で抽出物に存在する主要なカンナビノイドである）化学変種（chemovar）の全抽出物を含むものであった。ＴＨＣは、２番目に多く含まれるカンナビノイドであり、相当量存在しており（すなわち、ＴＨＣが総カンナビノイド含有量の１０重量％超含まれており、約１６％で存在する）、同定された多数の微量カンナビノイドが存在しており、その各々がＨＰＬＣ分析により測定されるように総カンナビノイド含有量の２重量％未満含まれていた。この抽出物におけるＴＨＣＶ対ＴＨＣの比率は、約５：１である。
【００５６】
実際には、ＴＨＣＶ含有量は抽出物の６７．５重量％であり、ＴＨＣ含有量は抽出物の１３．６重量％であり、他の同定されたカンナビノイドは合計で抽出物の約３重量％含まれており、残りの１６％は非カンナビノイドを含んでいた。
【００５７】
ＰＴＺ予備研究
ラットにおいて或る範囲のＰＴＺ濃度（５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ；文献に記載のある範囲）により誘導される発作を、カンナビノイドの効果の調査の前に最適な用量を決定するために調査した。
５０ｍｇ／ｋｇ及び６０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺにより誘導された発作様の活動はほとんどなかった（ｎ＝４）。
７０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺにより典型的に、間代発作が誘導された（スコア３．５；１３匹の被験体のうち８匹）。
８０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺにより通常（regularly）、強直間代発作が誘導された（スコア４及びスコア５；１０匹の被験体のうち６匹）。
【００５８】
加えて、ＰＴＺの投与の繰り返しにより経時的な感受性の増大がもたらされることが見出された。このため、或る用量のＰＴＺの投与を既に受けた動物に対しては実験を行わなかった。
【００５９】
最初に、ＰＴＺにより誘導される発作に対するＴＨＣＶ ＢＤＳの効果を、７０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺに対して評価した。以下で記載するように、これにより、典型的に重度の発作スコアが得られないビヒクル対照群がもたらされた。したがって、ＴＨＣＶ ＢＤＳを、８０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺに対してもスクリーニングした。８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺに曝露したビヒクル対照動物が経験する発作の重症度の増大が、潜在的な抗痙攣活性のより適切な試験であると考えられた。
【００６０】
中程度の重度の（７０ｍｇ／ｋｇ）ＰＴＺにより誘導される発作に対するＴＨＣＶ ＢＤＳの効果
３種類の用量のＴＨＣＶ ＢＤＳを、ラットにおいて中程度の発作を誘導することが分かったＰＴＺの濃度（７０ｍｇ／ｋｇ；上の予備研究を参照されたい）に対して評価した。使用したＴＨＣＶ ＢＤＳの低用量、中用量及び高用量はそれぞれ、０．３７ｍｇ／ｋｇ、３．７０ｍｇ／ｋｇ及び３７．０４ｍｇ／ｋｇであり、実際のＴＨＣＶの用量としてそれぞれ０．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇをもたらした。これらの用量を、ＴＨＣＶ含有量により、ＰＴＺにより誘導される発作に対する純粋なＴＨＣＶのスクリーニングに使用される用量と一致させた。
【００６１】
ＴＨＣＶ ＢＤＳは、第一ミオクローヌス反射までの潜時に対して、又は発作の重症度の尺度上で重症度スコア３．５に到達するまでの潜時に対して、何らの有意な効果をも有しなかった（図１）。これらの変数の両方に関する値は中用量及び高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳで処理した動物では対照と比較して高かったが、有意には到達しなかった（Ｐ＞０．０５）ことに留意するものとする。同様に、発作の持続時間に対して有意な影響は見られなかった（図２）。
【００６２】
７０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺの投与を受けた動物における発作の重症度（図３）及び致死率（図４）に対するＴＨＣＶ ＢＤＳの効果は、単純なパターンに適合しなかった。ビヒクルを単独で注射した動物で、その群に関して重症度スコアの中央値が３．５を超えたものはなく、死んだ動物もいなかった（ｎ＝１０）。
【００６３】
対照的に、７０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺにより、低用量のＴＨＣＶ ＢＤＳを注射した動物の５０％において重度の強直間代発作及び死が誘導され、重症度スコアの中央値が４．７５を示した。重症度のこの増大は、有意ではなかった。しかしながら、中用量及び高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳを注射した動物は、低用量に曝露した動物よりも低い重症度スコアの中央値及び低い致死率を示した（図３及び図４）。中用量及び高用量での致死率はビヒクル群の致死率より高かったが、有意に高くはなかった（Ｐ＞０．０５；図４）。しかしながら、重症度スコアの中央値は、中用量及び高用量の間で同じであった（図３）。この結果のパターンにより、対照（ビヒクルで処理した）動物において重度の発作を誘導する用量のＰＴＺに対してＴＨＣＶ ＢＤＳをスクリーニングする更なる実験のセットが必要とされることが示唆された。
【００６４】
重度の（８０ｍｇ／ｋｇ）ＰＴＺにより誘導される発作に対するＴＨＣＶ ＢＤＳの効果
８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺにより誘導される発作に対する同じ３種類の用量のＴＨＣＶ ＢＤＳの効果を評価した。８０ｍｇ／ｋｇが、ビヒクル対照群において７０ｍｇ／ｋｇより有意に（Ｐ＝０．００９）重度の発作を誘導した（発作の重症度スコアの中央値はそれぞれ６及び３．５であった）ことは注目に値する。ＴＨＣＶ ＢＤＳは、ＦＭＪ又は重症度スコア３．５までの潜時に対して有意な効果を有しなかった（図５）。同様に、発作の持続時間に対しても効果は観察されなかった（図６）。
【００６５】
低用量のＴＨＣＶ ＢＤＳにより、８０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺの投与を受けた動物における発作の重症度（図７）及び致死率（図８）の両方が減少した。低用量のＴＨＣＶ ＢＤＳの投与を受けた動物の重症度スコアの中央値は、ビヒクル対照より低かった（６と比較して３．５）。しかしながら、この差異は有意ではなかった（Ｐ＞０．５）。また、低用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ群の致死率は、ビヒクル対照群の半分であった（６０％に対して３０％）。
【００６６】
中用量及び高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳで処理した群は、それぞれ６及び６０％と比較して、より低い発作の重症度スコア４．７５（対照に対してＰ＞０．５）、及びより低い致死率５０％を有していた。
【００６７】
ｉｎ ｖｉｖｏでの要約及び結論
ＰＴＺモデルでのＴＨＣＶ ＢＤＳのスクリーニングは、ＰＴＺにより誘導される中程度又は重度の発作に対して何らの有意な抗痙攣効果又は痙攣促進効果も示さないように思われた。しかしながら、重度の（８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺ）発作の誘導の前に低用量のＴＨＣＶ ＢＤＳの投与を受けた動物においては、ビヒクル対照と比較して、より低い重症度及び致死率に向かう傾向が見られた。
【００６８】
より高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳでは、ＴＨＣＶ ＢＤＳの非ＴＨＣＶ内容物中に存在する、より高いレベルの他のカンナビノイド成分（例えばＴＨＣ）により、この効果が妨げられている可能性がある。より高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳは、ＴＨＣＶの任意の有望な正の効果を妨害し得る、漸増用量の非ＴＨＣＶ内容物（例えばＴＨＣ）を含有する。
【００６９】
実施例２−ＴＨＣＶ（純粋）
ＰＴＺにより誘導される発作に対する純粋なＴＨＣＶの効果
低用量（０．０２５ｍｇ／ｋｇ）、中用量（０．２５ｍｇ／ｋｇ）及び高用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）の純粋なＴＨＣＶを、ＰＴＺにより誘導される発作に対するその効果に関して評価した。この点で、実施例１（ＴＨＣＶ ＢＤＳ）との比較に関して、異なる用量の純粋なＴＨＣＶをＴＨＣＶ ＢＤＳと比較して使用したことは注目に値する。以下の表２を参照されたい。
【００７０】
【表２】
【００７１】
８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺにより、４つの全実験群（１群当たりｎ＝１６）由来の動物において種々の重症度の発作が首尾よく誘導された。ＰＴＺにより誘導される発作により、ビヒクルを単独で投与された動物のうち４４％の死が引き起こされた。低用量、中用量及び高用量のＴＨＣＶの投与を受けた群の全てが、それぞれ４１％、３３％及び３８％という、より低い致死率を示した。しかしながら、これらの値は、ビヒクル群の値と有意に異なってはいなかった（ｐ＞０．０５、二項検定）。
【００７２】
最初の発作の徴候までの、並びに使用した発作のスコア化尺度でのスコア［３］及びスコア［５］までの潜時、並びに生存した動物に関する発作の持続時間に関する平均値を、図９Ａ〜図９Ｄに記載する。
【００７３】
ビヒクル対照と比較して、ＴＨＣＶの投与を受けた動物においては、発作様の挙動の最初の顕在化までの潜時の増大により示される（図９Ａ）ように、発作の開始がより遅れたと見ることができる。
【００７４】
開始の遅れは、最高用量のＴＨＣＶでは有意であった（ｐ＝０．０２）。スコア［３］及びスコア［５］までの潜時に関して同様のパターンが見られ（図９Ｂ及び図９Ｃ）、全ての用量のＴＨＣＶで潜時の増大が示され、最高用量のＴＨＣＶで有意なレベルに到達した（［３］及び［５］に関して、それぞれｐ＝０．０１７及びｐ＝０．０１３）。
【００７５】
ビヒクル対照と比較して、中用量のＴＨＣＶの投与後では、実験期間中生存した動物におけるＰＴＺにより誘導される発作の持続時間が有意に短いことも観察された（図９Ｄ；ｐ＝０．０３）。
【００７６】
以下の表３は、各実験群における発作の重症度の中央値に関する値を示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
各実験群に関して最大重症度の中央値、及び発作の何らの徴候もなかった動物の％を示す（各々の値に対してｎ＝１６）。＊は、ビヒクル群からの有意差を示す（有意性の二項検定、Ｐ＜０．０５）。
【００７９】
ビヒクル対照動物が４．２５という発作の重症度の中央値を示したが、ＴＨＣＶの投与を受けた全ての群の重症度スコアの中央値は３．５であった。この減少は、有意に異なるものではなかった。
【００８０】
１２．５％のビヒクル対照動物が発作の指標を示さず、これらの動物はＰＴＺ投与後に発作を発生しないことが示唆された。０．２５ｍｇ／ｋｇの投与を受けた群においては、有意に多数の動物（３３．３％）が発作の徴候を示さなかった（表３；ｐ＝０．０３１）。このデータにより、中用量の０．２５ｍｇ／ｋｇのＴＨＣＶが発作の発生を防いだことが示唆される。
【００８１】
ｉｎ ｖｉｖｏでの要約及び結論
潜時の値に対する高用量のＴＨＣＶの効果により、ＴＨＣＶが開始及び発作の発生の両方を遅らせることができることが示唆され、中用量（０．２５ｍｇ／ｋｇ）のＴＨＣＶでの発作の発生率に対する中用量のＴＨＣＶの有意な効果により、ＰＴＺにより誘導される発作に対する有意な抗痙攣作用が示唆される。
【００８２】
実施例３−ＣＢＤ（純粋）
ＴＨＣＶに加えて、ＣＢＤもＰＴＺモデルにおいてスクリーニングした。結果は、このモデルにおける（１００ｍｇ／ｋｇのレベルの）ＣＢＤが、ビヒクル対照動物と比較して、致死率、及び最も重度の発作の発生率を有意に減少させたため、これが抗痙攣性であることを強く示唆している。
【００８３】
ＰＴＺにより誘導される発作に対する純粋なＣＢＤの効果
純粋なＣＢＤを、同体積のビヒクルを単独で投与された動物と平行して、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量で、標準ビヒクル（エタノール：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ：０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ＝１：１：１８）において腹腔内に（ＩＰ）注射した（各群に関してｎ＝１５）。６０分後にＰＴＺ（８０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を投与した。
【００８４】
ビヒクルを単独で投与した対照動物の４６．７％が、ＰＴＺ投与後３０分以内に死んだ（図１０）。対照的に、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤの投与を受けた動物の６．７％しか（１５匹のうち１匹のみ）死なず、顕著な低減が有意であることが分かった（ｐ＜０．００１）。
【００８５】
加えて、ビヒクル対照動物の５３．３％と比較して、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤの投与を受けた動物の６．７％でしか最も重度の発作（スコア５）が起こらず、この減少も有意なものであった（ｐ＜０．００１；ｉｎ ｖｉｖｏでの図１０）。
【００８６】
純粋なＴＨＣＶと対照的に、発作の発生の潜時の有意な増大は観察されなかった。しかしながら、顕著かつ有意な低減により、ＰＴＺにより誘導される発作に対する著しい抗痙攣効果が示される。
【００８７】
致死率レベル、及び最も重度の発作の発生率に対する、高用量（１００ｍｇ／ｋｇ）のＣＢＤでのＰＴＺモデルにおける純粋なＣＢＤのスクリーニング及び分析により、ＣＢＤが、ＰＴＺにより誘導される発作の重症度を減弱することができることが示唆される。
【００８８】
ピロカルピンモデル−実施例４及び実施例５
実施例４−純粋なＴＨＣＶ
ピロカルピンにより誘導される発作に対する純粋なＴＨＣＶの効果
純粋なＴＨＣＶを、同体積のビヒクルを単独で投与された動物と平行して、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ及び２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、標準ビヒクル（エタノール：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ：０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ＝１：１：１８）において腹腔内に（ＩＰ）注射した（各群に関してｎ≧１４）。１５分後にメチルスコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ；ピロカルピンの末梢性ムスカリン効果を低減するために）を投与し、その４５分後にピロカルピン（３８０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を投与した。
【００８９】
結果
発作の開始までの潜時に対するＴＨＣＶの有意な効果は、いずれの用量でも観察されなかった（対照に対して全ての用量に関してＰ＞０．５；チューキーの事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡ）。いずれの用量のＴＨＣＶについても、対照に対する致死率（百分率）の有意な変化は見られなかった（図１１）。
【００９０】
加えて、ＴＨＣＶは、動物群ごとに到達した発作の平均最大重症度に対する効果を有しなかった（図１２）。
【００９１】
特定の発作状態（片側前肢間代、両側前肢間代、起立及び転倒（rearing and falling）を伴う両側前肢間代、並びに強直間代発作）に達した動物の各群における百分率も評価した（図１３Ａ〜図１３Ｄ）。
【００９２】
ＴＨＣＶは、いずれの用量でも、片側前肢間代、両側前肢間代又は強直間代発作を示す動物の百分率における有意な変化をもたらさなかった。興味深いことに、０．２５ｍｇ／ｋｇのＴＨＣＶが、起立及び転倒を伴う両側前肢間代を示す動物の百分率において有意な増大をもたらしたが、この効果は他のいずれの用量でも見られなかった。
【００９３】
実施例５−純粋なＣＢＤ
ピロカルピンにより誘導される発作に対する純粋なＣＢＤの効果
純粋なＣＢＤを、同体積のビヒクルを単独で投与された動物と平行して、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量で、標準ビヒクル（エタノール：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ：０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ＝１：１：１８）において腹腔内に（ＩＰ）注射した（各群に関してｎ≧１４）。１５分後にメチルスコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ；ピロカルピンの末梢性ムスカリン効果を低減するために）を投与し、その４５分後にピロカルピン（３８０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を投与した。
【００９４】
結果
発作の開始までの潜時に対するＣＢＤの有意な効果は、いずれの用量でも観察されなかった（対照に対して全ての用量に関してＰ＞０．５；チューキーの事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡ）。１０ｍｇ／ｋｇの用量のＣＢＤについては、図１４に示されるように、対照に対する致死率（百分率）の有意な増大が見られた。
【００９５】
図１５は、ＣＢＤが、動物群ごとに達した発作の平均最大重症度に対する効果を有しなかったことを詳しく示している。
【００９６】
図１６Ａ〜図１６Ｄは、特定の発作状態（片側前肢間代、両側前肢間代、起立及び転倒を伴う両側前肢間代、並びに強直間代発作）に達した動物の各群における百分率を詳しく示している。
【００９７】
ＣＢＤは、１ｍｇ／ｋｇを超えるＣＢＤの用量で、片側前肢間代を示す動物の百分率の有意な減少をもたらした。興味深いことに、両側前肢間代を示す動物の百分率に有意差は見出されなかったが、起立及び転倒を伴う両側前肢間代を示す動物の百分率は１ｍｇ／ｋｇを超える全てのＣＢＤの用量で有意に低減した。強直間代発作を示す動物の百分率は、１ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤの用量で有意に低減したが、１０ｍｇ／ｋｇでは低減しなかった（図１４を参照されたい）。
【００９８】
図１７に示されるような、強直間代事象の平均頻度を検証することによる強直間代発作事象に対するＣＢＤの効果。ＣＢＤは、試験した全ての用量で、強直間代事象の平均頻度の有意な低減をもたらした。他の全ての発作スコアの平均頻度に対するＣＢＤの効果も同様の方法で評価したが、対照に対する有意差は見出されなかった（全てに関してＰ＞０．５）。
【００９９】
発作期間の総持続時間と比較した強直間代状態に費やされた持続時間（百分率）を検証した（図１８）。ＣＢＤは、１ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量で持続時間（百分率）を有意に低減させたが、１０ｍｇ／ｋｇでは有意には低減させなかった。
【０１００】
実施例６
ペニシリンモデル−実施例６（のみ）
実施例６−純粋なＣＢＤ
ペニシリンにより誘導される発作に対する純粋なＣＢＤの効果
ＣＢＤ（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ）、又はＣＢＤビヒクル（エタノール：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ：０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ＝１：１：１８）を、成体の雄性ウイスターラット（＞２５０ｇ）にｉ．ｐ．投与した。この１週間前に、動物に対して、麻酔下でカニューレを右側脳室中に外科的に埋め込んだ。ＣＢＤ投与の１時間後、生理食塩水溶液１．５μｌ中で１５０ＩＵのペニシリンを１分かけて右側脳室中に注入し、発作挙動を２時間ビデオ録画した。
【０１０１】
ビヒクル対照群から得られたデータを使用する、ペニシリン単独に対する動物の応答の詳細な検証の後、ペニシリンにより誘導される部分発作に関する最終的な発作のスコア化尺度を得た。したがって、このモデルに関して複数の既存及び公開済みのスコア化システムから得られた以下のスコア化システムを、かかる発作に対する薬剤の効果の分析に使用する。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
１２匹のビヒクルで処理した動物のうち７匹が、最も重度の発作（姿勢制御を失った強直間代発作；図１９Ａ）を発生したが、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤの投与により、これらの発作の発生が、有意性のある形で（ｐ＝０．００１）完全に防止された。これらの発作の発生の近有意な（Near-significant）減少が、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤで処理した動物において観察された（図１６Ａ、両方についてｐ＝０．０７６）。動物が最も重度の発作を経験した頻度も有意に影響され（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．００９；図１９Ｂ）、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤでのビヒクル群と比較した有意な減少（ｐ＝０．００６）、及び１０ｍｇ／ｋｇでの近有意な効果（ｐ＝０．０７１）が示された。
【０１０４】
発作の重症度、及び動物の致死率に対するＣＢＤ処理の効果を、図２０Ａ〜図２０Ｃにおいて説明する。１００ｍｇ／ｋｇの用量のＣＢＤにより、ビヒクルで処理した動物と比較して、ペニシリンにより誘導される発作の重症度の中央値が有意に低減した（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０２４；ビヒクルと１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤとの間の差異、ｐ＝０．０１２；図２０Ａ）。興味深いことに、全ての用量（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ）のＣＢＤが、無発作のままであった動物の割合を有意に増大させた（全ての用量に関してｐ＜０．００１；図２０Ｂ）。最後に、１００ｍｇ／ｋｇの用量が、ビヒクルと比較して、致死率に対する近有意な効果を有していた（ｐ＝０．０５７）。
【０１０５】
全体的な結論
これらの研究から、ＴＨＣＶ（純粋）及びＣＢＤ（純粋）の両方が、全般発作、特に間代／強直発作に対する抗てんかん薬としての展望を示すようであると考えられる。相当量のＴＨＣを含む他のカンナビノイドを含有するＴＨＣＶが豊富な抽出物に関して得られたデータにより、ＴＨＣがＴＨＣＶの効果を打ち消している可能性があること、及び主要な又は優勢なカンナビノイドとしてＴＨＣＶを含有し、また極めて少ないＴＨＣを含有する、又はＴＨＣを実質的に含有しないカンナビノイド抽出物が、てんかんの治療に望ましいと考えられることが示唆される。
【０１０６】
さらに、純粋なＣＢＤによる結果により、ＴＨＣＶ及びＣＢＤの両方を相当量含有し、さらに、極めて少ないＴＨＣを含有する、又はＴＨＣを実質的に含有しない抽出物が、最適な組合せを提供し得ることが示唆される。したがって、ＴＨＣが（数パーセント未満のレベルまで）選択的に及び実質的に除去された、ＴＨＣＶが優勢な抽出物を調製することが望ましいことが分かり得る。これを、ＣＢＤが主要な及び優勢なカンナビノイド（これもＴＨＣのレベルが低い）であるＣＢＤが豊富な抽出物（はるかに低いレベルのＴＨＣを含有する）と混合して、明確に規定された相当のレベルのＴＨＣＶ及びＣＢＤの両方を含むが、ＴＨＣのレベルは僅かである抽出物を作製することができると考えられる。かかる抽出物は、国際公開第０４／０１６２７７号に開示されるような、例えば二酸化炭素による抽出により得られる他のカンナビノイド、及び非カンナビノイド成分を含有していてもよく、これらの成分は、内在性カンナビノイド系において「補助的な（entourage）」効果を支持し得る。
【０１０７】
投与量については、ラット／ヒトの換算係数（×６）により、少なくとも６００ｍｇ（及び任意に４００ｍｇ〜８００ｍｇ）というＣＢＤの１日量、及びＴＨＣＶに関しては少なくとも１．５ｍｇ（中用量）〜好ましくは少なくとも１５ｍｇ（高用量）が示唆される。
【０１０８】
フィトカンナビノイド抽出物を使用する場合、低い又は無視できるレベルのＴＨＣ、並びに治療上有効なレベルのＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤを含む抽出物が望ましい。
【０１０９】
上の実施例に記載したデータは、ＣＢＤが、試験した３種類のモデルの全てにおいて或る程度の抗痙攣特性を示し、全般発作又は部分発作の治療において最良と考えられることを明確に示している。対照的に、ＴＨＣＶはＰＴＺモデルでのみ効果的であった。この知見により、これら２つのカンナビノイドが異なる作用メカニズムを有する可能性があること、及びその組合せがより包括的な治療をもたらすことができることが示唆される。この観点から、ＴＨＣＶは全身発作、より具体的には強直間代発作に対して選択的であると考えられ、ＣＢＤは全般発作及び部分発作において最も効果的と考えられる。
【０１１０】
【表５−１】
【０１１１】
【表５−２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、てんかんの治療におけるフィトカンナビノイドの１つ又は組合せの使用、より具体的には全般発作の治療におけるテトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）の使用、並びに／又は全般発作及び／若しくは部分発作（側頭葉発作と対照的に）におけるカンナビジオール（ＣＢＤ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
てんかんは、世界中でおよそ５千万人の人々が罹患している、広い疾患領域を示す慢性的な神経障害である（非特許文献１）。体内の「内在性カンナビノイド」系に関する理解の進歩により、幾つかの大麻ベースの医薬が、中枢神経系におけるこの過剰興奮性の障害を治療する可能性を有し得るという示唆がもたらされた（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。
【０００３】
大麻は、痙攣促進（pro-convulsant）効果（非特許文献５）及び抗痙攣効果の両方を有するとされている。したがって、カンナビノイドがまだ明らかな（unmasked）治療上の抗痙攣薬であるか、又は逆に、大麻の娯楽としての及び医薬としての使用者に対する潜在的なリスク因子であるかは、依然として決定されていない（非特許文献６）。
【０００４】
１９７５年に非特許文献７により、標準的な治療（フェノバルビタール及びフェニトイン）ではその発作が制御されない若年男性の症例が記載された。この男性が付き合い程度に大麻を吸い始めると、その発作がなくなった。しかしながら、この男性が大麻のみを摂取すると、発作が再発した。非特許文献７は、「マリファナがヒトのてんかんにおける抗痙攣効果を有し得る」と結論付けた。
【０００５】
非特許文献８による研究は、最初の発作の後に入院した３０８人のてんかん患者の大集団に関するものであった。この患者を、発作を起こしたことがない２９４人の患者からなる対照集団と比較し、大麻の使用により発作を有する可能性が低減すると考えられることが見出された。しかしながら、この研究には入院前の健康状態の尺度が含まれておらず、逆に患者の健康状態の差異が薬剤の使用に影響を及ぼした可能性があるため、この研究では「弱い」と主張する非特許文献９において、批判された。
【０００６】
特許文献１において、カンナビノイドであるカンナビジオール（ＣＢＤ）の抗てんかん効果に言及が為されている。
【０００７】
特許文献２は、広範な疾患の中でもてんかんを治療するためのＴＨＣＶの使用の可能性に言及している。
【０００８】
特許文献３は、ＴＨＣＶ及びＣＢＤを含有する配合物を開示している。
【０００９】
３つの対照臨床試験により、カンナビジオールの抗てんかん能が調査された。各試験において、大発作（全般性強直間代発作）又は部分発作の患者に対して、カンナビジオールが経口形態で投与された。
【００１０】
非特許文献１０は、従来の薬物療法では回復しない１６人の大発作患者に対する研究について報告した。この患者は、各自の通常の薬物療法、及び２００ｍｇ〜３００ｍｇのカンナビジオール又はプラセボの投与を受けた。ＣＢＤの投与を受けた患者のうち、３人は完全な改善、２人は部分的な改善、２人は僅かな改善を示したが、１人は変化しないままであった。唯一の望ましくない効果は軽度の鎮静であった。プラセボの投与を受けた患者のうち、１人は改善したが７人は変化しないままであった。
【００１１】
非特許文献１１は上手くいかなかった研究について報告したが、この研究では１２人のてんかん患者が、標準的な抗てんかん剤に加えて１日当たり２００ｍｇ〜３００ｍｇのカンナビジオールの投与を受けた。発作頻度の有意な改善は存在しないようであった。
【００１２】
非特許文献１２は、１日当たり９００ｍｇ〜１２００ｍｇのカンナビジオールの投与を１０月間受けた単一の患者による非盲検試験（open trial）を報告している。この試験により、この患者において発作頻度が顕著に低減することが示された。
【００１３】
これらの試験以来約２０年間更なる進展がないことは、おそらく重大なことである。これは、大麻に基づく医薬に対する一般的な偏見を含む多数の因子に起因すると考えられる。臨床試験に使用された用量レベルが最適でなかった可能性もあり、本出願人は、カンナビノイドがベル形の用量応答曲線を生じる可能性があると判断した。
【００１４】
ＣＢＤが有益であり得ることを示唆する開示に加えて、標準的な治療（フェノバルビタール及びフェニトイン）に応答しない５人の入院中の児童にテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）を投与したという報告がある（非特許文献１３）。１人は発作が完全になくなり、１人は発作がほぼ完全になくなり、その他の３人も以前より悪くはならなかった。
【００１５】
しかしながら、患者ごとに異なる発作感受性に部分的に起因する、４０種類を超える認識可能なてんかん症候群が存在し（非特許文献１４、非特許文献１５）、課題は、これらの種々の種類の症候群に対して効果的な薬剤を見出すことである。
【００１６】
神経細胞の活動は、適切な脳機能のための必要条件である。しかしながら、神経細胞の活動の興奮−抑制の平衡を妨害することにより、てんかん発作が誘導され得る。これらのてんかん発作は、部分発作及び全般発作という２つの基本的なカテゴリーにグループ分けすることができる。部分発作は特定の脳領域において起こり、通常は側頭葉（海馬を含有する）に局在したままであるが、全般発作は、部分発作の二次的な全般化として大脳皮質全体に現れる（非特許文献１４、非特許文献１５）。部分発作及び全般発作の分類に関するこの考え方は、１９６９年に国際抗てんかん連盟がてんかん発作の分類体系を発表するまで、常識となってはいなかった（非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）。
【００１７】
国際抗てんかん連盟は部分発作を更に分類し、意識状態の存在又は障害に応じて、部分発作を単純部分発作及び複雑部分発作に分けた（非特許文献１８）。
【００１８】
連盟は、全般発作も多数の臨床発作タイプへとカテゴリー分けしたが、そのうち幾つかの例を以下に概説する：
【００１９】
欠神発作は頻繁に起こり、進行中の活動の突然の開始及び中断を伴う。加えて、ほんの数秒続く発作に伴い発話が遅くなる、又は妨げられる（非特許文献１８）。
【００２０】
「大発作」としてよく知られる強直間代発作は、全般発作の中で最も頻繁に起こるものである（非特許文献１８）。この発作タイプは、２つの段階を含む：強直性の筋収縮の後、痙攣性運動の間代段階に移行する。患者は、発作中を通じて、またその後不定期間、意識不明のままとなる。
【００２１】
「転倒発作」として知られる脱力発作は、身体における特定の筋肉、筋肉群、又は全ての筋肉の筋緊張の突然の喪失により生じるものである（非特許文献１８）。
【００２２】
てんかん発作の開始は生命を脅かす場合があり、患者は長期間の健康上の影響も受ける（非特許文献１５）。これらの影響は多くの形をとり得る：
精神衛生上の問題（例えば、幼少期における正常なグルタミン酸作動性シナプスの発達の阻害）、
認知機能障害（例えば、学習し記憶を蓄えるための海馬中の神経回路の能力の減弱）、
形態上の変化（例えば、興奮毒性の結果として内側側頭葉てんかんを示す患者の海馬のＣＡ１領域及びＣＡ３領域中の神経細胞の選択的喪失）（非特許文献１９、非特許文献２０）。
【００２３】
てんかんが患者の生活様式にも大きな影響を及ぼす、すなわち患者が、大発作により起こる結果としての損傷（例えば頭部損傷）の恐怖の中で、又は日々の仕事を行うことができない、若しくは長い無発作期間をおかない限り車を運転することができないという中で生活する可能性があることは注目に値する（非特許文献２１）。
【００２４】
てんかんを有する者が患った発作において現れる神経細胞の活動、及び結果として起こる身体症状を模倣する、３種類の十分に確立され広範に使用される急性発作のｉｎ ｖｉｖｏモデルは、以下のものである：
ペンチレンテトラゾール誘導性の全般発作モデル（非特許文献２２、非特許文献２３）、
ピロカルピン誘導性の側頭葉（すなわち海馬）発作モデル（非特許文献２４）、及び
ペニシリン誘導性の部分発作モデル（非特許文献２５）。
【００２５】
これらは、ヒトにおける治療の研究に必要不可欠な広範な発作及びてんかんのモデルを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】国際公開第０２／０６４１０９号
【特許文献２】国際公開第２００６／０５４０５７号
【特許文献３】国際公開第２００９／００７６９７号
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Sander, 2003
【非特許文献２】Mackie, 2006
【非特許文献３】Wingerchuk, 2004
【非特許文献４】Alger, 2006
【非特許文献５】Brust et al., 1992
【非特許文献６】Ferdinand et al., 2005
【非特許文献７】Consroe et al., 1975
【非特許文献８】Ng (1990)
【非特許文献９】Institute of Medicine report (1999)
【非特許文献１０】Cunha et al (1980)
【非特許文献１１】Ames (1986)
【非特許文献１２】Trembly et al (1990)
【非特許文献１３】Davis & Ramsey
【非特許文献１４】McCormick and Contreras, 2001
【非特許文献１５】Lutz, 2004
【非特許文献１６】Merlis, 1970
【非特許文献１７】Gastaut, 1970
【非特許文献１８】Dreifuss et al., 1981
【非特許文献１９】Swann, 2004
【非特許文献２０】Avoli et al., 2005
【非特許文献２１】Fisher et al., 2000
【非特許文献２２】Obay et al., 2007
【非特許文献２３】Rauca et al., 2004
【非特許文献２４】Pereira et al., 2007
【非特許文献２５】Bostanci and Bagirici, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
てんかんと関連する特定の形態の発作を治療する際に有用なフィトカンナビノイド、又はフィトカンナビノイドの組合せを特定することが、本発明の目的の一つである。
【００２９】
効果的であることが分かる可能性が高い用量範囲を決定すること、及びその作用メカニズムの考え得る差異に基づき、より有益であることが分かる可能性が高い（種々の大麻の化学変種又は変種（varieties）中に存在し得るような）カンナビノイドの組合せを特定することが、本発明の別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明の第１の態様によれば、全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）及びカンナビジオール（ＣＢＤ）からなる群から選択される１つ又は複数のフィトカンナビノイドが提供される。
【００３１】
好ましくは、前記薬物は、間代発作及び／又は強直発作を治療するためのものである。
【００３２】
ＴＨＣＶの好ましい１日量は、少なくとも１．５ｍｇ、より好ましくは少なくとも５ｍｇ、１０ｍｇ〜１５ｍｇ以上である。
【００３３】
好ましくはＴＨＣＶを、少なくとも第２の治療上有効なカンナビノイド、好ましくはＣＢＤと組み合わせて使用する。
【００３４】
ＣＢＤは好ましくは、少なくとも４００ｍｇの、より好ましくは少なくとも６００ｍｇの、及び８００ｍｇ以上もの、ただし好ましくは１２００ｍｇ未満の１日量をもたらす量で存在する。
【００３５】
カンナビノイドは、純粋な若しくは単離されたカンナビノイドとして、又は植物抽出物の形態で存在し得る。植物抽出物を使用する場合、ＴＨＣ含有量が、総カンナビノイドの５重量％未満、より好ましくは４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満及び１重量％未満であることが好ましい。クロマトグラフィ等の技法を使用して、ＴＨＣを抽出物から選択的に除去することができる。
【００３６】
本発明は、特定の形態のてんかんを治療するための薬物の製造においてフィトカンナビノイドを使用することにも及ぶ。
【００３７】
本発明の第２の態様によれば、ＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤを含む、全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための組成物が提供される。
【００３８】
前記組成物は好ましくは、１つ又は複数のフィトカンナビノイド、及び１つ又は複数の添加剤を含有する植物抽出物の形態をとる。
【００３９】
本発明の第３の態様によれば、全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための薬物の製造において使用するための、ＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤが提供される。
【００４０】
本発明の第４の態様によれば、有効量のＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤを含む薬物を患者に投与することを含む、全般発作及び／又は部分発作を治療する方法が提供される。
【００４１】
組合せによる使用は、種々の動物モデルにおいて種々の用量で観察された種々の結果を考慮して、明らかに異なる作用メカニズムを前提としている。
【００４２】
本発明の実施形態を、以下の添付の図面を参照して以下に更に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】初期及び後期の発作の重症度までの潜時（latencies）を示す図である。ビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ、及び７０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺに関して、第一ミオクローヌス反射（ＦＭＪ）及びスコア３．５までの平均潜時±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。ｎ＝８〜１０。
【図２】発作の持続時間、及び死ぬまでの時間を示す図である。ビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ、及び７０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺに関して、生存した動物における発作の平均持続時間±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、及び死んだ動物における最初の発作の徴候から死ぬまでの時間±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。実験群内の死んだ動物の割合に応じてｎ＝３〜１０。∫＝ビヒクル群は死ななかったため、ここでは値を示していない。
【図３】重症度スコアの中央値を示す図である。７０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの前にビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳにより処理した動物の群に関する重症度スコアの中央値。全ての群に関してｎ＝１０。
【図４】致死率を示す図である。ビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ、及び７０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺにより処理した動物に関して、致死率を百分率として表す。全ての群に関してｎ＝１０。∫＝ビヒクル群は死ななかったため、値を示していない。
【図５】初期及び後期の発作の重症度までの潜時を示す図である。ビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ、及び８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺに関して、第一ミオクローヌス反射（ＦＭＪ）及びスコア３．５までの平均潜時±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。ｎ＝７〜１０。
【図６】発作の持続時間、及び死ぬまでの時間を示す図である。ビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ、及び８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺに関して、生存した動物における発作の平均持続時間±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、及び死んだ動物における最初の発作の徴候から死ぬまでの時間±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。実験群内の死んだ動物の割合に応じてｎ＝３〜７。
【図７】重症度スコアの中央値を示す図である。８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの前にビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳにより処理した動物の群に関する重症度スコアの中央値。全ての群に関してｎ＝１０。
【図８】致死率を示す図である。ビヒクル、又は低用量、中用量若しくは高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ、及び８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺにより処理した動物に関して、致死率を百分率として表す。全ての群に関してｎ＝１０。
【図９Ａ】純粋なＴＨＣＶを用いた場合の、ＰＴＺにより誘導される発作の発生を示す図である。図９Ａは、ビヒクル群及びＴＨＣＶ投与群に関して、８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの注射から発作の最初の徴候までの平均潜時（秒）を示す。特定の群内の各マーカーの発生率に応じてｎ＝５〜１６。全て値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、＊は、ビヒクル群からの有意差（Ｐ＜０．０５；マンホイットニーのＵ検定）を示す。
【図９Ｂ】純粋なＴＨＣＶを用いた場合の、ＰＴＺにより誘導される発作の発生を示す図である。図９Ｂは、ビヒクル群及びＴＨＣＶ投与群に関して、８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの注射からミオクローヌス発作の発生までの平均潜時（秒）を示す。特定の群内の各マーカーの発生率に応じてｎ＝５〜１６。全て値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、＊は、ビヒクル群からの有意差（Ｐ＜０．０５；マンホイットニーのＵ検定）を示す。
【図９Ｃ】純粋なＴＨＣＶを用いた場合の、ＰＴＺにより誘導される発作の発生を示す図である。図９Ｃは、ビヒクル群及びＴＨＣＶ投与群に関して、８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの注射から全強直間代発作までの平均潜時（秒）を示す。特定の群内の各マーカーの発生率に応じてｎ＝５〜１６。全て値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、＊は、ビヒクル群からの有意差（Ｐ＜０．０５；マンホイットニーのＵ検定）を示す。
【図９Ｄ】純粋なＴＨＣＶを用いた場合の、ＰＴＺにより誘導される発作の持続時間を示す図である。図９Ｄは、発作後生存した動物における発作の平均持続時間（秒）を示す。全て値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、＊は、ビヒクル群からの有意差（Ｐ＜０．０５；マンホイットニーのＵ検定）を示す。
【図１０Ａ】ＰＴＺにより誘導される発作に対するＣＢＤの効果を示す図である。ビヒクル及びＣＢＤ（１ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ、１０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ）を投与した動物（全ての群に関してｎ＝１５）において、８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺのＩＰ注射の結果として得られた致死率（％）。＊は、有意な結果（ｐ＜０．０１）を示す。
【図１０Ｂ】ＰＴＺにより誘導される発作に対するＣＢＤの効果を示す図である。８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺのＩＰ注射の結果として強直間代発作を起こした、ビヒクル及びＣＢＤ（１ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ、１０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ）を投与した動物の％。＊は、有意な結果（ｐ＜０．０１）を示す。
【図１１】致死率（百分率）に対してＴＨＣＶの効果がないことを示す図である。対照との比較により二項検定を使用して有意性を評価し、Ｐ＜０．０５で有意性を認めた。いずれの用量でも対照に対する有意差は見出されなかった。
【図１２】発作の平均最大重症度に対してＴＨＣＶの効果がないことを示す図である。チューキーの事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡにより有意性を評価した。対照に対する全ての比較に関してＰ＞０．５。
【図１３】ＴＨＣＶで処理した場合に特定の発作状態に到達した動物の各群における百分率を示す図である。対照に対する有意差を、二項検定を使用して評価した。Ｐ≦０．０５。
【図１４】致死率（百分率）に対するＣＢＤの効果を示す図である。有意性を、二項検定により評価した。＊は、致死率の有意な増大（Ｐ＜０．０５）を示す。この効果が１０ｍｇ／ｋｇでのみ現れ、１００ｍｇ／ｋｇでは消失し、二相効果を示唆したことに留意されたい。
【図１５】発作の平均最大重症度を示す図である。チューキーの事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡにより有意性を評価した。対照に対する全ての比較に関してＰ＞０．５。
【図１６】特定の発作状態に到達した動物の各群における百分率を説明する図である。対照に対する有意差を、二項検定を使用して評価した。Ｐ≦０．０５（＊）。Ｐ≦０．００１（＊＊＊）。
【図１７】強直−間代発作の平均頻度に対するＣＢＤの効果を示す図である。チューキーの事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを使用して有意性を評価した。Ｐ≦０．０５（＊）。Ｐ≦０．０１（＊＊）。
【図１８】発作期間の総持続時間と比較した強直間代状態に費やされた持続時間（百分率）を説明する図である。チューキーの事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを使用して有意性を評価した。Ｐ≦０．０５（＊）。
【図１９Ａ】姿勢制御を失った（without postural control）強直間代発作に対するＣＢＤの効果を説明する図である。姿勢制御を失った強直間代発作を起こした動物の％。統計的二項検定。＊＊＊及び＃は、それぞれｐ≦０．００１及びｐ≦０．１を示す。
【図１９Ｂ】姿勢制御を失った強直間代発作に対するＣＢＤの効果を説明する図である。２時間の記録期間中に（又は死ぬまでに）、姿勢制御を失った強直間代発作を動物が示した頻度。一方向ＡＮＯＶＡの後にチューキー検定。＊＊及び＃は、それぞれｐ≦０．０１及びｐ≦０．１を示す。
【図２０Ａ】ペニシリンにより誘導される発作の重症度に対するＣＢＤの効果を説明する図である。発作の重症度の中央値（灰色の線）。第一四分位数及び第三四分位数（黒色の横線）並びに最大値及び最小値（それぞれ、上方及び下方の誤差バー）も示す。一方向ＡＮＯＶＡの後にチューキー検定。＊は、ｐ≦０．０５を示す。
【図２０Ｂ】ペニシリンにより誘導される発作に対するＣＢＤの効果を説明する図である。全過程で無発作のままであった動物の百分率。統計的二項検定。＊＊＊は、ｐ≦０．００１を示す。
【図２０Ｃ】ペニシリンにより誘導される発作の致死率に対するＣＢＤの効果を説明する図である。致死率（百分率）。統計的二項検定。＃は、ｐ≦０．１を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４４】
詳細な説明
ＰＴＺモデル−実施例１〜実施例３
ＰＴＺモデルに関する一般手法
動物
雄性ウイスターラット（Ｐ２４−２９、７５ｇ〜１１０ｇ）を使用して、全般発作を有するＰＴＺモデルに対するカンナビノイド（ＴＨＣＶ（ＢＤＳ及び純粋）及びＣＢＤ）の効果を評価した。実験の前に、試験環境、ケージ、注射プロトコル、取り扱いに動物を慣らした。動物を、２１℃、１２時間の明暗サイクル（０９００に明るくする）、湿度５０％の部屋に収容し、飼料及び水を自由に摂取できる状態にした。
【００４５】
実験設定
５個の６Ｌ容蓋付パースペクス製タンクを、タンクの間に仕切りを設けた単一のベンチ上に配置した。ラットの挙動を観察するために、その仕切り上に閉回路テレビ（ＣＣＴＶ）カメラを取り付けた。Sony Topica ＣＣＤカメラ（Bluecherry, USA）を、ＢＮＣケーブルを介して、Brooktree デジタルキャプチャカード（Bluecherry, USA）を用いる低ノイズＰＣと接続した。Zoneminder（http://www.zoneminder.com）のソフトウェアを使用して、ラットをモニタリングし、録画を開始及び終了させ、ビデオファイルを管理した。組織内（In-house）Ｌｉｎｕｘ（登録商標）スクリプトを使用して、ビデオファイルを、Ｔｈｅ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ（Noldus Technologies）を使用する更なるオフライン解析に好適な形式へとエンコードした。
【００４６】
用量
広範な用量のＰＴＺ（体重１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜１００ｍｇ）を使用して、発作の誘導に最良の用量を決定した（以下を参照されたい）。結果として、腹腔内に（ＩＰ；０．９％の生理食塩水中５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液）注射する７０ｍｇ／ｋｇ及び８０ｍｇ／ｋｇの用量を、カンナビノイドをスクリーニングするために使用した。
【００４７】
実験プロトコル
試験日に、動物に、カンナビノイド（低用量、中用量又は高用量）、又は陰性対照群の役割を果たす同体積のカンナビノイドビヒクル（エタノール：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ：０．９％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ溶液＝１：１：１８）のＩＰ注射を行った。それから動物を３０分間観察し、その後動物に７０ｍｇ／ｋｇ又は８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺのＩＰ注射を行った。陰性ビヒクル対照の実験を、カンナビノイドを投与した被験体と並行して行った。ＰＴＺを投与した後、動物を観察しビデオ録画して、発作の重症度、及び複数の発作挙動タイプまでの潜時を決定した（以下のｉｎ ｖｉｖｏ解析を参照されたい）。動物を、発作の最後の徴候の後３０分間フィルムに収め（filmed）、それからそれぞれのケージに戻した。
【００４８】
Ｉｎ ｖｉｖｏ解析
実験手順中に動物を観察したが、全ての解析は、Ｔｈｅ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ挙動解析ソフトウェア（Noldus, Netherlands）を使用して、録画したビデオファイルによりオフラインで行った。発作の重症度のスコア化システムを使用して、被験体が経験した発作のレベルを決定した（Pohl & Mares, 1987）。全ての動物に関して、発作の全ての徴候を詳細に記載した。
【００４９】
【表１】
【００５０】
ＰＴＺの注射から発作の発生の特定の指標までの潜時：
ＰＴＺの注射から第一ミオクローヌス反射（ＦＭＪ；スコア１）までの、及び動物が「強直性要素及び身体のねじれを伴う前肢間代」（スコア３．５）に到達するまでの潜時（単位：秒）を記録した。ＦＭＪは、発作活動の開始の指標であるが、９０％を超える動物がスコア３．５を生じるため、より重度の発作の発生の良好なマーカーである。データを、実験群内の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。
【００５１】
発作の最大重症度：
これは、以下のスコア化尺度に基づき、各実験群に関する中央値として示す。
【００５２】
致死率（％）：
ＰＴＺにより誘導される発作の結果として死んだ動物の実験群内における百分率。ＴＨＣＶ（ＢＤＳ）研究において強直間代発作（スコア４及びスコア５）を発生した動物の大部分が結果的に死んだこと、及びスコア６（致死）は動物が強直間代発作も経験したことを自動的に示すことに留意されたい。
【００５３】
発作の持続時間：
発作の最初の徴候（通常はＦＭＪ）から（生存した動物と生存しなかった動物とに分けて）発作の最後の徴候までの時間、又は死んだ被験体の場合には死んだ時間までの時間（単位：秒）。これは、各実験群に関して平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。
【００５４】
統計：
潜時及び持続時間の差異を、チューキーの事後検定を伴う一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）により評価した。Ｐ≦０．０５を有意とみなした。
【００５５】
実施例１−ＴＨＣＶ（ＢＤＳ）
ＴＨＣＶ ＢＤＳは、ＴＨＣＶが優勢なカンナビノイドである（すなわち、ＴＨＣＶが、総カンナビノイド含有量の８０重量％で抽出物に存在する主要なカンナビノイドである）化学変種（chemovar）の全抽出物を含むものであった。ＴＨＣは、２番目に多く含まれるカンナビノイドであり、相当量存在しており（すなわち、ＴＨＣが総カンナビノイド含有量の１０重量％超含まれており、約１６％で存在する）、同定された多数の微量カンナビノイドが存在しており、その各々がＨＰＬＣ分析により測定されるように総カンナビノイド含有量の２重量％未満含まれていた。この抽出物におけるＴＨＣＶ対ＴＨＣの比率は、約５：１である。
【００５６】
実際には、ＴＨＣＶ含有量は抽出物の６７．５重量％であり、ＴＨＣ含有量は抽出物の１３．６重量％であり、他の同定されたカンナビノイドは合計で抽出物の約３重量％含まれており、残りの１６％は非カンナビノイドを含んでいた。
【００５７】
ＰＴＺ予備研究
ラットにおいて或る範囲のＰＴＺ濃度（５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ；文献に記載のある範囲）により誘導される発作を、カンナビノイドの効果の調査の前に最適な用量を決定するために調査した。
５０ｍｇ／ｋｇ及び６０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺにより誘導された発作様の活動はほとんどなかった（ｎ＝４）。
７０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺにより典型的に、間代発作が誘導された（スコア３．５；１３匹の被験体のうち８匹）。
８０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺにより通常（regularly）、強直間代発作が誘導された（スコア４及びスコア５；１０匹の被験体のうち６匹）。
【００５８】
加えて、ＰＴＺの投与の繰り返しにより経時的な感受性の増大がもたらされることが見出された。このため、或る用量のＰＴＺの投与を既に受けた動物に対しては実験を行わなかった。
【００５９】
最初に、ＰＴＺにより誘導される発作に対するＴＨＣＶ ＢＤＳの効果を、７０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺに対して評価した。以下で記載するように、これにより、典型的に重度の発作スコアが得られないビヒクル対照群がもたらされた。したがって、ＴＨＣＶ ＢＤＳを、８０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺに対してもスクリーニングした。８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺに曝露したビヒクル対照動物が経験する発作の重症度の増大が、潜在的な抗痙攣活性のより適切な試験であると考えられた。
【００６０】
中程度の重度の（７０ｍｇ／ｋｇ）ＰＴＺにより誘導される発作に対するＴＨＣＶ ＢＤＳの効果
３種類の用量のＴＨＣＶ ＢＤＳを、ラットにおいて中程度の発作を誘導することが分かったＰＴＺの濃度（７０ｍｇ／ｋｇ；上の予備研究を参照されたい）に対して評価した。使用したＴＨＣＶ ＢＤＳの低用量、中用量及び高用量はそれぞれ、０．３７ｍｇ／ｋｇ、３．７０ｍｇ／ｋｇ及び３７．０４ｍｇ／ｋｇであり、実際のＴＨＣＶの用量としてそれぞれ０．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇをもたらした。これらの用量を、ＴＨＣＶ含有量により、ＰＴＺにより誘導される発作に対する純粋なＴＨＣＶのスクリーニングに使用される用量と一致させた。
【００６１】
ＴＨＣＶ ＢＤＳは、第一ミオクローヌス反射までの潜時に対して、又は発作の重症度の尺度上で重症度スコア３．５に到達するまでの潜時に対して、何らの有意な効果をも有しなかった（図１）。これらの変数の両方に関する値は中用量及び高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳで処理した動物では対照と比較して高かったが、有意には到達しなかった（Ｐ＞０．０５）ことに留意するものとする。同様に、発作の持続時間に対して有意な影響は見られなかった（図２）。
【００６２】
７０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺの投与を受けた動物における発作の重症度（図３）及び致死率（図４）に対するＴＨＣＶ ＢＤＳの効果は、単純なパターンに適合しなかった。ビヒクルを単独で注射した動物で、その群に関して重症度スコアの中央値が３．５を超えたものはなく、死んだ動物もいなかった（ｎ＝１０）。
【００６３】
対照的に、７０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺにより、低用量のＴＨＣＶ ＢＤＳを注射した動物の５０％において重度の強直間代発作及び死が誘導され、重症度スコアの中央値が４．７５を示した。重症度のこの増大は、有意ではなかった。しかしながら、中用量及び高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳを注射した動物は、低用量に曝露した動物よりも低い重症度スコアの中央値及び低い致死率を示した（図３及び図４）。中用量及び高用量での致死率はビヒクル群の致死率より高かったが、有意に高くはなかった（Ｐ＞０．０５；図４）。しかしながら、重症度スコアの中央値は、中用量及び高用量の間で同じであった（図３）。この結果のパターンにより、対照（ビヒクルで処理した）動物において重度の発作を誘導する用量のＰＴＺに対してＴＨＣＶ ＢＤＳをスクリーニングする更なる実験のセットが必要とされることが示唆された。
【００６４】
重度の（８０ｍｇ／ｋｇ）ＰＴＺにより誘導される発作に対するＴＨＣＶ ＢＤＳの効果
８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺにより誘導される発作に対する同じ３種類の用量のＴＨＣＶ ＢＤＳの効果を評価した。８０ｍｇ／ｋｇが、ビヒクル対照群において７０ｍｇ／ｋｇより有意に（Ｐ＝０．００９）重度の発作を誘導した（発作の重症度スコアの中央値はそれぞれ６及び３．５であった）ことは注目に値する。ＴＨＣＶ ＢＤＳは、ＦＭＪ又は重症度スコア３．５までの潜時に対して有意な効果を有しなかった（図５）。同様に、発作の持続時間に対しても効果は観察されなかった（図６）。
【００６５】
低用量のＴＨＣＶ ＢＤＳにより、８０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＴＺの投与を受けた動物における発作の重症度（図７）及び致死率（図８）の両方が減少した。低用量のＴＨＣＶ ＢＤＳの投与を受けた動物の重症度スコアの中央値は、ビヒクル対照より低かった（６と比較して３．５）。しかしながら、この差異は有意ではなかった（Ｐ＞０．５）。また、低用量のＴＨＣＶ ＢＤＳ群の致死率は、ビヒクル対照群の半分であった（６０％に対して３０％）。
【００６６】
中用量及び高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳで処理した群は、それぞれ６及び６０％と比較して、より低い発作の重症度スコア４．７５（対照に対してＰ＞０．５）、及びより低い致死率５０％を有していた。
【００６７】
ｉｎ ｖｉｖｏでの要約及び結論
ＰＴＺモデルでのＴＨＣＶ ＢＤＳのスクリーニングは、ＰＴＺにより誘導される中程度又は重度の発作に対して何らの有意な抗痙攣効果又は痙攣促進効果も示さないように思われた。しかしながら、重度の（８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺ）発作の誘導の前に低用量のＴＨＣＶ ＢＤＳの投与を受けた動物においては、ビヒクル対照と比較して、より低い重症度及び致死率に向かう傾向が見られた。
【００６８】
より高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳでは、ＴＨＣＶ ＢＤＳの非ＴＨＣＶ内容物中に存在する、より高いレベルの他のカンナビノイド成分（例えばＴＨＣ）により、この効果が妨げられている可能性がある。より高用量のＴＨＣＶ ＢＤＳは、ＴＨＣＶの任意の有望な正の効果を妨害し得る、漸増用量の非ＴＨＣＶ内容物（例えばＴＨＣ）を含有する。
【００６９】
実施例２−ＴＨＣＶ（純粋）
ＰＴＺにより誘導される発作に対する純粋なＴＨＣＶの効果
低用量（０．０２５ｍｇ／ｋｇ）、中用量（０．２５ｍｇ／ｋｇ）及び高用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）の純粋なＴＨＣＶを、ＰＴＺにより誘導される発作に対するその効果に関して評価した。この点で、実施例１（ＴＨＣＶ ＢＤＳ）との比較に関して、異なる用量の純粋なＴＨＣＶをＴＨＣＶ ＢＤＳと比較して使用したことは注目に値する。以下の表２を参照されたい。
【００７０】
【表２】
【００７１】
８０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺにより、４つの全実験群（１群当たりｎ＝１６）由来の動物において種々の重症度の発作が首尾よく誘導された。ＰＴＺにより誘導される発作により、ビヒクルを単独で投与された動物のうち４４％の死が引き起こされた。低用量、中用量及び高用量のＴＨＣＶの投与を受けた群の全てが、それぞれ４１％、３３％及び３８％という、より低い致死率を示した。しかしながら、これらの値は、ビヒクル群の値と有意に異なってはいなかった（ｐ＞０．０５、二項検定）。
【００７２】
最初の発作の徴候までの、並びに使用した発作のスコア化尺度でのスコア［３］及びスコア［５］までの潜時、並びに生存した動物に関する発作の持続時間に関する平均値を、図９Ａ〜図９Ｄに記載する。
【００７３】
ビヒクル対照と比較して、ＴＨＣＶの投与を受けた動物においては、発作様の挙動の最初の顕在化までの潜時の増大により示される（図９Ａ）ように、発作の開始がより遅れたと見ることができる。
【００７４】
開始の遅れは、最高用量のＴＨＣＶでは有意であった（ｐ＝０．０２）。スコア［３］及びスコア［５］までの潜時に関して同様のパターンが見られ（図９Ｂ及び図９Ｃ）、全ての用量のＴＨＣＶで潜時の増大が示され、最高用量のＴＨＣＶで有意なレベルに到達した（［３］及び［５］に関して、それぞれｐ＝０．０１７及びｐ＝０．０１３）。
【００７５】
ビヒクル対照と比較して、中用量のＴＨＣＶの投与後では、実験期間中生存した動物におけるＰＴＺにより誘導される発作の持続時間が有意に短いことも観察された（図９Ｄ；ｐ＝０．０３）。
【００７６】
以下の表３は、各実験群における発作の重症度の中央値に関する値を示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
各実験群に関して最大重症度の中央値、及び発作の何らの徴候もなかった動物の％を示す（各々の値に対してｎ＝１６）。＊は、ビヒクル群からの有意差を示す（有意性の二項検定、Ｐ＜０．０５）。
【００７９】
ビヒクル対照動物が４．２５という発作の重症度の中央値を示したが、ＴＨＣＶの投与を受けた全ての群の重症度スコアの中央値は３．５であった。この減少は、有意に異なるものではなかった。
【００８０】
１２．５％のビヒクル対照動物が発作の指標を示さず、これらの動物はＰＴＺ投与後に発作を発生しないことが示唆された。０．２５ｍｇ／ｋｇの投与を受けた群においては、有意に多数の動物（３３．３％）が発作の徴候を示さなかった（表３；ｐ＝０．０３１）。このデータにより、中用量の０．２５ｍｇ／ｋｇのＴＨＣＶが発作の発生を防いだことが示唆される。
【００８１】
ｉｎ ｖｉｖｏでの要約及び結論
潜時の値に対する高用量のＴＨＣＶの効果により、ＴＨＣＶが開始及び発作の発生の両方を遅らせることができることが示唆され、中用量（０．２５ｍｇ／ｋｇ）のＴＨＣＶでの発作の発生率に対する中用量のＴＨＣＶの有意な効果により、ＰＴＺにより誘導される発作に対する有意な抗痙攣作用が示唆される。
【００８２】
実施例３−ＣＢＤ（純粋）
ＴＨＣＶに加えて、ＣＢＤもＰＴＺモデルにおいてスクリーニングした。結果は、このモデルにおける（１００ｍｇ／ｋｇのレベルの）ＣＢＤが、ビヒクル対照動物と比較して、致死率、及び最も重度の発作の発生率を有意に減少させたため、これが抗痙攣性であることを強く示唆している。
【００８３】
ＰＴＺにより誘導される発作に対する純粋なＣＢＤの効果
純粋なＣＢＤを、同体積のビヒクルを単独で投与された動物と平行して、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量で、標準ビヒクル（エタノール：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ：０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ＝１：１：１８）において腹腔内に（ＩＰ）注射した（各群に関してｎ＝１５）。６０分後にＰＴＺ（８０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を投与した。
【００８４】
ビヒクルを単独で投与した対照動物の４６．７％が、ＰＴＺ投与後３０分以内に死んだ（図１０）。対照的に、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤの投与を受けた動物の６．７％しか（１５匹のうち１匹のみ）死なず、顕著な低減が有意であることが分かった（ｐ＜０．００１）。
【００８５】
加えて、ビヒクル対照動物の５３．３％と比較して、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤの投与を受けた動物の６．７％でしか最も重度の発作（スコア５）が起こらず、この減少も有意なものであった（ｐ＜０．００１；ｉｎ ｖｉｖｏでの図１０）。
【００８６】
純粋なＴＨＣＶと対照的に、発作の発生の潜時の有意な増大は観察されなかった。しかしながら、顕著かつ有意な低減により、ＰＴＺにより誘導される発作に対する著しい抗痙攣効果が示される。
【００８７】
致死率レベル、及び最も重度の発作の発生率に対する、高用量（１００ｍｇ／ｋｇ）のＣＢＤでのＰＴＺモデルにおける純粋なＣＢＤのスクリーニング及び分析により、ＣＢＤが、ＰＴＺにより誘導される発作の重症度を減弱することができることが示唆される。
【００８８】
ピロカルピンモデル−実施例４及び実施例５
実施例４−純粋なＴＨＣＶ
ピロカルピンにより誘導される発作に対する純粋なＴＨＣＶの効果
純粋なＴＨＣＶを、同体積のビヒクルを単独で投与された動物と平行して、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ及び２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、標準ビヒクル（エタノール：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ：０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ＝１：１：１８）において腹腔内に（ＩＰ）注射した（各群に関してｎ≧１４）。１５分後にメチルスコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ；ピロカルピンの末梢性ムスカリン効果を低減するために）を投与し、その４５分後にピロカルピン（３８０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を投与した。
【００８９】
結果
発作の開始までの潜時に対するＴＨＣＶの有意な効果は、いずれの用量でも観察されなかった（対照に対して全ての用量に関してＰ＞０．５；チューキーの事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡ）。いずれの用量のＴＨＣＶについても、対照に対する致死率（百分率）の有意な変化は見られなかった（図１１）。
【００９０】
加えて、ＴＨＣＶは、動物群ごとに到達した発作の平均最大重症度に対する効果を有しなかった（図１２）。
【００９１】
特定の発作状態（片側前肢間代、両側前肢間代、起立及び転倒（rearing and falling）を伴う両側前肢間代、並びに強直間代発作）に達した動物の各群における百分率も評価した（図１３Ａ〜図１３Ｄ）。
【００９２】
ＴＨＣＶは、いずれの用量でも、片側前肢間代、両側前肢間代又は強直間代発作を示す動物の百分率における有意な変化をもたらさなかった。興味深いことに、０．２５ｍｇ／ｋｇのＴＨＣＶが、起立及び転倒を伴う両側前肢間代を示す動物の百分率において有意な増大をもたらしたが、この効果は他のいずれの用量でも見られなかった。
【００９３】
実施例５−純粋なＣＢＤ
ピロカルピンにより誘導される発作に対する純粋なＣＢＤの効果
純粋なＣＢＤを、同体積のビヒクルを単独で投与された動物と平行して、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量で、標準ビヒクル（エタノール：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ：０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ＝１：１：１８）において腹腔内に（ＩＰ）注射した（各群に関してｎ≧１４）。１５分後にメチルスコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ；ピロカルピンの末梢性ムスカリン効果を低減するために）を投与し、その４５分後にピロカルピン（３８０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を投与した。
【００９４】
結果
発作の開始までの潜時に対するＣＢＤの有意な効果は、いずれの用量でも観察されなかった（対照に対して全ての用量に関してＰ＞０．５；チューキーの事後検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡ）。１０ｍｇ／ｋｇの用量のＣＢＤについては、図１４に示されるように、対照に対する致死率（百分率）の有意な増大が見られた。
【００９５】
図１５は、ＣＢＤが、動物群ごとに達した発作の平均最大重症度に対する効果を有しなかったことを詳しく示している。
【００９６】
図１６Ａ〜図１６Ｄは、特定の発作状態（片側前肢間代、両側前肢間代、起立及び転倒を伴う両側前肢間代、並びに強直間代発作）に達した動物の各群における百分率を詳しく示している。
【００９７】
ＣＢＤは、１ｍｇ／ｋｇを超えるＣＢＤの用量で、片側前肢間代を示す動物の百分率の有意な減少をもたらした。興味深いことに、両側前肢間代を示す動物の百分率に有意差は見出されなかったが、起立及び転倒を伴う両側前肢間代を示す動物の百分率は１ｍｇ／ｋｇを超える全てのＣＢＤの用量で有意に低減した。強直間代発作を示す動物の百分率は、１ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤの用量で有意に低減したが、１０ｍｇ／ｋｇでは低減しなかった（図１４を参照されたい）。
【００９８】
図１７に示されるような、強直間代事象の平均頻度を検証することによる強直間代発作事象に対するＣＢＤの効果。ＣＢＤは、試験した全ての用量で、強直間代事象の平均頻度の有意な低減をもたらした。他の全ての発作スコアの平均頻度に対するＣＢＤの効果も同様の方法で評価したが、対照に対する有意差は見出されなかった（全てに関してＰ＞０．５）。
【００９９】
発作期間の総持続時間と比較した強直間代状態に費やされた持続時間（百分率）を検証した（図１８）。ＣＢＤは、１ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量で持続時間（百分率）を有意に低減させたが、１０ｍｇ／ｋｇでは有意には低減させなかった。
【０１００】
実施例６
ペニシリンモデル−実施例６（のみ）
実施例６−純粋なＣＢＤ
ペニシリンにより誘導される発作に対する純粋なＣＢＤの効果
ＣＢＤ（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ）、又はＣＢＤビヒクル（エタノール：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ：０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ＝１：１：１８）を、成体の雄性ウイスターラット（＞２５０ｇ）にｉ．ｐ．投与した。この１週間前に、動物に対して、麻酔下でカニューレを右側脳室中に外科的に埋め込んだ。ＣＢＤ投与の１時間後、生理食塩水溶液１．５μｌ中で１５０ＩＵのペニシリンを１分かけて右側脳室中に注入し、発作挙動を２時間ビデオ録画した。
【０１０１】
ビヒクル対照群から得られたデータを使用する、ペニシリン単独に対する動物の応答の詳細な検証の後、ペニシリンにより誘導される部分発作に関する最終的な発作のスコア化尺度を得た。したがって、このモデルに関して複数の既存及び公開済みのスコア化システムから得られた以下のスコア化システムを、かかる発作に対する薬剤の効果の分析に使用する。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
１２匹のビヒクルで処理した動物のうち７匹が、最も重度の発作（姿勢制御を失った強直間代発作；図１９Ａ）を発生したが、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤの投与により、これらの発作の発生が、有意性のある形で（ｐ＝０．００１）完全に防止された。これらの発作の発生の近有意な（Near-significant）減少が、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤで処理した動物において観察された（図１６Ａ、両方についてｐ＝０．０７６）。動物が最も重度の発作を経験した頻度も有意に影響され（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．００９；図１９Ｂ）、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤでのビヒクル群と比較した有意な減少（ｐ＝０．００６）、及び１０ｍｇ／ｋｇでの近有意な効果（ｐ＝０．０７１）が示された。
【０１０４】
発作の重症度、及び動物の致死率に対するＣＢＤ処理の効果を、図２０Ａ〜図２０Ｃにおいて説明する。１００ｍｇ／ｋｇの用量のＣＢＤにより、ビヒクルで処理した動物と比較して、ペニシリンにより誘導される発作の重症度の中央値が有意に低減した（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０２４；ビヒクルと１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤとの間の差異、ｐ＝０．０１２；図２０Ａ）。興味深いことに、全ての用量（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ）のＣＢＤが、無発作のままであった動物の割合を有意に増大させた（全ての用量に関してｐ＜０．００１；図２０Ｂ）。最後に、１００ｍｇ／ｋｇの用量が、ビヒクルと比較して、致死率に対する近有意な効果を有していた（ｐ＝０．０５７）。
【０１０５】
全体的な結論
これらの研究から、ＴＨＣＶ（純粋）及びＣＢＤ（純粋）の両方が、全般発作、特に間代／強直発作に対する抗てんかん薬としての展望を示すようであると考えられる。相当量のＴＨＣを含む他のカンナビノイドを含有するＴＨＣＶが豊富な抽出物に関して得られたデータにより、ＴＨＣがＴＨＣＶの効果を打ち消している可能性があること、及び主要な又は優勢なカンナビノイドとしてＴＨＣＶを含有し、また極めて少ないＴＨＣを含有する、又はＴＨＣを実質的に含有しないカンナビノイド抽出物が、てんかんの治療に望ましいと考えられることが示唆される。
【０１０６】
さらに、純粋なＣＢＤによる結果により、ＴＨＣＶ及びＣＢＤの両方を相当量含有し、さらに、極めて少ないＴＨＣを含有する、又はＴＨＣを実質的に含有しない抽出物が、最適な組合せを提供し得ることが示唆される。したがって、ＴＨＣが（数パーセント未満のレベルまで）選択的に及び実質的に除去された、ＴＨＣＶが優勢な抽出物を調製することが望ましいことが分かり得る。これを、ＣＢＤが主要な及び優勢なカンナビノイド（これもＴＨＣのレベルが低い）であるＣＢＤが豊富な抽出物（はるかに低いレベルのＴＨＣを含有する）と混合して、明確に規定された相当のレベルのＴＨＣＶ及びＣＢＤの両方を含むが、ＴＨＣのレベルは僅かである抽出物を作製することができると考えられる。かかる抽出物は、国際公開第０４／０１６２７７号に開示されるような、例えば二酸化炭素による抽出により得られる他のカンナビノイド、及び非カンナビノイド成分を含有していてもよく、これらの成分は、内在性カンナビノイド系において「補助的な（entourage）」効果を支持し得る。
【０１０７】
投与量については、ラット／ヒトの換算係数（×６）により、少なくとも６００ｍｇ（及び任意に４００ｍｇ〜８００ｍｇ）というＣＢＤの１日量、及びＴＨＣＶに関しては少なくとも１．５ｍｇ（中用量）〜好ましくは少なくとも１５ｍｇ（高用量）が示唆される。
【０１０８】
フィトカンナビノイド抽出物を使用する場合、低い又は無視できるレベルのＴＨＣ、並びに治療上有効なレベルのＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤを含む抽出物が望ましい。
【０１０９】
上の実施例に記載したデータは、ＣＢＤが、試験した３種類のモデルの全てにおいて或る程度の抗痙攣特性を示し、全般発作又は部分発作の治療において最良と考えられることを明確に示している。対照的に、ＴＨＣＶはＰＴＺモデルでのみ効果的であった。この知見により、これら２つのカンナビノイドが異なる作用メカニズムを有する可能性があること、及びその組合せがより包括的な治療をもたらすことができることが示唆される。この観点から、ＴＨＣＶは全身発作、より具体的には強直間代発作に対して選択的であると考えられ、ＣＢＤは全般発作及び部分発作において最も効果的と考えられる。
【０１１０】
【表５−１】
【０１１１】
【表５−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）及びカンナビジオール（ＣＢＤ）からなる群から選択される１つ又は複数のフィトカンナビノイド。
【請求項２】
前記全般発作が強直発作及び／又は間代発作である、請求項１に記載の全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のためのＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤ。
【請求項３】
前記ＴＨＣＶが、少なくとも一日量１．５ｍｇの請求項１又は２に記載の全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための単独の又はＣＢＤと組み合わせてのＴＨＣＶ。
【請求項４】
前記ＴＨＣＶが、少なくとも一日量１５ｍｇの請求項１又は２に記載の全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための単独の又はＣＢＤと組み合わせてのＴＨＣＶ。
【請求項５】
前記ＣＢＤが、少なくとも一日量４００ｍｇの請求項１又は２に記載の全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための単独の又はＴＨＣＶと組み合わせてのＣＢＤ。
【請求項６】
前記ＣＢＤが、一日量４００ｍｇ〜８００ｍｇの請求項１又は２に記載の全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための単独の又はＴＨＣＶと組み合わせてのＣＢＤ。
【請求項７】
前記ＴＨＣＶ及び／又は前記ＣＢＤが植物抽出物として存在し、該植物抽出物が、該抽出物中に存在する任意のカンナビノイドに対する百分率として５重量％未満のテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）を含む、請求項１又は２に記載の全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のためのＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤ。
【請求項８】
ＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤを含む、全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための組成物。
【請求項９】
全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための薬物の製造において使用するためのＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤ。
【請求項１０】
有効量のＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤを含む薬物を患者に投与することを含む、全般発作及び／又は部分発作を治療する方法。
【請求項１】
全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）及びカンナビジオール（ＣＢＤ）からなる群から選択される１つ又は複数のフィトカンナビノイド。
【請求項２】
前記全般発作が強直発作及び／又は間代発作である、請求項１に記載の全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のためのＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤ。
【請求項３】
前記ＴＨＣＶが、少なくとも一日量１．５ｍｇの請求項１又は２に記載の全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための単独の又はＣＢＤと組み合わせてのＴＨＣＶ。
【請求項４】
前記ＴＨＣＶが、少なくとも一日量１５ｍｇの請求項１又は２に記載の全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための単独の又はＣＢＤと組み合わせてのＴＨＣＶ。
【請求項５】
前記ＣＢＤが、少なくとも一日量４００ｍｇの請求項１又は２に記載の全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための単独の又はＴＨＣＶと組み合わせてのＣＢＤ。
【請求項６】
前記ＣＢＤが、一日量４００ｍｇ〜８００ｍｇの請求項１又は２に記載の全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための単独の又はＴＨＣＶと組み合わせてのＣＢＤ。
【請求項７】
前記ＴＨＣＶ及び／又は前記ＣＢＤが植物抽出物として存在し、該植物抽出物が、該抽出物中に存在する任意のカンナビノイドに対する百分率として５重量％未満のテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）を含む、請求項１又は２に記載の全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のためのＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤ。
【請求項８】
ＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤを含む、全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための組成物。
【請求項９】
全般発作及び／又は部分発作の治療における使用のための薬物の製造において使用するためのＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤ。
【請求項１０】
有効量のＴＨＣＶ及び／又はＣＢＤを含む薬物を患者に投与することを含む、全般発作及び／又は部分発作を治療する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ−Ｂ】
【図１６Ｃ−Ｄ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ−Ｂ】
【図１６Ｃ−Ｄ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１２−５３２０９３（Ｐ２０１２−５３２０９３Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１６８６７（Ｐ２０１２−５１６８６７）
【出願日】平成２２年６月２９日（２０１０．６．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５１０６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００１１６９
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５０８３６８９８７）ジーダブリュー・ファーマ・リミテッド (16)
【氏名又は名称原語表記】ＧＷ ＰＨＡＲＭＡ ＬＩＭＩＴＥＤ
【出願人】（０００２０６９５６）大塚製薬株式会社 (230)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２９日（２０１０．６．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５１０６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００１１６９
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５０８３６８９８７）ジーダブリュー・ファーマ・リミテッド (16)
【氏名又は名称原語表記】ＧＷ ＰＨＡＲＭＡ ＬＩＭＩＴＥＤ
【出願人】（０００２０６９５６）大塚製薬株式会社 (230)
【Ｆターム（参考）】
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