アカボヤから分離された抗菌ペプチド
本発明は、アカボヤから分離した抗菌ペプチドに関し、より詳しくはHalocynthia aurantiumの体液細胞から分離した抗菌ペプチド及び前記抗菌ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤に関する。本発明による抗菌ペプチドは、強酸及び強塩基条件でも抗菌活性に優れ、耐性菌に対する抵抗性にも優れており、天然抗生剤として有用に用いられ得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌ペプチドに関し、より詳しくは、アカボヤから分離された抗菌活性に優れるペプチドに関する。本発明による抗菌ペプチドは、強酸及び強塩基の条件下でも抗菌活性に優れるともに、耐性菌に対しても強力な抗菌性を示す。従って、天然抗菌剤として有効に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
現代の免疫学研究分野において、記憶性と特異性を備える後天性免疫機序と比べて先天性免疫機序は、今まで注目されていなかった。しかし、次の点からみるとき、動物系の自己防御体制において先天性免疫が寄与する役割は極めて大きな比重を占めていると認められる。まず第一に、先天性免疫細胞は、皮膚や腸の上皮細胞を通じた微生物の侵入を源泉的に抑制する。第二に、血液や体液に侵入した病原体等は、先天性免疫細胞の食細胞作用(phagocytosis)で制御される。第三に、先天性免疫細胞は、特異性を有していないので、感染の直後、後天性免疫機序や食細胞作用が活性化される前に、様々な侵入微生物等の体液内での成長を優先的に抑制させる。
【０００３】
又、先天的免疫を担当する細胞は、上記の機能を果たすために簡単な無機化合物（Ｈ２О２及びＮОなど）、抗菌ペプチド及び蛋白質のような様々な抗菌物質などを利用する。前記抗菌ペプチドや蛋白質は、主に粘膜上皮細胞の表面、体液及び食細胞の細胞内小器官などに存在し、サイズ、構造及び活性において極めて多様なものと報告されているが（Hancock, R.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 8856-8861）、大部分は、微生物細胞膜の負電荷に対して相補的な正電荷を呈していることが共通的特徴であり、酵素活性を有する抗菌蛋白質は、主に細菌の膜を加水分解し、抗菌ペプチドもまた微生物に対する共通の標的部位は細胞膜であるものと解されている（Zhang, L. et al., J. Biol. Cheml., 2001, 276, 35714-35722）。このような作用機序は、抗菌ペプチドが既存の抗生剤の耐性菌株に対して効果的に用いられる新たなタイプの抗生剤として開発され得るという可能性を示している。なお、最近、化学合成抗生剤の過多使用によって発生する頻繁な耐性菌株の出現は、これら抗菌ペプチドに対する関心をさらに増大させている。
【０００４】
これまで発見された抗菌ペプチドは、両極性のα−へリックス構造と、ジスルフィド結合で安定した構造を形成しているβ−シート構造を有するものに大別することができる。システイン(cysteine)を有する抗菌ペプチドは、通常、２〜８個の偶数個システイン残基を有することによって、分子内のジスルフィド結合を形成することにより、構造を安定化させる場合が大部分である。表１は、β−シート構造の抗菌ペプチドを、分子内のシステイン残基の個数によって分類した内容を示している。
【０００５】
【表１】
【０００６】
抗菌ペプチドの作用機序と選択性は、細菌の膜と相互作用する方式によって異なる。一般に、ペプチドは、グラム陰性菌の表面上のＬＰＳ（lipopolysaccharide）と作用して自己刺激された摂取経路(uptake pathway)を通じて受け入れられる。この受け入れ過程の第１のステップは、ペプチドが細胞表面のＬＰＳに存在する二価カチオンの結合部位に作用することであり、第２のステップは、細胞膜に挿入されてチャンネルを形成することである。
【０００７】
前記第１のステップにおいて、ペプチドは、Ｍｎ＋＋またはＭｇ＋＋のような二価カチオンより少なくとも３倍以上高い親和力でＬＰＳに結合することができるため、競争的に二価カチオンを代替することができるので、外膜の正常的な細胞膜の特性を破壊させる。このような影響を受けた細菌細胞膜は、一時的に隙間が生じて疎水性物質、低分子蛋白質或いは抗生剤などが通過するようになり（Piers, K.L. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1994, 38, 2311-2316）、特にペプチド自体を受け入れる効果が増大される。
【０００８】
第２のステップにおいて、ペプチドが細胞膜に挿入されてチャンネルを形成する過程において、カチオンペプチドの磁気がアニオンの細菌細胞膜と作用すると、その次の作用として、疎水性部位は膜側に向き、親水性部位はチャンネルを形成するために内側を向くようになる（Hancock, R.E. et al., Adv. Microbial Physiol., 1995, 37, 135-175）。このとき、膜の電位差が大きく、アニオン脂質の量が多く、及びコレステロールの量が少ないほどチャンネルの形成が良好になり、膜構造が崩壊されて細菌が死滅するようになる（Falla, T. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 19298-19303）。これに対して、多量のコレステロールと少量のアニオン脂質を有している真核細胞の場合は、ペプチドが効果的に作用することができなくなり、細菌に対する高い選択的活性を有するようになる。このような理由のため、抗菌ペプチドは、細胞毒性の効果が極めて少ない抗生剤として注目されている。その他にも、抗菌ペプチドが新たな抗生剤として有している長所をまとめると次のとおりである。
【０００９】
１．病原体膜を物理的に破壊する作用機序によって耐性菌の出現を防ぐことができる。
２．迅速な作用機序によって細菌の生存サイクルよりも速く作用する。
３．既存抗生剤の耐性菌に対して効果的に作用する。
４．広範囲な抗菌スペクトルを有する。
５．ＬＰＳとの結合力によって抗−耐毒性の効果がある。
６．遺伝工学の工程を利用する大量生産が可能であるため、新薬製剤として開発する場合低コスト化が可能となる。
【００１０】
なお、動物系統分類学的側面において、後口動物に属するホヤ(tunicate)は、幼生時期に脊索と背部の管状神経索を有する特徴を示すことにより、原始脊索動物に分類される無脊椎動物である。従って、系統進化的な側面からみると、ホヤは脊椎動物直前の進化段階の動物群として分類されるので、このようなホヤの分類学的位置のため、ホヤは動物免疫体系の進化的起源を糾明するための好適な動物として考えられてきた。特に、ホヤの体腔(hemocoel)には脊椎動物の循環系から発見される好中球(granulocytes)とマクロファージ（大食細胞）と類似の形態と機能を有した多くの食細胞が存在していることが観察された（Bone, Q., The Origin of Chordates, 1979, 2nd edn）。現在まで、ホヤの体液細胞から抗菌ペプチドを確認しようとする研究が進められており、Styela clavaの体液細胞から分離されたclavanin（Lee, I.H. et al., FEBS Lett., 1997, 400, 158-162; Lee, I.H. et al., Infection and Immunity, 1997, 65, 2898-2903; Zhao, C. et al., FEBS Lett., 1997, 410, 490-492）及びstyelin（Lee I.H., et al., Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 1997, 118, 515-521; Zhao, C. et al., FEBS Lett., 1997, 412, 144-148）がホヤから発見された代表的な抗菌ペプチドである。
【００１１】
韓国内には、主に二種類のホヤが棲息しているものと知られている。これらは、南西海岸で主に自然棲息するか、または養殖されるHalocynthia roretziと、半島東海岸の束草（地名：韓国江原道）地域でのみ自然棲息しているアカボヤと呼ばれるHalocynthia aurantiumである。前者のホヤについては、既に多年間日本で多くの研究が進行されており、Halocyamineのような変形されたペプチド形態テトラペプチドの抗菌物質が存在するものと知られているが（Azumi, K. et al., Experientia, 1990, 46, 1066-1068; K. Azumi et al., Biochemistry, 1990, 29, 159-165）、Halocynthia aurantiumから抗菌ペプチドが分離されたという報告は未だ皆無の事情である。
【００１２】
ここで、本発明者等は、Halocynthia aurantiumを対象としてその体液細胞に存在する抗菌ペプチドを研究した結果、dicinthaurinと命名された抗菌ペプチドを分離し（Lee, I.H. et al., Biochem. Biophys. Acta, 2001, in press）、最近、また他の種類の抗菌ペプチドを分離し、その構造を分析して、前記ペプチドが抗菌活性に優れていることを確認することにより、本発明を完成するに至った。
【００１３】
【非特許文献１】Hancock, R. E.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,2000,97,8856-8861
【非特許文献２】Zhang, L. et al., J. Biol. Cheml., 2001, 276, 35714-35722
【非特許文献３】Piers, K.L. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1994, 38, 2311-2316
【非特許文献４】Hancock, R.E. et al., Adv. Microbial Physiol., 1995, 37, 135-175
【非特許文献５】Falla, T. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 19298-19303
【非特許文献６】Lee, I.H. et al., FEBS Lett., 1997, 400, 158-162
【非特許文献７】Lee, I.H. et al., Infection and Immunity, 1997, 65, 2898-2903
【非特許文献８】Zhao, C. et al., FEBS Lett., 1997, 410, 490-492
【非特許文献９】Lee I.H., et al., Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 1997, 118, 515-521
【非特許文献１０】Zhao, C. et al., FEBS Lett., 1997, 412, 144-148
【非特許文献１１】Azumi, K. et al., Experientia, 1990, 46, 1066-1068; K. Azumi et al., Biochemistry, 1990, 29, 159-165
【非特許文献１２】Lee, I.H. et al., Biochem. Biophys. Acta, 2001, in press
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本発明は、ホヤ被嚢動物の一種から分離した抗菌ペプチド及びこの抗菌ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤を提供することを目的とする。
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、ホヤの体液細胞から分離した抗菌ペプチド及びこの抗菌ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤を提供する。
【００１６】
以下、本発明について詳述する。
先ず、本発明は、ホヤの体液細胞から分離した抗菌ペプチドを提供する。
【００１７】
本発明の抗菌ペプチドは、ホヤから分離したものであって、前記ホヤはアカボヤと呼ばれるHalocynthia aurantiumであることが好ましい。しかし、必ずしもこれに限定されるものではなく、他の生物から分離、或いは人工的に合成してもよいことは、当業者においては自明のことである。
【００１８】
本発明は、下記の各文字で表現される１８個のアミノ酸配列を有する化学式１で表されるペプチドを提供する。
【００１９】
＜化学式１＞
【００２０】
前記式中、
Ｗは、トリプトファンまたはその誘導体であり、
Ｘは、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体であり、
Ｂは、アルギニン、リジン、ヒスチジンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体であり、
Ｂ’は、アルギニン、リジン、ヒスチジンからなる群またはアスパラギンとグルタミンからなる群より選択される一つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体であり、及び
Ｕは、グリシン、セリン、アラニン、トレオニンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体である。
【００２１】
より好ましくは、化学式１で表される本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｗがトリプトファン、Ｘがロイシン、イソロイシン、バリン、Ｂがアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、Ｕがアラニン、セリン、グリシン、及びＣがシステインからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２２】
最も好ましくは、化学式１で表される本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｗ１がトリプトファン、Ｘ２がロイシン、Ｂ’３がアスパラギン、Ｕ４がアラニン、Ｘ５がロイシン、Ｘ６がロイシン、Ｂ７がヒスチジン、Ｂ８がヒスチジン、Ｕ９がグリシン、Ｘ１０がロイシン、Ｂ’１１がアスパラギン、Ｃ１２がシステイン、Ｕ１３がアラニン、Ｂ１４がリジン、Ｕ１５がグリシン、Ｘ１６がバリン、Ｘ１７がロイシン、及びＵ１８がアラニンであることを特徴する。従って、前記ペプチドは、配列番号１で記載されるアミノ酸配列を有することが最も好ましい。
【００２３】
また、本発明は、前記化学式１で表されるペプチドのＮ−末端部位のアミノ酸配列の中３個（Ｗ１Ｘ２Ｂ’３）が失われた化学式２で表される１５個のアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。
【００２４】
＜化学式２＞
【００２５】
前記式中、
Ｘは、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体であり、
Ｂは、アルギニン、リジン、ヒスチジンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体であり、
Ｂ’は、アルギニン、リジン、ヒスチジンからなる群またはアスパラギンとグルタミンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体であり、及び
Ｕは、グリシン、セリン、アラニン、トレオニンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体である。
【００２６】
より好ましくは、化学式２で表される本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｘがロイシン、イソロイシン、バリン、Ｂがアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、Ｕがアラニン、セリン、グリシン、及びＣがシステインからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２７】
最も好ましくは、化学式２で表される本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｕ４がアラニン、Ｘ５がロイシン、Ｘ６がロイシン、Ｂ７がヒスチジン、Ｂ８がヒスチジン、Ｕ９がグリシン、Ｘ１０がロイシン、Ｂ’１１がアスパラギン、Ｃ１２がシステイン、Ｕ１３がアラニン、Ｂ１４がリジン、Ｕ１５がグリシン、Ｘ１６がバリン、Ｘ１７がロイシン、及びＵ１８がアラニンであることを特徴とする。従って、前記ペプチドは、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有することが最も好ましい。
【００２８】
また、本発明は、前記化学式１で表されるペプチドのシステイン残基がジスルフィド結合されたダイマー型である次の化学式３で表されるペプチドを提供する。
【００２９】
＜化学式３＞
【００３０】
前記各文字で表現されるアミノ酸は、前記化学式１に記載のものと同一であり、前記ペプチドは、配列番号１で記載される２つのペプチドがそれぞれの１２番目のアミノ酸においてジスルフィド結合されることが最も好ましい。
【００３１】
また、本発明は、前記化学式２で表されるペプチドのシステイン残基がジスルフィド結合されたダイマー形である次の化学式４で表されるペプチドを提供する。
【００３２】
＜化学式４＞
【００３３】
前記各文字で表現されるアミノ酸は、前記化学式２に記載のものと同一であり、前記ペプチドは、配列番号２で記載される２つのペプチドがそれぞれの９番目のアミノ酸においてジスルフィド結合されることが最も好ましい。
また、本発明は、前記化学式１で表されるペプチド及び前記化学式２で表されるペプチドのシステイン残基が、ジスルフィド結合されたダイマー形である次の化学式５で表されるペプチドを提供する。
【００３４】
＜化学式５＞
【００３５】
前記各文字で表現されるアミノ酸は、前記化学式１及び化学式２に記載のものと同一であり、前記ペプチドは、配列番号１で記載されるペプチド配列の１２番目のアミノ酸と、配列番号２で記載されるペプチド配列の９番目のアミノ酸がジスルフィド結合されることが最も好ましい。
【００３６】
本発明の好適な実施例において、ホヤの体液細胞から前記化学式５で表されるペプチドを分離し、このペプチドが抗菌活性を有していることを確認して、これを「halocidin」(ハロシジン)と命名した。また、このhalocidinの構造を分析した結果、化学式１及び化学式２で表されるペプチドによって構成され、前記ペプチドのシステイン残基がジスルフィド結合からなることを確認した（図５参照）。ここで、前記化学式１で表されるペプチドを「１８Ｈｃ」と命名し、化学式２で表されるペプチドを「１５Ｈｃ」と命名した。次に、halocidinの特性を分析するために、前記化学式１または化学式２で表されるペプチドのそれぞれを用いてダイマー形態のペプチドを製造し、それぞれ化学式３または化学式４で表されるペプチドを製造した後、それぞれを「ｄｉ−１８Ｈｃ」または「ｄｉ−１５Ｈｃ」と命名した。
【００３７】
また、本発明では、合成１８Ｈｃにおいて、Ｃ−末端アミノ酸が１個除去されたペプチドを「（１８−１）Ｈｃ」、Ｃ−末端アミノ酸が２個除去されたペプチドを「（１８−２）Ｈｃ」と命名した。これと同様の方法で、Ｃ−末端アミノ酸がそれぞれ３〜６個除去されたペプチドをそれぞれ「（１８−３）Ｈｃ」、「（１８−４）Ｈｃ」、「（１８−５）Ｈｃ」、及び「（１８−６）Ｈｃ」と命名した。
【００３８】
また、ペプチド内のヒスチジン残基が全てリジンで置換されたペプチドである場合は、「Ｈｃｋ」と命名し、本発明のペプチドにおいて、Ｎ−末端にリジンが追加された場合は、ペプチドの前に「Ｋ」を追記し、追加されたリジンの個数だけの数字に（＋１）を追記して命名した。例えば、１８ＨｃのＮ−末端にリジンが１個追加された場合、「Ｋ（１８＋１）Ｈｃ」と命名した。
【００３９】
本発明において、分離及び製造した化学式１〜化学式５で表されるペプチドの質量を分析した結果、それぞれ１，９２９Ｄａ、１，５１６Ｄａ、３，８６１Ｄａ、３，０３１Ｄａ、及び３，４４５Ｄａ（表３参照）であった。特に、化学式５で表されるペプチドであるhalocidinのｐＩ値は８．９６５であり、ヘリカルホイール構造を有するヘテロダイマー形態のペプチドである（図８参照）。
【００４０】
本発明における化学式１〜化学式５で表されるペプチドの抗菌活性の有無を確認するために、ラジカル拡散分析（図９参照）、コロニー計数分析（図１０参照）、溶血分析（図１１参照）、グラム陰性菌株に対するラジカル拡散分析（図１２、図１３、図１４参照）、及びグラム陽性菌株に対するラジカル拡散分析（図１５、図１６、図１７参照）を行った結果、化学式１〜化学式５で表されるペプチドは、抗菌活性に優れ、中でもダイマー形態構造を有する化学式２、化学式４及び化学式５で表されるペプチドの活性がさらに優れており、化学式２で表されるペプチドの活性が最も優れていることをわかった。
【００４１】
また、抗菌活性を有する本発明のペプチドが苛酷な生体内においても抗菌活性が保持されるかを確認するために、上皮細胞、尿道、膣内環境のような生体内弱酸性のｐＨ５．５と、血液内の塩環境（ＮａＣｌ １５０ｍＭ）より高いＮａＣｌ２００ｍＭの条件においてペプチドの抗菌活性を測定した結果、化学式５で表されるペプチドは、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．４の条件下でも抗菌活性を示し（表４参照）、ＮａＣｌ １００ｍＭ〜ＮａＣｌ２００ｍＭ下においても抗菌活性を示していることを確認した（表５参照）。
【００４２】
前記の結果からして、化学式１〜化学式５で表される本発明のペプチドは、耐性菌株に対する抗菌活性が優れ、弱酸性のｐＨ及び強塩の条件下でも抗菌活性に優れているのが確認され、生体内においても優れた抗菌活性を有することにより、既存の抗生剤と比べて優秀な抗菌活性を有するペプチドであることが明らかになった。
【００４３】
また、本発明は、前記ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤を提供する。
【００４４】
上述したことから明らかなように、本発明のペプチドは、微生物に対する抗菌活性に優れ、生体内での苛酷な環境、すなわち、強酸、強塩基の条件においても抗菌活性に優れているので、耐性菌に対しても有効な抗菌剤として使用することができる。
【００４５】
以上のことによって、本発明のペプチドを有効成分として含有する抗菌剤を製造することができる。なお、本発明による抗菌剤は、臨床投与の場合、経口または非経口の投与が可能であり、一般的医薬品製剤の形態で使用することができる。
【００４６】
すなわち、本発明による抗菌剤は、実際の臨床投与の時、経口及び非経口の多様な剤形で投与することができ、製剤化の場合は、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形剤形には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形剤形は、一つ以上のhalocidinに少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、またはラクトース、ゼラチンなどを混合して調剤される。また、単なる賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤なども用いられる。経口投与のための液相製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などを挙げられるが、慣用される単純希釈剤の水、流動パラフィンの他に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水溶性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水溶性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性オイル、ethylolateのような注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、witepsol、マクロゴール、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセリンゼラチンなどが用いられる。
【００４７】
本発明の抗菌剤の有効容量は、０．５〜１ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇであり、一日２回投与されることができる。
【００４８】
本発明の抗菌剤は、抗微生物製剤または抗ウィルス製剤のような抗菌剤として広範囲に用いられ、適用可能な範囲は、植物、動物及び人間などに広く有害に作用するウィルス、グラム陽性菌、グラム陰性菌、カビ、酵母及び原生動物などに適用される。本発明の抗菌剤は、単独で用いられても、または用途に応じて他の抗生剤、例えば、エリスロマイシン、テトラサイクリン、アジトロマイシン、バンコマイシン、及びセファロスポリンなどと共に用いられてもよい。また、本発明による抗菌剤は、食品添加物、化粧品、軟膏または注射剤などとしても有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】アカボヤからhalocidinを精製する手順を示すＡＵ−ＰＡＧＥ写真であり、 レーン１：アカボヤ体液細胞の酸抽出物、 レーン２：セファデックスＧ−５０ゲルろ過カラムを通過した５１−８１番画分、 レーン３：Ｐｒｅｐ．ＡＵ−ＰＡＧＥを通過した３５−４５番画分、及び レーン４：ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製されたhalocidinできる。
【図２】halocidinを精製してＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣを行った結果を示すグラフであり、
【図３】精製されたhalocidinをトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した写真であり、 レーンＭ：標準分子量マーカー、 レーン１：天然halocidin、及び レーン２：ジチオスレイトール(dithiothreitol)で切断されたhalocidin
【図４】精製されたhalocidinをＭＡＬＤＩ質量分析したグラフであり、
【図５】halocidinの二つの構成要素の構造及びアミノ酸配列を示すものであり、
【図６】天然halocidinと合成halocidinでＲＰ−ＨＰＬＣを行ったグラフであり、 Ａ：１５Ｈｃ及び１８Ｈｃ、 Ｂ：ｄｉ−１５Ｈｃ、ｄｉ−１８Ｈｃ、及びhalocidin、 Ｃ：天然halocidin
【図７】１８Ｈｃを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（ピンク色線）、２０ｍＭ ＳＤＳのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（黒色線）、及び５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロエタノールの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（赤色線）に懸濁させて、ＣＤスペクトルを調査したグラフであり、 Ａ：１８Ｈｃ、Ｂ：ｄｉ−１８Ｈｃ、
【図８】halocidin（１８Ｈｃ）のヘリカルダイヤグラム（Ａ）及びｐＩ（Ｂ）を示す図であり、
【図９】ＭＲＳＡに対するペプチドのラジカル拡散分析の結果を示す写真（Ａ）とグラフ（Ｃ）、及びＭＤＲＰＡに対するペプチドのラジカル拡散分析の結果を示す写真（Ｂ）とグラフ（Ｄ）であり、 ａ：１５Ｈｃ、ｂ：ｄｉ−１５Ｈｃ、 ｃ：１８Ｈｃ、ｄ：ｄｉ−１８Ｈｃ、 ｅ：halocidin、ｆ：Magainin 1 ｇ：Bufforin 2
【図１０】ペプチドの抗菌活性をコロニー計数分析で示すグラフであり、
【図１１】ペプチドの溶血分析の結果を示すグラフであり、
【図１２】グラム陰性菌に対する１５Ｈｃ、１８Ｈｃ、halocidin、Bufforin 2、及びMagainin 1の抗菌活性を比較したグラフであり、 Ａ：Pseudomonas aeruginosa、 Ｂ：Salmonella cholerasuis、 Ｃ：Salmonella parotyphi A、 Ｄ：E.coli K112、及び Ｅ：E.coli DH5α
【図１３】グラム陰性菌に対する（１８−１）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−１）Ｈｃ、１８Ｈｃ、及びｄｉ−１８Ｈｃ の抗菌活性を比較したグラフであり、 Ａ：Pseudomonas aeruginosa、 Ｂ：Salmonella cholerasuis、 Ｃ：Salmonella parotyphi A、 Ｄ：E.coli K112、及び Ｅ：E.coli DH5α
【図１４】グラム陰性菌に対する（１８−２）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−２）Ｈｃ、（１８）Ｈｃｋ、及びｄｉ−（１８）Ｈｃｋの抗菌活性を比較したグラフであり、 Ａ：Pseudomonas aeruginosa、 Ｂ：Salmonella cholerasuis、 Ｃ：Salmonella parotyphi A、 Ｄ：E.coli K112、及び Ｅ：E.coli DH5a
【図１５】グラム陽性菌に対する１５Ｈｃ、１８Ｈｃ、halocidin、Bufforin 2、及びMagainin 1の抗菌活性を比較したグラフであり、 Ａ：Staphylococcus aureus、 Ｂ：Micrococcus luteus、 Ｃ：Enterococcus faecalis Ｄ：Bacillus subtilus、及び Ｅ：ＭＲＳＡ
【図１６】グラム陽性菌に対する（１８−１）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−１）Ｈｃ、１８Ｈｃ、及びｄｉ−１８Ｈｃの抗菌活性を比較したグラフであり、 Ａ：Staphylococcus aureus、 Ｂ：Micrococcus luteus、 Ｃ：Enterococcus faecalis Ｄ：Bacillus subtilus、及び Ｅ：ＭＲＳＡ
【図１７】グラム陽性菌に対する（１８−２）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−２）Ｈｃ、１８Ｈｃｋ、及びｄｉ−（１８）Ｈｃｋの抗菌活性を比較したグラフである。 Ａ：Staphylococcus aureus、 Ｂ：Micrococcus luteus、 Ｃ：Enterococcus faecalis Ｄ：Bacillus subtilus、及び Ｅ：ＭＲＳＡ
【００５０】
以下、本発明の現実的に好適な具体例を以降の実施例に基づいて説明する。ただし、本発明は下記の実施例に限定されないとともに、当業者であれば、下記の実施例から、本発明の範囲内で多様な変形や改良が可能であることは言うまでもない。
【実施例１】
【００５１】
実施例１：アカボヤから抗菌ペプチドの分離
＜１−１＞アカボヤから酸抽出物の分離
韓国江原道束草市の魚市場で購入したアカボヤと呼ばれるHalocynthia aurantium(以下、アカボヤ又は、ホヤと略記する)を生の状態で７０％エタノールで表皮を洗浄し乾燥させた。乾燥させたホヤの出水口を横切りに切開し、１５０ｍｇＥＤＴＡ入りの５０ｍｌ管に入れて、体液である血リンパを集めた。得られた血リンパを７４μｍポアサイズのメッシュフィルタ（Netwell, Corning Costar, Cambridge, MA, USA）を通過させて不純物を除去した後、４℃の３０分間３００ｇで遠心分離した。遠心分離後、沈殿された体液細胞である血球(hemocyte)を３０ｍｌの０．３４Ｍスクロースに懸濁させた後、４℃の３０分間３００ｇで遠心分離した。遠心分離後、形成された細胞層を分離して１０ｍｌの冷却された５％酢酸に懸濁させた。この懸濁液を１５秒間５回の超音波処理した後、５％酢酸４０ｍｌを添加した。前記酢酸で抽出された溶液を４℃で一夜混合した後、４℃で３０分間２０，０００ｇで遠心分離した。この遠心分離の後、得られた上澄液を、抗菌ペプチドを精製するための試料物質として用いた。
【００５２】
このようにして得られたアカボヤの酸抽出物は、ビシンコニン酸（Sigma）を用いて蛋白質定量し、最小５０ｍｇの蛋白質を含む上澄液を５％酢酸で平衡されたセファデックスＧ−５０ゲルろ過カラム（Sigma）にロードして溶出された各画分を得た。
【００５３】
＜１−２＞アカボヤの酸抽出画分の抗菌活性の測定
本発明者等は、前記実施例＜１−１＞で得られたアカボヤの酸抽出画分の抗菌活性を測定するために、超高感度の放射状拡散分析を行った。より具体的に説明すれば、前記実施例＜１−１＞で溶出した各画分１５０個を５回単位で分析した。各画分２ｍｌから１００μｌを取って真空回転濃縮機（vacuum centrifugation：Centra Evaporator, Bioneer, Korea）において濃縮させた後、０．０１％酢酸溶液５μｌに懸濁させた。一方、滅菌されたリン酸クエン酸緩衝液（９ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）、１％（ｗ／ｖ）１型アガロース（低電気浸透アガロース）（Ａ６０１３、Sigma）及び３％トリプシン大豆培養液（ＴＳＢ、Difco, Detroit, MI, USA）を成分とするゲルに、対数期中間部のメチシリン抵抗性菌株黄色ブドウ球菌（methicilin resistance Stapyhlococcus aureus、以下、「ＭＲＳＡ」という、韓国ソウル女子大学校ＣＣＡＲＭ３００１）を含ませ、直径３ｍｍのウェルを含むアガロースプレートを作った。前記の段階で細菌が含まれたアガロースプレートのウェルに前記製造した画分をロードした。前記ペプチドがアガロースゲル中に拡散されるように３時間の間反応させた後、６％ＴＳＢ及び１％アガロースゲルで構成された高栄養培地１０ｍｌを注入した。前記プレートを一夜培養して生存する細菌のコロニーが形成されるようにした。抗菌活性は、ロードしたペプチド画分の周辺に形成された透明環(clearing zone)の直径によって測定した。
【００５４】
その結果、５１−８１番ペプチド画分周辺の透明環のサイズが最も大きいことから抗菌活性が高いことが認められた。
【００５５】
＜１−３＞抗菌活性を有する画分からのペプチドの精製
本発明者等は、前記実施例＜１−２＞で得られた抗菌活性の高いペプチド画分をさらに精製するために、分離用酸尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「Ｐｒｅｐ ＡＵ−ＰＡＧＥ」という）に、前段階において抗菌活性を確認した５１−８１番画分を真空回転濃縮機で濃縮し、ロードした。前記Ｐｒｅｐ ＡＵ−ＰＡＧＥの流速は６０ｍｌ／時間とし、２ｍｌを1画分とした。
【００５６】
前記Ｐｒｅｐ ＡＵ−ＰＡＧＥ画分を２ｍｌの管に入れて真空回転濃縮機で濃縮した。各画分を１０回単位の間隔で二つのＡＵ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動した。一方のゲルはバンドを確認するために、Coomasie blueで染色し、他方のゲルはＭＲＳＡを用いて ゲル重層分析で蛋白質バンドの抗菌活性を確認した。ゲル重層分析は、ＭＲＳＡが含まれた下層寒天の１０ｍｌに電気泳動したゲルをロードし、前記ペプチドがアガロースゲル中に拡散するように３７℃で３時間の間反応させた後、高栄養培地（６％ＴＳＢ及び１％アガロースゲル）１０ｍｌを注入した。
【００５７】
その結果、３５−４５番画分に含まれた蛋白質が抗菌活性を示した（図１）。
【００５８】
上記において抗菌活性が確認された３５−４５番画分を全部集めて、最後の精製段階としてＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＲＰ−ＨＰＬＣ」という）カラム（Vydac 218TP54：The Separation Group, Hesperia, CA）にロードした。サンプルをロードした後、最初の１０分間は０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５％アセトニトリルを０．５ｍｌ／分の速度で流してカラムを洗浄した後、アセトニトリルの濃度を６０分間、１分当たり１％ずつ増加させた。上記のプロセスの間、アセトニトリルの各濃度別に出るピーク画分を収去した。収去した各画分の１０％を真空回転濃縮機で濃縮して放射状拡散分析で抗菌活性を確認した。
【００５９】
その結果、アセトニトリル４５．２％である５０．２分で分離されるペプチドが抗菌活性を保有していることが認められ、これを「ハロシジン」と命名した（図２）。
【実施例２】
【００６０】
実施例２：精製されたhalocidinの特性分析
＜２−１＞halocidinの質量分析
本発明者等は、前記実施例１において、アカボヤから分離した抗菌活性の有る新規のペプチドであるhalocidinの特性を分析するために、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）及びＡＵ−ＰＡＧＥにより分析した。具体的には、前記実施例１において分離した抗菌活性の有るペプチドであるhalocidinを凍結乾燥させた後、８Ｍ尿素２５μｌ及び０．４Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）２５μｌを添加して溶解し、４５ｍＭジチオスレイトールを添加し５０℃で１５分間反応させた。halocidinモノマーのビニルピリジン誘導体を取り出すために、前記halocidin混合物にビニルピリジン１５μｌを添加して室温で冷却させ、少なくとも３０分間暗所で反応させた。最終の反応産物はＲＰ−ＨＰＬＣで抽出した。この抽出物が良好に抽出されているか否かを確認するために、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＵ−ＰＡＧＥで分析し、分離されたhalocidinの正確な分子量を測定するために、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザーイオン化）質量分析計（Voyager-DE STR, PerSeptive Biosystems, USA）を用いて測定し、アミノ酸配列を分析するために、Procise 419（Applied Biosystems, USA）を用いて気相エドマン分解法によってそれぞれを分析した。
【００６１】
その結果、ＲＰ−ＨＰＬＣで抽出されたhalocidin及びジチオスレイトールによって切断されたhalocidinモノマーは、それぞれ約３．４ｋＤａ及び１．５と１．８ｋＤａの質量を有することが確認され（図３）、halocidinは、３４４３．６８３６ｍ／ｚで大ピークが現れ、１５１５．７４８７ｍ／ｚ及び１９２９．９１５１ｍ／ｚで小ピークが現れることが認められた（図４）。また、１８個のアミノ酸配列からなるモノマー及び１５個のアミノ酸配列からなるモノマーのシステイン残基がジスルフィド結合をなす構造を有していることが認められた（図５）。
【００６２】
前記の結果からアカボヤから分離した抗菌活性を示すペプチドであるhalocidinは、分子量が３，４４３．７Ｄａであり、１５モノマー及び１８モノマーからなり、前記モノマーのシステイン残基がジスルフィド結合された構造を有することが認められた。ここで、本発明者等は、halocidinを構成する１８モノマー及び１５モノマーをそれぞれ「１８Ｈｃ」及び「１５Ｈｃ」と命名した。
【００６３】
＜２−２＞合成halocidinの調剤及びアカボヤhalocidinとの質量比較
本発明者等は、halocidinが１５Ｈｃ及び１８Ｈｃからなることを確認し、その特性を比較、分析するために、合成ペプチドを製造した。具体的には、合成halocidinモノマーは、自動固相ペプチド合成装置（Pioneer, Applied Biosystems, USA）を用いて人工的に合成し、ＲＰ−ＨＰＬＣで再分離した。１５モノマー及び１８モノマーによって構成されたホモダイマー（以下、「ｄｉ」と略記する）型またはヘテロダイマー（一名、halocidin）型のペプチドは、１ｍｇ／ｍｌの合成ペプチドのそれぞれを０．１Ｍ重炭酸アンモニウムに混合し、その混合液を７２時間以上空気中に放置して合成した。最後に、合成されたhalocidinモノマー、ホモダイマー及びヘテロダイマーは、ＭＡＬＤＩ質量分析計で分子量を測定し、合成halocidinが良好に合成されたか否かを確認した。
合成されたペプチドモノマーの配列は、下記の表２の通りである。
【００６４】
【表２】
【００６５】
この結果、アカボヤのhalocidinと合成halocidinの予想質量とＭＡＬＤＩで測定した質量が一致することが確認された（表３）。
【００６６】
【表３】
【００６７】
＜２−３＞アカボヤのhalocidinと合成halocidinの溶出ピークの比較
本発明者等は、前記実施例＜２−２＞において質量が近似していることを確認した合成halocidin及びアカボヤのhalocidinが溶出されるピークを再確認するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを行った。具体的には、アセトニトリルで抽出したアカボヤのhalocidinを含む溶液を用いて、１０分間アセトニトリル５％を流した後、グラジエントを１分／ｍｌでかけながら、時間別に溶出される画分を測定した。その結果、二つのアカボヤのモノマー（１５Ｈｃ及び１８Ｈｃ）は、それぞれアセトニトリル３６．８％と４６．３％である４２分と５２分で溶出された（図６Ａ）。また、二つのホモダイマーであるｄｉ−１５Ｈｃ及びｄｉ−１８Ｈｃは、それぞれアセトニトリル３９．２％及び５１．７％で溶出され、halocidinの構造をなすヘテロダイマーは、天然halocidinが溶出されるアセトニトリル濃度（図６Ｃ）と同一に溶出された（図６Ｂ）。
【００６８】
＜２−４＞halocidinの２次構造の糾明
本発明者等は、halocidinの２次構造を糾明するために、halocidinのＣＤスペクトルを調べた。具体的には、１８Ｈｃとｄｉ−１８Ｈｃを用いて通過長さ１ｍｍの矩形セルを使用し、２５℃でリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ＳＤＳのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、及び５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロエタノールの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にそれぞれ懸濁させて、ＣJ−７１５ＣＤ／ＯＲＤ分光偏光計（JASCO., CO.）で円偏光二色性スペクトルを測定した。
【００６９】
その結果、１８Ｈｃとｄｉ−１８Ｈｃは、２０ｍＭ ＳＤＳのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）及び５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロエタノールの１０ｍＭリン酸緩衝液中で２０８ｎｍ及び２２２ｎｍにおいて二つの最小値を有し、１９３ｎｍにおいて最大値を有するα−へリックス構造を有していることが認められた（図７）。
【００７０】
＜２−５＞ヘリカルホイールダイヤグラム及びｐＩの測定
本発明者等は、halocidinの特性をさらに具体的に確認するために、ANTHEPROT 2000 V5.2ソフトウェアを用いてヘリカルホイールダイヤグラム（Ａ）及びｐＩを測定した。その結果、１８Ｈｃは、ヘリカルホイール構造を有し、極性と非極性残基の明らかなクラスタリング(clustering)を有して両親和性を有していることが認められた（図８Ａ）。また、ｐＨ変化による１８Ｈｃの電荷を測定した結果、１８ＨｃのｐＩ値は、８．９６５であることが認められた（図８Ｂ）。
【実施例３】
【００７１】
実施例３：halocidinの抗菌活性分析
本発明者等は、アカボヤから分離してその特性を糾明した新規の抗菌ペプチドであるhalocidinの抗菌活性を分析するために、超高感度の放射状拡散分析、コロニー計数分析、溶血分析、及びグラム陽性菌またはグラム陰性菌に対する抗菌活性を分析した。
【００７２】
＜３−１＞超高感度の放射状拡散分析
本発明者等は、実施例＜２−２＞で調剤した合成halocidinを用いて超高感度の放射状拡散分析を行った。具体的には、前記実施例＜１−２＞と同様にして、ＭＲＳＡ及び多剤抗生剤耐性のPseudomonas aeruginosa（以下、「ＭＤＲＰＡ」という）（韓国ソウル女子大学校ＣＣＡＲＭ２００２）菌株に対して１５Ｈｃ、ｄｉ−１５Ｈｃ、１８Ｈｃ、ｄｉ−１８Ｈｃ、halocidin、Magainin 1（Sigma）（比較群）及びｂufforin 2（Sigma）（比較群）のペプチド濃度による抗菌活性を測定した。
【００７３】
その結果、ＭＲＳＡ菌株に対するラジカル拡散分析では、抗菌活性が高いものと知られているBufforin 2は、濃度が増加するに従って透明環の直径が大きくなることによって抗菌活性があることが確認された。又、１８Ｈｃ、ｄｉ−１８Ｈｃ及びhalocidinは、濃度が増加するに従って前記Bufforin 2よりもさらに高い抗菌活性を有しており、特に、ｄｉ−１８Ｈｃの抗菌活性が最も高いことが認められた（図９Ａ及び図９Ｃ）。また、ＭＤＲＰＡに対するラジカル拡散分析では、抗菌活性が高いものと知られているMagainin 1及びBufforin 2はいずれも抗菌活性があり、１５Ｈｃ、ｄｉ−１５Ｈｃ、１８Ｈｃ、ｄｉ−１８Ｈｃ及びhalocidinはすべて比較群に近似する抗菌活性を示すか、またはより高い抗菌活性を示していることが認められた（図９Ｂ及び図９Ｄ）。
【００７４】
前記の結果に基づいて、アカボヤのhalocidinは抗菌活性が高く、特に、halocidin自体よりもhalocidinの構成要素である１５モノマー及び１８モノマーがホモダイマー型をなすペプチドが抗菌活性に優れていることを認めることができた。
【００７５】
＜３−２＞コロニー計数分析
本発明者等は、halocidinの抗菌活性を分析するために、コロニー計数分析を行った。具体的には、ペプチドの最終濃度が５μｇ／ｍｌとなるように、０．３μｇ／ｍｌのＴＳＢパウダーが含まれている滅菌された１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に入っている対数期中間部のＭＲＳＡまたはＭＤＲＰＡ菌株と共に混合した。この混合液は、最終容量が１００μｌとなるようにして３７℃振とう水槽で５分及び１５分間前反応させ、それぞれ前反応させた反応液２０μｌを取り出して１．５％Bacto agar（Difco）に塗布した。この塗布されたプレートを一夜の間反応させた後、プレート上に生成したコロニーの数を計数して抗菌活性を測定した。Magainin 1及びBufforin 2を比較群として用い、また対照群としてはペプチドの代わりに０．０１％酢酸を添加した。
【００７６】
その結果、ＭＲＳＡ及びＭＤＲＰＡ菌株に対して比較群及び対照群は、抗菌活性が殆ど現れないのに対して、１８Ｈｃ、ｄｉ−１８Ｈｃ及びhalocidinは、反応後５分目に抗菌活性が高く現れてから１５分まで持続された。又、抗菌活性はｄｉ−１８Ｈｃが最も高く現れ、その次に１８Ｈｃ及びhalocidinの順に抗菌活性が現れた（図１０）。この結果からして、halocidin自体よりもhalocidinの構成要素である１８Ｈｃのモノマー又はダイマー型が抗菌活性がさらに高いことを認めることができた。
【００７７】
＜３−３＞溶血分析
本発明者等は、halocidinの抗菌活性を分析するために、溶血分析を行った。具体的は、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５μｇ／ｍｌで希釈したペプチド２０μｌ及び２．５％（ｖ／ｖ）ヒト赤血球１８０μｌをＰＢＳに混合した。ここで、メリチン（Sigma）、強力な溶血活性を有するclavanin Aの残基が置換された活性物質であるclavanin AKを比較群として用い、０．０１％酢酸を対照群として用いた。前記混合液を３７℃で３０分間反応させた後、各管にＰＢＳ６００μｌを添加した。前記溶液を１０，０００ｇで３分間遠心分離して上澄液を分離した後、これを５４０ｎｍで吸光度を測定し、下記数学式１によって溶血活性（％）を計算した。
【００７８】
＜数学式１＞
【００７９】
その結果、ペプチドの溶血活性は、ｄｉ−１８Ｈｃが１８％、１８Ｈｃが９％、１５Ｈｃ、ｄｉ−１５Ｈｃ及びhalocidinが０％を示した（図１１）。従って、ｄｉ−１８Ｈｃの溶血活性が最も高いことが認められた。
【００８０】
＜３−４＞グラム陰性菌に対する抗菌活性の比較
本発明者等は、グラム陰性菌に対するhalocidinの抗菌活性をラジカル拡散分析で確認した。具体的には、グラム陰性菌であるPseudomonas aeruginosa、Salmonella cholerasuis、Salmonella parotyphi A、E.coli K112、及びE.coli DH5a菌株を用いて、１５Ｈｃ、１８Ｈｃ、及びhalocidinの抗菌活性を測定した。このとき、比較群としてBufforin 2及びMagainin 1を用いた。
【００８１】
その結果、１５Ｈｃ及び１８Ｈｃは、ペプチド濃度が増加しても抗菌活性が殆ど現れないかまたは微弱であるのに対して、halocidinは、比較群であるMagainin 1及びBufforin 2と殆ど近似するかまたは細菌の種類によってはさらに高い抗菌活性を示した（図１２）。
【００８２】
また、（１８−１）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−１）Ｈｃ、１８Ｈｃ、及びｄｉ−１８Ｈｃに対しても、前記と同様の方法で、ラジカル拡散分析を行った結果、細菌の種類によって差はあるが、全体として、ダイマー型であるｄｉ−（１８−１）Ｈｃ及びｄｉ−１８Ｈｃは、モノマー型である（１８−１）Ｈｃ及び１８Ｈｃに比べて高い抗菌活性を示した（図１３）。
【００８３】
また、（１８−２）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−２）Ｈｃ、（１８）Ｈｃｋ、及びｄｉ−（１８）Ｈｃｋに対しても、前記と同様の方法で、ラジカル拡散分析を行った結果、前記と同様、ダイマー型であるｄｉ−（１８−２）Ｈｃ及びｄｉ−１８Ｈｃｋが、モノマー型である（１８−２）Ｈｃ及び（１８）Ｈｃｋに比べて抗菌活性がさらに高く現れることが認められた（図１４）。
【００８４】
前記の結果に基づいて、halocidinは、グラム陰性菌に対して高い抗菌活性を示し、またhalocidinのサブユニットであるモノマーのそれぞれがダイマー型として存在するとき、抗菌活性が最も高く現れることが認められた。
【００８５】
＜３−５＞グラム陽性菌に対する抗菌活性の比較
本発明者等は、グラム陽性菌に対するhalocidinの抗菌活性をラジカル拡散分析で確認した。具体的には、グラム陽性菌であるStaphylococcus aureus、Micrococcus luteus、Enterococcus faecalis、Bacillus subtilus、及びＭＲＳＡに対して、１５Ｈｃ、１８Ｈｃ、halocidin、Bufforin 2、及びMagainin 1の抗菌活性を測定するために、前記実施例１と同様の方法でラジカル拡散分析を行った。
【００８６】
その結果、菌株によって差はあるが、全体としてhalocidinの抗菌活性が高く現れ、１５Ｈｃ及び１８Ｈｃは、抗菌活性が凡そ低く現れた（図１５）。
【００８７】
また、（１８−１）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−１）Ｈｃ、１８Ｈｃ、及びｄｉ−１８Ｈｃに対しても、前記と同様の方法でラジカル拡散分析を行った結果、細菌の種類によって差はあるが、全体的に、ダイマー型であるｄｉ−（１８−１）Ｈｃ及びｄｉ−１８Ｈｃは、モノマー型である（１８−１）Ｈｃ及び１８Ｈｃに比べて高い抗菌活性を示した（図１６）。
【００８８】
また、（１８−２）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−２）Ｈｃ、（１８）Ｈｃｋ、及びｄｉ−（１８）Ｈｃｋに対しても、前記と同様の方法でラジカル拡散分析を行った結果、前記と同様に、ダイマー型であるｄｉ−（１８−２）Ｈｃ及びｄｉ−（１８）Ｈｃｋが、モノマー型である（１８−２）Ｈｃ及び１８Ｈｃｋに比べて抗菌活性がさらに高く現れることが認められた（図１７）。
【００８９】
前記の結果からして、halocidinは、グラム陽性菌に対する抗菌活性が高く、またhalocidinのサブユニットであるモノマーのそれぞれがダイマー型として存在するとき、抗菌活性が最も高く現れることが認められた。
【００９０】
＜３−６＞ｐＨによる抗菌活性
本発明者等は、細菌に対して抗菌活性が優れていることを確認したhalocidinが、生体内の低いｐＨにおいても抗菌活性を示現するかを確認するために、ラジカル拡散分析によってｐＨの変化によるhalocidinの抗菌活性を測定した。具体的には、ｐＨを変化させる方法としては、栄養培地にＨＣｌを添加し、ｐＨメータで滴定して培地のｐＨを７．４、６．５、及び５．５に調整し、前記実施例１と同様の方法で、ＭＲＳＡ及びEnterococcus faecalis菌株に対してラジカル拡散分析を行った。
【００９１】
その結果、ｄｉ−１８Ｈｃ、ｄｉ−（１８−１）Ｈｃ、ｄｉ−ｋ（１８＋１）Ｈｃは、生体内の低いｐＨ環境である上皮組織、尿道、膣内環境のようなｐＨ５．５において、ｐＨ７．４におけると同様に、抗菌活性をそのまま維持していることが確認された（表４）。
【００９２】
【表４】
【００９３】
＜３−７＞塩に対する抗菌活性
本発明者等は、halocidinが有する抗菌活性が生体内での強塩基条件においても活性が有効であるかを確認しようとした。具体的には、栄養培地にＮａＣｌ１００ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、及びＮａＣｌ２００ｍＭを添加して、塩の条件を変更し、ＭＲＳＡ及びEnterococcus faecalis菌株を用いてラジカル拡散分析を行った。
【００９４】
その結果、ｄｉ−１８Ｈｃ、ｄｉ−（１８−１）Ｈｃ、ｄｉ−ｋ（１８＋１）Ｈｃは、高い塩環境である２００ｍＭでも、塩のない環境と同様の抗菌活性をそのまま維持していることが確認された（表５）。
【００９５】
【表５】
【００９６】
当業者であれば、前記実施例で開示された着想および特定の具体例が、本発明の同一目的を達成するためのほかの具体例を修正または設計するための基礎として容易に用いられることを明らかに理解可能であろう。また、当業者であれば、このような等価の具体例らが添付した特許請求範囲に開示した本発明の範囲から離脱しないことを理解されることは勿論である。
【産業上利用可能性】
【００９７】
前述のように、本発明のアカボヤから分離された抗菌ペプチドは強酸及び強塩基の条件下においても抗菌活性が優れ、耐性菌に対する抵抗性も強力で、天然抗生剤として有効に使用されることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌ペプチドに関し、より詳しくは、アカボヤから分離された抗菌活性に優れるペプチドに関する。本発明による抗菌ペプチドは、強酸及び強塩基の条件下でも抗菌活性に優れるともに、耐性菌に対しても強力な抗菌性を示す。従って、天然抗菌剤として有効に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
現代の免疫学研究分野において、記憶性と特異性を備える後天性免疫機序と比べて先天性免疫機序は、今まで注目されていなかった。しかし、次の点からみるとき、動物系の自己防御体制において先天性免疫が寄与する役割は極めて大きな比重を占めていると認められる。まず第一に、先天性免疫細胞は、皮膚や腸の上皮細胞を通じた微生物の侵入を源泉的に抑制する。第二に、血液や体液に侵入した病原体等は、先天性免疫細胞の食細胞作用(phagocytosis)で制御される。第三に、先天性免疫細胞は、特異性を有していないので、感染の直後、後天性免疫機序や食細胞作用が活性化される前に、様々な侵入微生物等の体液内での成長を優先的に抑制させる。
【０００３】
又、先天的免疫を担当する細胞は、上記の機能を果たすために簡単な無機化合物（Ｈ２О２及びＮОなど）、抗菌ペプチド及び蛋白質のような様々な抗菌物質などを利用する。前記抗菌ペプチドや蛋白質は、主に粘膜上皮細胞の表面、体液及び食細胞の細胞内小器官などに存在し、サイズ、構造及び活性において極めて多様なものと報告されているが（Hancock, R.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 8856-8861）、大部分は、微生物細胞膜の負電荷に対して相補的な正電荷を呈していることが共通的特徴であり、酵素活性を有する抗菌蛋白質は、主に細菌の膜を加水分解し、抗菌ペプチドもまた微生物に対する共通の標的部位は細胞膜であるものと解されている（Zhang, L. et al., J. Biol. Cheml., 2001, 276, 35714-35722）。このような作用機序は、抗菌ペプチドが既存の抗生剤の耐性菌株に対して効果的に用いられる新たなタイプの抗生剤として開発され得るという可能性を示している。なお、最近、化学合成抗生剤の過多使用によって発生する頻繁な耐性菌株の出現は、これら抗菌ペプチドに対する関心をさらに増大させている。
【０００４】
これまで発見された抗菌ペプチドは、両極性のα−へリックス構造と、ジスルフィド結合で安定した構造を形成しているβ−シート構造を有するものに大別することができる。システイン(cysteine)を有する抗菌ペプチドは、通常、２〜８個の偶数個システイン残基を有することによって、分子内のジスルフィド結合を形成することにより、構造を安定化させる場合が大部分である。表１は、β−シート構造の抗菌ペプチドを、分子内のシステイン残基の個数によって分類した内容を示している。
【０００５】
【表１】
【０００６】
抗菌ペプチドの作用機序と選択性は、細菌の膜と相互作用する方式によって異なる。一般に、ペプチドは、グラム陰性菌の表面上のＬＰＳ（lipopolysaccharide）と作用して自己刺激された摂取経路(uptake pathway)を通じて受け入れられる。この受け入れ過程の第１のステップは、ペプチドが細胞表面のＬＰＳに存在する二価カチオンの結合部位に作用することであり、第２のステップは、細胞膜に挿入されてチャンネルを形成することである。
【０００７】
前記第１のステップにおいて、ペプチドは、Ｍｎ＋＋またはＭｇ＋＋のような二価カチオンより少なくとも３倍以上高い親和力でＬＰＳに結合することができるため、競争的に二価カチオンを代替することができるので、外膜の正常的な細胞膜の特性を破壊させる。このような影響を受けた細菌細胞膜は、一時的に隙間が生じて疎水性物質、低分子蛋白質或いは抗生剤などが通過するようになり（Piers, K.L. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1994, 38, 2311-2316）、特にペプチド自体を受け入れる効果が増大される。
【０００８】
第２のステップにおいて、ペプチドが細胞膜に挿入されてチャンネルを形成する過程において、カチオンペプチドの磁気がアニオンの細菌細胞膜と作用すると、その次の作用として、疎水性部位は膜側に向き、親水性部位はチャンネルを形成するために内側を向くようになる（Hancock, R.E. et al., Adv. Microbial Physiol., 1995, 37, 135-175）。このとき、膜の電位差が大きく、アニオン脂質の量が多く、及びコレステロールの量が少ないほどチャンネルの形成が良好になり、膜構造が崩壊されて細菌が死滅するようになる（Falla, T. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 19298-19303）。これに対して、多量のコレステロールと少量のアニオン脂質を有している真核細胞の場合は、ペプチドが効果的に作用することができなくなり、細菌に対する高い選択的活性を有するようになる。このような理由のため、抗菌ペプチドは、細胞毒性の効果が極めて少ない抗生剤として注目されている。その他にも、抗菌ペプチドが新たな抗生剤として有している長所をまとめると次のとおりである。
【０００９】
１．病原体膜を物理的に破壊する作用機序によって耐性菌の出現を防ぐことができる。
２．迅速な作用機序によって細菌の生存サイクルよりも速く作用する。
３．既存抗生剤の耐性菌に対して効果的に作用する。
４．広範囲な抗菌スペクトルを有する。
５．ＬＰＳとの結合力によって抗−耐毒性の効果がある。
６．遺伝工学の工程を利用する大量生産が可能であるため、新薬製剤として開発する場合低コスト化が可能となる。
【００１０】
なお、動物系統分類学的側面において、後口動物に属するホヤ(tunicate)は、幼生時期に脊索と背部の管状神経索を有する特徴を示すことにより、原始脊索動物に分類される無脊椎動物である。従って、系統進化的な側面からみると、ホヤは脊椎動物直前の進化段階の動物群として分類されるので、このようなホヤの分類学的位置のため、ホヤは動物免疫体系の進化的起源を糾明するための好適な動物として考えられてきた。特に、ホヤの体腔(hemocoel)には脊椎動物の循環系から発見される好中球(granulocytes)とマクロファージ（大食細胞）と類似の形態と機能を有した多くの食細胞が存在していることが観察された（Bone, Q., The Origin of Chordates, 1979, 2nd edn）。現在まで、ホヤの体液細胞から抗菌ペプチドを確認しようとする研究が進められており、Styela clavaの体液細胞から分離されたclavanin（Lee, I.H. et al., FEBS Lett., 1997, 400, 158-162; Lee, I.H. et al., Infection and Immunity, 1997, 65, 2898-2903; Zhao, C. et al., FEBS Lett., 1997, 410, 490-492）及びstyelin（Lee I.H., et al., Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 1997, 118, 515-521; Zhao, C. et al., FEBS Lett., 1997, 412, 144-148）がホヤから発見された代表的な抗菌ペプチドである。
【００１１】
韓国内には、主に二種類のホヤが棲息しているものと知られている。これらは、南西海岸で主に自然棲息するか、または養殖されるHalocynthia roretziと、半島東海岸の束草（地名：韓国江原道）地域でのみ自然棲息しているアカボヤと呼ばれるHalocynthia aurantiumである。前者のホヤについては、既に多年間日本で多くの研究が進行されており、Halocyamineのような変形されたペプチド形態テトラペプチドの抗菌物質が存在するものと知られているが（Azumi, K. et al., Experientia, 1990, 46, 1066-1068; K. Azumi et al., Biochemistry, 1990, 29, 159-165）、Halocynthia aurantiumから抗菌ペプチドが分離されたという報告は未だ皆無の事情である。
【００１２】
ここで、本発明者等は、Halocynthia aurantiumを対象としてその体液細胞に存在する抗菌ペプチドを研究した結果、dicinthaurinと命名された抗菌ペプチドを分離し（Lee, I.H. et al., Biochem. Biophys. Acta, 2001, in press）、最近、また他の種類の抗菌ペプチドを分離し、その構造を分析して、前記ペプチドが抗菌活性に優れていることを確認することにより、本発明を完成するに至った。
【００１３】
【非特許文献１】Hancock, R. E.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,2000,97,8856-8861
【非特許文献２】Zhang, L. et al., J. Biol. Cheml., 2001, 276, 35714-35722
【非特許文献３】Piers, K.L. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1994, 38, 2311-2316
【非特許文献４】Hancock, R.E. et al., Adv. Microbial Physiol., 1995, 37, 135-175
【非特許文献５】Falla, T. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 19298-19303
【非特許文献６】Lee, I.H. et al., FEBS Lett., 1997, 400, 158-162
【非特許文献７】Lee, I.H. et al., Infection and Immunity, 1997, 65, 2898-2903
【非特許文献８】Zhao, C. et al., FEBS Lett., 1997, 410, 490-492
【非特許文献９】Lee I.H., et al., Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 1997, 118, 515-521
【非特許文献１０】Zhao, C. et al., FEBS Lett., 1997, 412, 144-148
【非特許文献１１】Azumi, K. et al., Experientia, 1990, 46, 1066-1068; K. Azumi et al., Biochemistry, 1990, 29, 159-165
【非特許文献１２】Lee, I.H. et al., Biochem. Biophys. Acta, 2001, in press
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本発明は、ホヤ被嚢動物の一種から分離した抗菌ペプチド及びこの抗菌ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤を提供することを目的とする。
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、ホヤの体液細胞から分離した抗菌ペプチド及びこの抗菌ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤を提供する。
【００１６】
以下、本発明について詳述する。
先ず、本発明は、ホヤの体液細胞から分離した抗菌ペプチドを提供する。
【００１７】
本発明の抗菌ペプチドは、ホヤから分離したものであって、前記ホヤはアカボヤと呼ばれるHalocynthia aurantiumであることが好ましい。しかし、必ずしもこれに限定されるものではなく、他の生物から分離、或いは人工的に合成してもよいことは、当業者においては自明のことである。
【００１８】
本発明は、下記の各文字で表現される１８個のアミノ酸配列を有する化学式１で表されるペプチドを提供する。
【００１９】
＜化学式１＞
【００２０】
前記式中、
Ｗは、トリプトファンまたはその誘導体であり、
Ｘは、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体であり、
Ｂは、アルギニン、リジン、ヒスチジンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体であり、
Ｂ’は、アルギニン、リジン、ヒスチジンからなる群またはアスパラギンとグルタミンからなる群より選択される一つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体であり、及び
Ｕは、グリシン、セリン、アラニン、トレオニンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体である。
【００２１】
より好ましくは、化学式１で表される本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｗがトリプトファン、Ｘがロイシン、イソロイシン、バリン、Ｂがアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、Ｕがアラニン、セリン、グリシン、及びＣがシステインからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２２】
最も好ましくは、化学式１で表される本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｗ１がトリプトファン、Ｘ２がロイシン、Ｂ’３がアスパラギン、Ｕ４がアラニン、Ｘ５がロイシン、Ｘ６がロイシン、Ｂ７がヒスチジン、Ｂ８がヒスチジン、Ｕ９がグリシン、Ｘ１０がロイシン、Ｂ’１１がアスパラギン、Ｃ１２がシステイン、Ｕ１３がアラニン、Ｂ１４がリジン、Ｕ１５がグリシン、Ｘ１６がバリン、Ｘ１７がロイシン、及びＵ１８がアラニンであることを特徴する。従って、前記ペプチドは、配列番号１で記載されるアミノ酸配列を有することが最も好ましい。
【００２３】
また、本発明は、前記化学式１で表されるペプチドのＮ−末端部位のアミノ酸配列の中３個（Ｗ１Ｘ２Ｂ’３）が失われた化学式２で表される１５個のアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。
【００２４】
＜化学式２＞
【００２５】
前記式中、
Ｘは、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体であり、
Ｂは、アルギニン、リジン、ヒスチジンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体であり、
Ｂ’は、アルギニン、リジン、ヒスチジンからなる群またはアスパラギンとグルタミンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体であり、及び
Ｕは、グリシン、セリン、アラニン、トレオニンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基またはその誘導体である。
【００２６】
より好ましくは、化学式２で表される本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｘがロイシン、イソロイシン、バリン、Ｂがアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、Ｕがアラニン、セリン、グリシン、及びＣがシステインからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２７】
最も好ましくは、化学式２で表される本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｕ４がアラニン、Ｘ５がロイシン、Ｘ６がロイシン、Ｂ７がヒスチジン、Ｂ８がヒスチジン、Ｕ９がグリシン、Ｘ１０がロイシン、Ｂ’１１がアスパラギン、Ｃ１２がシステイン、Ｕ１３がアラニン、Ｂ１４がリジン、Ｕ１５がグリシン、Ｘ１６がバリン、Ｘ１７がロイシン、及びＵ１８がアラニンであることを特徴とする。従って、前記ペプチドは、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有することが最も好ましい。
【００２８】
また、本発明は、前記化学式１で表されるペプチドのシステイン残基がジスルフィド結合されたダイマー型である次の化学式３で表されるペプチドを提供する。
【００２９】
＜化学式３＞
【００３０】
前記各文字で表現されるアミノ酸は、前記化学式１に記載のものと同一であり、前記ペプチドは、配列番号１で記載される２つのペプチドがそれぞれの１２番目のアミノ酸においてジスルフィド結合されることが最も好ましい。
【００３１】
また、本発明は、前記化学式２で表されるペプチドのシステイン残基がジスルフィド結合されたダイマー形である次の化学式４で表されるペプチドを提供する。
【００３２】
＜化学式４＞
【００３３】
前記各文字で表現されるアミノ酸は、前記化学式２に記載のものと同一であり、前記ペプチドは、配列番号２で記載される２つのペプチドがそれぞれの９番目のアミノ酸においてジスルフィド結合されることが最も好ましい。
また、本発明は、前記化学式１で表されるペプチド及び前記化学式２で表されるペプチドのシステイン残基が、ジスルフィド結合されたダイマー形である次の化学式５で表されるペプチドを提供する。
【００３４】
＜化学式５＞
【００３５】
前記各文字で表現されるアミノ酸は、前記化学式１及び化学式２に記載のものと同一であり、前記ペプチドは、配列番号１で記載されるペプチド配列の１２番目のアミノ酸と、配列番号２で記載されるペプチド配列の９番目のアミノ酸がジスルフィド結合されることが最も好ましい。
【００３６】
本発明の好適な実施例において、ホヤの体液細胞から前記化学式５で表されるペプチドを分離し、このペプチドが抗菌活性を有していることを確認して、これを「halocidin」(ハロシジン)と命名した。また、このhalocidinの構造を分析した結果、化学式１及び化学式２で表されるペプチドによって構成され、前記ペプチドのシステイン残基がジスルフィド結合からなることを確認した（図５参照）。ここで、前記化学式１で表されるペプチドを「１８Ｈｃ」と命名し、化学式２で表されるペプチドを「１５Ｈｃ」と命名した。次に、halocidinの特性を分析するために、前記化学式１または化学式２で表されるペプチドのそれぞれを用いてダイマー形態のペプチドを製造し、それぞれ化学式３または化学式４で表されるペプチドを製造した後、それぞれを「ｄｉ−１８Ｈｃ」または「ｄｉ−１５Ｈｃ」と命名した。
【００３７】
また、本発明では、合成１８Ｈｃにおいて、Ｃ−末端アミノ酸が１個除去されたペプチドを「（１８−１）Ｈｃ」、Ｃ−末端アミノ酸が２個除去されたペプチドを「（１８−２）Ｈｃ」と命名した。これと同様の方法で、Ｃ−末端アミノ酸がそれぞれ３〜６個除去されたペプチドをそれぞれ「（１８−３）Ｈｃ」、「（１８−４）Ｈｃ」、「（１８−５）Ｈｃ」、及び「（１８−６）Ｈｃ」と命名した。
【００３８】
また、ペプチド内のヒスチジン残基が全てリジンで置換されたペプチドである場合は、「Ｈｃｋ」と命名し、本発明のペプチドにおいて、Ｎ−末端にリジンが追加された場合は、ペプチドの前に「Ｋ」を追記し、追加されたリジンの個数だけの数字に（＋１）を追記して命名した。例えば、１８ＨｃのＮ−末端にリジンが１個追加された場合、「Ｋ（１８＋１）Ｈｃ」と命名した。
【００３９】
本発明において、分離及び製造した化学式１〜化学式５で表されるペプチドの質量を分析した結果、それぞれ１，９２９Ｄａ、１，５１６Ｄａ、３，８６１Ｄａ、３，０３１Ｄａ、及び３，４４５Ｄａ（表３参照）であった。特に、化学式５で表されるペプチドであるhalocidinのｐＩ値は８．９６５であり、ヘリカルホイール構造を有するヘテロダイマー形態のペプチドである（図８参照）。
【００４０】
本発明における化学式１〜化学式５で表されるペプチドの抗菌活性の有無を確認するために、ラジカル拡散分析（図９参照）、コロニー計数分析（図１０参照）、溶血分析（図１１参照）、グラム陰性菌株に対するラジカル拡散分析（図１２、図１３、図１４参照）、及びグラム陽性菌株に対するラジカル拡散分析（図１５、図１６、図１７参照）を行った結果、化学式１〜化学式５で表されるペプチドは、抗菌活性に優れ、中でもダイマー形態構造を有する化学式２、化学式４及び化学式５で表されるペプチドの活性がさらに優れており、化学式２で表されるペプチドの活性が最も優れていることをわかった。
【００４１】
また、抗菌活性を有する本発明のペプチドが苛酷な生体内においても抗菌活性が保持されるかを確認するために、上皮細胞、尿道、膣内環境のような生体内弱酸性のｐＨ５．５と、血液内の塩環境（ＮａＣｌ １５０ｍＭ）より高いＮａＣｌ２００ｍＭの条件においてペプチドの抗菌活性を測定した結果、化学式５で表されるペプチドは、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．４の条件下でも抗菌活性を示し（表４参照）、ＮａＣｌ １００ｍＭ〜ＮａＣｌ２００ｍＭ下においても抗菌活性を示していることを確認した（表５参照）。
【００４２】
前記の結果からして、化学式１〜化学式５で表される本発明のペプチドは、耐性菌株に対する抗菌活性が優れ、弱酸性のｐＨ及び強塩の条件下でも抗菌活性に優れているのが確認され、生体内においても優れた抗菌活性を有することにより、既存の抗生剤と比べて優秀な抗菌活性を有するペプチドであることが明らかになった。
【００４３】
また、本発明は、前記ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤を提供する。
【００４４】
上述したことから明らかなように、本発明のペプチドは、微生物に対する抗菌活性に優れ、生体内での苛酷な環境、すなわち、強酸、強塩基の条件においても抗菌活性に優れているので、耐性菌に対しても有効な抗菌剤として使用することができる。
【００４５】
以上のことによって、本発明のペプチドを有効成分として含有する抗菌剤を製造することができる。なお、本発明による抗菌剤は、臨床投与の場合、経口または非経口の投与が可能であり、一般的医薬品製剤の形態で使用することができる。
【００４６】
すなわち、本発明による抗菌剤は、実際の臨床投与の時、経口及び非経口の多様な剤形で投与することができ、製剤化の場合は、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形剤形には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形剤形は、一つ以上のhalocidinに少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、またはラクトース、ゼラチンなどを混合して調剤される。また、単なる賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤なども用いられる。経口投与のための液相製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などを挙げられるが、慣用される単純希釈剤の水、流動パラフィンの他に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水溶性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水溶性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性オイル、ethylolateのような注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、witepsol、マクロゴール、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセリンゼラチンなどが用いられる。
【００４７】
本発明の抗菌剤の有効容量は、０．５〜１ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇであり、一日２回投与されることができる。
【００４８】
本発明の抗菌剤は、抗微生物製剤または抗ウィルス製剤のような抗菌剤として広範囲に用いられ、適用可能な範囲は、植物、動物及び人間などに広く有害に作用するウィルス、グラム陽性菌、グラム陰性菌、カビ、酵母及び原生動物などに適用される。本発明の抗菌剤は、単独で用いられても、または用途に応じて他の抗生剤、例えば、エリスロマイシン、テトラサイクリン、アジトロマイシン、バンコマイシン、及びセファロスポリンなどと共に用いられてもよい。また、本発明による抗菌剤は、食品添加物、化粧品、軟膏または注射剤などとしても有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】アカボヤからhalocidinを精製する手順を示すＡＵ−ＰＡＧＥ写真であり、 レーン１：アカボヤ体液細胞の酸抽出物、 レーン２：セファデックスＧ−５０ゲルろ過カラムを通過した５１−８１番画分、 レーン３：Ｐｒｅｐ．ＡＵ−ＰＡＧＥを通過した３５−４５番画分、及び レーン４：ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製されたhalocidinできる。
【図２】halocidinを精製してＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣを行った結果を示すグラフであり、
【図３】精製されたhalocidinをトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した写真であり、 レーンＭ：標準分子量マーカー、 レーン１：天然halocidin、及び レーン２：ジチオスレイトール(dithiothreitol)で切断されたhalocidin
【図４】精製されたhalocidinをＭＡＬＤＩ質量分析したグラフであり、
【図５】halocidinの二つの構成要素の構造及びアミノ酸配列を示すものであり、
【図６】天然halocidinと合成halocidinでＲＰ−ＨＰＬＣを行ったグラフであり、 Ａ：１５Ｈｃ及び１８Ｈｃ、 Ｂ：ｄｉ−１５Ｈｃ、ｄｉ−１８Ｈｃ、及びhalocidin、 Ｃ：天然halocidin
【図７】１８Ｈｃを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（ピンク色線）、２０ｍＭ ＳＤＳのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（黒色線）、及び５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロエタノールの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（赤色線）に懸濁させて、ＣＤスペクトルを調査したグラフであり、 Ａ：１８Ｈｃ、Ｂ：ｄｉ−１８Ｈｃ、
【図８】halocidin（１８Ｈｃ）のヘリカルダイヤグラム（Ａ）及びｐＩ（Ｂ）を示す図であり、
【図９】ＭＲＳＡに対するペプチドのラジカル拡散分析の結果を示す写真（Ａ）とグラフ（Ｃ）、及びＭＤＲＰＡに対するペプチドのラジカル拡散分析の結果を示す写真（Ｂ）とグラフ（Ｄ）であり、 ａ：１５Ｈｃ、ｂ：ｄｉ−１５Ｈｃ、 ｃ：１８Ｈｃ、ｄ：ｄｉ−１８Ｈｃ、 ｅ：halocidin、ｆ：Magainin 1 ｇ：Bufforin 2
【図１０】ペプチドの抗菌活性をコロニー計数分析で示すグラフであり、
【図１１】ペプチドの溶血分析の結果を示すグラフであり、
【図１２】グラム陰性菌に対する１５Ｈｃ、１８Ｈｃ、halocidin、Bufforin 2、及びMagainin 1の抗菌活性を比較したグラフであり、 Ａ：Pseudomonas aeruginosa、 Ｂ：Salmonella cholerasuis、 Ｃ：Salmonella parotyphi A、 Ｄ：E.coli K112、及び Ｅ：E.coli DH5α
【図１３】グラム陰性菌に対する（１８−１）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−１）Ｈｃ、１８Ｈｃ、及びｄｉ−１８Ｈｃ の抗菌活性を比較したグラフであり、 Ａ：Pseudomonas aeruginosa、 Ｂ：Salmonella cholerasuis、 Ｃ：Salmonella parotyphi A、 Ｄ：E.coli K112、及び Ｅ：E.coli DH5α
【図１４】グラム陰性菌に対する（１８−２）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−２）Ｈｃ、（１８）Ｈｃｋ、及びｄｉ−（１８）Ｈｃｋの抗菌活性を比較したグラフであり、 Ａ：Pseudomonas aeruginosa、 Ｂ：Salmonella cholerasuis、 Ｃ：Salmonella parotyphi A、 Ｄ：E.coli K112、及び Ｅ：E.coli DH5a
【図１５】グラム陽性菌に対する１５Ｈｃ、１８Ｈｃ、halocidin、Bufforin 2、及びMagainin 1の抗菌活性を比較したグラフであり、 Ａ：Staphylococcus aureus、 Ｂ：Micrococcus luteus、 Ｃ：Enterococcus faecalis Ｄ：Bacillus subtilus、及び Ｅ：ＭＲＳＡ
【図１６】グラム陽性菌に対する（１８−１）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−１）Ｈｃ、１８Ｈｃ、及びｄｉ−１８Ｈｃの抗菌活性を比較したグラフであり、 Ａ：Staphylococcus aureus、 Ｂ：Micrococcus luteus、 Ｃ：Enterococcus faecalis Ｄ：Bacillus subtilus、及び Ｅ：ＭＲＳＡ
【図１７】グラム陽性菌に対する（１８−２）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−２）Ｈｃ、１８Ｈｃｋ、及びｄｉ−（１８）Ｈｃｋの抗菌活性を比較したグラフである。 Ａ：Staphylococcus aureus、 Ｂ：Micrococcus luteus、 Ｃ：Enterococcus faecalis Ｄ：Bacillus subtilus、及び Ｅ：ＭＲＳＡ
【００５０】
以下、本発明の現実的に好適な具体例を以降の実施例に基づいて説明する。ただし、本発明は下記の実施例に限定されないとともに、当業者であれば、下記の実施例から、本発明の範囲内で多様な変形や改良が可能であることは言うまでもない。
【実施例１】
【００５１】
実施例１：アカボヤから抗菌ペプチドの分離
＜１−１＞アカボヤから酸抽出物の分離
韓国江原道束草市の魚市場で購入したアカボヤと呼ばれるHalocynthia aurantium(以下、アカボヤ又は、ホヤと略記する)を生の状態で７０％エタノールで表皮を洗浄し乾燥させた。乾燥させたホヤの出水口を横切りに切開し、１５０ｍｇＥＤＴＡ入りの５０ｍｌ管に入れて、体液である血リンパを集めた。得られた血リンパを７４μｍポアサイズのメッシュフィルタ（Netwell, Corning Costar, Cambridge, MA, USA）を通過させて不純物を除去した後、４℃の３０分間３００ｇで遠心分離した。遠心分離後、沈殿された体液細胞である血球(hemocyte)を３０ｍｌの０．３４Ｍスクロースに懸濁させた後、４℃の３０分間３００ｇで遠心分離した。遠心分離後、形成された細胞層を分離して１０ｍｌの冷却された５％酢酸に懸濁させた。この懸濁液を１５秒間５回の超音波処理した後、５％酢酸４０ｍｌを添加した。前記酢酸で抽出された溶液を４℃で一夜混合した後、４℃で３０分間２０，０００ｇで遠心分離した。この遠心分離の後、得られた上澄液を、抗菌ペプチドを精製するための試料物質として用いた。
【００５２】
このようにして得られたアカボヤの酸抽出物は、ビシンコニン酸（Sigma）を用いて蛋白質定量し、最小５０ｍｇの蛋白質を含む上澄液を５％酢酸で平衡されたセファデックスＧ−５０ゲルろ過カラム（Sigma）にロードして溶出された各画分を得た。
【００５３】
＜１−２＞アカボヤの酸抽出画分の抗菌活性の測定
本発明者等は、前記実施例＜１−１＞で得られたアカボヤの酸抽出画分の抗菌活性を測定するために、超高感度の放射状拡散分析を行った。より具体的に説明すれば、前記実施例＜１−１＞で溶出した各画分１５０個を５回単位で分析した。各画分２ｍｌから１００μｌを取って真空回転濃縮機（vacuum centrifugation：Centra Evaporator, Bioneer, Korea）において濃縮させた後、０．０１％酢酸溶液５μｌに懸濁させた。一方、滅菌されたリン酸クエン酸緩衝液（９ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）、１％（ｗ／ｖ）１型アガロース（低電気浸透アガロース）（Ａ６０１３、Sigma）及び３％トリプシン大豆培養液（ＴＳＢ、Difco, Detroit, MI, USA）を成分とするゲルに、対数期中間部のメチシリン抵抗性菌株黄色ブドウ球菌（methicilin resistance Stapyhlococcus aureus、以下、「ＭＲＳＡ」という、韓国ソウル女子大学校ＣＣＡＲＭ３００１）を含ませ、直径３ｍｍのウェルを含むアガロースプレートを作った。前記の段階で細菌が含まれたアガロースプレートのウェルに前記製造した画分をロードした。前記ペプチドがアガロースゲル中に拡散されるように３時間の間反応させた後、６％ＴＳＢ及び１％アガロースゲルで構成された高栄養培地１０ｍｌを注入した。前記プレートを一夜培養して生存する細菌のコロニーが形成されるようにした。抗菌活性は、ロードしたペプチド画分の周辺に形成された透明環(clearing zone)の直径によって測定した。
【００５４】
その結果、５１−８１番ペプチド画分周辺の透明環のサイズが最も大きいことから抗菌活性が高いことが認められた。
【００５５】
＜１−３＞抗菌活性を有する画分からのペプチドの精製
本発明者等は、前記実施例＜１−２＞で得られた抗菌活性の高いペプチド画分をさらに精製するために、分離用酸尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「Ｐｒｅｐ ＡＵ−ＰＡＧＥ」という）に、前段階において抗菌活性を確認した５１−８１番画分を真空回転濃縮機で濃縮し、ロードした。前記Ｐｒｅｐ ＡＵ−ＰＡＧＥの流速は６０ｍｌ／時間とし、２ｍｌを1画分とした。
【００５６】
前記Ｐｒｅｐ ＡＵ−ＰＡＧＥ画分を２ｍｌの管に入れて真空回転濃縮機で濃縮した。各画分を１０回単位の間隔で二つのＡＵ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動した。一方のゲルはバンドを確認するために、Coomasie blueで染色し、他方のゲルはＭＲＳＡを用いて ゲル重層分析で蛋白質バンドの抗菌活性を確認した。ゲル重層分析は、ＭＲＳＡが含まれた下層寒天の１０ｍｌに電気泳動したゲルをロードし、前記ペプチドがアガロースゲル中に拡散するように３７℃で３時間の間反応させた後、高栄養培地（６％ＴＳＢ及び１％アガロースゲル）１０ｍｌを注入した。
【００５７】
その結果、３５−４５番画分に含まれた蛋白質が抗菌活性を示した（図１）。
【００５８】
上記において抗菌活性が確認された３５−４５番画分を全部集めて、最後の精製段階としてＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＲＰ−ＨＰＬＣ」という）カラム（Vydac 218TP54：The Separation Group, Hesperia, CA）にロードした。サンプルをロードした後、最初の１０分間は０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５％アセトニトリルを０．５ｍｌ／分の速度で流してカラムを洗浄した後、アセトニトリルの濃度を６０分間、１分当たり１％ずつ増加させた。上記のプロセスの間、アセトニトリルの各濃度別に出るピーク画分を収去した。収去した各画分の１０％を真空回転濃縮機で濃縮して放射状拡散分析で抗菌活性を確認した。
【００５９】
その結果、アセトニトリル４５．２％である５０．２分で分離されるペプチドが抗菌活性を保有していることが認められ、これを「ハロシジン」と命名した（図２）。
【実施例２】
【００６０】
実施例２：精製されたhalocidinの特性分析
＜２−１＞halocidinの質量分析
本発明者等は、前記実施例１において、アカボヤから分離した抗菌活性の有る新規のペプチドであるhalocidinの特性を分析するために、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）及びＡＵ−ＰＡＧＥにより分析した。具体的には、前記実施例１において分離した抗菌活性の有るペプチドであるhalocidinを凍結乾燥させた後、８Ｍ尿素２５μｌ及び０．４Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）２５μｌを添加して溶解し、４５ｍＭジチオスレイトールを添加し５０℃で１５分間反応させた。halocidinモノマーのビニルピリジン誘導体を取り出すために、前記halocidin混合物にビニルピリジン１５μｌを添加して室温で冷却させ、少なくとも３０分間暗所で反応させた。最終の反応産物はＲＰ−ＨＰＬＣで抽出した。この抽出物が良好に抽出されているか否かを確認するために、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＵ−ＰＡＧＥで分析し、分離されたhalocidinの正確な分子量を測定するために、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザーイオン化）質量分析計（Voyager-DE STR, PerSeptive Biosystems, USA）を用いて測定し、アミノ酸配列を分析するために、Procise 419（Applied Biosystems, USA）を用いて気相エドマン分解法によってそれぞれを分析した。
【００６１】
その結果、ＲＰ−ＨＰＬＣで抽出されたhalocidin及びジチオスレイトールによって切断されたhalocidinモノマーは、それぞれ約３．４ｋＤａ及び１．５と１．８ｋＤａの質量を有することが確認され（図３）、halocidinは、３４４３．６８３６ｍ／ｚで大ピークが現れ、１５１５．７４８７ｍ／ｚ及び１９２９．９１５１ｍ／ｚで小ピークが現れることが認められた（図４）。また、１８個のアミノ酸配列からなるモノマー及び１５個のアミノ酸配列からなるモノマーのシステイン残基がジスルフィド結合をなす構造を有していることが認められた（図５）。
【００６２】
前記の結果からアカボヤから分離した抗菌活性を示すペプチドであるhalocidinは、分子量が３，４４３．７Ｄａであり、１５モノマー及び１８モノマーからなり、前記モノマーのシステイン残基がジスルフィド結合された構造を有することが認められた。ここで、本発明者等は、halocidinを構成する１８モノマー及び１５モノマーをそれぞれ「１８Ｈｃ」及び「１５Ｈｃ」と命名した。
【００６３】
＜２−２＞合成halocidinの調剤及びアカボヤhalocidinとの質量比較
本発明者等は、halocidinが１５Ｈｃ及び１８Ｈｃからなることを確認し、その特性を比較、分析するために、合成ペプチドを製造した。具体的には、合成halocidinモノマーは、自動固相ペプチド合成装置（Pioneer, Applied Biosystems, USA）を用いて人工的に合成し、ＲＰ−ＨＰＬＣで再分離した。１５モノマー及び１８モノマーによって構成されたホモダイマー（以下、「ｄｉ」と略記する）型またはヘテロダイマー（一名、halocidin）型のペプチドは、１ｍｇ／ｍｌの合成ペプチドのそれぞれを０．１Ｍ重炭酸アンモニウムに混合し、その混合液を７２時間以上空気中に放置して合成した。最後に、合成されたhalocidinモノマー、ホモダイマー及びヘテロダイマーは、ＭＡＬＤＩ質量分析計で分子量を測定し、合成halocidinが良好に合成されたか否かを確認した。
合成されたペプチドモノマーの配列は、下記の表２の通りである。
【００６４】
【表２】
【００６５】
この結果、アカボヤのhalocidinと合成halocidinの予想質量とＭＡＬＤＩで測定した質量が一致することが確認された（表３）。
【００６６】
【表３】
【００６７】
＜２−３＞アカボヤのhalocidinと合成halocidinの溶出ピークの比較
本発明者等は、前記実施例＜２−２＞において質量が近似していることを確認した合成halocidin及びアカボヤのhalocidinが溶出されるピークを再確認するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを行った。具体的には、アセトニトリルで抽出したアカボヤのhalocidinを含む溶液を用いて、１０分間アセトニトリル５％を流した後、グラジエントを１分／ｍｌでかけながら、時間別に溶出される画分を測定した。その結果、二つのアカボヤのモノマー（１５Ｈｃ及び１８Ｈｃ）は、それぞれアセトニトリル３６．８％と４６．３％である４２分と５２分で溶出された（図６Ａ）。また、二つのホモダイマーであるｄｉ−１５Ｈｃ及びｄｉ−１８Ｈｃは、それぞれアセトニトリル３９．２％及び５１．７％で溶出され、halocidinの構造をなすヘテロダイマーは、天然halocidinが溶出されるアセトニトリル濃度（図６Ｃ）と同一に溶出された（図６Ｂ）。
【００６８】
＜２−４＞halocidinの２次構造の糾明
本発明者等は、halocidinの２次構造を糾明するために、halocidinのＣＤスペクトルを調べた。具体的には、１８Ｈｃとｄｉ−１８Ｈｃを用いて通過長さ１ｍｍの矩形セルを使用し、２５℃でリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ＳＤＳのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、及び５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロエタノールの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にそれぞれ懸濁させて、ＣJ−７１５ＣＤ／ＯＲＤ分光偏光計（JASCO., CO.）で円偏光二色性スペクトルを測定した。
【００６９】
その結果、１８Ｈｃとｄｉ−１８Ｈｃは、２０ｍＭ ＳＤＳのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）及び５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロエタノールの１０ｍＭリン酸緩衝液中で２０８ｎｍ及び２２２ｎｍにおいて二つの最小値を有し、１９３ｎｍにおいて最大値を有するα−へリックス構造を有していることが認められた（図７）。
【００７０】
＜２−５＞ヘリカルホイールダイヤグラム及びｐＩの測定
本発明者等は、halocidinの特性をさらに具体的に確認するために、ANTHEPROT 2000 V5.2ソフトウェアを用いてヘリカルホイールダイヤグラム（Ａ）及びｐＩを測定した。その結果、１８Ｈｃは、ヘリカルホイール構造を有し、極性と非極性残基の明らかなクラスタリング(clustering)を有して両親和性を有していることが認められた（図８Ａ）。また、ｐＨ変化による１８Ｈｃの電荷を測定した結果、１８ＨｃのｐＩ値は、８．９６５であることが認められた（図８Ｂ）。
【実施例３】
【００７１】
実施例３：halocidinの抗菌活性分析
本発明者等は、アカボヤから分離してその特性を糾明した新規の抗菌ペプチドであるhalocidinの抗菌活性を分析するために、超高感度の放射状拡散分析、コロニー計数分析、溶血分析、及びグラム陽性菌またはグラム陰性菌に対する抗菌活性を分析した。
【００７２】
＜３−１＞超高感度の放射状拡散分析
本発明者等は、実施例＜２−２＞で調剤した合成halocidinを用いて超高感度の放射状拡散分析を行った。具体的には、前記実施例＜１−２＞と同様にして、ＭＲＳＡ及び多剤抗生剤耐性のPseudomonas aeruginosa（以下、「ＭＤＲＰＡ」という）（韓国ソウル女子大学校ＣＣＡＲＭ２００２）菌株に対して１５Ｈｃ、ｄｉ−１５Ｈｃ、１８Ｈｃ、ｄｉ−１８Ｈｃ、halocidin、Magainin 1（Sigma）（比較群）及びｂufforin 2（Sigma）（比較群）のペプチド濃度による抗菌活性を測定した。
【００７３】
その結果、ＭＲＳＡ菌株に対するラジカル拡散分析では、抗菌活性が高いものと知られているBufforin 2は、濃度が増加するに従って透明環の直径が大きくなることによって抗菌活性があることが確認された。又、１８Ｈｃ、ｄｉ−１８Ｈｃ及びhalocidinは、濃度が増加するに従って前記Bufforin 2よりもさらに高い抗菌活性を有しており、特に、ｄｉ−１８Ｈｃの抗菌活性が最も高いことが認められた（図９Ａ及び図９Ｃ）。また、ＭＤＲＰＡに対するラジカル拡散分析では、抗菌活性が高いものと知られているMagainin 1及びBufforin 2はいずれも抗菌活性があり、１５Ｈｃ、ｄｉ−１５Ｈｃ、１８Ｈｃ、ｄｉ−１８Ｈｃ及びhalocidinはすべて比較群に近似する抗菌活性を示すか、またはより高い抗菌活性を示していることが認められた（図９Ｂ及び図９Ｄ）。
【００７４】
前記の結果に基づいて、アカボヤのhalocidinは抗菌活性が高く、特に、halocidin自体よりもhalocidinの構成要素である１５モノマー及び１８モノマーがホモダイマー型をなすペプチドが抗菌活性に優れていることを認めることができた。
【００７５】
＜３−２＞コロニー計数分析
本発明者等は、halocidinの抗菌活性を分析するために、コロニー計数分析を行った。具体的には、ペプチドの最終濃度が５μｇ／ｍｌとなるように、０．３μｇ／ｍｌのＴＳＢパウダーが含まれている滅菌された１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に入っている対数期中間部のＭＲＳＡまたはＭＤＲＰＡ菌株と共に混合した。この混合液は、最終容量が１００μｌとなるようにして３７℃振とう水槽で５分及び１５分間前反応させ、それぞれ前反応させた反応液２０μｌを取り出して１．５％Bacto agar（Difco）に塗布した。この塗布されたプレートを一夜の間反応させた後、プレート上に生成したコロニーの数を計数して抗菌活性を測定した。Magainin 1及びBufforin 2を比較群として用い、また対照群としてはペプチドの代わりに０．０１％酢酸を添加した。
【００７６】
その結果、ＭＲＳＡ及びＭＤＲＰＡ菌株に対して比較群及び対照群は、抗菌活性が殆ど現れないのに対して、１８Ｈｃ、ｄｉ−１８Ｈｃ及びhalocidinは、反応後５分目に抗菌活性が高く現れてから１５分まで持続された。又、抗菌活性はｄｉ−１８Ｈｃが最も高く現れ、その次に１８Ｈｃ及びhalocidinの順に抗菌活性が現れた（図１０）。この結果からして、halocidin自体よりもhalocidinの構成要素である１８Ｈｃのモノマー又はダイマー型が抗菌活性がさらに高いことを認めることができた。
【００７７】
＜３−３＞溶血分析
本発明者等は、halocidinの抗菌活性を分析するために、溶血分析を行った。具体的は、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５μｇ／ｍｌで希釈したペプチド２０μｌ及び２．５％（ｖ／ｖ）ヒト赤血球１８０μｌをＰＢＳに混合した。ここで、メリチン（Sigma）、強力な溶血活性を有するclavanin Aの残基が置換された活性物質であるclavanin AKを比較群として用い、０．０１％酢酸を対照群として用いた。前記混合液を３７℃で３０分間反応させた後、各管にＰＢＳ６００μｌを添加した。前記溶液を１０，０００ｇで３分間遠心分離して上澄液を分離した後、これを５４０ｎｍで吸光度を測定し、下記数学式１によって溶血活性（％）を計算した。
【００７８】
＜数学式１＞
【００７９】
その結果、ペプチドの溶血活性は、ｄｉ−１８Ｈｃが１８％、１８Ｈｃが９％、１５Ｈｃ、ｄｉ−１５Ｈｃ及びhalocidinが０％を示した（図１１）。従って、ｄｉ−１８Ｈｃの溶血活性が最も高いことが認められた。
【００８０】
＜３−４＞グラム陰性菌に対する抗菌活性の比較
本発明者等は、グラム陰性菌に対するhalocidinの抗菌活性をラジカル拡散分析で確認した。具体的には、グラム陰性菌であるPseudomonas aeruginosa、Salmonella cholerasuis、Salmonella parotyphi A、E.coli K112、及びE.coli DH5a菌株を用いて、１５Ｈｃ、１８Ｈｃ、及びhalocidinの抗菌活性を測定した。このとき、比較群としてBufforin 2及びMagainin 1を用いた。
【００８１】
その結果、１５Ｈｃ及び１８Ｈｃは、ペプチド濃度が増加しても抗菌活性が殆ど現れないかまたは微弱であるのに対して、halocidinは、比較群であるMagainin 1及びBufforin 2と殆ど近似するかまたは細菌の種類によってはさらに高い抗菌活性を示した（図１２）。
【００８２】
また、（１８−１）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−１）Ｈｃ、１８Ｈｃ、及びｄｉ−１８Ｈｃに対しても、前記と同様の方法で、ラジカル拡散分析を行った結果、細菌の種類によって差はあるが、全体として、ダイマー型であるｄｉ−（１８−１）Ｈｃ及びｄｉ−１８Ｈｃは、モノマー型である（１８−１）Ｈｃ及び１８Ｈｃに比べて高い抗菌活性を示した（図１３）。
【００８３】
また、（１８−２）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−２）Ｈｃ、（１８）Ｈｃｋ、及びｄｉ−（１８）Ｈｃｋに対しても、前記と同様の方法で、ラジカル拡散分析を行った結果、前記と同様、ダイマー型であるｄｉ−（１８−２）Ｈｃ及びｄｉ−１８Ｈｃｋが、モノマー型である（１８−２）Ｈｃ及び（１８）Ｈｃｋに比べて抗菌活性がさらに高く現れることが認められた（図１４）。
【００８４】
前記の結果に基づいて、halocidinは、グラム陰性菌に対して高い抗菌活性を示し、またhalocidinのサブユニットであるモノマーのそれぞれがダイマー型として存在するとき、抗菌活性が最も高く現れることが認められた。
【００８５】
＜３−５＞グラム陽性菌に対する抗菌活性の比較
本発明者等は、グラム陽性菌に対するhalocidinの抗菌活性をラジカル拡散分析で確認した。具体的には、グラム陽性菌であるStaphylococcus aureus、Micrococcus luteus、Enterococcus faecalis、Bacillus subtilus、及びＭＲＳＡに対して、１５Ｈｃ、１８Ｈｃ、halocidin、Bufforin 2、及びMagainin 1の抗菌活性を測定するために、前記実施例１と同様の方法でラジカル拡散分析を行った。
【００８６】
その結果、菌株によって差はあるが、全体としてhalocidinの抗菌活性が高く現れ、１５Ｈｃ及び１８Ｈｃは、抗菌活性が凡そ低く現れた（図１５）。
【００８７】
また、（１８−１）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−１）Ｈｃ、１８Ｈｃ、及びｄｉ−１８Ｈｃに対しても、前記と同様の方法でラジカル拡散分析を行った結果、細菌の種類によって差はあるが、全体的に、ダイマー型であるｄｉ−（１８−１）Ｈｃ及びｄｉ−１８Ｈｃは、モノマー型である（１８−１）Ｈｃ及び１８Ｈｃに比べて高い抗菌活性を示した（図１６）。
【００８８】
また、（１８−２）Ｈｃ、ｄｉ−（１８−２）Ｈｃ、（１８）Ｈｃｋ、及びｄｉ−（１８）Ｈｃｋに対しても、前記と同様の方法でラジカル拡散分析を行った結果、前記と同様に、ダイマー型であるｄｉ−（１８−２）Ｈｃ及びｄｉ−（１８）Ｈｃｋが、モノマー型である（１８−２）Ｈｃ及び１８Ｈｃｋに比べて抗菌活性がさらに高く現れることが認められた（図１７）。
【００８９】
前記の結果からして、halocidinは、グラム陽性菌に対する抗菌活性が高く、またhalocidinのサブユニットであるモノマーのそれぞれがダイマー型として存在するとき、抗菌活性が最も高く現れることが認められた。
【００９０】
＜３−６＞ｐＨによる抗菌活性
本発明者等は、細菌に対して抗菌活性が優れていることを確認したhalocidinが、生体内の低いｐＨにおいても抗菌活性を示現するかを確認するために、ラジカル拡散分析によってｐＨの変化によるhalocidinの抗菌活性を測定した。具体的には、ｐＨを変化させる方法としては、栄養培地にＨＣｌを添加し、ｐＨメータで滴定して培地のｐＨを７．４、６．５、及び５．５に調整し、前記実施例１と同様の方法で、ＭＲＳＡ及びEnterococcus faecalis菌株に対してラジカル拡散分析を行った。
【００９１】
その結果、ｄｉ−１８Ｈｃ、ｄｉ−（１８−１）Ｈｃ、ｄｉ−ｋ（１８＋１）Ｈｃは、生体内の低いｐＨ環境である上皮組織、尿道、膣内環境のようなｐＨ５．５において、ｐＨ７．４におけると同様に、抗菌活性をそのまま維持していることが確認された（表４）。
【００９２】
【表４】
【００９３】
＜３−７＞塩に対する抗菌活性
本発明者等は、halocidinが有する抗菌活性が生体内での強塩基条件においても活性が有効であるかを確認しようとした。具体的には、栄養培地にＮａＣｌ１００ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、及びＮａＣｌ２００ｍＭを添加して、塩の条件を変更し、ＭＲＳＡ及びEnterococcus faecalis菌株を用いてラジカル拡散分析を行った。
【００９４】
その結果、ｄｉ−１８Ｈｃ、ｄｉ−（１８−１）Ｈｃ、ｄｉ−ｋ（１８＋１）Ｈｃは、高い塩環境である２００ｍＭでも、塩のない環境と同様の抗菌活性をそのまま維持していることが確認された（表５）。
【００９５】
【表５】
【００９６】
当業者であれば、前記実施例で開示された着想および特定の具体例が、本発明の同一目的を達成するためのほかの具体例を修正または設計するための基礎として容易に用いられることを明らかに理解可能であろう。また、当業者であれば、このような等価の具体例らが添付した特許請求範囲に開示した本発明の範囲から離脱しないことを理解されることは勿論である。
【産業上利用可能性】
【００９７】
前述のように、本発明のアカボヤから分離された抗菌ペプチドは強酸及び強塩基の条件下においても抗菌活性が優れ、耐性菌に対する抵抗性も強力で、天然抗生剤として有効に使用されることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被嚢類動物から分離され、下記化学式１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記各アミノ酸は各文字で表されるペプチド；
＜化学式１＞
前記式中、
Ｗは、トリプトファンまたはその誘導体；
Ｘは、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体；
Ｂは、アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体；
Ｂ’は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群、またはアスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体；及び
Ｕは、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体。
【請求項２】
前記被嚢類動物がアカボヤ（Halocynthia aurantium）であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記Ｗがトリプトファンであり、Ｘがロイシン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択される１種であり、Ｂがアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンからなる群から選択される１種であり、Ｕがアラニン、セリン、およびグリシンからなる群から選択される１種であり、Ｃがシステインであることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列からなり、Ｗ１がトリプトファン、Ｘ２がロイシン、Ｂ’３がアスパラギン、Ｕ４がアラニン、Ｘ５がロイシン、Ｘ６がロイシン、Ｂ７がヒスチジン、Ｂ８がヒスチジン、Ｕ９がグリシン、Ｘ１０がロイシン、Ｂ’１１がアスパラギン、Ｃ１２がシステイン、Ｕ１３がアラニン、Ｂ１４がリジン、Ｕ１５がグリシン、Ｘ１６がバリン、Ｘ１７がロイシン、及びＵ１８がアラニンであることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記化学式１で表されるペプチドから３個のアミノ酸（Ｗ１Ｘ２Ｂ’３）が失われた、下記化学式２で表されるアミノ酸配列で構成されるペプチド；
＜化学式２＞
前記式中、
Ｕはグリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体；
Ｘはチロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体；
Ｂはアルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体；及び
Ｂ’はアルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群、またはアスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、およびその誘導体。
【請求項６】
Ｘがロイシン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｂがアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンからなる群から選択され、Ｕがアラニン、セリン、およびグリシンからなる群から選択され、Ｃがシステインであることを特徴とする、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが配列番号２で表されるアミノ酸配列からなり、Ｕ４がアラニン、Ｘ５がロイシン、Ｘ６がロイシン、Ｂ７がヒスチジン、Ｂ８がヒスチジン、Ｕ９がグリシン、Ｘ１０がロイシン、Ｂ’１１がアスパラギン、Ｃ１２がシステイン、Ｕ１３がアラニン、Ｂ１４がリジン、Ｕ１５がグリシン、Ｘ１６がバリン、Ｘ１７がロイシン、Ｕ１８がアラニンであることを特徴とする、請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１による化学式１で表されるペプチド及び請求項５による化学式２で表されるペプチドが、システイン位でジスルフィド結合される、化学式３で表されるペプチド；
＜化学式３＞
【請求項９】
請求項１による化学式１で表される２個のペプチドが、システイン位でジスルフィド結合される、化学式４で表されるペプチド；
＜化学式４＞
【請求項１０】
請求項５による化学式２で表される２個のペプチドが、システイン位でジスルフィド結合される、化学式５で表されるペプチド；
＜化学式５＞
【請求項１１】
化学式１〜化学式５で表される化合物からなる群から選択される１つ以上のペプチドを有効成分として含有する抗菌剤。
【請求項１】
被嚢類動物から分離され、下記化学式１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記各アミノ酸は各文字で表されるペプチド；
＜化学式１＞
前記式中、
Ｗは、トリプトファンまたはその誘導体；
Ｘは、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体；
Ｂは、アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体；
Ｂ’は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群、またはアスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体；及び
Ｕは、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体。
【請求項２】
前記被嚢類動物がアカボヤ（Halocynthia aurantium）であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記Ｗがトリプトファンであり、Ｘがロイシン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択される１種であり、Ｂがアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンからなる群から選択される１種であり、Ｕがアラニン、セリン、およびグリシンからなる群から選択される１種であり、Ｃがシステインであることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列からなり、Ｗ１がトリプトファン、Ｘ２がロイシン、Ｂ’３がアスパラギン、Ｕ４がアラニン、Ｘ５がロイシン、Ｘ６がロイシン、Ｂ７がヒスチジン、Ｂ８がヒスチジン、Ｕ９がグリシン、Ｘ１０がロイシン、Ｂ’１１がアスパラギン、Ｃ１２がシステイン、Ｕ１３がアラニン、Ｂ１４がリジン、Ｕ１５がグリシン、Ｘ１６がバリン、Ｘ１７がロイシン、及びＵ１８がアラニンであることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記化学式１で表されるペプチドから３個のアミノ酸（Ｗ１Ｘ２Ｂ’３）が失われた、下記化学式２で表されるアミノ酸配列で構成されるペプチド；
＜化学式２＞
前記式中、
Ｕはグリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体；
Ｘはチロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体；
Ｂはアルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、またはその誘導体；及び
Ｂ’はアルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群、またはアスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基、およびその誘導体。
【請求項６】
Ｘがロイシン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｂがアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンからなる群から選択され、Ｕがアラニン、セリン、およびグリシンからなる群から選択され、Ｃがシステインであることを特徴とする、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが配列番号２で表されるアミノ酸配列からなり、Ｕ４がアラニン、Ｘ５がロイシン、Ｘ６がロイシン、Ｂ７がヒスチジン、Ｂ８がヒスチジン、Ｕ９がグリシン、Ｘ１０がロイシン、Ｂ’１１がアスパラギン、Ｃ１２がシステイン、Ｕ１３がアラニン、Ｂ１４がリジン、Ｕ１５がグリシン、Ｘ１６がバリン、Ｘ１７がロイシン、Ｕ１８がアラニンであることを特徴とする、請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１による化学式１で表されるペプチド及び請求項５による化学式２で表されるペプチドが、システイン位でジスルフィド結合される、化学式３で表されるペプチド；
＜化学式３＞
【請求項９】
請求項１による化学式１で表される２個のペプチドが、システイン位でジスルフィド結合される、化学式４で表されるペプチド；
＜化学式４＞
【請求項１０】
請求項５による化学式２で表される２個のペプチドが、システイン位でジスルフィド結合される、化学式５で表されるペプチド；
＜化学式５＞
【請求項１１】
化学式１〜化学式５で表される化合物からなる群から選択される１つ以上のペプチドを有効成分として含有する抗菌剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００６−５１８７０６（Ｐ２００６−５１８７０６Ａ）
【公表日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５５０７３（Ｐ２００４−５５５０７３）
【出願日】平成１４年１１月２２日（２００２．１１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００２／００２１９５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８４０７
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１４年６月１９日Ｗｏｏｎｇ Ｓｉｋ Ｊａｎｇ，Ｋｙｕ Ｎａｍ Ｋｉｍ，Ｙｏｕｎｇ Ｓｈｉｎ Ｌｅｅ，Ｍｙｕｎｇ Ｈｅｅ Ｎａｍ，Ｉｎ Ｈｅｅ Ｌｅｅ発表の「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ」に発表
【出願人】（５０５１８８７３３）
【出願人】（５０５１８８７４４）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１４年１１月２２日（２００２．１１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００２／００２１９５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８４０７
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１４年６月１９日Ｗｏｏｎｇ Ｓｉｋ Ｊａｎｇ，Ｋｙｕ Ｎａｍ Ｋｉｍ，Ｙｏｕｎｇ Ｓｈｉｎ Ｌｅｅ，Ｍｙｕｎｇ Ｈｅｅ Ｎａｍ，Ｉｎ Ｈｅｅ Ｌｅｅ発表の「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ」に発表
【出願人】（５０５１８８７３３）
【出願人】（５０５１８８７４４）
【Ｆターム（参考）】
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