アクアポリン３産生促進剤、及びそれを含有する化粧料
【課題】 ＡＱＰ３の産生を促進することによるＡＱＰ３産生促進剤の提供、及びそれを用いた化粧料、並びに薬用製剤類、医薬品及び医薬部外品などの各種外用剤の提供を目的とする。
【解決手段】 酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを併用することにより、上記目的を達成する。
【解決手段】 酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを併用することにより、上記目的を達成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクアポリン３（ａｑｕａｐｏｒｉｎ３：以下、ＡＱＰ３とする）タンパク質の産生を促進するＡＱＰ３産生促進剤、及び該ＡＱＰ３産生促進剤を含有する化粧料、並びに薬用製剤類、医薬品及び医薬部外品などの各種外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、表皮、真皮、皮下組織からなる三層構造を有する人体最大の器官であり、外界の刺激をブロックするバリア機能及び体内の水分の消失を防ぐ機能がある。これらの機能を担う皮膚において、水分が重要な役割を果たし、水分が不足し乾燥状態となると肌荒れやかゆみ、しわや炎症の原因となる。皮膚内部での水の動きについてのこれまでの研究によって、アクアポリン（ＡＱＰ）タンパク質が皮膚の物性や生理機能に関係していることが徐々にわかりつつある。ＡＱＰは、水チャネルとも呼ばれ、細胞膜上で水を選択的に透過させるタンパク質として知られている。ヒトに存在する１３種類のＡＱＰ（ＡＱＰ０〜ＡＱＰ１２）のうち、ＡＱＰ１、ＡＱＰ３、ＡＱＰ５、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＡＱＰ１０が皮膚に存在する。このうちＡＱＰ３は、表皮での機能が詳細に解析されており、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＡＱＰ１０などとともに水だけでなくグリセロールや尿素などの非イオン性小分子も透過させる事が知られている。マウスでの実験によると、ＡＱＰ３遺伝子欠損マウスでは、角層水分量、皮膚粘弾性、バリア機能回復の低下が認められ、ＡＱＰ３が皮膚物性及び皮膚生理機能に深く関与していることが示された（非特許文献１）。これより、加齢に伴うＡＱＰ３の減少が、角層水分量、皮膚粘弾性、バリア機能回復の低下等の皮膚の老化現象に関係すると推測することができ、ＡＱＰ３の産生促進により、これらの減少が抑制され、皮膚の状態がより好ましい状態となると考えられる。ＡＱＰ３産生促進成分としては、ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物（特許文献１）、トコフェリルレチノエート（特許文献２）が知られているが、これらのＡＱＰ３産生促進作用は十分ではない。そこで、安全性が高く、皮膚などへの適用性の良好な、更なる優れたＡＱＰ３産生促進剤が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−１６８７３２号公報
【特許文献２】特開２００６−２９０８７３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、第２９巻、ｐ.１４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＡＱＰ３の産生を促進することによるＡＱＰ３産生促進剤の提供、及びそれを用いた化粧料、並びに薬用製剤類、医薬品及び医薬部外品などの各種外用剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＡＱＰ３産生促進効果を有することが知られている酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを併用すると、酢酸マグネシウムのＡＱＰ３産生促進能力が飛躍的に増大することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを含有するＡＱＰ３産生促進剤を提供し、更に、該ＡＱＰ３産生促進剤を含有するＡＱＰ３産生促進効果の顕著な化粧料、並びに薬用製剤類、医薬品及び医薬部外品などの各種外用剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを含有する本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、哺乳動物細胞、例えば脳、眼、鼻腔、気管、腎臓、腸、赤血球等を構成する細胞において、ＡＱＰ３産生能力を促進させる効果を有する。特に、本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、皮膚、眼、鼻腔粘膜等の外界に面する器官に適用した場合、これらの器官を構成する細胞のＡＱＰ３産生能力を促進し、これにより、水やグリセリンが器官内を循環し、保湿性やバリア機能の回復を高め、老化を防止する。
【０００９】
さらに、本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、少量の酢酸マグネシウム使用量で極めて優れたＡＱＰ３産生促進効果を発揮する。したがって、その使用に際して、例えば他の成分と混合して化粧料、並びに薬用製剤類、医薬品及び医薬部外品などの各種外用剤として使用する場合に、酢酸マグネシウム由来の臭いを軽減することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを含有することを特徴とする。これらはいずれも、医薬又は民間薬、食品、化粧品の成分として一般的に用いられているものを使用することができる。
【００１１】
本発明における酢酸マグネシウムは、一般試薬として市販されているものを用いることもできる。
【００１２】
本発明におけるチンピエキスは、ウンシュウミカン（Citrus unshiu Markovich）又はその近縁のミカン科植物（Rutaceae）の果皮から抽出して得られる。
【００１３】
本発明におけるバンランコンエキスは、タイセイ（Isatis tinctoria var. indigotica）又はその近縁のアブラナ科植物（Cruciferae）の根から抽出して得られるエキスである。
【００１４】
本発明におけるコトウニンエキスは、オニグルミ（J. mandshurica Maxim. var. seboldiana Makino）又はその近縁のクルミ科植物（Juglandaceae）の種子から抽出して得られるエキスである。
【００１５】
これらの植物抽出エキスは、前記の各植物の各種部位又はその破砕物から、溶媒抽出して得ることができる。
【００１６】
抽出溶媒に特に制限はなく、意図する使用や後加工処理等に応じて適宜に選択することができるが、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級１価アルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１,３−ブタンジオール、グリセリンなどの多価アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、クロロホルム、四塩化炭素などのハロ
ゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどの炭化水素類など一般に用いられる有機溶媒を挙げることができ、これらの中から選ばれる１種、または２種以上を混合して用いることができ、また、水と有機溶媒の混合溶媒を用いることができる。
【００１７】
水と併用する有機溶媒としては、炭素数４以下の低級アルコール、低級アルキルジオールが好ましく、エタノール、１,３−ブタンジオールなど皮膚刺激性の低い溶剤を用いることが好ましい。水と有機溶媒の混合溶媒を用いる場合、その混合割合は質量基準で、水：有機溶媒＝１０：９０〜８０：２０とすることが好ましい。
【００１８】
抽出温度としては、使用する溶媒の種類や量等のその他の抽出条件に応じて適宜に設定することができるが、１５〜１００℃が好ましく、１５〜５０℃がより好ましい。抽出温度を５０℃以下にすることにより、植物抽出エキス中に含まれる成分の分解や変質を抑えることができる。抽出時間に特に制限はないが、抽出温度が５０℃を超える場合、３０秒〜５時間が好ましく、５０℃以下で抽出する場合、５分〜７日間が好ましい。
【００１９】
前記各植物抽出エキスは、抽出溶媒又は別の溶剤に溶解した液状で用いることができ、また、その濃縮物、凍結乾燥した粉末品、又は、その他慣用の精製処理に付された精製品としても用いることができる。
【００２０】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、上記の植物抽出エキス１種以上と、酢酸マグネシウムとを混合することにより得られる。混合様式は、固体形体のもの同士を混合しても、任意の溶媒中に溶解した溶液形態のもの同士を混合しても、又は、溶液形態の一方に、固体形体の他方を溶解することによって混合しても、いずれの様式であってもよい。
【００２１】
また、本発明のＡＱＰ３産生促進剤を、化粧料、並びに薬用製剤類、医薬品及び医薬部外品などの各種外用剤として、その他の成分と混合して使用する場合は、各種植物抽出エキス、酢酸マグネシウム及びその他の成分を、任意の順番で混合することができ、植物抽出エキスと酢酸マグネシウムとを予め混合するプレミックスの形態でなくともよい。
【００２２】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤において、酢酸マグネシウム量と総植物抽出エキス量との配合比は、植物抽出エキスを１種、または２種以上用いる場合のいずれも、例えば、酢酸マグネシウム無水物及び植物抽出エキス粉末品として換算して、質量基準で、酢酸マグネシウム：植物抽出エキス＝１００：０.０１〜１００：３０００の範囲であってよい。これらの併用による相乗効果を高め、より優れた保湿効果を得るためには、より好ましくは酢酸マグネシウム：植物抽出エキス＝１００：０.１〜１００：２５００であり、特に好ましくは酢酸マグネシウム：植物抽出エキス＝１００：０.２〜１００：２３００である。また、植物抽出エキスを２種以上用いる場合、各植物エキスの配合割合に特に制限はなく、任意の割合で配合することができる。
【００２３】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、そのまま単独で、又は他の成分と混合して、化粧料、薬用製剤類、医薬品、医薬部外品など各種の外用剤として使用することができる。そして、保湿に寄与する有効成分として機能し、頭皮・頭髪、顔、全身の皮膚等に適用されて、その構成細胞におけるＡＱＰ３産生を促進する。
【００２４】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤を含有する化粧料としては、特に制限はなく、例えば、リンス、ヘアクリーム、ヘアトニック、染毛剤、育毛剤、整髪料等の毛髪用化粧料；シャンプー、石鹸等の洗浄料；ローション、乳液、ペースト、クリーム、ジェル、フェイスパック、メイクアップ用品、日焼け止め用品等の皮膚用化粧料を例示することができる。
【００２５】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤を含有する外用剤の剤形としては、軟膏剤、ハップ剤、液剤、ゲル剤、乳液剤、クリーム剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
また、本発明のＡＱＰ３産生促進剤を含有する化粧料及び各種外用剤は、ヒトに対して好適に適用されるが、本発明の効果を発揮する範囲において、ヒト以外の哺乳動物に対しても適用することができる。
【００２７】
本発明の化粧料及び各種外用剤において、ＡＱＰ３産生促進剤の配合量に特に制限はなく、任意の濃度で配合することができるが、酢酸マグネシウムの好ましい配合量は、無水物換算で、０.０００１〜５質量％であり、優れた保湿効果を発揮し、かつ十分な保存安定性を示すために、より好ましくは０.０００５〜３質量％、特に好ましくは０.００１〜１質量％である。また、植物抽出エキスの好ましい総配合量は、粉末品として換算して、０.０００１〜１０質量％であり、保湿について高い相乗効果を達成するために、より好ましくは０.０００５〜８質量％、特に好ましくは０.００１〜５質量％である。酢酸マグネシウムと植物抽出エキスの総配合量が前記下限未満では、ＡＱＰ３産生促進による保湿効果が余り期待できず、前記上限値を超えて使用しても、それに見合う効果が期待できない場合がある。植物抽出エキスを２種以上用いる場合の植物抽出エキスの割合に特に制限はなく、任意の割合で配合することができる。
【００２８】
本発明において、各種植物抽出エキス及びそれを含有するＡＱＰ３産生促進剤は、化粧料及び各種外用剤を構成するその他の成分と混合する際に、必要に応じて、予め有機溶剤中に溶解して用いることができる。この場合、例えば、皮膚刺激性の低い有機溶剤として、エタノール、１,３−ブタンジオールなどを挙げることができる。
【００２９】
本発明の化粧料及び各種外用剤を構成するその他の成分としては、皮膚外用剤として従来から使用されている機能成分や界面活性剤、油脂類などの基材成分、増粘剤、防腐剤、等張化剤、紫外線吸収剤、キレート剤、酸化防止剤、香料、着色料など種々の添加物を必要に応じて、本発明の効果を損なわない範囲の濃度で用いることができる。
【００３０】
このような機能成分としては、例えば、保湿剤、エモリエント剤、血行促進剤、細胞賦活化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、抗菌剤、美白剤、過酸化物抑制剤などが挙げられる。より具体的には、グリセリン、１,３−ブタンジオール、尿素、アミノ酸類、ヒアルロン酸などの保湿剤；スクワラン、マカデミアナッツ油、オリーブ油、ホホバ油、シリコン油などのエモリエント剤；ビタミンE類、トウガラシチンキなどの血行促進剤；核酸などの細胞賦活化剤、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ジブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、酢酸トコフェロールなどの抗酸化剤；グリチルリチン、アラントインなどの抗炎症剤；ヒノキチオール、塩化ベンザルコニウム、クロルヘキシジン塩、パラヒドロキシ安息香酸エステルなどの抗菌剤；アスコルビン酸などの美白剤；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）などの過酸化物抑制剤などが挙げられる。
【００３１】
また、他の植物・動物・微生物由来の各種抽出物、例えば、オウゴンエキス、イチョウエキス、胎盤抽出物、乳酸菌培養抽出物などを併用することもできる。
【００３２】
本発明の化粧料及び各種外用剤に、既知の保湿剤を加えることにより、さらに効果的な保湿効果が期待される。
【００３３】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能な界面活性剤に特に制限はなく、一般的な非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤を用いることができる。例えば、高級アルコールのアルキレンオキサイド付加物、高級アルキルアミンのアルキレンオキサイド付加物、高級脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物、高級脂肪酸アミドのアルキレンオキサイド付加物、多価アルコールの脂肪酸エステル、硬化ひまし油のアルキレンオキサイド付加物、ポリエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ステロール等のアルキレンオキサイド付加物などの非イオン界面活性剤；アルキル硫酸ナトリウム、アルキロイルメチルタウリンナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムなどの陰イオン界面活性剤；塩化アルキルピリジニウム、塩化ジステアリルジメリルアンモニウムなどの陽イオン界面活性剤；アミノプロピオン酸ナトリウム、アルキルポリアミノエチルグリシンなどの両性界面活性剤が挙げられる。そして、これらの界面活性剤は１種又は２種以上を選択して使用することができる。
【００３４】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能な基材成分に特に制限はなく、例えば、オリーブ油、ツバキ油、アボカド油、マカデミアナッツ油、杏仁油、ホホバ油、スクワラン、スクワレン、馬油など、一般的に知られている油脂類を用いることができる。
【００３５】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能な増粘剤に特に制限はなく、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、及びこれらの各種誘導体；ヒドロキシアルキルセルロースなどのセルロース類及びその誘導体；デキストラン、ゼラチン、アラビアガム、トラガントガムなどのガム類；カルボキシビニルポリマーなどの水溶性高分子を用いることができる。
【００３６】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能な防腐剤に特に制限はなく、例えば、パラヒドロキシ安息香酸エステル、パラオキシ安息香酸塩とその誘導体、フェノキシエタノール、ヒノキチオール、塩化ベンザルコニウム、クロルヘキシジン塩などを用いることができる。
【００３７】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能な等張化剤として、特に制限はなく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどの無機塩類を用いることができる。
【００３８】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能な紫外線吸収剤として、特に制限はなく、例えば、パラアミノ安息香酸、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、ベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤などを用いることができる。
【００３９】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能なキレート剤として、特に制限はなく、例えば、エチレンジアミン四酢酸、フィチン酸、クエン酸及びこれらの水溶性塩などを用いることができる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を更に詳しく説明するために実施例によって説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００４１】
（Ｉ）植物抽出エキスの製造
（１）チンピエキスの製造
ウンシュウミカンの果皮を５０ｇ採取し、これを５０質量％エタノール水溶液３７５ｇ中に入れて、室温（約２５℃）下で２４時間振とう処理した。これをろ過し、得られたろ液から水及びエタノールを減圧留去し、チンピエキスを得た。これを凍結乾燥し、チンピエキス（粉末）１４.５３ｇを得、以下に示す実施例に使用した。
【００４２】
（２）バンランコンエキスの製造
タイセイの根を５０ｇ採取し、これを５０質量％エタノール水溶液３７５ｇ中に入れて、室温（約２５℃）下で２４時間振とう処理した。これをろ過し、得られたろ液から水及びエタノールを減圧留去し、バンランコンエキスを得た。これを凍結乾燥し、バンランコンエキス（粉末）１０.６１ｇを得、以下に示す実施例に使用した。
【００４３】
（３）コトウニンエキスの製造
オニグルミの種子を５０ｇ採取し、これを５０質量％エタノール水溶液３７５ｇ中に入れて、室温（約２５℃）下で２４時間振とう処理した。これをろ過し、得られたろ液から水及びエタノールを減圧留去し、コトウニンエキスを得た。これを凍結乾燥し、コトウニンエキス（粉末）２.７７ｇを得、以下に示す実施例に使用した。
【００４４】
（４）ザクロエキスの製造
ザクロの果肉を５０ｇ採取し、これを５０質量％エタノール水溶液３７５ｇ中に入れて、室温（約２５℃）下で２４時間振とう処理した。これをろ過し、得られたろ液から水及びエタノールを減圧留去し、従来よりＡＱＰ３産生促進作用を有するとされるザクロエキスを得た。これを凍結乾燥し、ザクロエキス（粉末）１２.８１ｇを得、以下に示す比較例に使用した。
【００４５】
（II）ＡＱＰ３産生促進剤
ヒト不死化表皮正常角化細胞におけるＡＱＰ３産生量を以下の方法で測定することにより、本発明のＡＱＰ３産生促進剤の産生促進効果を評価した。
【００４６】
１．細胞の培養
ヒト不死化表皮正常角化細胞（ＰＨＫ１６−０ｂ、１,０００,０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／本、Ｌｏｔ Ｎｏ.；０９１０２００３、ヒューマンサイエンス研究資源バンク）を、３７℃の水浴で融解後、ＭＣＤＢ１５３培地（Ｓｉｇｍａ社製）中に懸濁し、６ｃｍのシャーレに９０,０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、３７℃、５％−ＣＯ2、加湿インキュベータ内で１０日間培養した。この間、１日おきに培地を交換した。
【００４７】
サブコンフルエントとなったヒト不死化表皮正常角化細胞を、トリプシン０.２５質量％を含むリン酸緩衝溶液で処理後、剥離し、ＭＣＤＢ１５３培地（Ｓｉｇｍａ社製）中に懸濁し、１０ｃｍシャーレ１枚に３３,０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、１０日間培養した。この間、１日おきに培地交換をした。
【００４８】
サブコンフルエントとなったヒト不死化表皮正常角化細胞を、トリプシン０.２５質量％を含むリン酸緩衝溶液で処理後、剥離し、ＭＣＤＢ１５３培地（Ｓｉｇｍａ社製）中に懸濁し、２４ウェルプレート（２.０ｃｍ2／ウェル）に２５,０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、９日間培養した。この間、１日おきに培地を交換した。
【００４９】
その後、表２に示した濃度の酢酸マグネシウムと植物抽出エキスとを含む試験用培地に交換し、２４時間培養した。ここで用いた試験用培地の調製方法は以下に示す。培地を除去し、ヒト不死化表皮正常角化細胞を３７℃に加温したリン酸緩衝液５００μＬで洗浄した後、トリプシン０.２５質量％を含むリン酸緩衝溶液（５００μＬ）で処理を行い、ヒト不死化表皮正常角化細胞を２ｍＬのエッペンドルフチューブに回収した。８６０×ｇで５分間遠心し、上清を除去した後、氷冷したリン酸緩衝液１ｍＬで懸濁し、遠心した（８６０×ｇ、５分、４℃）。上清を除去した後、ペレットを用いてｍＲＮＡの測定を行った。
【００５０】
２．試験用培地の調製
ＭＣＤＢ１５３培地中に酢酸マグネシウムを０.７２質量％及び０.００７２質量％となるように溶解し、０.２２μｍメンブランフィルターで滅菌濾過し、酢酸マグネシウム添加培地を得た。また、５０質量％エタノール水溶液中に、植物抽出エキスを、５質量％、２.５質量％、１質量％、０.２質量％となるように溶解し、０.２２μｍメンブランフィルターで滅菌濾過し、植物抽出エキス溶液を得た。
【００５１】
エタノールの最終濃度が０.５質量％となるように、植物抽出エキス溶液を酢酸マグネシウム添加培地に添加し、酢酸マグネシウム及び各種植物抽出エキスの最終濃度が表２のようになる試験用培地を得た。
【００５２】
３．ＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現量の測定
１）細胞からのＲＮＡ抽出
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（２５０）（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡの抽出を行った。キットに付属するバッファーＲＬＴおよびバッファーＲＰＥはそれぞれ１ｍＬあたり、前者には２−メルカプトエタノール１０μＬを、後者にはエタノール４ｍＬを添加し、混和してから使用した。２ｍＬのエッペンドルフチューブに回収したヒト不死化表皮正常角化細胞（２４−ウェルプレートのウェル分）にバッファーＲＬＴを３５０μＬ添加し、シリンジに２０Ｇの注射針を取り付け、ヒト不死化表皮正常角化細胞懸濁液をそれぞれ２０回通した。
【００５３】
次に７０容量％エタノール（エタノール：超純水＝７：３）を３５０μＬ添加後、ボルテックスミキサーを用い混和した。この７００μＬを２ｍＬコレクションチューブ上にセッティングしたＲＮｅａｓｙミニスピンカラム（キット付属品）にアプライし、１８,７００×ｇで１５秒間遠心分離を行った。次に、７００μＬのバッファーＲＷ１をＲＮｅａｓｙミニスピンカラムにアプライし、１８,７００×ｇで１５秒間遠心分離を行い、カラムを洗浄した。
【００５４】
更に、５００μＬのバッファーＲＰＥで同様にカラムを洗浄後、再度５００μＬのバッファーＲＰＥを添加し、１８,７００×ｇで２分間遠心分離を行い、カラムを洗浄した。その後、ＲＮｅａｓｙミニスピンカラムを新しい２ｍＬコレクションチューブの上に移し、１８,７００×ｇで１分間遠心分離を行い、洗浄液を完全に除去した。最後に、ＲＮｅａｓｙミニスピンカラムを新しい１.５ｍＬエッペンドルフチューブの上に移し、２０μＬのＲＮａｓｅを含まない純水を添加して１分間放置後、１８,７００×ｇで１分間遠心分離を行い、ＲＮＡを溶出した。
【００５５】
２）ｃＤＮＡの合成
抽出したＲＮＡから、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【００５６】
１サンプルにつき、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔに含まれる１０×Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （ＲＴ）バッファー２.０μＬ、２５×ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（１００ｍＭ）０.８μＬ、１０×ＲＴランダムプライマー２.０μＬ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標） リバーストランスクリプターゼ１.０ μＬ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １.０μＬ、ＵＬＴＲＡＳＰＥＣ ＷＡＴＥＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）３.２μＬを氷上で静かに混合し、２×ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを調製した。
【００５７】
Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）ＰＣＲ Ｐｌａｔｅｓ ９６−ｗｅｌｌ ｃｌｅａｒ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）の各ウェルへ２×ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘを１０μＬずつ、精製したＲＮＡを１μｇずつ添加し混合した。これをｉＱ（登録商標） サーマルサイクラー （５８２ＢＲ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製) を用いてステップ１として２５℃で１０分間、ステップ２として３７℃で１２０分間、ステップ３として８５℃で５秒間インキュベート後、ＴＥバッファーにて２０倍希釈し、ｃＤＮＡ ＴＥバッファー溶液とした。
【００５８】
３）リアルタイムＰＣＲ
Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）ＰＣＲ Ｐｌａｔｅｓ ９６−ｗｅｌｌ ｃｌｅａｒのそれぞれのウェルへｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ２５μＬ、目的遺伝子のフォワードプライマー（５ｐｍｏｌ／μＬ）３μＬ、リバースプライマー（５ｐｍｏｌ／μＬ）３μＬ、ｃＤＮＡ ＴＥバッファー溶液４μＬ、ＲＮａｓｅを含まない純水１５μＬを加えた。温度条件は熱変性９５℃で１５秒、アニーリング５６℃で３０秒、伸長反応７２℃で３０秒とした。ＰＣＲ産物の蛍光強度をＭｙ ｉＱ（登録商標） ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｒ リアルタイムＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）によりモニタリングした。
【００５９】
ＡＱＰ３および内部標準遺伝子として使用したＧＡＰＤＨについて、表１に示すフォワードプライマーおよびリバースプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。
【００６０】
【表１】
【００６１】
４）データの解析
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて一定の蛍光強度が得られるまでのサイクル数をモニタリングし、ＧＡＰＤＨとＡＱＰ３のサイクル数から２−ΔΔＣＴ法を用いて発現量を算出した。ＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨで補正した後、酢酸マグネシウム及びいずれの植物抽出エキスも含有しない場合（比較例１）のＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現量を１.０として、以下の実施例１〜１１、及び比較例２〜１４のＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現量を比較した。その結果を表２に示す。なお、ＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現量とＡＱＰ３（タンパク質）の産生量とは比例する。
【００６２】
【表２】
【００６３】
表２の実施例１〜１１の結果が示すように、酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを含む本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、ヒト不死化表皮正常角化細胞におけるＡＱＰ３産生に対し、優れた産生促進効果をもたらすことが分かる。
【００６４】
（III）化粧料
本発明のＡＱＰ３産生促進剤を配合した化粧料を調製し、効果を評価した。
【００６５】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤を配合した化粧料（シャンプー、コンディショナー、ヘアトニック、全身用ローション）を表３〜６に示す組成で調製した。調製方法は以下の通りである。チンピ、バンランコン、コトウニンの各抽出エキスは凍結乾燥した粉末品を用いた。なお、配合量の単位はｇであり、表中の精製水の「残量」とは全量を１００ｇとする量である。
【００６６】
１．シャンプー（実施例１２〜２３、比較例１５）
表３のＡ成分を７５℃に加温し、撹拌しながら３５℃まで冷却した。その後、撹拌を続けながらＢ成分を加え、さらにＣ成分を加えて、調製を終了した。
【００６７】
【表３】
【００６８】
２．コンディショナー（実施例２４〜３５、比較例１６）
表４のＤ成分、Ｅ成分をそれぞれ７５℃に加温し、Ｄ成分をパドルミキサーで撹拌しながら、Ｅ成分を少量ずつ加えた。Ｅ成分を全量添加後、パドルミキサーで撹拌しながら冷却して、４５℃以下でＦ成分を加えて調製を終了した。
【００６９】
【表４】
【００７０】
３．ヘアトニック（実施例３６〜４７、比較例１７）
表５のＧ成分、Ｈ成分、Ｉ成分の全てを４０℃に加温して混合した。
【００７１】
【表５】
【００７２】
４．全身用ローション（実施例４８〜５９、比較例１８）
表６のＪ成分、Ｋ成分のそれぞれを８０℃で加温して溶解し、Ｋ成分をＪ成分に撹拌しながら徐々に加えて乳化した。その後撹拌しながら冷却し、４０℃でＬ成分を加えて、３５℃で調製を終了した。
【００７３】
【表６】
【００７４】
５．評価
前記実施例１２〜５９、比較例１５〜１８の化粧料について、それぞれ３０〜５０歳代の皮膚の乾燥を訴える男女各２名ずつの計１９２名に対して評価を行った。シャンプー及びコンディショナーについては毎日の入浴時に頭皮又は頭髪に適量使用し、ヘアトニックについては毎日の入浴後又は朝に頭皮又は頭髪に適量使用し、それぞれ半頭は実施例１２〜４７の化粧料、半頭は比較例１５〜１７の化粧料とし、これを６ヶ月間続けるモニター試験を行った。全身用ローションについては、１日に２回（朝、夜）、顔面、及び前腕に適宜使用し、顔面、前腕片側は実施例４８〜５９の化粧料、片側は比較例１８の化粧料を使用し、これを６ヶ月続けるモニター試験を行った。それぞれの比較例と比べて下記の基準にて評価を行った。総スコアの結果を、シャンプーについては表７、コンディショナーについては表８、ヘアトニックについては表９、全身用ローションについては表１０に示す。
【００７５】
なお、この期間中、シャンプーのモニター試験対象者は、シャンプーのみ本発明のシャンプーを使用し、それ以外の頭皮または頭髪用化粧料については、通常使用しているものをそのまま使用した。コンディショナー、ヘアトニック、全身用ローションのモニター試験対象者も同様である。
なお、使用期間中に皮膚の異常を訴えたものはいなかった。
【００７６】
スコア値
＋３：比較例よりも非常に潤いを感じられた
＋２：比較例よりもかなり潤いを感じられた
＋１：比較例よりもやや潤いを感じられた
０：差がない
−１：比較例のほうがやや潤いを感じられた
−２：比較例のほうがかなり潤いを感じられた
−３：比較例のほうが非常に潤いを感じられた
【００７７】
【表７】
【００７８】
【表８】
【００７９】
【表９】
【００８０】
【表１０】
【００８１】
表７〜１０の結果が示すように、本発明のＡＱＰ３産生促進剤を配合した実施例１２〜５９の化粧料では、比較例１５〜１８の化粧料と比べて、皮膚の乾燥の改善が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを含有する本発明は、ＡＱＰ３産生促進剤として有用である。本発明のＡＱＰ３産生促進剤を含有する化粧料は、哺乳動物細胞、特に外界に面する器官を構成する細胞、例えば表皮角化細胞等で産生されるＡＱＰ３の量を増大させ、その結果、器官、例えば皮膚の乾燥改善がなされる。そして、老化現象の防止等を目的とした化粧品をはじめとする各種の外用剤への利用が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクアポリン３（ａｑｕａｐｏｒｉｎ３：以下、ＡＱＰ３とする）タンパク質の産生を促進するＡＱＰ３産生促進剤、及び該ＡＱＰ３産生促進剤を含有する化粧料、並びに薬用製剤類、医薬品及び医薬部外品などの各種外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、表皮、真皮、皮下組織からなる三層構造を有する人体最大の器官であり、外界の刺激をブロックするバリア機能及び体内の水分の消失を防ぐ機能がある。これらの機能を担う皮膚において、水分が重要な役割を果たし、水分が不足し乾燥状態となると肌荒れやかゆみ、しわや炎症の原因となる。皮膚内部での水の動きについてのこれまでの研究によって、アクアポリン（ＡＱＰ）タンパク質が皮膚の物性や生理機能に関係していることが徐々にわかりつつある。ＡＱＰは、水チャネルとも呼ばれ、細胞膜上で水を選択的に透過させるタンパク質として知られている。ヒトに存在する１３種類のＡＱＰ（ＡＱＰ０〜ＡＱＰ１２）のうち、ＡＱＰ１、ＡＱＰ３、ＡＱＰ５、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＡＱＰ１０が皮膚に存在する。このうちＡＱＰ３は、表皮での機能が詳細に解析されており、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＡＱＰ１０などとともに水だけでなくグリセロールや尿素などの非イオン性小分子も透過させる事が知られている。マウスでの実験によると、ＡＱＰ３遺伝子欠損マウスでは、角層水分量、皮膚粘弾性、バリア機能回復の低下が認められ、ＡＱＰ３が皮膚物性及び皮膚生理機能に深く関与していることが示された（非特許文献１）。これより、加齢に伴うＡＱＰ３の減少が、角層水分量、皮膚粘弾性、バリア機能回復の低下等の皮膚の老化現象に関係すると推測することができ、ＡＱＰ３の産生促進により、これらの減少が抑制され、皮膚の状態がより好ましい状態となると考えられる。ＡＱＰ３産生促進成分としては、ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物（特許文献１）、トコフェリルレチノエート（特許文献２）が知られているが、これらのＡＱＰ３産生促進作用は十分ではない。そこで、安全性が高く、皮膚などへの適用性の良好な、更なる優れたＡＱＰ３産生促進剤が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−１６８７３２号公報
【特許文献２】特開２００６−２９０８７３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、第２９巻、ｐ.１４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＡＱＰ３の産生を促進することによるＡＱＰ３産生促進剤の提供、及びそれを用いた化粧料、並びに薬用製剤類、医薬品及び医薬部外品などの各種外用剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＡＱＰ３産生促進効果を有することが知られている酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを併用すると、酢酸マグネシウムのＡＱＰ３産生促進能力が飛躍的に増大することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを含有するＡＱＰ３産生促進剤を提供し、更に、該ＡＱＰ３産生促進剤を含有するＡＱＰ３産生促進効果の顕著な化粧料、並びに薬用製剤類、医薬品及び医薬部外品などの各種外用剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを含有する本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、哺乳動物細胞、例えば脳、眼、鼻腔、気管、腎臓、腸、赤血球等を構成する細胞において、ＡＱＰ３産生能力を促進させる効果を有する。特に、本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、皮膚、眼、鼻腔粘膜等の外界に面する器官に適用した場合、これらの器官を構成する細胞のＡＱＰ３産生能力を促進し、これにより、水やグリセリンが器官内を循環し、保湿性やバリア機能の回復を高め、老化を防止する。
【０００９】
さらに、本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、少量の酢酸マグネシウム使用量で極めて優れたＡＱＰ３産生促進効果を発揮する。したがって、その使用に際して、例えば他の成分と混合して化粧料、並びに薬用製剤類、医薬品及び医薬部外品などの各種外用剤として使用する場合に、酢酸マグネシウム由来の臭いを軽減することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを含有することを特徴とする。これらはいずれも、医薬又は民間薬、食品、化粧品の成分として一般的に用いられているものを使用することができる。
【００１１】
本発明における酢酸マグネシウムは、一般試薬として市販されているものを用いることもできる。
【００１２】
本発明におけるチンピエキスは、ウンシュウミカン（Citrus unshiu Markovich）又はその近縁のミカン科植物（Rutaceae）の果皮から抽出して得られる。
【００１３】
本発明におけるバンランコンエキスは、タイセイ（Isatis tinctoria var. indigotica）又はその近縁のアブラナ科植物（Cruciferae）の根から抽出して得られるエキスである。
【００１４】
本発明におけるコトウニンエキスは、オニグルミ（J. mandshurica Maxim. var. seboldiana Makino）又はその近縁のクルミ科植物（Juglandaceae）の種子から抽出して得られるエキスである。
【００１５】
これらの植物抽出エキスは、前記の各植物の各種部位又はその破砕物から、溶媒抽出して得ることができる。
【００１６】
抽出溶媒に特に制限はなく、意図する使用や後加工処理等に応じて適宜に選択することができるが、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級１価アルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１,３−ブタンジオール、グリセリンなどの多価アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、クロロホルム、四塩化炭素などのハロ
ゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどの炭化水素類など一般に用いられる有機溶媒を挙げることができ、これらの中から選ばれる１種、または２種以上を混合して用いることができ、また、水と有機溶媒の混合溶媒を用いることができる。
【００１７】
水と併用する有機溶媒としては、炭素数４以下の低級アルコール、低級アルキルジオールが好ましく、エタノール、１,３−ブタンジオールなど皮膚刺激性の低い溶剤を用いることが好ましい。水と有機溶媒の混合溶媒を用いる場合、その混合割合は質量基準で、水：有機溶媒＝１０：９０〜８０：２０とすることが好ましい。
【００１８】
抽出温度としては、使用する溶媒の種類や量等のその他の抽出条件に応じて適宜に設定することができるが、１５〜１００℃が好ましく、１５〜５０℃がより好ましい。抽出温度を５０℃以下にすることにより、植物抽出エキス中に含まれる成分の分解や変質を抑えることができる。抽出時間に特に制限はないが、抽出温度が５０℃を超える場合、３０秒〜５時間が好ましく、５０℃以下で抽出する場合、５分〜７日間が好ましい。
【００１９】
前記各植物抽出エキスは、抽出溶媒又は別の溶剤に溶解した液状で用いることができ、また、その濃縮物、凍結乾燥した粉末品、又は、その他慣用の精製処理に付された精製品としても用いることができる。
【００２０】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、上記の植物抽出エキス１種以上と、酢酸マグネシウムとを混合することにより得られる。混合様式は、固体形体のもの同士を混合しても、任意の溶媒中に溶解した溶液形態のもの同士を混合しても、又は、溶液形態の一方に、固体形体の他方を溶解することによって混合しても、いずれの様式であってもよい。
【００２１】
また、本発明のＡＱＰ３産生促進剤を、化粧料、並びに薬用製剤類、医薬品及び医薬部外品などの各種外用剤として、その他の成分と混合して使用する場合は、各種植物抽出エキス、酢酸マグネシウム及びその他の成分を、任意の順番で混合することができ、植物抽出エキスと酢酸マグネシウムとを予め混合するプレミックスの形態でなくともよい。
【００２２】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤において、酢酸マグネシウム量と総植物抽出エキス量との配合比は、植物抽出エキスを１種、または２種以上用いる場合のいずれも、例えば、酢酸マグネシウム無水物及び植物抽出エキス粉末品として換算して、質量基準で、酢酸マグネシウム：植物抽出エキス＝１００：０.０１〜１００：３０００の範囲であってよい。これらの併用による相乗効果を高め、より優れた保湿効果を得るためには、より好ましくは酢酸マグネシウム：植物抽出エキス＝１００：０.１〜１００：２５００であり、特に好ましくは酢酸マグネシウム：植物抽出エキス＝１００：０.２〜１００：２３００である。また、植物抽出エキスを２種以上用いる場合、各植物エキスの配合割合に特に制限はなく、任意の割合で配合することができる。
【００２３】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、そのまま単独で、又は他の成分と混合して、化粧料、薬用製剤類、医薬品、医薬部外品など各種の外用剤として使用することができる。そして、保湿に寄与する有効成分として機能し、頭皮・頭髪、顔、全身の皮膚等に適用されて、その構成細胞におけるＡＱＰ３産生を促進する。
【００２４】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤を含有する化粧料としては、特に制限はなく、例えば、リンス、ヘアクリーム、ヘアトニック、染毛剤、育毛剤、整髪料等の毛髪用化粧料；シャンプー、石鹸等の洗浄料；ローション、乳液、ペースト、クリーム、ジェル、フェイスパック、メイクアップ用品、日焼け止め用品等の皮膚用化粧料を例示することができる。
【００２５】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤を含有する外用剤の剤形としては、軟膏剤、ハップ剤、液剤、ゲル剤、乳液剤、クリーム剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
また、本発明のＡＱＰ３産生促進剤を含有する化粧料及び各種外用剤は、ヒトに対して好適に適用されるが、本発明の効果を発揮する範囲において、ヒト以外の哺乳動物に対しても適用することができる。
【００２７】
本発明の化粧料及び各種外用剤において、ＡＱＰ３産生促進剤の配合量に特に制限はなく、任意の濃度で配合することができるが、酢酸マグネシウムの好ましい配合量は、無水物換算で、０.０００１〜５質量％であり、優れた保湿効果を発揮し、かつ十分な保存安定性を示すために、より好ましくは０.０００５〜３質量％、特に好ましくは０.００１〜１質量％である。また、植物抽出エキスの好ましい総配合量は、粉末品として換算して、０.０００１〜１０質量％であり、保湿について高い相乗効果を達成するために、より好ましくは０.０００５〜８質量％、特に好ましくは０.００１〜５質量％である。酢酸マグネシウムと植物抽出エキスの総配合量が前記下限未満では、ＡＱＰ３産生促進による保湿効果が余り期待できず、前記上限値を超えて使用しても、それに見合う効果が期待できない場合がある。植物抽出エキスを２種以上用いる場合の植物抽出エキスの割合に特に制限はなく、任意の割合で配合することができる。
【００２８】
本発明において、各種植物抽出エキス及びそれを含有するＡＱＰ３産生促進剤は、化粧料及び各種外用剤を構成するその他の成分と混合する際に、必要に応じて、予め有機溶剤中に溶解して用いることができる。この場合、例えば、皮膚刺激性の低い有機溶剤として、エタノール、１,３−ブタンジオールなどを挙げることができる。
【００２９】
本発明の化粧料及び各種外用剤を構成するその他の成分としては、皮膚外用剤として従来から使用されている機能成分や界面活性剤、油脂類などの基材成分、増粘剤、防腐剤、等張化剤、紫外線吸収剤、キレート剤、酸化防止剤、香料、着色料など種々の添加物を必要に応じて、本発明の効果を損なわない範囲の濃度で用いることができる。
【００３０】
このような機能成分としては、例えば、保湿剤、エモリエント剤、血行促進剤、細胞賦活化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、抗菌剤、美白剤、過酸化物抑制剤などが挙げられる。より具体的には、グリセリン、１,３−ブタンジオール、尿素、アミノ酸類、ヒアルロン酸などの保湿剤；スクワラン、マカデミアナッツ油、オリーブ油、ホホバ油、シリコン油などのエモリエント剤；ビタミンE類、トウガラシチンキなどの血行促進剤；核酸などの細胞賦活化剤、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ジブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、酢酸トコフェロールなどの抗酸化剤；グリチルリチン、アラントインなどの抗炎症剤；ヒノキチオール、塩化ベンザルコニウム、クロルヘキシジン塩、パラヒドロキシ安息香酸エステルなどの抗菌剤；アスコルビン酸などの美白剤；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）などの過酸化物抑制剤などが挙げられる。
【００３１】
また、他の植物・動物・微生物由来の各種抽出物、例えば、オウゴンエキス、イチョウエキス、胎盤抽出物、乳酸菌培養抽出物などを併用することもできる。
【００３２】
本発明の化粧料及び各種外用剤に、既知の保湿剤を加えることにより、さらに効果的な保湿効果が期待される。
【００３３】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能な界面活性剤に特に制限はなく、一般的な非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤を用いることができる。例えば、高級アルコールのアルキレンオキサイド付加物、高級アルキルアミンのアルキレンオキサイド付加物、高級脂肪酸のアルキレンオキサイド付加物、高級脂肪酸アミドのアルキレンオキサイド付加物、多価アルコールの脂肪酸エステル、硬化ひまし油のアルキレンオキサイド付加物、ポリエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ステロール等のアルキレンオキサイド付加物などの非イオン界面活性剤；アルキル硫酸ナトリウム、アルキロイルメチルタウリンナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムなどの陰イオン界面活性剤；塩化アルキルピリジニウム、塩化ジステアリルジメリルアンモニウムなどの陽イオン界面活性剤；アミノプロピオン酸ナトリウム、アルキルポリアミノエチルグリシンなどの両性界面活性剤が挙げられる。そして、これらの界面活性剤は１種又は２種以上を選択して使用することができる。
【００３４】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能な基材成分に特に制限はなく、例えば、オリーブ油、ツバキ油、アボカド油、マカデミアナッツ油、杏仁油、ホホバ油、スクワラン、スクワレン、馬油など、一般的に知られている油脂類を用いることができる。
【００３５】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能な増粘剤に特に制限はなく、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、及びこれらの各種誘導体；ヒドロキシアルキルセルロースなどのセルロース類及びその誘導体；デキストラン、ゼラチン、アラビアガム、トラガントガムなどのガム類；カルボキシビニルポリマーなどの水溶性高分子を用いることができる。
【００３６】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能な防腐剤に特に制限はなく、例えば、パラヒドロキシ安息香酸エステル、パラオキシ安息香酸塩とその誘導体、フェノキシエタノール、ヒノキチオール、塩化ベンザルコニウム、クロルヘキシジン塩などを用いることができる。
【００３７】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能な等張化剤として、特に制限はなく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどの無機塩類を用いることができる。
【００３８】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能な紫外線吸収剤として、特に制限はなく、例えば、パラアミノ安息香酸、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、ベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤などを用いることができる。
【００３９】
本発明の化粧料及び各種外用剤に使用可能なキレート剤として、特に制限はなく、例えば、エチレンジアミン四酢酸、フィチン酸、クエン酸及びこれらの水溶性塩などを用いることができる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を更に詳しく説明するために実施例によって説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００４１】
（Ｉ）植物抽出エキスの製造
（１）チンピエキスの製造
ウンシュウミカンの果皮を５０ｇ採取し、これを５０質量％エタノール水溶液３７５ｇ中に入れて、室温（約２５℃）下で２４時間振とう処理した。これをろ過し、得られたろ液から水及びエタノールを減圧留去し、チンピエキスを得た。これを凍結乾燥し、チンピエキス（粉末）１４.５３ｇを得、以下に示す実施例に使用した。
【００４２】
（２）バンランコンエキスの製造
タイセイの根を５０ｇ採取し、これを５０質量％エタノール水溶液３７５ｇ中に入れて、室温（約２５℃）下で２４時間振とう処理した。これをろ過し、得られたろ液から水及びエタノールを減圧留去し、バンランコンエキスを得た。これを凍結乾燥し、バンランコンエキス（粉末）１０.６１ｇを得、以下に示す実施例に使用した。
【００４３】
（３）コトウニンエキスの製造
オニグルミの種子を５０ｇ採取し、これを５０質量％エタノール水溶液３７５ｇ中に入れて、室温（約２５℃）下で２４時間振とう処理した。これをろ過し、得られたろ液から水及びエタノールを減圧留去し、コトウニンエキスを得た。これを凍結乾燥し、コトウニンエキス（粉末）２.７７ｇを得、以下に示す実施例に使用した。
【００４４】
（４）ザクロエキスの製造
ザクロの果肉を５０ｇ採取し、これを５０質量％エタノール水溶液３７５ｇ中に入れて、室温（約２５℃）下で２４時間振とう処理した。これをろ過し、得られたろ液から水及びエタノールを減圧留去し、従来よりＡＱＰ３産生促進作用を有するとされるザクロエキスを得た。これを凍結乾燥し、ザクロエキス（粉末）１２.８１ｇを得、以下に示す比較例に使用した。
【００４５】
（II）ＡＱＰ３産生促進剤
ヒト不死化表皮正常角化細胞におけるＡＱＰ３産生量を以下の方法で測定することにより、本発明のＡＱＰ３産生促進剤の産生促進効果を評価した。
【００４６】
１．細胞の培養
ヒト不死化表皮正常角化細胞（ＰＨＫ１６−０ｂ、１,０００,０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／本、Ｌｏｔ Ｎｏ.；０９１０２００３、ヒューマンサイエンス研究資源バンク）を、３７℃の水浴で融解後、ＭＣＤＢ１５３培地（Ｓｉｇｍａ社製）中に懸濁し、６ｃｍのシャーレに９０,０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、３７℃、５％−ＣＯ2、加湿インキュベータ内で１０日間培養した。この間、１日おきに培地を交換した。
【００４７】
サブコンフルエントとなったヒト不死化表皮正常角化細胞を、トリプシン０.２５質量％を含むリン酸緩衝溶液で処理後、剥離し、ＭＣＤＢ１５３培地（Ｓｉｇｍａ社製）中に懸濁し、１０ｃｍシャーレ１枚に３３,０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、１０日間培養した。この間、１日おきに培地交換をした。
【００４８】
サブコンフルエントとなったヒト不死化表皮正常角化細胞を、トリプシン０.２５質量％を含むリン酸緩衝溶液で処理後、剥離し、ＭＣＤＢ１５３培地（Ｓｉｇｍａ社製）中に懸濁し、２４ウェルプレート（２.０ｃｍ2／ウェル）に２５,０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、９日間培養した。この間、１日おきに培地を交換した。
【００４９】
その後、表２に示した濃度の酢酸マグネシウムと植物抽出エキスとを含む試験用培地に交換し、２４時間培養した。ここで用いた試験用培地の調製方法は以下に示す。培地を除去し、ヒト不死化表皮正常角化細胞を３７℃に加温したリン酸緩衝液５００μＬで洗浄した後、トリプシン０.２５質量％を含むリン酸緩衝溶液（５００μＬ）で処理を行い、ヒト不死化表皮正常角化細胞を２ｍＬのエッペンドルフチューブに回収した。８６０×ｇで５分間遠心し、上清を除去した後、氷冷したリン酸緩衝液１ｍＬで懸濁し、遠心した（８６０×ｇ、５分、４℃）。上清を除去した後、ペレットを用いてｍＲＮＡの測定を行った。
【００５０】
２．試験用培地の調製
ＭＣＤＢ１５３培地中に酢酸マグネシウムを０.７２質量％及び０.００７２質量％となるように溶解し、０.２２μｍメンブランフィルターで滅菌濾過し、酢酸マグネシウム添加培地を得た。また、５０質量％エタノール水溶液中に、植物抽出エキスを、５質量％、２.５質量％、１質量％、０.２質量％となるように溶解し、０.２２μｍメンブランフィルターで滅菌濾過し、植物抽出エキス溶液を得た。
【００５１】
エタノールの最終濃度が０.５質量％となるように、植物抽出エキス溶液を酢酸マグネシウム添加培地に添加し、酢酸マグネシウム及び各種植物抽出エキスの最終濃度が表２のようになる試験用培地を得た。
【００５２】
３．ＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現量の測定
１）細胞からのＲＮＡ抽出
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（２５０）（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡの抽出を行った。キットに付属するバッファーＲＬＴおよびバッファーＲＰＥはそれぞれ１ｍＬあたり、前者には２−メルカプトエタノール１０μＬを、後者にはエタノール４ｍＬを添加し、混和してから使用した。２ｍＬのエッペンドルフチューブに回収したヒト不死化表皮正常角化細胞（２４−ウェルプレートのウェル分）にバッファーＲＬＴを３５０μＬ添加し、シリンジに２０Ｇの注射針を取り付け、ヒト不死化表皮正常角化細胞懸濁液をそれぞれ２０回通した。
【００５３】
次に７０容量％エタノール（エタノール：超純水＝７：３）を３５０μＬ添加後、ボルテックスミキサーを用い混和した。この７００μＬを２ｍＬコレクションチューブ上にセッティングしたＲＮｅａｓｙミニスピンカラム（キット付属品）にアプライし、１８,７００×ｇで１５秒間遠心分離を行った。次に、７００μＬのバッファーＲＷ１をＲＮｅａｓｙミニスピンカラムにアプライし、１８,７００×ｇで１５秒間遠心分離を行い、カラムを洗浄した。
【００５４】
更に、５００μＬのバッファーＲＰＥで同様にカラムを洗浄後、再度５００μＬのバッファーＲＰＥを添加し、１８,７００×ｇで２分間遠心分離を行い、カラムを洗浄した。その後、ＲＮｅａｓｙミニスピンカラムを新しい２ｍＬコレクションチューブの上に移し、１８,７００×ｇで１分間遠心分離を行い、洗浄液を完全に除去した。最後に、ＲＮｅａｓｙミニスピンカラムを新しい１.５ｍＬエッペンドルフチューブの上に移し、２０μＬのＲＮａｓｅを含まない純水を添加して１分間放置後、１８,７００×ｇで１分間遠心分離を行い、ＲＮＡを溶出した。
【００５５】
２）ｃＤＮＡの合成
抽出したＲＮＡから、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【００５６】
１サンプルにつき、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔに含まれる１０×Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （ＲＴ）バッファー２.０μＬ、２５×ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（１００ｍＭ）０.８μＬ、１０×ＲＴランダムプライマー２.０μＬ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標） リバーストランスクリプターゼ１.０ μＬ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １.０μＬ、ＵＬＴＲＡＳＰＥＣ ＷＡＴＥＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）３.２μＬを氷上で静かに混合し、２×ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを調製した。
【００５７】
Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）ＰＣＲ Ｐｌａｔｅｓ ９６−ｗｅｌｌ ｃｌｅａｒ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）の各ウェルへ２×ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘを１０μＬずつ、精製したＲＮＡを１μｇずつ添加し混合した。これをｉＱ（登録商標） サーマルサイクラー （５８２ＢＲ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製) を用いてステップ１として２５℃で１０分間、ステップ２として３７℃で１２０分間、ステップ３として８５℃で５秒間インキュベート後、ＴＥバッファーにて２０倍希釈し、ｃＤＮＡ ＴＥバッファー溶液とした。
【００５８】
３）リアルタイムＰＣＲ
Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）ＰＣＲ Ｐｌａｔｅｓ ９６−ｗｅｌｌ ｃｌｅａｒのそれぞれのウェルへｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ２５μＬ、目的遺伝子のフォワードプライマー（５ｐｍｏｌ／μＬ）３μＬ、リバースプライマー（５ｐｍｏｌ／μＬ）３μＬ、ｃＤＮＡ ＴＥバッファー溶液４μＬ、ＲＮａｓｅを含まない純水１５μＬを加えた。温度条件は熱変性９５℃で１５秒、アニーリング５６℃で３０秒、伸長反応７２℃で３０秒とした。ＰＣＲ産物の蛍光強度をＭｙ ｉＱ（登録商標） ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｒ リアルタイムＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）によりモニタリングした。
【００５９】
ＡＱＰ３および内部標準遺伝子として使用したＧＡＰＤＨについて、表１に示すフォワードプライマーおよびリバースプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。
【００６０】
【表１】
【００６１】
４）データの解析
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて一定の蛍光強度が得られるまでのサイクル数をモニタリングし、ＧＡＰＤＨとＡＱＰ３のサイクル数から２−ΔΔＣＴ法を用いて発現量を算出した。ＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨで補正した後、酢酸マグネシウム及びいずれの植物抽出エキスも含有しない場合（比較例１）のＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現量を１.０として、以下の実施例１〜１１、及び比較例２〜１４のＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現量を比較した。その結果を表２に示す。なお、ＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現量とＡＱＰ３（タンパク質）の産生量とは比例する。
【００６２】
【表２】
【００６３】
表２の実施例１〜１１の結果が示すように、酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを含む本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、ヒト不死化表皮正常角化細胞におけるＡＱＰ３産生に対し、優れた産生促進効果をもたらすことが分かる。
【００６４】
（III）化粧料
本発明のＡＱＰ３産生促進剤を配合した化粧料を調製し、効果を評価した。
【００６５】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤を配合した化粧料（シャンプー、コンディショナー、ヘアトニック、全身用ローション）を表３〜６に示す組成で調製した。調製方法は以下の通りである。チンピ、バンランコン、コトウニンの各抽出エキスは凍結乾燥した粉末品を用いた。なお、配合量の単位はｇであり、表中の精製水の「残量」とは全量を１００ｇとする量である。
【００６６】
１．シャンプー（実施例１２〜２３、比較例１５）
表３のＡ成分を７５℃に加温し、撹拌しながら３５℃まで冷却した。その後、撹拌を続けながらＢ成分を加え、さらにＣ成分を加えて、調製を終了した。
【００６７】
【表３】
【００６８】
２．コンディショナー（実施例２４〜３５、比較例１６）
表４のＤ成分、Ｅ成分をそれぞれ７５℃に加温し、Ｄ成分をパドルミキサーで撹拌しながら、Ｅ成分を少量ずつ加えた。Ｅ成分を全量添加後、パドルミキサーで撹拌しながら冷却して、４５℃以下でＦ成分を加えて調製を終了した。
【００６９】
【表４】
【００７０】
３．ヘアトニック（実施例３６〜４７、比較例１７）
表５のＧ成分、Ｈ成分、Ｉ成分の全てを４０℃に加温して混合した。
【００７１】
【表５】
【００７２】
４．全身用ローション（実施例４８〜５９、比較例１８）
表６のＪ成分、Ｋ成分のそれぞれを８０℃で加温して溶解し、Ｋ成分をＪ成分に撹拌しながら徐々に加えて乳化した。その後撹拌しながら冷却し、４０℃でＬ成分を加えて、３５℃で調製を終了した。
【００７３】
【表６】
【００７４】
５．評価
前記実施例１２〜５９、比較例１５〜１８の化粧料について、それぞれ３０〜５０歳代の皮膚の乾燥を訴える男女各２名ずつの計１９２名に対して評価を行った。シャンプー及びコンディショナーについては毎日の入浴時に頭皮又は頭髪に適量使用し、ヘアトニックについては毎日の入浴後又は朝に頭皮又は頭髪に適量使用し、それぞれ半頭は実施例１２〜４７の化粧料、半頭は比較例１５〜１７の化粧料とし、これを６ヶ月間続けるモニター試験を行った。全身用ローションについては、１日に２回（朝、夜）、顔面、及び前腕に適宜使用し、顔面、前腕片側は実施例４８〜５９の化粧料、片側は比較例１８の化粧料を使用し、これを６ヶ月続けるモニター試験を行った。それぞれの比較例と比べて下記の基準にて評価を行った。総スコアの結果を、シャンプーについては表７、コンディショナーについては表８、ヘアトニックについては表９、全身用ローションについては表１０に示す。
【００７５】
なお、この期間中、シャンプーのモニター試験対象者は、シャンプーのみ本発明のシャンプーを使用し、それ以外の頭皮または頭髪用化粧料については、通常使用しているものをそのまま使用した。コンディショナー、ヘアトニック、全身用ローションのモニター試験対象者も同様である。
なお、使用期間中に皮膚の異常を訴えたものはいなかった。
【００７６】
スコア値
＋３：比較例よりも非常に潤いを感じられた
＋２：比較例よりもかなり潤いを感じられた
＋１：比較例よりもやや潤いを感じられた
０：差がない
−１：比較例のほうがやや潤いを感じられた
−２：比較例のほうがかなり潤いを感じられた
−３：比較例のほうが非常に潤いを感じられた
【００７７】
【表７】
【００７８】
【表８】
【００７９】
【表９】
【００８０】
【表１０】
【００８１】
表７〜１０の結果が示すように、本発明のＡＱＰ３産生促進剤を配合した実施例１２〜５９の化粧料では、比較例１５〜１８の化粧料と比べて、皮膚の乾燥の改善が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキスとを含有する本発明は、ＡＱＰ３産生促進剤として有用である。本発明のＡＱＰ３産生促進剤を含有する化粧料は、哺乳動物細胞、特に外界に面する器官を構成する細胞、例えば表皮角化細胞等で産生されるＡＱＰ３の量を増大させ、その結果、器官、例えば皮膚の乾燥改善がなされる。そして、老化現象の防止等を目的とした化粧品をはじめとする各種の外用剤への利用が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキス、とを含有することを特徴とするアクアポリン３産生促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載のアクアポリン３産生促進剤を含有することを特徴とする外用剤。
【請求項３】
請求項１に記載のアクアポリン３産生促進剤を含有することを特徴とする化粧料。
【請求項１】
酢酸マグネシウムと、チンピエキス、バンランコンエキス、コトウニンエキスからなる群より選ばれる１種以上の植物抽出エキス、とを含有することを特徴とするアクアポリン３産生促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載のアクアポリン３産生促進剤を含有することを特徴とする外用剤。
【請求項３】
請求項１に記載のアクアポリン３産生促進剤を含有することを特徴とする化粧料。
【公開番号】特開２０１１−１９０１８５（Ｐ２０１１−１９０１８５Ａ）
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５５２６１（Ｐ２０１０−５５２６１）
【出願日】平成２２年３月１２日（２０１０．３．１２）
【出願人】（０００２２６１６１）日華化学株式会社 (208)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１２日（２０１０．３．１２）
【出願人】（０００２２６１６１）日華化学株式会社 (208)
【Ｆターム（参考）】
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