アクチンの製造方法、それに用いるベクターおよび原核宿主細胞
【課題】 高収率でアクチンを容易に製造可能なアクチンの製造方法を提供する。
【解決手段】 本発明のアクチンの製造方法は、アクチン遺伝子を含むコールドショック発現ベクターにより形質転換された原核宿主細胞を準備する準備工程と、前記原核宿主細胞の正常生理的増殖温度よりも低い温度で前記原核宿主細胞を培養することにより前記コールドショック発現ベクター中のアクチン遺伝子を発現させてアクチンを産生させるアクチン産生工程とを含むことを特徴とする。
【解決手段】 本発明のアクチンの製造方法は、アクチン遺伝子を含むコールドショック発現ベクターにより形質転換された原核宿主細胞を準備する準備工程と、前記原核宿主細胞の正常生理的増殖温度よりも低い温度で前記原核宿主細胞を培養することにより前記コールドショック発現ベクター中のアクチン遺伝子を発現させてアクチンを産生させるアクチン産生工程とを含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクチンの製造方法、それに用いるベクターおよび原核宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
アクチンは、筋肉を構成するタンパク質として、１９４２年に発見された。筋肉において、アクチンは多量化して繊維状となり、ＡＴＰをＡＤＰに変換するエネルギーにより、繊維状アクチンの間をミオシンが滑ることで筋肉が収縮する。この他に、アクチンは、一般の細胞内にもマトリックスタンパク質として存在し、生体内のタンパク質総量の５ないし１０％を占める最も量の多いタンパク質である。アクチンは、一分子あたり、ＡＴＰおよびカルシウムを各一個有している。アクチンの形状は、亜鈴状をしており、ＡＴＰが失われると、二量体となる。単量体をＧアクチンといい、重合してポリマーとなったアクチンをＦアクチンという。真核生物に広く存在するアクチンの一次構造は、保守的で種別による大きな変化はない。哺乳類では、六種類のアイソアクチンが知られており、等電点の差から、αアクチン（骨格筋）、βアクチン（一般細胞）、γアクチン（平滑筋）等がある。
【０００３】
このように、アクチンは、広く生物に分布するタンパク質であるため、その研究が各分野で進められている。しかしながら、研究材料としてのアクチンの入手が困難である。すなわち、ヒト等の真核生物のアクチンを遺伝子工学で製造する場合、通常、アクチン遺伝子を導入した組換え酵母が用いられるが、この手法では、培養や細胞の粉砕等に手間がかかり不便である（非特許文献１）。また、生物から直接アクチンを採取する方法もあるが、生体材料の確保や抽出精製作業の点から大量のアクチンを採取することは実質的に困難である。このような点から、研究材料として市販されているアクチンは、大変高価であり、アクチンを大量に用いて研究することが困難であった。さらに、アクチンの機能や生物進化的な意義を解明するには、アクチンの変異体を作製する必要がある。このため、大量培養が容易で発現タンパク質の抽出精製が酵母よりも容易な大腸菌を用いてアクチン遺伝子を発現させることが試みられている（非特許文献２）。しかしながら、大腸菌を用いたアクチンの生産では、アクチン重合による不溶化、不純物タンパク質生成、アクチンの分解等の原因により、その収率等に問題があった。したがって、大腸菌を用いてアクチンを高収率で生産することは不可能であるというのが、従来の技術常識であり、他の原核生物を用いても同様であった。
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３２：３３７−３５０（Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９２）
【非特許文献２】ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．２６５，Ｎｏ．２９，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５，ｐｐ．１７９８０−１７９８７，１９９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、アクチンないしアクチンの変異体を高収率で容易に製造可能なアクチンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のアクチンの製造方法は、アクチン遺伝子を含むコールドショック発現ベクターにより形質転換された原核宿主細胞を準備する準備工程と、前記原核宿主細胞の正常生理的増殖温度よりも低い温度で前記原核収縮細胞を培養することにより前記コールドショック発現ベクター中のアクチン遺伝子を発現させてアクチンを産生させるアクチン産生工程とを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
このように、本発明の製造方法では、低温化でアクチン遺伝子を発現させるため、アクチンの重合による不溶化を防止でき、不純物タンパク質の生成およびアクチンの分解を抑制することが可能である。また、本発明の製造方法では、大量培養が容易であり、また生成したアクチンの抽出精製操作が容易な原核宿主細胞を使用している。したがって、本発明の製造方法によれば、高収率で容易にアクチンを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
つぎに、本発明について例をあげて詳しく説明する。ただし、本発明は、下記の事項によって限定されない。
【０００９】
本発明において、対象になるアクチンは特に制限されず、アクチン変異体も含む。また、製造対象になるアクチンは、αアクチン、βアクチン、γアクチンおよびこれらのアクチンの各変異体が好ましく、より好ましくは、βアクチンおよびその変異体である。また、アクチンの変異体を製造する場合のアクチン遺伝子は、アクチンの変異遺伝子である。本発明のベクターは、本発明の製造方法に使用するベクターであって、前記ベクターはコールドショック発現ベクターであり、前記ベクターが、アクチン遺伝子またはアクチンの変異遺伝子を発現可能な状態で含むベクターである。本発明のベクターとしては、例えば、後述のベクターがある。
【００１０】
本発明の原核宿主細胞は、本発明のアクチンの製造方法に使用する原核宿主細胞であって、本発明のベクターにより形質転換されている原核宿主細胞である。本発明において、前記原核宿主細胞は、特に限定されず、例えば、大腸菌および枯草菌等があげられ、このなかでも大腸菌が好ましい。
【００１１】
本発明において、前記原核宿主細胞が大腸菌であり、前記コールドショック発現ベクターが、大腸菌コールドショック遺伝子のプロモータおよび５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）を含むベクターであることが好ましい。また、前記プロモータが、ｃｓｐＡプロモータであることが好ましい。また、前記ベクターは、さらに１２塩基配列のＡＴリッチの翻訳増強エレメントを含むことが好ましい。前記ＡＴリッチとは、１２塩基配列中の７０％以上の塩基がＡＴであることを意味する。そして、前記ベクターは、ＡＡＧＡＧＧＴのＳＤ配列を有することが好ましい。アクチン遺伝子の塩基配列中には、ＡＡＧＧという偽ＳＤ配列が含まれており、このため従来のベクターを用いて大腸菌でアクチン遺伝子を発現しようとすると、アクチン遺伝子の途中から翻訳が始まってしまい、これが不純物タンパク質生成の原因の一つであった。これに対し、前記ベクターが、ＡＡＧＡＧＧＴのＳＤ配列を有すると、大腸菌中のｒＲＮＡサブユニットとの配列と親和性が高いため、アクチン遺伝子の偽ＳＤ配列からの翻訳が防止できる。
【００１２】
上述のコールドショック発現ベクターとしては、例えば、特表２００５−５１８８０４号公報に記載のベクターがあり、前記ベクターの塩基配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋに登録されており、そのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．は、ＡＢ１８６３８８，ＡＢ１８６３８９、ＡＢ１８６３９０およびＡＢ１８６３９１である。また、前記公報記載のベクターの市販品としては、タカラバイオ社製の商品名ｐＣｏｌｄ Ｉ〜ＩＶ ベクターがある（以下、「ｐＣｏｌｄベクター」ともいう）。ｐＣｏｌｄベクターの外来遺伝子挿入部位には、ｃｏｓＡプロモータ、ｌａｃオペレータ、ｃｓｐＡ５´ＵＴＲ、ＭＣＳ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）およびｃｓｐＡ３´ＵＴＲが、この順序で作動的に連結しており、前記ＭＣＳ部位に、アクチン遺伝子やアクチンの変異遺伝子を挿入できる。また、前記外来遺伝子挿入部位には、必要に応じて、ＴＥＥ配列、Ｈｉｓ・Ｔａｇ配列およびＦａｃｔｏｒ Ｘａ切断配列が挿入される。その他、ｐＣｏｌｄベクターには、大腸菌の複製起点（ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）、ｌａｃ Ｉ，Ａｍｐｒ，Ｍ１３ ＩＧの各遺伝子が挿入されている。
【００１３】
本発明の前記アクチン産生工程において、本プラスミドは、正常生理的増殖温度よりも１３℃低い温度で培養することが好ましく、より好ましくは、正常生理的増殖温度よりも２０℃低い温度で培養することである。例えば、大腸菌の正常生理的増殖温度は３７℃であるので、タンパク発現工程の培養温度は、２４℃以下が好ましく、より好ましくは１７℃以下である。
【００１４】
本発明の製造方法において、さらに、前記原核宿主細胞を、その正常生理的増殖温度で培養する一般培養工程を有し、前記一般培養工程で前記原核宿主細胞を培養した後、前記アクチン産生工程を実施することが好ましい。すなわち、前記一般培養工程で大腸菌を十分量培養した後、アクチン産生工程を実施すれば、アクチンをより大量に製造することができる。
【００１５】
本発明において、さらに、前記原核宿主細胞を溶菌して産生されたアクチンを回収する回収工程を有することが好ましい。そして、前記回収工程を、ＡＤＰおよびセリンプロテアーゼインヒビターの少なくとも一方の存在下で実施することが好ましい。ＡＤＰの存在下で前記回収工程を実施すれば、生成したアクチンの重合をより効果的に抑制でき、また前記セリンプロテアーゼインヒビターの存在下で前記回収工程を実施すれば、生成したアクチンのプロテアーゼによる分解をより効果的に抑制できるからである。前記セリンプロテアーゼインヒビターは、ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＩＦＰ）が好ましい。なお、ＡＤＰおよび前記インヒビターの少なくとも一方の存在下という条件は、前記回収工程の全工程に適用してもよいし、一部の工程に適用してもよいが、好ましくは全工程に適用することである。
【００１６】
本発明において、さらに、前記回収したアクチンを精製する精製工程を有することが好ましい。例えば、Ｈｉｓ・Ｔａｇを有する前記ｐＣｏｌｄベクターを用いれば、後述の実施例２に記載するように、Ｎｉカラムのクロマトグラフィーを実施して精製することができ、これにより、高純度のアクチンを得ることが可能になる。
【００１７】
本発明の製造方法は、例えば、ｐＣｏｌｄベクターを用い、つぎのようにして実施できる。
【００１８】
まず、アクチン遺伝子を準備する。アクチン遺伝子は既に塩基配列が公知であり、種々生物組織から特異的プライマーを用いてクローニングして自家調製できる。
【００１９】
つぎに、ｐＣｏｌｄベクターのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩサイトの間に前記アクチン遺伝子をサブクローニングして発現用プラスミドを作製する。この発現用プラスミドで宿主大腸菌を形質転換し、アンピシリンを含む選択培地プレートを用いて形質転換体を選択する。つぎに、５０〜１００μｇ/ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地に形質転換体を植菌し、３７℃で振とう培養する。培養液の濁度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．４〜０．５になるまで菌が増殖した時点で培養液を４℃に冷却する。そして、最終濃度０．１〜１．０ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して１５℃で静置して培養する。培養終了後、菌を集めて溶菌し、可溶物の中からアクチンを回収する。前記溶菌からアクチンの回収に至るまでの工程は、ＡＤＰおよびＤＩＦＰの存在下で行う。なお、前記製造工程の各培養の時間は、種々の条件により適宜決定する。
【００２０】
つぎに、本発明の実施例について比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、下記の実施例および比較例によってなんら限定されない。
【実施例１】
【００２１】
（形質転換大腸菌の作製）
プラスミド精製（アルカリＳＤＳ法）によって得たｐＧＥＸ−６Ｐ−ＡｃｔｉｎプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ（東洋紡社製）およびＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）により制限酵素処理を行ってＡｃｔｉｎ ｃＤＮＡを切り出した。ベクターとしては、商品名ｐＣｏｌｄ Ｉ ＤＮＡ（Ｃｏｄｅ３３６０，タカラバイオ社製）を用いた。前記ｐＣｏｌｄ Ｉ ＤＮＡベクターを、ＢａｍＨＩ（東洋紡社製）およびＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）により制限酵素処理を行い、ついで、アルカリフォスフォターゼ処理を行った。商品名Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｓ ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用い、前記ＡｃｔｉｎインサートＤＮＡ（０．５ｐｍｏｌ）および前記ベクター（０．０５ｐｍｏｌ）を混合して５μＬの溶液を調製し、これに前記キットのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ ５μＬを加え、１５℃で４時間インキュベートしてＬｉｇａｔｉｏｎを行った後、前記キットのＳｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩ １μＬを加えて、下記のＴＳＳ法で、大腸菌ＸＬ−１株への形質移入を行った。大腸菌ＸＬ−１株を増殖させてプラスミドを調製した後、再びＴＳＳ法で、大腸菌ＢＬ−２１株に形質導入した。前記大腸菌ＢＬ−２１株においてミニスケール発現を行い、アクチンの発現を確認するとともに、ジデオキシ法でＤＮＡ配列の確認を行った。
【００２２】
ＴＳＳ法（大腸菌の形質転換法）
大腸菌ＢＬ−２１株を２ｍＬ ＬＢ培地（アンピシリンなし）で、３７℃で一晩震盪培養する。培養液２０μＬを２ｍＬ ＬＢ培地へ移し、さらに３時間震盪培養する。その培養液１．５ｍＬをエッペンチューブへ移し、小型遠心機で１５０００ｒｐｍ×１分遠心し、デカンテーションにより上澄みを除去する。沈澱した菌体を手でほぐし、氷冷する。菌体にＴＳＳ溶液２００μＬ、ＤＭＳＯ１０μＬ，およびＤＮＡ溶液１０μＬを順次加え、ピペッティングにより混合する。３０分間氷冷した後、クリーンベンチの中でＬＢ−Ａｍｐ５０寒天プレートに菌体をスプレッダーで捲く。プレートを気相インキュベータで３７℃１０時間インキュベートする。プラスミドがトランスフォームされた菌はコロニーを形成するので、形成したコロニーを楊子でつついて採取する。
【００２３】
（アクチン遺伝子の発現）
前記形質転換大腸菌を、ＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ入り）を用い、３７℃で４時間、試験管（４ｍＬ×５）で振とう培養し、ついで、２リットル培地中で３７℃で４時間、静置培養した。つぎに、４℃に冷却後、前記培地にＩＰＴＧ（最終濃度５０μＭ）を添加して１５℃で２０時間培養することによりＩＰＴＧ誘導してアクチン遺伝子を発現させた。
【００２４】
（溶菌処理）
アクチン遺伝子の発現後、遠心（６０００ｒｐｍ×１０分、４℃）して前記大腸菌を集菌し、冷凍機で１時間以上凍結させた後、融解し、下記の組成の溶菌バッファーに前記大腸菌を分散した。なお、下記の組成表に示すように、インヒビター類は、分散させた後に添加した。そして、前記溶菌バッファーに分散した前記大腸菌を超音波処理（６０Ｗ×１分、８回）により溶菌した。
【００２５】
溶菌バッファー組成 （１００ｍＬに対して）
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） １ｍＬ（１０ｍＭ）
０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） １ｍＬ（１ｍＭ）
０．４Ｍ ＰＭＳＦ ２５μＬ（０．１ｍＭ）（分散後添加）
１Ｍ ＤＴＴ ５０μＬ（０．５ｍＭ）（分散後添加）
１Ｍ ＡＤＰ １００μＬ（１ｍＭ）（分散後添加）
ＤＩＦＰ ６．０μＬ（分散後添加）
【００２６】
（アクチンの回収と粗精製）
前記超音波処理した液を遠心（１８０００ｒｐｍ×２０分、４℃）し、その上清液を採取した。前記上清液に対し、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（商品名Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ、キアゲン社製）を用いて、粗精製を行った。前記Ｎｉ−ＮＴＡビーズは、下記組成のＰＢＳ（１ｍＭのＡＤＰ添加）を加えて濃度５０％のスラリーにしたものである。前記上清液に、前記Ｎｉ−ＮＴＡビーズのスラリーを６ｍｌ添加し、４℃で一晩ディスクロータでゆっくり回転させた。その後、静置して沈澱させ、沈殿を回収した。洗浄は，下記のＰＢＳ，界面活性剤、バッファーＰ（各４０ｍＬ）を順次用いて、次のように行った。すなわち、沈澱に洗浄液を加えて１０分間４℃で回転させた後、遠心（２２００ｒｐｍ×１０分、４℃）して沈澱を取る操作を繰り返した。次に沈澱からの溶出にはバッファーＰ´を１０ｍＬ加えて４℃で３０分間回転後、遠心（同上）して上清をとるという操作を３回繰り返した。得られた上清について、下記バッファーＧ（１リットル）に対する透析（２時間、４℃）を行った。２時間後、外液を交換し、さらに、２時間、前述と同様の透析を行った。その後、遠心ろ過フィルター（商品名Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、分画３００００、ミリポア社製）を用いてタンパク質溶液を濃縮し、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびタンパク質定量を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥについては、ＩＰＴＧ誘導前、ＩＰＴＧ誘導後、溶菌後の上清、溶菌後の沈殿、ビーズ吸着後上清、１回目洗浄液（ＰＢＳ）、２回目洗浄液（Ｔｒｉｔｏｎ溶液）、３回目洗浄液（バッファーＰ）、溶出１回目の溶出液についても実施した。なお、粗精製で得られたアクチンは、ＨｉｓのＴａｇがついたアクチン（Ｈｉｓ−Ａｃｔｉｎ）である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１の写真に示す。前記タンパク質の定量は、プロテインアッセイ染色液（Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅによる発色液、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用い、標準液として牛血清アルブミンを用いて実施した。
【００２７】
ＰＢＳ組成
５０ｍＭ ＮａＣｌ
５０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４
１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４
１ｍＭ ＡＤＰ
５ｍＭ イミダゾール
【００２８】
界面活性剤溶液（Ｔｒｉｔｏｎ溶液）
商品名Ｔｒｉｔｏｎ ０．５％（ｗ／ｖ）
１０ｍＭ イミダゾール
１ｍＭ ＡＤＰ
【００２９】
バッファーＰ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ イミダゾール
１ｍＭ ＡＤＰ
【００３０】
バッファーＰ´
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
２５０ｍＭ イミダゾール
１ｍＭ ＤＴＴ
１ｍＭ ＡＤＰ
【００３１】
バッファーＧ
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２ｍＭ ＡＴＰ
０．５ｍＭ ＤＴＴ
【００３２】
（比較例１）
アクチン遺伝子挿入ベクターとしてｐＧＥＸ−６Ｐ−ａｃｔｉｎを準備し、これを用いて大腸菌を形質転換した。この形質転換大腸菌を、実施例１と同じ培地を用い、３７℃で３時間、振とう培養し、ついで、前記培地にＩＰＴＧ（最終濃度５０μM）を添加した。そして２０℃で２０時間培養することによりＩＰＴＧ誘導してアクチン遺伝子を発現させた。前記大腸菌について、以下に示す条件および操作で、アクチンの回収と粗精製を行った。
【００３３】
前記超音波処理した液を遠心（１８０００ｒｐｍ×２０分、４℃）し、その上清液を採取した。前記上清液に対し、Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（商品名Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて粗製製を行った。前記ビーズは、前記組成のＰＢＳを加えて濃度５０％のスラリーにしたものである。前記上清液に、前記ビーズのスラリーを６ｍｌ添加し、４℃で一晩ディスクロータでゆっくり回転させた。その後、静置して沈澱させ、沈殿を回収した。洗浄は，前記のＰＢＳ，界面活性剤、バッファーＰ（各４０ｍＬ）を順次用いて、次のように行った。すなわち、沈澱に洗浄液を加えて１０分間４℃で回転させた後、遠心（２２００ｒｐｍ×１０分、４℃）して沈澱を取る操作を繰り返した。次に沈澱からの溶出にはバッファーＰ´を１０ｍＬ加えて４℃で３０分間回転後、遠心（同上）して上清をとるという操作を３回繰り返した。得られた上清について、ＧＳＴ融合タンパク質切断用プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓ）１０μＬおよび１ｍＭ ＤＴＴ２４０μＬを添加した前記バッファーＰを加えて、４℃で１時間ディスクロータでゆっくり回転させる溶出（抽出）処理を６回行った。前記抽出液を、下記バッファー（１リットル）に対する透析（２時間、４℃）を行った。２時間後、外液を交換し、さらに、２時間、前述と同様の透析を行った。その後、遠心ろ過フィルター（商品名Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、分画３００００、ミリポア社製）を用いてタンパク質溶液を濃縮し、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびタンパク質定量を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥについては、ビーズ吸着後１回目から６回目の抽出液と，それらのうち純度のよかった１回目と２回目を合わせて濃縮したもの（精製サンプル）について示した。なお、この粗精製で得られたアクチンは、Ｔａｇのないアクチンである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２の写真に示す。前記タンパク質の定量は、前記実施例１と同様にして実施した。
【００３４】
バッファー組成
１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２ｍＭ ＡＴＰ
【００３５】
前記実施例１において、粗精製におけるアクチンの純度は、７０％であり、回収率は、アクチン量２．７ｍｇ／Ｌ（培地）であり、高回収率でアクチンを得ることができた。これに対し、比較例１では、純度は７０％であったが、回収率がアクチン量０．５ｍｇ／Ｌ（培地）であり、回収率が悪かった。なお、比較例１では、Ｔａｇを外す必要があったので、これ以上精製することができないため、純度をさらに上げることは困難であった。これに対し、本実施例では、以下の実施例２に示すように、さらに純度を上げることが可能であった。
【実施例２】
【００３６】
実施例１と同様にして粗精製のアクチン（Ｈｉｓ−Ａｃｔｉｎ）を得た。このアクチンを前記Ｎｉ−ＮＴＡビーズを充填したカラムにより精製を行った。前記カラムによる精製は、まず、１０ｍＭイミダゾールを含むＮｉ用バッファー（下記参照）によりプレ平衡化を行ったＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ５ｍＬをカラムに詰めた後、同じバッファーを送液して平衡化を行った。その後、前記粗精製のアクチン溶液（濃縮液）をカラムの上に載せて４℃で６０分間放置し、再度、前記バッファーをチャートが落ち着くまで流した（カラム洗浄）。つぎに、１０〜２５０ｍＭイミダゾール含有のＮｉ用バッファーでグラジェントを行い、約１．５ｍＬずつのフラクションで回収した。回収したフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥして、目的のタンパク質（アクチン）のみを含むフラクションについて、実施例１と同様にして、濃縮および透析を行い、精製アクチン（Ｈｉｓ−Ａｃｔｉｎ）を得た。前記カラムの溶出チャートおよび各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、図３に示す。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、本実施例で得られた精製アクチンの純度は、９０〜９５％であった。
【００３７】
Ｎｉ用バッファー
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２ｍＭ ＡＤＰ
０．１ｍＭ ＤＴＴ
【００３８】
このようにして得られた精製アクチンについて、重合能を調べた。すなわち、まず、約１０μＭの精製アクチン溶液に、１／１０量の１０×バッファーＦ（下記参照）およびプロテアーゼインヒビター溶液（下記参照）を加え、３７℃で３０分インキュベートした。この反応液を、クッションバッファー（下記参照）の上に重層させ、超遠心（２６５０００×ｇ、１時間、２４℃）を行い、上清（Ｇ−Ａｃｔｉｎ）および沈殿物（Ｆ−Ａｃｔｉｎ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。また、対照として、市販の精製アクチン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製）を用いて同様に重合能を調べた。これらの結果を、図４に示す。なお、図４の上に前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を示し、図４の下に、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＡｃｔｉｎバンドを定量化したグラフを示す。
【００３９】
バッファーＦ
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
５０ｍＭ ＫＣｌ
２ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｍＭ ＡＴＰ
【００４０】
プロテアーゼインヒビター溶液
０．２ｍＭ ＰＭＳＦ
１０μＭ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ
１μＭ Ｐｅｐｓｔａｉｎ
５ｍＭ ＤＩＦＰ
【００４１】
クッションバッファー
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．２ｍＭ ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０％（ｗ／ｖ） グリセリン
【００４２】
図４に示すように、本実施例の精製アクチンは、市販の精製アクチンと同等の重合能を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、アクチンを高回収率で容易に製造できるアクチンの製造方法である。本発明によれば、高品質のアクチンないしアクチン変異体を低コストかつ大量に供給可能である。したがって、本発明は、アクチンに関する研究、技術開発、臨床応用、生物学、医学、薬学および農学等のアクチンに関わる全ての分野に好ましく利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、本発明の一実施例におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図２】図２は、比較例のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図３】図３は、本発明のその他の実施例における溶出チャートおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図４】図４は、前記実施例におけるアクチンの重合能を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクチンの製造方法、それに用いるベクターおよび原核宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
アクチンは、筋肉を構成するタンパク質として、１９４２年に発見された。筋肉において、アクチンは多量化して繊維状となり、ＡＴＰをＡＤＰに変換するエネルギーにより、繊維状アクチンの間をミオシンが滑ることで筋肉が収縮する。この他に、アクチンは、一般の細胞内にもマトリックスタンパク質として存在し、生体内のタンパク質総量の５ないし１０％を占める最も量の多いタンパク質である。アクチンは、一分子あたり、ＡＴＰおよびカルシウムを各一個有している。アクチンの形状は、亜鈴状をしており、ＡＴＰが失われると、二量体となる。単量体をＧアクチンといい、重合してポリマーとなったアクチンをＦアクチンという。真核生物に広く存在するアクチンの一次構造は、保守的で種別による大きな変化はない。哺乳類では、六種類のアイソアクチンが知られており、等電点の差から、αアクチン（骨格筋）、βアクチン（一般細胞）、γアクチン（平滑筋）等がある。
【０００３】
このように、アクチンは、広く生物に分布するタンパク質であるため、その研究が各分野で進められている。しかしながら、研究材料としてのアクチンの入手が困難である。すなわち、ヒト等の真核生物のアクチンを遺伝子工学で製造する場合、通常、アクチン遺伝子を導入した組換え酵母が用いられるが、この手法では、培養や細胞の粉砕等に手間がかかり不便である（非特許文献１）。また、生物から直接アクチンを採取する方法もあるが、生体材料の確保や抽出精製作業の点から大量のアクチンを採取することは実質的に困難である。このような点から、研究材料として市販されているアクチンは、大変高価であり、アクチンを大量に用いて研究することが困難であった。さらに、アクチンの機能や生物進化的な意義を解明するには、アクチンの変異体を作製する必要がある。このため、大量培養が容易で発現タンパク質の抽出精製が酵母よりも容易な大腸菌を用いてアクチン遺伝子を発現させることが試みられている（非特許文献２）。しかしながら、大腸菌を用いたアクチンの生産では、アクチン重合による不溶化、不純物タンパク質生成、アクチンの分解等の原因により、その収率等に問題があった。したがって、大腸菌を用いてアクチンを高収率で生産することは不可能であるというのが、従来の技術常識であり、他の原核生物を用いても同様であった。
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３２：３３７−３５０（Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９２）
【非特許文献２】ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．２６５，Ｎｏ．２９，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５，ｐｐ．１７９８０−１７９８７，１９９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、アクチンないしアクチンの変異体を高収率で容易に製造可能なアクチンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のアクチンの製造方法は、アクチン遺伝子を含むコールドショック発現ベクターにより形質転換された原核宿主細胞を準備する準備工程と、前記原核宿主細胞の正常生理的増殖温度よりも低い温度で前記原核収縮細胞を培養することにより前記コールドショック発現ベクター中のアクチン遺伝子を発現させてアクチンを産生させるアクチン産生工程とを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
このように、本発明の製造方法では、低温化でアクチン遺伝子を発現させるため、アクチンの重合による不溶化を防止でき、不純物タンパク質の生成およびアクチンの分解を抑制することが可能である。また、本発明の製造方法では、大量培養が容易であり、また生成したアクチンの抽出精製操作が容易な原核宿主細胞を使用している。したがって、本発明の製造方法によれば、高収率で容易にアクチンを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
つぎに、本発明について例をあげて詳しく説明する。ただし、本発明は、下記の事項によって限定されない。
【０００９】
本発明において、対象になるアクチンは特に制限されず、アクチン変異体も含む。また、製造対象になるアクチンは、αアクチン、βアクチン、γアクチンおよびこれらのアクチンの各変異体が好ましく、より好ましくは、βアクチンおよびその変異体である。また、アクチンの変異体を製造する場合のアクチン遺伝子は、アクチンの変異遺伝子である。本発明のベクターは、本発明の製造方法に使用するベクターであって、前記ベクターはコールドショック発現ベクターであり、前記ベクターが、アクチン遺伝子またはアクチンの変異遺伝子を発現可能な状態で含むベクターである。本発明のベクターとしては、例えば、後述のベクターがある。
【００１０】
本発明の原核宿主細胞は、本発明のアクチンの製造方法に使用する原核宿主細胞であって、本発明のベクターにより形質転換されている原核宿主細胞である。本発明において、前記原核宿主細胞は、特に限定されず、例えば、大腸菌および枯草菌等があげられ、このなかでも大腸菌が好ましい。
【００１１】
本発明において、前記原核宿主細胞が大腸菌であり、前記コールドショック発現ベクターが、大腸菌コールドショック遺伝子のプロモータおよび５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）を含むベクターであることが好ましい。また、前記プロモータが、ｃｓｐＡプロモータであることが好ましい。また、前記ベクターは、さらに１２塩基配列のＡＴリッチの翻訳増強エレメントを含むことが好ましい。前記ＡＴリッチとは、１２塩基配列中の７０％以上の塩基がＡＴであることを意味する。そして、前記ベクターは、ＡＡＧＡＧＧＴのＳＤ配列を有することが好ましい。アクチン遺伝子の塩基配列中には、ＡＡＧＧという偽ＳＤ配列が含まれており、このため従来のベクターを用いて大腸菌でアクチン遺伝子を発現しようとすると、アクチン遺伝子の途中から翻訳が始まってしまい、これが不純物タンパク質生成の原因の一つであった。これに対し、前記ベクターが、ＡＡＧＡＧＧＴのＳＤ配列を有すると、大腸菌中のｒＲＮＡサブユニットとの配列と親和性が高いため、アクチン遺伝子の偽ＳＤ配列からの翻訳が防止できる。
【００１２】
上述のコールドショック発現ベクターとしては、例えば、特表２００５−５１８８０４号公報に記載のベクターがあり、前記ベクターの塩基配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋに登録されており、そのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．は、ＡＢ１８６３８８，ＡＢ１８６３８９、ＡＢ１８６３９０およびＡＢ１８６３９１である。また、前記公報記載のベクターの市販品としては、タカラバイオ社製の商品名ｐＣｏｌｄ Ｉ〜ＩＶ ベクターがある（以下、「ｐＣｏｌｄベクター」ともいう）。ｐＣｏｌｄベクターの外来遺伝子挿入部位には、ｃｏｓＡプロモータ、ｌａｃオペレータ、ｃｓｐＡ５´ＵＴＲ、ＭＣＳ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）およびｃｓｐＡ３´ＵＴＲが、この順序で作動的に連結しており、前記ＭＣＳ部位に、アクチン遺伝子やアクチンの変異遺伝子を挿入できる。また、前記外来遺伝子挿入部位には、必要に応じて、ＴＥＥ配列、Ｈｉｓ・Ｔａｇ配列およびＦａｃｔｏｒ Ｘａ切断配列が挿入される。その他、ｐＣｏｌｄベクターには、大腸菌の複製起点（ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）、ｌａｃ Ｉ，Ａｍｐｒ，Ｍ１３ ＩＧの各遺伝子が挿入されている。
【００１３】
本発明の前記アクチン産生工程において、本プラスミドは、正常生理的増殖温度よりも１３℃低い温度で培養することが好ましく、より好ましくは、正常生理的増殖温度よりも２０℃低い温度で培養することである。例えば、大腸菌の正常生理的増殖温度は３７℃であるので、タンパク発現工程の培養温度は、２４℃以下が好ましく、より好ましくは１７℃以下である。
【００１４】
本発明の製造方法において、さらに、前記原核宿主細胞を、その正常生理的増殖温度で培養する一般培養工程を有し、前記一般培養工程で前記原核宿主細胞を培養した後、前記アクチン産生工程を実施することが好ましい。すなわち、前記一般培養工程で大腸菌を十分量培養した後、アクチン産生工程を実施すれば、アクチンをより大量に製造することができる。
【００１５】
本発明において、さらに、前記原核宿主細胞を溶菌して産生されたアクチンを回収する回収工程を有することが好ましい。そして、前記回収工程を、ＡＤＰおよびセリンプロテアーゼインヒビターの少なくとも一方の存在下で実施することが好ましい。ＡＤＰの存在下で前記回収工程を実施すれば、生成したアクチンの重合をより効果的に抑制でき、また前記セリンプロテアーゼインヒビターの存在下で前記回収工程を実施すれば、生成したアクチンのプロテアーゼによる分解をより効果的に抑制できるからである。前記セリンプロテアーゼインヒビターは、ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＩＦＰ）が好ましい。なお、ＡＤＰおよび前記インヒビターの少なくとも一方の存在下という条件は、前記回収工程の全工程に適用してもよいし、一部の工程に適用してもよいが、好ましくは全工程に適用することである。
【００１６】
本発明において、さらに、前記回収したアクチンを精製する精製工程を有することが好ましい。例えば、Ｈｉｓ・Ｔａｇを有する前記ｐＣｏｌｄベクターを用いれば、後述の実施例２に記載するように、Ｎｉカラムのクロマトグラフィーを実施して精製することができ、これにより、高純度のアクチンを得ることが可能になる。
【００１７】
本発明の製造方法は、例えば、ｐＣｏｌｄベクターを用い、つぎのようにして実施できる。
【００１８】
まず、アクチン遺伝子を準備する。アクチン遺伝子は既に塩基配列が公知であり、種々生物組織から特異的プライマーを用いてクローニングして自家調製できる。
【００１９】
つぎに、ｐＣｏｌｄベクターのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩサイトの間に前記アクチン遺伝子をサブクローニングして発現用プラスミドを作製する。この発現用プラスミドで宿主大腸菌を形質転換し、アンピシリンを含む選択培地プレートを用いて形質転換体を選択する。つぎに、５０〜１００μｇ/ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地に形質転換体を植菌し、３７℃で振とう培養する。培養液の濁度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．４〜０．５になるまで菌が増殖した時点で培養液を４℃に冷却する。そして、最終濃度０．１〜１．０ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して１５℃で静置して培養する。培養終了後、菌を集めて溶菌し、可溶物の中からアクチンを回収する。前記溶菌からアクチンの回収に至るまでの工程は、ＡＤＰおよびＤＩＦＰの存在下で行う。なお、前記製造工程の各培養の時間は、種々の条件により適宜決定する。
【００２０】
つぎに、本発明の実施例について比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、下記の実施例および比較例によってなんら限定されない。
【実施例１】
【００２１】
（形質転換大腸菌の作製）
プラスミド精製（アルカリＳＤＳ法）によって得たｐＧＥＸ−６Ｐ−ＡｃｔｉｎプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ（東洋紡社製）およびＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）により制限酵素処理を行ってＡｃｔｉｎ ｃＤＮＡを切り出した。ベクターとしては、商品名ｐＣｏｌｄ Ｉ ＤＮＡ（Ｃｏｄｅ３３６０，タカラバイオ社製）を用いた。前記ｐＣｏｌｄ Ｉ ＤＮＡベクターを、ＢａｍＨＩ（東洋紡社製）およびＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）により制限酵素処理を行い、ついで、アルカリフォスフォターゼ処理を行った。商品名Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｓ ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用い、前記ＡｃｔｉｎインサートＤＮＡ（０．５ｐｍｏｌ）および前記ベクター（０．０５ｐｍｏｌ）を混合して５μＬの溶液を調製し、これに前記キットのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ ５μＬを加え、１５℃で４時間インキュベートしてＬｉｇａｔｉｏｎを行った後、前記キットのＳｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩ １μＬを加えて、下記のＴＳＳ法で、大腸菌ＸＬ−１株への形質移入を行った。大腸菌ＸＬ−１株を増殖させてプラスミドを調製した後、再びＴＳＳ法で、大腸菌ＢＬ−２１株に形質導入した。前記大腸菌ＢＬ−２１株においてミニスケール発現を行い、アクチンの発現を確認するとともに、ジデオキシ法でＤＮＡ配列の確認を行った。
【００２２】
ＴＳＳ法（大腸菌の形質転換法）
大腸菌ＢＬ−２１株を２ｍＬ ＬＢ培地（アンピシリンなし）で、３７℃で一晩震盪培養する。培養液２０μＬを２ｍＬ ＬＢ培地へ移し、さらに３時間震盪培養する。その培養液１．５ｍＬをエッペンチューブへ移し、小型遠心機で１５０００ｒｐｍ×１分遠心し、デカンテーションにより上澄みを除去する。沈澱した菌体を手でほぐし、氷冷する。菌体にＴＳＳ溶液２００μＬ、ＤＭＳＯ１０μＬ，およびＤＮＡ溶液１０μＬを順次加え、ピペッティングにより混合する。３０分間氷冷した後、クリーンベンチの中でＬＢ−Ａｍｐ５０寒天プレートに菌体をスプレッダーで捲く。プレートを気相インキュベータで３７℃１０時間インキュベートする。プラスミドがトランスフォームされた菌はコロニーを形成するので、形成したコロニーを楊子でつついて採取する。
【００２３】
（アクチン遺伝子の発現）
前記形質転換大腸菌を、ＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ入り）を用い、３７℃で４時間、試験管（４ｍＬ×５）で振とう培養し、ついで、２リットル培地中で３７℃で４時間、静置培養した。つぎに、４℃に冷却後、前記培地にＩＰＴＧ（最終濃度５０μＭ）を添加して１５℃で２０時間培養することによりＩＰＴＧ誘導してアクチン遺伝子を発現させた。
【００２４】
（溶菌処理）
アクチン遺伝子の発現後、遠心（６０００ｒｐｍ×１０分、４℃）して前記大腸菌を集菌し、冷凍機で１時間以上凍結させた後、融解し、下記の組成の溶菌バッファーに前記大腸菌を分散した。なお、下記の組成表に示すように、インヒビター類は、分散させた後に添加した。そして、前記溶菌バッファーに分散した前記大腸菌を超音波処理（６０Ｗ×１分、８回）により溶菌した。
【００２５】
溶菌バッファー組成 （１００ｍＬに対して）
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） １ｍＬ（１０ｍＭ）
０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） １ｍＬ（１ｍＭ）
０．４Ｍ ＰＭＳＦ ２５μＬ（０．１ｍＭ）（分散後添加）
１Ｍ ＤＴＴ ５０μＬ（０．５ｍＭ）（分散後添加）
１Ｍ ＡＤＰ １００μＬ（１ｍＭ）（分散後添加）
ＤＩＦＰ ６．０μＬ（分散後添加）
【００２６】
（アクチンの回収と粗精製）
前記超音波処理した液を遠心（１８０００ｒｐｍ×２０分、４℃）し、その上清液を採取した。前記上清液に対し、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（商品名Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ、キアゲン社製）を用いて、粗精製を行った。前記Ｎｉ−ＮＴＡビーズは、下記組成のＰＢＳ（１ｍＭのＡＤＰ添加）を加えて濃度５０％のスラリーにしたものである。前記上清液に、前記Ｎｉ−ＮＴＡビーズのスラリーを６ｍｌ添加し、４℃で一晩ディスクロータでゆっくり回転させた。その後、静置して沈澱させ、沈殿を回収した。洗浄は，下記のＰＢＳ，界面活性剤、バッファーＰ（各４０ｍＬ）を順次用いて、次のように行った。すなわち、沈澱に洗浄液を加えて１０分間４℃で回転させた後、遠心（２２００ｒｐｍ×１０分、４℃）して沈澱を取る操作を繰り返した。次に沈澱からの溶出にはバッファーＰ´を１０ｍＬ加えて４℃で３０分間回転後、遠心（同上）して上清をとるという操作を３回繰り返した。得られた上清について、下記バッファーＧ（１リットル）に対する透析（２時間、４℃）を行った。２時間後、外液を交換し、さらに、２時間、前述と同様の透析を行った。その後、遠心ろ過フィルター（商品名Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、分画３００００、ミリポア社製）を用いてタンパク質溶液を濃縮し、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびタンパク質定量を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥについては、ＩＰＴＧ誘導前、ＩＰＴＧ誘導後、溶菌後の上清、溶菌後の沈殿、ビーズ吸着後上清、１回目洗浄液（ＰＢＳ）、２回目洗浄液（Ｔｒｉｔｏｎ溶液）、３回目洗浄液（バッファーＰ）、溶出１回目の溶出液についても実施した。なお、粗精製で得られたアクチンは、ＨｉｓのＴａｇがついたアクチン（Ｈｉｓ−Ａｃｔｉｎ）である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１の写真に示す。前記タンパク質の定量は、プロテインアッセイ染色液（Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅによる発色液、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用い、標準液として牛血清アルブミンを用いて実施した。
【００２７】
ＰＢＳ組成
５０ｍＭ ＮａＣｌ
５０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４
１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４
１ｍＭ ＡＤＰ
５ｍＭ イミダゾール
【００２８】
界面活性剤溶液（Ｔｒｉｔｏｎ溶液）
商品名Ｔｒｉｔｏｎ ０．５％（ｗ／ｖ）
１０ｍＭ イミダゾール
１ｍＭ ＡＤＰ
【００２９】
バッファーＰ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ イミダゾール
１ｍＭ ＡＤＰ
【００３０】
バッファーＰ´
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
２５０ｍＭ イミダゾール
１ｍＭ ＤＴＴ
１ｍＭ ＡＤＰ
【００３１】
バッファーＧ
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２ｍＭ ＡＴＰ
０．５ｍＭ ＤＴＴ
【００３２】
（比較例１）
アクチン遺伝子挿入ベクターとしてｐＧＥＸ−６Ｐ−ａｃｔｉｎを準備し、これを用いて大腸菌を形質転換した。この形質転換大腸菌を、実施例１と同じ培地を用い、３７℃で３時間、振とう培養し、ついで、前記培地にＩＰＴＧ（最終濃度５０μM）を添加した。そして２０℃で２０時間培養することによりＩＰＴＧ誘導してアクチン遺伝子を発現させた。前記大腸菌について、以下に示す条件および操作で、アクチンの回収と粗精製を行った。
【００３３】
前記超音波処理した液を遠心（１８０００ｒｐｍ×２０分、４℃）し、その上清液を採取した。前記上清液に対し、Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（商品名Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて粗製製を行った。前記ビーズは、前記組成のＰＢＳを加えて濃度５０％のスラリーにしたものである。前記上清液に、前記ビーズのスラリーを６ｍｌ添加し、４℃で一晩ディスクロータでゆっくり回転させた。その後、静置して沈澱させ、沈殿を回収した。洗浄は，前記のＰＢＳ，界面活性剤、バッファーＰ（各４０ｍＬ）を順次用いて、次のように行った。すなわち、沈澱に洗浄液を加えて１０分間４℃で回転させた後、遠心（２２００ｒｐｍ×１０分、４℃）して沈澱を取る操作を繰り返した。次に沈澱からの溶出にはバッファーＰ´を１０ｍＬ加えて４℃で３０分間回転後、遠心（同上）して上清をとるという操作を３回繰り返した。得られた上清について、ＧＳＴ融合タンパク質切断用プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓ）１０μＬおよび１ｍＭ ＤＴＴ２４０μＬを添加した前記バッファーＰを加えて、４℃で１時間ディスクロータでゆっくり回転させる溶出（抽出）処理を６回行った。前記抽出液を、下記バッファー（１リットル）に対する透析（２時間、４℃）を行った。２時間後、外液を交換し、さらに、２時間、前述と同様の透析を行った。その後、遠心ろ過フィルター（商品名Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、分画３００００、ミリポア社製）を用いてタンパク質溶液を濃縮し、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびタンパク質定量を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥについては、ビーズ吸着後１回目から６回目の抽出液と，それらのうち純度のよかった１回目と２回目を合わせて濃縮したもの（精製サンプル）について示した。なお、この粗精製で得られたアクチンは、Ｔａｇのないアクチンである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２の写真に示す。前記タンパク質の定量は、前記実施例１と同様にして実施した。
【００３４】
バッファー組成
１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２ｍＭ ＡＴＰ
【００３５】
前記実施例１において、粗精製におけるアクチンの純度は、７０％であり、回収率は、アクチン量２．７ｍｇ／Ｌ（培地）であり、高回収率でアクチンを得ることができた。これに対し、比較例１では、純度は７０％であったが、回収率がアクチン量０．５ｍｇ／Ｌ（培地）であり、回収率が悪かった。なお、比較例１では、Ｔａｇを外す必要があったので、これ以上精製することができないため、純度をさらに上げることは困難であった。これに対し、本実施例では、以下の実施例２に示すように、さらに純度を上げることが可能であった。
【実施例２】
【００３６】
実施例１と同様にして粗精製のアクチン（Ｈｉｓ−Ａｃｔｉｎ）を得た。このアクチンを前記Ｎｉ−ＮＴＡビーズを充填したカラムにより精製を行った。前記カラムによる精製は、まず、１０ｍＭイミダゾールを含むＮｉ用バッファー（下記参照）によりプレ平衡化を行ったＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ５ｍＬをカラムに詰めた後、同じバッファーを送液して平衡化を行った。その後、前記粗精製のアクチン溶液（濃縮液）をカラムの上に載せて４℃で６０分間放置し、再度、前記バッファーをチャートが落ち着くまで流した（カラム洗浄）。つぎに、１０〜２５０ｍＭイミダゾール含有のＮｉ用バッファーでグラジェントを行い、約１．５ｍＬずつのフラクションで回収した。回収したフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥして、目的のタンパク質（アクチン）のみを含むフラクションについて、実施例１と同様にして、濃縮および透析を行い、精製アクチン（Ｈｉｓ−Ａｃｔｉｎ）を得た。前記カラムの溶出チャートおよび各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、図３に示す。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、本実施例で得られた精製アクチンの純度は、９０〜９５％であった。
【００３７】
Ｎｉ用バッファー
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２ｍＭ ＡＤＰ
０．１ｍＭ ＤＴＴ
【００３８】
このようにして得られた精製アクチンについて、重合能を調べた。すなわち、まず、約１０μＭの精製アクチン溶液に、１／１０量の１０×バッファーＦ（下記参照）およびプロテアーゼインヒビター溶液（下記参照）を加え、３７℃で３０分インキュベートした。この反応液を、クッションバッファー（下記参照）の上に重層させ、超遠心（２６５０００×ｇ、１時間、２４℃）を行い、上清（Ｇ−Ａｃｔｉｎ）および沈殿物（Ｆ−Ａｃｔｉｎ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。また、対照として、市販の精製アクチン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製）を用いて同様に重合能を調べた。これらの結果を、図４に示す。なお、図４の上に前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を示し、図４の下に、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＡｃｔｉｎバンドを定量化したグラフを示す。
【００３９】
バッファーＦ
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
５０ｍＭ ＫＣｌ
２ｍＭ ＭｇＣｌ２
１ｍＭ ＡＴＰ
【００４０】
プロテアーゼインヒビター溶液
０．２ｍＭ ＰＭＳＦ
１０μＭ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ
１μＭ Ｐｅｐｓｔａｉｎ
５ｍＭ ＤＩＦＰ
【００４１】
クッションバッファー
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．２ｍＭ ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０％（ｗ／ｖ） グリセリン
【００４２】
図４に示すように、本実施例の精製アクチンは、市販の精製アクチンと同等の重合能を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、アクチンを高回収率で容易に製造できるアクチンの製造方法である。本発明によれば、高品質のアクチンないしアクチン変異体を低コストかつ大量に供給可能である。したがって、本発明は、アクチンに関する研究、技術開発、臨床応用、生物学、医学、薬学および農学等のアクチンに関わる全ての分野に好ましく利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、本発明の一実施例におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図２】図２は、比較例のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図３】図３は、本発明のその他の実施例における溶出チャートおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図４】図４は、前記実施例におけるアクチンの重合能を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチンの製造方法であって、アクチン遺伝子を含むコールドショック発現ベクターにより形質転換された原核宿主細胞を準備する準備工程と、前記原核宿主細胞の正常生理的増殖温度よりも低い温度で前記原核宿主細胞を培養することにより前記コールドショック発現ベクター中のアクチン遺伝子を発現させてアクチンを産生させるアクチン産生工程とを含むことを特徴とするアクチンの製造方法。
【請求項２】
前記原核宿主細胞が大腸菌であり、前記コールドショック発現ベクターが、大腸菌コールドショック遺伝子のプロモータおよび５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）を含むベクターである請求項１記載のアクチンの製造方法。
【請求項３】
前記プロモータが、ｃｓｐＡプロモータである請求項２記載のアクチンの製造方法。
【請求項４】
前記ベクターが、さらに１２塩基配列のＡＴリッチの翻訳増強エレメントを含む請求項２または３に記載のアクチンの製造方法。
【請求項５】
前記ベクターが、ＡＡＧＡＧＧＴのＳＤ配列を有する請求項２から４のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項６】
前記産生工程において、前記正常生理的増殖温度よりも１３℃低い温度で培養する請求項１から５のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項７】
さらに、前記原核宿主細胞を、その正常生理的増殖温度で培養する一般培養工程を有し、前記一般培養工程で前記原核宿主細胞を培養した後、前記アクチン産生工程を実施する請求項１から６のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項８】
さらに、前記原核宿主細胞を溶菌して産生されたアクチンを回収する回収工程を有する請求項１から７のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項９】
前記回収工程を、ＡＤＰおよびセリンプロテアーゼインヒビターの少なくとも一方の存在下で実施する請求項８記載のアクチンの製造方法。
【請求項１０】
前記セリンプロテアーゼインヒビターが、ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＩＦＰ）である請求項９記載のアクチンの製造方法。
【請求項１１】
さらに、回収したアクチンを精製する精製工程を有する請求項１から１０のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項１２】
前記アクチンが、β−アクチンである請求項１から１１のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項１３】
前記アクチンが、アクチン変異体であり、前記アクチン遺伝子が、前記アクチンの変異遺伝子である請求項１から１１のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項１４】
請求項１記載のアクチンの製造方法に使用するベクターであって、前記ベクターがコールドショック発現ベクターであり、前記ベクターが、アクチン遺伝子またはアクチンの変異遺伝子を発現可能な状態で含むベクター。
【請求項１５】
請求項１記載のアクチンの製造方法に使用する原核宿主細胞であって、請求項１４記載のベクターにより形質転換されている原核宿主細胞。
【請求項１】
アクチンの製造方法であって、アクチン遺伝子を含むコールドショック発現ベクターにより形質転換された原核宿主細胞を準備する準備工程と、前記原核宿主細胞の正常生理的増殖温度よりも低い温度で前記原核宿主細胞を培養することにより前記コールドショック発現ベクター中のアクチン遺伝子を発現させてアクチンを産生させるアクチン産生工程とを含むことを特徴とするアクチンの製造方法。
【請求項２】
前記原核宿主細胞が大腸菌であり、前記コールドショック発現ベクターが、大腸菌コールドショック遺伝子のプロモータおよび５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）を含むベクターである請求項１記載のアクチンの製造方法。
【請求項３】
前記プロモータが、ｃｓｐＡプロモータである請求項２記載のアクチンの製造方法。
【請求項４】
前記ベクターが、さらに１２塩基配列のＡＴリッチの翻訳増強エレメントを含む請求項２または３に記載のアクチンの製造方法。
【請求項５】
前記ベクターが、ＡＡＧＡＧＧＴのＳＤ配列を有する請求項２から４のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項６】
前記産生工程において、前記正常生理的増殖温度よりも１３℃低い温度で培養する請求項１から５のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項７】
さらに、前記原核宿主細胞を、その正常生理的増殖温度で培養する一般培養工程を有し、前記一般培養工程で前記原核宿主細胞を培養した後、前記アクチン産生工程を実施する請求項１から６のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項８】
さらに、前記原核宿主細胞を溶菌して産生されたアクチンを回収する回収工程を有する請求項１から７のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項９】
前記回収工程を、ＡＤＰおよびセリンプロテアーゼインヒビターの少なくとも一方の存在下で実施する請求項８記載のアクチンの製造方法。
【請求項１０】
前記セリンプロテアーゼインヒビターが、ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＩＦＰ）である請求項９記載のアクチンの製造方法。
【請求項１１】
さらに、回収したアクチンを精製する精製工程を有する請求項１から１０のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項１２】
前記アクチンが、β−アクチンである請求項１から１１のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項１３】
前記アクチンが、アクチン変異体であり、前記アクチン遺伝子が、前記アクチンの変異遺伝子である請求項１から１１のいずれか一項に記載のアクチンの製造方法。
【請求項１４】
請求項１記載のアクチンの製造方法に使用するベクターであって、前記ベクターがコールドショック発現ベクターであり、前記ベクターが、アクチン遺伝子またはアクチンの変異遺伝子を発現可能な状態で含むベクター。
【請求項１５】
請求項１記載のアクチンの製造方法に使用する原核宿主細胞であって、請求項１４記載のベクターにより形質転換されている原核宿主細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−２７５０１０（Ｐ２００７−２７５０１０Ａ）
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１０８２７６（Ｐ２００６−１０８２７６）
【出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発表した刊行物：「平成１７年度 応用化学専攻 修士論文発表会 要旨」 発行者名：国立大学法人愛媛大学 頒布年月日：平成１８年２月２４日 発表した刊行物：「ＮＡＤＰＨ ｏｘｉｄａｓｅ成分ｐ４７▲ｐｈｏｘ▼へのＡｃｔｉｎの結合とその役割」 発行者名：国立大学法人愛媛大学 頒布年月日：平成１８年２月２７日 発表した研究集会：平成１７年度 応用化学専攻 修士論文発表会 主催者名：国立大学法人愛媛大学大学院理工学研究科 共催者名：国立大学法人愛媛大学 開催日：平成１８年３月１日〜平成１８年３月２日 発表日：平成１８年３月１日
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発表した刊行物：「平成１７年度 応用化学専攻 修士論文発表会 要旨」 発行者名：国立大学法人愛媛大学 頒布年月日：平成１８年２月２４日 発表した刊行物：「ＮＡＤＰＨ ｏｘｉｄａｓｅ成分ｐ４７▲ｐｈｏｘ▼へのＡｃｔｉｎの結合とその役割」 発行者名：国立大学法人愛媛大学 頒布年月日：平成１８年２月２７日 発表した研究集会：平成１７年度 応用化学専攻 修士論文発表会 主催者名：国立大学法人愛媛大学大学院理工学研究科 共催者名：国立大学法人愛媛大学 開催日：平成１８年３月１日〜平成１８年３月２日 発表日：平成１８年３月１日
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【Ｆターム（参考）】
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