アシル担体タンパク質に基づくタンパク質をラベルするための方法
広い多様性を有する様々なラベルによってアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）融合タンパク質をラベルするための方法を開示する。本方法は、ホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）またはその相同物を用いて、ラベルを補酵素Ａ型基質からＡＣＰ融合タンパク質へ転移することに基づく。本方法は、生体外および生体内の両方において、新しい物理的または化学的性質を融合タンパク質に導入する分子を融合タンパク質へ結合させることにより、融合タンパク質を検出し操作することを可能にする。そのようなラベルの例には、特に、分光学的プローブ即ちレポーター分子、親和性タグ、反応性ラジカルを生成する分子、架橋剤、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介するリガンド、または融合タンパク質の固定化に適当な分子がある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質から目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質またはその断片を含む融合タンパク質へラベルを転移する方法、ならびに特にラベルされた融合タンパク質を検出しおよび／または操作することをさらに含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複雑な生体系の理解の進歩は、その背後にある生体分子特にタンパク質の相互作用の特性決定に掛かっている。増大する数の生物におけるＤＮＡ配列決定により、その生物の読み取り枠（ＯＲＦ）が明らかにされてきたが、その一方で、対応するタンパク質を生体内および生体外で特性決定できる可能性は限られている。この目的の実現を目指す戦略の大部分は、生体外での応用のための融合物の精製または生体内でのタンパク質の追跡を可能にする融合タンパク質を構築することに基礎を置いている。そのようなタグの例には、６×Ｈiｓタグ、グルタチオンＳ転移酵素、マルトース結合タンパク質、エピトープタグ、酵母ツーハイブリッドシステム、Ｏ6−アルキルグアニン-ＤＮＡアルキル転移酵素、分解ユビキチン、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質が挙げられる。しかし、これらの方法はすべて様々な限界や不利益を有する。
【０００３】
Gehring et al.(1997)および Lambalot and Walsh(1995)は、Ｅ．ｃｏｌｉのホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）を用いて、アポ-アシル担体タンパク質（ａｐｏ−ＡＣＰ）の保存されているセリン残基に生体外で補助因子４’−ホスホパンテテイン（Ｐ−ｐａｎｔ）を結合させて、ホロ-ＡＣＰを生成させる翻訳後修飾を触媒させることを記載している。Ｐ−ｐａｎｔの起源は補酵素Ａである。Gehring et al.(1997)はさらにＰ−ｐａｎｔ部分が修飾されているが依然としてＡＣＰＳの基質として働くことができる補酵素Ａの類似物質を用いて、修飾されたＰ−ｐａｎｔを補助因子とするホロ-ＡＣＰが得られることを示している。
【０００４】
ＡＣＰＳなどの単離されたホスホパンテテイニル転移酵素は国際特許出願WO 97/13845に記載されている。
【０００５】
ラベルをＯ6−アルキルグアニン-ＤＮＡアルキル転移酵素（ＡＧＴ）融合タンパク質に転移する方法、およびこの方法をＡＧＴ融合タンパク質の検出に用いることが国際特許出願WO 02/083937に記載されている。
【０００６】
発明の開示
本発明は、目的のタンパク質を検出し、および／または操作する方法であって、目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）またはその断片を含む融合タンパク質を、ラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質およびホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）もしくはその相同物と接触させること、その結果ＡＣＰＳがラベルを融合タンパク質へ転移させ、また場合によっては、そのラベルを認識しおよび／または操作するために設計されたシステム中でそのラベルを用いて、得られたそのラベル付融合タンパク質を検出しおよび／またはさらに操作すること、を含む方法に関する。
【０００７】
さらにまた、本発明は目的のタンパク質およびＡＣＰまたはその断片を含む融合タンパク質のそのような方法中での使用に関する。特に本発明の方法は、目的のタンパク質を精製もしくは固定化するため、または本発明の方法において目的のタンパク質をそれに結合されたラベルにより生体外もしくは生体内で連続的にモニターするために用いられる。
【０００８】
本発明の融合タンパク質に組み込まれる目的のタンパク質は任意の種類のものでよく、それには二次構造、三次構造、もしくは四次構造を持つ、または持たない、任意の長さのタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドが含まれる。
【０００９】
本発明の方法で用いられる特別のラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質は、ＣｏＡ、または修飾されたＣｏＡから、ラベル即ち検出可能なマーカーをさらに付加するための少なくとも１つの反応部位を有するリンカーを結合させることによって得ることができる。本発明はまた、そのような新規のラベルされた補酵素Ａ型基質、それを製造する方法、そのような新規の補酵素Ａ型基質の合成において有用な中間体、および本発明の方法中でのそれらの使用に関する。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、目的のタンパク質を検出し、および／または操作する方法であって、目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）またはその断片を含む融合タンパク質を、ラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質およびホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）もしくはその相同物と接触させること、その結果ＡＣＰＳがラベルを融合タンパク質へ転移させ、また場合によっては、ラベルを認識しおよび／または操作するために設計されたシステム中でラベルを用いて、得られたラベル付融合タンパク質を検出し、および／またはさらに操作するようにすること、を含む方法に関する。
【００１１】
ＡＣＰまたはＡＣＰドメインは、脂肪酸、ポリケチドの生合成および非リボソームペプチド合成において担体として作用する。ＡＣＰはホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）によって翻訳後修飾される。この酵素は補助因子４−ホスホパンテテイン（Ｐ−ｐａｎｔ）を補酵素ＡからＡＣＰの保存されているセリン残基に転移する。ＡＣＰＳはまたホスホパンテテイニル転移酵素とも呼ばれる。ＡＣＰＳは、ＣｏＡのホスホパンテテイン部分のチオール基に対する修飾に関して比較的低い基質特異性を所持していることが示されている。これを活用して、ＡＣＰ融合タンパク質をＡＣＰＳおよびホスホパンテテイン部分を介してラベルを所持するＣｏＡ誘導体と共にインキュベートすることにより、特異的にラベルすることができる。ラベルが、このようにしてホスホパンテテイン部分と共にＡＣＰの保存されたセリン残基に転移される。ラベリングは融合タンパク質の性質とは独立である。
【００１２】
ＡＣＰおよびＡＣＰＳという語句は、ここでは任意の一対のタンパク質であって２つのうちの１つ（ＡＣＰ）がＣｏＡ誘導体起源のホスホパンテテイン誘導体に対するアクセプターであり、他の１つ（ＡＣＰＳ）がホスホパンテテイン誘導体のＡＣＰへの転移を触媒するものを表す。
【００１３】
ＡＣＰＳおよびホスホパンテテイン転移酵素という語句は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰＳと相同性のある多数のホスホパンテテイニル転移酵素が、脂肪酸合成に関与せず、むしろ自然産物の生合成に関与しているタンパク質を修飾するという事実にもかかわらず、ここでは交換できる語句であるとして用いる（Lambalot et al.,1996）。このようなホスホパンテテイニル転移酵素の例には：エンテロバクチン合成に関与するＥｎｔＤ；サーファクチン生合成に関与するＳｆｐおよびＰｓｆ−１；グラミシジンＳ生合成に関与するＧｓｐ；リシン生合成に関与するＬＹＳ５；バシトラシン生合成に関与するＢｌｉ；イチュリンＡ生合成に関与するＬｐａ−１４；および、ノシヘプチド生合成に関与するＮｓｈＣ、がある。本発明はＥ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰＳと相同性のあるラベリング方式を持つ全てのＡＣＰＳの使用を含む。
【００１４】
ＡＣＰという用語は、Lambalot et al.(1996)によって定義されたように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰＳまたはＥ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰＳと相同性のある任意のＡＣＰＳによって翻訳後にホスホパンテテイニル化されることとなる任意のタンパク質を表す。これには、脂肪酸合成に関与するタンパク質ばかりでなく、ポリケチド合成、非リボソームペプチド合成、アミノ酸合成、およびデプシペプチド合成に関与するタンパク質も含まれる。ＡＣＰＳによる翻訳後修飾に加えて、これらのタンパク質は共通して種々の基質とアシルパンテテイニル・チオエステルを形成し、ホスホパンテテイニル部分がセリン残基に結合される。これらの自然の機能において、ＡＣＰは、多機能酵素（Ｉ型脂肪酸合成酵素のような）のドメイン、または別のタンパク質（II型脂肪酸合成酵素のような）のドメインであり得る。
【００１５】
「検出する」とは、ラベルおよびそれに結合している目的のタンパク質を、ラベルを観測するために設計されたシステム中でラベルの性質に基づいて観察することを意味するものであり、また特別なラベルを認識し、ラベルの性質によって特別な環境でラベルを見出し、場合によっては、ラベルおよびそれに結合したタンパク質を定量化し、また場合によっては、ラベルの微細環境を決定することなどを含む。
【００１６】
「操作する」とは、ラベルおよびそれに結合している目的のタンパク質を操作することを意味し、またラベルおよびそれに結合している目的のタンパク質を、ラベルを操作するために設計されたシステム中でラベルの性質に基づいて操作することを含み、ならびに化学的または生物学的環境から分離すること、別の化学的または生物学的環境へ導入すること、精製すること、即ち望ましくない副産物および不純物から分離すること、ラベルを固体の担体と反応させることによって固定化すること、ラベルおよび／または目的のタンパク質の性質を修飾するために化学的または生物学的試薬と接触させることなどを含む。
【００１７】
ここで開示する方法は一般にある範囲の応用に適用でき、特異的におよび共有結合的に融合タンパク質を（１）ラベルされた融合タンパク質の環境の変化を感受し誘起することができるラベルによってラベルすることができ、（２）ラベルによって融合タンパク質に特異的に導入された物理的および／または化学的性質によって融合タンパク質を操作することを助けるラベルによってラベルすることができ、および／または（３）ラベルによって導入された性質を通じて融合タンパク質の精製を助けるラベルによってラベルすることができる。ここで開示する方法はＡＣＰ融合タンパク質を生体外および生体内、例えば細胞中の両方でラベルするために用いることができる。
【００１８】
さらにまた、本発明は目的のタンパク質とＡＣＰまたはその断片を含む融合タンパク質のそのような方法中での使用に関する。特に、本発明の方法は目的のタンパク質の精製と固定化に、または、目的のタンパク質を生体外および生体内において本発明の方法によりそれに結合されたラベルにより連続的にモニターすることに用いられる。
【００１９】
一つの態様において、本発明は目的のタンパク質を生体外および生体内において連続的にモニターする方法を提供する。この方法では、目的のタンパク質とアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）またはその断片を含む融合タンパク質を、ラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質およびホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）またはその相同物と接触させて、ＡＣＰＳがラベルを融合タンパク質へ転移し、またラベルを、ラベルを認識するために設計されたシステム中で観察する。
【００２０】
さらにある態様において、本発明は目的のタンパク質を生体外および生体内において操作する方法を提供する。そこでは目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）もしくはその断片を含む融合タンパク質を、ラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質およびホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）もしくはその相同物と接触させて、その結果ＡＣＰＳがラベルを融合タンパク質へ転移し、また融合タンパク質をラベルの物理的および／または化学的性質に基づいて操作する
【００２１】
ある特別な態様においては、ラベルの物理的および／または化学的性質によってラベルされた融合タンパク質の効率的な精製が可能であり、したがって本発明は、本発明の方法の諸工程すなわち、ラベルの物理的および／または化学的性質を精製に利用し、その後融合タンパク質を切断して高純度の目的のタンパク質を供給する工程を遂行することによる、目的のタンパク質の精製方法を提供する。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）もしくはその断片を含む融合タンパク質を固体支持体に固定化する方法を提供する。この方法は融合タンパク質を、固体支持体に結合しているかまたは結合できるラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質およびホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）もしくはその相同物と接触させることを含み、これにより、ホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）がラベルをＡＣＰ融合タンパク質へ共有結合させるように転移し、ＡＣＰ融合タンパク質はそれにより固体支持体に結合されるかまたはその後に結合され得る。ラベルが最初は固体支持体に結合されていない本発明の特別な態様において、本方法はさらに、ラベルされたＡＣＰ融合タンパク質が固体支持体に固定化されるようにそれを固体支持体と接触させる工程を含んでもよい。これらの本発明の好ましい実施態様においてラベルは、転移されたときまたは次の反応において固体支持体に共有結合的に結合されてもよく、または特異的な結合対の一員であって、他の一員が固体支持体に共有結合的にもしくは任意の他の手段により結合しているか結合可能であってもよい。それは例えばビオチンおよびアビジンもしくはストレプトアビジンの特異的結合対を用いる場合である。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、生体外はもちろん生体内においてもＡＣＰ融合タンパク質をラベルする方法を提供する。生体内におけるＡＣＰ融合タンパク質のラベリングという語句は、細胞外スペースに向いているＡＣＰ融合タンパク質をラベルすることはもちろん、細胞内の全ての区画においてラベルすることを含む。もしＡＣＰ融合タンパク質のラベリングが生体内で行なわれ、ＡＣＰに融合されたタンパク質が原形質膜タンパク質である場合には、融合タンパク質のＡＣＰ部分は原形質膜の細胞質側または細胞外側のどちらに付着していてもよい。ラベリングを生体外で行なう場合は、融合タンパク質のラベリングは細胞抽出物中でまたはＡＣＰ融合タンパク質を精製または濃縮した形で行うことができる。
【００２４】
本発明は、所望のタンパク質へのラベルの特異的な付加を、その目的のタンパク質とアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）またはその断片との間で融合タンパク質を形成させることにより遂行できたという成果を基礎にしている。
【００２５】
好ましい応用において、アシル担体タンパク質即ち「ＡＣＰ」は、ホロ-アシル担体タンパク質合成酵素即ち「ＡＣＰＳ」によって、ラベルされた４’−ホスホパンテテインが適当な補酵素Ａ（「ＣｏＡ」）から融合タンパク質の一部を形成するＡＣＰもしくはその断片のセリン残基へ転移される方法で、修飾される性質を有する。好ましい実施態様において、ＡＣＰは、例えばRawling and Cronan, 1992およびその中の引用文献中に記載のＥ．ｃｏｌｉのアシル担体タンパク質である。しかし、他のアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）、例えばGehring et al., 1997に記載されているStreptomyces種のＡＣＰ、または適当にラベルされたＣｏＡ存在下で上に定義したＡＣＰＳによって修飾される性質を有する任意のＡＣＰが知られており、本発明において使用できる。本発明においてＡＣＰはまた、野生型ＡＣＰの変異体であって１個以上のアミノ酸置換、欠失または付加によって野生型と異なり、しかしＡＣＰＳにより触媒される反応において、ラベルされた４’−ホスホパンテテインに対するアクセプターとして作用する性質を依然として保持している変異体も含む。他のＡＣＰ変異体を周知技術を用いて化学的に修飾してもよい。ＡＣＰ変異体は周知のタンパク質工学技術を用いて、および／またはＡＣＰＳによって触媒される反応におけるラベルされた４’−ホスホパンテテインの転移に対する新しいアクセプター配列を生成し選択するための分子進展を利用して生成することができる。ＡＣＰ断片とは、ホスホパンテテイン誘導体と結合するセリン残基を含み、またそのようなホスホパンテテイン誘導体を受容する機能を残存させている断片である。
【００２６】
好ましい実施態様において、ＡＣＰＳは、例えばLambalot and Walsh,1995またはその中で引用された文献に記載されたＥ．ｃｏｌｉのホロ-アシル担体タンパク質合成酵素である。しかし、他のホロ-アシル担体タンパク質合成酵素、例えばLambalot et al.,1996記載のBacillus subtilis由来のＡＣＰＳまたは上で定義したＡＣＰを適当にラベルされたＣｏＡ存在下で修飾する性質を有するならば本発明において採用可能である任意の形のタンパク質なども知られている。これらのＡＣＰＳはまたLambalot et al.,1996記載のように、ホスホパンテテイニル転移酵素としても知られており、また本発明はこの一般的な種別の酵素の使用を含む。本発明において、ホロ-アシル担体タンパク質合成酵素はまた野生型ＡＣＰＳの変異体であって１個以上のアミノ酸置換、欠失または付加によって野生型と異なり、しかしラベルされた４’−ホスホパンテテインを特異的にＡＣＰ融合タンパク質に転移する性質を依然として保持している変異体も含む。他のＡＣＰＳ変異体を周知技術を用いて化学的に修飾してもよい。ＡＣＰＳ変異体は周知のタンパク質工学技術を用いて、および／またはラベルされた４’−ホスホパンテテインを異なるアクセプター配列に転移するための新しい特異性を生成し選択する分子進展を利用して、生成することができる。
【００２７】
ＡＣＰ融合タンパク質のＡＣＰＳによるラベリングのための、多くの考察を有利に織込む。最も大切なことは、ＡＣＰ融合タンパク質のラベリングは、ラベルする前にＡＣＰ融合タンパク質のＡＣＰ部分がアポ型で存在することに依存していることである。もしＡＣＰ融合タンパク質が、翻訳後修飾の基質としてこのＡＣＰ融合タンパク質を受容する内在的ＡＣＰＳを有する宿主において発現されているならば、ＡＣＰ融合タンパク質は所望の修飾に対して少なくとも部分的に遮断される可能性がある。この望ましくないＡＣＰ融合タンパク質の修飾を最小にするために種々の解決策が提案されている。第一に、宿主のＡＣＰＳによって効率的に修飾されないＡＣＰを選択する、即ちＡＣＰが宿主の生化学と直交するように選択する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰは、ヒト細胞において融合タンパク質として発現されたときにヒトのＡＣＰＳによって有意な程度には修飾されない（図３参照）。第二に、ＡＣＰ融合タンパク質の過剰発現によってＡＣＰ融合タンパク質の主にアポＡＣＰが形成されるようになる。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＥ．ｃｏｌｉ由来の６×Ｈｉｓ−ＡＣＰを過剰発現させることにより、これらの細胞内に内在性ＡＣＰＳが存在するにもかかわらず、大部分は６×ＨｉｓのアポＡＣＰが生成されることになる。
【００２８】
ラベル反応のために、ＡＣＰ融合タンパク質はまた、対応するＡＣＰＳおよびＣｏＡ誘導体の両方と接触しなければならない。このことは生体内応用において、ＡＣＰ融合タンパク質が細胞表面に表示されるか、またはＡＣＰＳとＣｏＡ誘導体が微量注入などの技術を用いて目的の細胞内に導入されるかどちらかであることを意味する。
【００２９】
本発明において、ＡＣＰとの融合タンパク質のタンパク質部分への言及は、二次構造、三次構造、四次構造を有するまたは有しないタンパク質、任意の長さのポリペプチドおよびペプチドが含まれることを意図したものであり、また好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸から２０００個までのアミノ酸を、好ましくは５０から１０００個の間のアミノ酸から成る。本発明による目的のタンパク質は次の群から選択される。その群は、酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核レセプタータンパク質、核局在信号タンパク質、タンパク質補助因子、抗体、膜ポンプタンパク質、膜チャネルタンパク質、膜担体タンパク質、運動タンパク質、シグナル伝達に含まれるタンパク質、核タンパク質、リボソームタンパク質、小単量体ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、特別な細胞内区画を標的とするタンパク質としての役割を担う配列を有するタンパク質、一般にラベルとしてまたは親和性タグとして用いられるタンパク質、および前述のタンパク質のドメインもしくはサブドメイン、から成る。ＡＣＰ融合タンパク質は１つ以上の、例えば１つ、２つ、３つの、ＡＣＰのＮ−末端、Ｃ−末端、またはＮ−およびＣ−末端においてＡＣＰと融合した目的のタンパク質から成ればよい。
【００３０】
より詳しく言えば、本発明による目的のタンパク質はつぎの群から選択される。
即ちその群は、
酵素、例えば、転移酵素（ＥＣ２）、より具体的にはメチル基以外のアルキルもしくはアリル基を転移する転移酵素（ＥＣ２．５）、特にグルタチオン転移酵素（ＥＣ２．５．１．１８）、
あるいは、リンを含む基を転移する転移酵素であるキナーゼ（ＥＣ２．７）、例えば酵母のカゼインキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３７）またはチロシンタンパク質キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１２）のような、基質タンパク質のリン酸化標的部位としてセリンもしくはスレオニンを有するタンパク質キナーゼなど、特にアルコール基をアクセプターとするキナーゼ（ＥＣ２．７．１）；
あるいは、例えば酸化還元酵素（ＥＣ１）、より具体的には過酸化物をアクセプターとする酸化還元酵素（ＥＣ１．１１）、特にチトクロームＣペルオキシダーゼ酵素（ＥＣ１．１１．１．５）；
あるいは、例えば加水分解酵素（ＥＣ３）、より具体的にはエステル結合に作用する加水分解酵素（ＥＣ３．１）、特にタンパク質リン酸モノエステル加水分解酵素などのリン酸モノエステル加水分解酵素（ＥＣ３．１．３）；またはペプチダーゼもしくはプロテアーゼ（ＥＣ３．４）としても知られるペプチド結合を加水分解する加水分解酵素、特にカスパーゼ；
ＤＮＡ結合タンパク質、より具体的にはｍＲＮＡ合成を阻害するタンパク質因子である転写リプレッサータンパク質、特にＥ．ｃｏｌｉにおいてｍＲＮＡ合成を阻害するタンパク質因子、特にＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン；
転写調節タンパク質、より具体的には転写リプレッサータンパク質、特にトリプトファン／アスパラギン酸反復構造を含む転写リプレッサータンパク質；
膜タンパク質、例えば少なくとも１つの膜貫通へリックスを示す膜タンパク質、より具体的には小胞体（ＥＲ）膜由来の膜タンパク質、特にＥＲ膜貫通タンパク質Ｓｅｃ６２などの特にＥＲへのタンパク質移行活性を有する膜タンパク質；
あるいは、例えば７回膜貫通ヘリクッス（７−ＴＭ）タンパク質、より具体的には７−ＴＭタンパク質がＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）であるもの、特に哺乳類などの、例えばヒトのニューロキニン−１−レセプター（ＮＫ１）などの分子量約１kDaより上の高分子リガンドを結合する７−ＴＭタンパク質；
あるいは、例えば細胞膜由来の膜貫通イオンチャネルタンパク質、特にリガンド作動性イオンチャネルタンパク質、より具体的には、セロトニンレセプター５−ＨＴ３などのセロトニン感受性のリガンド作動性イオンチャネルタンパク質；
あるいは、例えばイオンチャネルおよびＧタンパク質共役レセプター以外の膜レセプター；
あるいは、例えば、特に酵母由来の、ペルオキシソームの膜タンパク質、タンパク質Ｐｅｘ１５など；
核レセプタータンパク質、例えば転写因子ファミリー由来の核レセプタータンパク質、より具体的にはリガンド誘導可能な転写因子ファミリー由来の核レセプタータンパク質、特に例えばヒトエストロゲンレセプターｈＥＲなどのエストロゲンレセプターのようなステロイドファミリー由来の核レセプター；
サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来の核局在信号などの核局在信号タンパク質；
例えば遺伝子構造中にユビキチン配列を含むタンパク質のようなタンパク質性補助因子；
小単量体ＧＴＰアーゼ、より具体的にはＲａｓファミリーメンバーのような膜結合性小単量体ＧＴＰアーゼ；
例えば複数薬剤耐性タンパク質のようなＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質；
細胞内構造タンパク質、より具体的には細胞骨格タンパク質、より具体的にはヒト細胞質β−アクチン；
例えばゴルジ体、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、原形質膜、またはペルオキシソームへと、特別の細胞区画へタンパク質を指向させる役割の配列を有するタンパク質；
一般にラベルまたは親和性タグとして用いられるタンパク質、例えばＵＶもしくは可視光照射による励起によって蛍光信号を与える蛍光タンパク質、強化シアノ蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）として知られる蛍光タンパク質などの、特に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）として知られるファミリー由来の蛍光タンパク質；
および上述タンパク質のドメインまたはサブドメイン、
である。
【００３１】
さらに、本発明による目的のタンパク質は供給源に従って選択される。特に、目的のタンパク質には、ヒト、マウス、ラット、他の高等動物、真核生物種、バクテリア種、例えばサルモネラ、より具体的には、salmonella typhiもしくはsalmonella typhimurium、ミコバクテリア、より具体的には mycobacterium tuberculosis、ブドウ球菌、より具体的にはstaphylococcus aureusなどに存在するタンパク質、または、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトインフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、またはコロナウイルスなどのウイルス源由来のタンパク質である。
【００３２】
さらにまた、目的のタンパク質は、ガン、心臓血管病、精神障害、アルツハイマー、肥満、ウイルス感染、およびバクテリア感染などの、一定の病気におけるその役割に従って選択される。
【００３３】
本発明の特定の実施態様において、融合タンパク質は、一方の側のＥ．ｃｏｌｉのＡＣＰまたはそのようなＡＣＰのＤＮＡの変異体およびＡＣＰのＤＮＡ配列のＮ−末端（Ｎ）もしくはＣ−末端（Ｃ）もしくはＮ−末端とＣ−末端側に結合された（上に挙げたような）目的のタンパク質をコードする配列とから生成され、本発明の融合タンパク質が導かれる。融合タンパク質はさらに適当なリンカー、例えば融合タンパク質中のＡＣＰと目的のタンパク質の間の、および／または２つの目的のタンパク質の間の適当な条件下で酵素切断を受けやすいリンカーを含む。そのようなリンカーの例には、ＤＮＡ段階で適当な制限酵素によって切断されるリンカー、例えばＢｇｌ IIによって切断されるＡＧＡＴＣＴ、および／またはタンパク質段階で適当な酵素、例えばタバコエッチウイルスＮｌａ（ＴＥＶ）プロテアーゼによって切断されるリンカーがある。
【００３４】
融合タンパク質は原核生物宿主、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ、または真核生物宿主、例えば酵母、真菌、昆虫、または哺乳動物細胞中で発現できる。
【００３５】
本発明はまた、目的のタンパク質とＡＣＰもしくはその断片との新規な融合タンパク質に関する。
【００３６】
本発明において、ラベルされたＣｏＡ型基質は、好ましくは次の一般式（Ｉ）：
【化２】
または、次の一般式（II）：
【化３】
を持つ、ラベルされた補酵素Ａの誘導体である。式中、Ｒは補酵素Ａとラベルを繋ぐリンカー基であり、また「ラベル」は、ここに記載した融合タンパク質の検出、精製および／または操作のために適当なラベル分子である。
【００３７】
しかし、本発明は式（Ｉ）または（II）の基質に限られない。広い範囲の他の基質をＡＣＰ融合タンパク質へラベルを転移するために使用できるからである。例えば、式（Ｉ）の化合物のプリン部の置換、糖部分またはパンテテイニル酸部分の修飾、が考えられる。
【００３８】
式（Ｉ）または（II）の化合物中のリンカー基Ｒはラベルを補酵素Ａに結合する柔軟なリンカーである。リンカー単位は構想した応用、即ちＡＣＰを含む融合タンパク質へのラベルの転移との関連で選ばれる。それらはまた適当な溶媒中で基質の溶解度を増加させる。用いたリンカーは実際の応用条件下で化学的に安定である。リンカーＲはＡＣＰとの反応にもラベルの検出にも干渉せず、しかし補酵素Ａ型基質がＡＣＰを含む融合タンパク質と反応した後のある時点で切断されるように構成することができる。
【００３９】
リンカー基Ｒは１〜３００個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキレン基であり、場合によっては、
（ａ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられ、特に３個ごとの炭素原子が酸素に置き換えられ、例えば、１〜１００個のエチレノキシ単位を有するポリエチレノキシ基を表し；
（ｂ）１個以上の炭素原子が水素原子を持つ窒素原子に置き換えられ、また隣接する炭素原子がオキソにより置き換えられて、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を表し；
（ｃ）１個以上の炭素原子が酸素に置き換えられ、また隣接する炭素原子がオキソで置き換えられ、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
（ｄ）隣接する２個の炭素原子間の結合が２重または３重結合であり、官能基−ＣＨ=ＣＨ−または−Ｃ≡Ｃ−を表し；
（ｅ）１個以上の炭素原子がフェニレン、飽和または不飽和シクロアルキレン、飽和または不飽和ビシクロアルキレン、架橋ヘテロ芳香族または架橋飽和または不飽和ヘテロシクリル基に置き換えられており、
（ｆ）隣接する２個の炭素原子がジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−により置き換えられており；
または、場合によっては置換基を含む、２個以上の、特に２個の、アルキレン基および／または上の（ａ）〜（ｆ）で定義した修飾されたアルキレン基の組み合わせである。
【００４０】
考慮した置換基は、例えば低級アルキル例えばメチル、低級アルコキシ例えばメトキシ、低級アシロキシ例えばアセトキシ、またはハロゲニル例えばクロロである。
【００４１】
さらに考慮した置換基は、例えばα−アミノ酸がリンカーＲに取り込まれた場合に得られる置換基であり、その場合炭素原子は（ｂ）で定義したアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−で置き換えられる。そのようなアルキレン基の炭素鎖のリンカー部分において、Ｒは−（ＮＨ−ＣＨＲ’−ＣＯ）n−基で置き換えられる。ここでｎは１〜１００の間であり、Ｒ’は種々のα−アミノ酸の残基を表す。
【００４２】
さらなる置換基は光切断性リンカーＲとなる置換基、例えばｏ−ニトロフェニル基である。特に、このｏ−ニトロフェニル置換基はアミド結合に隣接した炭素原子に、例えば−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ（ｏ−ニトロフェニル）−ＮＨ−ＣＯ−基に存在する。
【００４３】
上の（ｅ）で定義した炭素原子と置き換えられるフェニレン基は、例えば１，２−、１，３−、または好ましくは１，４−フェニレンである。上の（ｅ）で定義した炭素原子と置き換えられる飽和または不飽和シクロアルキレン基は、例えばシクロペンチレンまたはシクロヘキシレンまたはさらに、例えば１−または２−の位置で不飽和のシクロヘキシレンである。上の（ｅ）で定義した炭素原子と置き換えられる飽和または不飽和ビシクロアルキレン基は、例えば、場合によっては、２−の位置で不飽和のまたは２−と５−の位置で二重に不飽和のビシクロ［２，２，１］ヘプチレンまたはビシクロ［２，２，２］オクチレンである。上の（ｅ）で定義した炭素原子と置き換えられるヘテロ芳香族基は、例えばトリアゾリデン、好ましくは１，４−トリアゾリデン、またはイソオキサゾリデン、好ましくは３，５−イソオキサゾリデンである。上の（ｅ）で定義した炭素原子と置き換えられる飽和または不飽和ヘテロシクリル基は、例えば２，５−テトラヒドロフランジイルまたは２，５−ジオギサンジイル、またはイソオキサゾリジネン、好ましくは３，５−イソオキサゾリジネンである。
【００４４】
好ましいリンカー基Ｒは、例えば、場合によってはメチル、メトキシ、またはアセトキシ基で置換された１〜２０個の炭素原子のアルキル鎖、または１〜２０個のエチレノキシ基から成るポリエチレングリコール鎖などの、柔軟なリンカーである。
【００４５】
基質のラベル部分は、当業者が融合タンパク質を応用しようと意図するその応用に応じて選択できる。ラベルの例には：
（１）蛍光団、発色団などの分光学的プローブ、磁気的プローブまたはコントラスト剤、あるいはまた電子顕微鏡技術で有用なプローブ；
（２）放射性ラベルされた分子；
（３）相手と特異的に結合できる特異的な結合対の一方の分子。そのような特異的結合対は周知であり、例えばアビジンまたはストレプトアビジンと結合できるビオチンである；
（４）他の生体分子と相互作用すると想定される分子；
（５）他の生体分子と相互作用すると想定される分子のライブラリー；
（６）例えばNadeau et al.,2002に記載された、当業者に周知の他の生体分子と架橋できる分子；
（７）Ｈ2Ｏ2とアスコルビン酸に曝露されるとヒドロキシラジカルを生成できる例えばHori et al.,2002に記載の繋留された金属キレートなどの分子；
（８）例えばJay et al.1999に記載のマラカイトグリーンなどの、光照射によって反応性ラジカルを生成できる分子；
（９）支持体がガラススライド、ミクロタイタープレートまたは熟練の当業者に周知の任意の一般ポリマーである、固形支持体に共有結合した分子；
（１０）相補的な鎖と塩基対を形成できる核酸またはその誘導体；
（１１）リピッドまたは膜に挿入される性質を有する他の疎水性分子；
（１２）望ましい酵素学的、化学的、または物理学的性質を有する生体分子；
（１３）上に挙げた性質の任意の組み合わせを有する分子；
が含まれる。
【００４６】
ラベルされたＣｏＡ誘導体は、ホスホパンテテイニル部分がＡＣＰ融合タンパク質へ転移することができ検出可能であるラベル、例えば蛍光団、発色団、磁気的プローブ、放射性ラベルされた分子、または任意の他の分光学的プローブなどのラベルを所持しており、そのラベルされたＣｏＡ誘導体を使用することによって、本発明を、生体外または細胞内もしくは細胞表面上（生体内）において、検出できるラベルをＡＣＰ融合タンパク質へ特異的かつ共有結合的に結合させるために使用することが可能になる。これにより、生体内および生体外においてＡＣＰ融合タンパク質の検出と特性決定が可能になる。生体内という語句は、細胞外スペースに向いているＡＣＰ融合タンパク質のラベルはもちろん、細胞の全ての区画中でＡＣＰ融合タンパク質をラベルすることを含む。この方法を、遺伝的に目的のタンパク質と融合させ、生きている細胞中でその研究をすることができるようにする緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の応用と比較することができる。ＧＦＰとその突然変異体の欠点は、原則としてＧＦＰ中に存在する自然に存在する蛍光団の使用に限定されることである。細胞内（生体内）でのラベリングは、タンパク質の機能的な構造に小さな影響のみを与え、ＡＣＰのホスホパンテテイニル部分によりラベルされる機能を保持する一般的な固定手順によって細胞を固定した後にも利用できる。
【００４７】
ホスホパンテテイニル部分がＡＣＰタンパク質に転移できるビオチンなどの親和性タグを有するようなラベル付ＣｏＡ誘導体を使用することによって、本発明を親和性タグを融合タンパク質へ転移するために用いることが可能になり、融合タンパク質に親和性タグの結合相手が結合できるようになる。例として、ビオチンなどの親和性タグによってラベルされたＣｏＡ基質およびＡＣＰＳを、ＡＣＰ融合タンパク質を発現している細胞抽出液（バクテリアもしくは真核生物の）または精製されたＡＣＰ融合タンパク質に加えることによって、親和性タグによる融合タンパク質の共有結合的修飾が可能になる。これによって次に、親和性タグとその結合相手との相互作用を利用して、例えばビオチンの場合は固定化されたアビジンもしくはストレプトアビジンとの相互作用によって、融合タンパク質の単離が可能になる。もしラベルがジスルフィド架橋などの切断可能な結合を有するリンカー基Ｒを介してＡＣＰ融合タンパク質にリンクしているならば、またはもしリンカーが光切断性であれば、精製後にＡＣＰ融合タンパク質から親和性タグを切り離すことができる。
【００４８】
ＡＣＰ融合タンパク質へ転移でき、また外部の刺激に曝露するとヒドロキシラジカルなどの反応性ラジカルを生成できるラベルをホスホパンテテイニル部分が所持するラベル付ＣｏＡ誘導体の使用によって、目的のタンパク質およびその近くのタンパク質の立体構造の研究が可能になる。生成されたラジカルはＡＣＰ融合タンパク質およびそのごく近傍のタンパク質を不活性化することができて、それのよってそれらのタンパク質の役割の研究が可能になる。そのようなラベルの例は、Ｈ2Ｏ2とアスコルビン酸に曝露することによりヒドロキシラジカルを生成するテザー金属キレート錯体、およびレーザー照射によってヒドロキシラジカルを生成するマラカイトグリーンなどの発色団である。ヒドロキシラジカルを生成するために発色団とレーザーの使用することは、例えばJay et al.,1998に記載されているように、発色団援用レーザー誘導不活性化（ＣＡＬＩ）として周知である。ＣＡＬＩは、時間的に制御され空間的に解像された態様で特異的に細胞中の一定のタンパク質を特異的に不活性化するために使用する方法であって、また発色団とタンパク質が空間的に近傍にあることを基礎にしている。レーザー照射すると、発色団はヒドロキシラジカルを生成し、それは発色団から約１００nm以内のそしてそれ以内のみの全てのタンパク質を不活性化する。現在までは、発色団は、目的のタンパク質に特異的な発色団でラベルされた抗体を微量注入することによって目的のタンパク質の空間的近傍にもたらされた。本発明において、マラカイトグリーンのような発色団でＡＣＰ融合タンパク質をラベルし次にレーザー照射することによって、時間的に制御され空間的に解像された態様でＡＣＰ融合タンパク質およびＡＣＰ融合タンパク質と相互作用するタンパク質を不活性化することを可能にすることになる。この方法は生体内および生体外の両方で応用できる。
【００４９】
類似の方法で、ＡＣＰ融合タンパク質を繋留された金属キレートでラベルし、そしてＡＣＰ融合タンパク質およびＡＣＰ融合タンパク質と相互作用するタンパク質をＨ2Ｏ2およびアスコルビン酸に曝露することにより特異的に不活性化できる。この方法はＡＣＰ融合タンパク質またはＡＣＰ融合タンパク質のごく近傍のタンパク質の機能の研究に用いることができるばかりでなく、ＡＣＰ融合タンパク質のごく近傍のタンパク質の同定にも用いることができる。ここで、ＡＣＰ融合タンパク質のごく近傍のタンパク質を、特異的な抗体によりそのタンパク質の断片を検出することにより、高分解能二次元電気泳動ゲル上からそれらのタンパク質が消滅したことにより、または質量分析法もしくはＮ−末端分解によるタンパク質配列決定法などの分離および配列決定技術により切断されたタンパク質断片を同定することにより、同定できる。
【００５０】
ホスホパンテテイニル部分がＡＣＰ融合タンパク質に転移できるリガンドを有するラベル付ＣｏＡ誘導体の使用により、本発明を、リガンドおよびタンパク質などのリガンドの結合相手を、特異的に融合タンパク質へ結合させるために用いることができることになる。もしリガンドがもう１つのタンパク質Ｙに結合し、タンパク質Ｙがラベルされた融合タンパク質と二量体を形成することが生物学的機能または測定可能な信号を生起させるならば、生物学的機能または測定可能な信号はラベルされたＡＣＰ融合タンパク質の添加に依存する。もしＡＣＰが細胞表面に表示されているタンパク質に連結されているならば、リガンドとの相互作用が、リガンドによって修飾される他の分子（これにはリガンドによって修飾される、個々の生体分子または他の細胞、組織、および無傷の生物の一部としての生体分子、が含まれる）との接触を媒介する。
【００５１】
ホスホパンテテイニル部分が担体の表面に共有結合的に結合している場合には、またはラベルが非共有結合的にそれ自身表面に結合している別の分子により結合され得る分子である場合には、ラベルされたＣｏＡ誘導体の使用によって、本発明を、固体支持体上にタンパク質配列（アレー）を構築するために使用することが可能になる。後者の手法の例は、ラベルがビオチンで、表面に結合している分子がストレプトアビジンまたはアビジンである。担体の可能な例はガラススライド、マイクロタイタープレートまたは任意の機能化ポリマーである。基質として用いられるＣｏＡ誘導体は担体上にラベルを介して固定化され、そして続くＡＣＰＳが触媒するＡＣＰ融合タンパク質の反応がラベルを融合タンパク質へ転移させ、担体上にそのような融合タンパク質を固定化させる。対応するＣｏＡ誘導体によって前処理された担体上に（様々な）ＡＣＰ融合タンパク質をＡＣＰＳと共に空間的に解像された態様でスポットすることによりタンパク質アレーの作製が可能になる。
【００５２】
他のタンパク質に架橋することができる分子であるラベルにホスホパンテテイニル部分が共有結合的に結合している場合には、ラベルされたＣｏＡ誘導体の使用によって、本発明を、適当な環境における目的のタンパク質の相互作用を研究するために使用することが可能になる。そのような架橋リンカーの例は、マレイミド、活性エステルもしくはアジド、および熟練当業者に知られた他の分子、例えばNadeau et al.,2002に記載の分子などの官能基を含む分子である。そのようなラベルされたＣｏＡ誘導体をＡＣＰＳの存在下で他のタンパク質と（生体内または生体外で）相互作用するＡＣＰ融合タンパク質と接触させることによって、ＡＣＰ融合タンパク質をそれが相互作用するタンパク質にラベルを介して共有結合的に架橋することができる。これによって、ＡＣＰ融合タンパク質と相互作用するタンパク質の同定が可能になる。
【００５３】
ホスホパンテテイニル部分がＡＣＰと膜レセプターから成るＡＣＰ融合タンパク質へ転移されることが可能なリガンドを所持している場合の、ラベルされたＣｏＡ誘導体の使用は、ラベルされたレセプターの検出を可能にする。この細胞表面レセプターのラベリングはレセプターの内部移行の観察を可能にする。ある特別の応用はリガンド結合後の、例えば薬剤、新薬、または新薬候補によるレセプタータンパク質の内部移行の研究である。レセプターの内部移行は様々な方法により、例えば細胞膜から細胞内部へのラベルの移動を顕微鏡で検出することによって、またはラベルの蛍光の特徴が細胞内環境へ移動して変化することによって、検出できる。そのような変化はまた顕微鏡用具無しで検出することもできて、細胞外液に消光剤を加えることにより容易になる可能性がある。
【００５４】
ホスホパンテテイニル部分が電子顕微鏡によって直接検出できるリガンド例えば電子密度の高いナノ粒子、を有するＣｏＡ誘導体の使用。ホスホパンテテイニル部分の電子顕微鏡による検出への別の応用は、例えばジアニシジンなどの芳香族アミンに光照射して酸化させ、高電子密度の沈殿を生じさせそれを次に電子顕微鏡で検出するためのエオシンなどの、光増感剤として使用されるラベルに基づいている。
【００５５】
例として、本発明の実施態様を、添付した図を参照してここでより詳しく記載することにする。
【実施例】
【００５６】
次の実施例および実験的手順は、当業者に本発明の完全な開示および実施方法の記載を提供するために記載するものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【００５７】
ＣｏＡ−Ｂｔの合成
１００μlのＤＭＦ中のビオチン-マレイミド（１mg、０．００２２mmol）溶液に、９０μl ＤＭＦおよび１０μlの５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５中の補酵素Ａ二ナトリウム塩（１．７９mg、０．００２２mmol、１当量）溶液を加える。混合物を４時間室温で攪拌する。それを次にＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ １：４で希釈し、小分けした５００μlを調製用ＨＰＬＣカラムに注入する：勾配（Ａ＝Ｈ2Ｏ ９９％、ＣＨ3ＣＮ １％、５０ｍM ＮＨ4ＯＡｃ／Ｂ＝ＣＨ3ＣＮ）Ａ／Ｂ９５：５からＡ／Ｂ８０：２０までを２分間、Ａ／Ｂ６８：３２までを７分間、Ａ／Ｂ ２０：８０までを２分間行い、その後Ａ／Ｂ ９５：５に戻す。ＣｏＡ−ビオチンの滞留時間は６．５分である。所望の生産物を含む分画を真空で濃縮し、ＤＭＳＯに溶解し、そして純度を制御するために分析量を注入する。精製した分画を合わせる。ＣｏＡ−ビオチンの濃度を２６０nmの吸収（ε（アデニン、２６０nm）＝１５，３００［Ｍ-1cm-1］）で決定する。ＣｏＡ−Ｂｔの収量は０．８９５mg（３３％）である。
ＥＳＩ−ＭＳ（m／z）計算値１２１７．２９６［M（−1）］、測定値１２１７．２６５７［M（−1）］。
【００５８】
【化４】
【００５９】
ＣｏＡ−Ｄｇの合成
５０μl ＤＭＦ中のＮ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド２（１mg、０．００４４mmol）溶液に、ＤＭＦ／緩衝液混合液（７０μｌ ＤＭＦ／３０μｌ ５０mM Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５）中の補酵素Ａ二ナトリウム塩（３．６mg、０．００４４mmol、１当量）溶液を加える。反応を分析用ＨＰＬＣによって追跡し（２６０nmで検出）反応の終了を証明する。続いて、５０μl ＤＭＦおよび１０μl Ｅｔ3Ｎに溶解した３−アミノ−３−デオキシジゴキシゲニン ヘミスクシンアミド スクシンイミジル エステル（２．６mg、０．００４４mmol、１当量）溶液を加え、反応混合液を４時間室温で攪拌する。反応物を調製用ＨＰＬＣに掛け、望みの生成物を含む分画を真空で濃縮し、ＤＭＳＯに溶解し、そして純度を分析用ＨＰＬＣによって分析する。精製した生成物を含む分画を合わせる。
ＣｏＡ−Ｄｇの濃度をアデニンの吸光係数（ε（アデニン、２６０nm）＝１５，３００［Ｍ-1cm-1］）を使って決定する。ＣｏＡ−Ｄｇの収量は２．３７mg（３７％）である。
ＥＳＩ−ＭＳ（m／z）計算値１４６２．３７０７［M（−1）］、測定値１４６２．４８１M（−1）］。
【００６０】
【化５】
【００６１】
ＣｏＡ−Ｃｙ３の合成
１００μl ＤＭＦ中のＣｙ３−マレイミド３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、１mg、０．００１２６mmol）溶液に、９０μl ＤＭＦおよび１０μl ５０mM Ｔｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．５中の補酵素Ａ二ナトリウム塩（１．０５mg、０．００１２６mmol、１当量）溶液を加える。混合液を４時間室温で攪拌する。それを次にＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ １：４で希釈し、小分けした５００μlを調製用ＨＰＬＣカラムに注入する。勾配、Ａ／Ｂ９５：５からＡ／Ｂ９０：１０までを２分間、Ａ／Ｂ ６５：３５までを１５分間、Ａ／Ｂ２０：８０までを２分間行い、その後Ａ／Ｂ ９５：５に戻す（ＡおよびＢについては先の実施例参照）。ＣｏＡ−Ｃｙ３の滞留時間は１０分である。所望の生産物を含む分画を真空で濃縮し、ＤＭＳＯに溶解し、そして純度を制御するために分析量を注入する。精製した分画を合併する。ＣｏＡ−Ｃｙ３の濃度を５４９nmの吸収（ε（５４９nm）＝１５０，０００［M-1cm-1］）で決定する。ＣｏＡ−Ｃｙ３の収量は０．８４７mg（４４％）である。
ＥＳＩ−ＭＳ（m／z）計算値１５１９．３７０［M（-1）］、測定値１５１９．３０７１［M（-1）］。
【００６２】
【化６】
【００６３】
ＣｏＡ−Ｃｙ５の合成
Ｃｙ５−マレイミド４（１mg、０．００１２２mmol）から出発するＣｏＡ−Ｃｙ５の合成をＣｏＡ−Ｃｙ３について記述したのと同様に行う。ＣｏＡ−Ｃｙ５の濃度をＣｙ５の吸光係数（ε（６４６nm）＝２５０，０００［Ｍ-1cm-1］）を用いて決定する。ＣｏＡ−Ｃｙ５の収量は０．８２８mg（４４％）である。
ＥＳＩ−ＭＳ（m／z）計算値１５４５．３８６［M（-1）］および７７２．１８９［M（-2）］、測定値７７１．６５２４［M（-2）］。
【００６４】
【化７】
【００６５】
６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳのクローニング、発現、および精製
ＸＬ１−ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉのＡＣＰＳ遺伝子を単一コロニーＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ−１５ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にＮｄｅｌ制限部位（下線）付きの順方向プライマー５’−ＴＣＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＴＡ ＴＴＡ ＧＧＴ ＴＴＡ ＧＧＣ ＡＣＧ Ｇ−３’およびＸｈｏｌ制限部位（下線）付きの逆方向プライマー５’−ＴＣＡ ＡＧＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＴＡ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡＣ ＣＧＴ ＧＧＣ Ａ−３’を用いてクローニングする。Ｅ．ｃｏｌｉのＡＣＰＳのＮ−末端に融合されたペプチドの配列（プラスミドｐＥＴ−１５ｂ起源）は（１文字コードで）ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨであり、これにＡＣＰＳの最初のアミノ酸、メチオニン、が続く。この融合タンパク質を６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳと呼ぶ。
【００６６】
６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳをコードするｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づく発現ベクターを含むＢＬ２１ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の液体培養を吸光度ＯＤ600nm０．６となるまで成長させる。６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳの発現を最終濃度１mMとなるようにＩＰＴＧを加えて誘導する。３．５時間２２０rpm、２４℃でインキュベーションした後、培養物を１０分間３０００ｇ ４℃で遠心する。沈殿を１０mlの抽出緩衝液（１５０mM ＮａＣｌ、５mMイミダゾール、５０mM ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０）に再懸濁し、ＰＭＳＦとアプロチミンをそれぞれ最終濃度１mMおよび２μg／mlとなるように加える。リゾチームを１mg／mlとなるように加え、混合物を氷上で１５分間インキュベーションしまた何度か反転させる。次に、それを１０分間超音波で破壊する（９５％出力、５０％動作）。ＤＮＡ分解酵素Ｉを最終濃度０．０１mg／mlとなるよう加える。４℃で３０分後、混合液を１０分間１８，０００rpmで遠心する。
【００６７】
タンパク質を精製するために、予め抽出緩衝液で３回洗浄しておいた３５０μlのＮｉ−ＮＴＡを溶解物に加える。混合物を２０分間氷上でインキュベーションし数度混ぜ合わせた。抽出混合物を次にプロピレンカラムに加え、流出に任せた。カラムを５×４００μlのＤＮＡ溶出緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ Ｃｌ、ｐＨ８．５）で洗い、次に２×５ml洗浄緩衝液（３００mM ＮａＣｌ、１０mMイミダゾール、５０mM ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．５）で洗浄する。タンパク質を流出させるために、溶出緩衝液（３００mM ＮａＣｌ、１５０mMイミダゾール、ｐＨ７．５）をカラムに加え、１０分間インキュベーションし、次に流出液を集める。溶出は、１５０μl溶出緩衝液で段階的に続け、これ以上タンパク質がブラッドフォード（Bradford）分析で検出できなくなるまで行う。最後に合わせた溶出液を透析緩衝液（５０mM ＨＥＰＥＳ、３０％グリセロール、ｐＨ７．２）中で終夜透析し、残存する塩を除く。精製した６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳ（ＭＷ１６．２１５kDa）を小分けにして−８０℃で保存した。濃度をブラッドフォード分析で３７．６μＭと決定する。収量はＢＬ２１Ｅ．ｃｏｌｉ細胞培養１リットル当たり０．９１２mg。
【００６８】
６×Ｈｉｓ−ＡＣＰのクローニング、発現、および精製
ＸＬ１−ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉのＡＣＰ遺伝子を、Ｎｄｅｌ制限部位（下線）付きの順方向プライマー５’−ＧＴ ＣＧＧ ＴＡＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＣＴ ＡＴＣ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＧ−３’、およびＢａｍＨＩ制限部位（下線）付きの逆方向プライマー５’−ＴＣＡ ＴＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＣＧＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ Ｇ−３’、を用いて、単一コロニーＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ−１５ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉのＡＣＰのＮ−末端に融合されたペプチドの配列（６×Ｈｉｓ−ＡＣＰを生成する）は（１文字コードで）ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨであり、これにＡＣＰの最初のアミノ酸、メチオニン、が続く。
【００６９】
６×Ｈｉｓ−ＡＣＰをコードするｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づく発現ベクターを含むＢＬ２１Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の液体培養を吸光度ＯＤ600nm０．６となるまで成長させる。６×Ｈｉｓ−ＡＣＰの発現を最終濃度１mMとなるようにＩＰＴＧを加えて誘導する。３．５時間２２０rpm、３７℃でインキュベーションした後、培養物を１０分間３０００ｇ４℃で遠心する。６×Ｈｉｓ−ＡＣＰの精製のために沈殿を正確に上の実験で記述した通りに操作する。６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ（ＭＷ１０．８０２kDa）の濃度をブラッドフォード分析で１８８μＭと決定する。収量：ＢＬ２１Ｅ．ｃｏｌｉ細胞培養１リットル当たり３．１mg。
【００７０】
アポ-およびホロ-６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ間の比率を決定するために、精製した６×Ｈｉｓ−ＡＣＰをＱ−Ｔｏｆ−Ｕｌｔｉｍａ（Micromass／Waters）を用いたＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓ．モード）により、場合によっては、Ｃａｐ−ＬＣ（Waters）、Ｘｔｅｒｒａ ＲＰ−Ｃ４カラム（Waters,５μm、０．３２×５０mm；流速８μl／min）によるクロマトグラフィーに連結し、ＭａｘＥｎｔ１−ソフトウエアによる逆畳み込みを行って、解析する。混合物のＥＳＩ−ＭＳが、調製品はホロ-およびアポ-ＡＣＰの混合物であることを証明した。最初のメチオニンを除く精製したアポ-６×Ｈｉｓ−ＡＣＰの質量は１０．６７２０kDaであることが分かり（計算値１０．６７１６kDa）、またホロ-６×Ｈｉｓ−ＡＣＰの質量は１１．０１２kDa（計算値１１．０１１９kDa）であることが分かる。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって、ホロ-およびアポ-型に対応するピークの同定と積分が可能になる。ホロ-型の１００分率は１６％（滞留時間１１．７７分）、またアポ-型のそれは８４％（滞留時間１４．１６分）である。
【００７１】
６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａの発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＣＰのＮ−末端に融合されたペプチドの配列は（１文字コードで）ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨであり、これにＡＣＰの最初のアミノ酸、メチオニン、が続き、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＣＰのＣ−末端に融合されたペプチドの配列は（１文字コードで）ＴＳＲＳＹＰＹＤＶＰＤＹＡＲＷ（６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａを生成する）である。
【００７２】
６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａをコードするｐＥＴ−１５ｂに基づく発現ベクターを含むＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の液体培養を吸光度ＯＤ600nm０．６となるまで成長させる。６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａの発現を最終濃度１mMとなるようにＩＰＴＧを加えて誘導する。２２０rpm、２４℃で３時間インキュベーションした後、培養物を３０００ｇ４℃で１０分間遠心する。６×Ｈｉｓ−ＡｃｐＳの精製に対して記述した通りに、６×Ｈｉｓ−ＡＣＰを精製する。６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａ（ＭＷ１２．６５kDa）の濃度をブラッドフォード分析で４００μＭと決定する。またタンパク質の総収量は振とうフラスコ培養１リットル当たり１０mgである。
【００７３】
ＣｏＡ−Ｂｔおよび６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳを用いた６×Ｈｉｓ−ＡＣＰの生体外ビオチン化
精製した６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ（１μM）を反応緩衝液（４３μl、５０mM Ｔｒｉｓ ＣｌｐＨ８．８）中で６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳ（０．２μM）およびＭｇＣｌ2（１０mM）と室温でインキュベートさせる。７．５μlを解析用に分取する。ＣｏＡ−Ｂｔを最終濃度５μMとなるように加える。一定時間ごとに各７．５μlを分取する。分取したものを補酵素Ａ（最終濃度１mM）で３０秒間クエンチし、８．２μlＳＤＳ緩衝液２×を加える。試料を２分間９５℃で加熱する。ビオチン化された６×Ｈｉｓ−ＡＣＰをストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（ＮＥＭ）および化学発光ペルオキシダーゼ基質（Renaissance reagent plus, NEN）を用い、ウエスタン-ブロッティングにより検出する。ウエスタン-ブロットをイメージステーション（Ｋｏｄａｋ４４０）を用いて解析する。対照として、バックグラウンドをチェックし、また反応の特異性をチェックするために、各タンパク質１つのみを含む試料、および２つのタンパク質のただ１つおよびＣｏＡ−Ｂｔを含む試料も調製しビオチン化を上のように分析する。ビオチン化は３つの成分全ての存在に依存する。
【００７４】
ゲルシフトアッセイによる６×Ｈｉｓ−ＡＣＰのビオチン化の定量化
精製した６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ（３μM）を室温でＣｏＡ−Ｂｔ（１０μM）および精製した６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳ（５μM）と最終容積５０μlの反応緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ Ｃｌ、ｐＨ８．８、１０mM ＭｇＣｌ2）中でインキュベートする。３０分インキュベーション後、混合液を終夜ＴＢＳ（（１０mM Ｔｒｉｓ Ｃｌ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．９）に対して透析し、過剰のＣｏＡ−Ｂｔを除く。小分けした反応液を、最終濃度０．６μg／μlのストレプトアビジンと１時間インキュベートする。２％ＳＤＳのみを含む２×ＳＤＳ試料緩衝液を試料に加え、そして試料を加熱せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥを直接行う。タンパク質をクーマシー染色で検出し、またビオチン化の程度を、ビオチン化されておらず、ストレプトアビジンとインキュベートしていない等量の６×Ｈｉｓ−ＡＣＰを含む試料とバンド強度を比較して推定する。
【００７５】
ＣｏＡとＣｏＡ−ラベル間の競合の定量
精製された６×Ｈｉｓ−ＡｃｐＳ（０．４μM）を、室温で、ＣｏＡ−ＢｔまたはＣｏＡ−Ｄｇ（２μM）、種々の量のＣｏＡ（０．２、４、８、１２、２０、４０、８０μM）および精製６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａ（０．４μM）と２０μl反応緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ７．５、１０mM ＭｇＣｌ2）中でインキュベートする。２５分後、各試料を２０μlの２×ＳＤＳ試料緩衝液を加えてクエンチし、９５℃２分間加熱した。ラベルされた６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａを、ストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（１：１２５００希釈）または抗−ジゴキシゲニン抗体−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（１：５００希釈）および化学発光ペルオキシダーゼ基質を用い、ウエスタン-ブロッティングにより検出する。各実験に対して、０μM ＣｏＡの信号強度を任意に１に設定する。
【００７６】
酵母細胞表面上へのＡｇａ２−ＡＣＰのラベリング
酵母ゲノムＤＮＡ由来のＡＧＡ２配列を増幅し、ＰＣＲ断片の両端に導入したＥｃｏＲＩおよびＳａｌｌ制限部位を利用して、酵母発現ベクターｐＲＳ３１４のＰcup1−プロモーター配列の後へ挿入する。ＡＣＰ配列のＰＣＲ増幅によって導入したＳａｌｌおよびＡｃｃ６５１制限部位を用いて、ＡＣＰをＡＧＡ２のうしろのフレームへクローニングする。ＡＣＰはＨＡ−エピトープをコードする配列により延長される。Ａｇａ２ｐおよびＡＣＰを連結する配列は：ＦＶＤＥＭＬＹＦＱＧＭである。Ａｇａ２ｐの最後の残基とＡＣＰの最初の残基とに下線を付す。ＨＡ−エピトープを含むＡＣＰのＣ−末端配列は：ＱＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧである。ＡＣＰの最後の残基に下線を付す。ＰGAL1−プロモーター由来のＡｇａ１ｐとＰCUP1−プロモーター由来のＡｇａ２−ＡＣＰとを発現する酵母系統ＥＢＹ１００（ＭＡＴａ ｕｒａ３−５２ ｔｒｉｐ１ ｌｅｕ２Δ１ ｈｉｓ３Δ２００ ｐｅｐ４::ＨＩＳ３ ｃａｎ１ ＧＡＬ ｐＩＵ２１１:ＵＲＡ３）（Invitrogen, Carlsbad, CA）を、２％ガラクトースおよび０．１mM銅を含む選択培地１０ml中で、細胞が１．４ＯＤ600単位のＯＤ600になるまで生育したものを、２mlの水で洗い、０．２mlのラベリング緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ Ｃｌ ｐＨ８．８、１００mM ＮａＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ2）に再懸濁する。ＣｏＡ基質および６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳをそれぞれ最終濃度１０および１μM加える。室温で３０分後、反応液を２mlＰＢＳに希釈することによりラベリングを止める。細胞を２mlＰＢＳで４回洗い、直接蛍光顕微鏡検査に付すか、または、２０nM Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ストレプトアビジン結合体（Milan Analytic AG, Switzerland）を含む０．２mlのＱｄｏｔ（登録商標）インキュベーション緩衝液中で２０分間インキュベート後細胞を２mlＰＢＳで４回洗浄して蛍光顕微鏡検査に付す。細胞を、６３×油浸（開口数１．４）対物レンズを用いて、ツアイスＡｘｉｏｖｅｒｔ１３５蛍光顕微鏡（Carl Zeiss, Gottingen, Germany）で検査する。
【００７７】
ＨＥＫ２９３細胞上に表示されるＡＣＰ−ＮＫ１融合タンパク質のラベリング
ＡＣＰ−ＮＫ１の一時的発現のために、５−ＨＴ3−レセプターの信号配列（Ｓｉｇ5HT3）を短いＤＹＶリンカーを介してＡＣＰのＮ−末端に融合し、ＮＫ１を短いＴＳリンカーを介してＡＣＰのＣ−末端に融合する。その結果の構成において、ＦＬＡＧタグおよび６×ＨｉｓタグもまたＮＫ１のＣ−末端に結合させる。融合タンパク質に対応する遺伝子をｐＣＥＰ４（Invitrogen）ベクターのＮｈｅIおよびＢａｍＨＩ部位に挿入する。ＨＥＫ２９３細胞を２．２％ウシ胎児血清（GIBCO, BRL）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbeccoの修正Ｅａｇｌｅ培地; GIBCO BRL）中で生育させる。一時的トランスフェクションを記載（Nat Biotechnol 21,86-89 （2003））通りに行い、ＨＥＫ２９３細胞を、ＡＣＰ−ＮＫ１を発現するベクターと核を標的とするＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ−ＮＬＳ3）を発現するベクターにより共トランスフェクションする。２４時間後、細胞を１０分間室温で、ＭｇＣｌ2（１０mM）、６×Ｈｉｓ−ＡｃｐＳ（１μM）、およびＣｏＡ−Ｃｙ３、ＣｏＡ−Ｃｙ５、またはＣｏＡ−Ｂｔ（各５μM）のいずれかを含むＰＢＳ緩衝液５００μlとインキュベートする。細胞を次に過剰の基質を除くためにＰＢＳで３回洗浄し、Ｃｙ３またはＣｙ５でラベルする場合は直接にレーザー走査共焦点蛍光顕微鏡によって分析する。ビオチン化された細胞を、ＰＢＳ中１μg／ml濃度のＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ（登録商標）Ｃｙ５−ラベルしたストレプトアビジン（Amersham Biosciences）とインキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄する。レーザー走査共焦点蛍光顕微鏡像を、６３×水浸（開口数１．２）対物レンズ付きのＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０顕微鏡（Carl Zeiss AG, Gottingen, Germany）の４８８nmアルゴン／クロプトンレーザー線、５４３nm ＨｅＮＥレーザー線、または６３３nm ＨｅＮＥレーザー線を用いて記録する。走査速度およびレーザー強度を蛍光プローブの光退色および細胞の損傷または形態学的変化を回避するように調整する。蛍光を、ＧＦＰに敏感なチャネルおよびそれぞれの色素に敏感なチャネルで解析する。試験した各細胞試料に対して、ＧＦＰチャネルにおいて明確な核ラベリングが観察され、また細胞膜領域において明確な膜ラベリングが、ＣｏＡ−Ｃｙ３ラベル後、ＣｏＡ−Ｃｙ５ラベル後、およびＣｏＡ−Ｂｔラベル後であって、かつそれに続くストレプトアビジン-Ｃｙ５染色後に観察される。膜染色はトランスフェクションされない細胞では観察されず、ＧＦＰは核内発現されないことを示しており、これはそれぞれＣｙ３、Ｃｙ５、およびビオチンによるＡＣＰ−ＮＫ１の特異的ラベリングを示している。一時的にＨＥＫ２９３細胞に発現されたＡＣＰ−ＮＫ１レセプターをさらなる実験で、ＣｏＡ−Ｃｙ５およびテトラメチルローダミンでラベルされたサブスタンスＰ（ＳＰ−ｒｈｏ）、即ちＮＫ１の自然のリガンド、で共染色する。両物質はもっぱら膜領域を染色し、同一の染色領域となる。過剰のサブスタンスＰによって１分以内にＳＰ−ｒｈｏ染色が元に戻ることが、さらにラベリングの特異性とまたＡＣＰ−ＮＫ１のリガンド結合機能性をも証明する。
【００７８】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】（Ａ）６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ（１μM）、６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳ（０．２μM）およびＣｏＡ−Ｂｔ（５μM）の反応の解析：指定した時間（ｔ）に一定量を反応混合液から分取し、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ結合体を用いるウエスタンブロットにより６×Ｈｉｓ−ＡＣＰのビオチン化を精査する。（Ｂ）６×Ｈｉｓ−ＡＣＰのビオチン化の定量化：６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ（３μM）、６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳ（５μM）およびＣｏＡ−Ｂｔ（１０μM）を３０分間インキュベートし、透析し、分取した試料をストレプトアビジンとインキュベートしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに付す（第２列）。安定なビオチン-ストレプトアビジン複合体の形成がビオチン化タンパク質のゲルシフトをもたらす。ビオチン化の量を、第２列の６×Ｈｉｓ−ＡＣＰのバンド強度を、等濃度の６×Ｈｉｓ−ＡＣＰを含むがストレプトアビジンの無い試料（第１列）のバンド強度と比較して評価する。（Ｃ）ＣｏＡとＣｏＡ−Ｂｔ間のまたはＣｏＡとＣｏＡ−Ｄｇ間の、ＡＣＰＳの基質としての競合の定量：６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ（０．４μM）、６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳ（０．４μM）、ＣｏＡ−ＢｔまたはＣｏＡ−Ｄｇ（２μM）、および種々の濃度のＣｏＡ（０〜８０μM）を３０分間インキュベートし、ラベリングの程度をウエスタンブロットにより決定する。ウエスタンブロットの相対信号強度（Ｉ）を［ＣｏＡ］／［ＣｏＡ-Ｌ］（Ｌ＝ラベル）に対してプロットし、等式Ｉ＝Ａ／（１＋ＢＸ）にフィットさせる。ここで、Ｘは［ＣｏＡ］／［ＣｏＡ-Ｌ］、Ａは特定しない定数、Ｂは比（ｋcat／ＫＭ）CoA／（ｋcat／ＫＭ）CoA-Lである。これらの実験より、特異性定数の比が（ｋcat／ＫＭ）CoA／（ｋcat／ＫＭ）CoA-Btに対して０．４８、（ｋcat／ＫＭ）CoA／（ｋcat／ＫＭ）CoA-Dgに対して０．３５という結果となり、フリーのＣｏＡと誘導体化されたＣｏＡの間で重大な区別は無いことを明らかにする。
【図２】（Ａ〜Ｆ）酵母の細胞表面上のＡＣＰ融合タンパク質のラベリング。Ｃｙ３（Ａ）またはストレプトアビジンでコートされた量子ドットにより追跡したビオチン（Ｄ）によってラベルされたＡｇａ２−ＡＣＰを発現した酵母細胞の蛍光顕微鏡写真。（Ｂ）は（Ａ）と、（Ｄ）は（Ｅ）と同じであるが、但しＡＧＡ２−ＡＣＰを発現していない細胞である。（Ｃ）および（Ｆ）はそれぞれ（Ｂ）および（Ｄ）と同一の試料の透過顕微鏡写真である。これらの実験は、Ａｇａ２ｐ−ＡＣＰを発現している酵母細胞のみがラベルされることを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質から目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質またはその断片を含む融合タンパク質へラベルを転移する方法、ならびに特にラベルされた融合タンパク質を検出しおよび／または操作することをさらに含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複雑な生体系の理解の進歩は、その背後にある生体分子特にタンパク質の相互作用の特性決定に掛かっている。増大する数の生物におけるＤＮＡ配列決定により、その生物の読み取り枠（ＯＲＦ）が明らかにされてきたが、その一方で、対応するタンパク質を生体内および生体外で特性決定できる可能性は限られている。この目的の実現を目指す戦略の大部分は、生体外での応用のための融合物の精製または生体内でのタンパク質の追跡を可能にする融合タンパク質を構築することに基礎を置いている。そのようなタグの例には、６×Ｈiｓタグ、グルタチオンＳ転移酵素、マルトース結合タンパク質、エピトープタグ、酵母ツーハイブリッドシステム、Ｏ6−アルキルグアニン-ＤＮＡアルキル転移酵素、分解ユビキチン、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質が挙げられる。しかし、これらの方法はすべて様々な限界や不利益を有する。
【０００３】
Gehring et al.(1997)および Lambalot and Walsh(1995)は、Ｅ．ｃｏｌｉのホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）を用いて、アポ-アシル担体タンパク質（ａｐｏ−ＡＣＰ）の保存されているセリン残基に生体外で補助因子４’−ホスホパンテテイン（Ｐ−ｐａｎｔ）を結合させて、ホロ-ＡＣＰを生成させる翻訳後修飾を触媒させることを記載している。Ｐ−ｐａｎｔの起源は補酵素Ａである。Gehring et al.(1997)はさらにＰ−ｐａｎｔ部分が修飾されているが依然としてＡＣＰＳの基質として働くことができる補酵素Ａの類似物質を用いて、修飾されたＰ−ｐａｎｔを補助因子とするホロ-ＡＣＰが得られることを示している。
【０００４】
ＡＣＰＳなどの単離されたホスホパンテテイニル転移酵素は国際特許出願WO 97/13845に記載されている。
【０００５】
ラベルをＯ6−アルキルグアニン-ＤＮＡアルキル転移酵素（ＡＧＴ）融合タンパク質に転移する方法、およびこの方法をＡＧＴ融合タンパク質の検出に用いることが国際特許出願WO 02/083937に記載されている。
【０００６】
発明の開示
本発明は、目的のタンパク質を検出し、および／または操作する方法であって、目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）またはその断片を含む融合タンパク質を、ラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質およびホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）もしくはその相同物と接触させること、その結果ＡＣＰＳがラベルを融合タンパク質へ転移させ、また場合によっては、そのラベルを認識しおよび／または操作するために設計されたシステム中でそのラベルを用いて、得られたそのラベル付融合タンパク質を検出しおよび／またはさらに操作すること、を含む方法に関する。
【０００７】
さらにまた、本発明は目的のタンパク質およびＡＣＰまたはその断片を含む融合タンパク質のそのような方法中での使用に関する。特に本発明の方法は、目的のタンパク質を精製もしくは固定化するため、または本発明の方法において目的のタンパク質をそれに結合されたラベルにより生体外もしくは生体内で連続的にモニターするために用いられる。
【０００８】
本発明の融合タンパク質に組み込まれる目的のタンパク質は任意の種類のものでよく、それには二次構造、三次構造、もしくは四次構造を持つ、または持たない、任意の長さのタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドが含まれる。
【０００９】
本発明の方法で用いられる特別のラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質は、ＣｏＡ、または修飾されたＣｏＡから、ラベル即ち検出可能なマーカーをさらに付加するための少なくとも１つの反応部位を有するリンカーを結合させることによって得ることができる。本発明はまた、そのような新規のラベルされた補酵素Ａ型基質、それを製造する方法、そのような新規の補酵素Ａ型基質の合成において有用な中間体、および本発明の方法中でのそれらの使用に関する。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、目的のタンパク質を検出し、および／または操作する方法であって、目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）またはその断片を含む融合タンパク質を、ラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質およびホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）もしくはその相同物と接触させること、その結果ＡＣＰＳがラベルを融合タンパク質へ転移させ、また場合によっては、ラベルを認識しおよび／または操作するために設計されたシステム中でラベルを用いて、得られたラベル付融合タンパク質を検出し、および／またはさらに操作するようにすること、を含む方法に関する。
【００１１】
ＡＣＰまたはＡＣＰドメインは、脂肪酸、ポリケチドの生合成および非リボソームペプチド合成において担体として作用する。ＡＣＰはホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）によって翻訳後修飾される。この酵素は補助因子４−ホスホパンテテイン（Ｐ−ｐａｎｔ）を補酵素ＡからＡＣＰの保存されているセリン残基に転移する。ＡＣＰＳはまたホスホパンテテイニル転移酵素とも呼ばれる。ＡＣＰＳは、ＣｏＡのホスホパンテテイン部分のチオール基に対する修飾に関して比較的低い基質特異性を所持していることが示されている。これを活用して、ＡＣＰ融合タンパク質をＡＣＰＳおよびホスホパンテテイン部分を介してラベルを所持するＣｏＡ誘導体と共にインキュベートすることにより、特異的にラベルすることができる。ラベルが、このようにしてホスホパンテテイン部分と共にＡＣＰの保存されたセリン残基に転移される。ラベリングは融合タンパク質の性質とは独立である。
【００１２】
ＡＣＰおよびＡＣＰＳという語句は、ここでは任意の一対のタンパク質であって２つのうちの１つ（ＡＣＰ）がＣｏＡ誘導体起源のホスホパンテテイン誘導体に対するアクセプターであり、他の１つ（ＡＣＰＳ）がホスホパンテテイン誘導体のＡＣＰへの転移を触媒するものを表す。
【００１３】
ＡＣＰＳおよびホスホパンテテイン転移酵素という語句は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰＳと相同性のある多数のホスホパンテテイニル転移酵素が、脂肪酸合成に関与せず、むしろ自然産物の生合成に関与しているタンパク質を修飾するという事実にもかかわらず、ここでは交換できる語句であるとして用いる（Lambalot et al.,1996）。このようなホスホパンテテイニル転移酵素の例には：エンテロバクチン合成に関与するＥｎｔＤ；サーファクチン生合成に関与するＳｆｐおよびＰｓｆ−１；グラミシジンＳ生合成に関与するＧｓｐ；リシン生合成に関与するＬＹＳ５；バシトラシン生合成に関与するＢｌｉ；イチュリンＡ生合成に関与するＬｐａ−１４；および、ノシヘプチド生合成に関与するＮｓｈＣ、がある。本発明はＥ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰＳと相同性のあるラベリング方式を持つ全てのＡＣＰＳの使用を含む。
【００１４】
ＡＣＰという用語は、Lambalot et al.(1996)によって定義されたように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰＳまたはＥ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰＳと相同性のある任意のＡＣＰＳによって翻訳後にホスホパンテテイニル化されることとなる任意のタンパク質を表す。これには、脂肪酸合成に関与するタンパク質ばかりでなく、ポリケチド合成、非リボソームペプチド合成、アミノ酸合成、およびデプシペプチド合成に関与するタンパク質も含まれる。ＡＣＰＳによる翻訳後修飾に加えて、これらのタンパク質は共通して種々の基質とアシルパンテテイニル・チオエステルを形成し、ホスホパンテテイニル部分がセリン残基に結合される。これらの自然の機能において、ＡＣＰは、多機能酵素（Ｉ型脂肪酸合成酵素のような）のドメイン、または別のタンパク質（II型脂肪酸合成酵素のような）のドメインであり得る。
【００１５】
「検出する」とは、ラベルおよびそれに結合している目的のタンパク質を、ラベルを観測するために設計されたシステム中でラベルの性質に基づいて観察することを意味するものであり、また特別なラベルを認識し、ラベルの性質によって特別な環境でラベルを見出し、場合によっては、ラベルおよびそれに結合したタンパク質を定量化し、また場合によっては、ラベルの微細環境を決定することなどを含む。
【００１６】
「操作する」とは、ラベルおよびそれに結合している目的のタンパク質を操作することを意味し、またラベルおよびそれに結合している目的のタンパク質を、ラベルを操作するために設計されたシステム中でラベルの性質に基づいて操作することを含み、ならびに化学的または生物学的環境から分離すること、別の化学的または生物学的環境へ導入すること、精製すること、即ち望ましくない副産物および不純物から分離すること、ラベルを固体の担体と反応させることによって固定化すること、ラベルおよび／または目的のタンパク質の性質を修飾するために化学的または生物学的試薬と接触させることなどを含む。
【００１７】
ここで開示する方法は一般にある範囲の応用に適用でき、特異的におよび共有結合的に融合タンパク質を（１）ラベルされた融合タンパク質の環境の変化を感受し誘起することができるラベルによってラベルすることができ、（２）ラベルによって融合タンパク質に特異的に導入された物理的および／または化学的性質によって融合タンパク質を操作することを助けるラベルによってラベルすることができ、および／または（３）ラベルによって導入された性質を通じて融合タンパク質の精製を助けるラベルによってラベルすることができる。ここで開示する方法はＡＣＰ融合タンパク質を生体外および生体内、例えば細胞中の両方でラベルするために用いることができる。
【００１８】
さらにまた、本発明は目的のタンパク質とＡＣＰまたはその断片を含む融合タンパク質のそのような方法中での使用に関する。特に、本発明の方法は目的のタンパク質の精製と固定化に、または、目的のタンパク質を生体外および生体内において本発明の方法によりそれに結合されたラベルにより連続的にモニターすることに用いられる。
【００１９】
一つの態様において、本発明は目的のタンパク質を生体外および生体内において連続的にモニターする方法を提供する。この方法では、目的のタンパク質とアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）またはその断片を含む融合タンパク質を、ラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質およびホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）またはその相同物と接触させて、ＡＣＰＳがラベルを融合タンパク質へ転移し、またラベルを、ラベルを認識するために設計されたシステム中で観察する。
【００２０】
さらにある態様において、本発明は目的のタンパク質を生体外および生体内において操作する方法を提供する。そこでは目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）もしくはその断片を含む融合タンパク質を、ラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質およびホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）もしくはその相同物と接触させて、その結果ＡＣＰＳがラベルを融合タンパク質へ転移し、また融合タンパク質をラベルの物理的および／または化学的性質に基づいて操作する
【００２１】
ある特別な態様においては、ラベルの物理的および／または化学的性質によってラベルされた融合タンパク質の効率的な精製が可能であり、したがって本発明は、本発明の方法の諸工程すなわち、ラベルの物理的および／または化学的性質を精製に利用し、その後融合タンパク質を切断して高純度の目的のタンパク質を供給する工程を遂行することによる、目的のタンパク質の精製方法を提供する。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）もしくはその断片を含む融合タンパク質を固体支持体に固定化する方法を提供する。この方法は融合タンパク質を、固体支持体に結合しているかまたは結合できるラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質およびホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）もしくはその相同物と接触させることを含み、これにより、ホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）がラベルをＡＣＰ融合タンパク質へ共有結合させるように転移し、ＡＣＰ融合タンパク質はそれにより固体支持体に結合されるかまたはその後に結合され得る。ラベルが最初は固体支持体に結合されていない本発明の特別な態様において、本方法はさらに、ラベルされたＡＣＰ融合タンパク質が固体支持体に固定化されるようにそれを固体支持体と接触させる工程を含んでもよい。これらの本発明の好ましい実施態様においてラベルは、転移されたときまたは次の反応において固体支持体に共有結合的に結合されてもよく、または特異的な結合対の一員であって、他の一員が固体支持体に共有結合的にもしくは任意の他の手段により結合しているか結合可能であってもよい。それは例えばビオチンおよびアビジンもしくはストレプトアビジンの特異的結合対を用いる場合である。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、生体外はもちろん生体内においてもＡＣＰ融合タンパク質をラベルする方法を提供する。生体内におけるＡＣＰ融合タンパク質のラベリングという語句は、細胞外スペースに向いているＡＣＰ融合タンパク質をラベルすることはもちろん、細胞内の全ての区画においてラベルすることを含む。もしＡＣＰ融合タンパク質のラベリングが生体内で行なわれ、ＡＣＰに融合されたタンパク質が原形質膜タンパク質である場合には、融合タンパク質のＡＣＰ部分は原形質膜の細胞質側または細胞外側のどちらに付着していてもよい。ラベリングを生体外で行なう場合は、融合タンパク質のラベリングは細胞抽出物中でまたはＡＣＰ融合タンパク質を精製または濃縮した形で行うことができる。
【００２４】
本発明は、所望のタンパク質へのラベルの特異的な付加を、その目的のタンパク質とアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）またはその断片との間で融合タンパク質を形成させることにより遂行できたという成果を基礎にしている。
【００２５】
好ましい応用において、アシル担体タンパク質即ち「ＡＣＰ」は、ホロ-アシル担体タンパク質合成酵素即ち「ＡＣＰＳ」によって、ラベルされた４’−ホスホパンテテインが適当な補酵素Ａ（「ＣｏＡ」）から融合タンパク質の一部を形成するＡＣＰもしくはその断片のセリン残基へ転移される方法で、修飾される性質を有する。好ましい実施態様において、ＡＣＰは、例えばRawling and Cronan, 1992およびその中の引用文献中に記載のＥ．ｃｏｌｉのアシル担体タンパク質である。しかし、他のアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）、例えばGehring et al., 1997に記載されているStreptomyces種のＡＣＰ、または適当にラベルされたＣｏＡ存在下で上に定義したＡＣＰＳによって修飾される性質を有する任意のＡＣＰが知られており、本発明において使用できる。本発明においてＡＣＰはまた、野生型ＡＣＰの変異体であって１個以上のアミノ酸置換、欠失または付加によって野生型と異なり、しかしＡＣＰＳにより触媒される反応において、ラベルされた４’−ホスホパンテテインに対するアクセプターとして作用する性質を依然として保持している変異体も含む。他のＡＣＰ変異体を周知技術を用いて化学的に修飾してもよい。ＡＣＰ変異体は周知のタンパク質工学技術を用いて、および／またはＡＣＰＳによって触媒される反応におけるラベルされた４’−ホスホパンテテインの転移に対する新しいアクセプター配列を生成し選択するための分子進展を利用して生成することができる。ＡＣＰ断片とは、ホスホパンテテイン誘導体と結合するセリン残基を含み、またそのようなホスホパンテテイン誘導体を受容する機能を残存させている断片である。
【００２６】
好ましい実施態様において、ＡＣＰＳは、例えばLambalot and Walsh,1995またはその中で引用された文献に記載されたＥ．ｃｏｌｉのホロ-アシル担体タンパク質合成酵素である。しかし、他のホロ-アシル担体タンパク質合成酵素、例えばLambalot et al.,1996記載のBacillus subtilis由来のＡＣＰＳまたは上で定義したＡＣＰを適当にラベルされたＣｏＡ存在下で修飾する性質を有するならば本発明において採用可能である任意の形のタンパク質なども知られている。これらのＡＣＰＳはまたLambalot et al.,1996記載のように、ホスホパンテテイニル転移酵素としても知られており、また本発明はこの一般的な種別の酵素の使用を含む。本発明において、ホロ-アシル担体タンパク質合成酵素はまた野生型ＡＣＰＳの変異体であって１個以上のアミノ酸置換、欠失または付加によって野生型と異なり、しかしラベルされた４’−ホスホパンテテインを特異的にＡＣＰ融合タンパク質に転移する性質を依然として保持している変異体も含む。他のＡＣＰＳ変異体を周知技術を用いて化学的に修飾してもよい。ＡＣＰＳ変異体は周知のタンパク質工学技術を用いて、および／またはラベルされた４’−ホスホパンテテインを異なるアクセプター配列に転移するための新しい特異性を生成し選択する分子進展を利用して、生成することができる。
【００２７】
ＡＣＰ融合タンパク質のＡＣＰＳによるラベリングのための、多くの考察を有利に織込む。最も大切なことは、ＡＣＰ融合タンパク質のラベリングは、ラベルする前にＡＣＰ融合タンパク質のＡＣＰ部分がアポ型で存在することに依存していることである。もしＡＣＰ融合タンパク質が、翻訳後修飾の基質としてこのＡＣＰ融合タンパク質を受容する内在的ＡＣＰＳを有する宿主において発現されているならば、ＡＣＰ融合タンパク質は所望の修飾に対して少なくとも部分的に遮断される可能性がある。この望ましくないＡＣＰ融合タンパク質の修飾を最小にするために種々の解決策が提案されている。第一に、宿主のＡＣＰＳによって効率的に修飾されないＡＣＰを選択する、即ちＡＣＰが宿主の生化学と直交するように選択する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰは、ヒト細胞において融合タンパク質として発現されたときにヒトのＡＣＰＳによって有意な程度には修飾されない（図３参照）。第二に、ＡＣＰ融合タンパク質の過剰発現によってＡＣＰ融合タンパク質の主にアポＡＣＰが形成されるようになる。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＥ．ｃｏｌｉ由来の６×Ｈｉｓ−ＡＣＰを過剰発現させることにより、これらの細胞内に内在性ＡＣＰＳが存在するにもかかわらず、大部分は６×ＨｉｓのアポＡＣＰが生成されることになる。
【００２８】
ラベル反応のために、ＡＣＰ融合タンパク質はまた、対応するＡＣＰＳおよびＣｏＡ誘導体の両方と接触しなければならない。このことは生体内応用において、ＡＣＰ融合タンパク質が細胞表面に表示されるか、またはＡＣＰＳとＣｏＡ誘導体が微量注入などの技術を用いて目的の細胞内に導入されるかどちらかであることを意味する。
【００２９】
本発明において、ＡＣＰとの融合タンパク質のタンパク質部分への言及は、二次構造、三次構造、四次構造を有するまたは有しないタンパク質、任意の長さのポリペプチドおよびペプチドが含まれることを意図したものであり、また好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸から２０００個までのアミノ酸を、好ましくは５０から１０００個の間のアミノ酸から成る。本発明による目的のタンパク質は次の群から選択される。その群は、酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核レセプタータンパク質、核局在信号タンパク質、タンパク質補助因子、抗体、膜ポンプタンパク質、膜チャネルタンパク質、膜担体タンパク質、運動タンパク質、シグナル伝達に含まれるタンパク質、核タンパク質、リボソームタンパク質、小単量体ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、特別な細胞内区画を標的とするタンパク質としての役割を担う配列を有するタンパク質、一般にラベルとしてまたは親和性タグとして用いられるタンパク質、および前述のタンパク質のドメインもしくはサブドメイン、から成る。ＡＣＰ融合タンパク質は１つ以上の、例えば１つ、２つ、３つの、ＡＣＰのＮ−末端、Ｃ−末端、またはＮ−およびＣ−末端においてＡＣＰと融合した目的のタンパク質から成ればよい。
【００３０】
より詳しく言えば、本発明による目的のタンパク質はつぎの群から選択される。
即ちその群は、
酵素、例えば、転移酵素（ＥＣ２）、より具体的にはメチル基以外のアルキルもしくはアリル基を転移する転移酵素（ＥＣ２．５）、特にグルタチオン転移酵素（ＥＣ２．５．１．１８）、
あるいは、リンを含む基を転移する転移酵素であるキナーゼ（ＥＣ２．７）、例えば酵母のカゼインキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３７）またはチロシンタンパク質キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１２）のような、基質タンパク質のリン酸化標的部位としてセリンもしくはスレオニンを有するタンパク質キナーゼなど、特にアルコール基をアクセプターとするキナーゼ（ＥＣ２．７．１）；
あるいは、例えば酸化還元酵素（ＥＣ１）、より具体的には過酸化物をアクセプターとする酸化還元酵素（ＥＣ１．１１）、特にチトクロームＣペルオキシダーゼ酵素（ＥＣ１．１１．１．５）；
あるいは、例えば加水分解酵素（ＥＣ３）、より具体的にはエステル結合に作用する加水分解酵素（ＥＣ３．１）、特にタンパク質リン酸モノエステル加水分解酵素などのリン酸モノエステル加水分解酵素（ＥＣ３．１．３）；またはペプチダーゼもしくはプロテアーゼ（ＥＣ３．４）としても知られるペプチド結合を加水分解する加水分解酵素、特にカスパーゼ；
ＤＮＡ結合タンパク質、より具体的にはｍＲＮＡ合成を阻害するタンパク質因子である転写リプレッサータンパク質、特にＥ．ｃｏｌｉにおいてｍＲＮＡ合成を阻害するタンパク質因子、特にＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン；
転写調節タンパク質、より具体的には転写リプレッサータンパク質、特にトリプトファン／アスパラギン酸反復構造を含む転写リプレッサータンパク質；
膜タンパク質、例えば少なくとも１つの膜貫通へリックスを示す膜タンパク質、より具体的には小胞体（ＥＲ）膜由来の膜タンパク質、特にＥＲ膜貫通タンパク質Ｓｅｃ６２などの特にＥＲへのタンパク質移行活性を有する膜タンパク質；
あるいは、例えば７回膜貫通ヘリクッス（７−ＴＭ）タンパク質、より具体的には７−ＴＭタンパク質がＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）であるもの、特に哺乳類などの、例えばヒトのニューロキニン−１−レセプター（ＮＫ１）などの分子量約１kDaより上の高分子リガンドを結合する７−ＴＭタンパク質；
あるいは、例えば細胞膜由来の膜貫通イオンチャネルタンパク質、特にリガンド作動性イオンチャネルタンパク質、より具体的には、セロトニンレセプター５−ＨＴ３などのセロトニン感受性のリガンド作動性イオンチャネルタンパク質；
あるいは、例えばイオンチャネルおよびＧタンパク質共役レセプター以外の膜レセプター；
あるいは、例えば、特に酵母由来の、ペルオキシソームの膜タンパク質、タンパク質Ｐｅｘ１５など；
核レセプタータンパク質、例えば転写因子ファミリー由来の核レセプタータンパク質、より具体的にはリガンド誘導可能な転写因子ファミリー由来の核レセプタータンパク質、特に例えばヒトエストロゲンレセプターｈＥＲなどのエストロゲンレセプターのようなステロイドファミリー由来の核レセプター；
サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来の核局在信号などの核局在信号タンパク質；
例えば遺伝子構造中にユビキチン配列を含むタンパク質のようなタンパク質性補助因子；
小単量体ＧＴＰアーゼ、より具体的にはＲａｓファミリーメンバーのような膜結合性小単量体ＧＴＰアーゼ；
例えば複数薬剤耐性タンパク質のようなＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質；
細胞内構造タンパク質、より具体的には細胞骨格タンパク質、より具体的にはヒト細胞質β−アクチン；
例えばゴルジ体、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、原形質膜、またはペルオキシソームへと、特別の細胞区画へタンパク質を指向させる役割の配列を有するタンパク質；
一般にラベルまたは親和性タグとして用いられるタンパク質、例えばＵＶもしくは可視光照射による励起によって蛍光信号を与える蛍光タンパク質、強化シアノ蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）として知られる蛍光タンパク質などの、特に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）として知られるファミリー由来の蛍光タンパク質；
および上述タンパク質のドメインまたはサブドメイン、
である。
【００３１】
さらに、本発明による目的のタンパク質は供給源に従って選択される。特に、目的のタンパク質には、ヒト、マウス、ラット、他の高等動物、真核生物種、バクテリア種、例えばサルモネラ、より具体的には、salmonella typhiもしくはsalmonella typhimurium、ミコバクテリア、より具体的には mycobacterium tuberculosis、ブドウ球菌、より具体的にはstaphylococcus aureusなどに存在するタンパク質、または、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトインフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、またはコロナウイルスなどのウイルス源由来のタンパク質である。
【００３２】
さらにまた、目的のタンパク質は、ガン、心臓血管病、精神障害、アルツハイマー、肥満、ウイルス感染、およびバクテリア感染などの、一定の病気におけるその役割に従って選択される。
【００３３】
本発明の特定の実施態様において、融合タンパク質は、一方の側のＥ．ｃｏｌｉのＡＣＰまたはそのようなＡＣＰのＤＮＡの変異体およびＡＣＰのＤＮＡ配列のＮ−末端（Ｎ）もしくはＣ−末端（Ｃ）もしくはＮ−末端とＣ−末端側に結合された（上に挙げたような）目的のタンパク質をコードする配列とから生成され、本発明の融合タンパク質が導かれる。融合タンパク質はさらに適当なリンカー、例えば融合タンパク質中のＡＣＰと目的のタンパク質の間の、および／または２つの目的のタンパク質の間の適当な条件下で酵素切断を受けやすいリンカーを含む。そのようなリンカーの例には、ＤＮＡ段階で適当な制限酵素によって切断されるリンカー、例えばＢｇｌ IIによって切断されるＡＧＡＴＣＴ、および／またはタンパク質段階で適当な酵素、例えばタバコエッチウイルスＮｌａ（ＴＥＶ）プロテアーゼによって切断されるリンカーがある。
【００３４】
融合タンパク質は原核生物宿主、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ、または真核生物宿主、例えば酵母、真菌、昆虫、または哺乳動物細胞中で発現できる。
【００３５】
本発明はまた、目的のタンパク質とＡＣＰもしくはその断片との新規な融合タンパク質に関する。
【００３６】
本発明において、ラベルされたＣｏＡ型基質は、好ましくは次の一般式（Ｉ）：
【化２】
または、次の一般式（II）：
【化３】
を持つ、ラベルされた補酵素Ａの誘導体である。式中、Ｒは補酵素Ａとラベルを繋ぐリンカー基であり、また「ラベル」は、ここに記載した融合タンパク質の検出、精製および／または操作のために適当なラベル分子である。
【００３７】
しかし、本発明は式（Ｉ）または（II）の基質に限られない。広い範囲の他の基質をＡＣＰ融合タンパク質へラベルを転移するために使用できるからである。例えば、式（Ｉ）の化合物のプリン部の置換、糖部分またはパンテテイニル酸部分の修飾、が考えられる。
【００３８】
式（Ｉ）または（II）の化合物中のリンカー基Ｒはラベルを補酵素Ａに結合する柔軟なリンカーである。リンカー単位は構想した応用、即ちＡＣＰを含む融合タンパク質へのラベルの転移との関連で選ばれる。それらはまた適当な溶媒中で基質の溶解度を増加させる。用いたリンカーは実際の応用条件下で化学的に安定である。リンカーＲはＡＣＰとの反応にもラベルの検出にも干渉せず、しかし補酵素Ａ型基質がＡＣＰを含む融合タンパク質と反応した後のある時点で切断されるように構成することができる。
【００３９】
リンカー基Ｒは１〜３００個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキレン基であり、場合によっては、
（ａ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられ、特に３個ごとの炭素原子が酸素に置き換えられ、例えば、１〜１００個のエチレノキシ単位を有するポリエチレノキシ基を表し；
（ｂ）１個以上の炭素原子が水素原子を持つ窒素原子に置き換えられ、また隣接する炭素原子がオキソにより置き換えられて、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を表し；
（ｃ）１個以上の炭素原子が酸素に置き換えられ、また隣接する炭素原子がオキソで置き換えられ、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
（ｄ）隣接する２個の炭素原子間の結合が２重または３重結合であり、官能基−ＣＨ=ＣＨ−または−Ｃ≡Ｃ−を表し；
（ｅ）１個以上の炭素原子がフェニレン、飽和または不飽和シクロアルキレン、飽和または不飽和ビシクロアルキレン、架橋ヘテロ芳香族または架橋飽和または不飽和ヘテロシクリル基に置き換えられており、
（ｆ）隣接する２個の炭素原子がジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−により置き換えられており；
または、場合によっては置換基を含む、２個以上の、特に２個の、アルキレン基および／または上の（ａ）〜（ｆ）で定義した修飾されたアルキレン基の組み合わせである。
【００４０】
考慮した置換基は、例えば低級アルキル例えばメチル、低級アルコキシ例えばメトキシ、低級アシロキシ例えばアセトキシ、またはハロゲニル例えばクロロである。
【００４１】
さらに考慮した置換基は、例えばα−アミノ酸がリンカーＲに取り込まれた場合に得られる置換基であり、その場合炭素原子は（ｂ）で定義したアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−で置き換えられる。そのようなアルキレン基の炭素鎖のリンカー部分において、Ｒは−（ＮＨ−ＣＨＲ’−ＣＯ）n−基で置き換えられる。ここでｎは１〜１００の間であり、Ｒ’は種々のα−アミノ酸の残基を表す。
【００４２】
さらなる置換基は光切断性リンカーＲとなる置換基、例えばｏ−ニトロフェニル基である。特に、このｏ−ニトロフェニル置換基はアミド結合に隣接した炭素原子に、例えば−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ（ｏ−ニトロフェニル）−ＮＨ−ＣＯ−基に存在する。
【００４３】
上の（ｅ）で定義した炭素原子と置き換えられるフェニレン基は、例えば１，２−、１，３−、または好ましくは１，４−フェニレンである。上の（ｅ）で定義した炭素原子と置き換えられる飽和または不飽和シクロアルキレン基は、例えばシクロペンチレンまたはシクロヘキシレンまたはさらに、例えば１−または２−の位置で不飽和のシクロヘキシレンである。上の（ｅ）で定義した炭素原子と置き換えられる飽和または不飽和ビシクロアルキレン基は、例えば、場合によっては、２−の位置で不飽和のまたは２−と５−の位置で二重に不飽和のビシクロ［２，２，１］ヘプチレンまたはビシクロ［２，２，２］オクチレンである。上の（ｅ）で定義した炭素原子と置き換えられるヘテロ芳香族基は、例えばトリアゾリデン、好ましくは１，４−トリアゾリデン、またはイソオキサゾリデン、好ましくは３，５−イソオキサゾリデンである。上の（ｅ）で定義した炭素原子と置き換えられる飽和または不飽和ヘテロシクリル基は、例えば２，５−テトラヒドロフランジイルまたは２，５−ジオギサンジイル、またはイソオキサゾリジネン、好ましくは３，５−イソオキサゾリジネンである。
【００４４】
好ましいリンカー基Ｒは、例えば、場合によってはメチル、メトキシ、またはアセトキシ基で置換された１〜２０個の炭素原子のアルキル鎖、または１〜２０個のエチレノキシ基から成るポリエチレングリコール鎖などの、柔軟なリンカーである。
【００４５】
基質のラベル部分は、当業者が融合タンパク質を応用しようと意図するその応用に応じて選択できる。ラベルの例には：
（１）蛍光団、発色団などの分光学的プローブ、磁気的プローブまたはコントラスト剤、あるいはまた電子顕微鏡技術で有用なプローブ；
（２）放射性ラベルされた分子；
（３）相手と特異的に結合できる特異的な結合対の一方の分子。そのような特異的結合対は周知であり、例えばアビジンまたはストレプトアビジンと結合できるビオチンである；
（４）他の生体分子と相互作用すると想定される分子；
（５）他の生体分子と相互作用すると想定される分子のライブラリー；
（６）例えばNadeau et al.,2002に記載された、当業者に周知の他の生体分子と架橋できる分子；
（７）Ｈ2Ｏ2とアスコルビン酸に曝露されるとヒドロキシラジカルを生成できる例えばHori et al.,2002に記載の繋留された金属キレートなどの分子；
（８）例えばJay et al.1999に記載のマラカイトグリーンなどの、光照射によって反応性ラジカルを生成できる分子；
（９）支持体がガラススライド、ミクロタイタープレートまたは熟練の当業者に周知の任意の一般ポリマーである、固形支持体に共有結合した分子；
（１０）相補的な鎖と塩基対を形成できる核酸またはその誘導体；
（１１）リピッドまたは膜に挿入される性質を有する他の疎水性分子；
（１２）望ましい酵素学的、化学的、または物理学的性質を有する生体分子；
（１３）上に挙げた性質の任意の組み合わせを有する分子；
が含まれる。
【００４６】
ラベルされたＣｏＡ誘導体は、ホスホパンテテイニル部分がＡＣＰ融合タンパク質へ転移することができ検出可能であるラベル、例えば蛍光団、発色団、磁気的プローブ、放射性ラベルされた分子、または任意の他の分光学的プローブなどのラベルを所持しており、そのラベルされたＣｏＡ誘導体を使用することによって、本発明を、生体外または細胞内もしくは細胞表面上（生体内）において、検出できるラベルをＡＣＰ融合タンパク質へ特異的かつ共有結合的に結合させるために使用することが可能になる。これにより、生体内および生体外においてＡＣＰ融合タンパク質の検出と特性決定が可能になる。生体内という語句は、細胞外スペースに向いているＡＣＰ融合タンパク質のラベルはもちろん、細胞の全ての区画中でＡＣＰ融合タンパク質をラベルすることを含む。この方法を、遺伝的に目的のタンパク質と融合させ、生きている細胞中でその研究をすることができるようにする緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の応用と比較することができる。ＧＦＰとその突然変異体の欠点は、原則としてＧＦＰ中に存在する自然に存在する蛍光団の使用に限定されることである。細胞内（生体内）でのラベリングは、タンパク質の機能的な構造に小さな影響のみを与え、ＡＣＰのホスホパンテテイニル部分によりラベルされる機能を保持する一般的な固定手順によって細胞を固定した後にも利用できる。
【００４７】
ホスホパンテテイニル部分がＡＣＰタンパク質に転移できるビオチンなどの親和性タグを有するようなラベル付ＣｏＡ誘導体を使用することによって、本発明を親和性タグを融合タンパク質へ転移するために用いることが可能になり、融合タンパク質に親和性タグの結合相手が結合できるようになる。例として、ビオチンなどの親和性タグによってラベルされたＣｏＡ基質およびＡＣＰＳを、ＡＣＰ融合タンパク質を発現している細胞抽出液（バクテリアもしくは真核生物の）または精製されたＡＣＰ融合タンパク質に加えることによって、親和性タグによる融合タンパク質の共有結合的修飾が可能になる。これによって次に、親和性タグとその結合相手との相互作用を利用して、例えばビオチンの場合は固定化されたアビジンもしくはストレプトアビジンとの相互作用によって、融合タンパク質の単離が可能になる。もしラベルがジスルフィド架橋などの切断可能な結合を有するリンカー基Ｒを介してＡＣＰ融合タンパク質にリンクしているならば、またはもしリンカーが光切断性であれば、精製後にＡＣＰ融合タンパク質から親和性タグを切り離すことができる。
【００４８】
ＡＣＰ融合タンパク質へ転移でき、また外部の刺激に曝露するとヒドロキシラジカルなどの反応性ラジカルを生成できるラベルをホスホパンテテイニル部分が所持するラベル付ＣｏＡ誘導体の使用によって、目的のタンパク質およびその近くのタンパク質の立体構造の研究が可能になる。生成されたラジカルはＡＣＰ融合タンパク質およびそのごく近傍のタンパク質を不活性化することができて、それのよってそれらのタンパク質の役割の研究が可能になる。そのようなラベルの例は、Ｈ2Ｏ2とアスコルビン酸に曝露することによりヒドロキシラジカルを生成するテザー金属キレート錯体、およびレーザー照射によってヒドロキシラジカルを生成するマラカイトグリーンなどの発色団である。ヒドロキシラジカルを生成するために発色団とレーザーの使用することは、例えばJay et al.,1998に記載されているように、発色団援用レーザー誘導不活性化（ＣＡＬＩ）として周知である。ＣＡＬＩは、時間的に制御され空間的に解像された態様で特異的に細胞中の一定のタンパク質を特異的に不活性化するために使用する方法であって、また発色団とタンパク質が空間的に近傍にあることを基礎にしている。レーザー照射すると、発色団はヒドロキシラジカルを生成し、それは発色団から約１００nm以内のそしてそれ以内のみの全てのタンパク質を不活性化する。現在までは、発色団は、目的のタンパク質に特異的な発色団でラベルされた抗体を微量注入することによって目的のタンパク質の空間的近傍にもたらされた。本発明において、マラカイトグリーンのような発色団でＡＣＰ融合タンパク質をラベルし次にレーザー照射することによって、時間的に制御され空間的に解像された態様でＡＣＰ融合タンパク質およびＡＣＰ融合タンパク質と相互作用するタンパク質を不活性化することを可能にすることになる。この方法は生体内および生体外の両方で応用できる。
【００４９】
類似の方法で、ＡＣＰ融合タンパク質を繋留された金属キレートでラベルし、そしてＡＣＰ融合タンパク質およびＡＣＰ融合タンパク質と相互作用するタンパク質をＨ2Ｏ2およびアスコルビン酸に曝露することにより特異的に不活性化できる。この方法はＡＣＰ融合タンパク質またはＡＣＰ融合タンパク質のごく近傍のタンパク質の機能の研究に用いることができるばかりでなく、ＡＣＰ融合タンパク質のごく近傍のタンパク質の同定にも用いることができる。ここで、ＡＣＰ融合タンパク質のごく近傍のタンパク質を、特異的な抗体によりそのタンパク質の断片を検出することにより、高分解能二次元電気泳動ゲル上からそれらのタンパク質が消滅したことにより、または質量分析法もしくはＮ−末端分解によるタンパク質配列決定法などの分離および配列決定技術により切断されたタンパク質断片を同定することにより、同定できる。
【００５０】
ホスホパンテテイニル部分がＡＣＰ融合タンパク質に転移できるリガンドを有するラベル付ＣｏＡ誘導体の使用により、本発明を、リガンドおよびタンパク質などのリガンドの結合相手を、特異的に融合タンパク質へ結合させるために用いることができることになる。もしリガンドがもう１つのタンパク質Ｙに結合し、タンパク質Ｙがラベルされた融合タンパク質と二量体を形成することが生物学的機能または測定可能な信号を生起させるならば、生物学的機能または測定可能な信号はラベルされたＡＣＰ融合タンパク質の添加に依存する。もしＡＣＰが細胞表面に表示されているタンパク質に連結されているならば、リガンドとの相互作用が、リガンドによって修飾される他の分子（これにはリガンドによって修飾される、個々の生体分子または他の細胞、組織、および無傷の生物の一部としての生体分子、が含まれる）との接触を媒介する。
【００５１】
ホスホパンテテイニル部分が担体の表面に共有結合的に結合している場合には、またはラベルが非共有結合的にそれ自身表面に結合している別の分子により結合され得る分子である場合には、ラベルされたＣｏＡ誘導体の使用によって、本発明を、固体支持体上にタンパク質配列（アレー）を構築するために使用することが可能になる。後者の手法の例は、ラベルがビオチンで、表面に結合している分子がストレプトアビジンまたはアビジンである。担体の可能な例はガラススライド、マイクロタイタープレートまたは任意の機能化ポリマーである。基質として用いられるＣｏＡ誘導体は担体上にラベルを介して固定化され、そして続くＡＣＰＳが触媒するＡＣＰ融合タンパク質の反応がラベルを融合タンパク質へ転移させ、担体上にそのような融合タンパク質を固定化させる。対応するＣｏＡ誘導体によって前処理された担体上に（様々な）ＡＣＰ融合タンパク質をＡＣＰＳと共に空間的に解像された態様でスポットすることによりタンパク質アレーの作製が可能になる。
【００５２】
他のタンパク質に架橋することができる分子であるラベルにホスホパンテテイニル部分が共有結合的に結合している場合には、ラベルされたＣｏＡ誘導体の使用によって、本発明を、適当な環境における目的のタンパク質の相互作用を研究するために使用することが可能になる。そのような架橋リンカーの例は、マレイミド、活性エステルもしくはアジド、および熟練当業者に知られた他の分子、例えばNadeau et al.,2002に記載の分子などの官能基を含む分子である。そのようなラベルされたＣｏＡ誘導体をＡＣＰＳの存在下で他のタンパク質と（生体内または生体外で）相互作用するＡＣＰ融合タンパク質と接触させることによって、ＡＣＰ融合タンパク質をそれが相互作用するタンパク質にラベルを介して共有結合的に架橋することができる。これによって、ＡＣＰ融合タンパク質と相互作用するタンパク質の同定が可能になる。
【００５３】
ホスホパンテテイニル部分がＡＣＰと膜レセプターから成るＡＣＰ融合タンパク質へ転移されることが可能なリガンドを所持している場合の、ラベルされたＣｏＡ誘導体の使用は、ラベルされたレセプターの検出を可能にする。この細胞表面レセプターのラベリングはレセプターの内部移行の観察を可能にする。ある特別の応用はリガンド結合後の、例えば薬剤、新薬、または新薬候補によるレセプタータンパク質の内部移行の研究である。レセプターの内部移行は様々な方法により、例えば細胞膜から細胞内部へのラベルの移動を顕微鏡で検出することによって、またはラベルの蛍光の特徴が細胞内環境へ移動して変化することによって、検出できる。そのような変化はまた顕微鏡用具無しで検出することもできて、細胞外液に消光剤を加えることにより容易になる可能性がある。
【００５４】
ホスホパンテテイニル部分が電子顕微鏡によって直接検出できるリガンド例えば電子密度の高いナノ粒子、を有するＣｏＡ誘導体の使用。ホスホパンテテイニル部分の電子顕微鏡による検出への別の応用は、例えばジアニシジンなどの芳香族アミンに光照射して酸化させ、高電子密度の沈殿を生じさせそれを次に電子顕微鏡で検出するためのエオシンなどの、光増感剤として使用されるラベルに基づいている。
【００５５】
例として、本発明の実施態様を、添付した図を参照してここでより詳しく記載することにする。
【実施例】
【００５６】
次の実施例および実験的手順は、当業者に本発明の完全な開示および実施方法の記載を提供するために記載するものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【００５７】
ＣｏＡ−Ｂｔの合成
１００μlのＤＭＦ中のビオチン-マレイミド（１mg、０．００２２mmol）溶液に、９０μl ＤＭＦおよび１０μlの５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５中の補酵素Ａ二ナトリウム塩（１．７９mg、０．００２２mmol、１当量）溶液を加える。混合物を４時間室温で攪拌する。それを次にＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ １：４で希釈し、小分けした５００μlを調製用ＨＰＬＣカラムに注入する：勾配（Ａ＝Ｈ2Ｏ ９９％、ＣＨ3ＣＮ １％、５０ｍM ＮＨ4ＯＡｃ／Ｂ＝ＣＨ3ＣＮ）Ａ／Ｂ９５：５からＡ／Ｂ８０：２０までを２分間、Ａ／Ｂ６８：３２までを７分間、Ａ／Ｂ ２０：８０までを２分間行い、その後Ａ／Ｂ ９５：５に戻す。ＣｏＡ−ビオチンの滞留時間は６．５分である。所望の生産物を含む分画を真空で濃縮し、ＤＭＳＯに溶解し、そして純度を制御するために分析量を注入する。精製した分画を合わせる。ＣｏＡ−ビオチンの濃度を２６０nmの吸収（ε（アデニン、２６０nm）＝１５，３００［Ｍ-1cm-1］）で決定する。ＣｏＡ−Ｂｔの収量は０．８９５mg（３３％）である。
ＥＳＩ−ＭＳ（m／z）計算値１２１７．２９６［M（−1）］、測定値１２１７．２６５７［M（−1）］。
【００５８】
【化４】
【００５９】
ＣｏＡ−Ｄｇの合成
５０μl ＤＭＦ中のＮ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド２（１mg、０．００４４mmol）溶液に、ＤＭＦ／緩衝液混合液（７０μｌ ＤＭＦ／３０μｌ ５０mM Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５）中の補酵素Ａ二ナトリウム塩（３．６mg、０．００４４mmol、１当量）溶液を加える。反応を分析用ＨＰＬＣによって追跡し（２６０nmで検出）反応の終了を証明する。続いて、５０μl ＤＭＦおよび１０μl Ｅｔ3Ｎに溶解した３−アミノ−３−デオキシジゴキシゲニン ヘミスクシンアミド スクシンイミジル エステル（２．６mg、０．００４４mmol、１当量）溶液を加え、反応混合液を４時間室温で攪拌する。反応物を調製用ＨＰＬＣに掛け、望みの生成物を含む分画を真空で濃縮し、ＤＭＳＯに溶解し、そして純度を分析用ＨＰＬＣによって分析する。精製した生成物を含む分画を合わせる。
ＣｏＡ−Ｄｇの濃度をアデニンの吸光係数（ε（アデニン、２６０nm）＝１５，３００［Ｍ-1cm-1］）を使って決定する。ＣｏＡ−Ｄｇの収量は２．３７mg（３７％）である。
ＥＳＩ−ＭＳ（m／z）計算値１４６２．３７０７［M（−1）］、測定値１４６２．４８１M（−1）］。
【００６０】
【化５】
【００６１】
ＣｏＡ−Ｃｙ３の合成
１００μl ＤＭＦ中のＣｙ３−マレイミド３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、１mg、０．００１２６mmol）溶液に、９０μl ＤＭＦおよび１０μl ５０mM Ｔｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．５中の補酵素Ａ二ナトリウム塩（１．０５mg、０．００１２６mmol、１当量）溶液を加える。混合液を４時間室温で攪拌する。それを次にＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ １：４で希釈し、小分けした５００μlを調製用ＨＰＬＣカラムに注入する。勾配、Ａ／Ｂ９５：５からＡ／Ｂ９０：１０までを２分間、Ａ／Ｂ ６５：３５までを１５分間、Ａ／Ｂ２０：８０までを２分間行い、その後Ａ／Ｂ ９５：５に戻す（ＡおよびＢについては先の実施例参照）。ＣｏＡ−Ｃｙ３の滞留時間は１０分である。所望の生産物を含む分画を真空で濃縮し、ＤＭＳＯに溶解し、そして純度を制御するために分析量を注入する。精製した分画を合併する。ＣｏＡ−Ｃｙ３の濃度を５４９nmの吸収（ε（５４９nm）＝１５０，０００［M-1cm-1］）で決定する。ＣｏＡ−Ｃｙ３の収量は０．８４７mg（４４％）である。
ＥＳＩ−ＭＳ（m／z）計算値１５１９．３７０［M（-1）］、測定値１５１９．３０７１［M（-1）］。
【００６２】
【化６】
【００６３】
ＣｏＡ−Ｃｙ５の合成
Ｃｙ５−マレイミド４（１mg、０．００１２２mmol）から出発するＣｏＡ−Ｃｙ５の合成をＣｏＡ−Ｃｙ３について記述したのと同様に行う。ＣｏＡ−Ｃｙ５の濃度をＣｙ５の吸光係数（ε（６４６nm）＝２５０，０００［Ｍ-1cm-1］）を用いて決定する。ＣｏＡ−Ｃｙ５の収量は０．８２８mg（４４％）である。
ＥＳＩ−ＭＳ（m／z）計算値１５４５．３８６［M（-1）］および７７２．１８９［M（-2）］、測定値７７１．６５２４［M（-2）］。
【００６４】
【化７】
【００６５】
６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳのクローニング、発現、および精製
ＸＬ１−ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉのＡＣＰＳ遺伝子を単一コロニーＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ−１５ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にＮｄｅｌ制限部位（下線）付きの順方向プライマー５’−ＴＣＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＴＡ ＴＴＡ ＧＧＴ ＴＴＡ ＧＧＣ ＡＣＧ Ｇ−３’およびＸｈｏｌ制限部位（下線）付きの逆方向プライマー５’−ＴＣＡ ＡＧＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＴＡ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡＣ ＣＧＴ ＧＧＣ Ａ−３’を用いてクローニングする。Ｅ．ｃｏｌｉのＡＣＰＳのＮ−末端に融合されたペプチドの配列（プラスミドｐＥＴ−１５ｂ起源）は（１文字コードで）ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨであり、これにＡＣＰＳの最初のアミノ酸、メチオニン、が続く。この融合タンパク質を６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳと呼ぶ。
【００６６】
６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳをコードするｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づく発現ベクターを含むＢＬ２１ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の液体培養を吸光度ＯＤ600nm０．６となるまで成長させる。６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳの発現を最終濃度１mMとなるようにＩＰＴＧを加えて誘導する。３．５時間２２０rpm、２４℃でインキュベーションした後、培養物を１０分間３０００ｇ ４℃で遠心する。沈殿を１０mlの抽出緩衝液（１５０mM ＮａＣｌ、５mMイミダゾール、５０mM ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０）に再懸濁し、ＰＭＳＦとアプロチミンをそれぞれ最終濃度１mMおよび２μg／mlとなるように加える。リゾチームを１mg／mlとなるように加え、混合物を氷上で１５分間インキュベーションしまた何度か反転させる。次に、それを１０分間超音波で破壊する（９５％出力、５０％動作）。ＤＮＡ分解酵素Ｉを最終濃度０．０１mg／mlとなるよう加える。４℃で３０分後、混合液を１０分間１８，０００rpmで遠心する。
【００６７】
タンパク質を精製するために、予め抽出緩衝液で３回洗浄しておいた３５０μlのＮｉ−ＮＴＡを溶解物に加える。混合物を２０分間氷上でインキュベーションし数度混ぜ合わせた。抽出混合物を次にプロピレンカラムに加え、流出に任せた。カラムを５×４００μlのＤＮＡ溶出緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ Ｃｌ、ｐＨ８．５）で洗い、次に２×５ml洗浄緩衝液（３００mM ＮａＣｌ、１０mMイミダゾール、５０mM ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．５）で洗浄する。タンパク質を流出させるために、溶出緩衝液（３００mM ＮａＣｌ、１５０mMイミダゾール、ｐＨ７．５）をカラムに加え、１０分間インキュベーションし、次に流出液を集める。溶出は、１５０μl溶出緩衝液で段階的に続け、これ以上タンパク質がブラッドフォード（Bradford）分析で検出できなくなるまで行う。最後に合わせた溶出液を透析緩衝液（５０mM ＨＥＰＥＳ、３０％グリセロール、ｐＨ７．２）中で終夜透析し、残存する塩を除く。精製した６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳ（ＭＷ１６．２１５kDa）を小分けにして−８０℃で保存した。濃度をブラッドフォード分析で３７．６μＭと決定する。収量はＢＬ２１Ｅ．ｃｏｌｉ細胞培養１リットル当たり０．９１２mg。
【００６８】
６×Ｈｉｓ−ＡＣＰのクローニング、発現、および精製
ＸＬ１−ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉのＡＣＰ遺伝子を、Ｎｄｅｌ制限部位（下線）付きの順方向プライマー５’−ＧＴ ＣＧＧ ＴＡＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＣＴ ＡＴＣ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＧ−３’、およびＢａｍＨＩ制限部位（下線）付きの逆方向プライマー５’−ＴＣＡ ＴＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＣＧＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ Ｇ−３’、を用いて、単一コロニーＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ−１５ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉのＡＣＰのＮ−末端に融合されたペプチドの配列（６×Ｈｉｓ−ＡＣＰを生成する）は（１文字コードで）ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨであり、これにＡＣＰの最初のアミノ酸、メチオニン、が続く。
【００６９】
６×Ｈｉｓ−ＡＣＰをコードするｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づく発現ベクターを含むＢＬ２１Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の液体培養を吸光度ＯＤ600nm０．６となるまで成長させる。６×Ｈｉｓ−ＡＣＰの発現を最終濃度１mMとなるようにＩＰＴＧを加えて誘導する。３．５時間２２０rpm、３７℃でインキュベーションした後、培養物を１０分間３０００ｇ４℃で遠心する。６×Ｈｉｓ−ＡＣＰの精製のために沈殿を正確に上の実験で記述した通りに操作する。６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ（ＭＷ１０．８０２kDa）の濃度をブラッドフォード分析で１８８μＭと決定する。収量：ＢＬ２１Ｅ．ｃｏｌｉ細胞培養１リットル当たり３．１mg。
【００７０】
アポ-およびホロ-６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ間の比率を決定するために、精製した６×Ｈｉｓ−ＡＣＰをＱ−Ｔｏｆ−Ｕｌｔｉｍａ（Micromass／Waters）を用いたＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓ．モード）により、場合によっては、Ｃａｐ−ＬＣ（Waters）、Ｘｔｅｒｒａ ＲＰ−Ｃ４カラム（Waters,５μm、０．３２×５０mm；流速８μl／min）によるクロマトグラフィーに連結し、ＭａｘＥｎｔ１−ソフトウエアによる逆畳み込みを行って、解析する。混合物のＥＳＩ−ＭＳが、調製品はホロ-およびアポ-ＡＣＰの混合物であることを証明した。最初のメチオニンを除く精製したアポ-６×Ｈｉｓ−ＡＣＰの質量は１０．６７２０kDaであることが分かり（計算値１０．６７１６kDa）、またホロ-６×Ｈｉｓ−ＡＣＰの質量は１１．０１２kDa（計算値１１．０１１９kDa）であることが分かる。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって、ホロ-およびアポ-型に対応するピークの同定と積分が可能になる。ホロ-型の１００分率は１６％（滞留時間１１．７７分）、またアポ-型のそれは８４％（滞留時間１４．１６分）である。
【００７１】
６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａの発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＣＰのＮ−末端に融合されたペプチドの配列は（１文字コードで）ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨであり、これにＡＣＰの最初のアミノ酸、メチオニン、が続き、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＣＰのＣ−末端に融合されたペプチドの配列は（１文字コードで）ＴＳＲＳＹＰＹＤＶＰＤＹＡＲＷ（６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａを生成する）である。
【００７２】
６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａをコードするｐＥＴ−１５ｂに基づく発現ベクターを含むＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の液体培養を吸光度ＯＤ600nm０．６となるまで成長させる。６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａの発現を最終濃度１mMとなるようにＩＰＴＧを加えて誘導する。２２０rpm、２４℃で３時間インキュベーションした後、培養物を３０００ｇ４℃で１０分間遠心する。６×Ｈｉｓ−ＡｃｐＳの精製に対して記述した通りに、６×Ｈｉｓ−ＡＣＰを精製する。６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａ（ＭＷ１２．６５kDa）の濃度をブラッドフォード分析で４００μＭと決定する。またタンパク質の総収量は振とうフラスコ培養１リットル当たり１０mgである。
【００７３】
ＣｏＡ−Ｂｔおよび６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳを用いた６×Ｈｉｓ−ＡＣＰの生体外ビオチン化
精製した６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ（１μM）を反応緩衝液（４３μl、５０mM Ｔｒｉｓ ＣｌｐＨ８．８）中で６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳ（０．２μM）およびＭｇＣｌ2（１０mM）と室温でインキュベートさせる。７．５μlを解析用に分取する。ＣｏＡ−Ｂｔを最終濃度５μMとなるように加える。一定時間ごとに各７．５μlを分取する。分取したものを補酵素Ａ（最終濃度１mM）で３０秒間クエンチし、８．２μlＳＤＳ緩衝液２×を加える。試料を２分間９５℃で加熱する。ビオチン化された６×Ｈｉｓ−ＡＣＰをストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（ＮＥＭ）および化学発光ペルオキシダーゼ基質（Renaissance reagent plus, NEN）を用い、ウエスタン-ブロッティングにより検出する。ウエスタン-ブロットをイメージステーション（Ｋｏｄａｋ４４０）を用いて解析する。対照として、バックグラウンドをチェックし、また反応の特異性をチェックするために、各タンパク質１つのみを含む試料、および２つのタンパク質のただ１つおよびＣｏＡ−Ｂｔを含む試料も調製しビオチン化を上のように分析する。ビオチン化は３つの成分全ての存在に依存する。
【００７４】
ゲルシフトアッセイによる６×Ｈｉｓ−ＡＣＰのビオチン化の定量化
精製した６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ（３μM）を室温でＣｏＡ−Ｂｔ（１０μM）および精製した６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳ（５μM）と最終容積５０μlの反応緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ Ｃｌ、ｐＨ８．８、１０mM ＭｇＣｌ2）中でインキュベートする。３０分インキュベーション後、混合液を終夜ＴＢＳ（（１０mM Ｔｒｉｓ Ｃｌ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．９）に対して透析し、過剰のＣｏＡ−Ｂｔを除く。小分けした反応液を、最終濃度０．６μg／μlのストレプトアビジンと１時間インキュベートする。２％ＳＤＳのみを含む２×ＳＤＳ試料緩衝液を試料に加え、そして試料を加熱せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥを直接行う。タンパク質をクーマシー染色で検出し、またビオチン化の程度を、ビオチン化されておらず、ストレプトアビジンとインキュベートしていない等量の６×Ｈｉｓ−ＡＣＰを含む試料とバンド強度を比較して推定する。
【００７５】
ＣｏＡとＣｏＡ−ラベル間の競合の定量
精製された６×Ｈｉｓ−ＡｃｐＳ（０．４μM）を、室温で、ＣｏＡ−ＢｔまたはＣｏＡ−Ｄｇ（２μM）、種々の量のＣｏＡ（０．２、４、８、１２、２０、４０、８０μM）および精製６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａ（０．４μM）と２０μl反応緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ７．５、１０mM ＭｇＣｌ2）中でインキュベートする。２５分後、各試料を２０μlの２×ＳＤＳ試料緩衝液を加えてクエンチし、９５℃２分間加熱した。ラベルされた６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ−ｈａを、ストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（１：１２５００希釈）または抗−ジゴキシゲニン抗体−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（１：５００希釈）および化学発光ペルオキシダーゼ基質を用い、ウエスタン-ブロッティングにより検出する。各実験に対して、０μM ＣｏＡの信号強度を任意に１に設定する。
【００７６】
酵母細胞表面上へのＡｇａ２−ＡＣＰのラベリング
酵母ゲノムＤＮＡ由来のＡＧＡ２配列を増幅し、ＰＣＲ断片の両端に導入したＥｃｏＲＩおよびＳａｌｌ制限部位を利用して、酵母発現ベクターｐＲＳ３１４のＰcup1−プロモーター配列の後へ挿入する。ＡＣＰ配列のＰＣＲ増幅によって導入したＳａｌｌおよびＡｃｃ６５１制限部位を用いて、ＡＣＰをＡＧＡ２のうしろのフレームへクローニングする。ＡＣＰはＨＡ−エピトープをコードする配列により延長される。Ａｇａ２ｐおよびＡＣＰを連結する配列は：ＦＶＤＥＭＬＹＦＱＧＭである。Ａｇａ２ｐの最後の残基とＡＣＰの最初の残基とに下線を付す。ＨＡ−エピトープを含むＡＣＰのＣ−末端配列は：ＱＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧである。ＡＣＰの最後の残基に下線を付す。ＰGAL1−プロモーター由来のＡｇａ１ｐとＰCUP1−プロモーター由来のＡｇａ２−ＡＣＰとを発現する酵母系統ＥＢＹ１００（ＭＡＴａ ｕｒａ３−５２ ｔｒｉｐ１ ｌｅｕ２Δ１ ｈｉｓ３Δ２００ ｐｅｐ４::ＨＩＳ３ ｃａｎ１ ＧＡＬ ｐＩＵ２１１:ＵＲＡ３）（Invitrogen, Carlsbad, CA）を、２％ガラクトースおよび０．１mM銅を含む選択培地１０ml中で、細胞が１．４ＯＤ600単位のＯＤ600になるまで生育したものを、２mlの水で洗い、０．２mlのラベリング緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ Ｃｌ ｐＨ８．８、１００mM ＮａＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ2）に再懸濁する。ＣｏＡ基質および６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳをそれぞれ最終濃度１０および１μM加える。室温で３０分後、反応液を２mlＰＢＳに希釈することによりラベリングを止める。細胞を２mlＰＢＳで４回洗い、直接蛍光顕微鏡検査に付すか、または、２０nM Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５ストレプトアビジン結合体（Milan Analytic AG, Switzerland）を含む０．２mlのＱｄｏｔ（登録商標）インキュベーション緩衝液中で２０分間インキュベート後細胞を２mlＰＢＳで４回洗浄して蛍光顕微鏡検査に付す。細胞を、６３×油浸（開口数１．４）対物レンズを用いて、ツアイスＡｘｉｏｖｅｒｔ１３５蛍光顕微鏡（Carl Zeiss, Gottingen, Germany）で検査する。
【００７７】
ＨＥＫ２９３細胞上に表示されるＡＣＰ−ＮＫ１融合タンパク質のラベリング
ＡＣＰ−ＮＫ１の一時的発現のために、５−ＨＴ3−レセプターの信号配列（Ｓｉｇ5HT3）を短いＤＹＶリンカーを介してＡＣＰのＮ−末端に融合し、ＮＫ１を短いＴＳリンカーを介してＡＣＰのＣ−末端に融合する。その結果の構成において、ＦＬＡＧタグおよび６×ＨｉｓタグもまたＮＫ１のＣ−末端に結合させる。融合タンパク質に対応する遺伝子をｐＣＥＰ４（Invitrogen）ベクターのＮｈｅIおよびＢａｍＨＩ部位に挿入する。ＨＥＫ２９３細胞を２．２％ウシ胎児血清（GIBCO, BRL）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbeccoの修正Ｅａｇｌｅ培地; GIBCO BRL）中で生育させる。一時的トランスフェクションを記載（Nat Biotechnol 21,86-89 （2003））通りに行い、ＨＥＫ２９３細胞を、ＡＣＰ−ＮＫ１を発現するベクターと核を標的とするＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ−ＮＬＳ3）を発現するベクターにより共トランスフェクションする。２４時間後、細胞を１０分間室温で、ＭｇＣｌ2（１０mM）、６×Ｈｉｓ−ＡｃｐＳ（１μM）、およびＣｏＡ−Ｃｙ３、ＣｏＡ−Ｃｙ５、またはＣｏＡ−Ｂｔ（各５μM）のいずれかを含むＰＢＳ緩衝液５００μlとインキュベートする。細胞を次に過剰の基質を除くためにＰＢＳで３回洗浄し、Ｃｙ３またはＣｙ５でラベルする場合は直接にレーザー走査共焦点蛍光顕微鏡によって分析する。ビオチン化された細胞を、ＰＢＳ中１μg／ml濃度のＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ（登録商標）Ｃｙ５−ラベルしたストレプトアビジン（Amersham Biosciences）とインキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄する。レーザー走査共焦点蛍光顕微鏡像を、６３×水浸（開口数１．２）対物レンズ付きのＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０顕微鏡（Carl Zeiss AG, Gottingen, Germany）の４８８nmアルゴン／クロプトンレーザー線、５４３nm ＨｅＮＥレーザー線、または６３３nm ＨｅＮＥレーザー線を用いて記録する。走査速度およびレーザー強度を蛍光プローブの光退色および細胞の損傷または形態学的変化を回避するように調整する。蛍光を、ＧＦＰに敏感なチャネルおよびそれぞれの色素に敏感なチャネルで解析する。試験した各細胞試料に対して、ＧＦＰチャネルにおいて明確な核ラベリングが観察され、また細胞膜領域において明確な膜ラベリングが、ＣｏＡ−Ｃｙ３ラベル後、ＣｏＡ−Ｃｙ５ラベル後、およびＣｏＡ−Ｂｔラベル後であって、かつそれに続くストレプトアビジン-Ｃｙ５染色後に観察される。膜染色はトランスフェクションされない細胞では観察されず、ＧＦＰは核内発現されないことを示しており、これはそれぞれＣｙ３、Ｃｙ５、およびビオチンによるＡＣＰ−ＮＫ１の特異的ラベリングを示している。一時的にＨＥＫ２９３細胞に発現されたＡＣＰ−ＮＫ１レセプターをさらなる実験で、ＣｏＡ−Ｃｙ５およびテトラメチルローダミンでラベルされたサブスタンスＰ（ＳＰ−ｒｈｏ）、即ちＮＫ１の自然のリガンド、で共染色する。両物質はもっぱら膜領域を染色し、同一の染色領域となる。過剰のサブスタンスＰによって１分以内にＳＰ−ｒｈｏ染色が元に戻ることが、さらにラベリングの特異性とまたＡＣＰ−ＮＫ１のリガンド結合機能性をも証明する。
【００７８】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】（Ａ）６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ（１μM）、６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳ（０．２μM）およびＣｏＡ−Ｂｔ（５μM）の反応の解析：指定した時間（ｔ）に一定量を反応混合液から分取し、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ結合体を用いるウエスタンブロットにより６×Ｈｉｓ−ＡＣＰのビオチン化を精査する。（Ｂ）６×Ｈｉｓ−ＡＣＰのビオチン化の定量化：６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ（３μM）、６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳ（５μM）およびＣｏＡ−Ｂｔ（１０μM）を３０分間インキュベートし、透析し、分取した試料をストレプトアビジンとインキュベートしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに付す（第２列）。安定なビオチン-ストレプトアビジン複合体の形成がビオチン化タンパク質のゲルシフトをもたらす。ビオチン化の量を、第２列の６×Ｈｉｓ−ＡＣＰのバンド強度を、等濃度の６×Ｈｉｓ−ＡＣＰを含むがストレプトアビジンの無い試料（第１列）のバンド強度と比較して評価する。（Ｃ）ＣｏＡとＣｏＡ−Ｂｔ間のまたはＣｏＡとＣｏＡ−Ｄｇ間の、ＡＣＰＳの基質としての競合の定量：６×Ｈｉｓ−ＡＣＰ（０．４μM）、６×Ｈｉｓ−ＡＣＰＳ（０．４μM）、ＣｏＡ−ＢｔまたはＣｏＡ−Ｄｇ（２μM）、および種々の濃度のＣｏＡ（０〜８０μM）を３０分間インキュベートし、ラベリングの程度をウエスタンブロットにより決定する。ウエスタンブロットの相対信号強度（Ｉ）を［ＣｏＡ］／［ＣｏＡ-Ｌ］（Ｌ＝ラベル）に対してプロットし、等式Ｉ＝Ａ／（１＋ＢＸ）にフィットさせる。ここで、Ｘは［ＣｏＡ］／［ＣｏＡ-Ｌ］、Ａは特定しない定数、Ｂは比（ｋcat／ＫＭ）CoA／（ｋcat／ＫＭ）CoA-Lである。これらの実験より、特異性定数の比が（ｋcat／ＫＭ）CoA／（ｋcat／ＫＭ）CoA-Btに対して０．４８、（ｋcat／ＫＭ）CoA／（ｋcat／ＫＭ）CoA-Dgに対して０．３５という結果となり、フリーのＣｏＡと誘導体化されたＣｏＡの間で重大な区別は無いことを明らかにする。
【図２】（Ａ〜Ｆ）酵母の細胞表面上のＡＣＰ融合タンパク質のラベリング。Ｃｙ３（Ａ）またはストレプトアビジンでコートされた量子ドットにより追跡したビオチン（Ｄ）によってラベルされたＡｇａ２−ＡＣＰを発現した酵母細胞の蛍光顕微鏡写真。（Ｂ）は（Ａ）と、（Ｄ）は（Ｅ）と同じであるが、但しＡＧＡ２−ＡＣＰを発現していない細胞である。（Ｃ）および（Ｆ）はそれぞれ（Ｂ）および（Ｄ）と同一の試料の透過顕微鏡写真である。これらの実験は、Ａｇａ２ｐ−ＡＣＰを発現している酵母細胞のみがラベルされることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質を検出し、および／または操作するための方法であって、目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）またはその断片を含む融合タンパク質を、ラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質およびホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）もしくはその相同物と接触させ、その結果ＡＣＰＳがラベルを融合タンパク質へ転移させること、ならびにそのラベルを検出しおよび／または操作するために設計されたシステムにおいてそのラベルを用いて、得られたそのラベルされた融合タンパク質を検出しおよび／またはさらに操作すること、を含む方法。
【請求項２】
得られたラベルされた融合タンパク質を、生体外もしくは生体内でラベルを連続的にモニターするために設計されたシステムにおいて連続的にモニターすることができる、請求項１記載の、目的のタンパク質を検出するための方法。
【請求項３】
請求項２記載の、生体外で目的のタンパク質を検出するための方法。
【請求項４】
請求項２記載の、生体内の細胞中の目的のタンパク質を検出するための方法。
【請求項５】
ラベルされた融合タンパク質を、ラベルを精製するために設計されたシステム中で精製し、およびさらなる工程において目的のタンパク質をラベルされた融合タンパク質から切断する、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項６】
ラベルされた融合タンパク質を、ラベルを固定するために設計されたシステム中で固体支持体に固定する、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項７】
ＡＣＰＳがＥ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰＳである、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項８】
ＡＣＰＳ相同物が、ＥｎｔＤ、Ｓｆｐ、Ｐｓｆ−１、Ｇｓｐ、ＬＹＳ５、Ｂｌｉ、Ｌｐａ−１４、およびノシヘプチド生合成に関与するＮｓｈＣから成る群より選択される、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。本発明はラベリングスキームにおけるＥ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰＳと相同的な、全てのＡＣＰＳの使用を含む。
【請求項９】
ＡＣＰがＥ．ｃｏｌｉのアシル担体タンパク質である、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項１０】
ＡＣＰがStreptomyces種由来である、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項１１】
ＡＣＰが野生型ＡＣＰの変異体であって、１個以上のアミノ酸置換、欠失または付加により野生型ＡＣＰと異なるが、ＡＣＰＳにより触媒される反応において、ラベルされた４’−ホスホパンテテインに対するアクセプターとして働く性質を依然として保持している、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項１２】
ＡＣＰが、ホスホパンテテイン誘導体と結合するセリン残基を含むＡＣＰ断片であって、かつそのようなホスホパンテテイン誘導体を受容する機能を保持している、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項１３】
目的のタンパク質が１２〜５０００個のアミノ酸から成ることを特徴とする、目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）またはその断片を含む融合タンパク質。
【請求項１４】
目的のタンパク質が５０〜１０００個のアミノ酸から成ることを特徴とする、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
目的のタンパク質が、酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核レセプタータンパク質、核局在信号タンパク質、タンパク質補助因子、抗体、膜ポンプタンパク質、膜チャネルタンパク質、膜担体タンパク質、運動タンパク質、シグナル伝達に関与するタンパク質、核タンパク質、リボソームタンパク質、小単量体ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、タンパク質を特定の細胞内区画へ向かわせる原因である配列を有するタンパク質、一般にラベルとしてまたは親和性タグとして用いられるタンパク質、およびそのようなタンパク質のドメインもしくはサブドメインから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
目的のタンパク質が、ヒト、他の高等哺乳動物、真核生物種、バクテリア種、またはウイルス源に由来することを特徴とする、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
目的のタンパク質が、サルモネラ、ミコバクテリア、ブドウ球菌、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトインフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、またはコロナウイルスに由来することを特徴とする、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
目的のタンパク質が、ガン、心臓血管病、精神障害、アルツハイマー、肥満、ウイルス感染、またはバクテリア感染において役割を果たすことを特徴とする、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
適当な条件下において酵素切断を受けやすいリンカーを通じて連結されているＡＣＰおよび目的のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
ＡＣＰおよびニューロキニン−１レセプターを含む請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１記載の方法における請求項１３記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２２】
式（Ｉ）または（II）：
【化１】
（式中、Ｒは補酵素Ａとラベルを架橋するリンカー基であり；「ラベル」は、ラベルを検出し、および／または操作するために設計されたシステムにおいて融合タンパク質の検出および／または操作に適したラベル分子である）
のラベルされたＣｏＡ型基質。
【請求項２３】
請求項２２記載のラベルされたＣｏＡ型基質であって、Ｒは、１〜３００個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキレン基であり、場合によっては
（ａ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられており；
（ｂ）１個以上の炭素原子が水素原子を持つ窒素原子により置き換えられ、また隣接する炭素原子がオキソにより置き換えられて、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を表し；
（ｃ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられ、また隣接する炭素原子がオキソにより置き換えられて、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
（ｄ）２個の隣接する炭素原子間の結合が２重または３重結合であって、官能基−ＣＨ=ＣＨ−または−Ｃ≡Ｃ−を表し；
（ｅ）１個以上の炭素原子がフェニレン、飽和または不飽和シクロアルキレン、飽和または不飽和ビシクロアルキレン、架橋ヘテロ芳香族または架橋飽和または不飽和ヘテロシクリル基により置き換えられており；
（ｆ）２個の隣接する炭素原子がジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−により置き換えられており；または、場合によっては置換基を含む、２個以上の、特に２個の、アルキレン基および／または上の（ａ）〜（ｆ）で定義された修飾されたアルキレン基の組み合わせである、請求項２２記載のラベルされたＣｏＡ型基質。
【請求項２４】
請求項２２記載のラベルされたＣｏＡ型基質であって、「ラベル」が次：
（１）分光学的プローブ；
（２）放射性ラベルされた分子；
（３）相手と特異的に結合できる特異的な結合対の一方である分子。
（４）他の生体分子と相互作用すると想定される分子；
（５）他の生体分子と相互作用すると想定される分子のライブラリー；
（６）他の生体分子と架橋できる分子；
（７）Ｈ2Ｏ2とアスコルビン酸に曝露されるとヒドロキシルラジカルを生成できる分子；
（８）光照射により反応性ラジカルを生成できる分子；
（９）固形支持体に共有結合した分子；
（１０）相補的な鎖と塩基対を形成できる核酸またはその誘導体；
（１１）リピッドまたは膜に挿入される性質を有する他の疎水性分子；
（１２）望ましい酵素学的、化学的、または物理的性質を有する生体分子；および
（１３）（１）〜（１２）の性質の任意の組み合わせを有する分子、
からなる群より選択される、請求項２２記載のラベルされたＣｏＡ型基質。
【請求項２５】
「ラベル」がビオチン、ジゴキシゲニン、Ｃｙ−３、およびＣｙ−５から選択される、請求項２２記載のラベルされたＣｏＡ型基質。
【請求項２６】
請求項１記載の方法における請求項２２記載のラベルされたＣｏＡ型基質の使用。
【請求項１】
目的のタンパク質を検出し、および／または操作するための方法であって、目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）またはその断片を含む融合タンパク質を、ラベルされた補酵素Ａ（ＣｏＡ）型基質およびホロ-アシル担体タンパク質合成酵素（ＡＣＰＳ）もしくはその相同物と接触させ、その結果ＡＣＰＳがラベルを融合タンパク質へ転移させること、ならびにそのラベルを検出しおよび／または操作するために設計されたシステムにおいてそのラベルを用いて、得られたそのラベルされた融合タンパク質を検出しおよび／またはさらに操作すること、を含む方法。
【請求項２】
得られたラベルされた融合タンパク質を、生体外もしくは生体内でラベルを連続的にモニターするために設計されたシステムにおいて連続的にモニターすることができる、請求項１記載の、目的のタンパク質を検出するための方法。
【請求項３】
請求項２記載の、生体外で目的のタンパク質を検出するための方法。
【請求項４】
請求項２記載の、生体内の細胞中の目的のタンパク質を検出するための方法。
【請求項５】
ラベルされた融合タンパク質を、ラベルを精製するために設計されたシステム中で精製し、およびさらなる工程において目的のタンパク質をラベルされた融合タンパク質から切断する、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項６】
ラベルされた融合タンパク質を、ラベルを固定するために設計されたシステム中で固体支持体に固定する、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項７】
ＡＣＰＳがＥ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰＳである、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項８】
ＡＣＰＳ相同物が、ＥｎｔＤ、Ｓｆｐ、Ｐｓｆ−１、Ｇｓｐ、ＬＹＳ５、Ｂｌｉ、Ｌｐａ−１４、およびノシヘプチド生合成に関与するＮｓｈＣから成る群より選択される、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。本発明はラベリングスキームにおけるＥ．ｃｏｌｉ由来のＡＣＰＳと相同的な、全てのＡＣＰＳの使用を含む。
【請求項９】
ＡＣＰがＥ．ｃｏｌｉのアシル担体タンパク質である、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項１０】
ＡＣＰがStreptomyces種由来である、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項１１】
ＡＣＰが野生型ＡＣＰの変異体であって、１個以上のアミノ酸置換、欠失または付加により野生型ＡＣＰと異なるが、ＡＣＰＳにより触媒される反応において、ラベルされた４’−ホスホパンテテインに対するアクセプターとして働く性質を依然として保持している、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項１２】
ＡＣＰが、ホスホパンテテイン誘導体と結合するセリン残基を含むＡＣＰ断片であって、かつそのようなホスホパンテテイン誘導体を受容する機能を保持している、請求項１記載の、目的のタンパク質を操作するための方法。
【請求項１３】
目的のタンパク質が１２〜５０００個のアミノ酸から成ることを特徴とする、目的のタンパク質およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）またはその断片を含む融合タンパク質。
【請求項１４】
目的のタンパク質が５０〜１０００個のアミノ酸から成ることを特徴とする、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
目的のタンパク質が、酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核レセプタータンパク質、核局在信号タンパク質、タンパク質補助因子、抗体、膜ポンプタンパク質、膜チャネルタンパク質、膜担体タンパク質、運動タンパク質、シグナル伝達に関与するタンパク質、核タンパク質、リボソームタンパク質、小単量体ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、タンパク質を特定の細胞内区画へ向かわせる原因である配列を有するタンパク質、一般にラベルとしてまたは親和性タグとして用いられるタンパク質、およびそのようなタンパク質のドメインもしくはサブドメインから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
目的のタンパク質が、ヒト、他の高等哺乳動物、真核生物種、バクテリア種、またはウイルス源に由来することを特徴とする、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
目的のタンパク質が、サルモネラ、ミコバクテリア、ブドウ球菌、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトインフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、またはコロナウイルスに由来することを特徴とする、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
目的のタンパク質が、ガン、心臓血管病、精神障害、アルツハイマー、肥満、ウイルス感染、またはバクテリア感染において役割を果たすことを特徴とする、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
適当な条件下において酵素切断を受けやすいリンカーを通じて連結されているＡＣＰおよび目的のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
ＡＣＰおよびニューロキニン−１レセプターを含む請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１記載の方法における請求項１３記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２２】
式（Ｉ）または（II）：
【化１】
（式中、Ｒは補酵素Ａとラベルを架橋するリンカー基であり；「ラベル」は、ラベルを検出し、および／または操作するために設計されたシステムにおいて融合タンパク質の検出および／または操作に適したラベル分子である）
のラベルされたＣｏＡ型基質。
【請求項２３】
請求項２２記載のラベルされたＣｏＡ型基質であって、Ｒは、１〜３００個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキレン基であり、場合によっては
（ａ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられており；
（ｂ）１個以上の炭素原子が水素原子を持つ窒素原子により置き換えられ、また隣接する炭素原子がオキソにより置き換えられて、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を表し；
（ｃ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられ、また隣接する炭素原子がオキソにより置き換えられて、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
（ｄ）２個の隣接する炭素原子間の結合が２重または３重結合であって、官能基−ＣＨ=ＣＨ−または−Ｃ≡Ｃ−を表し；
（ｅ）１個以上の炭素原子がフェニレン、飽和または不飽和シクロアルキレン、飽和または不飽和ビシクロアルキレン、架橋ヘテロ芳香族または架橋飽和または不飽和ヘテロシクリル基により置き換えられており；
（ｆ）２個の隣接する炭素原子がジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−により置き換えられており；または、場合によっては置換基を含む、２個以上の、特に２個の、アルキレン基および／または上の（ａ）〜（ｆ）で定義された修飾されたアルキレン基の組み合わせである、請求項２２記載のラベルされたＣｏＡ型基質。
【請求項２４】
請求項２２記載のラベルされたＣｏＡ型基質であって、「ラベル」が次：
（１）分光学的プローブ；
（２）放射性ラベルされた分子；
（３）相手と特異的に結合できる特異的な結合対の一方である分子。
（４）他の生体分子と相互作用すると想定される分子；
（５）他の生体分子と相互作用すると想定される分子のライブラリー；
（６）他の生体分子と架橋できる分子；
（７）Ｈ2Ｏ2とアスコルビン酸に曝露されるとヒドロキシルラジカルを生成できる分子；
（８）光照射により反応性ラジカルを生成できる分子；
（９）固形支持体に共有結合した分子；
（１０）相補的な鎖と塩基対を形成できる核酸またはその誘導体；
（１１）リピッドまたは膜に挿入される性質を有する他の疎水性分子；
（１２）望ましい酵素学的、化学的、または物理的性質を有する生体分子；および
（１３）（１）〜（１２）の性質の任意の組み合わせを有する分子、
からなる群より選択される、請求項２２記載のラベルされたＣｏＡ型基質。
【請求項２５】
「ラベル」がビオチン、ジゴキシゲニン、Ｃｙ−３、およびＣｙ−５から選択される、請求項２２記載のラベルされたＣｏＡ型基質。
【請求項２６】
請求項１記載の方法における請求項２２記載のラベルされたＣｏＡ型基質の使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５０９６０８（Ｐ２００７−５０９６０８Ａ）
【公表日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３０６９６（Ｐ２００６−５３０６９６）
【出願日】平成１６年５月１９日（２００４．５．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１７３３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４５８８
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（５０３１８３２９３）ウペエフエル・エコル・ポリテクニック・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ (11)
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＦＬ ＥＣＯＬＥ ＰＯＬＹＴＥＣＨＮＩＱＵＥＦＥＤＥＲＡＬＥ ＤＥ ＬＡＵＳＡＮＮＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月１９日（２００４．５．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１７３３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４５８８
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（５０３１８３２９３）ウペエフエル・エコル・ポリテクニック・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ (11)
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＦＬ ＥＣＯＬＥ ＰＯＬＹＴＥＣＨＮＩＱＵＥＦＥＤＥＲＡＬＥ ＤＥ ＬＡＵＳＡＮＮＥ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]