アスパラギン誘導体およびその用途
【目的】レトロウイルス性疾患の治療剤として有用なレトロウイルスプロテアーゼ阻害物質の提供。
【構成】式（Ｉ）で表わされるアスパラギン誘導体、ならびに該誘導体を含有するレトロウイルス性疾患治療剤。
［環Ａはピロリジン環等の５〜７員環を、Ｒ１，Ｒ２はともに水素原子を示すか、あるいは結合して縮合環を形成してもよい。Ｒ３はエステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基、Ｒ４は水素原子またはアシル基を示し、Ｘは−ＣＨ（ＯＨ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）−を示す。］式（II）の化合物は上記アスパラギン誘導体の代表的な例である。
【構成】式（Ｉ）で表わされるアスパラギン誘導体、ならびに該誘導体を含有するレトロウイルス性疾患治療剤。
［環Ａはピロリジン環等の５〜７員環を、Ｒ１，Ｒ２はともに水素原子を示すか、あるいは結合して縮合環を形成してもよい。Ｒ３はエステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基、Ｒ４は水素原子またはアシル基を示し、Ｘは−ＣＨ（ＯＨ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）−を示す。］式（II）の化合物は上記アスパラギン誘導体の代表的な例である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、レトロウイルスプロテアーゼ阻害活性を有する新規なアスパラギン誘導体およびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】レトロウイルスは、レトロウイルス科に属するウイルスであって、遺伝子としてＲＮＡを持ち、自身の有する逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）の働きによりＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する段階を自己複製の第１段階とするウイルスの総称である。レトロウイルス科は３つの亜科（オンコウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス）からなる。レトロウイルスは、鳥類や哺乳類の種々の動物を宿主として感染、増殖し、肉腫、白血病、癌などを引き起こすもののあることが知られている。ヒトを宿主とするレトロウイルスとしては、成人Ｔ細胞白血病ウイルス（adult Ｔ−cell leukemia virus, ＡＴＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（human Ｔ−cell leukemia virus typeＩ、ＨＴＬＶ−Ｉ）およびヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus, ＨＩＶ）などが報告されているが、ＡＴＬＶは、ＨＴＬＶ−Ｉと同一のウイルスであることが証明された。ＨＴＬＶにはこの他に、Ｔ細胞系のヘアリーセル白血病（hairycell leukemia）を誘導するII型が存在する。ＨＩＶはＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に分類され、ＨＩＶ−１は重篤な免疫不全症である後天性免疫不全症候群（aquired immunodeficiency syndrome, ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであることが分かっている。また、ＨＩＶ−２もＡＩＤＳの原因ウイルスとされているが、ＨＩＶ−１ほどはっきりとは解明されていない。
【０００３】ＡＴＬＶによって引き起こされる成人Ｔ細胞白血病は、日本の南西地域特に九州地方に多く見られる白血病であり、１９７７年にはじめて報告された。成人Ｔ細胞白血病患者では、Ｔ４陽性Ｔ細胞が癌化して、皮膚病変、リンパ節腫大、肝脾腫等を招来する。成人Ｔ細胞白血病に対しては有効な治療法はなく、発病するとほとんどが１年以内に死亡する。
【０００４】ＨＩＶ−１によって引き起こされるＡＩＤＳは、予後不良の免疫不全症として最近注目を集めている疾病であって、カリニ肺炎やカポシ肉腫などの臨床像を特徴とする。ＨＩＶ−１は、Ｔ４陽性細胞に感染して細胞内に侵入、増殖し、これを破壊することにより免疫不全を招来する。現在ＡＩＤＳの治療薬としてアジドチミジン（ＡＺＴ）が使用されており、症状の改善および延命効果が認められている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のように抗レトロウイルス剤としてＡＺＴが使用されているものの、この物質は副作用として骨髄抑制を起こすなどの欠点を有しており、さらに効果が高く副作用の少ない治療薬の出現が期待されている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】レトロウイルスのゲノムにコードされているプロテアーゼは感染性成熟ウイルス粒子の形成に際して重要な役割を果たしており、このプロテアーゼ機能を欠損すると感染性粒子の形成の起こらないことが知られている［I. Katoh ら，ウィロロジー（Virology）第１４５巻，２８０頁（１９８５年）］。
【０００７】したがって、該プロテアーゼの阻害剤はレトロウイルス性疾患の予防および治療薬に成り得るものと考えられ、最近になってペプスタチンＡ［フェブス レターズ（FEBS Lett.），２４７，３４９（１９８９）］、種々の合成ペプチド性誘導体［ネイチャー（Nature），３４３，９０（１９９０）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.），２６５，１４６７５（１９９０）、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）， ３３，１２８５（１９９０）、サイエンス（Science），２４７，４５４（１９９０）および２４８，３５８（１９９０）］や非ペプチド性化合物［サイエンス（Science），２４９，５２７（１９９０）、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、３３，２６８７（１９９０）および３４，１ ２２５（１９９１）］等のプロテアーゼ阻害剤が該治療剤として提案されている。本発明者らの一人、加藤らは広く自然界に該プロテアーゼ阻害物質を検索し、その結果、土壌中から分離した１菌株が該プロテアーゼ阻害物質を産生すること、該菌株が放線菌の中のキタサトスポリア属に属すること、該微生物の培養液から精製取得したペプチド性の新規な化合物たるＲＰＩ−８５６、ＲＰＩ−８５７、ＲＰＩ−８５８、ＲＰＩ−８５９が試験管内で該プロテアーゼを強く阻害することを見出し、すでに特許出願した（特願平２−２８２０２５，特願平３−１４５０および特願平３−１７６０４号明細書参照）。本発明者らは、これらのペプチド性化合物の化学構造に基づいてドラッグデザインを行い、関連化合物の合成研究を鋭意行った結果、以下に示されるアスパラギン誘導体が高い該プロテアーゼ阻害活性を示すことを見出し、さらに研究を進め本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明は、一般式（I）
【化３】
［式中、環Ａは５〜７員環を示し、Ｒ1，Ｒ2はともに水素原子を示すか、または結合して縮合環を形成していてもよく、Ｒ3はエステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基を示し、Ｒ4は水素原子またはアシル基を示し、Ｘは
【化４】
で表わされるアスパラギン誘導体およびその塩、および化合物（I）を含有してなるレトロウイルス性疾患治療剤を提供するものである。
【０００９】化合物（I）に関し、Ｒ1，Ｒ2が結合して縮合環を形成する場合、５〜６員環を形成することが好ましく、なかでもＲ1，Ｒ2が結合してベンゾ縮合、パーヒドロベンゾ縮合もしくはパーヒドロシクロペンタ縮合を示すのが好ましい。この場合、具体的には式
【化５】
などを挙げることができる。
【００１０】化合物（I）に関し、Ｒ1，Ｒ2で表わされる基の好ましい例は、ともに水素原子であるものおよび結合してパーヒドロベンゾ縮合であるものがあげられる。化合物（I）に関し、Ｒ3で表わされるエステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基としては、例えばカルボキシル，カルバモイル，低級アルコキシカルボニル（例、メトキシカルボニル，エトキシカルボニル，プロポキシカルボニル，イソプロポキシカルボニル，ブトキシカルボニル，イソブトキシカルボニル，tert−ブトキシカルボニルなどのＣ1-4アルコキシ−ＣＯ−など），アラルキルオキシカルボニル（例、ベンジルオキシカルボニル，ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル，ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル，フェネチルオキシカルボニルなどの置換されていてもよいフェニル−Ｃ1-4アルコキシ−ＣＯ−など），低級アルキルアミノカルボニル（例、メチルアミノカルボニル，エチルアミノカルボニル，プロピルアミノカルボニル，イソプロピルアミノカルボニル，ブチルアミノカルボニル，イソブチルアミノカルボニル，tert−ブチルアミノカルボニルなどのＮ−Ｃ1-4アルキルアミノなど），アラルキルアミノカルボニル（例、ベンジルアミノカルボニル，フェネチルアミノカルボニルなどのＮ−フェニル−Ｃ1-4アルキルアミノ）などがあげられ、なかでも低級アルコキシカルボニルおよび低級アルキルアミノカルボニルが好ましく、とりわけ、tert−ブトキシカルボニルおよびtert−ブチルアミノカルボニルが好ましい。
【００１１】化合物（I）に関し、Ｒ4で表わされるアシル基としては、例えば低級アルカノイル（例、ホルミル，アセチル，プロピオニル，ブチリル，イソブチリルなどのＣ1-5アルカノイルなど），低級アルコキシカルボニル（例、メトキシカルボニル，エトキシカルボニル，プロポキシカルボニル，イソプロポキシカルボニル，ブトキシカルボニル，イソブトキシカルボニル，tert−ブトキシカルボニルなどのＣ1-4アルコキシ−ＣＯ−など），アラルキルオキシカルボニル（例、ベンジルオキシカルボニル，ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル，ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル，ナフチルメチルオキシカルボニルなどの置換されていてもよいフェニル−Ｃ1-4アルコキシ−ＣＯ−など），アリールカルボニル（例、ベンゾイル，ナフトイル，トルオイルなど），ヘテロアリールカルボニル（例、フロイル，テノイル，ニコチノイル，イソニコチノイル，キノリノイル，イソキノリノイル，キナゾリノイルなど），アリールスルホニル（例、ｐ−トルエンスルホニル，ベンゼンスルホニル，ナフタレンスルホニルなど）などがあげられ、なかでも低級アルコキシカルボニル，アラルキルオキシカルボニル，ヘテロアリールカルボニルが好ましく、とりわけ、tert−ブトキシカルボニル，ベンジルオキシカルボニル，２−キノリノイルが好ましい。
【００１２】化合物（I）に関し、環Ａとしては５〜６員環，とりわけピロリジン環およびピペリジン環が好ましい。本発明化合物に属する好ましい化合物の具体例としては、例えば〔表１〕に示す化合物があげられる。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【化６】
［式中、各記号は前記と同意義。］で表わされる化合物を酸化することによって製造することができる。
【００１５】反応は通常、ジメチルスルホキシド中、ピリジンおよびトリフルオロ酢酸の存在下に行うことが好ましく、反応温度は０〜６０℃程度で行われ、反応時間は１〜２４時間である。
【００１６】本発明化合物（I）は、たとえば式（II）
【化７】
［式中、各記号は前記と同意義。］で表わされる化合物と、式（III）
【化８】
［式中、Ｒ4′はアシル基であり、他の記号は前記と同意義。］で表わされる化合物を縮合させることによって得ることができる。
【００１７】該縮合反応条件としては、たとえば縮合試薬（例、ジシクロヘキシルカルボジイミド，カルボニルジイミダゾール，シアノリン酸ジエチル，ジフェニルリン酸アジド等）などを用いるか、または化合物（III）にたとえば２,４,５−トリクロロフェノール，ペンタクロロフェノール，ペンタフルオロフェノール，２−ニトロフェノールおよび４−ニトロフェノール等のフェノール類、または、たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミド，Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボン酸イミド，１−ヒドロキシベンズトリアゾール，Ｎ−ヒドロキシピペリジン等のＮ−ヒドロキシ化合物をジシクロヘキシルカルボジイミド等の触媒の存在下に縮合させ、化合物（III）を活性なエステル体に変換した後、化合物（II）と反応させることが好ましい。また化合物（III）にたとえば、クロロ炭酸メチル，クロロ炭酸エチル，クロロ炭酸イソブチルなどを、好ましくは有機塩基（例、トリエチルアミン，Ｎ−メチルモルホリン）の存在下に反応させ、混合酸無水物に変換した後、化合物（II）と反応させることもできる。これらの反応において、反応温度は通常約−３０℃〜＋５０℃であり、用いる溶媒としては、たとえばジオキサン，テトラヒドロフラン，アセトニトリル，ジエチルエーテル，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，ジメチルスルホキシド，Ｎ−メチルピロリドン，クロロホルム，塩化メチレンなどが挙げられ、これら溶媒は単独もしくは混合溶媒として用いてもよい。
【００１８】本発明化合物（I）は、たとえば式（IV）
【化９】
［式中、Ｒ4′はアシル基であり、他の記号は前記と同意義。］で表わされる化合物と式（V）
【化１０】
［式中、各記号は前記と同意義。］で表わされる化合物を縮合させることによって製造することができる。該縮合反応条件としては、上述した（II）と（III）の縮合反応において適用される条件と同様な反応条件が好ましい。
【００１９】本発明化合物（I）においてＲ4が水素である化合物は、式（I″）で表わされる化合物を脱保護反応に付すことによって製造することができる。
【化１１】
［式中、Ｒ4″はアミノ保護基を示し、他の記号は前記と同意義。］
また、本発明化合物（I）においてＲ3がカルボキシル基である化合物は、式（I″′）で表わされる化合物を脱保護反応に付すことによって製造することができる。
【化１２】
［式中、Ｒ3′は保護されたカルボキシル基を示し、他の記号は前記と同意義。］。
【００２０】該脱保護反応としては、その保護基の種類あるいは、化合物（I″），（I″′）の脱保護条件下での安定性に応じて、酸あるいは塩基による方法、または接触還元による方法を適宜選択して行うことができる。酸による方法の場合には、保護基の種類その他の条件によって異なるが、酸として例えば塩酸、臭化水素、フッ化水素、沃化水素、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、硫酸、リン酸等の無機酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸等の有機酸の他、酸性イオン交換樹脂等が使用される。塩基による方法の場合には、保護基の種類その他の条件によって異なるが、塩基として例えばナトリウム，カリウム等のアルカリ金属もしくはカルシウム，マグネシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩等の無機塩基、金属アルコキサイド類、有機アミン類、第四アンモニウム塩等の有機塩基の他、塩基性イオン交換樹脂等が使用される。上記酸または塩基による方法の場合において溶媒を使用する場合には、たとえば、水，メタノール，エタノール，酢酸エチル，クロロホルム，テトラヒドロフラン，ジオキサン，ピリジン，酢酸，アセトン，塩化メチレンなどを単一、もしくは混合して用いることができる。また金属と酸による方法においては水，アセトン等が繁用されるが酸が液体のときは酸自身を溶媒として使用することもできる。酸および塩基による方法において反応温度は、通常冷却下ないし加温程度で行なわれ、反応時間は約３０分ないし２０時間である。
【００２１】一方接触還元による方法の場合には、水またはたとえばメタノール，エタノール，ジオキサン，酢酸エチルなどの有機溶媒あるいはそれらの混合溶媒中、たとえばパラジウム−炭素などの適当な触媒の存在下に行われる。本反応は常圧または１５０kg／cm2程度までの圧力下、常温ないし＋１００℃の温度で行われるが、一般に常温，常圧で充分反応は進行する。
【００２２】本発明化合物（I）は分子内に不斉原子を３個以上有しているので８個以上の立体異性体が存在し得るが、その立体異性体ならびにそれらの混合物のいずれも本発明に包含されるものである。とりわけアスパラギン残基中の不斉炭素，ベンジル基とＸが結合した不斉炭素およびＲ3が結合した不斉炭素のいずれもがＳ配置である光学活性体が好ましい。
【００２３】化合物（I）は塩としても得られ、該塩としては、たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩などの無機酸塩、たとえば酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、フマール酸塩、マレイン酸塩、トリエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩などの有機酸塩、たとえばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩などの金属塩、たとえば、トリエチルアミン塩、グアニジン塩、アンモニウム塩、ヒドラジン塩、キニーネ塩、シンコニン塩などの塩基との塩が挙げられる。
【００２４】かくして得られる化合物（I）は反応混合物から通常の分離精製手段、たとえば抽出、濃縮、中和、ろ過、再結晶、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどの手段を用いることによって単離することができる。化合物（I）は少なくとも８個の立体異性体が存在し得る。これら個々の異性体およびこれらの混合物のいずれも本発明に包含されるが、所望によりこれらの異性体を個別に製造することもできる。たとえば原料化合物（I′），（II），（III），（IV）および（V）のそれぞれの単一の異性体を用いて上記の反応を行うことにより、化合物（I）の単一の異性体を得ることができるし、また生成物が二種類以上の異性体混合物の場合には、これを通常の分離方法、たとえば光学活性酸（例、カンファースルホン酸、酒石酸など）との塩を生成させる方法や、各種のクロマトグラフィー、分別再結晶などの分離手段によってそれぞれの異性体に分離することもできる。
【００２５】化合物（Ｉ）の塩は必要に応じ前記した無機酸あるいは有機酸を加えることによって生理学的に許容される塩として得ることができる。本発明における合成中間体（II）において、例えばＲ1，Ｒ2がともに水素原子であり、Ｒ3がtert−ブチルアミノカルボニルであり、環Ａがピロリジン環であり、Ｘが
【化１３】
である化合物（XI）は次の反応式で示す方法で合成することができる。
【００２６】
【化１４】
ここで用いた（IX）はジャーナル・オブ・メディシカル・ケミストリー（J. Med. Chem.）, ２０，５１０（１９７７）に記載された方法で合成することができる。
【００２７】以下参考例および試験例においてＨＩＶ−１プロテアーゼの調製法および該プロテアーゼに対する本発明化合物（I）の阻害作用についてそれぞれ述べる。
参考例１ ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子の発現プラスミドの構築ＨＩＶ−１プロテアーゼはpol遺伝子にコードされた蛋白質の１つであり、感染細胞内においてはgag−polのポリプロテインとして合成されたものが、プロテアーゼ自身の作用によりプロセシングされることにより生成されると考えられている［J. M. Mc Cune ら、セル(Cell)第５３巻，５５頁（１９８８年）］。一方、プロテアーゼ領域を含むpol遺伝子の一部を大腸菌で発現させることにより、分子量１１キロダルトンの活性型ＨＩＶ−１プロテアーゼが自身のオートプロセシング作用により生成されることが既に知られている［M. C. Graves ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第８５巻，２４４９頁（１９８８年）］。
【００２８】そこで、まずＨＩＶ−１の全遺伝子を含有するプラスミドｐＮＬ４−３［A. Adachi ら、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J. Virol.）第５９巻，２８４頁（１９８６年）］からプロテアーゼ領域を含有する１.５kb のＢglII−ＢalI断片を取得した。次に、この断片にリンカー ５’−ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡ−３’ （配列番号：１）
３’−ＧＡＴＡＣＧＧＴＣＴＡＧ−５’ （配列番号：２）
を接続した後、ＥcoＲＩで消化し、さらにリンカー［５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧ−３’］（配列番号：３）を接続した後、ＥcoＲＩで消化した。次に、この断片の切断点をクレノーフラグメントで埋めて平滑末端にした。一方、Ｔ７プロモーターを含む大腸菌用発現ベクターｐＥＴ−３ｃ［A. H. Rosenberg ら、ジーン（Gene）第５６巻，１２５頁（１９８７年）］をＮdeＩで消化し、その切断点をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで埋めて平滑末端にした。次に、これら両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて接続し、Ｔ７プロモーターとプロテアーゼ遺伝子の向きが同方向となったものをｐＨＩＶ７００４とした。
【００２９】参考例２ 組換え型ＨＩＶ−１プロテアーゼの調製Escherichia coli ＭＭ２９４株にＴ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３［F. W. Studier ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）第１８９巻，１１３頁（１９８６年）］を溶原化させてEscherichia coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）を作製した。参考例１で得られたｐＨＩＶ７００４を、Escherichia coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）に導入して、形質転換体Escherichia coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＩＶ７００４を得た。本形質転換体をアンピシリン５０μg／mlを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液０.２mlを２０mlの同じ培地に接種し、３７℃で対数増殖期（１８０−２００ Ｋｌｅｔｔ ｕｎｉｔ）まで培養した。次に、最終濃度が０.４mＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに３７℃で２時間培養した。培養液２００mlから、菌体を５０００rpm で５分間遠心することにより集め、これを〔表２〕に記載した組成を持つ緩衝液Ａ２０mlに懸濁した。懸濁液にニワトリ卵白リゾチーム２mgを加え、氷冷下で１０分間放置後、ノニデットＰ４０（ＮＰ４０）を最終濃度１％になるように加え、超音波破砕装置を用いて菌体を破砕した。上記処理を行った溶菌液を、日立工機社製のＲＲ−２４Ａローターを用いて１６０００rpm で１０分間遠心分離し、ＨＩＶ−１プロテアーゼを含む粗抽出液２０mlを得た。
【００３０】
【表２】 緩衝液Ａの組成５０mＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８.０５mＭ エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）
０.１％ ノニデットＰ４０（ＮＰ４０）
０.０２％ ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）
１０％ グリセリン１mＭ フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）
０.１mＭ パラアミジノフェニルメタンスルフォニルフルオリド（APMSF）
【００３１】試験例１ ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害作用ＨＩＶ−１ gagＰ１７とＰ２４の解裂部位を含む合成ペプチドgag−１１（ＳＱＶＳＱＮＹＰＩＶＱＮＬ）（配列番号：４）を基質とし、反応産物gag−１２（ＳＱＶＳＱＮＹ）（配列番号：５）の生成を指標としてＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害活性を測定した。即ち、基質gag−１１ ３μg、 種々の濃度の試料、ＨＩＶ−１プロテアーゼを含む５％グリセロール−１ＭＮaＣl−０.２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.２）（３０μl）中で３〜５時間反応させた。０.１３Ｍトリクロロ酢酸−０.２６Ｍ酢酸ナトリウム−０.４Ｍ酢酸１５０μlを加えることにより反応を停止した。室温で１０分間放置した後遠心上清を得た。上記の上清のうち４８μlを０.１％トリフロロ酢酸で平衡化したＹＭＣ−パックＦＬ−ＯＤＳカラム（０.４６×３cm、ワイエムシィ社）に負荷し、アセトニトリルの濃度勾配で溶出した。本条件下において、gag−１２の生成量を５０％阻害するために必要な反応液中の試料濃度をＩＣ50値として表わした。化合物（I）のＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害活性を〔表３〕に示した。
【００３２】
【表３】
試 料 ＩＣ50（μＭ）
(化合物番号) ────────────────────────── １ ０.０２０ ２ ０.０３４ ３ ０.０２１ ４ ０.０３１〔表３〕の結果から、本発明化合物（I）は非常に強いＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害物質であることが明らかである。
【００３３】以上のように、化合物（I）はレトロウイルスのプロテアーゼ阻害活性を有しており、また毒性も低いので、レトロウイルス性疾患治療剤として有用な物質である。 本発明化合物（I）を抗レトロウイルス剤として用いる場合、希釈剤、賦形剤、担体などと混合して、薬学的に許容される製剤とし、経口的または非経口的に投与する。例えば、注射剤として用いる場合は、化合物（I）を水溶液剤として、成人１日当り０.１〜１０mg／kgを静脈内投与する。
【００３４】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。
実施例１１−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−プロリン（化合物IV：２３.０ｇ，９２.２mmol）をテトラヒドロフラン（１５０ml）に溶解し、氷冷下にトリエチルアミン（１４.１ml，１０２mmol）を加えた。次に、クロロギ酸イソブチル（１３.２ml，１０２mmol）のテトラヒドロフラン（４３ml）溶液を滴下し、氷冷下で１時間撹拌した後、tert−ブチルアミン（１９.４ml，１８４mmol）を加えた。氷冷下で１時間、さらに室温で一夜撹拌した後、溶媒を留去した。残渣に水，酢酸エチル（各２００ml）を加えて分液し、酢酸エチル層を１０％リン酸ナトリウム水溶液，５％重曹水，飽和食塩水の順で洗浄し、乾燥（ＭgＳＯ4）後、減圧留去した。得られた白色粉末を酢酸エチル−ヘキサン（１：１，４０ml）から再結晶し、１−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物VII：１５.５ｇ，５５％）を白色結晶として得た。さらにろ液を減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel ６０，１００ｇ：酢酸エチル−ヘキサン＝１：１で溶出）で精製すると追加のプロリンアミド体（化合物VII：５.９ｇ，２１.０％）が得られた。
ｍｐ ９０−９１℃元素分析値： Ｃ17Ｈ24Ｎ2Ｏ3としてCalcd：Ｃ，６７.０８； Ｈ，７.９５； Ｎ，９.２０Found：Ｃ，６６.８５； Ｈ，７.９６； Ｎ，９.４５ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：３０５（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(d6-DMSO)δ：1.18(6H,s),1.24(3H,s),1.7-1.95(3H,m),1.95-2.2(1H,m),3.3-3.5(2H,m),4.1-4.2(1H,m),4.9-5.10(2H,m),7.2-7.5(6H,m)
【００３５】実施例２１−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物VII：８.０ｇ，２６.３mmol）をメタノール−水（６：１，１４０ml）に溶解し、１０％パラジウム−炭素（０.５ｇ）を加え、水素気流中、１時間撹拌した。触媒をろ別し、触媒部分を洗浄（１０％メタノール水溶液）し、ろ液と洗液を合わせて減圧留去した。得られた油状物を減圧乾燥すると結晶化した。これにジエチルエーテルと石油エーテルの混液を加えてろ取すると、Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物VIII：３.４ｇ，７５.７％）が無色粉末晶として得られた。
ｍｐ ７９−８０℃元素分析値： Ｃ9Ｈ18Ｎ2ＯとしてCalcd：Ｃ，６３.４９； Ｈ，１０.６６； Ｎ，１６.４５Found：Ｃ，６３.４５； Ｈ，１０.８９； Ｎ，１６.１５1Ｈ−ＮＭＲ(d6-DMSO)δ：1.26(9H,s),1.5-1.7(3H,m),1.8-2.0(1H,m),2.78(2H,ddd,J=6.1,6.5,9.7Hz),3.2-3.4(1H,m),7.57(1H,br s)
【００３６】実施例３（２ＲＳ，３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸（化合物IX：２.０ｇ，６.０７mmol）をジメチルホルムアミド（２０ml）に溶解した。氷冷下にＮ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物VIII：１.２４ｇ，７.２８mmol），シアノリン酸ジエチル（ＤＥＰＣ）（２.０９ｇ，１２.２mmol）のジエチルホルムアミド（５ml）溶液およびトリエチルアミン（１.７６ml，１２.２mmol）を順次加え、氷冷下に１時間、さらに室温に戻して２.５時間撹拌した。反応液に水（約５ml）を加えて１時間撹拌した後、水（８０ml）を加え、酢酸エチル（１５０ml）で抽出した。酢酸エチル層を１０％リン酸ナトリウム水溶液、５％重曹水、飽和食塩水の順で洗浄し、乾燥（Ｍg ＳＯ4）した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （Kieselgel ６０，１４０ｇ：酢酸エチル−ヘキサン＝２：１で溶出）で精製すると１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物X） のジアステレオマーＡ（極性大：０.６９５ｇ）及びジアステレオマーＢ（極性 小：０.４１５ｇ）が無色粉末晶として得られた。
ジアステレオマーＡ白色粉末晶ｍｐ ６３−６６℃元素分析値： Ｃ27Ｈ35Ｎ3Ｏ5・1/2Ｈ2ＯとしてCalcd：Ｃ，６６.１０； Ｈ，７.４０； Ｎ，８.５７Found：Ｃ，６６.４０； Ｈ，７.４３； Ｎ，８.５４ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：４８２（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：1.29(9H,s),1.75-2.4(4H,m),2.6-2.8(2H,m),3.6-4.25(5H,m),4.3-4.65(2H,m),4.99(2H,s),5.43(1H,d,J=8.8Hz),6.49(1H,s),7.1-7.4(10H,m)ジアステレオマーＢ白色粉末晶ｍｐ １１４−１１５℃元素分析値： Ｃ27Ｈ35Ｎ3Ｏ5としてCalcd：Ｃ，６７.３４； Ｈ，７.３３； Ｎ，８.７３Found：Ｃ，６７.５１； Ｈ，７.２９； Ｎ，８.７７ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：４８２（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：1.29(9H,s),1.7-2.3(4H,m),2.95(2H,d,J=7.8Hz),3.0-3.4(2H,m),3.87(1H,d,J=5.6Hz),3.95(1H,d,J=3.6Hz),4.10(1H,d,J=4.6Hz),4.22(1H,m),5.03(2H,s),5.09(1H,br s),6.43(1H,br s),7.2-7.5(10H,m)
【００３７】実施例４１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物X，ジアステレオマーＡ：３００mg，０.６２mmol）をメタノール−水（４：１，８ml）に溶解し、１０％パラジウム−炭素（４０mg）を加え、水素気流下、４時間撹拌した。触媒をろ別し、触媒部分を洗浄（５０％メタノール水溶液）し、ろ液と洗液を合わせて減圧留去した。残渣にジエチルエーテルを加えて、析出した結晶をろ取すると１−［（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物XI：２１０mg）が白色粉末晶として得られた。
ｍｐ １５４.５−１５６.０℃元素分析値： Ｃ19Ｈ29Ｎ3Ｏ3としてCalcd：Ｃ，６５.６８； Ｈ，８.４１； Ｎ，１２.０９Found：Ｃ，６５.３５； Ｈ，８.５５； Ｎ，１２.１３1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：1.29(9H,s),1.4-2.2(2H,br m),1.7-2.4(4H,m),2.53(1H,dd,J=10.0,13.3Hz),2.95(1H,dd,J=3.2,13.4Hz),3.0-3.2(1H,m),3.5-3.7(2H,m),4.27(1H,d,J=5.4Hz),4.45-4.55(1H,m),6.57(1H,s),7.1-7.4(5H,m)
【００３８】実施例５１−［（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物XI：２４０mg，０.６９mmol）をジメチルホルムアミド（８ml）に溶解し、氷冷下にＮアルフア−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギンのｐ−ニトロフェニルエステル（２６７mg，０. ６９mmol）を加え、氷冷下に１時間、さらに室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し た後、残渣に水，酢酸エチル（各３０ml）を加えて分液した。酢酸エチ ル層を１０％リン酸ナトリウム水溶液，５％重曹水，飽和食塩水の順に洗浄し、乾燥（ＭgＳＯ4）した後、減圧留去した。得られた黄色油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel ６０，２０ｇ：酢酸エチル−メタノール＝９：１で溶出）で精製すると１−［（３Ｓ）−３−（Ｎアルフア−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギニル）アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物１：２００mg，４８. ７％）が白色粉 末晶として得られた。
ｍｐ １０２−１０３℃（dec.）
元素分析値： Ｃ31Ｈ41Ｎ5Ｏ7としてCalcd：Ｃ，６２.５１； Ｈ，６.９４； Ｎ，１１.７６Found：Ｃ，６２.２０； Ｈ，７.０６； Ｎ，１１.６６ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：５９６（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(d6-DMSO)δ：１．２５（９Ｈ，ｓ），１．７−２．１（４Ｈ，ｍ），２．２−２．４５（２Ｈ，ｍ），２．５５−２．８（２Ｈ，ｍ），３．５−３．７（２Ｈ，ｍ），４．０−４．２（１Ｈ，ｍ），４．２−４．４（３Ｈ，ｍ），４．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），５．０１（２Ｈ，ｓ），６．８７（１Ｈ，ｓ），７．０５−７．４（５Ｈ，ｍ），７．２２（１Ｈ，ｓ），７．３５（５Ｈ，ｓ），７．５２（１Ｈ，ｓ），７．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）
【００３９】実施例６ベンゼン（１ｍｌ）とジメチルスルホキシド（０.５ml）の混液にジシクロヘキシルカルボジイミド（１０４mg，０.５０４mmol）とピリジン（１４μl，０.１６８mmol）を加え、次いで氷冷下に１−［（３Ｓ）−３−（Ｎアルフア−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギニル）アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物１：１００mg，０. １６８mmol）を加えた。１０分後にトリフルオロ酢酸（６.６μl，０.０ ８４mmol）を加え、室温で一夜撹拌した。反応液に酢酸エチル（２ml）を加え、不溶物 をろ別した。ろ液に酢酸エチル（２５ml）を加え、これを水（３０ml× ３）で洗浄し、乾燥（ＭgＳＯ4）した後、減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel ６０，１５ｇ：酢酸エチル−塩化メチレン−メタノール＝５：５：１で溶出）で精製すると１−［（３Ｓ）−３−（Ｎアルフア−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギニル）アミノ−２−オキソ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物２：２０mg，２０.１ ％）が白色粉末晶として得られた。
ｍｐ ８９−９３℃ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：５９４（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(d6-DMSO)δ：1.21(3H,s),1.24(6H,s),1.65-2.0(4H,m),2.0-2.4(2H,m),2.75-3.1(1H,m),3.1-3.3(1H,m),3.4-3.6(2H,m),4.2-4.5(2H,m),4.5-4.9(1H,m),4.9-5.1(2H,m),6.88(1H,br s),7.1-7.3(5H,m),7.33(5H,s),7.5-7.6(1H,m),8.15-8.6(1H,m)
【００４０】実施例７（２ＲＳ，３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸（化合物IX：２.１６ｇ，６.５５mmol）をジメチルホルムアミド（５ml）に溶解し、氷冷下にＬ−プロリン−tert−ブチルエステル（１.２３ｇ，７.２１mmol）のジメチルホルムアミド（２.５ml）溶液，シアノリン酸ジエチル（１.２３ｇ，７.２１mmol）のジメチルホルムアミド（２.５ml）溶液 およびトリエチルアミン（１.０ml，７.２１mmol）を順次加えた。氷冷下に１時間、さらに室温で一夜撹拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル（８０ml）に溶解し、得られた溶液を冷５％塩酸，５％重曹水，飽和食塩水の順で洗浄し、乾燥（ＭgＳＯ4）した後、減圧留去した。残留物を酢酸エチル−ヘキサン（１：１，１２ml）から結晶化し、１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｌ−プロリン−tert−ブチルエステルのジアステレオマーＢ（極性小）を白色結晶として８００mg（２５.３％）得た。さらにろ液を減圧留去した後、残留物をシリカゲルカラムクロ マトグラフィー（Kieselgel ６０，３０ｇ：酢酸エチル−ヘキサン＝１：２で溶出）で精製すると、追加のジアステレオマーＢ１４０mg（４.４％）とジアステ レオマーＡ（極性大，非結晶性粉末）１.０３ｇ（３２.６％）が得られた。
ジアステレオマーＡｍｐ ５８−６０℃ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：４８３（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：1.43(3H,s),1.45(6H,s),1.6-2.3(4H,m),2.5-3.0(2H,m),3.6-3.9(2H,m),4.15-4.3(1H,m),4.45-4.55(1H,m),4.60(1H,br s),5.00(2H,s),5.0-5.1(1H,m),5.22(1H,d,J=8.4Hz),7.15-7.4(5H,m),7.27(5H,s)ジアステレオマーＢｍｐ １５１.０−１５３.５℃ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：４８３（ＭＨ+）
元素分析値： Ｃ27Ｈ34Ｎ2Ｏ6としてCalcd：Ｃ，６７.２０； Ｈ，７.１０； Ｎ，５.８０Found：Ｃ，６７.１１； Ｈ，７.２５； Ｎ，５.５３1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：1.43(9H,s),1.8-2.1(4H,m),2.94(1H,d,J=2.8Hz),2.98(1H,s),3.05-3.2(1H,m),3.15-3.4(1H,m),3.97(1H,br s),4.1-4.3(3H,m),5.03(2H,d,J=4.0Hz),5.14(1H,d,J=9.8Hz),7.2-7.4(10H,m)
【００４１】実施例８１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｌ−プロリン−tert−ブチルエステルのジアステレオマーＢ（８４０mg，１.７４mmol）をジオキサン（５ml）に溶解し、４Ｎ塩酸−ジオキサン溶液（２ml）を加え、室温で２４時間撹拌した。反応液にジオキサン（５ml）を加えて減圧濃縮を３回くり返した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel ６０，３０ｇ：酢酸エチル−ヘキサン＝２：１で溶出）で精製し、１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｌ−プロリンの非結晶性粉末４１０mg（５５.３％）を得た。
ｍｐ １５５.５−１５６.０℃ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：４２７（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：1.55-1.75(1H,m),1.85-2.1(2H,m),2.25-2.45(1H,m),2.85-3.15(2H,m),3.25-3.5(1H,m),3.55-3.75(1H,m),4.12(1H,dd,J=7.2,8.4Hz),4.5-4.6(1H,m),4.64(1H,d,J=5.2Hz),4.65-4.75(1H,m),5.03(2H,q,J=10.8,32.8Hz),7.27(5H,s),7.15-7.4(6H,m)
【００４２】実施例９１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｌ−プロリン（２７０mg，０.６３mmol）をジメチルホルムアミド（４ml）に溶解し、氷冷下にｎ−ブチルアミン（１８６μl，１.９０mmol），シアノリン酸ジエチル（２４０mg，１.３９mmol）のジメチルホルムアミド（０.５ml）溶液およびトリエチルアミン（１９４μl，１.３９mmol）を順次加え、氷冷下に１時間、さらに室温で一夜撹拌した。反応液に水（５ml）を加え、１時間撹拌した後、さらに水（３０ml）を加え、酢酸エチル（４０ml）で抽出した。酢酸エチル層を１０％リン酸ナトリウム水溶液，５％重曹水，飽和食塩水の順で洗浄し、乾燥（ＭgＳＯ4）した後、減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel ６０，２０ｇ：酢酸エチル−ヘキサン＝２：１で溶出）で精製した後、ヘキサンから結晶化し、１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−ブチル−Ｌ−プロリンアミドの白色粉末晶１５０mg（４９.２％）を得た。
ｍｐ ６６.５−６８.５℃ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：４８２（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：0.90(3H,t,J=6.8Hz),1.2-1.6(4H,m),1.75-2.1(3H,m),2.15-2.3(1H,m),2.8-3.4(6H,m),3.87(1H,br s), 4.0-4.3(3H,m),5.03(2H,s),5.10(1H,d,J=9.4Hz),6.57(1H,br s),7.2-7.4(5H,m),7.33(5H,s)
【００４３】実施例１０２−キノリンカルボン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１.０８ｇ，４.００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（４ｍｌ）に溶解し、これにＬ−アスパラギン・１水和物（６００ｍｇ，４．００ｍｍｏｌ）を加え、室温で１００時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、残渣にジクロロメタン（１８ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。生じた白色沈殿物を濾取し、ジクロロメタン（４０ｍｌ）で洗浄するとＮアルフア−（２−キノリルカルボニル）−Ｌ−アスパラギン（１.０９ｇ，９４.９％）が白色粉末晶として得られた。
ｍｐ １８９ −１９３ ℃（分解）
元素分析値：Ｃ14Ｈ13Ｎ3Ｏ4・０.２Ｈ2Ｏとして計算値 Ｃ，５７.８１；Ｈ，４.６４；Ｎ，１４.４４実測値 Ｃ，５７.８６；Ｈ，４.６６；Ｎ，１４.５５ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：２８８（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(d6-DMSO）δ：2.67-2.93(2H,m),4.78-4.87(1H,m),7.01(1H,s),7.52(1H,s),7.74(1H,t,J=7.2Hz),7.89(1H,t,J=7.2Hz), 8.09-8.21(3H,m),8.59(1H,d,J=8Hz),9.17(1H,d,J=8Hz)
【００４４】実施例１１Ｎアルフア−（２−キノリルカルボニル）−Ｌ−アスパラギン（１４６ｍｇ，０.５０９ｍｍｏｌ）と１−［（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物ＸＩ：１７５ｍｇ，０．５０９ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解し、−５℃以下で、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（７３ｍｇ，０．５４０ｍｍｏｌ）、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド（１１１ｍｇ，０．５４０ｍｍｏｌ）を加え、−５℃以下で２時間、さらに室温で１６時間攪拌した。生じた不溶物を濾別し、溶媒を減圧留去した。残渣に１０％リン酸水溶液、酢酸エチル（各３０ｍｌ）を加えて分液した。酢酸エチル層を５％重曹水，飽和食塩水の順に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）した後、減圧留去した。得られた粉末をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel 60, １８ｇ：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝８：８：１で溶出）で２回精製すると１−［（３Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−［Ｎアルフア−（２−キノリルカルボニル）−Ｌ−アスパラギニル］アミノ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物３：１５０ｍｇ，４７.８％）が非結晶性白色粉末として得られた。
ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：６１７（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3）δ：1.29(9H,s),1.7-2.4(4H,m),2.64-3.10(4H,m),3.69(2H,t,J=6.6Hz),4.09-4.16(1H,m),4.40-4.66(3H,m), 4.91-5.05(1H,m),5.58(1H,brs),6.10(1H,brs),6.57(1H,s),6.95-7.18(5H,m),7.64(1H,t,J=7Hz),7.75-7.91(3H,m),8.11-8.34(3H,m),9.20(1H,d,J=7.8Hz)元素分析値：Ｃ33Ｈ40Ｎ6Ｏ6・Ｈ2Ｏとして計算値 Ｃ，６２.４５；Ｈ，６.６７；Ｎ，１３.２４実測値 Ｃ，６２.２０；Ｈ，６.８０；Ｎ，１３.１９
【００４５】実施例１２１−［（３Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−［Ｎアルフア−（２−キノリルカルボニル）−Ｌ−アスパラギニル］アミノ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物３：５０ｍｇ，０.０８１ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（２.５ｍｌ）に、氷冷下塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３１ｍｇ，０.０１６ｍｍｏｌ）、ピリジントリフルオロ酢酸塩（５．９ｍｇ，０.０３ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（０.２ｍｌ）を順次加えた。室温で２４時間攪拌した後、再度氷冷下に塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３１ｍｇ，０.０１６ｍｍｏｌ）、ピリジントリフルオロ酢酸塩（５．９ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（０．２ｍｌ）を順次加えた。室温で７２時間攪拌した後、反応液に酢酸エチル（２０ｍｌ）を加え、これを水（１０ｍｌ×２）で洗浄した。酢酸エチル層を乾燥（ＭｇＳＯ４）した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel 60，２０ｇ：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝５：５：１で溶出）で２回精製すると１−［（３Ｓ）−３−［Ｎアルフア−（２−キノリルカルボニル）−Ｌ−アスパラギニル］アミノ−２−オキソ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物４：２０ｍｇ，４０.２％）が白色粉末晶として得られた。
ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：６１５（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3）δ：1.16(3H,s),1.20-1.37(6H,m),1.70-2.35(4H,m),2.56-3.78(6H,m),4.38-4.60(1H,m),4.92-5.1(1H,m), 5.1-5.35(1H,m),5.35-5.55(1H,m),5.80-6.12(1H,m),6.4-6.57(1H,m),6.95-7.29(5H,m),7.46-7.93(4H,m),8.09-8.35(3H,m),9.25-9.48(1H,m)ｍｐ １１５−１１８℃
【００４６】
【配列表】配列番号：１配列の長さ：１２配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列AATTCTATGC CA 12
【００４７】配列番号：２配列の長さ：１２配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列GATACGGTCT AG 12
【００４８】配列番号：３配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列CTAGCTAGCT AGAATTCTAG CTAGCTAG 28
【００４９】配列番号：４配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列Ser Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu 1 5 10
【００５０】配列番号：５配列の長さ：７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、レトロウイルスプロテアーゼ阻害活性を有する新規なアスパラギン誘導体およびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】レトロウイルスは、レトロウイルス科に属するウイルスであって、遺伝子としてＲＮＡを持ち、自身の有する逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）の働きによりＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する段階を自己複製の第１段階とするウイルスの総称である。レトロウイルス科は３つの亜科（オンコウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス）からなる。レトロウイルスは、鳥類や哺乳類の種々の動物を宿主として感染、増殖し、肉腫、白血病、癌などを引き起こすもののあることが知られている。ヒトを宿主とするレトロウイルスとしては、成人Ｔ細胞白血病ウイルス（adult Ｔ−cell leukemia virus, ＡＴＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（human Ｔ−cell leukemia virus typeＩ、ＨＴＬＶ−Ｉ）およびヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus, ＨＩＶ）などが報告されているが、ＡＴＬＶは、ＨＴＬＶ−Ｉと同一のウイルスであることが証明された。ＨＴＬＶにはこの他に、Ｔ細胞系のヘアリーセル白血病（hairycell leukemia）を誘導するII型が存在する。ＨＩＶはＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に分類され、ＨＩＶ−１は重篤な免疫不全症である後天性免疫不全症候群（aquired immunodeficiency syndrome, ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであることが分かっている。また、ＨＩＶ−２もＡＩＤＳの原因ウイルスとされているが、ＨＩＶ−１ほどはっきりとは解明されていない。
【０００３】ＡＴＬＶによって引き起こされる成人Ｔ細胞白血病は、日本の南西地域特に九州地方に多く見られる白血病であり、１９７７年にはじめて報告された。成人Ｔ細胞白血病患者では、Ｔ４陽性Ｔ細胞が癌化して、皮膚病変、リンパ節腫大、肝脾腫等を招来する。成人Ｔ細胞白血病に対しては有効な治療法はなく、発病するとほとんどが１年以内に死亡する。
【０００４】ＨＩＶ−１によって引き起こされるＡＩＤＳは、予後不良の免疫不全症として最近注目を集めている疾病であって、カリニ肺炎やカポシ肉腫などの臨床像を特徴とする。ＨＩＶ−１は、Ｔ４陽性細胞に感染して細胞内に侵入、増殖し、これを破壊することにより免疫不全を招来する。現在ＡＩＤＳの治療薬としてアジドチミジン（ＡＺＴ）が使用されており、症状の改善および延命効果が認められている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のように抗レトロウイルス剤としてＡＺＴが使用されているものの、この物質は副作用として骨髄抑制を起こすなどの欠点を有しており、さらに効果が高く副作用の少ない治療薬の出現が期待されている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】レトロウイルスのゲノムにコードされているプロテアーゼは感染性成熟ウイルス粒子の形成に際して重要な役割を果たしており、このプロテアーゼ機能を欠損すると感染性粒子の形成の起こらないことが知られている［I. Katoh ら，ウィロロジー（Virology）第１４５巻，２８０頁（１９８５年）］。
【０００７】したがって、該プロテアーゼの阻害剤はレトロウイルス性疾患の予防および治療薬に成り得るものと考えられ、最近になってペプスタチンＡ［フェブス レターズ（FEBS Lett.），２４７，３４９（１９８９）］、種々の合成ペプチド性誘導体［ネイチャー（Nature），３４３，９０（１９９０）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.），２６５，１４６７５（１９９０）、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）， ３３，１２８５（１９９０）、サイエンス（Science），２４７，４５４（１９９０）および２４８，３５８（１９９０）］や非ペプチド性化合物［サイエンス（Science），２４９，５２７（１９９０）、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、３３，２６８７（１９９０）および３４，１ ２２５（１９９１）］等のプロテアーゼ阻害剤が該治療剤として提案されている。本発明者らの一人、加藤らは広く自然界に該プロテアーゼ阻害物質を検索し、その結果、土壌中から分離した１菌株が該プロテアーゼ阻害物質を産生すること、該菌株が放線菌の中のキタサトスポリア属に属すること、該微生物の培養液から精製取得したペプチド性の新規な化合物たるＲＰＩ−８５６、ＲＰＩ−８５７、ＲＰＩ−８５８、ＲＰＩ−８５９が試験管内で該プロテアーゼを強く阻害することを見出し、すでに特許出願した（特願平２−２８２０２５，特願平３−１４５０および特願平３−１７６０４号明細書参照）。本発明者らは、これらのペプチド性化合物の化学構造に基づいてドラッグデザインを行い、関連化合物の合成研究を鋭意行った結果、以下に示されるアスパラギン誘導体が高い該プロテアーゼ阻害活性を示すことを見出し、さらに研究を進め本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明は、一般式（I）
【化３】
［式中、環Ａは５〜７員環を示し、Ｒ1，Ｒ2はともに水素原子を示すか、または結合して縮合環を形成していてもよく、Ｒ3はエステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基を示し、Ｒ4は水素原子またはアシル基を示し、Ｘは
【化４】
で表わされるアスパラギン誘導体およびその塩、および化合物（I）を含有してなるレトロウイルス性疾患治療剤を提供するものである。
【０００９】化合物（I）に関し、Ｒ1，Ｒ2が結合して縮合環を形成する場合、５〜６員環を形成することが好ましく、なかでもＲ1，Ｒ2が結合してベンゾ縮合、パーヒドロベンゾ縮合もしくはパーヒドロシクロペンタ縮合を示すのが好ましい。この場合、具体的には式
【化５】
などを挙げることができる。
【００１０】化合物（I）に関し、Ｒ1，Ｒ2で表わされる基の好ましい例は、ともに水素原子であるものおよび結合してパーヒドロベンゾ縮合であるものがあげられる。化合物（I）に関し、Ｒ3で表わされるエステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基としては、例えばカルボキシル，カルバモイル，低級アルコキシカルボニル（例、メトキシカルボニル，エトキシカルボニル，プロポキシカルボニル，イソプロポキシカルボニル，ブトキシカルボニル，イソブトキシカルボニル，tert−ブトキシカルボニルなどのＣ1-4アルコキシ−ＣＯ−など），アラルキルオキシカルボニル（例、ベンジルオキシカルボニル，ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル，ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル，フェネチルオキシカルボニルなどの置換されていてもよいフェニル−Ｃ1-4アルコキシ−ＣＯ−など），低級アルキルアミノカルボニル（例、メチルアミノカルボニル，エチルアミノカルボニル，プロピルアミノカルボニル，イソプロピルアミノカルボニル，ブチルアミノカルボニル，イソブチルアミノカルボニル，tert−ブチルアミノカルボニルなどのＮ−Ｃ1-4アルキルアミノなど），アラルキルアミノカルボニル（例、ベンジルアミノカルボニル，フェネチルアミノカルボニルなどのＮ−フェニル−Ｃ1-4アルキルアミノ）などがあげられ、なかでも低級アルコキシカルボニルおよび低級アルキルアミノカルボニルが好ましく、とりわけ、tert−ブトキシカルボニルおよびtert−ブチルアミノカルボニルが好ましい。
【００１１】化合物（I）に関し、Ｒ4で表わされるアシル基としては、例えば低級アルカノイル（例、ホルミル，アセチル，プロピオニル，ブチリル，イソブチリルなどのＣ1-5アルカノイルなど），低級アルコキシカルボニル（例、メトキシカルボニル，エトキシカルボニル，プロポキシカルボニル，イソプロポキシカルボニル，ブトキシカルボニル，イソブトキシカルボニル，tert−ブトキシカルボニルなどのＣ1-4アルコキシ−ＣＯ−など），アラルキルオキシカルボニル（例、ベンジルオキシカルボニル，ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル，ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル，ナフチルメチルオキシカルボニルなどの置換されていてもよいフェニル−Ｃ1-4アルコキシ−ＣＯ−など），アリールカルボニル（例、ベンゾイル，ナフトイル，トルオイルなど），ヘテロアリールカルボニル（例、フロイル，テノイル，ニコチノイル，イソニコチノイル，キノリノイル，イソキノリノイル，キナゾリノイルなど），アリールスルホニル（例、ｐ−トルエンスルホニル，ベンゼンスルホニル，ナフタレンスルホニルなど）などがあげられ、なかでも低級アルコキシカルボニル，アラルキルオキシカルボニル，ヘテロアリールカルボニルが好ましく、とりわけ、tert−ブトキシカルボニル，ベンジルオキシカルボニル，２−キノリノイルが好ましい。
【００１２】化合物（I）に関し、環Ａとしては５〜６員環，とりわけピロリジン環およびピペリジン環が好ましい。本発明化合物に属する好ましい化合物の具体例としては、例えば〔表１〕に示す化合物があげられる。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【化６】
［式中、各記号は前記と同意義。］で表わされる化合物を酸化することによって製造することができる。
【００１５】反応は通常、ジメチルスルホキシド中、ピリジンおよびトリフルオロ酢酸の存在下に行うことが好ましく、反応温度は０〜６０℃程度で行われ、反応時間は１〜２４時間である。
【００１６】本発明化合物（I）は、たとえば式（II）
【化７】
［式中、各記号は前記と同意義。］で表わされる化合物と、式（III）
【化８】
［式中、Ｒ4′はアシル基であり、他の記号は前記と同意義。］で表わされる化合物を縮合させることによって得ることができる。
【００１７】該縮合反応条件としては、たとえば縮合試薬（例、ジシクロヘキシルカルボジイミド，カルボニルジイミダゾール，シアノリン酸ジエチル，ジフェニルリン酸アジド等）などを用いるか、または化合物（III）にたとえば２,４,５−トリクロロフェノール，ペンタクロロフェノール，ペンタフルオロフェノール，２−ニトロフェノールおよび４−ニトロフェノール等のフェノール類、または、たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミド，Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボン酸イミド，１−ヒドロキシベンズトリアゾール，Ｎ−ヒドロキシピペリジン等のＮ−ヒドロキシ化合物をジシクロヘキシルカルボジイミド等の触媒の存在下に縮合させ、化合物（III）を活性なエステル体に変換した後、化合物（II）と反応させることが好ましい。また化合物（III）にたとえば、クロロ炭酸メチル，クロロ炭酸エチル，クロロ炭酸イソブチルなどを、好ましくは有機塩基（例、トリエチルアミン，Ｎ−メチルモルホリン）の存在下に反応させ、混合酸無水物に変換した後、化合物（II）と反応させることもできる。これらの反応において、反応温度は通常約−３０℃〜＋５０℃であり、用いる溶媒としては、たとえばジオキサン，テトラヒドロフラン，アセトニトリル，ジエチルエーテル，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，ジメチルスルホキシド，Ｎ−メチルピロリドン，クロロホルム，塩化メチレンなどが挙げられ、これら溶媒は単独もしくは混合溶媒として用いてもよい。
【００１８】本発明化合物（I）は、たとえば式（IV）
【化９】
［式中、Ｒ4′はアシル基であり、他の記号は前記と同意義。］で表わされる化合物と式（V）
【化１０】
［式中、各記号は前記と同意義。］で表わされる化合物を縮合させることによって製造することができる。該縮合反応条件としては、上述した（II）と（III）の縮合反応において適用される条件と同様な反応条件が好ましい。
【００１９】本発明化合物（I）においてＲ4が水素である化合物は、式（I″）で表わされる化合物を脱保護反応に付すことによって製造することができる。
【化１１】
［式中、Ｒ4″はアミノ保護基を示し、他の記号は前記と同意義。］
また、本発明化合物（I）においてＲ3がカルボキシル基である化合物は、式（I″′）で表わされる化合物を脱保護反応に付すことによって製造することができる。
【化１２】
［式中、Ｒ3′は保護されたカルボキシル基を示し、他の記号は前記と同意義。］。
【００２０】該脱保護反応としては、その保護基の種類あるいは、化合物（I″），（I″′）の脱保護条件下での安定性に応じて、酸あるいは塩基による方法、または接触還元による方法を適宜選択して行うことができる。酸による方法の場合には、保護基の種類その他の条件によって異なるが、酸として例えば塩酸、臭化水素、フッ化水素、沃化水素、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、硫酸、リン酸等の無機酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸等の有機酸の他、酸性イオン交換樹脂等が使用される。塩基による方法の場合には、保護基の種類その他の条件によって異なるが、塩基として例えばナトリウム，カリウム等のアルカリ金属もしくはカルシウム，マグネシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩等の無機塩基、金属アルコキサイド類、有機アミン類、第四アンモニウム塩等の有機塩基の他、塩基性イオン交換樹脂等が使用される。上記酸または塩基による方法の場合において溶媒を使用する場合には、たとえば、水，メタノール，エタノール，酢酸エチル，クロロホルム，テトラヒドロフラン，ジオキサン，ピリジン，酢酸，アセトン，塩化メチレンなどを単一、もしくは混合して用いることができる。また金属と酸による方法においては水，アセトン等が繁用されるが酸が液体のときは酸自身を溶媒として使用することもできる。酸および塩基による方法において反応温度は、通常冷却下ないし加温程度で行なわれ、反応時間は約３０分ないし２０時間である。
【００２１】一方接触還元による方法の場合には、水またはたとえばメタノール，エタノール，ジオキサン，酢酸エチルなどの有機溶媒あるいはそれらの混合溶媒中、たとえばパラジウム−炭素などの適当な触媒の存在下に行われる。本反応は常圧または１５０kg／cm2程度までの圧力下、常温ないし＋１００℃の温度で行われるが、一般に常温，常圧で充分反応は進行する。
【００２２】本発明化合物（I）は分子内に不斉原子を３個以上有しているので８個以上の立体異性体が存在し得るが、その立体異性体ならびにそれらの混合物のいずれも本発明に包含されるものである。とりわけアスパラギン残基中の不斉炭素，ベンジル基とＸが結合した不斉炭素およびＲ3が結合した不斉炭素のいずれもがＳ配置である光学活性体が好ましい。
【００２３】化合物（I）は塩としても得られ、該塩としては、たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩などの無機酸塩、たとえば酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、フマール酸塩、マレイン酸塩、トリエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩などの有機酸塩、たとえばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩などの金属塩、たとえば、トリエチルアミン塩、グアニジン塩、アンモニウム塩、ヒドラジン塩、キニーネ塩、シンコニン塩などの塩基との塩が挙げられる。
【００２４】かくして得られる化合物（I）は反応混合物から通常の分離精製手段、たとえば抽出、濃縮、中和、ろ過、再結晶、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどの手段を用いることによって単離することができる。化合物（I）は少なくとも８個の立体異性体が存在し得る。これら個々の異性体およびこれらの混合物のいずれも本発明に包含されるが、所望によりこれらの異性体を個別に製造することもできる。たとえば原料化合物（I′），（II），（III），（IV）および（V）のそれぞれの単一の異性体を用いて上記の反応を行うことにより、化合物（I）の単一の異性体を得ることができるし、また生成物が二種類以上の異性体混合物の場合には、これを通常の分離方法、たとえば光学活性酸（例、カンファースルホン酸、酒石酸など）との塩を生成させる方法や、各種のクロマトグラフィー、分別再結晶などの分離手段によってそれぞれの異性体に分離することもできる。
【００２５】化合物（Ｉ）の塩は必要に応じ前記した無機酸あるいは有機酸を加えることによって生理学的に許容される塩として得ることができる。本発明における合成中間体（II）において、例えばＲ1，Ｒ2がともに水素原子であり、Ｒ3がtert−ブチルアミノカルボニルであり、環Ａがピロリジン環であり、Ｘが
【化１３】
である化合物（XI）は次の反応式で示す方法で合成することができる。
【００２６】
【化１４】
ここで用いた（IX）はジャーナル・オブ・メディシカル・ケミストリー（J. Med. Chem.）, ２０，５１０（１９７７）に記載された方法で合成することができる。
【００２７】以下参考例および試験例においてＨＩＶ−１プロテアーゼの調製法および該プロテアーゼに対する本発明化合物（I）の阻害作用についてそれぞれ述べる。
参考例１ ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子の発現プラスミドの構築ＨＩＶ−１プロテアーゼはpol遺伝子にコードされた蛋白質の１つであり、感染細胞内においてはgag−polのポリプロテインとして合成されたものが、プロテアーゼ自身の作用によりプロセシングされることにより生成されると考えられている［J. M. Mc Cune ら、セル(Cell)第５３巻，５５頁（１９８８年）］。一方、プロテアーゼ領域を含むpol遺伝子の一部を大腸菌で発現させることにより、分子量１１キロダルトンの活性型ＨＩＶ−１プロテアーゼが自身のオートプロセシング作用により生成されることが既に知られている［M. C. Graves ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第８５巻，２４４９頁（１９８８年）］。
【００２８】そこで、まずＨＩＶ−１の全遺伝子を含有するプラスミドｐＮＬ４−３［A. Adachi ら、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J. Virol.）第５９巻，２８４頁（１９８６年）］からプロテアーゼ領域を含有する１.５kb のＢglII−ＢalI断片を取得した。次に、この断片にリンカー ５’−ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡ−３’ （配列番号：１）
３’−ＧＡＴＡＣＧＧＴＣＴＡＧ−５’ （配列番号：２）
を接続した後、ＥcoＲＩで消化し、さらにリンカー［５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧ−３’］（配列番号：３）を接続した後、ＥcoＲＩで消化した。次に、この断片の切断点をクレノーフラグメントで埋めて平滑末端にした。一方、Ｔ７プロモーターを含む大腸菌用発現ベクターｐＥＴ−３ｃ［A. H. Rosenberg ら、ジーン（Gene）第５６巻，１２５頁（１９８７年）］をＮdeＩで消化し、その切断点をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで埋めて平滑末端にした。次に、これら両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて接続し、Ｔ７プロモーターとプロテアーゼ遺伝子の向きが同方向となったものをｐＨＩＶ７００４とした。
【００２９】参考例２ 組換え型ＨＩＶ−１プロテアーゼの調製Escherichia coli ＭＭ２９４株にＴ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３［F. W. Studier ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）第１８９巻，１１３頁（１９８６年）］を溶原化させてEscherichia coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）を作製した。参考例１で得られたｐＨＩＶ７００４を、Escherichia coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）に導入して、形質転換体Escherichia coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＩＶ７００４を得た。本形質転換体をアンピシリン５０μg／mlを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液０.２mlを２０mlの同じ培地に接種し、３７℃で対数増殖期（１８０−２００ Ｋｌｅｔｔ ｕｎｉｔ）まで培養した。次に、最終濃度が０.４mＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに３７℃で２時間培養した。培養液２００mlから、菌体を５０００rpm で５分間遠心することにより集め、これを〔表２〕に記載した組成を持つ緩衝液Ａ２０mlに懸濁した。懸濁液にニワトリ卵白リゾチーム２mgを加え、氷冷下で１０分間放置後、ノニデットＰ４０（ＮＰ４０）を最終濃度１％になるように加え、超音波破砕装置を用いて菌体を破砕した。上記処理を行った溶菌液を、日立工機社製のＲＲ−２４Ａローターを用いて１６０００rpm で１０分間遠心分離し、ＨＩＶ−１プロテアーゼを含む粗抽出液２０mlを得た。
【００３０】
【表２】 緩衝液Ａの組成５０mＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８.０５mＭ エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）
０.１％ ノニデットＰ４０（ＮＰ４０）
０.０２％ ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）
１０％ グリセリン１mＭ フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）
０.１mＭ パラアミジノフェニルメタンスルフォニルフルオリド（APMSF）
【００３１】試験例１ ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害作用ＨＩＶ−１ gagＰ１７とＰ２４の解裂部位を含む合成ペプチドgag−１１（ＳＱＶＳＱＮＹＰＩＶＱＮＬ）（配列番号：４）を基質とし、反応産物gag−１２（ＳＱＶＳＱＮＹ）（配列番号：５）の生成を指標としてＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害活性を測定した。即ち、基質gag−１１ ３μg、 種々の濃度の試料、ＨＩＶ−１プロテアーゼを含む５％グリセロール−１ＭＮaＣl−０.２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.２）（３０μl）中で３〜５時間反応させた。０.１３Ｍトリクロロ酢酸−０.２６Ｍ酢酸ナトリウム−０.４Ｍ酢酸１５０μlを加えることにより反応を停止した。室温で１０分間放置した後遠心上清を得た。上記の上清のうち４８μlを０.１％トリフロロ酢酸で平衡化したＹＭＣ−パックＦＬ−ＯＤＳカラム（０.４６×３cm、ワイエムシィ社）に負荷し、アセトニトリルの濃度勾配で溶出した。本条件下において、gag−１２の生成量を５０％阻害するために必要な反応液中の試料濃度をＩＣ50値として表わした。化合物（I）のＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害活性を〔表３〕に示した。
【００３２】
【表３】
試 料 ＩＣ50（μＭ）
(化合物番号) ────────────────────────── １ ０.０２０ ２ ０.０３４ ３ ０.０２１ ４ ０.０３１〔表３〕の結果から、本発明化合物（I）は非常に強いＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害物質であることが明らかである。
【００３３】以上のように、化合物（I）はレトロウイルスのプロテアーゼ阻害活性を有しており、また毒性も低いので、レトロウイルス性疾患治療剤として有用な物質である。 本発明化合物（I）を抗レトロウイルス剤として用いる場合、希釈剤、賦形剤、担体などと混合して、薬学的に許容される製剤とし、経口的または非経口的に投与する。例えば、注射剤として用いる場合は、化合物（I）を水溶液剤として、成人１日当り０.１〜１０mg／kgを静脈内投与する。
【００３４】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。
実施例１１−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−プロリン（化合物IV：２３.０ｇ，９２.２mmol）をテトラヒドロフラン（１５０ml）に溶解し、氷冷下にトリエチルアミン（１４.１ml，１０２mmol）を加えた。次に、クロロギ酸イソブチル（１３.２ml，１０２mmol）のテトラヒドロフラン（４３ml）溶液を滴下し、氷冷下で１時間撹拌した後、tert−ブチルアミン（１９.４ml，１８４mmol）を加えた。氷冷下で１時間、さらに室温で一夜撹拌した後、溶媒を留去した。残渣に水，酢酸エチル（各２００ml）を加えて分液し、酢酸エチル層を１０％リン酸ナトリウム水溶液，５％重曹水，飽和食塩水の順で洗浄し、乾燥（ＭgＳＯ4）後、減圧留去した。得られた白色粉末を酢酸エチル−ヘキサン（１：１，４０ml）から再結晶し、１−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物VII：１５.５ｇ，５５％）を白色結晶として得た。さらにろ液を減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel ６０，１００ｇ：酢酸エチル−ヘキサン＝１：１で溶出）で精製すると追加のプロリンアミド体（化合物VII：５.９ｇ，２１.０％）が得られた。
ｍｐ ９０−９１℃元素分析値： Ｃ17Ｈ24Ｎ2Ｏ3としてCalcd：Ｃ，６７.０８； Ｈ，７.９５； Ｎ，９.２０Found：Ｃ，６６.８５； Ｈ，７.９６； Ｎ，９.４５ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：３０５（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(d6-DMSO)δ：1.18(6H,s),1.24(3H,s),1.7-1.95(3H,m),1.95-2.2(1H,m),3.3-3.5(2H,m),4.1-4.2(1H,m),4.9-5.10(2H,m),7.2-7.5(6H,m)
【００３５】実施例２１−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物VII：８.０ｇ，２６.３mmol）をメタノール−水（６：１，１４０ml）に溶解し、１０％パラジウム−炭素（０.５ｇ）を加え、水素気流中、１時間撹拌した。触媒をろ別し、触媒部分を洗浄（１０％メタノール水溶液）し、ろ液と洗液を合わせて減圧留去した。得られた油状物を減圧乾燥すると結晶化した。これにジエチルエーテルと石油エーテルの混液を加えてろ取すると、Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物VIII：３.４ｇ，７５.７％）が無色粉末晶として得られた。
ｍｐ ７９−８０℃元素分析値： Ｃ9Ｈ18Ｎ2ＯとしてCalcd：Ｃ，６３.４９； Ｈ，１０.６６； Ｎ，１６.４５Found：Ｃ，６３.４５； Ｈ，１０.８９； Ｎ，１６.１５1Ｈ−ＮＭＲ(d6-DMSO)δ：1.26(9H,s),1.5-1.7(3H,m),1.8-2.0(1H,m),2.78(2H,ddd,J=6.1,6.5,9.7Hz),3.2-3.4(1H,m),7.57(1H,br s)
【００３６】実施例３（２ＲＳ，３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸（化合物IX：２.０ｇ，６.０７mmol）をジメチルホルムアミド（２０ml）に溶解した。氷冷下にＮ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物VIII：１.２４ｇ，７.２８mmol），シアノリン酸ジエチル（ＤＥＰＣ）（２.０９ｇ，１２.２mmol）のジエチルホルムアミド（５ml）溶液およびトリエチルアミン（１.７６ml，１２.２mmol）を順次加え、氷冷下に１時間、さらに室温に戻して２.５時間撹拌した。反応液に水（約５ml）を加えて１時間撹拌した後、水（８０ml）を加え、酢酸エチル（１５０ml）で抽出した。酢酸エチル層を１０％リン酸ナトリウム水溶液、５％重曹水、飽和食塩水の順で洗浄し、乾燥（Ｍg ＳＯ4）した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （Kieselgel ６０，１４０ｇ：酢酸エチル−ヘキサン＝２：１で溶出）で精製すると１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物X） のジアステレオマーＡ（極性大：０.６９５ｇ）及びジアステレオマーＢ（極性 小：０.４１５ｇ）が無色粉末晶として得られた。
ジアステレオマーＡ白色粉末晶ｍｐ ６３−６６℃元素分析値： Ｃ27Ｈ35Ｎ3Ｏ5・1/2Ｈ2ＯとしてCalcd：Ｃ，６６.１０； Ｈ，７.４０； Ｎ，８.５７Found：Ｃ，６６.４０； Ｈ，７.４３； Ｎ，８.５４ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：４８２（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：1.29(9H,s),1.75-2.4(4H,m),2.6-2.8(2H,m),3.6-4.25(5H,m),4.3-4.65(2H,m),4.99(2H,s),5.43(1H,d,J=8.8Hz),6.49(1H,s),7.1-7.4(10H,m)ジアステレオマーＢ白色粉末晶ｍｐ １１４−１１５℃元素分析値： Ｃ27Ｈ35Ｎ3Ｏ5としてCalcd：Ｃ，６７.３４； Ｈ，７.３３； Ｎ，８.７３Found：Ｃ，６７.５１； Ｈ，７.２９； Ｎ，８.７７ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：４８２（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：1.29(9H,s),1.7-2.3(4H,m),2.95(2H,d,J=7.8Hz),3.0-3.4(2H,m),3.87(1H,d,J=5.6Hz),3.95(1H,d,J=3.6Hz),4.10(1H,d,J=4.6Hz),4.22(1H,m),5.03(2H,s),5.09(1H,br s),6.43(1H,br s),7.2-7.5(10H,m)
【００３７】実施例４１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物X，ジアステレオマーＡ：３００mg，０.６２mmol）をメタノール−水（４：１，８ml）に溶解し、１０％パラジウム−炭素（４０mg）を加え、水素気流下、４時間撹拌した。触媒をろ別し、触媒部分を洗浄（５０％メタノール水溶液）し、ろ液と洗液を合わせて減圧留去した。残渣にジエチルエーテルを加えて、析出した結晶をろ取すると１−［（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物XI：２１０mg）が白色粉末晶として得られた。
ｍｐ １５４.５−１５６.０℃元素分析値： Ｃ19Ｈ29Ｎ3Ｏ3としてCalcd：Ｃ，６５.６８； Ｈ，８.４１； Ｎ，１２.０９Found：Ｃ，６５.３５； Ｈ，８.５５； Ｎ，１２.１３1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：1.29(9H,s),1.4-2.2(2H,br m),1.7-2.4(4H,m),2.53(1H,dd,J=10.0,13.3Hz),2.95(1H,dd,J=3.2,13.4Hz),3.0-3.2(1H,m),3.5-3.7(2H,m),4.27(1H,d,J=5.4Hz),4.45-4.55(1H,m),6.57(1H,s),7.1-7.4(5H,m)
【００３８】実施例５１−［（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物XI：２４０mg，０.６９mmol）をジメチルホルムアミド（８ml）に溶解し、氷冷下にＮアルフア−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギンのｐ−ニトロフェニルエステル（２６７mg，０. ６９mmol）を加え、氷冷下に１時間、さらに室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し た後、残渣に水，酢酸エチル（各３０ml）を加えて分液した。酢酸エチ ル層を１０％リン酸ナトリウム水溶液，５％重曹水，飽和食塩水の順に洗浄し、乾燥（ＭgＳＯ4）した後、減圧留去した。得られた黄色油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel ６０，２０ｇ：酢酸エチル−メタノール＝９：１で溶出）で精製すると１−［（３Ｓ）−３−（Ｎアルフア−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギニル）アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物１：２００mg，４８. ７％）が白色粉 末晶として得られた。
ｍｐ １０２−１０３℃（dec.）
元素分析値： Ｃ31Ｈ41Ｎ5Ｏ7としてCalcd：Ｃ，６２.５１； Ｈ，６.９４； Ｎ，１１.７６Found：Ｃ，６２.２０； Ｈ，７.０６； Ｎ，１１.６６ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：５９６（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(d6-DMSO)δ：１．２５（９Ｈ，ｓ），１．７−２．１（４Ｈ，ｍ），２．２−２．４５（２Ｈ，ｍ），２．５５−２．８（２Ｈ，ｍ），３．５−３．７（２Ｈ，ｍ），４．０−４．２（１Ｈ，ｍ），４．２−４．４（３Ｈ，ｍ），４．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），５．０１（２Ｈ，ｓ），６．８７（１Ｈ，ｓ），７．０５−７．４（５Ｈ，ｍ），７．２２（１Ｈ，ｓ），７．３５（５Ｈ，ｓ），７．５２（１Ｈ，ｓ），７．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）
【００３９】実施例６ベンゼン（１ｍｌ）とジメチルスルホキシド（０.５ml）の混液にジシクロヘキシルカルボジイミド（１０４mg，０.５０４mmol）とピリジン（１４μl，０.１６８mmol）を加え、次いで氷冷下に１−［（３Ｓ）−３−（Ｎアルフア−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギニル）アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物１：１００mg，０. １６８mmol）を加えた。１０分後にトリフルオロ酢酸（６.６μl，０.０ ８４mmol）を加え、室温で一夜撹拌した。反応液に酢酸エチル（２ml）を加え、不溶物 をろ別した。ろ液に酢酸エチル（２５ml）を加え、これを水（３０ml× ３）で洗浄し、乾燥（ＭgＳＯ4）した後、減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel ６０，１５ｇ：酢酸エチル−塩化メチレン−メタノール＝５：５：１で溶出）で精製すると１−［（３Ｓ）−３−（Ｎアルフア−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギニル）アミノ−２−オキソ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−tert−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物２：２０mg，２０.１ ％）が白色粉末晶として得られた。
ｍｐ ８９−９３℃ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：５９４（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(d6-DMSO)δ：1.21(3H,s),1.24(6H,s),1.65-2.0(4H,m),2.0-2.4(2H,m),2.75-3.1(1H,m),3.1-3.3(1H,m),3.4-3.6(2H,m),4.2-4.5(2H,m),4.5-4.9(1H,m),4.9-5.1(2H,m),6.88(1H,br s),7.1-7.3(5H,m),7.33(5H,s),7.5-7.6(1H,m),8.15-8.6(1H,m)
【００４０】実施例７（２ＲＳ，３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸（化合物IX：２.１６ｇ，６.５５mmol）をジメチルホルムアミド（５ml）に溶解し、氷冷下にＬ−プロリン−tert−ブチルエステル（１.２３ｇ，７.２１mmol）のジメチルホルムアミド（２.５ml）溶液，シアノリン酸ジエチル（１.２３ｇ，７.２１mmol）のジメチルホルムアミド（２.５ml）溶液 およびトリエチルアミン（１.０ml，７.２１mmol）を順次加えた。氷冷下に１時間、さらに室温で一夜撹拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル（８０ml）に溶解し、得られた溶液を冷５％塩酸，５％重曹水，飽和食塩水の順で洗浄し、乾燥（ＭgＳＯ4）した後、減圧留去した。残留物を酢酸エチル−ヘキサン（１：１，１２ml）から結晶化し、１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｌ−プロリン−tert−ブチルエステルのジアステレオマーＢ（極性小）を白色結晶として８００mg（２５.３％）得た。さらにろ液を減圧留去した後、残留物をシリカゲルカラムクロ マトグラフィー（Kieselgel ６０，３０ｇ：酢酸エチル−ヘキサン＝１：２で溶出）で精製すると、追加のジアステレオマーＢ１４０mg（４.４％）とジアステ レオマーＡ（極性大，非結晶性粉末）１.０３ｇ（３２.６％）が得られた。
ジアステレオマーＡｍｐ ５８−６０℃ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：４８３（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：1.43(3H,s),1.45(6H,s),1.6-2.3(4H,m),2.5-3.0(2H,m),3.6-3.9(2H,m),4.15-4.3(1H,m),4.45-4.55(1H,m),4.60(1H,br s),5.00(2H,s),5.0-5.1(1H,m),5.22(1H,d,J=8.4Hz),7.15-7.4(5H,m),7.27(5H,s)ジアステレオマーＢｍｐ １５１.０−１５３.５℃ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：４８３（ＭＨ+）
元素分析値： Ｃ27Ｈ34Ｎ2Ｏ6としてCalcd：Ｃ，６７.２０； Ｈ，７.１０； Ｎ，５.８０Found：Ｃ，６７.１１； Ｈ，７.２５； Ｎ，５.５３1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：1.43(9H,s),1.8-2.1(4H,m),2.94(1H,d,J=2.8Hz),2.98(1H,s),3.05-3.2(1H,m),3.15-3.4(1H,m),3.97(1H,br s),4.1-4.3(3H,m),5.03(2H,d,J=4.0Hz),5.14(1H,d,J=9.8Hz),7.2-7.4(10H,m)
【００４１】実施例８１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｌ−プロリン−tert−ブチルエステルのジアステレオマーＢ（８４０mg，１.７４mmol）をジオキサン（５ml）に溶解し、４Ｎ塩酸−ジオキサン溶液（２ml）を加え、室温で２４時間撹拌した。反応液にジオキサン（５ml）を加えて減圧濃縮を３回くり返した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel ６０，３０ｇ：酢酸エチル−ヘキサン＝２：１で溶出）で精製し、１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｌ−プロリンの非結晶性粉末４１０mg（５５.３％）を得た。
ｍｐ １５５.５−１５６.０℃ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：４２７（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：1.55-1.75(1H,m),1.85-2.1(2H,m),2.25-2.45(1H,m),2.85-3.15(2H,m),3.25-3.5(1H,m),3.55-3.75(1H,m),4.12(1H,dd,J=7.2,8.4Hz),4.5-4.6(1H,m),4.64(1H,d,J=5.2Hz),4.65-4.75(1H,m),5.03(2H,q,J=10.8,32.8Hz),7.27(5H,s),7.15-7.4(6H,m)
【００４２】実施例９１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｌ−プロリン（２７０mg，０.６３mmol）をジメチルホルムアミド（４ml）に溶解し、氷冷下にｎ−ブチルアミン（１８６μl，１.９０mmol），シアノリン酸ジエチル（２４０mg，１.３９mmol）のジメチルホルムアミド（０.５ml）溶液およびトリエチルアミン（１９４μl，１.３９mmol）を順次加え、氷冷下に１時間、さらに室温で一夜撹拌した。反応液に水（５ml）を加え、１時間撹拌した後、さらに水（３０ml）を加え、酢酸エチル（４０ml）で抽出した。酢酸エチル層を１０％リン酸ナトリウム水溶液，５％重曹水，飽和食塩水の順で洗浄し、乾燥（ＭgＳＯ4）した後、減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel ６０，２０ｇ：酢酸エチル−ヘキサン＝２：１で溶出）で精製した後、ヘキサンから結晶化し、１−［（３Ｓ）−３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−ブチル−Ｌ−プロリンアミドの白色粉末晶１５０mg（４９.２％）を得た。
ｍｐ ６６.５−６８.５℃ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：４８２（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)δ：0.90(3H,t,J=6.8Hz),1.2-1.6(4H,m),1.75-2.1(3H,m),2.15-2.3(1H,m),2.8-3.4(6H,m),3.87(1H,br s), 4.0-4.3(3H,m),5.03(2H,s),5.10(1H,d,J=9.4Hz),6.57(1H,br s),7.2-7.4(5H,m),7.33(5H,s)
【００４３】実施例１０２−キノリンカルボン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１.０８ｇ，４.００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（４ｍｌ）に溶解し、これにＬ−アスパラギン・１水和物（６００ｍｇ，４．００ｍｍｏｌ）を加え、室温で１００時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、残渣にジクロロメタン（１８ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。生じた白色沈殿物を濾取し、ジクロロメタン（４０ｍｌ）で洗浄するとＮアルフア−（２−キノリルカルボニル）−Ｌ−アスパラギン（１.０９ｇ，９４.９％）が白色粉末晶として得られた。
ｍｐ １８９ −１９３ ℃（分解）
元素分析値：Ｃ14Ｈ13Ｎ3Ｏ4・０.２Ｈ2Ｏとして計算値 Ｃ，５７.８１；Ｈ，４.６４；Ｎ，１４.４４実測値 Ｃ，５７.８６；Ｈ，４.６６；Ｎ，１４.５５ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：２８８（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(d6-DMSO）δ：2.67-2.93(2H,m),4.78-4.87(1H,m),7.01(1H,s),7.52(1H,s),7.74(1H,t,J=7.2Hz),7.89(1H,t,J=7.2Hz), 8.09-8.21(3H,m),8.59(1H,d,J=8Hz),9.17(1H,d,J=8Hz)
【００４４】実施例１１Ｎアルフア−（２−キノリルカルボニル）−Ｌ−アスパラギン（１４６ｍｇ，０.５０９ｍｍｏｌ）と１−［（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物ＸＩ：１７５ｍｇ，０．５０９ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解し、−５℃以下で、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（７３ｍｇ，０．５４０ｍｍｏｌ）、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド（１１１ｍｇ，０．５４０ｍｍｏｌ）を加え、−５℃以下で２時間、さらに室温で１６時間攪拌した。生じた不溶物を濾別し、溶媒を減圧留去した。残渣に１０％リン酸水溶液、酢酸エチル（各３０ｍｌ）を加えて分液した。酢酸エチル層を５％重曹水，飽和食塩水の順に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）した後、減圧留去した。得られた粉末をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel 60, １８ｇ：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝８：８：１で溶出）で２回精製すると１−［（３Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−［Ｎアルフア−（２−キノリルカルボニル）−Ｌ−アスパラギニル］アミノ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物３：１５０ｍｇ，４７.８％）が非結晶性白色粉末として得られた。
ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：６１７（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3）δ：1.29(9H,s),1.7-2.4(4H,m),2.64-3.10(4H,m),3.69(2H,t,J=6.6Hz),4.09-4.16(1H,m),4.40-4.66(3H,m), 4.91-5.05(1H,m),5.58(1H,brs),6.10(1H,brs),6.57(1H,s),6.95-7.18(5H,m),7.64(1H,t,J=7Hz),7.75-7.91(3H,m),8.11-8.34(3H,m),9.20(1H,d,J=7.8Hz)元素分析値：Ｃ33Ｈ40Ｎ6Ｏ6・Ｈ2Ｏとして計算値 Ｃ，６２.４５；Ｈ，６.６７；Ｎ，１３.２４実測値 Ｃ，６２.２０；Ｈ，６.８０；Ｎ，１３.１９
【００４５】実施例１２１−［（３Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−［Ｎアルフア−（２−キノリルカルボニル）−Ｌ−アスパラギニル］アミノ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物３：５０ｍｇ，０.０８１ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（２.５ｍｌ）に、氷冷下塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３１ｍｇ，０.０１６ｍｍｏｌ）、ピリジントリフルオロ酢酸塩（５．９ｍｇ，０.０３ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（０.２ｍｌ）を順次加えた。室温で２４時間攪拌した後、再度氷冷下に塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３１ｍｇ，０.０１６ｍｍｏｌ）、ピリジントリフルオロ酢酸塩（５．９ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（０．２ｍｌ）を順次加えた。室温で７２時間攪拌した後、反応液に酢酸エチル（２０ｍｌ）を加え、これを水（１０ｍｌ×２）で洗浄した。酢酸エチル層を乾燥（ＭｇＳＯ４）した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kieselgel 60，２０ｇ：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝５：５：１で溶出）で２回精製すると１−［（３Ｓ）−３−［Ｎアルフア−（２−キノリルカルボニル）−Ｌ−アスパラギニル］アミノ−２−オキソ−４−フェニルブチリル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−プロリンアミド（化合物４：２０ｍｇ，４０.２％）が白色粉末晶として得られた。
ＳＩＭＳ(ｍ／ｚ)：６１５（ＭＨ+）
1Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3）δ：1.16(3H,s),1.20-1.37(6H,m),1.70-2.35(4H,m),2.56-3.78(6H,m),4.38-4.60(1H,m),4.92-5.1(1H,m), 5.1-5.35(1H,m),5.35-5.55(1H,m),5.80-6.12(1H,m),6.4-6.57(1H,m),6.95-7.29(5H,m),7.46-7.93(4H,m),8.09-8.35(3H,m),9.25-9.48(1H,m)ｍｐ １１５−１１８℃
【００４６】
【配列表】配列番号：１配列の長さ：１２配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列AATTCTATGC CA 12
【００４７】配列番号：２配列の長さ：１２配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列GATACGGTCT AG 12
【００４８】配列番号：３配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列CTAGCTAGCT AGAATTCTAG CTAGCTAG 28
【００４９】配列番号：４配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列Ser Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu 1 5 10
【００５０】配列番号：５配列の長さ：７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド
【特許請求の範囲】
【請求項１】式
【化１】
［式中、環Ａは５〜７員環を示し、Ｒ1，Ｒ2はともに水素原子を示すか、または結合して縮合環を形成していてもよく、Ｒ3はエステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基を示し、Ｒ4は水素原子またはアシル基を示し、Ｘは
【化２】
で表わされるアスパラギン誘導体およびその塩。
【請求項２】請求項１記載のアスパラギン誘導体を含有してなるレトロウイルス性疾患治療剤。
【請求項１】式
【化１】
［式中、環Ａは５〜７員環を示し、Ｒ1，Ｒ2はともに水素原子を示すか、または結合して縮合環を形成していてもよく、Ｒ3はエステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基を示し、Ｒ4は水素原子またはアシル基を示し、Ｘは
【化２】
で表わされるアスパラギン誘導体およびその塩。
【請求項２】請求項１記載のアスパラギン誘導体を含有してなるレトロウイルス性疾患治療剤。
【公開番号】特開平５−１７８８２４
【公開日】平成５年（１９９３）７月２０日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平４−１５９６７８
【出願日】平成４年（１９９２）６月１８日
【出願人】（０００００２９３４）武田薬品工業株式会社 (396)
【公開日】平成５年（１９９３）７月２０日
【国際特許分類】
【出願日】平成４年（１９９２）６月１８日
【出願人】（０００００２９３４）武田薬品工業株式会社 (396)
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