アスペルギルス・テレウスの変異株によるトリオール酸（Ｉ）の新規発酵
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明はアスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus）の変異株を用いた少くとも５．２ｇ／リットルの７−〔１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒドロ−２（Ｓ），６（Ｒ）−ジメチル−８（Ｓ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）ナフチル〕−３（Ｒ），５（Ｒ）−ジヒドロキシヘプタン酸（トリオール酸、Ｉ）を生産し、かつ以下で定義されるようなトリオール酸関連副産物の生成が０．８５ｇ／リットル以下及びロバスタチンの生成が０．１０mg／リットル未満である新規発酵プロセスで有用なアスペルギルス・テレウス株に関する。
【０００２】トリオール酸（Ｉ）はコレステロール生合成に関与する酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−CoA)レダクターゼの阻害剤である。その酵素の阻害剤として、トリオール酸は抗高コレステロール血症剤として有用である。更にそれは他の抗高コレステロール血症剤、特にポリヒドロナフチル環の８位に様々な側鎖を有する化合物の製造用中間体としても有用である。例えば、その部位に２，２−ジメチルブチリルオキシ側鎖を有するシンバスタチンは、米国特許第４，４４４，７８４号明細書に記載された操作に従い出発物質としてトリオール酸のラクトン体を用いて製造できる。本発明は詳しくは、少なくとも５．２ｇ／リットルのトリオール酸（Ｉ）を０．８５ｇ／リットル以下のトリオール酸関連副産物及び０．１０mg／リットル未満のロバスタチンと共に産生することができるアスペルギルス・テレウスの株ＭＦ−５５４４、ＡＴＣＣ７４０６４及びその変異株に関する。本発明はここで開示されたアスペルギルス・テレウス株を培養して主要発酵産物としてトリオール酸を産生させる発酵プロセスにも関する。
【０００３】高コレステロール血症は西洋諸国における死亡及び廃疾の筆頭原因であるアテローム性動脈硬化症及び冠状心疾患に関する主要リスクファクターの１つとして知られる、胆汁酸金属イオン封鎖剤は抗高コレステロール血症剤として中程度に有用と思われるが、それらは多量に、即ち一度に数グラム用いられねばならず、しかもそれらは美味とはとても言えない。現在市販されるメバコール（ＭＥＶＡＣＯＲ・商標）（ロバスタチン）はＨＭＧ−CoA レダクターゼ酵素を阻害してコレステロール生合成を制限することにより機能する非常に活性の強い抗高コレステロール血症剤のグループの１つである。天然発酵産物メバスタチン及びロバスタチンに加えて、それらの様々な半合成及び全合成アナログが存在する。例えば、８−アシル部分が２，２−ジメチルブチリルオキシであるシンバスタチンはロバスタチンよりも更に一層強力なＨＭＧ−CoA レダクターゼ阻害剤である。シンバスタチンは一部の市場でゾコール（ＺＯＣＯＲ・商標）として現在市販されている。ここで開示されたプロセスで産生されるトリオール酸（Ｉ）は、その対応ジオールラクトン（II）へラクトン化されて、ポリヒドロナフチル部分を有し、ＨＭＧ−CoA レダクターゼ阻害剤として機能するシンバスタチンや他の８−エステルアナログ及び誘導体の形成用の出発物質として役立つ。
【０００４】前記ジオールラクトン（II）はエンドーらの公開日本特許出願第８６−１３７９８号明細書（１９８６年）に記載されたようにモナスカス・ルバー（Monascusruber）の発酵により生産されている。遠藤ら、ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（J.Antibiotics)，第３９巻，第１６７０頁，１９８９年による更に最近の文献では、メビノリン（ロバスタチン）及びトリオール酸（Ｉ）を産生するモナスクス・ルバーの様々な株が開示されている。更に、トリオール酸（Ｉ）及びその対応ジオールラクトン（II）は８−（α−メチルブチリルオキシ）基の化学的加水分解によりロバスタチンから産生されている。しかしながら、アスペルギルス・テレウスの培養物を用いてトリオール酸を高収率で形成し、かつトリオール酸関連副産物の産生が最少であるようなトリオール酸（Ｉ）の産生に関しては当業界で教示又は示唆が全くない。実際に、いずれかの微生物により最少のトリオール酸関連副産物産生でかつトリオール酸（Ｉ）が高収率で形成されうるという教示又は示唆は従来技術に存在していない。注目されるように、分離困難なこれらのトリオール酸関連副産物が非常に少量しか形成されないことは本発明の重要な利点である。
【０００５】以下本発明を詳細に説明する。本発明はアスペルギルス・テレウスの培養物を用いた７−〔１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒドロ−２（Ｓ），６（Ｒ）−ジメチル−８（Ｓ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−ナフチル〕−３（Ｒ），５（Ｒ）−ジヒドロキシヘプタン酸（トリオール酸、Ｉ）の新規発酵生産に関する。トリオール酸（Ｉ）は更にラクトン化条件下でその対応ジオールラクトン（II）に変換してもよい。
【化５】
本発明は有意な量のトリオール酸（Ｉ）を産生することがわかったアスペルギルス・テレウスの新規株に関するが、これはアスペルギルス・テレウスが今まで８位エステル側鎖を有する化合物のみを産生するとして知られていた事実からみて意外な発見である。すなわち本発明は、アスペルギルス・テレウスの菌株であって、アスペルギルス・テレウスのロバスタチン産生株の変異誘発から形成され、上記菌株がロバスタチン収率０．００２％未満の形成で上記化合物（Ｉ）を形成することが出来る菌株である。また本発明は、ロバスタチン収率０．００２％未満の形成で化合物（Ｉ）を形成することが出来るＭＦ−５５４４、ＡＴＣＣ７４０６４の菌株又はその変異株である。さらに化合物（Ｉ）の形成に適した条件下で上記微生物を培養し、化合物を回収することから成る化合物（Ｉ）の形成方法である。さらに本発明は、上記の菌株を含んで成る培養物組成物である。
【０００６】本発明に含まれるアスペルギルス・テレウスの新規株は、それらが少なくとも５．２ｇ／リットルのトリオール酸（Ｉ）を生産ししかも１ｇ／リットル以下のトリオール酸関連副産物及び特に０．１０mg／リットル未満（＜０．００２％）のロバスタチンしか産生しないという事実で特徴付けられる。“トリオール酸関連副産物”という用語は、共役デセン環系のためにλmax ＝２３８nmのＵＶスペクトルを示すポリヒドロナフチル構造を有する、（Ｉ）及び（II）以外のあらゆるＨＭＧ−CoA レダクターゼ阻害剤を意味するとしてここでは定義される。本発明に含まれるアスペルギルス・テレウスの新規株が高収率でトリオール酸を産生するが少量のトリオール酸関連副産物しか産生しない、特にロバスタチンを産生しない（＜０．００２％）という事実は、この分野における従来技術からみて予想外かつ意外である。
【０００７】トリオール酸関連副産物はトリオール酸自体と構造上似ており、このため関係産物であるトリオール酸から分離することが困難である。これらのトリオール酸関連副産物が非常に少量しか形成されないことは本発明の重要な利点である。本発明に含まれるアスペルギルス・テレウスの新規株は、公けに入手しうるアスペルギルス・テレウスのロバスタチン産生株を変異誘発して得ることができる。例えば、米国特許第４，２３１，９３８号明細書は受理 No.ＡＴＣＣ２０５４１としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託されたロバスタチン産生株ＭＦ−４８３３について記載している。このような株は変異誘発、例えばＵＶ処理、ニトロソグアニジン及びソラレン架橋変異誘発に付してよい。変異誘発の程度は栄養要求性、即ち親株による正常代謝及び再生産に必要な最小要素を超えた特定の生育因子を変異株が要求すること、により決定される。別のモニターリングシステムでは挿入色素アクリフラビンを用いる。この色素は１０5 胞子／プレートでまいた場合に親ロバスタチン産生株を全く増殖させないが、変異誘発後には約３〜５コロニー／プレートで増殖が起る。変異株は再単離後、プールされて、更に変異誘発に付され、これら操作の反復により、本発明が関与する株の定義内に属するアスペルギルス・テレウスの変異株が得られる。
【０００８】通常は親株において過剰の有害変異の蓄積を避けるために穏やかな変異誘発をめざす。しかしながら、トリオール産生ＭＦ−５５４４変異株は強力な変異誘発物質ニトロソグアニジンによる比較的過酷な変異誘発後に単離された。前記変異誘発操作と実施例１の詳細な記載を用いて、高力価のトリオール酸（Ｉ）と検出しえない量（０．１０mg／リットル未満）のロバスタチン及び０．８５ｇ／リットル未満のトリオール酸関連化合物を生じるアスペルギルス・テレウスの株をつくることができる。
【０００９】アスペルギルス・テレウスＭＦ−５５４４は１４日間で５．９５ｇ／リットルに達するトリオール酸を産生する。少量（０．８５ｇ／リットル未満）のトリオール関連化合物も産生されるが、但しロバスタチンの産生はない（０．１０mg／リットル未満）。前記変異誘発操作及び実施例は充分に実施可能なトリオール酸（Ｉ）の形成経路を提供する。特定株ＭＦ−５５４４はブダペスト条約に従いＡＴＣＣ７４０６４としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された。この寄託は本発明の実施上最良の態様を与えるために行われた。アスペルギルス・テレウス株ＭＦ−５５４４は下記の形態学的特徴を示す：
【００１０】コロニーは２０℃で１２時間−１２時間の明／暗下、酵母−麦芽エキス寒天〔ディフコ(Difco) 〕上で７日間で径１０mmに達する；３７℃では７日間で同培地上で径３４mmに達する；２０℃、オートミール寒天（ディフコ）上では径１２mmに達する；３７℃、オートミール寒天（ディフコ）上では径４５mmに達する。コロニーは２０℃の増殖と比較すると３７℃では明らかに放射状にひだ即ち褶曲が形成される。２０℃で酵母−麦芽エキス寒天上、コロニーは深さ０．５mm以内に達し、わずかに台状でビロード状〜わずかに綿毛状で鈍い光沢があり、端部沈降し、全縁で、端部で透明〜淡黄色状バフ色又は淡いピンクがかったバフ色、明バフ色（Light Buff）、淡オーカーバフ色（Pale Ochraceous-Buff）、淡ピンク状シナモン色（Pale Pinkish Cinnamon)〔リジウェイ，Ｒ.(Ridgway,R.),１９１２年，カラースタンダード及び名称（Color Standards and Nomenclature),ワシントン，Ｄ．Ｃ．による大文字化色名〕、すぐにピンクがかったバフ色〜ピンクがかった褐色、ピンク状バフ色（Pinkish Baff) 、明ピンクがかったシナモン色（Light Pinkish Cinnamon）、バフピンク色（Buff Pink)、シナモンバフ色（Cinnamon-Buff)になり、最後に端部で濁ピンク状タン皮色、ピンクがかったシナモン色、シナモン色（Cinnamon) 、クレー色（Clay Color) 、裏面は緑が濁黄灰色〜クリーム黄色、クリーム色（Cream Color)、明バフ色（Light Buff) 、暖バフ色（Warm Buff)、但しすぐに黄色〜オーカー色、コロニアルバフ色（Colonial Buff)、深コロニアルバフ色（Deep Colonial Buff) 、セーム革色（Chamois)、黄オーカー色（Yellow Ochre）であり、黄色拡散性色素がコロニーの端部から寒天中に数mm滲出している。
【００１１】分生子柄は柄足細胞から生じ、高さ１２０〜１９０μｍ、幅４．５〜６．５μｍ、直線状又は屈曲状で、時々不規則的にくびれ、頂嚢のすぐ下でわずかにくびれていることが多く、厚壁で、壁は約０．５μｍ厚、滑らかで無色である。分生子頭は分生子柱の頂部で径５０〜１００μｍ、二段梗子で分生子産生細胞群がメトレ（metulae)から生じ、円柱状で、分生子鎖は経時的にやや裂け出し、最初は白色だが、但しすぐに淡ピンク色になり、成熟時には均一にピンクがかったバフ色である。分生子産生細胞は小瓶状で、１〜５個、通常３〜４個５〜１０個（１．５〜３μｍ）の群でメトレから生じ、円柱状で、末端はつぼまるか、又はややひらいたカラレット状である。メツラは広い円柱状〜やや棍棒状で、周辺のメトレは上方に曲がり、６〜１０×２．５〜４．５μｍである。頂嚢は径１０〜２６μｍで、亜球状〜半球状であり、上部４０〜６０％がメトレでおおわれている。分生子は径１．５〜４μｍ、球状〜やや球状、滑らか、KOH 中無色で、無色接合部で鎖状に付着している。菌糸は隔壁を有し、滑らかで、高度に分岐し、径１０μｍ以内で、厚い方の菌糸は屈折率の高い内容物を含み、古くなった内部菌糸は側部及び末端厚膜胞子（“粉状胞子”）を産生する。厚膜胞子は出芽で生じ、豊富で、径６〜１０μｍ、球状〜やや球状、無色で屈折率の高い内容物を含む。ヒュール（Hulle)細胞、菌核及び閉子嚢果は存在しない。
【００１２】培地本発明に含まれるアスペルギルス・テレウスの変異株の発酵は他の発酵産物の産生に用いられるような水性培地で行われる。このような培地は微生物により同化しうる炭素源、窒素源及び無機塩を含有している。一般に、糖、例えばラクトース、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、キシロース、マンニトール等のような炭水化物及び穀物、例えばオート麦、ライ麦、コーンスターチ、コーンミール等のようなデンプンが栄養培地中で資化性炭素源として単独で又は組合せていずれかで用いることができる。培地に用いられる炭水化物源の正確な量は培地の他の成分にもよるが、一般に炭水化物の量は通常培地の約１８〜３５重量％である。これらの炭素源は個別的に用いても又はこのような数種の炭素源が培地で組合されてもよい。一般に多くのタンパク質物質が発酵プロセスで窒素源として用いられる。適切な窒素源としては、例えば酵母加水分解産物、プライマリイースト、大豆ミール、綿実粉、カゼインの加水分解産物、コーンスチープリカー、ディスティラーズソリュブル又はトマトペーストがある。窒素源は単独で又は組合せて、水性培地の約５〜６０重量％範囲の量で用いられる。
【００１３】培地に配合できる栄養無機塩としてはナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸、硫酸、塩化物、炭酸等のイオンを生じることができる常用塩がある。コバルト、マンガン、鉄及びマグネシウムのような微量金属も含有される。実施例で記載された培地は用いてよい様々な培地の単なる例示であって、限定するためのものではない。特に、トリオール酸産生培地で用いられる炭素源としてはデキストロース、デキストリン、オート粉、オートミール、糖蜜、クエン酸塩、大豆油、グリセロール、麦芽エキス、タラ肝油、デンプン、エタノール、イチジク、アスコルビン酸ナトリウム及びラード油がある。窒素源としてはペプトン化ミルク、自己消化酵母、酵母ＲＮＡ、トマトペースト、カゼイン、プライマリイースト、ピーナツミール、ディスティラーズソリュブル、コーンスチープリカー、大豆ミール、コーンミール、NZアミン、ビーフエキス、アスパラギン、綿実ミール及び硫酸アンモニウムがある。主要イオン成分はCaCO3 、KH2PO4、MgSO4 ・７H2O 及びNaClであり、少量の CoCl2・６H2O 及び微量のMn、Mo、Ｂ及びCuも存在してよい。諸成分を１リットルフラスコに入れ、容量を蒸留水で１リットルに調整する。pHは培地を継続的に攪拌しながら４０％NaOHで７．０に調整し、pHは１５分間かけて安定化する。培地はバッフルなしの２５０mlフラスコ内に３０mlずつ分注し、そのまま１２１℃で２０分間オートクレーブ処理する。次いでこれらのフラスコを実施例１に記載する種接種原で接種する。
【００１４】発酵プロセス及び条件好ましい実施態様では、発酵は約２０〜３７℃範囲の温度で行われるが、しかしながら最良の結果を得るには約２２〜３０℃の温度で発酵を行うことが好ましい。アスペルギルス培養物を増殖させてトリオール酸を産生するのに適した栄養培地のpHは約６．０〜８．０である。トリオール酸は表面及び深部双方の培養で産生されるが、深部状態で発酵を行うことが好ましい。小規模発酵は適切な栄養培地にアスペルギルス培養物を接種し、産生培地に移した後、約２８℃の一定温度で数日間シェーカー上で進めることにより都合よく行われる。
【００１５】発酵は１回以上の種菌展開段階を経て培地の入った滅菌フラスコ内で開始する。種菌段階用の栄養培地は炭素及び窒素源の適切ないかなる組合せであってもよい。種菌フラスコは約２８℃の定温室内で２日間又は十分増殖するまで振盪し、得られた増殖物の一部を第二段階種菌用又は産生培地のいずれかに接種するために用いる。中間段階種菌フラスコを用いる場合も、実質上同様に行う、即ち最後の種菌段階のフラスコ内容物の一部を用い産生培地に接種する。接種したフラスコは一定温度で数日間振盪し、インキュベート期間の最後にフラスコの内容物を遠心又は濾過する。
【００１６】大規模培養の場合には、攪拌機及び発酵培地通気手段を備えた適切なタンク内で発酵を行うことが好ましい。この方法によれば、栄養培地はタンク内で調製され、約１２０℃の温度で加熱することにより滅菌される。冷却後、滅菌された培地に予め増殖させた産生培養用種菌を接種し、発酵は栄養培地を攪拌及び／又は通気して約２８℃の温度に維持しながら一定期間、例えば３〜１６日間にわたり続ける。このトリオール酸産生方法は特に大量の製造に適している。
【００１７】発酵産物の単離トリオール酸は主としてヒドロキシカルボキシレート（開環ラクトン）形で発酵ブロス中に存在する。ＭＦ−５５４４発酵の全ブロス抽出はロバスタチン全ブロス抽出の場合（米国特許第４，２３１，９３８号）と同様の操作を用いて行われるのが好ましい。ＨＰＬＣ追跡分析では、全ブロス中に存在する夾雑物のほとんどがpH３．５〜４．５に調整してから行う初めの酢酸イソプロピル（ＩＰＡＣ）抽出で除去され、同時にトリオールの７０〜７２％がこの工程で回収されることを示した。この後に炭酸塩抽出（pH１１〜１２）を行ったが、トリオール酸の損失は非常に少なかった。炭酸塩層の最終的ＩＰＡＣ抽出（pH３．５〜４．５）を行って有機相中にトリオール酸を回収するが、収率の減少はほとんどない。
【００１８】ラクトン化本発明のプロセスによるアスペルギルス・テレウス株の発酵では主産物としてトリオール酸を生じる。トリオール酸のラクトン化は標準操作、即ち加熱又は酸触媒ラクトン化のいずれかを用いて行われる。ロバスタチン関連化合物の酸触媒ラクトン化に関する操作は米国特許第４，９１６，２３９号明細書に記載されている。
【実施例】
【００１９】実施例１７−〔１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒドロ−２（Ｓ），６（Ｒ）−ジメチル−８（Ｓ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−ナフチル〕−３（Ｒ），５（Ｒ）−ジヒドロキシヘプタン酸（トリオール酸Ｉ）の製造（ａ）ニトロソグアニド変異誘発とＨＰＬＣアッセイ変異誘発：１）アスペルギルス・テレウスのロバスタチン産生株の純粋培養物をＹＭＥ＋ＴＥの斜面上に画線接種し、通常の室内ケイ光照射下２８℃で増殖させた。
２）５〜７日間後、無菌保存原液（５％ラクトース、１０％グリセロール、０．００５％ＮＰ・４０）２mlを各斜面に加え、表面を滅菌白金耳で静かにこすって分生子柄を遊離させた。
３）胞子懸濁液を滅菌０．５mmガラスビーズ約２５個の入ったスクリューキャップ管に移し、約１分間攪拌した。胞子を血球計数器でカウントし、貯蔵溶液で１×１０8 胞子／mlに希釈した。胞子懸濁液を使用時まで−８０℃で貯蔵した。
４）上記胞子懸濁液１mlずつ４個のスナップキャップ遠心管にいれ、３０００×ｇ、４℃で５分間遠心した。上清を捨て、各胞子ペレットをボルテックスミキサーで攪拌してリン酸緩衝液（pH７の１００mMリン酸ナトリウム、０．００５％ＮＰ・４０）０．９mlに再懸濁した。
５）３本の管に１mg／mlＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎ′−ニトログアニジン０．１mlを加え、水０．１mlを四番目に加えた。混和後、管を２８℃でインキュベートした。コントロールは直ちに３０００ｇ、４℃で５分間遠心した。他の３本の管も同様に各々１５，３０及び６０分間遠心した。各遠心の直後に上清を捨て、胞子を上記リン酸緩衝液１mlに再懸濁した。
６）胞子の入った各管を水で１：１０4 、１：１０5 及び１：１０6 に希釈した。各希釈液５０μｌを数枚のＹＭＥ＋ＴＥプレート上にまき（２５ml／１００mmプレート）、プレートを室内ケイ光燈下２８℃でインキュベートした。４日間後にコロニーを（計数可能な数を有するプレートについて）カウントした。
７）更に２日間後、元の胞子の１０〜５０％のみが生存するように胞子を変異誘発したプレートから個々のコロニーを取出した。取出されたコロニーを用いてＹＭＥ＋ＴＥ斜面に接種し、これを前記のように増殖させた。
８）選択した変異株を植えた斜面が胞子形成したら、胞子懸濁液を前記のように調製し、種培地（５×１０6 胞子／ml培地；２５０mlバッフルなしフラスコ中４０ml）に接種した。２８時間後、種菌を発酵培地（１０％持ち込み容量；２５０mlバッフルなしフラスコ中発酵培地３０ml）に接種した。すべてのフラスコをニューブランスウィックＧ−５３（New Brunswick Ｇ−５３）シェーカーで２２０rpm 、２８℃で振盪した。
９）８日間の発酵後に１倍容量のメタノールを各フラスコに加え、フラスコを３０分間攪拌し、内容物を静置し、上清をトリオール及び他のブロス成分の存在に関してＨＰＬＣにより調べた。
【００２０】培養抽出物のＨＰＬＣアッセイ抽出物はワットマン・パーティシル（Whatman Partisil）５Ｃ８（４．６mm×２５cm）カラム上１．５ml／min でポンプ駆動される４５％アセトニトリル及び５５％リン酸の均一移動相条件下ＨＰＬＣにより分析した。検出波長は２３５nmであった。トリオール産物はトリオールアンモニウム塩標準との比較でそれらの特徴的ＵＶスペクトル及び保持時間により同定した。
【００２１】ｂ）斜面培養物の調製アスペルギルス・テレウスＭＦ−５５４４の培養物はキャップ付ガラス管中ＹＭＥ＋ＴＥ培地（８ml）含有寒天斜面上で培養して維持した。培養物を２７．５℃で５〜７日間斜面上で生育させ、４℃で１か月まで貯蔵し、斜面を種フラスコ用の接種原として用いた。ＹＭＥ＋ＴＥ培地は下記組成を有する：
【表１】
ＹＭＥ＋ＴＥ培地（寒天斜面）：酵母エキス ４．０ｇ／リットル麦芽エキス １０．０ｇ／リットルグルコース ４．０ｇ／リットル微量元素＃２ ５．０ｇ／リットル寒天 ２０．０ｇ／リットルNaOHでpH７．０に調整。１２１℃で２０分間のオートクレーブ処理。
【表２】
微量元素＃２FeSO4 ・７H2O １０００mg／リットルMnSO4 ・H2O １０００mg／リットルCuCl2 ・２H2O ２５mg／リットルCaCl2 １００mg／リットルH3BO3 ５６mg／リットル(NH4)6Mo７０２４・４H2O １９mg／リットルZnSO4 ・７H2O ２００mg／リットル０．６N HCl で調整し、５℃で貯蔵最大力価は下記成分を有する“ＨＬＣ”種培地で生育させた種接種原を用いて得られた：
【表３】
アルダミンpHはチャンプレイン・インダストリーズ（Champlain Industries）から入手でき、ブレンドされた一次増殖酵母及びビール酵母である。ファーマメディア（Pharmamedia)はトレーダーズ・プロテイン・カンパニー（Trader's Protein Company) から購入し、“綿実粉”である。上記成分の各々を蒸留水に連続的に加え、次を加える前によく溶解させた。蒸留水８００mlを最終容量１０００mlになるまで加え、pHを４０％NaOHで７．０に調整し、１０分間安定化させた。培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。滅菌後pHは６．５〜６．６となっているべきである。
【００２２】ｃ）発酵による産生種フラスコ用接種原を調製するため、寒天斜面の１本分内容物を蒸留水又は生理食塩水（０．７％NaCl) ５mlでかきとった。この接種原１mlをオートクレーブで滅菌したＨＬＣ種培地４０ml含有２５０mlバッフルなしエーレンマイヤーフラスコに加えた（あるいは実施例２のように、ラクトース／グリセロール胞子懸濁液１mlを用いることもできる）。ＨＬＣ種フラスコをロータリーシェーカー上２２０rpm.２７．５℃で２４〜２６時間インキュベートし、このフラスコの内容物１mlを滅菌ＧＰ−９産生培地（下記参照）３０ml含有２５０mlバッフルなしエーレンマイヤーフラスコに接種した。このフラスコをロータリーシェーカー上２２０rpm 、２７．５℃で４〜１４日間インキュベートした。最大トリオール酸産生は１４日目にみられた。
【００２３】ｄ）トリオール酸の抽出トリオールは下記のように酢酸イソプロピル（ＩＰＡＣ）を用いた液−液抽出により発酵ブロスから回収した（２リットル；最初ＨＰＬＣ分析により５．９８ｇ／リットル）：ブロスのpHを１０％硫酸（６０ml）で４．０〜４．５に調整し、ブロスをＩＰＡＣ（１：３４リットル）と混ぜ、遠心した。ＩＰＡＣ層を回収し、pH１１．５の炭酸ナトリウム溶液（４００ml）と混ぜて非極性成分を除去した。次いで豊富炭酸塩層（トリオール含有）を８５％リン酸（１２ml）でpH４．０に調整後ＩＰＡＣ（４５０ml）に逆抽出した。
【００２４】ｅ）ラクトン化７０％メタンスルホン酸（ＭＳＡ）（８７μｌ；２mM）を実施例１（ｄ）のＩＰＡＣ層に加え、溶液をその原容量（１００ml）の〜１／５蒸発濃縮した。濃縮／ラクトン化の完了をＨＰＬＣ分析で確認した後、ＩＰＡＣを炭酸ナトリウム溶液（１００ml）と混ぜて荷電種を除去した。ジオールラクトンは−２０℃でＩＰＡＣ層から結晶化した。
【００２５】実施例２米からの凍結分生子の調製アスペルギルス・テレウスＭＦ−５５４４培養物は凍結胞子懸濁物として維持することができる。“アンクルベン転化長粒米”（Uncle Ben's Converted LongGrain Rice)２５０ｇを２８００mlエーレンマイヤーフラスコ中において水が透明になるまで水洗した。フラスコから水を捨て、フラスコを１２１℃で３０分間オートクレーブ処理して滅菌した。冷却後、米含有フラスコを（かきとりにより蒸留水又は塩水（０．７％NaCl）５mlに懸濁された）１斜面分の内容物を接種し、振盪してから２７．５℃で１２〜１６日間インキュベートした。胞子を回収するため、５％ラクトース／１０％グリセロール含有溶液２５０〜５００mlを加え、フラスコを振盪し、滅菌ステンレススチールメッシュ通して濾液を集めた。ラクトース／グリセロール胞子懸濁液を−９０℃で凍結し、前記実施例１のようにＨＬＣ種フラスコ用の接種原として用いた。
【００２６】実施例３アンモニウム塩の形成細胞ペレット及び／又は細胞砕片を濾過又は遠心により産生フラスコから除去した。次いでこのプロセスからの濾液又は上清を工程１ｄで示したように抽出するか又は濾液を用いてトリオール酸のアンモニウム塩を単離した。推定トリオール力価２９．８３ｇ／リットルのＩＰＡＣ流（５ml）を硫酸マグネシウムで脱水し、しかる後焼結ガラスロートで濾過した。メタノール（０．２ml）を加え、混合液を氷浴（０℃）につけ、水酸化アンモニウム：メタノール（１：３）溶液０．０３mlを加えた。混合液にトリオールアンモニウム塩１mgを核として入れ、３０分間エージングした。温度を−８℃に下げ、水酸化アンモニウム：メタノール（１：３）０．０３mlを２時間にわたり１５分間毎に加えた。得られた濃厚スラリーを濾過して、象牙色結晶を得た。ここで特許請求されたアスペルギルス・テレウス株の培養物は式（Ｉ）の化合物の形成にとり有害である生存汚染微生物を含まないとして定義される。
【０００１】本発明はアスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus）の変異株を用いた少くとも５．２ｇ／リットルの７−〔１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒドロ−２（Ｓ），６（Ｒ）−ジメチル−８（Ｓ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）ナフチル〕−３（Ｒ），５（Ｒ）−ジヒドロキシヘプタン酸（トリオール酸、Ｉ）を生産し、かつ以下で定義されるようなトリオール酸関連副産物の生成が０．８５ｇ／リットル以下及びロバスタチンの生成が０．１０mg／リットル未満である新規発酵プロセスで有用なアスペルギルス・テレウス株に関する。
【０００２】トリオール酸（Ｉ）はコレステロール生合成に関与する酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−CoA)レダクターゼの阻害剤である。その酵素の阻害剤として、トリオール酸は抗高コレステロール血症剤として有用である。更にそれは他の抗高コレステロール血症剤、特にポリヒドロナフチル環の８位に様々な側鎖を有する化合物の製造用中間体としても有用である。例えば、その部位に２，２−ジメチルブチリルオキシ側鎖を有するシンバスタチンは、米国特許第４，４４４，７８４号明細書に記載された操作に従い出発物質としてトリオール酸のラクトン体を用いて製造できる。本発明は詳しくは、少なくとも５．２ｇ／リットルのトリオール酸（Ｉ）を０．８５ｇ／リットル以下のトリオール酸関連副産物及び０．１０mg／リットル未満のロバスタチンと共に産生することができるアスペルギルス・テレウスの株ＭＦ−５５４４、ＡＴＣＣ７４０６４及びその変異株に関する。本発明はここで開示されたアスペルギルス・テレウス株を培養して主要発酵産物としてトリオール酸を産生させる発酵プロセスにも関する。
【０００３】高コレステロール血症は西洋諸国における死亡及び廃疾の筆頭原因であるアテローム性動脈硬化症及び冠状心疾患に関する主要リスクファクターの１つとして知られる、胆汁酸金属イオン封鎖剤は抗高コレステロール血症剤として中程度に有用と思われるが、それらは多量に、即ち一度に数グラム用いられねばならず、しかもそれらは美味とはとても言えない。現在市販されるメバコール（ＭＥＶＡＣＯＲ・商標）（ロバスタチン）はＨＭＧ−CoA レダクターゼ酵素を阻害してコレステロール生合成を制限することにより機能する非常に活性の強い抗高コレステロール血症剤のグループの１つである。天然発酵産物メバスタチン及びロバスタチンに加えて、それらの様々な半合成及び全合成アナログが存在する。例えば、８−アシル部分が２，２−ジメチルブチリルオキシであるシンバスタチンはロバスタチンよりも更に一層強力なＨＭＧ−CoA レダクターゼ阻害剤である。シンバスタチンは一部の市場でゾコール（ＺＯＣＯＲ・商標）として現在市販されている。ここで開示されたプロセスで産生されるトリオール酸（Ｉ）は、その対応ジオールラクトン（II）へラクトン化されて、ポリヒドロナフチル部分を有し、ＨＭＧ−CoA レダクターゼ阻害剤として機能するシンバスタチンや他の８−エステルアナログ及び誘導体の形成用の出発物質として役立つ。
【０００４】前記ジオールラクトン（II）はエンドーらの公開日本特許出願第８６−１３７９８号明細書（１９８６年）に記載されたようにモナスカス・ルバー（Monascusruber）の発酵により生産されている。遠藤ら、ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（J.Antibiotics)，第３９巻，第１６７０頁，１９８９年による更に最近の文献では、メビノリン（ロバスタチン）及びトリオール酸（Ｉ）を産生するモナスクス・ルバーの様々な株が開示されている。更に、トリオール酸（Ｉ）及びその対応ジオールラクトン（II）は８−（α−メチルブチリルオキシ）基の化学的加水分解によりロバスタチンから産生されている。しかしながら、アスペルギルス・テレウスの培養物を用いてトリオール酸を高収率で形成し、かつトリオール酸関連副産物の産生が最少であるようなトリオール酸（Ｉ）の産生に関しては当業界で教示又は示唆が全くない。実際に、いずれかの微生物により最少のトリオール酸関連副産物産生でかつトリオール酸（Ｉ）が高収率で形成されうるという教示又は示唆は従来技術に存在していない。注目されるように、分離困難なこれらのトリオール酸関連副産物が非常に少量しか形成されないことは本発明の重要な利点である。
【０００５】以下本発明を詳細に説明する。本発明はアスペルギルス・テレウスの培養物を用いた７−〔１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒドロ−２（Ｓ），６（Ｒ）−ジメチル−８（Ｓ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−ナフチル〕−３（Ｒ），５（Ｒ）−ジヒドロキシヘプタン酸（トリオール酸、Ｉ）の新規発酵生産に関する。トリオール酸（Ｉ）は更にラクトン化条件下でその対応ジオールラクトン（II）に変換してもよい。
【化５】
本発明は有意な量のトリオール酸（Ｉ）を産生することがわかったアスペルギルス・テレウスの新規株に関するが、これはアスペルギルス・テレウスが今まで８位エステル側鎖を有する化合物のみを産生するとして知られていた事実からみて意外な発見である。すなわち本発明は、アスペルギルス・テレウスの菌株であって、アスペルギルス・テレウスのロバスタチン産生株の変異誘発から形成され、上記菌株がロバスタチン収率０．００２％未満の形成で上記化合物（Ｉ）を形成することが出来る菌株である。また本発明は、ロバスタチン収率０．００２％未満の形成で化合物（Ｉ）を形成することが出来るＭＦ−５５４４、ＡＴＣＣ７４０６４の菌株又はその変異株である。さらに化合物（Ｉ）の形成に適した条件下で上記微生物を培養し、化合物を回収することから成る化合物（Ｉ）の形成方法である。さらに本発明は、上記の菌株を含んで成る培養物組成物である。
【０００６】本発明に含まれるアスペルギルス・テレウスの新規株は、それらが少なくとも５．２ｇ／リットルのトリオール酸（Ｉ）を生産ししかも１ｇ／リットル以下のトリオール酸関連副産物及び特に０．１０mg／リットル未満（＜０．００２％）のロバスタチンしか産生しないという事実で特徴付けられる。“トリオール酸関連副産物”という用語は、共役デセン環系のためにλmax ＝２３８nmのＵＶスペクトルを示すポリヒドロナフチル構造を有する、（Ｉ）及び（II）以外のあらゆるＨＭＧ−CoA レダクターゼ阻害剤を意味するとしてここでは定義される。本発明に含まれるアスペルギルス・テレウスの新規株が高収率でトリオール酸を産生するが少量のトリオール酸関連副産物しか産生しない、特にロバスタチンを産生しない（＜０．００２％）という事実は、この分野における従来技術からみて予想外かつ意外である。
【０００７】トリオール酸関連副産物はトリオール酸自体と構造上似ており、このため関係産物であるトリオール酸から分離することが困難である。これらのトリオール酸関連副産物が非常に少量しか形成されないことは本発明の重要な利点である。本発明に含まれるアスペルギルス・テレウスの新規株は、公けに入手しうるアスペルギルス・テレウスのロバスタチン産生株を変異誘発して得ることができる。例えば、米国特許第４，２３１，９３８号明細書は受理 No.ＡＴＣＣ２０５４１としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託されたロバスタチン産生株ＭＦ−４８３３について記載している。このような株は変異誘発、例えばＵＶ処理、ニトロソグアニジン及びソラレン架橋変異誘発に付してよい。変異誘発の程度は栄養要求性、即ち親株による正常代謝及び再生産に必要な最小要素を超えた特定の生育因子を変異株が要求すること、により決定される。別のモニターリングシステムでは挿入色素アクリフラビンを用いる。この色素は１０5 胞子／プレートでまいた場合に親ロバスタチン産生株を全く増殖させないが、変異誘発後には約３〜５コロニー／プレートで増殖が起る。変異株は再単離後、プールされて、更に変異誘発に付され、これら操作の反復により、本発明が関与する株の定義内に属するアスペルギルス・テレウスの変異株が得られる。
【０００８】通常は親株において過剰の有害変異の蓄積を避けるために穏やかな変異誘発をめざす。しかしながら、トリオール産生ＭＦ−５５４４変異株は強力な変異誘発物質ニトロソグアニジンによる比較的過酷な変異誘発後に単離された。前記変異誘発操作と実施例１の詳細な記載を用いて、高力価のトリオール酸（Ｉ）と検出しえない量（０．１０mg／リットル未満）のロバスタチン及び０．８５ｇ／リットル未満のトリオール酸関連化合物を生じるアスペルギルス・テレウスの株をつくることができる。
【０００９】アスペルギルス・テレウスＭＦ−５５４４は１４日間で５．９５ｇ／リットルに達するトリオール酸を産生する。少量（０．８５ｇ／リットル未満）のトリオール関連化合物も産生されるが、但しロバスタチンの産生はない（０．１０mg／リットル未満）。前記変異誘発操作及び実施例は充分に実施可能なトリオール酸（Ｉ）の形成経路を提供する。特定株ＭＦ−５５４４はブダペスト条約に従いＡＴＣＣ７４０６４としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された。この寄託は本発明の実施上最良の態様を与えるために行われた。アスペルギルス・テレウス株ＭＦ−５５４４は下記の形態学的特徴を示す：
【００１０】コロニーは２０℃で１２時間−１２時間の明／暗下、酵母−麦芽エキス寒天〔ディフコ(Difco) 〕上で７日間で径１０mmに達する；３７℃では７日間で同培地上で径３４mmに達する；２０℃、オートミール寒天（ディフコ）上では径１２mmに達する；３７℃、オートミール寒天（ディフコ）上では径４５mmに達する。コロニーは２０℃の増殖と比較すると３７℃では明らかに放射状にひだ即ち褶曲が形成される。２０℃で酵母−麦芽エキス寒天上、コロニーは深さ０．５mm以内に達し、わずかに台状でビロード状〜わずかに綿毛状で鈍い光沢があり、端部沈降し、全縁で、端部で透明〜淡黄色状バフ色又は淡いピンクがかったバフ色、明バフ色（Light Buff）、淡オーカーバフ色（Pale Ochraceous-Buff）、淡ピンク状シナモン色（Pale Pinkish Cinnamon)〔リジウェイ，Ｒ.(Ridgway,R.),１９１２年，カラースタンダード及び名称（Color Standards and Nomenclature),ワシントン，Ｄ．Ｃ．による大文字化色名〕、すぐにピンクがかったバフ色〜ピンクがかった褐色、ピンク状バフ色（Pinkish Baff) 、明ピンクがかったシナモン色（Light Pinkish Cinnamon）、バフピンク色（Buff Pink)、シナモンバフ色（Cinnamon-Buff)になり、最後に端部で濁ピンク状タン皮色、ピンクがかったシナモン色、シナモン色（Cinnamon) 、クレー色（Clay Color) 、裏面は緑が濁黄灰色〜クリーム黄色、クリーム色（Cream Color)、明バフ色（Light Buff) 、暖バフ色（Warm Buff)、但しすぐに黄色〜オーカー色、コロニアルバフ色（Colonial Buff)、深コロニアルバフ色（Deep Colonial Buff) 、セーム革色（Chamois)、黄オーカー色（Yellow Ochre）であり、黄色拡散性色素がコロニーの端部から寒天中に数mm滲出している。
【００１１】分生子柄は柄足細胞から生じ、高さ１２０〜１９０μｍ、幅４．５〜６．５μｍ、直線状又は屈曲状で、時々不規則的にくびれ、頂嚢のすぐ下でわずかにくびれていることが多く、厚壁で、壁は約０．５μｍ厚、滑らかで無色である。分生子頭は分生子柱の頂部で径５０〜１００μｍ、二段梗子で分生子産生細胞群がメトレ（metulae)から生じ、円柱状で、分生子鎖は経時的にやや裂け出し、最初は白色だが、但しすぐに淡ピンク色になり、成熟時には均一にピンクがかったバフ色である。分生子産生細胞は小瓶状で、１〜５個、通常３〜４個５〜１０個（１．５〜３μｍ）の群でメトレから生じ、円柱状で、末端はつぼまるか、又はややひらいたカラレット状である。メツラは広い円柱状〜やや棍棒状で、周辺のメトレは上方に曲がり、６〜１０×２．５〜４．５μｍである。頂嚢は径１０〜２６μｍで、亜球状〜半球状であり、上部４０〜６０％がメトレでおおわれている。分生子は径１．５〜４μｍ、球状〜やや球状、滑らか、KOH 中無色で、無色接合部で鎖状に付着している。菌糸は隔壁を有し、滑らかで、高度に分岐し、径１０μｍ以内で、厚い方の菌糸は屈折率の高い内容物を含み、古くなった内部菌糸は側部及び末端厚膜胞子（“粉状胞子”）を産生する。厚膜胞子は出芽で生じ、豊富で、径６〜１０μｍ、球状〜やや球状、無色で屈折率の高い内容物を含む。ヒュール（Hulle)細胞、菌核及び閉子嚢果は存在しない。
【００１２】培地本発明に含まれるアスペルギルス・テレウスの変異株の発酵は他の発酵産物の産生に用いられるような水性培地で行われる。このような培地は微生物により同化しうる炭素源、窒素源及び無機塩を含有している。一般に、糖、例えばラクトース、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、キシロース、マンニトール等のような炭水化物及び穀物、例えばオート麦、ライ麦、コーンスターチ、コーンミール等のようなデンプンが栄養培地中で資化性炭素源として単独で又は組合せていずれかで用いることができる。培地に用いられる炭水化物源の正確な量は培地の他の成分にもよるが、一般に炭水化物の量は通常培地の約１８〜３５重量％である。これらの炭素源は個別的に用いても又はこのような数種の炭素源が培地で組合されてもよい。一般に多くのタンパク質物質が発酵プロセスで窒素源として用いられる。適切な窒素源としては、例えば酵母加水分解産物、プライマリイースト、大豆ミール、綿実粉、カゼインの加水分解産物、コーンスチープリカー、ディスティラーズソリュブル又はトマトペーストがある。窒素源は単独で又は組合せて、水性培地の約５〜６０重量％範囲の量で用いられる。
【００１３】培地に配合できる栄養無機塩としてはナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸、硫酸、塩化物、炭酸等のイオンを生じることができる常用塩がある。コバルト、マンガン、鉄及びマグネシウムのような微量金属も含有される。実施例で記載された培地は用いてよい様々な培地の単なる例示であって、限定するためのものではない。特に、トリオール酸産生培地で用いられる炭素源としてはデキストロース、デキストリン、オート粉、オートミール、糖蜜、クエン酸塩、大豆油、グリセロール、麦芽エキス、タラ肝油、デンプン、エタノール、イチジク、アスコルビン酸ナトリウム及びラード油がある。窒素源としてはペプトン化ミルク、自己消化酵母、酵母ＲＮＡ、トマトペースト、カゼイン、プライマリイースト、ピーナツミール、ディスティラーズソリュブル、コーンスチープリカー、大豆ミール、コーンミール、NZアミン、ビーフエキス、アスパラギン、綿実ミール及び硫酸アンモニウムがある。主要イオン成分はCaCO3 、KH2PO4、MgSO4 ・７H2O 及びNaClであり、少量の CoCl2・６H2O 及び微量のMn、Mo、Ｂ及びCuも存在してよい。諸成分を１リットルフラスコに入れ、容量を蒸留水で１リットルに調整する。pHは培地を継続的に攪拌しながら４０％NaOHで７．０に調整し、pHは１５分間かけて安定化する。培地はバッフルなしの２５０mlフラスコ内に３０mlずつ分注し、そのまま１２１℃で２０分間オートクレーブ処理する。次いでこれらのフラスコを実施例１に記載する種接種原で接種する。
【００１４】発酵プロセス及び条件好ましい実施態様では、発酵は約２０〜３７℃範囲の温度で行われるが、しかしながら最良の結果を得るには約２２〜３０℃の温度で発酵を行うことが好ましい。アスペルギルス培養物を増殖させてトリオール酸を産生するのに適した栄養培地のpHは約６．０〜８．０である。トリオール酸は表面及び深部双方の培養で産生されるが、深部状態で発酵を行うことが好ましい。小規模発酵は適切な栄養培地にアスペルギルス培養物を接種し、産生培地に移した後、約２８℃の一定温度で数日間シェーカー上で進めることにより都合よく行われる。
【００１５】発酵は１回以上の種菌展開段階を経て培地の入った滅菌フラスコ内で開始する。種菌段階用の栄養培地は炭素及び窒素源の適切ないかなる組合せであってもよい。種菌フラスコは約２８℃の定温室内で２日間又は十分増殖するまで振盪し、得られた増殖物の一部を第二段階種菌用又は産生培地のいずれかに接種するために用いる。中間段階種菌フラスコを用いる場合も、実質上同様に行う、即ち最後の種菌段階のフラスコ内容物の一部を用い産生培地に接種する。接種したフラスコは一定温度で数日間振盪し、インキュベート期間の最後にフラスコの内容物を遠心又は濾過する。
【００１６】大規模培養の場合には、攪拌機及び発酵培地通気手段を備えた適切なタンク内で発酵を行うことが好ましい。この方法によれば、栄養培地はタンク内で調製され、約１２０℃の温度で加熱することにより滅菌される。冷却後、滅菌された培地に予め増殖させた産生培養用種菌を接種し、発酵は栄養培地を攪拌及び／又は通気して約２８℃の温度に維持しながら一定期間、例えば３〜１６日間にわたり続ける。このトリオール酸産生方法は特に大量の製造に適している。
【００１７】発酵産物の単離トリオール酸は主としてヒドロキシカルボキシレート（開環ラクトン）形で発酵ブロス中に存在する。ＭＦ−５５４４発酵の全ブロス抽出はロバスタチン全ブロス抽出の場合（米国特許第４，２３１，９３８号）と同様の操作を用いて行われるのが好ましい。ＨＰＬＣ追跡分析では、全ブロス中に存在する夾雑物のほとんどがpH３．５〜４．５に調整してから行う初めの酢酸イソプロピル（ＩＰＡＣ）抽出で除去され、同時にトリオールの７０〜７２％がこの工程で回収されることを示した。この後に炭酸塩抽出（pH１１〜１２）を行ったが、トリオール酸の損失は非常に少なかった。炭酸塩層の最終的ＩＰＡＣ抽出（pH３．５〜４．５）を行って有機相中にトリオール酸を回収するが、収率の減少はほとんどない。
【００１８】ラクトン化本発明のプロセスによるアスペルギルス・テレウス株の発酵では主産物としてトリオール酸を生じる。トリオール酸のラクトン化は標準操作、即ち加熱又は酸触媒ラクトン化のいずれかを用いて行われる。ロバスタチン関連化合物の酸触媒ラクトン化に関する操作は米国特許第４，９１６，２３９号明細書に記載されている。
【実施例】
【００１９】実施例１７−〔１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−ヘキサヒドロ−２（Ｓ），６（Ｒ）−ジメチル−８（Ｓ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−ナフチル〕−３（Ｒ），５（Ｒ）−ジヒドロキシヘプタン酸（トリオール酸Ｉ）の製造（ａ）ニトロソグアニド変異誘発とＨＰＬＣアッセイ変異誘発：１）アスペルギルス・テレウスのロバスタチン産生株の純粋培養物をＹＭＥ＋ＴＥの斜面上に画線接種し、通常の室内ケイ光照射下２８℃で増殖させた。
２）５〜７日間後、無菌保存原液（５％ラクトース、１０％グリセロール、０．００５％ＮＰ・４０）２mlを各斜面に加え、表面を滅菌白金耳で静かにこすって分生子柄を遊離させた。
３）胞子懸濁液を滅菌０．５mmガラスビーズ約２５個の入ったスクリューキャップ管に移し、約１分間攪拌した。胞子を血球計数器でカウントし、貯蔵溶液で１×１０8 胞子／mlに希釈した。胞子懸濁液を使用時まで−８０℃で貯蔵した。
４）上記胞子懸濁液１mlずつ４個のスナップキャップ遠心管にいれ、３０００×ｇ、４℃で５分間遠心した。上清を捨て、各胞子ペレットをボルテックスミキサーで攪拌してリン酸緩衝液（pH７の１００mMリン酸ナトリウム、０．００５％ＮＰ・４０）０．９mlに再懸濁した。
５）３本の管に１mg／mlＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎ′−ニトログアニジン０．１mlを加え、水０．１mlを四番目に加えた。混和後、管を２８℃でインキュベートした。コントロールは直ちに３０００ｇ、４℃で５分間遠心した。他の３本の管も同様に各々１５，３０及び６０分間遠心した。各遠心の直後に上清を捨て、胞子を上記リン酸緩衝液１mlに再懸濁した。
６）胞子の入った各管を水で１：１０4 、１：１０5 及び１：１０6 に希釈した。各希釈液５０μｌを数枚のＹＭＥ＋ＴＥプレート上にまき（２５ml／１００mmプレート）、プレートを室内ケイ光燈下２８℃でインキュベートした。４日間後にコロニーを（計数可能な数を有するプレートについて）カウントした。
７）更に２日間後、元の胞子の１０〜５０％のみが生存するように胞子を変異誘発したプレートから個々のコロニーを取出した。取出されたコロニーを用いてＹＭＥ＋ＴＥ斜面に接種し、これを前記のように増殖させた。
８）選択した変異株を植えた斜面が胞子形成したら、胞子懸濁液を前記のように調製し、種培地（５×１０6 胞子／ml培地；２５０mlバッフルなしフラスコ中４０ml）に接種した。２８時間後、種菌を発酵培地（１０％持ち込み容量；２５０mlバッフルなしフラスコ中発酵培地３０ml）に接種した。すべてのフラスコをニューブランスウィックＧ−５３（New Brunswick Ｇ−５３）シェーカーで２２０rpm 、２８℃で振盪した。
９）８日間の発酵後に１倍容量のメタノールを各フラスコに加え、フラスコを３０分間攪拌し、内容物を静置し、上清をトリオール及び他のブロス成分の存在に関してＨＰＬＣにより調べた。
【００２０】培養抽出物のＨＰＬＣアッセイ抽出物はワットマン・パーティシル（Whatman Partisil）５Ｃ８（４．６mm×２５cm）カラム上１．５ml／min でポンプ駆動される４５％アセトニトリル及び５５％リン酸の均一移動相条件下ＨＰＬＣにより分析した。検出波長は２３５nmであった。トリオール産物はトリオールアンモニウム塩標準との比較でそれらの特徴的ＵＶスペクトル及び保持時間により同定した。
【００２１】ｂ）斜面培養物の調製アスペルギルス・テレウスＭＦ−５５４４の培養物はキャップ付ガラス管中ＹＭＥ＋ＴＥ培地（８ml）含有寒天斜面上で培養して維持した。培養物を２７．５℃で５〜７日間斜面上で生育させ、４℃で１か月まで貯蔵し、斜面を種フラスコ用の接種原として用いた。ＹＭＥ＋ＴＥ培地は下記組成を有する：
【表１】
ＹＭＥ＋ＴＥ培地（寒天斜面）：酵母エキス ４．０ｇ／リットル麦芽エキス １０．０ｇ／リットルグルコース ４．０ｇ／リットル微量元素＃２ ５．０ｇ／リットル寒天 ２０．０ｇ／リットルNaOHでpH７．０に調整。１２１℃で２０分間のオートクレーブ処理。
【表２】
微量元素＃２FeSO4 ・７H2O １０００mg／リットルMnSO4 ・H2O １０００mg／リットルCuCl2 ・２H2O ２５mg／リットルCaCl2 １００mg／リットルH3BO3 ５６mg／リットル(NH4)6Mo７０２４・４H2O １９mg／リットルZnSO4 ・７H2O ２００mg／リットル０．６N HCl で調整し、５℃で貯蔵最大力価は下記成分を有する“ＨＬＣ”種培地で生育させた種接種原を用いて得られた：
【表３】
アルダミンpHはチャンプレイン・インダストリーズ（Champlain Industries）から入手でき、ブレンドされた一次増殖酵母及びビール酵母である。ファーマメディア（Pharmamedia)はトレーダーズ・プロテイン・カンパニー（Trader's Protein Company) から購入し、“綿実粉”である。上記成分の各々を蒸留水に連続的に加え、次を加える前によく溶解させた。蒸留水８００mlを最終容量１０００mlになるまで加え、pHを４０％NaOHで７．０に調整し、１０分間安定化させた。培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。滅菌後pHは６．５〜６．６となっているべきである。
【００２２】ｃ）発酵による産生種フラスコ用接種原を調製するため、寒天斜面の１本分内容物を蒸留水又は生理食塩水（０．７％NaCl) ５mlでかきとった。この接種原１mlをオートクレーブで滅菌したＨＬＣ種培地４０ml含有２５０mlバッフルなしエーレンマイヤーフラスコに加えた（あるいは実施例２のように、ラクトース／グリセロール胞子懸濁液１mlを用いることもできる）。ＨＬＣ種フラスコをロータリーシェーカー上２２０rpm.２７．５℃で２４〜２６時間インキュベートし、このフラスコの内容物１mlを滅菌ＧＰ−９産生培地（下記参照）３０ml含有２５０mlバッフルなしエーレンマイヤーフラスコに接種した。このフラスコをロータリーシェーカー上２２０rpm 、２７．５℃で４〜１４日間インキュベートした。最大トリオール酸産生は１４日目にみられた。
【００２３】ｄ）トリオール酸の抽出トリオールは下記のように酢酸イソプロピル（ＩＰＡＣ）を用いた液−液抽出により発酵ブロスから回収した（２リットル；最初ＨＰＬＣ分析により５．９８ｇ／リットル）：ブロスのpHを１０％硫酸（６０ml）で４．０〜４．５に調整し、ブロスをＩＰＡＣ（１：３４リットル）と混ぜ、遠心した。ＩＰＡＣ層を回収し、pH１１．５の炭酸ナトリウム溶液（４００ml）と混ぜて非極性成分を除去した。次いで豊富炭酸塩層（トリオール含有）を８５％リン酸（１２ml）でpH４．０に調整後ＩＰＡＣ（４５０ml）に逆抽出した。
【００２４】ｅ）ラクトン化７０％メタンスルホン酸（ＭＳＡ）（８７μｌ；２mM）を実施例１（ｄ）のＩＰＡＣ層に加え、溶液をその原容量（１００ml）の〜１／５蒸発濃縮した。濃縮／ラクトン化の完了をＨＰＬＣ分析で確認した後、ＩＰＡＣを炭酸ナトリウム溶液（１００ml）と混ぜて荷電種を除去した。ジオールラクトンは−２０℃でＩＰＡＣ層から結晶化した。
【００２５】実施例２米からの凍結分生子の調製アスペルギルス・テレウスＭＦ−５５４４培養物は凍結胞子懸濁物として維持することができる。“アンクルベン転化長粒米”（Uncle Ben's Converted LongGrain Rice)２５０ｇを２８００mlエーレンマイヤーフラスコ中において水が透明になるまで水洗した。フラスコから水を捨て、フラスコを１２１℃で３０分間オートクレーブ処理して滅菌した。冷却後、米含有フラスコを（かきとりにより蒸留水又は塩水（０．７％NaCl）５mlに懸濁された）１斜面分の内容物を接種し、振盪してから２７．５℃で１２〜１６日間インキュベートした。胞子を回収するため、５％ラクトース／１０％グリセロール含有溶液２５０〜５００mlを加え、フラスコを振盪し、滅菌ステンレススチールメッシュ通して濾液を集めた。ラクトース／グリセロール胞子懸濁液を−９０℃で凍結し、前記実施例１のようにＨＬＣ種フラスコ用の接種原として用いた。
【００２６】実施例３アンモニウム塩の形成細胞ペレット及び／又は細胞砕片を濾過又は遠心により産生フラスコから除去した。次いでこのプロセスからの濾液又は上清を工程１ｄで示したように抽出するか又は濾液を用いてトリオール酸のアンモニウム塩を単離した。推定トリオール力価２９．８３ｇ／リットルのＩＰＡＣ流（５ml）を硫酸マグネシウムで脱水し、しかる後焼結ガラスロートで濾過した。メタノール（０．２ml）を加え、混合液を氷浴（０℃）につけ、水酸化アンモニウム：メタノール（１：３）溶液０．０３mlを加えた。混合液にトリオールアンモニウム塩１mgを核として入れ、３０分間エージングした。温度を−８℃に下げ、水酸化アンモニウム：メタノール（１：３）０．０３mlを２時間にわたり１５分間毎に加えた。得られた濃厚スラリーを濾過して、象牙色結晶を得た。ここで特許請求されたアスペルギルス・テレウス株の培養物は式（Ｉ）の化合物の形成にとり有害である生存汚染微生物を含まないとして定義される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 アスペルギルス・テレウスの菌株であって、上記株がアスペルギルス・テレウスのロバスタチン産生株の変異誘発から形成され、上記菌株がロバスタチン収率０．００２％未満の形成で下記構造の化合物：
【化１】
を形成することができる菌株。
【請求項２】 ロバスタチン収率０．００２％未満の形成で下記構造（Ｉ）の化合物：
【化２】
を形成することができるＭＦ−５５４４、ＡＴＣＣ７４０６４の菌株又はその変異株。
【請求項３】 構造（Ｉ）の化合物が少なくとも５．２ｇ／リットルの力価で形成され、トリオール酸関連副産物が０．８５ｇ／リットル以下の収率で形成される、請求項２記載の菌株。
【請求項４】 前記菌株が生物学的に純粋な菌株である、請求項１記載の菌株。
【請求項５】 前記菌株が生物学的に純粋な菌株である、請求項２記載の菌株。
【請求項６】 前記菌株が生物学的に純粋な菌株である、請求項３記載の菌株。
【請求項７】 下記構造（Ｉ）の化合物：
【化３】
の形成方法であって、化合物（Ｉ）の形成に適した条件下で請求項１記載の微生物を培養し、化合物を回収することからなる方法。
【請求項８】 下記構造（Ｉ）の化合物：
【化４】
の形成方法であって、上記化合物の形成に適した条件下で請求項２記載の微生物を培養し、化合物を回収することからなる方法。
【請求項９】 化合物（Ｉ）が少なくとも５．２ｇ／リットルの力価で形成され、トリオール酸関連副産物が０．８５ｇ／リットル以下の収率で形成される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】 請求項１乃至６のいずれか１項に記載の菌株を含んで成る培養物組成物。
【請求項１】 アスペルギルス・テレウスの菌株であって、上記株がアスペルギルス・テレウスのロバスタチン産生株の変異誘発から形成され、上記菌株がロバスタチン収率０．００２％未満の形成で下記構造の化合物：
【化１】
を形成することができる菌株。
【請求項２】 ロバスタチン収率０．００２％未満の形成で下記構造（Ｉ）の化合物：
【化２】
を形成することができるＭＦ−５５４４、ＡＴＣＣ７４０６４の菌株又はその変異株。
【請求項３】 構造（Ｉ）の化合物が少なくとも５．２ｇ／リットルの力価で形成され、トリオール酸関連副産物が０．８５ｇ／リットル以下の収率で形成される、請求項２記載の菌株。
【請求項４】 前記菌株が生物学的に純粋な菌株である、請求項１記載の菌株。
【請求項５】 前記菌株が生物学的に純粋な菌株である、請求項２記載の菌株。
【請求項６】 前記菌株が生物学的に純粋な菌株である、請求項３記載の菌株。
【請求項７】 下記構造（Ｉ）の化合物：
【化３】
の形成方法であって、化合物（Ｉ）の形成に適した条件下で請求項１記載の微生物を培養し、化合物を回収することからなる方法。
【請求項８】 下記構造（Ｉ）の化合物：
【化４】
の形成方法であって、上記化合物の形成に適した条件下で請求項２記載の微生物を培養し、化合物を回収することからなる方法。
【請求項９】 化合物（Ｉ）が少なくとも５．２ｇ／リットルの力価で形成され、トリオール酸関連副産物が０．８５ｇ／リットル以下の収率で形成される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】 請求項１乃至６のいずれか１項に記載の菌株を含んで成る培養物組成物。
【特許番号】第２６１１０８８号
【登録日】平成９年（１９９７）２月２７日
【発行日】平成９年（１９９７）５月２１日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平４−１４４５６３
【出願日】平成４年（１９９２）６月４日
【公開番号】特開平６−７１７６
【公開日】平成６年（１９９４）１月１８日
【微生物の受託番号】 ＡＴＣＣ ７４０６４
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【登録日】平成９年（１９９７）２月２７日
【発行日】平成９年（１９９７）５月２１日
【国際特許分類】
【出願日】平成４年（１９９２）６月４日
【公開番号】特開平６−７１７６
【公開日】平成６年（１９９４）１月１８日
【微生物の受託番号】 ＡＴＣＣ ７４０６４
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
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