アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子及びその用途
【課題】ビシナルジケトン又はダイアセチル生成能の低い醸造酵母の育種ならびにビシナルジケトン又はダイアセチル含量の減少した酒類の製造法を提供する。
【解決手段】本発明は、アセト乳酸シンターゼ遺伝子及びその用途に関し、特に、香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のアセト乳酸シンターゼであるIlv6pをコードする遺伝子ILV6、特にビール酵母に特徴的なnonScILV6遺伝子の発現量を低減させることによって、製品のオフフレーバーとなるVDK、特にDAの生成能を低減させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【解決手段】本発明は、アセト乳酸シンターゼ遺伝子及びその用途に関し、特に、香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のアセト乳酸シンターゼであるIlv6pをコードする遺伝子ILV6、特にビール酵母に特徴的なnonScILV6遺伝子の発現量を低減させることによって、製品のオフフレーバーとなるVDK、特にDAの生成能を低減させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子及びその用途に関し、特に、香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子ILV6、特にビール酵母に特徴的なnonScILV6遺伝子の発現量を抑制することによって、製品のオフフレーバーとなるビシナルジケトン類、特にダイアセチル生産量を低減させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類の香気成分のうち、ダイアセチル（以下DA）臭はビール、清酒及びワイン等の醸造酒における代表的オフフレーバーのひとつである。DA臭（ビールではムレ臭またはバター臭、清酒ではツワリ香とも表現される）はDAを主とするビシナルジケトン類（以下VDK）が製品中に閾値以上存在することによって発生し、ビールにおける閾値は0.1ppm（Journal of the Institute of Brewing、76、486（1970）：非特許文献１）といわれている。
【０００３】
酒類中のVDKはDA と2,3-ペンタンジオン（以下PD）に大別される。DA とPDは、それぞれバリン及びイソロイシン生合成系中間産物のα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸を前駆体として、酵母の関与しない非酵素的反応によって生成される。
【０００４】
以上のことから、VDK（DA及びPD）及びその前駆体α-アセトヒドロキシ酸類（α-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸）全体が製品にDA臭をもたらす可能性のあるものとしてとらえることができ、これらを安定的に低減させる酵母の育種は酒類の製造管理を容易にするばかりでなく、新商品開発の可能性を広げることができる。
【０００５】
DA臭の制御方法として、例えば特開2001-204457公報（特許文献１）では、α-アセト乳酸の前駆体となるピルビン酸濃度の低い酒母を用いることによってDAの生成を抑制する方法が報告されている。また、アセト乳酸シンターゼはピルビン酸またはα-オキソ酪酸をそれぞれα-アセト乳酸またはα-アセトヒドロキシ酪酸に変換する酵素であるが、酵母のアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子としてはILV2およびILV6が存在し、両者の遺伝子産物が複合体を形成することが知られている。Journal of Basic Microbiology, 28(3), 175-183（1988）（非特許文献２）では、このうち活性部位をコードするILV2に対する変異導入や遺伝子破壊を施し、上記酵素の活性を抑制することで前駆体（α-アセトヒドロキシ酸類）の合成を低下させ、結果としてDA濃度が低減することが報告されている。活性制御部位であるIlv6pについては、例えばBiochemistry, 38(16), 5222-31（1999）（非特許文献３）でアセト乳酸シンターゼ活性に対する酵素学的解析が行われているが、DA生成への影響は明らかではない。
【０００６】
さらに、Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 94-99（1973）（非特許文献４）ではバリン・ロイシン・イソロイシン要求性酵母でVDK生成量が低減することが報告されているが、栄養要求性株では増殖・発酵遅延が生じやすいことから実用化には至っていない。特開2002-291465号公報（特許文献２）ではこれらの分岐アミノ酸のアナログに対して感受性となる変異株を取得し、それらの中からDA低蓄積株を選抜するという方法が示されている。Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84（1987）（非特許文献５）では実験室酵母に由来するILV5遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母が、また、European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560（1987）（非特許文献６）では同じくILV3遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母がそれぞれ報告されている。このときILV5遺伝子がコードするアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素活性は5-7倍増加し、VDK生成量は4割程度まで減少した。また、ILV3遺伝子がコードするジヒドロキシ酸デヒドラターゼの酵素活性は5-6倍増加したが、VDK生成量に有意な減少はみられなかった。ただし上記2報告とも合成培地を用いており、実際のビール醸造への影響は解析されていない。Dulieuらは、European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460（1997）（非特許文献７）においてα-アセト乳酸脱炭酸酵素を使用することでDAの前駆体となるα-アセト乳酸をアセトインに迅速に変換する方法を提案したが、日本では税制上発酵中の醪に酵素を添加することはできない。特開平2-265488号公報（特許文献３）及び特開平7-171号公報（特許文献４）ではいずれもα-アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするDNA鎖を用いた遺伝子操作酵母が報告されている。
【特許文献１】特開2001-204457号公報
【特許文献２】特開2002-291465号公報
【特許文献３】特開平2-265488号公報
【特許文献４】特開平7-171号公報
【非特許文献１】Journal of the Institute of Brewing、76、486（1970）
【非特許文献２】Journal of Basic Microbiology, 28(3), 175-183（1988）
【非特許文献３】Biochemistry, 38(16), 5222-31（1999）
【非特許文献４】Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 94-99（1973）
【非特許文献５】Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84（1987）
【非特許文献６】European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560（1987）
【非特許文献７】European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460（1997）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、酵母においてVDK、特にDA臭の発生を低減させることのできるタンパク質をコードする遺伝子ならびに該タンパク質を利用してVDK低生産性の酵母を育種し、香味に優れた酒類の製造を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から既知のタンパク質より有利な効果を奏するアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子の発現を抑制した形質転換酵母を作製し、ビール中のVDK濃度、特にDA濃度が低減することを確認して、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、ビール酵母に特徴的に存在する新規なアセト乳酸シンターゼ遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる製品中のVDK濃度、特にDA濃度の制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターあるいはDNA断片、該ベクターあるいはDNA断片が導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【００１０】
（１）以下の(a)〜(ｆ)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(ｆ)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１１】
（２）以下の(g)〜(i)のいずれかである上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１２】
（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(j)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【００１３】
（８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（８ａ）以下の(ａ)〜(ｃ)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(b)該プロモーターにアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(c)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。（９）上記（６）に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【００１４】
（１０）上記（８）〜（９）のいずれかに記載のベクターが導入された形質転換酵母。
（１１）上記（８）〜（９）のいずれかに記載のベクターを導入することによって、全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能が低減された上記(１０)に記載の醸造用酵母。
（１２）上記（７）に記載のタンパク質の発現量を減少させることによって全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能が低減された上記（１１）に記載の醸造用酵母。
（１３）上記（８）〜（９）のいずれかに記載のベクターを導入することによって、または、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を破壊することによって、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された醸造用酵母。
【００１５】
（１４）上記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１５）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１６）醸造する酒類がワインである上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１７）上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【００１６】
（１８）配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能について評価する方法。
（１８ａ）上記（１８）に記載の方法によって、全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能が低い酵母を選別する方法。
（１８ｂ）上記（１８ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１９）被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能を評価する方法。
（１９ａ）上記（１９）に記載の方法で、被検酵母を評価し、アセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量が低い酵母を選別する、酵母の選択方法。
（１９ｂ）上記（１９ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
【００１７】
（２０）被検酵母を培養して、上記（７）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とする全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２１）基準酵母及び被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が低発現である被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。
（２２）基準酵母及び被検酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の少ない被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。即ち、複数の酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、その中で該タンパク質量の少ない被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。
【００１８】
（２３）上記（１０）〜（１３）に記載の酵母および上記（２０）〜（２２）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、全ビシナルジケトン生産量又は全ダイアセチル生産量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、製品中でオフフレーバーとなるビシナルジケトン類（VDK）（例えば、ダイアセチル（DA）、２，３−ペンタンジオン（PD）など）又はその前駆体（例えば、α−アセトヒドロキシ酸類など）、特にダイアセチル（DA）又はその前駆体（例えば、α−アセト乳酸など）の生産量を低減させることができるため、香味に優れた酒類を容易に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明者らは、特開2004-283169に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のアセト乳酸シンターゼをコードするnonScILV6遺伝子を単離・同定した。この塩基配列を配列番号：１に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
なお、本明細書中、VDKとその前駆体であるαアセトヒドロキシ酸を総称して、「全ビシナルジケトン」ということもある。また、DAとその前駆体であるα−アセト乳酸を総称して「全ダイアセチル」ということもある。
【００２１】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（具体的には、DNA、以下、これらを単に「DNA」とも称する）；及び(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするDNAは、上記のビール酵母由来のアセト乳酸シンターゼをコードするDNAに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のDNAを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個（1〜数個）、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２のアミノ酸配列と約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、アセト乳酸シンターゼ活性は、例えばPangらの方法（Biochemistry, 38, 5222-5231 (1999)）によって測定することができる。
【００２２】
また、本発明は、(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００２３】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA）」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするDNAの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるDNAをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００２４】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２５】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
【００２６】
これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするDNAと約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。
【００２７】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、(j) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド； (k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド； (l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記(a)〜(i)のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制することができる。したがって、上記DNAの発現を抑制する場合に好適に利用することができる。
【００２８】
本明細書中、「DNAの転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンスDNAのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現 （日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993などを参照）。アンチセンスDNAの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンスDNAの長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。
【００２９】
本明細書中、「DNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、RNA interference（RNAi）によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、21〜25塩基長のRNA干渉を生ずる二重鎖RNA、例えば、dsRNA (double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)又はshRNA(short hairpin RNA)が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖RNA(dsRNA、siRNA又はshRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April； Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002 May 15等参照）。
【００３０】
本明細書中、「DNAの転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザイムのことをいう。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいい、ターゲットとするDNAの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992など参照）。また、「DNAの発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるDNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。
【００３１】
本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照）。
【００３２】
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００３３】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００３４】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００３５】
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制するように、(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(b)該プロモーターにアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(c)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。また、上記(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクターには、これらのポリヌクレオチドが、発現可能なように導入される。なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（DNA）を破壊することによって、上記DNAの発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)、特開平6-253826号公報など参照）。
【００３６】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
【００３７】
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００３８】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzymol., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J. Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリイオン金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約30℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20%〜50%となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。 その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００３９】
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
本発明においては、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された醸造用酵母などを用いることによって、所望の酒類でVDK、特にDA生成量が減少し、香味に優れた酒類を製造することができる。具体的には、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、VDK生成量、特にDA生成量を低減させることによって、所望の酒類で、かつVDK含量、特にDA含量が低減された酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、VDK、特にDA生成量が減少した酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、香味に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
【００４０】
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母のVDK又はDA生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷO01／040514号公報、特開平8−205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
【００４１】
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、アセト乳酸シンターゼ遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマー又はプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
【００４２】
遺伝子又は特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
【００４３】
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のVDK又はDA生成能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
【００４４】
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のVDK又はDA生成能を評価することもできる。この場合は、被検酵母を培養し、アセト乳酸シンターゼ遺伝子産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的RT-PCRによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
【００４５】
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするVDK又はDA生成能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母（例えば、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株）及び被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子の発現が抑制されている（すなわち低発現である）被検酵母を選択することによって、酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
【００４６】
あるいは、被検酵母を培養して、VDK又はDA生成能の低い、あるいはアセト乳酸シンターゼ活性の低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母または基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。VDK又はDA生成能は、公知の方法によって測定することができる。例えば、全ビシナルジケトン量の定量は、Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966に記載の方法によって行うことができる。全ダイアセチル量の定量は、例えば、J Agric Food Chem. 50(13):3647-53, 2002に記載の方法によって行うことができる。アセト乳酸シンターゼ活性は、例えば、Epelbaumらの方法（Anal. Biochem, 191, 96-9 (1990)）によって測定することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、ｐ67-75、学会出版センターなど参照）。
【００４７】
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲン シス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母から任意の組み合わせで選択しても良い。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
実施例１：ビール試醸中のnonScILV6遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行った。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScILV6遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScILV6遺伝子が発現していることを確認した。
【００５０】
実施例２：nonScILV6遺伝子の破壊
文献 (Goldstein et al., yeast. 15 1541 (1999)) の方法にしたがい、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド(pFA6a (G418r), pAG25 (nat1),pAG32 (hph)) をテンプレートとしたPCRによって遺伝子破壊用断片を作製する。PCR用のプライマーとして、nonScILV6_delta_for（配列番号：３）、nonScILV6_delta _rv（配列番号：４）を用いる。
上述の方法で作製した遺伝子破壊用断片でビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株より分離した胞子クローン株（W34/70-2）を形質転換する。形質転換は特開平07-303475号公報に記載された方法で行い、ジェネチシン(Geneticin)300mg/Lあるいはノーセオスリシン(Nourseothricin) 50mg/LあるいはハイグロマイシンB(Hygromycin B) 200mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択する。
【００５１】
実施例３：ビール試験醸造におけるVDK生成量の解析
親株ならびに実施例2で得られるnonScILV6破壊株を用いた発酵試験を以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度 11.85%
麦汁容量 2L
麦汁溶存酸素濃度 8ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）、エキス消費量の経時変化を調べる。醪中の全VDKの定量は、VDK（DA及びPD）をヒドロキシルアミンと反応させ、生成したグリオキシム誘導体と2価鉄イオンが反応して生じる錯体の吸光度を測定することによって行う（Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966）。この時、前駆体であるα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸をあらかじめガス洗い法（酸化的脱炭酸反応）によってそれぞれDA、PDに変換しておくことにより、これらを含めた全VDK量とする。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の酒類製造法によれば、製品中でオフフレーバーとなるVDK、特にDA生産量が低減され、香味に優れた酒類を容易に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScILV6遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
［配列番号：３］プライマー
［配列番号：４］プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子及びその用途に関し、特に、香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子ILV6、特にビール酵母に特徴的なnonScILV6遺伝子の発現量を抑制することによって、製品のオフフレーバーとなるビシナルジケトン類、特にダイアセチル生産量を低減させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類の香気成分のうち、ダイアセチル（以下DA）臭はビール、清酒及びワイン等の醸造酒における代表的オフフレーバーのひとつである。DA臭（ビールではムレ臭またはバター臭、清酒ではツワリ香とも表現される）はDAを主とするビシナルジケトン類（以下VDK）が製品中に閾値以上存在することによって発生し、ビールにおける閾値は0.1ppm（Journal of the Institute of Brewing、76、486（1970）：非特許文献１）といわれている。
【０００３】
酒類中のVDKはDA と2,3-ペンタンジオン（以下PD）に大別される。DA とPDは、それぞれバリン及びイソロイシン生合成系中間産物のα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸を前駆体として、酵母の関与しない非酵素的反応によって生成される。
【０００４】
以上のことから、VDK（DA及びPD）及びその前駆体α-アセトヒドロキシ酸類（α-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸）全体が製品にDA臭をもたらす可能性のあるものとしてとらえることができ、これらを安定的に低減させる酵母の育種は酒類の製造管理を容易にするばかりでなく、新商品開発の可能性を広げることができる。
【０００５】
DA臭の制御方法として、例えば特開2001-204457公報（特許文献１）では、α-アセト乳酸の前駆体となるピルビン酸濃度の低い酒母を用いることによってDAの生成を抑制する方法が報告されている。また、アセト乳酸シンターゼはピルビン酸またはα-オキソ酪酸をそれぞれα-アセト乳酸またはα-アセトヒドロキシ酪酸に変換する酵素であるが、酵母のアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子としてはILV2およびILV6が存在し、両者の遺伝子産物が複合体を形成することが知られている。Journal of Basic Microbiology, 28(3), 175-183（1988）（非特許文献２）では、このうち活性部位をコードするILV2に対する変異導入や遺伝子破壊を施し、上記酵素の活性を抑制することで前駆体（α-アセトヒドロキシ酸類）の合成を低下させ、結果としてDA濃度が低減することが報告されている。活性制御部位であるIlv6pについては、例えばBiochemistry, 38(16), 5222-31（1999）（非特許文献３）でアセト乳酸シンターゼ活性に対する酵素学的解析が行われているが、DA生成への影響は明らかではない。
【０００６】
さらに、Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 94-99（1973）（非特許文献４）ではバリン・ロイシン・イソロイシン要求性酵母でVDK生成量が低減することが報告されているが、栄養要求性株では増殖・発酵遅延が生じやすいことから実用化には至っていない。特開2002-291465号公報（特許文献２）ではこれらの分岐アミノ酸のアナログに対して感受性となる変異株を取得し、それらの中からDA低蓄積株を選抜するという方法が示されている。Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84（1987）（非特許文献５）では実験室酵母に由来するILV5遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母が、また、European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560（1987）（非特許文献６）では同じくILV3遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母がそれぞれ報告されている。このときILV5遺伝子がコードするアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素活性は5-7倍増加し、VDK生成量は4割程度まで減少した。また、ILV3遺伝子がコードするジヒドロキシ酸デヒドラターゼの酵素活性は5-6倍増加したが、VDK生成量に有意な減少はみられなかった。ただし上記2報告とも合成培地を用いており、実際のビール醸造への影響は解析されていない。Dulieuらは、European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460（1997）（非特許文献７）においてα-アセト乳酸脱炭酸酵素を使用することでDAの前駆体となるα-アセト乳酸をアセトインに迅速に変換する方法を提案したが、日本では税制上発酵中の醪に酵素を添加することはできない。特開平2-265488号公報（特許文献３）及び特開平7-171号公報（特許文献４）ではいずれもα-アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするDNA鎖を用いた遺伝子操作酵母が報告されている。
【特許文献１】特開2001-204457号公報
【特許文献２】特開2002-291465号公報
【特許文献３】特開平2-265488号公報
【特許文献４】特開平7-171号公報
【非特許文献１】Journal of the Institute of Brewing、76、486（1970）
【非特許文献２】Journal of Basic Microbiology, 28(3), 175-183（1988）
【非特許文献３】Biochemistry, 38(16), 5222-31（1999）
【非特許文献４】Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 94-99（1973）
【非特許文献５】Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84（1987）
【非特許文献６】European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560（1987）
【非特許文献７】European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460（1997）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、酵母においてVDK、特にDA臭の発生を低減させることのできるタンパク質をコードする遺伝子ならびに該タンパク質を利用してVDK低生産性の酵母を育種し、香味に優れた酒類の製造を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から既知のタンパク質より有利な効果を奏するアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子の発現を抑制した形質転換酵母を作製し、ビール中のVDK濃度、特にDA濃度が低減することを確認して、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、ビール酵母に特徴的に存在する新規なアセト乳酸シンターゼ遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる製品中のVDK濃度、特にDA濃度の制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターあるいはDNA断片、該ベクターあるいはDNA断片が導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【００１０】
（１）以下の(a)〜(ｆ)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(ｆ)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１１】
（２）以下の(g)〜(i)のいずれかである上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１２】
（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(j)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【００１３】
（８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（８ａ）以下の(ａ)〜(ｃ)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(b)該プロモーターにアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(c)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。（９）上記（６）に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【００１４】
（１０）上記（８）〜（９）のいずれかに記載のベクターが導入された形質転換酵母。
（１１）上記（８）〜（９）のいずれかに記載のベクターを導入することによって、全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能が低減された上記(１０)に記載の醸造用酵母。
（１２）上記（７）に記載のタンパク質の発現量を減少させることによって全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能が低減された上記（１１）に記載の醸造用酵母。
（１３）上記（８）〜（９）のいずれかに記載のベクターを導入することによって、または、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を破壊することによって、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された醸造用酵母。
【００１５】
（１４）上記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１５）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１６）醸造する酒類がワインである上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１７）上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【００１６】
（１８）配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能について評価する方法。
（１８ａ）上記（１８）に記載の方法によって、全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能が低い酵母を選別する方法。
（１８ｂ）上記（１８ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１９）被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能を評価する方法。
（１９ａ）上記（１９）に記載の方法で、被検酵母を評価し、アセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量が低い酵母を選別する、酵母の選択方法。
（１９ｂ）上記（１９ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
【００１７】
（２０）被検酵母を培養して、上記（７）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とする全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２１）基準酵母及び被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が低発現である被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。
（２２）基準酵母及び被検酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の少ない被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。即ち、複数の酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、その中で該タンパク質量の少ない被検酵母を選択する、上記（２０）に記載の酵母の選択方法。
【００１８】
（２３）上記（１０）〜（１３）に記載の酵母および上記（２０）〜（２２）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、全ビシナルジケトン生産量又は全ダイアセチル生産量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、製品中でオフフレーバーとなるビシナルジケトン類（VDK）（例えば、ダイアセチル（DA）、２，３−ペンタンジオン（PD）など）又はその前駆体（例えば、α−アセトヒドロキシ酸類など）、特にダイアセチル（DA）又はその前駆体（例えば、α−アセト乳酸など）の生産量を低減させることができるため、香味に優れた酒類を容易に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明者らは、特開2004-283169に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のアセト乳酸シンターゼをコードするnonScILV6遺伝子を単離・同定した。この塩基配列を配列番号：１に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
なお、本明細書中、VDKとその前駆体であるαアセトヒドロキシ酸を総称して、「全ビシナルジケトン」ということもある。また、DAとその前駆体であるα−アセト乳酸を総称して「全ダイアセチル」ということもある。
【００２１】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（具体的には、DNA、以下、これらを単に「DNA」とも称する）；及び(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするDNAは、上記のビール酵母由来のアセト乳酸シンターゼをコードするDNAに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のDNAを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個（1〜数個）、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２のアミノ酸配列と約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、アセト乳酸シンターゼ活性は、例えばPangらの方法（Biochemistry, 38, 5222-5231 (1999)）によって測定することができる。
【００２２】
また、本発明は、(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００２３】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA）」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするDNAの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるDNAをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００２４】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２５】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
【００２６】
これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするDNAと約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。
【００２７】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、(j) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド； (k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド； (l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記(a)〜(i)のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制することができる。したがって、上記DNAの発現を抑制する場合に好適に利用することができる。
【００２８】
本明細書中、「DNAの転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンスDNAのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現 （日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993などを参照）。アンチセンスDNAの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンスDNAの長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。
【００２９】
本明細書中、「DNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、RNA interference（RNAi）によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、21〜25塩基長のRNA干渉を生ずる二重鎖RNA、例えば、dsRNA (double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)又はshRNA(short hairpin RNA)が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖RNA(dsRNA、siRNA又はshRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April； Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002 May 15等参照）。
【００３０】
本明細書中、「DNAの転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザイムのことをいう。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいい、ターゲットとするDNAの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992など参照）。また、「DNAの発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるDNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。
【００３１】
本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照）。
【００３２】
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００３３】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００３４】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００３５】
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制するように、(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(b)該プロモーターにアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(c)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。また、上記(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクターには、これらのポリヌクレオチドが、発現可能なように導入される。なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（DNA）を破壊することによって、上記DNAの発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)、特開平6-253826号公報など参照）。
【００３６】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
【００３７】
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００３８】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzymol., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J. Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリイオン金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約30℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20%〜50%となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。 その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００３９】
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
本発明においては、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された醸造用酵母などを用いることによって、所望の酒類でVDK、特にDA生成量が減少し、香味に優れた酒類を製造することができる。具体的には、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、VDK生成量、特にDA生成量を低減させることによって、所望の酒類で、かつVDK含量、特にDA含量が低減された酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、VDK、特にDA生成量が減少した酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、香味に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
【００４０】
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母のVDK又はDA生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷO01／040514号公報、特開平8−205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
【００４１】
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、アセト乳酸シンターゼ遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマー又はプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
【００４２】
遺伝子又は特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
【００４３】
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のVDK又はDA生成能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
【００４４】
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のVDK又はDA生成能を評価することもできる。この場合は、被検酵母を培養し、アセト乳酸シンターゼ遺伝子産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的RT-PCRによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
【００４５】
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするVDK又はDA生成能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母（例えば、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株）及び被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子の発現が抑制されている（すなわち低発現である）被検酵母を選択することによって、酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
【００４６】
あるいは、被検酵母を培養して、VDK又はDA生成能の低い、あるいはアセト乳酸シンターゼ活性の低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母または基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。VDK又はDA生成能は、公知の方法によって測定することができる。例えば、全ビシナルジケトン量の定量は、Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966に記載の方法によって行うことができる。全ダイアセチル量の定量は、例えば、J Agric Food Chem. 50(13):3647-53, 2002に記載の方法によって行うことができる。アセト乳酸シンターゼ活性は、例えば、Epelbaumらの方法（Anal. Biochem, 191, 96-9 (1990)）によって測定することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、ｐ67-75、学会出版センターなど参照）。
【００４７】
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲン シス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母から任意の組み合わせで選択しても良い。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
実施例１：ビール試醸中のnonScILV6遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行った。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScILV6遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScILV6遺伝子が発現していることを確認した。
【００５０】
実施例２：nonScILV6遺伝子の破壊
文献 (Goldstein et al., yeast. 15 1541 (1999)) の方法にしたがい、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド(pFA6a (G418r), pAG25 (nat1),pAG32 (hph)) をテンプレートとしたPCRによって遺伝子破壊用断片を作製する。PCR用のプライマーとして、nonScILV6_delta_for（配列番号：３）、nonScILV6_delta _rv（配列番号：４）を用いる。
上述の方法で作製した遺伝子破壊用断片でビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株より分離した胞子クローン株（W34/70-2）を形質転換する。形質転換は特開平07-303475号公報に記載された方法で行い、ジェネチシン(Geneticin)300mg/Lあるいはノーセオスリシン(Nourseothricin) 50mg/LあるいはハイグロマイシンB(Hygromycin B) 200mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択する。
【００５１】
実施例３：ビール試験醸造におけるVDK生成量の解析
親株ならびに実施例2で得られるnonScILV6破壊株を用いた発酵試験を以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度 11.85%
麦汁容量 2L
麦汁溶存酸素濃度 8ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）、エキス消費量の経時変化を調べる。醪中の全VDKの定量は、VDK（DA及びPD）をヒドロキシルアミンと反応させ、生成したグリオキシム誘導体と2価鉄イオンが反応して生じる錯体の吸光度を測定することによって行う（Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966）。この時、前駆体であるα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸をあらかじめガス洗い法（酸化的脱炭酸反応）によってそれぞれDA、PDに変換しておくことにより、これらを含めた全VDK量とする。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の酒類製造法によれば、製品中でオフフレーバーとなるVDK、特にDA生産量が低減され、香味に優れた酒類を容易に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScILV6遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
［配列番号：３］プライマー
［配列番号：４］プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(f)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i)のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(j) 請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l) 請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項９】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
【請求項１１】
請求項８または９に記載のベクターを導入することによって、全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能が低減された請求項１０に記載の醸造用酵母。
【請求項１２】
請求項７に記載のタンパク質の発現量を減少させることによって、全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能が低減された請求項１１に記載の醸造用酵母。
【請求項１３】
請求項８もしくは９に記載のベクターを導入することによって、または、請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を破壊することによって、請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された醸造用酵母。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１５】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１４に記載の酒類の製造方法。
【請求項１６】
醸造する酒類がワインである請求項１４に記載の酒類の製造方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１８】
配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能について評価する方法。
【請求項１９】
被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能を評価する方法。
【請求項２０】
被検酵母を培養して、請求項７に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とする全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項２１】
基準酵母及び被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が低発現である被検酵母を選択する、請求項２０に記載の酵母の選択方法。
【請求項２２】
基準酵母及び被検酵母を培養して各酵母における請求項７に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の少ない被検酵母を選択する、請求項２０に記載の酵母の選択方法。
【請求項２３】
請求項１０〜１３に記載の酵母および請求項２０〜２２に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、全ビシナルジケトン生産量又は全ダイアセチル生産量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【請求項１】
以下の(a)〜(f)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i)のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(j) 請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l) 請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項９】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
【請求項１１】
請求項８または９に記載のベクターを導入することによって、全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能が低減された請求項１０に記載の醸造用酵母。
【請求項１２】
請求項７に記載のタンパク質の発現量を減少させることによって、全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能が低減された請求項１１に記載の醸造用酵母。
【請求項１３】
請求項８もしくは９に記載のベクターを導入することによって、または、請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を破壊することによって、請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された醸造用酵母。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１５】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１４に記載の酒類の製造方法。
【請求項１６】
醸造する酒類がワインである請求項１４に記載の酒類の製造方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１８】
配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能について評価する方法。
【請求項１９】
被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能を評価する方法。
【請求項２０】
被検酵母を培養して、請求項７に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とする全ビシナルジケトン生産能又は全ダイアセチル生産能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項２１】
基準酵母及び被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するアセト乳酸シンターゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が低発現である被検酵母を選択する、請求項２０に記載の酵母の選択方法。
【請求項２２】
基準酵母及び被検酵母を培養して各酵母における請求項７に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の少ない被検酵母を選択する、請求項２０に記載の酵母の選択方法。
【請求項２３】
請求項１０〜１３に記載の酵母および請求項２０〜２２に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、全ビシナルジケトン生産量又は全ダイアセチル生産量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１６５３５１（Ｐ２００９−１６５３５１Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−４７５６６（Ｐ２００６−４７５６６）
【出願日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー酒類株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー酒類株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
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