アテローム性動脈硬化症の治療のためのペプチドに基づいた免疫治療、及び酸化した低密度リポ蛋白質に対する免疫応答の測定のためのペプチドベースのアッセーの開発
【課題】アテローム性動脈硬化症の治療のための免疫治療に使用されるペプチド、および酸化低密度リポ蛋白質に対する免疫応答の測定、およびアテローム性動脈硬化症の存在または不存在の診断のためのペプチドベースのＥＬＩＳＡの開発の提供。
【解決手段】本発明はアポリポタンパク質Ｂ断片、特に、虚血性心疾患に対する免疫源としてのまたは治療的な性質を有し、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）)の一またはそれ以上の前記ペプチドを使用して、虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関する抗体の存在または不存在を分析するヒトを含む哺乳類の免疫感作または治療のための定義されたペプチドに関する。
【解決手段】本発明はアポリポタンパク質Ｂ断片、特に、虚血性心疾患に対する免疫源としてのまたは治療的な性質を有し、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）)の一またはそれ以上の前記ペプチドを使用して、虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関する抗体の存在または不存在を分析するヒトを含む哺乳類の免疫感作または治療のための定義されたペプチドに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチド、特にアテローム性動脈硬化症の治療のための免疫治療に使用されるペプチド、および酸化低密度リポ蛋白質に対する免疫応答の測定、およびアテローム性動脈硬化症の存在または不存在の診断のためのペプチドベースのＥＬＩＳＡの開発に関する。
【０００２】
特に、本発明は下記のものを含む：
ｌ）表１に列挙した、天然型または変性したペプチドを単独でまたは組み合わせて、好ましくは適当な担体および助剤と共に、虚血性の予防および治療用のための免疫療法としてまたは抗アテローム性動脈硬化症「ワクチン」として使用すること
２）心疾患
３）虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関する抗体の検出用のＥＬＩＳＡにおける該ペプチドの使用。
【背景技術】
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は大動脈または中動脈の最も内側の層（内膜）の肥厚を引き起こす慢性病である。これは血流を減少させ、罹患した血管によって供給される器官中の虚血および組織破壊を引き起こしうる。アテローム性動脈硬化症は心筋梗塞、脳卒中および周辺の動脈疾患を含む心疾患の主な原因である。それは西欧諸国における主な死因であり、２０年以内に全世界の主要な死因になることが予測される。
【０００４】
この疾病は、主に低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）であるリポタンパク質の血管の細胞外マトリックスへの蓄積によって始まる。これらのＬＤＬ粒子は凝集し、酸化的変性を進行させる。酸化ＬＤＬは毒性であり、血管損傷を引き起こす。アテローム性動脈硬化症は、多くの点で炎症と繊維化を含むこの傷に対する反応を表す。
【０００５】
１９８９年には、パリンスキ（Palinski）およびその同僚が、ヒトにおける酸化ＬＤＬに対する循環する自己抗体を確認した。この観察により、アテローム性動脈硬化症が酸化したリポタンパク質に対する免疫応答によって引き起こされる自己免疫疾患であることが提案された。この時に、いくつかの研究所は、酸化ＬＤＬに対する抗体価と心疾患との関係を探索し始めた。しかしながら、これらの研究から出現した臨床像は明白と言うにはほど遠いものであった。酸化ＬＤＬの多くの異なるエピトープに対する抗体は存在していたが、これらのエピトープの構造は未知であった。従って、「酸化ＬＤＬ抗体」の語は、１つの特異抗体よりはむしろ、異なる抗体の未知の混合物を意味するものであった。Ｔ細胞に依存しないＩｇＭ抗体は、Ｔ細胞に依存するＩｇＧ抗体より頻度が高かった。
【０００６】
酸化ＬＤＬに対する抗体は、心疾患を有する患者にも、健全なコントロールにも存在した。いくつかの初期の研究には酸化ＬＤＬ抗体価と心疾患との関連を報告したものもあるが、そのような関連を見いだせないものもあった。これらの研究の主な弱点は、抗体価の測定に使用されるＥＬＩＳＡ試験がリガンドとして酸化ＬＤＬ粒子を使用していたことである。ＬＤＬの組成は個体が異なれば異なり、酸化の変性の程度は制御するのも評価するのも困難であり、酸化ＬＤＬ粒子中の異なるエピトープに対する抗体のレベルを測定することはできない。ある程度までは技術的な問題により、それまでのところ利用可能な技術を使用して、酸化ＬＤＬに対する抗体反応の役割を評価することは困難であった。しかしながら、完全な酸化ＬＤＬ粒子を使用する場合、よく定義され複製可能なワクチンのコンポーネントを作成することは可能ではなかった。
【０００７】
血管壁の酸化ＬＤＬに対する自己免疫応答がアテローム性動脈硬化症の進展に重要な役割を果たす可能性を調査する別の方法は、それ自身の酸化ＬＤＬに対して動物を免疫感作することである。このアプローチの背後にある考えは、酸化ＬＤＬに対する自己免疫応答が古典的免疫技術を用いて強化されると、血管炎症の増加およびアテローム性動脈硬化症の進行をもたらすことである。この仮説をテストするために、ウサギを同族の酸化ＬＤＬで免疫し、次に、３か月間、この動物に高コレステロール食を与えて、アテローム性動脈硬化症を引き起こした。
【０００８】
しかしながら、もとの仮説とは対照的に、酸化ＬＤＬによる免疫感作は、アテローム性動脈硬化症を約５０％縮小する保護効果を有していた。より積極的なプラークの進展を生じさせる血管バルーンインジュリーと高コレステロール食を組み合わせた後続の研究でも、同様の結果が得られた。我々の研究と平行して、他のいくつかの研究所は同様の観察を報告した。利用可能なデータをともに採用すると、アテローム性動脈硬化症の進展に対して保護を行う、酸化ＬＤＬに対する自己免疫を含む免疫応答が存在することが明白に実証された。
【０００９】
これらの観察は、さらに人におけるアテローム性動脈硬化症をベースとする心疾患の治療のための免疫治療あるいは「ワクチン」の開発の可能性を示唆する。これを行う１つのアプローチは、個体を、自己のＬＤＬで、例えば銅により酸化した後、免疫感作することであろう。しかしながら、このアプローチは、酸化ＬＤＬにおけるどの構造が防御免疫を引き起こす原因であるか、また酸化ＬＤＬがさらに逆の免疫応答を生じさせるエピトープを含んでいるかどうかが知られていないという事実によって複雑になる。
【００１０】
酸化ＬＤＬ中のエピトープの同定は、いくつかの観点から重要である：
まず、これらのエピトープのうちの１つあるいはいくつかのものは、酸化ＬＤＬで免疫感作した動物中で観察される抗アテローム発生免疫応答を活性化する原因となると考えられる。従って、これらのエピトープを含むペプチドは、ヒトの免疫治療あるいは「アテローム性動脈硬化症ワクチン」の開発の可能性を表わすかもしれない。さらに、それらは、ヒトにおいて進展したアテローム性動脈硬化症の治療のために使用することができる。
【００１１】
第２に、同定されたエピトープを含むペプチドは、酸化ＬＤＬの特定の構造に対する抗体を検出することができるＥＬＩＳＡを開発するために使用することができる。そのようなＥＬＩＳＡは、現在利用可能な、抗原として酸化ＬＤＬ粒子を使用するものより正確で且つ信頼できるであろう。さらに、それは、心疾患に関連した、酸化ＬＤＬの中の異なるエピトープに対する免疫応答の分析を可能にするであろう。
【００１２】
特許文献１は、アテローム性動脈硬化症を分析するためのペプチドの使用に関する。該特許文献１に示されている技術は、原理として放射物理学的診断の形式である。ペプチド配列は放射能で標識され、血流に注射される。このペプチド配列がアポリポタンパクＢの中にある配列と同一である場合は、アポリポタンパクＢについて存在しているレセプターが存在する組織に結合するであろう。血管では、これは上記全てのアテローム性動脈硬化のプラークである。その後、血管壁の放射能の濃度は、例えば、ガンマカメラによって測定することができる。従って、この技術は、放射標識されたペプチド配列がアテローム性動脈硬化のプラークに存在する正常な組織レセプターに結合するであろうという事実に基づいた放射物理学的方法であり、これは外部放射能分析を使用して検出される。これは、アテローム性動脈硬化のプラークを識別する直接分析方法である。それは、患者に放射性化合物が投与されることを必要とする。
【００１３】
本発明の技術は全く異なる法則および方法に基づく。請求項１によると、本発明は、アポリポタンパクＢのペプチド配列に対する免疫反応を分析する方法、並びに心疾患に対する免疫用のアポリポタンパクＢの断片に関する。そのような免疫反応は、進展したアテローム性動脈硬化症の個体中で増加していることが示された。本発明の技術は、ポリマーウェルの底にペプチド配列を結合させることに基づく。血液サンプルが添加されると、該ペプチドはこれらの配列に特異的な抗体を結合させるであろう。その後、結合した抗体の量を免疫学的方法／技術を用いて調べる。従って、前記特許文献１の技術とは対照的に、これは、アテローム性動脈硬化のプラークを識別し局在化させる直接の測定方法でなく、アテローム性動脈硬化症の進展の高度な共変を示す免疫学的応答を調べるものである。
【００１４】
このように、本発明の基本原理は、前述の特許のものとは全く異なる。後者が、アテローム性動脈硬化の組織の中にあるリポタンパク質の正常なレセプターへのペプチド配列の結合に依存するのに対し、前者は、ペプチド配列に対する免疫反応の検出およびこれらのペプチド配列の抗体の測定に基づいている。
【００１５】
公表された研究（非特許文献１および非特許文献２）により、酸化ＬＤＬに対する免疫感作により、アテローム性動脈硬化症の進展が縮小されることを示された。これは、一般に酸化ＬＤＬに対する免疫反応が保護する効果があることを示すであろう。しかしながら、ここに与えられた結果は、驚くべきことに、これが必ずしもそうとは限らないことを示した。例えば、ペプチド＃１０、４５、１５４、１９９および２４０の混合物を用いた免疫感作は、アテローム性動脈硬化症の進展を増加させた。他のペプチド配列、例えばペプチド配列＃１、および３０〜３４を用いた免疫感作は、アテローム性動脈硬化症の進展に対する総合的な効果を欠いている。これらの結果は驚くべきである。その酸化ＬＤＬに対する免疫反応は、酸化ＬＤＬの中のどの構造に向けられるかに依存して、アテローム性動脈硬化症の進展を保護し、該進展に寄与し、または全く効果を奏しないからである。これらの発見は、免疫反応を保護することを活性化することを分離した免疫方法を開発することを可能にする。さらに、それらは、使用される粒子がアテローム発生の免疫反応を生じさせる構造を高レベルで含んでいる場合、完全な酸化ＬＤＬを使用する免疫感作が不利益な効果を奏するかもしれないことを示す。
【００１６】
特許文献２は、血清と血漿中の酸化ＬＤＬの存在を測定するための、酸化ＬＤＬの粒子に結合するマウスのモノクローナル抗体のパネルの使用に関する。従って、これは、酸化ＬＤＬに対する抗体を測定する方法が示されている本発明とは全く異なる。
【００１７】
特許文献３は、ペプチド配列を用いた免疫感作によって抗体を調製する方法に関し、該抗体は、ＥＬＩＳＡを使用したアポリポタンパクの測定のために使用することができる。従って、これはこのように本発明と全く異なるものである。
【００１８】
特許文献４はアポリポタンパクの正常型の組換え抗体を記載する。この抗体は、血漿および血清中の正常なアポリポタンパクＢの存在を調べ、循環中の正常なＬＤＬの粒子の量を低下させることにより、アテローム性動脈硬化症を治療するために使用される。
【００１９】
本発明において、抗体の使用は、アテローム性動脈硬化症の治療のために記述されている。しかしながら、特許文献４とは異なり、これらの抗体は、ＬＤＬの正常な粒子ではなく酸化ＬＤＬの粒子中に存在する構造を指向する。その効果は、それがアテローム性動脈硬化症の進展を生じさせると予測される酸化ＬＤＬであるということである。酸化ＬＤＬに特有の構造を指向する抗体の使用は、該特許文献４には記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第５，９７２，８９０号
【特許文献２】国際公開第９９／０８１０９号
【特許文献３】米国特許第４，９７０，１４４号
【特許文献４】米国特許第５，８６１，２７６号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】パリンスキ他（Palinski et al.）、1995
【非特許文献２】ジョージ他（George et al.）、1998
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
発明の要約
血管壁におけるリポタンパク質、主としてＬＤＬの酸化は、アテローム性動脈硬化症の進展において重要な要素であると考えられる。ＬＤＬの酸化中に生じた生成物は、血管細胞にとって有毒であり、炎症を引き起こし、プラーク形成を開始する。酸化ＬＤＬ中のエピトープは免疫系によって認識され、抗体産生を生じさせる。動物実験により、これらの免疫応答のうちのいくつかがアテローム性動脈硬化症に対する保護効果を持っていることが示された。抗体は、通常、ペプチドに基づいた構造をほとんど排他的に指向する。ＬＤＬ、アポリポタンパクＢ中に存在する唯一の蛋白質の完全な配列をカバーするポリペプチドライブラリーを使用して、ヒトにおいて抗体産生を生じさせる酸化ＬＤＬ中のエピトープが同定された。これらのペプチドエピトープは酸化ＬＤＬと心疾患に対する免疫応答の関連を研究し、かつ虚血性心疾患の予防および治療のための免疫療法または抗アテローム性動脈硬化症「ワクチン」を開発するためのＥＬＩＳＡを開発するために使用することができる。
【００２３】
発明の詳細な説明
酸化ＬＤＬ中のエピトープの分子特性は、ヒトにおいて抗体依存性の免疫応答を生じさることが実証された。使用されたアプローチは、免疫応答が５−６のアミノ酸長のペプチド配列を殆ど排他的に指向するという事実の利点を利用する。ＬＤＬは唯一の蛋白質、４５６３アミノ酸長のアポリポタンパクＢのみを含む。酸化の間、アポリポタンパクＢは断片化され、アルデヒド付加物が正に帯電したアミノ酸、特にリジンに結合する。これは、アポリポタンパクＢの三次元構造のために通常は露出していないペプチド配列が免疫細胞にアクセス可能になるか、および／またはその通常露出しているペプチド配列がアルデヒドとのハプテン化により免疫原性となることを意味する。
【００２４】
これにより、下記のペプチド、天然型またはＭＤＡ誘導体が、免疫反応を生じるような効果を有することが調べられた。これらのペプチドは：
ＦＬＤＴＶＹＧＮＣＳＴＨＦＴＶＫＴＲＫＧ
ＰＱＣＳＴＨＩＬＱＷＬＫＲＶＨＡＮＰＬＬ
ＶＩＳＩＰＲＬＱＡＥＡＲＳＥＩＬＡＨＷＳ
ＫＬＶＫＥＡＬＫＥＳＱＬＰＴＶＭＤＦＲＫ
ＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫＱＴＥＡＴＭＴＦＫ
ＤＧＳＬＲＨＫＦＬＤＳＮＩＫＦＳＨＶＥＫ
ＫＧＴＹＧＬＳＣＱＲＤＰＮＴＧＲＬＮＧＥ
ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
ＳＬＴＳＴＳＤＬＱＳＧＩＩＫＮＴＡＳＬＫ
ＴＡＳＬＫＹＥＮＹＥＬＴＬＫＳＤＴＮＧＫ
ＤＭＴＦＳＫＱＮＡＬＬＲＳＥＹＱＡＤＹＥ
ＭＫＶＫＩＩＲＴＩＤＱＭＱＮＳＥＬＱＷＰ
ＩＡＬＤＤＡＫＩＮＦＮＥＫＬＳＱＬＱＴＹ
ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫＫＮＫＨ
ＥＥＥＭＬＥＮＶＳＬＶＣＰＫＤＡＴＲＦＫ
ＧＳＴＳＨＨＬＶＳＲＫＳＩＳＡＡＬＥＨＫ
ＩＥＮＩＤＦＮＫＳＧＳＳＴＡＳＷＩＱＮＶ
ＩＲＥＶＴＱＲＬＮＧＥＩＱＡＬＥＬＰＱＫ
ＥＶＤＶＬＴＫＹＳＱＰＥＤＳＬＩＰＦＦＥ
ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ
ＬＬＤＩＡＮＹＬＭＥＱＩＱＤＤＣＴＧＤＥ
ＣＴＧＤＥＤＹＴＹＫＩＫＲＶＩＧＮＭＧＱ
ＧＮＭＧＱＴＭＥＱＬＴＰＥＬＫＳＳＩＬＫ
ＳＳＩＬＫＣＶＱＳＴＫＰＳＬＭＩＱＫＡＡ
ＩＱＫＡＡＩＱＡＬＲＫＭＥＰＫＤＫＤＱＥ
ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
ＳＬＮＳＨＧＬＥＬＮＡＤＩＬＧＴＤＫＩＮ
ＷＩＱＮＶＤＴＫＹＱＩＲＩＱＩＱＥＫＬＱ
ＴＹＩＳＤＷＷＴＬＡＡＫＮＬＴＤＦＡＥＱ
ＥＡＴＬＱＲＩＹＳＬＷＥＨＳＴＫＮＨＬＱ
ＡＬＬＶＰＰＥＴＥＥＡＫＱＶＬＦＬＤＴＶ
ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ
ＳＧＡＳＭＫＬＴＴＮＧＲＦＲＥＨＮＡＫＦ
ＮＬＩＧＤＦＥＶＡＥＫＩＮＡＦＲＡＫＶＨ
ＧＨＳＶＬＴＡＫＧＭＡＬＦＧＥＧＫＡＥＦ
ＦＫＳＳＶＩＴＬＮＴＮＡＥＬＦＮＱＳＤＩ
ＦＰＤＬＧＱＥＶＡＬＮＡＮＴＫＮＱＫＩＲ、並びに非抗体産生ペプチド
ＡＴＲＦＫＨＬＲＫＹＴＹＮＹＱＡＱＳＳＳ
またはこれらのペプチドの一またはそれ以上の活性部位である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＭＤＡ変性ペプチド１−１００に対するＩｇＧ抗体の抗体反応を示すグラフ。
【図２】ＭＤＡ変性ペプチド１０１−２００に対するＩｇＧ抗体の抗体反応を示すグラフ。
【図３】ＭＤＡ変性ペプチド２０１−３０２に対するＩｇＧ抗体の抗体反応を示すグラフ。
【図４】ＭＤＡ変性ペプチド１−１００に対するＩｇＭ抗体の抗体反応を示すグラフ。
【図５】ＭＤＡ変性ペプチド１０１−２００に対するＩｇＭ抗体の抗体反応を示すグラフ。
【図６】ＭＤＡ変性ペプチド２０１−３０２に対するＩｇＭ抗体の抗体反応を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
材料および方法
ＬＤＬ酸化の結果免疫原性になるアポリポプロテインＢの部分を調べるために、ヒトアポリポプロテインＢの全配列をカバーする２０アミノ酸の長さのペプチドからなるポリペプチドライブラリーを形成した。これらのペプチドは、全ての配列をカバーするために破断点で５アミノ酸の重複を有するように製造した。ペプチドは、そのままの状態で、またはリン脂質リポソーム挿入した後、銅に接触させて酸化した後またはＬＤＬ酸化中に生じ得るアミノ酸の異なる変性を模したマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）変性の後に使用した。
【００２７】
ペプチド
ヒトアポリポプロテインＢの全アミノ酸配列に相当する３０２ペプチドを合成し（ユーロ−ダイアグノスティカ アクチボラゲット、マルモ、スウェーデンおよびケイアイ ロス ペターソン エイエス（KI Ross Petersen AS）、ホーホルム（Horholm）、デンマーク）、ＥＬＩＳＡで使用した。各合成ペプチドのフラクションを、０．５ＭのＭＤＡ（シグマ−アルドリッチ スウェーデン アクチボラゲット（Sigma-Aldrich Sweden AB）、ストックホルム、スウェーデン）で３７℃で３時間、そしてリポソームの存在下で、０．５ＭのＭＤＡにより３７℃で３時間または５μＭのＣｕＣｌ２（シグマ）により３７℃で１８時間変性させた。ＭＤＡで変性させたペプチドはいくつかの変更をした１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで、４℃で１８時間透析した。これらのペプチドの変性を、ペプチドの分離に適する変性ポリアクリルアミドゲル（バイオ−ラッド ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）、ハーキュリーズ（Hercules）、カリフォルニア（CA）で試験した。ペプチドは、該タンパク質のＮ末端から出発して、１−３０２の番号を付された。
【００２８】
他のアルデヒドをヒドロキシノネナール等の誘導体の製造に使用することもできる。
【００２９】
リポソーム
クロロホルム中、モル比９：１の卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）（シグマ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）（シグマ）と３ｍＭ濃度のリン脂質（ＰＬ）の混合物を、ガラス容器中、緩やかなアルゴン流の下で蒸発させた。その後、該容器を３時間真空下に置いた。滅菌濾過した１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４中、０．１０ｍＭペプチド（５ｍｌ）、１４５ｍＭのＮａＣｌおよび０．００３％のアジ化ナトリウムを含有する溶液をＥＰＣ／ＰＳ乾燥フィルムに添加し、５０℃で１５分間インキュベートした。この混合物を室温で約５分間穏やかにボルテックスミキサーで混合し、その後、氷冷浴中に入れ、１分間の間隙をおいて７．５アンプリチュードミクロンで３分間で３回超音波処理した（ソニープレップ（Sonyprep）１５０ ＭＳＥ サンヨー（Sanyo）、タムロ−メドラブ（Tamro-Medlab）、スウェーデン）。天然のまたは０．５ＭのＭＤＡにより３７℃で３時間もしくは５ｍＭのＣｕＣｌ２により３７℃で１８時間変性したＰＬペプチド混合物を、アルミホイルで封をしたガラスバイアルに４℃、アルゴン下で保存し、１週間以内に使用した。このＭＤＡ変性混合物を、貯蔵前に、いくつかの変化を加えた１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで、４℃で１８時間透析した。該混合物の変性を、ペプチドの分離に適する変性ポリアクリルアミドゲル（バイオ−ラッド ラボラトリーズ エイエス（Bio-Rad Laboratories AB）、サンドバイバーグ（Sundbyberg）、スウェーデン）で試験した。
【００３０】
血漿サンプル
心疾患の患者（ＡＨＰ）１０人および健常な血液ドナー（ＮＨＰ）５０人（女性２５人、男性２５人）からの血漿サンプルを集めプールした。二つのプールを分割し、−８０℃で貯蔵した。
【００３１】
ＥＬＩＳＡ
リポソームの存在下または不存在下でＰＢＳ、ｐＨ７．４（２０μｇ／ｍｌ）で希釈した天然のまたは変性した合成ペプチドを、マイクロタイタープレートウェル（ヌンク マキシソープ（Nunc Maxisorp）、ヌンク（Nunc）、ロスキルド（Roskilde）、デンマーク）に吸着させ、４℃で一晩インキュベートした。参考用として、ペプチドの一つ（Ｐ６）を、各プレートに流した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した後、コーティングされたプレートを、ＴＢＳ中のスーパーブロック（SuperBlock）（ピアース（Pierce）、ロックフォード（Rockford）、イリノイ（ILで室温で５分間ブロックし、続いて、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）で希釈されたプールされたヒト血漿、ＡＨＰまたはＮＨＰを室温で２時間、その後４℃で一晩インキュベートした。すすいだ後、該ペプチドに対する自己抗体の付着を、ＴＢＳ−Ｔで適当に希釈したビオチニル化ウサギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ抗体（ダコ エイ／エス（DakoA/S）、グロストラップ（Glostrup）、デンマーク）を用いることにより検出した。さらに室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、結合したビオチニル化抗体をアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（シグマ）で検出し、室温で２時間インキュベートした。着色反応を、ホスファターゼ基質キット（ピアース）を用いて展開し、室温で１時間インキュベートした後、４０５ｎｍの吸収を測定した。異なるペプチドの吸収値をＰ６の吸収値で分け、比較した。
【００３２】
アポリポプロテインＢの配列は、添付図面の配列番号１〜３７に示されている。ＡＨＰおよびＮＨＰのいずれも、大量の異なるペプチドに対する抗体を含んでいた。天然および変性ペプチドの両方に対する抗体が同定された。通常、ＭＤＡ変性ペプチドに対する抗体力価は、対応する天然型ペプチドのものより高いか等しい。天然型、ＭＤＡ変性、銅酸化ペプチドを比較すると、高い相関度を示し、ＭＤＡ変性ペプチドを用いた場合にもっとも高い抗体力価が検出された。リポソームに組み込まれたペプチドを使用すると、抗体レベルは増加しなかった。ＩｇＭサブクラスの抗体は、ＩｇＧサブタイプの抗体に比べてはるかに一般的である。
【００３３】
最も高い抗体レベルが検出されたペプチドは、一般的な特性により６グループに分けることができた（表１）：
（Ａ）ＭＤＡ変性ペプチドに対する高レベルのＩｇＧ抗体（ｎ＝３）
（Ｂ）高レベルのＩｇＭ抗体であるが、天然型およびＭＤＡ変性ペプチドに差はなかった（ｎ＝９）
（Ｃ）高レベルのＩｇＧ抗体であるが、天然型およびＭＤＡ変性ペプチドに差はなかった（ｎ＝２）
（Ｄ）ＭＤＡ変性ペプチドに対する高レベルのＩｇＧ抗体、ＡＨＰ−プールに比べて、ＮＨＰ−プールにおいて少なくとも２倍高い（ｎ＝５）
（Ｅ）ＭＤＡ変性ペプチドに対する高いレベルのＩｇＭ抗体、ＡＨＰ−プールに比べて、ＮＨＰ−プールにおいて少なくとも２倍高い（ｎ＝１１）
（Ｆ）高レベルのＩｇＧ抗体であるが、無傷のおよびＭＤＡ変性ペプチドの差はなく、ＡＨＰプール中の抗体はＮＨＰプールと比較して少なくとも２倍である（ｎ＝７）
（Ｇ）ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体がない
【００３４】
表１
Ａ． 高レベルＩｇＧ、ＭＤＡ−差
Ｐ １１． ＦＬＤＴＶＹＧＮＣＳＴＨＦＴＶＫＴＲＫＧ
Ｐ ２５． ＰＱＣＳＴＨＩＬＱＷＬＫＲＶＨＡＮＰＬＬ
Ｐ ７４． ＶＩＳＩＰＲＬＱＡＥＡＲＳＥＩＬＡＨＷＳ
Ｂ． 高レベルＩｇＭ、ＭＤＡ−差なし
Ｐ ４０． ＫＬＶＫＥＡＬＫＥＳＱＬＰＴＶＭＤＦＲＫ
Ｐ ６８． ＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫＱＴＥＡＴＭＴＦＫ
Ｐ ９４． ＤＧＳＬＲＨＫＦＬＤＳＮＩＫＦＳＨＶＥＫ
Ｐ ９９． ＫＧＴＹＧＬＳＣＱＲＤＰＮＴＧＲＬＮＧＥ
Ｐ １００． ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
Ｐ １０２． ＳＬＴＳＴＳＤＬＱＳＧＩＩＫＮＴＡＳＬＫ
Ｐ １０３． ＴＡＳＬＫＹＥＮＹＥＬＴＬＫＳＤＴＮＧＫ
Ｐ １０５． ＤＭＴＦＳＫＱＮＡＬＬＲＳＥＹＱＡＤＹＥ
Ｐ １７７． ＭＫＶＫＩＩＲＴＩＤＱＭＱＮＳＥＬＱＷＰ
Ｃ． 高レベルＩｇＧ、ＭＤＡ 差なし
Ｐ １４３． ＩＡＬＤＤＡＫＩＮＦＮＥＫＬＳＱＬＱＴＹ
Ｐ ２１０． ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫＫＮＫＨ
Ｄ． ＮＨＳ／ＡＨＰ、ＩｇＧ−ａｋ＞２、ＭＤＡ−差
Ｐ １． ＥＥＥＭＬＥＮＶＳＬＶＣＰＫＤＡＴＲＦＫ
Ｐ １２９． ＧＳＴＳＨＨＬＶＳＲＫＳＩＳＡＡＬＥＨＫ
Ｐ １４８． ＩＥＮＩＤＦＮＫＳＧＳＳＴＡＳＷＩＱＮＶ
Ｐ １６２． ＩＲＥＶＴＱＲＬＮＧＥＩＱＡＬＥＬＰＱＫ
Ｐ ２５２． ＥＶＤＶＬＴＫＹＳＱＰＥＤＳＬＩＰＦＦＥ
Ｅ． ＮＨＳ／ＡＨＰ、ＩｇＭ−ａｋ＞２、ＭＤＡ−差
Ｐ ３０１． ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ
Ｐ ３０． ＬＬＤＩＡＮＹＬＭＥＱＩＱＤＤＣＴＧＤＥ
Ｐ ３１． ＣＴＧＤＥＤＹＴＹＫＩＫＲＶＩＧＮＭＧＱ
Ｐ ３２． ＧＮＭＧＱＴＭＥＱＬＴＰＥＬＫＳＳＩＬＫ
Ｐ ３３． ＳＳＩＬＫＣＶＱＳＴＫＰＳＬＭＩＱＫＡＡ
Ｐ ３４． ＩＱＫＡＡＩＱＡＬＲＫＭＥＰＫＤＫＤＱＥ
Ｐ １００． ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
Ｐ １０７． ＳＬＮＳＨＧＬＥＬＮＡＤＩＬＧＴＤＫＩＮ
Ｐ １４９． ＷＩＱＮＶＤＴＫＹＱＩＲＩＱＩＱＥＫＬＱ
Ｐ １６９． ＴＹＩＳＤＷＷＴＬＡＡＫＮＬＴＤＦＡＥＱ
Ｐ ２３６． ＥＡＴＬＱＲＩＹＳＬＷＥＨＳＴＫＮＨＬＱ
Ｆ． ＮＨＳ／ＡＨＰ、ＩｇＧ−ａｋ＜０．５、ＭＤＡ−差なし
Ｐ １０． ＡＬＬＶＰＰＥＴＥＥＡＫＱＶＬＦＬＤＴＶ
Ｐ ４５． ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ
Ｐ １１１． ＳＧＡＳＭＫＬＴＴＮＧＲＦＲＥＨＮＡＫＦ
Ｐ １５４． ＮＬＩＧＤＦＥＶＡＥＫＩＮＡＦＲＡＫＶＨ
Ｐ １９９． ＧＨＳＶＬＴＡＫＧＭＡＬＦＧＥＧＫＡＥＦ
Ｐ ２２２． ＦＫＳＳＶＩＴＬＮＴＮＡＥＬＦＮＱＳＤＩ
Ｐ ２４０． ＦＰＤＬＧＱＥＶＡＬＮＡＮＴＫＮＱＫＩＲ
Ｇ．
Ｐ ２． ＡＴＲＦＫＨＬＲＫＹＴＹＮＹＱＡＱＳＳＳ
【００３５】
これらの３８のペプチド配列の全ては、アテローム動脈硬化症および虚血性心疾患の進展に重要な役割を果たす免疫応答の標的を表す。従って、これらのペプチドは、アポリポプロテインＢにおけるＭＤＡ変性アミノ酸の定められた配列に対する抗体レベルと心疾患の進展のリスクとの関連を決定するＥＬＩＳＡの開発に使用され得る。
【００３６】
これらのペプチドは、酸化ＬＤＬで免疫した実験動物に見られる保護免疫の可能なメディエータをも表し、アテローム動脈硬化症に対する免疫療法またはワクチンのさらなる開発における試験のために使用され得る。
【００３７】
このように、ヒトアポリポプロテインＢにおける３８の異なる配列が、ヒトにおいて免疫応答を著しく上昇させることが確認された。これらのエピトープは、酸化ＬＤＬに対する抗体としてあらかじめ記載されたものを表すと考えられる。殆どの免疫応答は、ペプチド配列を指向し、アポリポプロテインＢはＬＤＬにおける唯一のタンパク質であるので、このプロジェクトで用いられる試みは、酸化ＬＤＬ粒に対する本質的に全ての抗体についての特異的なエピトープを同定することができるであろう。カルジオリピンに対する抗体を含むリン脂質特異的抗体ファミリーが酸化ＬＤＬと反応するが、これらの抗体の特異性および役割は完全に特徴的であり続けることが記載されている。
【００３８】
多くの場合、ＭＤＡ変性ペプチドに対する抗体力価は、対応する天然型ペプチドのものより高い。ＭＤＡ変性ペプチドに対する抗体が検出された場合、それはほぼ常に天然型配列に対する抗体の存在と関連する。これに対する説明としては、アポリポプロテインＢにおいてＭＤＡ変性アミノ酸（ＬＤＬ酸化の結果生じるＭＤＡ変性）に対する免疫応答が天然型の配列に対する許容性の破壊を導くことが考えられる。他の配列については、ＭＤＡ変性と天然型配列に対する抗体力価に差はない。これは、免疫応答が天然型配列に対するものを指向していることを提案する。免疫系に通常さらされているタンパク質のアミノ酸配列に対する免疫応答はない。天然型ＬＤＬ粒において、アポリポプロテインＢの大部分はＬＤＬのリン脂質層に隠れているので、免疫系にアクセスできない。ＬＤＬの酸化の間に、アポリポプロテインＢのアミノ酸鎖は断片化され、三次元構造に変化が生じる。これにより、通常は免疫応答にアクセス不可能なペプチド配列が露出し、これらの配列に対する抗体が生成すると考えられ、これが天然型のアポリポプロテインＢに対する抗体の存在が見られることを説明するであろう。さもなければ、真の免疫応答は、ＭＤＡ変性配列に対するものであるが、天然型の配列と交差反応性を有し、結合に差がないほど大きいことが示されるであろう。
【００３９】
表２
７８人の被験者（後天的に進展した心筋梗塞、２６の健常対照群（healthy controls）および２６の疾病はないが高リスクの個体）における異なるペプチドと内膜／中膜の厚さとして評価した頸動脈におけるアテローム動脈硬化症との相関
＋、ｒ＞０．２＜０．３、ｐ＝＜０．０５；＋＋、ｒ＞０．３＜０．４、ｐ＝０．０１；＋＋＋、ｒ＞０．４、ｐ＝＜０．００１、灰色、心筋梗塞に罹患した群で顕著に増加したペプチド抗体レベル
【００４０】
酸化ＬＤＬ中の特定のエピトープに対する免疫反応と心疾患の進展の存在および／または危険性との関係を調べるために、これらのペプチド（天然型またはＭＤＡ変性型）に基づいたＥＬＩＳＡを使用し得る可能性を、予備的研究として調べた。この研究は、マルモ ダイエット キャンサー スタディ（Malmo Diet Cancer study）（人口ベースの研究）に参加した被験者について行われ、１９８９年と１９９３年の間に３０，０００以上の個体を募集した。表１に列挙した３８のペプチドのうちの２４のペプチドに対する抗体レベルを、継続期間に急性心筋梗塞が進展した２６人の被験者、年齢、性および喫煙の有無を合わせた２６の健常者対照群の基線の血漿サンプルについて調べた。年齢、性および喫煙の有無を合わせた、ＬＤＬコレステロール値が５．０ｍｍｏｌ／ｌ以上の群も、心疾患が進展していない高リスクグループ中の抗体レベルを研究するために含めた。
【００４１】
分析された２４のペプチドのうちの１９のペプチドについては、ＭＤＡ変性ペプチドに対するＩｇＭ抗体レベルと、総頚動脈の超音波調査によって評価されるような頚動脈（内膜／中膜厚さ）中のアテローム性動脈硬化症の程度の間に著しい相関性が確認された。即ち、より高い抗体レベルはより増大したアテローム性動脈硬化症となる（表２）。これらのペプチドの多くに、天然のペプチドに対する抗体のレベルと頚動脈の内膜／中膜厚さとの著しい相関性が存在した。４つのペプチドだけが、ＩｇＧ抗体と頚動脈の内膜／中膜厚さとの著しい相関性を示した。これらの観察は、アテローム性動脈硬化症が進展した患者の確認に、ＭＤＡ変性ペプチド（単独で、あるいは組み合わせて）を使用するＥＬＩＳＡを使用し得ることを示唆する。
【００４２】
試験したペプチドのうちの４つは、アテローム性動脈硬化症が進展した存在に関連するだけでなく、その後心筋梗塞を罹患した患者群においても著しく上昇した（表２）。これらのペプチドのうちの１つ（ペプチド２４０）のデータを図７に示す。これらの観察は、さらに、ペプチドベースのＥＬＩＳＡが心筋梗塞が進展する危険が増加している患者を確認するのにも使用し得ることを示す。
【００４３】
また、後に心筋梗塞に罹患した群においても、天然型のペプチド１０３、１６２および１９９、およびＭＤＡ変性ペプチド１０２に対するＩｇＧ抗体レベルの著しい増加があった。しかしながら、これらのペプチドに対するＩｇＧ抗体は、頚動脈中のアテローム性動脈硬化症の存在にはそれほど関係していなかった。
【００４４】
特に興味深い観察は、健常者対照群および高リスクグループ（５．０ｍｍｏｌ／ｌより高いＬＤＬコレステロール）において、心筋梗塞が進展したグループよりも著しく高いレベルのＩｇＭ抗体が存在したＭＤＡ変性ペプチド２１０に対する抗体に見られた。従って、ＭＤＡ変性ペプチド２１０に対する抗体は、心疾患が進展する危険性が減少した個体のためのマーカーを表わし得る。
【００４５】
天然型およびＭＤＡ変性アポＢ−１００ペプチド配列による免疫感作が実験動物にアテローム性動脈硬化症の抑制をもたらすことが示された（ノーディン フレドリクソン（Nordin Fredrikson）、（ソダーバーグ他）（Soderberg et al）、シュー他（Chyu et al）。これらのアテロームの防御免疫応答が作動するメカニズムはまだ完全には解明されていない。しかしながら、考えられる可能性は、これらのペプチド配列に対して生成された抗体によってアテロームの保護効果が媒介されるということである。これらの抗体は、例えばマクロファージＦｃ受容体による酸化的に損傷したＬＤＬ粒子の除去を促進するであろう。
【００４６】
マクロファージスカベンジャー受容体は、広範囲の酸化的損傷を伴うＬＤＬのみを認識する。最近の研究により、循環する酸化ＬＤＬの存在が確認された（１０、１１）。これらの粒子は、最小の酸化的損傷のみを有しており、スカベンジャー受容体によって認識されない。循環する酸化ＬＤＬ粒子への抗体の結合は、それらが血管組織に蓄積する前に、循環からそれらが取り除かれるのを助ける（１２）。
【００４７】
いくつかの研究は、アテローム性動脈硬化症からの保護における抗体用の役割を支持した。Ｂ細胞の再構成は、脾臓が摘出されたアポＥ ｎｕｌｌマウス（１３）におけるアテローム性動脈硬化症の進展およびＲＡＧ−１マウスにおける頚動脈の傷の後の新内膜形成を抑制した（我々の研究所からの出版されていない観察）。さらに、免疫グロブリンを繰り返し注射することによりアポＥ ｎｕｌｌマウス中のアテローム性動脈硬化症が縮小されることが示された（６）。
【００４８】
上記で論じたように、アポＢ−１００の中のＭＤＡ変性ペプチド配列に対する抗体は、合成ペプチドを用いた能動免疫感作により生じ得る。この方法は、抗体産生の完全な効果が得られるまでに、２〜３週間を要する。
【００４９】
いくつかの状況においては、より迅速な効果が必要であり得る。一例として、酸化ＬＤＬが炎症に寄与している不安定なアテローム性動脈硬化のプラークが挙げられる。これらの状況下では、天然型およびＭＤＡ変性配列に対する精製された、または遺伝子組み換えにより生産された抗体の注入による受動免疫法が、より速い効果を奏し得る。
【００５０】
精製された、または遺伝子組み換えにより生産された抗体の注入による受動免疫法が有効である別の状況として、高齢の個体における冠動脈疾患が挙げられる。我々の研究により、人が高齢となるに従ってアポＢペプチド配列に対する抗体の減少が生じ、これが酸化ＬＤＬの血漿レベルの増加に関係していることが示された（ノーディン フレドリクソン、ヘドラブ他（Hedblad et al。このことは、酸化ＬＤＬにおいて、抗原に対する抗体産生を担う免疫細胞の老化を示唆し得る。また、循環からの酸化的に損傷したＬＤＬ粒子の不完全なクリアランスに帰するかもしれない。従って、これらの患者は、アポＢ−１００ペプチド配列による能動免疫法からよりも、精製された、または遺伝子組み換えにより生産された抗体の注入による受動免疫法により、さらに利益を受け得る。
【００５１】
下記で使用される合成の天然型ペプチド（ユーロ−ダイアグノスティカ アクチボラゲット（Euro-Diagnostica AB）、マルモ（Malmo）、スウェーデン）は、最初にスクリーニングされたポリペプチドライブラリーからのペプチド１、２および３０１であった。ペプチド１（アミノ酸配列：ＥＥＥＭＬＥＮＶＳＬＶＣＰＫＤＡＴＲＦＫ、ｎ＝１０）およびペプチド３０１（アミノ酸配列：ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ、ｎ＝１０）は、各々天然型ペプチドよりも、ＭＤＡ変性ペプチドに対する高いＩｇＧまたはＩｇＭ抗体応答を有することが見出された。また、両方の力価は健常者において、より高い値であった。これらのペプチドは、これらのペプチドに対する抗体反応がアテローム性動脈硬化症に対して保護するかもしれないという仮定に基づいて選択された。
【００５２】
ペプチド２（アミノ酸配列：ＡＴＲＦＫＨＬＲＫＹＴＹＮＹＱＡＱＳＳＳ、ｎ＝１０）は、初期の抗体スクリーニングにおいて抗体反応を誘起しなかったので、コントロールペプチドとして選択された。ミョウバンを投与したマウスをコントロール（ｎ＝９）に供した。
【００５３】
アポＥ（−／−）マウスに、６−７週齢で皮下に一次免疫を受けさせ、３週間後に腹腔内ブースターを行った。マウスに、免疫感作の開始からの高コレステロール食を与え、２５週齢で屠殺するまで継続した。屠殺時に、４グループのマウス中の体重に著しい違いはなかった。また、市販のキット（シグマ）を使用して測定された血清コレステロールに統計的な有意差はなかった。それらの平均血清コレステロール値はすべて７１５ｍｇ／ｄｌより高かった。
【００５４】
アテローム性動脈硬化のプラークによって覆われた下行大動脈の領域をオイルレッドＯ染色の後のｅｎ ｆａｃｅ調製で測定した。コントロール群と比較すると、ペプチド番号２および３０１で免疫したマウスにおいては、アテローム性動脈硬化の病巣が実質的に減少した（図２）。ペプチド番号１による免疫感作は、コントロール群と比較して、アテローム性動脈硬化症の顕著な減少を生じなかった。下行大動脈とは対照的に、大動脈根中のアテローム性動脈硬化症の病巣は４つの実験群で異なることはなかった（図３）。
【００５５】
大動脈洞プラークの大きさあるいはその脂質含量については、４つのグループで差はなかった（表Ａ）。４グループのマウスにおいて、大動脈弓中の平均プラークサイズに違いはなかった。しかしながら、オイルレッドＯ染色による胸部および腹部の下行大動脈のプラークサイズのｅｎ ｆａｃｅ評価は、コントロールグループとペプチド番号１のグループが大動脈に同様の量のアテローム性動脈硬化のプラークを有するのに対し、ペプチド番号２および９のグループが大動脈に著しく縮小されたアテローム性動脈硬化の病巣を有していることを明らかにした（表Ａ）。ペプチド免疫感作は大動脈洞あるいは大動脈弓のプラークサイズに影響しなかったが、下行大動脈のプラークを縮小したという観察は興味深く、ペプチド免疫感作が新しいプラーク形成を縮小するかもしれないがプラークの進行に影響しないことを示唆する。
【００５６】
さらに、ペプチド免疫がアテローム性動脈硬化のプラークの表現型を調整するかどうか試験した。凍結切片の形態の大動脈洞プラークを単球／マクロファージ抗体（ＭＯＭＡ−２、セロテック（Serotec））で免疫組織化学的に染色した。
【００５７】
ｅｎ ｆａｃｅ観察による発見と一致して、ペプチド番号２は、マクロファージの浸潤を実質的に減少させた（図１）。三色染色により、ペプチド番号２のグループからの大動脈洞プラークにおいて、平均４０．０±７．７％のコラーゲン含量が明らかになった；ミョウバンコントロールグループ、ペプチド番号１番のグループ、ペプチド番号９のグループの平均コラーゲン含量は、それぞれ３２．３±５．３％、３５．６±８．５％および２９．４±９．６％であった。
【００５８】
各グループにおいて免疫感作したペプチドに対する抗体反応が測定された。免疫感作後の抗体価はペプチド番号１の群で６．１±３．１倍、ペプチド番号２のグループで２．４±１．０倍、ペプチド番号９のグループで１．８±０．６倍であったのに対し、ミョウバングループはペプチド番号１に対して３．９±２．７倍の増加、ペプチド番号２に対し２．０±０．５倍の増加、ペプチド番号９に対して２．０±０．９倍の増加であった。免疫グループとミョウバン処理グループの両方で免疫ペプチドに対する抗体価が並列的に増加したことは驚くべきことである。このことは、下記の可能性を意味するであろう：
（１）体液の免疫応答（細胞の免疫応答のような）以外のメカニズムは、アテローム性動脈硬化症を調整することに関与し得る；あるいは、（２）この抗体の増加は経時的コレステロール過剰血症に対するバイ−ストランダー（by-stander）反応であった。
【００５９】
なぜペプチド免疫感作がアテローム性動脈硬化症を縮小したかを説明し、および／またはプラーク表現型を調整する明瞭な推定メカニズムはないが、この発明の新規性は免疫原としてＬＤＬのペプチドを使用することおよび免疫修飾手段としてのその実現可能性の点にある。このペプチドベースの免疫手段はアテローム性動脈硬化のプラークを調節する。抗原として同族のｏｘＬＤＬあるいは天然型のＬＤＬを使用した免疫感作により、プラークサイズが縮小されることが示されたが１−３、同族のヒトＬＤＬの有用性、生産、感染および安全性の点から、このアプローチを臨床に適用するのは魅力に欠ける。我々の最終結果は、健常者におけるより高いＩｇＭまたはＩｇＧ抗体反応を有するペプチドを使用する免疫感作が、進行したアテローム性動脈硬化のプラークの進展から、実験動物を保護するかもしれないという我々の初期の仮説と異なるが、ペプチドベースの免疫療法が実現可能であることはここで実証される。
【００６０】
免疫ペプチド番号２を使用する免疫感作が下行大動脈における新しいアテローム性動脈硬化症の進展およびマクロファージ潜入の減少およびプラーク中のより高いコラーゲン含有量から動物を保護したことを見いだしたのは、そのペプチドが初期のヒトスクリーニングではなんの抗体応答をも与えなかったので、驚くべきことである。これは、（ａ）ペプチド番号２がヒトの免疫系に露出されていないアポ−Ｂ−１００蛋白質構造の一部であるからかもしれない。従って、抗体は健康なヒトの血清プールから生成されず検知されなかった；（ｂ）また、それはペプチド番号２のアミノ酸配列が、マウスにとっては外来であり、マウスは、新しいアテローム性動脈硬化症の形成を調整するこのペプチドおよびその表現形に対する免疫応答を進展させないためであるとも考えられる。
【００６１】
プラークサイズが大動脈枝の異なる部分で評価される場合、プラークサイズに対する同族のＬＤＬ免疫の効果が変動した。例えば、アメリ他（Ameli et al）は、高コレステロール血症のウサギにおいて、天然型のＬＤＬによる免疫感作により大動脈のプラーク形成が縮小されることを示し１、フレイギャング（Freigang et al）は、プラークサイズの縮小を大動脈ではなく大動脈洞で示した。彼らの発見と本発明の発見を合わせると、ペプチド免疫がプラークサイズだけでなくプラークの組成をも調整することが推測された。プラークを縮小する効果は、下行大動脈でのみ観察された。アポＥ（−／−）マウスは単一の動物の中の発展の様々な段階で、特に高コレステロール食を供給された時、アテローム性動脈硬化症を進展させることが知られている。若い動物におけるアテローム性動脈硬化症の初期の外観は大動脈洞にあり６、７、また１５週後の高脂、高コレステロール食による大動脈洞の疾病は進行したプラークであった。これに対し、アテローム性動脈硬化症の初期段階は下行大動脈にあった６。下行大動脈中のプラーク成熟および進展の一時的な進行が、大動脈洞のそれと比べて遅いので、免疫感作が下行大動脈中の疾病の大きさを縮小したが、大動脈洞中の疾病はしないという発見は、免疫感作がアテローム性動脈硬化症組成の初期の段階に影響することを示唆する。高齢の、そして血清コレステロールの値が超生理学的である動物は、コレステロール過剰血の悪影響によって免疫感作のプラーク縮小効果が打ち消される可能性がある。さらに、大動脈洞プラークが早く成熟し、２５週齢で屠殺された場合、プラークサイズになんらかの差異を検出するには遅すぎる。病巣の大きさは大動脈洞プラーク中では調整されないが、ペプチド免疫感作によりプラークの組成は調整された。本発明の実験計画は、下行大動脈の進展の初期の段階のプラークの組成を検討することを妨げた。
【００６２】
実験結果は、アテローム性動脈硬化症を防ぐ新規なアプローチのための、あるいは重篤な高脂血症の場合でも順調にプラーク表現型を調整するための免疫源として、ＬＤＬ関連アポＢ−１００のペプチド配列を使用する実現可能性を強調する。このペプチドベースの免疫感作の手法は、同族のＬＤＬの絶縁および単離および調製の必要性およびそれに付随する汚染の危険性を排除できるので、抗原として同族のｏｘＬＤＬまたは天然型ＬＤＬを使用するよりも有利である。ペプチド番号２および３０１による免疫感作のプラーク縮小効果は、下行大動脈でのみ見られた。これらの発見は、他の治療の介在も大動脈弓よりも下行大動脈で高い効果を示すという過去の報告とも矛盾せず、おそらく疾病が下行大動脈より大動脈の根および大動脈弓でより急速に進展するので１４〜１７、介在１４、１５、１６、１８、１９のためのより小さな機会を作り出すと考えられる。下行大動脈中のプラーク成熟および進展の一時的な進行が、大動脈洞および大動脈弓でのそれと比べて遅いので、免疫感作が下行大動脈中で病巣サイズを縮小するが、大動脈洞中および大動脈弓ではしないという発見は、免疫感作がアテローム性動脈硬化症組成の初期の段階を優先的に防ぐことを示唆する。高齢の、そして血清コレステロールの値が超生理学的である動物は、コレステロール過剰血の悪影響によって免疫感作のプラーク縮小効果が打ち消される可能性がある。病巣サイズは大動脈洞か大動脈弓で調整されなかったが、ペプチド番号２による免疫感作は、縮小されたマクロファージ浸潤および増加したコラーゲン量の、より安定したプラーク表現型を生じさせる好ましい方向にプラークの組成を調整しなかった。要約すると、マウスモデル中のアテローム性動脈硬化症の抑制のための新規なペプチドベースの免疫調節アプローチが実証される。
【００６３】
要約すると、新規なペプチドベースの免疫調節アプローチが、アテローム性動脈硬化のプラークを調整することが実証される。我々のモデル中のアテローム性動脈硬化症組成の変化は中程度でしかなかったが、このペプチドベースの免疫感作はアテローム性動脈硬化症の研究、予防または治療において、代替ツールを提供し得る。
【００６４】
方法
ペプチドの調製
ペプチドは、イムジェクト（Imject）（登録商標）スーパーキャリヤ（SuperCarrier）（登録商標）ＥＤＣキット（ピアース、ロックフォード、イリノイ）を用い、製造者の指示に従い、小さな変更を加えて製造した。結合バッファー５００μｌ中のペプチド１ｇを２００μｌの脱イオン水中の２ｍｇの担体と混合した。その後、この混合物を１ｍｇの結合試薬（ＥＤＣ、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドＨＣｌ）と共に室温で２時間インキュベートした。その後、０．０８３Ｍリン酸ナトリウム、０．９Ｍの塩化ナトリウムｐＨ７．２溶液で４℃で一晩透析した。この透析結合物を、Ｉｍｊｅｃｔ乾燥配合生成バッファーで希釈し、最終容量を１．５ｍｌとした。免疫アジュバントとしてミョウバンを用い、容量比１：１でペプチド結合物と混合した。各免疫感作におけるペプチドの量は、注射一回あたり３３μｇ／１００μｌであった。
【００６５】
動物プロトコル
ジャクソン ラボラトリーズ（Jackson Laboratories）（バー ハーバー（Bar Habor））、メイン（Me）からのアポＥ（−／−）マウスに、６〜７週齢で皮下投与による第一回の免疫感作を行い、続いて３週後に腹腔内ブースターを行った。免疫感作開始時からマウスに高コレステロール食を与え、２５週齢で屠殺するまで続けた。２週間後、屠殺時に血液サンプルを集めた。ミョウバンを投与したマウスをコントロールとした。実験プロトコルは、セダーズ−シナイ メディカル センターの動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）に認可された。全てのマウスを米国認定動物管理研究所（American Association of Accreditation of Laboratories Animal Care）に委託した動物施設内に入れ、１２時間の昼夜サイクルで飼育し、水および餌を制限せずに与えた。屠殺時にマウスにエンフルレンの吸入による麻酔をかけた。屠殺前に血漿をレトロオービタルブリード（retro-orbital bleeding）により採取した。
【００６６】
組織採取および分割
アテローム動脈硬化の形成に対するペプチド免疫感作の効果を評価するために、大動脈洞、大動脈弓および下行胸部および腹部大動脈のプラークの大きさを評価した。心臓および大動脈枝（tree）に生理学的な圧力で規定の食塩水をかけた後、心臓および近位の大動脈を取り出し、ＯＣＴ化合物（ティシュー−テック（Tissue-Tek））に埋め込み、冷凍した。連続的な６μｍの厚切片を少なくとも２つの大動脈弁の外観から集め、大動脈洞プラーク評価用の大動脈弁の一片を消失させた。典型的には、連続する３つの切片が１枚のスライド上に置き、合計２５−３０枚のスライドを一匹のマウスから集めた。また、スライド五枚目毎に染色のためにグループ分けした。また、左鎮骨下動脈までの上行大動脈および大動脈弓も同様に切片にし、処理した。胸部および腹部の下行大動脈を、オイルレッドＯ染色の後にプラークの組成のｅｎ ｆａｃｅ評価のために別々に処理した。
【００６７】
胸部および腹部下行大動脈のｅｎ ｆａｃｅ調製物
８ｇ／ｍｌの水中濃度の鶏卵アルブミン（シグマ）を、グリセリンと１：１で混合した。アジ化ナトリウムを添加し、アジ化ナトリウムの最終濃度を０．２％とした。胸部および腹部の大動脈から周辺の組織および脂肪を除去して清浄にした後、左側の腎臓部の動脈から鎮骨下動脈までの大動脈切片を、ヒストチョイス（Histochoice）（アムレスコ（Amresco））内で一晩定着させるために注意深く除去した。その後、大動脈は注意深く縦に開き、卵アルブミン溶液新たに被覆されたスライド上にルミナールと共にサイドアップで置いた。アルブミン溶液が乾燥したら、大動脈をオイルレッドＯで染色し、コンピューター補助組織学でアテローム性動脈硬化症の範囲を評価した。
【００６８】
免疫組織化学と組織学
大動脈洞からの切片を、標準のプロトコルを使用して、ＭＯＭＡ−２抗体（セロテック）で免疫組織化学的に染色した。コラーゲンの量およびプラークの大きさおよび脂質含有量についてのオイルレッドＯ染色を評価するためのトリクロム染色を、標準の染色プロトコルを用いて行った。コンピューター補助形態分析を、前記のように組織構造を評価するために行った８。
【００６９】
抗体力価測定
ペプチド免疫感作の後の抗体応答を測定するために、ＥＬＩＳＡを開発した。免疫化したペプチドに対する抗体力価を、ブースターの２週間後、屠殺時に集めた血液を使用して測定した。３つのペプチドに対する抗体応答を、同じタイミングのミョウバングループにおいて測定した。ＰＢＳ ｐＨ ７．４（２０μｇ／ｍｌ）で希釈した天然型の合成ペプチドを、マイクロタイタープレートウェル（ヌンク マキシソープ、ヌンク、ロスキルド、デンマーク）に吸着させ、４℃で一晩インキュベートした。０．０５０％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、コーティングしたプレートを、ＴＢＳ中のスーパーブロック（ピアース）で室温で５分間ブロックし、その後、室温で２時間、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）中、１／５０に希釈したマウス血清を室温で２時間、その後４℃で一晩インキュベートした。すすいだ後、ペプチドを指向する抗体の付着物を、ＴＢＳ−Ｔの中で適切に薄められた、該ペプチドを指向する抗体の付着物を、ＴＢＳ−Ｔで適切に希釈したビオチニル化ウサギ抗マウスＩｇ抗体（ダコ エイ／エス（Dako A/S）、グロストラップ（Glostrup）、デンマーク）を使用して検出した。さらに２時間インキュベートした後、該プレートを洗浄し、結合したビオチニル化抗体をアルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジン（シグマ）によって検出し、室温で２時間でインキュベートした。ホスファターゼ基質キット（ピアース）を用いて着色反応を展開した。４０５ｎｍにおける吸光度を、室温で１時間のインキュベートの後に測定した。バックグランドを差し引いた後、平均値を計算した。
【００７０】
当然ながら、他のアッセーモデル、例えば、放射性免疫測定のような抗体を検出するイムノアッセー、ウェスタンブロッティングおよびサザンブロッティング、並びにペプチドに結合した抗体の検出、酵素電極、および他の分析方法も同様に利用できる。
【００７１】
統計
データは平均値±Ｓｔｄ．として示される。使用される統計方法は、本文、表または図に挙げた。Ｐ＜０．０５の時、統計的に有意であるとした。
【００７２】
表Ａ 大動脈洞のプラークサイズおよびその脂質含有量、大動脈弓プラークサイズおよび下行大動脈中のプラークの比率
＊ミョウバングループとの有意差。統計分析にはＡＮＯＶＡ、続いてターキー−クラマー（Tukey-Kramer）試験を使用した。
【００７３】
アポＥノックアウトマウスのアテローム性動脈硬化症におけるアポリポプロテインＢ−１００ペプチド配列の免疫感作の効果のデータを表Ｂに示す。
【００７４】
表Ｂ
アポＥノックアウトマウスにおけるアテローム性動脈硬化症のアポリポプロテインＢ−１００ペプチド配列による免疫感作の効果
【００７５】
複数のペプチド配列の混合物を用いた免疫感作
大動脈におけるアテローム性動脈硬化症に対する効果
1. ペプチド配列 １４３および２１０ −６４．６％
2. ペプチド配列 １１、２５および７４ −５９．６％
3. ペプチド配列 １２９、１４８および１６７ −５６．８％
4. ペプチド配列 ９９、１００、１０２、１０３および１０５ −４０．１％
5. ペプチド配列 ３０、３１、３２、３３および３４ ＋６．６％
6. ペプチド配列 １０、４５、１５４、１９９および２４０ ＋１７．８％
【００７６】
単一ペプチド配列を用いた免疫感作
1. ペプチド配列 ２ −６７．７％
2. ペプチド配列 ２１０ −５７．９％
3. ペプチド配列 ３０１ −５５．２％
4. ペプチド配列 ４５ −４７．４％
5. ペプチド配列 ７４ −３１．０％
6. ペプチド配列 １ −１５．４％
7. ペプチド配列 ２４０ ０％
【００７７】
ペプチドの投与は、通常、皮下注射、静脈注射、筋肉注射あるいは腹腔内注射のような注射によって行われる。第一の免疫の投与量は、体重、年齢および他の身体的医学的条件に依存して、患者一人当たり１〜１００ｍｇであり得る。特別な状況下では、１種類またはそれ以上のペプチドを含有する溶液をカテーテルによって冠状動脈の血管に局所投与することも可能である。血流への吸収を可能にするには認めるために特別の注意を払わなければならないが、経口投与も同様に考慮され得る。注射剤は、本発明の断片またはペプチドの一種類またはそれ以上を０．５〜９９．５重量％を含有し得る。
【００７８】
ペプチドは通常、陽イオン化したウシ血清アルブミンに結合して、またアジュバントとして水酸化アルミニウムを使用して投与される。当該分野で知られている他のアジュバントも同様に使用することができる。
【００７９】
ペプチドの投与のための溶液はＥＤＴＡまたは酸化防止剤を含まない。
ペプチドは、アテローム性動脈硬化症に既に罹患している患者に治療剤として使用されてもよい。従って、本発明の断片またはペプチドの一種類またはそれ以上を加えるために、いかなる適切な投与経路を使用してもよい。
【００８０】
初期の研究は、ペプチドのどのタイプの酸化変性がヒトの血漿中で抗体によって認識されるに至るかを決定することに焦点を絞っていた。これらの研究は、ペプチド１−５および２９７−３０２を使用して行われた。ＬＤＬの酸化中に、リン脂質およびコレステロールエステル中のポリ不飽和脂肪酸は、悪玉アルデヒド（ＭＤＡ）のような高度に反応性のブレークダウン生成物の生成にいたる過酸化を進行させる。その後、ＭＤＡは、それらを高度に免疫原性にするアポＢ−１００の中のリジンおよびヒスチジン残基との共有結合付加物を形成し得る。ＬＤＬの酸化は、さらに、免疫系には通常アクセス可能でないペプチド配列を露呈させるアポＢ−１００の分割に至る。天然型のペプチドが使用された実験において、ＭＤＡ変性の後、あるいはリン脂質リポソーム中への進入およびそれに続く銅の酸化またはＭＤＡ変性の後、ＩｇＭ抗体が、天然型のＭＤＡおよびリポソーム酸化ペプチドに対して同定され、抗体力価はＭＤＡ−ペプチド＞ＭＤＡ変性リポソームペプチド＞リポソーム酸化ペプチド＞天然型ペプチドであった。特異性試験は、ＭＤＡ変性ペプチドへの抗体の結合が、ＭＤＡ−ＬＤＬと銅酸化ＬＤＬの両方と競合することを示した。
【００８１】
その後、我々は、健常者対照群由来のプールされた血漿、および抗原として、天然型およびＭＤＡ変性ペプチドを用いて、完全なペプチドライブラリーのスクリーニングを行った。アポＢ−１００中の多く部位に対する抗体が同定された。バックグラウンドコントロールの吸光度の２倍を陽性力価として切り落とし、完全なアポＢ−１００配列を構成する３０２個のペプチドのうちの１０２個に対する抗体を検出した。ＩｇＭ結合は、ＩｇＧ結合より本質的に豊富であった。一般に、結合はＭＤＡ変性ペプチド配列の方が対応する天然型ペプチド配列よりも高かったが、両者には著しい相関性があった。天然型およびＭＤＡ変性配列の両方への結合は、ＭＤＡ変性ＬＤＬおよび銅酸化ＬＤＬの添加により競合するが、天然型のＬＤＬによってはされない。これらの観察は、アポＢ−１００中のＭＤＡ変性ペプチド配列に対する免疫応答が、天然型の配列に対して交差反応性となることを示唆する。天然型のＬＤＬが天然型のアポＢ−１００ペプチド配列に結合する抗体に競合できないことは興味深いことであるが、これらの配列は単にＬＤＬ酸化の結果生じるアポＢ−１００の蛋白質分解の後に露出されるようになることを示し得る。分子の親水性と疎水性の部分のいずれも抗体により認識された。アポＢ−１００ペプチドライブラリーの第二のスクリーニングは、冠動脈疾患（ＣＨＤ、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）および不安定狭心症；ｎ＝１０）の臨床上の兆候のある患者からのプールされた血漿を使用して行われた。プールされたＣＨＤ血漿中の抗体は同じ配列に結合し、健常者対照群血漿中の抗体と全く同じ分布であった。しかしながら、ＣＨＤの患者からの血漿と比較し、コントロールの血漿ではいくつかのペプチド（＃１、３０〜３４、１００、１０７、１４８、１４９、１６２、１６９、２３６、２５２および３０１）の抗体力価は少なくとも２倍高く、少数のペプチド（＃１０、４５、１１１、１５４、１９９、２２２および２４０）に対する力価はコントロールと比較して、ＣＨＤ患者からの血漿において高かった。その後、我々は、アポＢ−１００中のＭＤＡ変性ペプチド配列に対する抗体レベルがＣＨＤの進展の危険性を予測するかどうか調査する予想臨床研究を実施した。我々は、枝分かれケースコントロールデザイン（nested case control design）を用いて、冠動脈疾患（ＣＨＤによる、ＡＭＩあるいは死）を有する７８人の患者およびマルモ ダイエット キャンサー スタディからの１４９人のコントロールを選択した。症例にもコントロール個体にもＭＩまたは脳卒中の病歴はなかった。封入から急性冠動脈疾患の平均期間は２．８年（０．１〜５．９年の範囲）であった。抗体レベルを酸化防止剤を補充した基線血漿サンプル中で測定した。基線における超音波検査法によって評価される頚動脈の内膜−中膜厚さ（ＩＭＴ）を用いて、我々はさらに抗体レベルと既存の血管疾病の程度の関連性を調べた。我々は、初期のスクリーニング研究で、８つのＭＤＡ変性ペプチド配列を研究し、高い血漿抗体レベル（７４、１０２および２１０）および／またはコントロールとＣＨＤの血漿プールの著しい差（３２、４５、１２９、１６２および２４０）を関連づけた。コントロールは、ＭＤＡペプチド７４に対するより高いＩｇＭレベルを有することが見いだされ（０．２５８、範囲０〜１．１２３の吸光度単位対０．１７８、範囲０〜０．７３２の吸光度単位、ｐ＜０．０５）、さもなければ症例とコントロールの間の抗体レベルの差はなかった。ＭＤＡペプチド１０２、１２９および１６２（それぞれｒ＝０．２３３、０．２３２および０．２３４、ｐ＜０．０５）に対する、ＩＭＴとＩｇＭの間の関連が症例において見られ、ＩＭＴとＭＤＡペプチド４５（ｒ＝０．１８、ｐ＜０．０５）との関連がコントロールにおいて見られた。ＭＤＡペプチド１２９の抗体と総およびＬＤＬコレステロール（ｒ＝０．１９およびｒ＝０．１９、ｐ＜０．０１）間で弱い相関性が見られた。さもなければ、ペプチド抗体レベルは、総血漿コレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールあるいは血漿トリグリセリドと何の関連も示さなかった。異なるペプチドに対する抗体のレベルに強い共変動（ｒ値の範囲０．６〜０．９）があった。唯一の例外は、他のペプチドに対する抗体に関連して、弱いか全くなかったＭＤＡペプチド７４に対する抗体であった。
【００８２】
ＭＤＡペプチド７４以外のすべての配列に対する抗体は、症例において年齢と逆の相関を示したが（−０．３８〜−０．５８の範囲のｒ値、ｐ＜０．０１０．００１）、コントロールではそうではなかった。酸化ＬＤＬの血漿レベルは対照的に、年齢につれて増加した。この関連もコントロールより症例においてより強かった。ＭＤＡ変性ペプチド配列に対する免疫応答と心疾患の間の関連が異なる年齢グループにおいて異なっていたかを調査するために、平均年齢（６１才）の上か下かで、症例およびコントロールについてサブグループ分析を実施した。より若い年齢群の症例については、コントロールと比較してペプチド３２および４５に対する抗体レベルが上昇し、ペプチド７４に対する抗体レベルが減少した。しかし、より高齢の年齢グループでは差は見い出されなかった。ペプチド７４を除くすべてのＭＤＡペプチド配列に対する抗体は、より若い年齢グループの中ではＩＭＴに著しく関連していたが、より高齢のグループでは関連しなかった（表）。
【００８３】
これらの研究により、ヒトの抗体によって認識されるアポＢ−１００の中の多くのＭＤＡ変性配列が同定された。ＬＤＬ酸化の結果アポＢ−１００のＭＤＡ変性が生じることは、これらの抗体が前記の酸化ＬＤＬ自己抗体のファミリーに属することを示す。この概念は、ＭＤＡ変性アポＢ−１００ペプチドに結合する抗体が酸化ＬＤＬの添加により競合されるという観察によっても支持される。ホーッコ（Horkko）らによって識別された、酸化したリン脂質と共に、これらのＭＤＡ変性ペプチド配列は、酸化ＬＤＬの中の大多数の抗原構造を構成すると考えられる。酸化ＬＤＬ抗リン脂質抗体と同様に、ＭＤＡ変性アポＢ−１００配列に対する抗体はＩｇＭ型であった。これは、さらに、後者の抗体がＴ １５天然型抗体のファミリーに属していることを提案し得る。Ｔ １５抗体は、初期の細菌感染に対するＴ細胞非依存性防御において、またアポトーシス細胞の除去において重要な役割を果たす。ここに記載したＭＤＡペプチド抗体が同様の機能を有するか調べることが残されている。多くの天然型アポＢ−１００配列に対する抗体も同定されている。しかしながら、天然型およびＭＤＡ変性された配列の抗体間の共変は、これらの抗体がＬＤＬ酸化に応じて形成されることをも提案する。さらに、ＭＤＡ変性ペプチド配列が、対応する天然型の配列と交差反応することも可能である。天然型のアポＢ−１００配列に対する抗体がさらに天然型のＬＤＬ粒子に結合する場合、これはＬＤＬの代謝にも重要な影響があると考えられる。しかしながら、天然型のＬＤＬが、天然型のアポＢ−１００に結合する抗体と競合しないという発見、および天然型アポＢ−１００の配列に対する抗体とＬＤＬコレステロール値に関連がないことは、そのような減少の存在に反する。
【００８４】
ＭＤＡ変性ペプチド配列に対する抗体は、症例においては年齢とともに次第に減少したが、コントロールにおいてはそうではなかった。ＭＤＡペプチド７４を除き、ＭＤＡペプチドに対するＩｇＭ抗体は、より若い年齢グループ（６２才未満）では頚動脈のＩＭＴに関係していたが、より高齢のグループの中ではしていなかった。これらの発見は、５０才と７０才の間に、免疫系とアテローム性動脈硬化の血管壁の相互作用の著しい変化がおきることを提案する。１つの可能性は、より若い個体では、アテローム性動脈硬化の疾病プロセスが、免疫細胞のより顕著な関与のある、より活発な段階にあるということである。別の可能性は、より高齢の患者におけるＭＤＡ変性ペプチド配列に対する抗体レベルの減少が、アテローム性動脈硬化症に関与する免疫細胞の老化を反映するということである。免疫老化（immunosenescence）により免疫細胞の機能が害されることが、高齢者における伝染および癌への感受性の増加に寄与することが提案されている。興味深いことに、免疫老化は酸化のストレスへの関与を示す酸化防止剤によって抑制される。酸化ＬＤＬの中のエピトープに相互作用する免疫細胞は酸化ストレスに特に露出されるであろう。酸化ＬＤＬが非常に若い年齢で動脈の中に既にあるので、これらの免疫応答は、数十年間の間連続的に挑戦されており、これが免疫老化の進展にさらに寄与しているのであろう。
【００８５】
アポＢ−１００内の２つの部位に対する増加した抗体は、６２歳より下の患者の心筋梗塞および冠動脈の死のための危険を予言することが見いだされた。これらの部位に対する抗体は、同じ根本的な病態生理学のプロセスに応じてそれらが生産されたことを提案する高レベルの共同変化を示した。血液のサンプリングから冠動脈疾患までの平均期間わずか２．８年であったという事実により、これらの抗体が特に増加したＣＨＤの危険のためのマーカーとして興味深くなる。ＭＤＡ変性アポＢ−１００ペプチド配列に対する抗体レベルが高脂血症、高血圧症および糖尿病のような他のＣＨＤ危険因子とは関連を示さなかったことは、これらの抗体がＣＨＤの危険性の独立したマーカーであると示唆する。本発明の研究におけるＣＨＤの症例はそれほどハイリスクの個体ではなく、この点で一般的なＣＨＤ患者の代表例であった。ＭＤＡ変性アポＢ−１００配列に対するＩｇＭにより、確立している危険因子のスクリーニングによっては高リスクであるとはされなかった個体において急性冠動脈疾患の進展の短期の危険を予測されるという発見は、それが積極的な予防治療を必要とする個体を識別する際の有用な器具となることを提案する。しかしながら、アポＢ−１００のＭＤＡ変性ペプチド配列に対する抗体を決定する臨床値を完全に確立するには、多変量解析によるかなり大規模の予測研究が必要である。本発明の臨床研究の別の制限は、我々がアポＢ−１００の中の少数の抗原部位に対する抗体を分析しただけであり、他の部位に対する抗体力価が心血管の危険のよりよいマーカーとなるかもしれないということである。
【００８６】
６０才未満の患者においては、アポＢ−１００中の多くのＭＤＡ変性部位が、頚動脈のＩＭＴによって評価されるような既存の血管疾病の範囲と関連付けられた。ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも密接に頚動脈のＩＭＴに関係していた。頚動脈のＩＭＴは一般的なアテローム性動脈硬化の程度の基準として明白な制限があるが、これらの観察は、アポＢ−１００の中のＭＤＡ変性配列に対するＩｇＭの測定が存在しているアテローム性動脈硬化症の程度を評価する方法の一つとなり得ることを提案する。これらの観察は、さらに冠動脈疾病および頚動脈疾病と酸化ＬＤＬに対するＩｇＭ抗体との関連を報告したいくつかの従来の研究に整合する。
【００８７】
ペプチド７４に対する抗体は多くの点において他のアポＢ−１００ペプチド抗体と異なっていた。それらは症例よりもコントロールにおいて高く、年齢とともに減少することがなく、頚動脈疾患の程度には関連していなかった。従って、このペプチド配列に対する抗体は、アテロームの保護免疫応答のための興味深い候補を表わす。
【００８８】
重要な疑問は、なぜこれらの関連が生じるかである。それらは、ＭＤＡ変性アポＢ−１００部位に対する免疫応答がいかにアテローム性動脈硬化の疾病プロセスに関係するかを明白に実証する。高い抗体レベルは、より重篤なアテローム性動脈硬化症およびより増加した急性冠状動脈疾患の進展の危険と関連するので、一つの明白な可能性は、これらの免疫応答がアテローム発生を促進するということである。ＨＳＰ ６５のような熱衝撃蛋白質に対する免疫応答がアテロームを発生することを実証する研究は、この概念をある程度支持する。しかしながら、動物実験研究は、酸化ＬＤＬ免疫のアテロームの保護効果を示した。脾臓摘出アポＥ ＮｕｌｌマウスのＢ細胞の再構築により、アテローム性動脈硬化症が減少した。アテローム性動脈硬化症の縮小は、免疫グロブリンを繰り返し注射したアポＥ ｎｕｌｌマウスでも見られた。本発明の観察は、必ずしも、酸化ＬＤＬに対する免疫応答のアテロームの保護役割について論じているのではない。これらの免疫応答は、ＬＤＬ酸化のような前アテローム発生のプロセスによって活性化される。従って、それらは、さらに疾病プロセスの重篤さに比例すると考えられ、疾病進行に寄与することなく、疾病の重篤さおよびＣＨＤの危険のマーカーとして寄与することができた。二つの関連文献で報告されたアポＢ−１００ペプチド配列によるアポＥ ｎｕｌｌマウスの免疫が、アテローム性動脈硬化症の進展を抑制するという発見は、症例となると考えられる。確かに、本発明の研究の最も重要な結果は、アテローム性動脈硬化症に対するワクチンコンポーネントとして使用することができる構造の同定である。年齢により生じるアポＢ−１００の中のＭＤＡ変性ペプチド配列に対する抗体の減少には、酸化ＬＤＬの血漿レベルの増加が伴うという認識は、循環からの最小に酸化されたＬＤＬのクリアランスの増加が、これらの抗体がアテローム性動脈硬化症に対して保護することができるメカニズムの一つであることを提案する。
【００８９】
方法
研究人口
研究対象、１９２６−４５の間の、マルモ（Malmo）「ダイエット アンド キャンサー（Diet and Cancer）（ＭＤＣ）」研究集団に属するボー（borr）。１９９１年１１月と１９９４年２月の間のＭＤＣ研究に入った人間の任意の５０％に、頚動脈の疫学に関する研究に参加することを依頼した。健康診断に続いて、動脈疾病、罹患率および致死率についての情報の確認用ルーチン、並びに伝統的な危険因子の定義が報告された。
【００９０】
急性冠動脈疾患の８５の症例、即ち、致命的または非致命的なＭＩまたは冠動脈疾患（ＣＨＤ）による死が確認された。心筋梗塞か脳卒中の病歴を有する参加者（ｎ＝６）は、本発明の研究に参加する資格がない。各症例について、心筋梗塞または脳卒中の病歴のないコントロール２名を、年齢、性別、喫煙習慣、高血圧症の存在、スクリーニング試験への参加月数および継続期間を個々に合わせて用いた。ロジスティックの理由（血液サンプルはペプチドの評価に十分な量で利用することはできなかった）により、７つの症例については１名のコントロールのみが利用可能であり、１つの症例にはコントロールがなかった。この症例は分析から除外された。従って、研究人口は、２２７人の患者、７８の症例および１４９のコントロールからなり、基線において年齢は４９−６７才（平均６１才）であった。
【００９１】
研究所分析
一晩絶食した血液サンプルを、総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロールおよび全血グルコースの血清値の測定のために採取した。ＬＤＬコレステロールは、フライドウォルド（Friedewald）式によりｍｍｏｌ／Ｌに計算した。酸化ＬＤＬは、ＥＬＩＳＡ（マーコーディア（Mercordia))によって測定した。Ｂモード超音波バスキュログラフィー（vasculography）ＭＨＺ変換器を備えたアキューソン１２８コンピュータ断層撮影法システム（アキューソン（Acuson）、マウンテンビュー（Mountain View）、カリフォルニア）を、前記のような右頚動脈の中で頚動脈プラークの評価に使用した。
【００９２】
アポＢ１００ペプチド配列に対するＥＬＩＳＡの開発
全ヒトアポリポプロテインＢアミノ酸配列に相当する３０２個のペプチドを合成し（ユーロ−ダイアグノスティカ アクチボラゲット、マルモ、スウェーデンおよびケイアイ ロス ペターソン エイエス、ホーホルム、デンマーク）、ＥＬＩＳＡで使用した。各合成ペプチドのフラクションを０．５ＭのＭＤＡ（シグマ−アルドリッチ スウェーデン アクチボラゲット、ストックホルム、スウェーデン）、０．５ＭのＭＤＡにより３７℃で３時間、およびリポソームの存在下で０．５ＭのＭＤＡにより３７℃で３時間または５ｍＭのＣｕＣｌ２（シグマ）により３７℃で１８時間変性した。ＭＤＡ変性ペプチドを、いくつかの変更をした１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで４℃で１８時間透析した。該ペプチドの変性を、ペプチドの分離に適する変性ポリアクリルアミドゲル（バイオ−ラッド ラボラトリーズ、ハーキュリーズ、カリフォルニア）で試験した。
【００９３】
クロロホルム溶液中、モル比９：１の卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）（シグマ）とホスファチジルセリン（ＰＳ）（シグマ）の混合物および３ｍＭのリン脂質（ＰＬ）を、ガラス血管中、穏やかなアルゴン流下で蒸発させた。その後、該溶液を真空下に３時間置いた。滅菌濾過１０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４中の０．１０ｍＭペプチド（５ｍｌ）、１４５ｍＭのＮａＣｌおよび０．００３％のナトリウムアジドをＥＰＣ／ＰＳ乾燥フィルムに添加し、５０℃で１５分間インキュベートした。この混合物を室温で５分間おだやかにボルテックスミキサーで混合し、その後氷冷浴に入れ、７．４アンプリチュードミクロンで１分間の間隙を入れて３分間で３回、超音波処理した（ソニープレップ１５０ ＭＳＥ サンヨー、タムロ−メドラブ、スウェーデン）。このＰＬペプチド混合物（天然型または０．５ＭのＭＤＡにより３７℃で３１１変性または５ｍＭのＣｕＣｌ２により３７℃で１８時間変性したもの）をガラスバイアル中にアルゴン下、４℃で、アルミホイルで封をして貯蔵し、１週間以内に使用した。このＭＤＡ変性混合物を、貯蔵前に、いくつかの変更をした１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで４℃で１８時間透析した。該混合物の変性を、ペプチドの分離に適する変性ポリアクリルアミドゲル（バイオ−ラッド ラボラトリーズ エイエス、サンドバイバーグ、スウェーデン）で試験した。
【００９４】
リポソームの存在下または不存在下でＰＢＳ、ｐＨ７．４（２０ｌｅｇ／ｍｌ）で希釈した天然のまたは変性した合成ペプチドを、マイクロタイタープレートウェル（ヌンク マキシソープ、ヌンク、ロスキルド、デンマーク）に吸着させ、４℃で一晩インキュベートした。参照用として、ペプチドの一つ（Ｐ６）を、各プレートに流した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した後、コーティングされたプレートを、ＴＢＳ中のスーパーブロック（ピアース、ロックフォード、イリノイ）で室温で５分間ブロックし、続いて、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）で希釈されたプールされたヒト血漿を室温で２時間、その後４℃で一晩インキュベートした。すすいだ後、該ペプチドに対する自己抗体の付着を、ＴＢＳ−Ｔで適当に希釈したビオチニル化ウサギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ抗体（ダコ エイ／エス、グロストラップ、デンマーク）を用いることにより検出した。さらに室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、結合したビオチニル化抗体をアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（シグマ）で検出し、室温で２時間インキュベートした。着色反応を、ホスファターゼ基質キット（ピアース）を用いて展開し、室温で１時間インキュベートした後、４０５ｎｍの吸収を測定した。異なるペプチドの吸収値をＰ６の吸収値で分け、比較した。
【００９５】
統計
ＳＰＳＳを統計分析のために使用した。適切な場合、結果は平均値と範囲として、および比率として示される。ボックスプロット（Boxplot）とスキャッタープロット（scatterplots）を、症例および対応するコントロール中の年齢と選択されたペプチドの関係を説明するために使用した。対応するグラフも、年齢と選択されたペプチドの関係を、症例およびコントロールについて、基線の平均年齢（６１才）未満または以上で、また別に平均年齢未満の症例およびコントロールについて例証するために使用した。症例とコントロールでは、別々に、年齢と性別のために調整された部分的な相関係数が、選択されたペプチドおよび血液脂質レベルと共通の頚動脈のＩＭＴの間で計算された。年齢および性別で調節した部分的な相関係数は、平均年齢以下およびそれ以上で症例およびコントロールにおける共通の頚動脈のＩＭＴと選択されたペプチドの間で計算された。独立のサンプルｔ−検定は通常分配された連続変数を評価するために、カイ二乗検定は症例とコントロールの比率を評価するために使用された。非パラメーター検定（マン−ホイットニー）は症例とコントロールの間の非通常分配された連続変数を評価するために使用された。ｐ−値はすべて両側（two-tail）である。
【００９６】
表
心筋梗塞のある若い患者（４９−６１才）および高齢の患者（６２−６７才）における、および年齢、性別、喫煙および高血圧症を一致させたそれらの対応するコントロールにおける、年齢および性別で合わせた異なる基線ＭＤＡペプチドおよび共通の頚動脈内膜中膜厚さのための相関係数
ペプチド ４９−６１才の症例およびコントロール ６２−６７才の症例およびコントロール
n=116 n=111
IGM
MDA 32 0.235t -0.101
MDA 45 0.366$ -0.030
MDA 74 0.178 0.063
MDA 102 0.255$ -0.039
MDA 129 0.330$ -0.009
MDA 162 0.2451 0.001
MDA 210 0.254 0.013
MDA 240 0.284$ 0.006
IGG
MDA215 0.119 -0.059
p<0.05;$/xO.O1
【００９７】
発明の特徴
本発明は、ヒトを含む哺乳類の免疫感作または治療のためのアポリポタンパク質Ｂ断片であって、虚血性心疾患に対する免疫源としてのまたは治療的な性質を有し、虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関する抗体の存在または不存在を分析するアポリポタンパク質Ｂ断片に関する。
該断片がアルデヒドのハプテンであり得る。
該断片がマロンジアルデヒドまたはヒドロキシノネナールを用いて変性され得る。
【００９８】
本発明は下記の群からなる天然型またはアルデヒド誘導体である断片であるペプチド：
ＦＬＤＴＶＹＧＮＣＳＴＨＦＴＶＫＴＲＫＧ
ＰＱＣＳＴＨＩＬＱＷＬＫＲＶＨＡＮＰＬＬ
ＶＩＳＩＰＲＬＱＡＥＡＲＳＥＩＬＡＨＷＳ
ＫＬＶＫＥＡＬＫＥＳＱＬＰＴＶＭＤＦＲＫ
ＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫＱＴＥＡＴＭＴＦＫ
ＤＧＳＬＲＨＫＦＬＤＳＮＩＫＦＳＨＶＥＫ
ＫＧＴＹＧＬＳＣＱＲＤＰＮＴＧＲＬＮＧＥ
ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
ＳＬＴＳＴＳＤＬＱＳＧＩＩＫＮＴＡＳＬＫ
ＴＡＳＬＫＹＥＮＹＥＬＴＬＫＳＤＴＮＧＫ
ＤＭＴＦＳＫＱＮＡＬＬＲＳＥＹＱＡＤＹＥ
ＭＫＶＫＩＩＲＴＩＤＱＭＱＮＳＥＬＱＷＰ
ＩＡＬＤＤＡＫＩＮＦＮＥＫＬＳＱＬＱＴＹ
ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫＫＮＫＨ
ＥＥＥＭＬＥＮＶＳＬＶＣＰＫＤＡＴＲＦＫ
ＧＳＴＳＨＨＬＶＳＲＫＳＩＳＡＡＬＥＨＫ
ＩＥＮＩＤＦＮＫＳＧＳＳＴＡＳＷＩＱＮＶ
ＩＲＥＶＴＱＲＬＮＧＥＩＱＡＬＥＬＰＱＫ
ＥＶＤＶＬＴＫＹＳＱＰＥＤＳＬＩＰＦＦＥ
ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ
ＬＬＤＩＡＮＹＬＭＥＱＩＱＤＤＣＴＧＤＥ
ＣＴＧＤＥＤＹＴＹＫＩＫＲＶＩＧＮＭＧＱ
ＧＮＭＧＱＴＭＥＱＬＴＰＥＬＫＳＳＩＬＫ
ＳＳＩＬＫＣＶＱＳＴＫＰＳＬＭＩＱＫＡＡ
ＩＱＫＡＡＩＱＡＬＲＫＭＥＰＫＤＫＤＱＥ
ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
ＳＬＮＳＨＧＬＥＬＮＡＤＩＬＧＴＤＫＩＮ
ＷＩＱＮＶＤＴＫＹＱＩＲＩＱＩＱＥＫＬＱ
ＴＹＩＳＤＷＷＴＬＡＡＫＮＬＴＤＦＡＥＱ
ＥＡＴＬＱＲＩＹＳＬＷＥＨＳＴＫＮＨＬＱ
ＡＬＬＶＰＰＥＴＥＥＡＫＱＶＬＦＬＤＴＶ
ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ
ＳＧＡＳＭＫＬＴＴＮＧＲＦＲＥＨＮＡＫＦ
ＮＬＩＧＤＦＥＶＡＥＫＩＮＡＦＲＡＫＶＨ
ＧＨＳＶＬＴＡＫＧＭＡＬＦＧＥＧＫＡＥＦ
ＦＫＳＳＶＩＴＬＮＴＮＡＥＬＦＮＱＳＤＩ
ＦＰＤＬＧＱＥＶＡＬＮＡＮＴＫＮＱＫＩＲ
ＡＴＲＦＫＨＬＲＫＹＴＹＮＹＱＡＱＳＳＳ
またはこれらのペプチドの一またはそれ以上の活性部位にも関する。
【００９９】
本発明は下記の群から選択されるペプチド
ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ
ＡＬＬＶＰＰＥＴＥＥＡＫＱＶＬＦＬＤＴＶ
ＦＬＤＴＶＹＧＮＣＳＴＨＦＴＶＫＴＲＫＧ
ＰＱＣＳＴＨＩＬＱＷＬKＲＶＨＡＮＰＬＬ
ＬＬＤＩＡＮＹＬＭＥＱＩＱＤＤＣＴＧＤＥ
ＣＴＧＤＥＤＹＴＹＫＩＫＲＶＩＧＮＭＧＱ
ＧＮＭＧＱＴＭＥＱＬＴＰＥＬＫＳＳＩＬＫ
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またはこれらのペプチドの１種類またはそれ以上の活性部位にも関する。
前記ペプチドは天然型であり得る。
前記ペプチドは酸化型であり得る。
前記ペプチドは銅を用いて酸化されていてもよい。
前記ペプチドはリン脂質リポソームとの組み合わせで存在し得る。
前記ペプチドはマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）誘導体型であり得る。
前記ペプチドはヒドロキシノネナール誘導体型であり得る。
【０１００】
本発明は、所望によりアジュバントを組み合わせた、虚血性心疾患の治療のための免疫療法または治療法を目的とする医薬組成物の調製における、天然型またはＭＤＡもしくはヒドロキシノネナール誘導体型の１種類またはそれ以上の断片／ペプチドの使用にも関する。
該使用において、免疫投与量が前記断片／ペプチド１〜１００ｍｇであり得る。
【０１０１】
本発明は、前記断片／ペプチドの１種類またはそれ以上の治療有効量を、所望により１種類またはそれ以上の薬理学的に無害の充填剤および／または助剤との組み合わせで含有する医薬組成物にも関する。
該医薬組成物において、前記断片／ペプチドがカチオン化ウシ血清アルブミンに結合して存在し得て、助剤として水酸化アルミニウムが使用され得る。
該医薬組成物において、前記組成物が注射用組成物として存在し得る。
【０１０２】
本発明は、断片／ペプチドの１種類またはそれ以上を含む、虚血性心疾患に対するヒトを含むほ乳類の免疫感作のためのワクチンにも関する。
本発明は、１種類またはそれ以上の前記天然型および／またはＭＤＡ変性配列に対する精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体の治療有効量を含む虚血性心疾患に対するヒトを含むほ乳類の免疫感作のためのワクチンにも関する。
該ワクチンにおいて、前記免疫感作のための断片／ペプチドがカチオン化ウシ血清アルブミンに結合して存在してもよく、助剤として水酸化アルミニウムが使用され得る。
【０１０３】
本発明は、天然型またはＭＤＡもしくはヒドロキシノネナール誘導体型の１種類またはそれ以上の前記断片および／またはペプチドの治療有効量をアテローム性動脈硬化症に罹患した、または虚血性心疾患が進展する危険性に面したヒトを含むほ乳類に投与する、アテローム性動脈硬化症に罹患した、または虚血性心疾患が進展する危険性に面したヒトを含むほ乳類の予防的治療または治療方法にも関する。
【０１０４】
本発明は、天然型またはＭＤＡ変性配列に対する精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体の治療有効量を投与して受動免疫を起こす、アテローム性動脈硬化症に罹患した、または虚血性心疾患が進展する危険性に面したヒトを含むほ乳類の予防的治療または治療方法にも関する。
該方法において、病態が、高齢者における、酸化ＬＤＬが炎症、細胞毒性およびプラーク破壊の危険性に寄与していると考えられる不安定なアテロームプラーク、並びに冠動脈心疾患の１またはそれ以上であり得る。
【０１０５】
本発明は、アッセーにおいて一またはそれ以上の前記断片および／またはペプチドを用いる、虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関連する抗体の存在または不存在を診断する方法にも関する。
該方法において、前記アッセーがイムノアッセーであり得る。
該方法において、前記イムノアッセーがＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティングであり得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチド、特にアテローム性動脈硬化症の治療のための免疫治療に使用されるペプチド、および酸化低密度リポ蛋白質に対する免疫応答の測定、およびアテローム性動脈硬化症の存在または不存在の診断のためのペプチドベースのＥＬＩＳＡの開発に関する。
【０００２】
特に、本発明は下記のものを含む：
ｌ）表１に列挙した、天然型または変性したペプチドを単独でまたは組み合わせて、好ましくは適当な担体および助剤と共に、虚血性の予防および治療用のための免疫療法としてまたは抗アテローム性動脈硬化症「ワクチン」として使用すること
２）心疾患
３）虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関する抗体の検出用のＥＬＩＳＡにおける該ペプチドの使用。
【背景技術】
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は大動脈または中動脈の最も内側の層（内膜）の肥厚を引き起こす慢性病である。これは血流を減少させ、罹患した血管によって供給される器官中の虚血および組織破壊を引き起こしうる。アテローム性動脈硬化症は心筋梗塞、脳卒中および周辺の動脈疾患を含む心疾患の主な原因である。それは西欧諸国における主な死因であり、２０年以内に全世界の主要な死因になることが予測される。
【０００４】
この疾病は、主に低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）であるリポタンパク質の血管の細胞外マトリックスへの蓄積によって始まる。これらのＬＤＬ粒子は凝集し、酸化的変性を進行させる。酸化ＬＤＬは毒性であり、血管損傷を引き起こす。アテローム性動脈硬化症は、多くの点で炎症と繊維化を含むこの傷に対する反応を表す。
【０００５】
１９８９年には、パリンスキ（Palinski）およびその同僚が、ヒトにおける酸化ＬＤＬに対する循環する自己抗体を確認した。この観察により、アテローム性動脈硬化症が酸化したリポタンパク質に対する免疫応答によって引き起こされる自己免疫疾患であることが提案された。この時に、いくつかの研究所は、酸化ＬＤＬに対する抗体価と心疾患との関係を探索し始めた。しかしながら、これらの研究から出現した臨床像は明白と言うにはほど遠いものであった。酸化ＬＤＬの多くの異なるエピトープに対する抗体は存在していたが、これらのエピトープの構造は未知であった。従って、「酸化ＬＤＬ抗体」の語は、１つの特異抗体よりはむしろ、異なる抗体の未知の混合物を意味するものであった。Ｔ細胞に依存しないＩｇＭ抗体は、Ｔ細胞に依存するＩｇＧ抗体より頻度が高かった。
【０００６】
酸化ＬＤＬに対する抗体は、心疾患を有する患者にも、健全なコントロールにも存在した。いくつかの初期の研究には酸化ＬＤＬ抗体価と心疾患との関連を報告したものもあるが、そのような関連を見いだせないものもあった。これらの研究の主な弱点は、抗体価の測定に使用されるＥＬＩＳＡ試験がリガンドとして酸化ＬＤＬ粒子を使用していたことである。ＬＤＬの組成は個体が異なれば異なり、酸化の変性の程度は制御するのも評価するのも困難であり、酸化ＬＤＬ粒子中の異なるエピトープに対する抗体のレベルを測定することはできない。ある程度までは技術的な問題により、それまでのところ利用可能な技術を使用して、酸化ＬＤＬに対する抗体反応の役割を評価することは困難であった。しかしながら、完全な酸化ＬＤＬ粒子を使用する場合、よく定義され複製可能なワクチンのコンポーネントを作成することは可能ではなかった。
【０００７】
血管壁の酸化ＬＤＬに対する自己免疫応答がアテローム性動脈硬化症の進展に重要な役割を果たす可能性を調査する別の方法は、それ自身の酸化ＬＤＬに対して動物を免疫感作することである。このアプローチの背後にある考えは、酸化ＬＤＬに対する自己免疫応答が古典的免疫技術を用いて強化されると、血管炎症の増加およびアテローム性動脈硬化症の進行をもたらすことである。この仮説をテストするために、ウサギを同族の酸化ＬＤＬで免疫し、次に、３か月間、この動物に高コレステロール食を与えて、アテローム性動脈硬化症を引き起こした。
【０００８】
しかしながら、もとの仮説とは対照的に、酸化ＬＤＬによる免疫感作は、アテローム性動脈硬化症を約５０％縮小する保護効果を有していた。より積極的なプラークの進展を生じさせる血管バルーンインジュリーと高コレステロール食を組み合わせた後続の研究でも、同様の結果が得られた。我々の研究と平行して、他のいくつかの研究所は同様の観察を報告した。利用可能なデータをともに採用すると、アテローム性動脈硬化症の進展に対して保護を行う、酸化ＬＤＬに対する自己免疫を含む免疫応答が存在することが明白に実証された。
【０００９】
これらの観察は、さらに人におけるアテローム性動脈硬化症をベースとする心疾患の治療のための免疫治療あるいは「ワクチン」の開発の可能性を示唆する。これを行う１つのアプローチは、個体を、自己のＬＤＬで、例えば銅により酸化した後、免疫感作することであろう。しかしながら、このアプローチは、酸化ＬＤＬにおけるどの構造が防御免疫を引き起こす原因であるか、また酸化ＬＤＬがさらに逆の免疫応答を生じさせるエピトープを含んでいるかどうかが知られていないという事実によって複雑になる。
【００１０】
酸化ＬＤＬ中のエピトープの同定は、いくつかの観点から重要である：
まず、これらのエピトープのうちの１つあるいはいくつかのものは、酸化ＬＤＬで免疫感作した動物中で観察される抗アテローム発生免疫応答を活性化する原因となると考えられる。従って、これらのエピトープを含むペプチドは、ヒトの免疫治療あるいは「アテローム性動脈硬化症ワクチン」の開発の可能性を表わすかもしれない。さらに、それらは、ヒトにおいて進展したアテローム性動脈硬化症の治療のために使用することができる。
【００１１】
第２に、同定されたエピトープを含むペプチドは、酸化ＬＤＬの特定の構造に対する抗体を検出することができるＥＬＩＳＡを開発するために使用することができる。そのようなＥＬＩＳＡは、現在利用可能な、抗原として酸化ＬＤＬ粒子を使用するものより正確で且つ信頼できるであろう。さらに、それは、心疾患に関連した、酸化ＬＤＬの中の異なるエピトープに対する免疫応答の分析を可能にするであろう。
【００１２】
特許文献１は、アテローム性動脈硬化症を分析するためのペプチドの使用に関する。該特許文献１に示されている技術は、原理として放射物理学的診断の形式である。ペプチド配列は放射能で標識され、血流に注射される。このペプチド配列がアポリポタンパクＢの中にある配列と同一である場合は、アポリポタンパクＢについて存在しているレセプターが存在する組織に結合するであろう。血管では、これは上記全てのアテローム性動脈硬化のプラークである。その後、血管壁の放射能の濃度は、例えば、ガンマカメラによって測定することができる。従って、この技術は、放射標識されたペプチド配列がアテローム性動脈硬化のプラークに存在する正常な組織レセプターに結合するであろうという事実に基づいた放射物理学的方法であり、これは外部放射能分析を使用して検出される。これは、アテローム性動脈硬化のプラークを識別する直接分析方法である。それは、患者に放射性化合物が投与されることを必要とする。
【００１３】
本発明の技術は全く異なる法則および方法に基づく。請求項１によると、本発明は、アポリポタンパクＢのペプチド配列に対する免疫反応を分析する方法、並びに心疾患に対する免疫用のアポリポタンパクＢの断片に関する。そのような免疫反応は、進展したアテローム性動脈硬化症の個体中で増加していることが示された。本発明の技術は、ポリマーウェルの底にペプチド配列を結合させることに基づく。血液サンプルが添加されると、該ペプチドはこれらの配列に特異的な抗体を結合させるであろう。その後、結合した抗体の量を免疫学的方法／技術を用いて調べる。従って、前記特許文献１の技術とは対照的に、これは、アテローム性動脈硬化のプラークを識別し局在化させる直接の測定方法でなく、アテローム性動脈硬化症の進展の高度な共変を示す免疫学的応答を調べるものである。
【００１４】
このように、本発明の基本原理は、前述の特許のものとは全く異なる。後者が、アテローム性動脈硬化の組織の中にあるリポタンパク質の正常なレセプターへのペプチド配列の結合に依存するのに対し、前者は、ペプチド配列に対する免疫反応の検出およびこれらのペプチド配列の抗体の測定に基づいている。
【００１５】
公表された研究（非特許文献１および非特許文献２）により、酸化ＬＤＬに対する免疫感作により、アテローム性動脈硬化症の進展が縮小されることを示された。これは、一般に酸化ＬＤＬに対する免疫反応が保護する効果があることを示すであろう。しかしながら、ここに与えられた結果は、驚くべきことに、これが必ずしもそうとは限らないことを示した。例えば、ペプチド＃１０、４５、１５４、１９９および２４０の混合物を用いた免疫感作は、アテローム性動脈硬化症の進展を増加させた。他のペプチド配列、例えばペプチド配列＃１、および３０〜３４を用いた免疫感作は、アテローム性動脈硬化症の進展に対する総合的な効果を欠いている。これらの結果は驚くべきである。その酸化ＬＤＬに対する免疫反応は、酸化ＬＤＬの中のどの構造に向けられるかに依存して、アテローム性動脈硬化症の進展を保護し、該進展に寄与し、または全く効果を奏しないからである。これらの発見は、免疫反応を保護することを活性化することを分離した免疫方法を開発することを可能にする。さらに、それらは、使用される粒子がアテローム発生の免疫反応を生じさせる構造を高レベルで含んでいる場合、完全な酸化ＬＤＬを使用する免疫感作が不利益な効果を奏するかもしれないことを示す。
【００１６】
特許文献２は、血清と血漿中の酸化ＬＤＬの存在を測定するための、酸化ＬＤＬの粒子に結合するマウスのモノクローナル抗体のパネルの使用に関する。従って、これは、酸化ＬＤＬに対する抗体を測定する方法が示されている本発明とは全く異なる。
【００１７】
特許文献３は、ペプチド配列を用いた免疫感作によって抗体を調製する方法に関し、該抗体は、ＥＬＩＳＡを使用したアポリポタンパクの測定のために使用することができる。従って、これはこのように本発明と全く異なるものである。
【００１８】
特許文献４はアポリポタンパクの正常型の組換え抗体を記載する。この抗体は、血漿および血清中の正常なアポリポタンパクＢの存在を調べ、循環中の正常なＬＤＬの粒子の量を低下させることにより、アテローム性動脈硬化症を治療するために使用される。
【００１９】
本発明において、抗体の使用は、アテローム性動脈硬化症の治療のために記述されている。しかしながら、特許文献４とは異なり、これらの抗体は、ＬＤＬの正常な粒子ではなく酸化ＬＤＬの粒子中に存在する構造を指向する。その効果は、それがアテローム性動脈硬化症の進展を生じさせると予測される酸化ＬＤＬであるということである。酸化ＬＤＬに特有の構造を指向する抗体の使用は、該特許文献４には記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第５，９７２，８９０号
【特許文献２】国際公開第９９／０８１０９号
【特許文献３】米国特許第４，９７０，１４４号
【特許文献４】米国特許第５，８６１，２７６号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】パリンスキ他（Palinski et al.）、1995
【非特許文献２】ジョージ他（George et al.）、1998
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
発明の要約
血管壁におけるリポタンパク質、主としてＬＤＬの酸化は、アテローム性動脈硬化症の進展において重要な要素であると考えられる。ＬＤＬの酸化中に生じた生成物は、血管細胞にとって有毒であり、炎症を引き起こし、プラーク形成を開始する。酸化ＬＤＬ中のエピトープは免疫系によって認識され、抗体産生を生じさせる。動物実験により、これらの免疫応答のうちのいくつかがアテローム性動脈硬化症に対する保護効果を持っていることが示された。抗体は、通常、ペプチドに基づいた構造をほとんど排他的に指向する。ＬＤＬ、アポリポタンパクＢ中に存在する唯一の蛋白質の完全な配列をカバーするポリペプチドライブラリーを使用して、ヒトにおいて抗体産生を生じさせる酸化ＬＤＬ中のエピトープが同定された。これらのペプチドエピトープは酸化ＬＤＬと心疾患に対する免疫応答の関連を研究し、かつ虚血性心疾患の予防および治療のための免疫療法または抗アテローム性動脈硬化症「ワクチン」を開発するためのＥＬＩＳＡを開発するために使用することができる。
【００２３】
発明の詳細な説明
酸化ＬＤＬ中のエピトープの分子特性は、ヒトにおいて抗体依存性の免疫応答を生じさることが実証された。使用されたアプローチは、免疫応答が５−６のアミノ酸長のペプチド配列を殆ど排他的に指向するという事実の利点を利用する。ＬＤＬは唯一の蛋白質、４５６３アミノ酸長のアポリポタンパクＢのみを含む。酸化の間、アポリポタンパクＢは断片化され、アルデヒド付加物が正に帯電したアミノ酸、特にリジンに結合する。これは、アポリポタンパクＢの三次元構造のために通常は露出していないペプチド配列が免疫細胞にアクセス可能になるか、および／またはその通常露出しているペプチド配列がアルデヒドとのハプテン化により免疫原性となることを意味する。
【００２４】
これにより、下記のペプチド、天然型またはＭＤＡ誘導体が、免疫反応を生じるような効果を有することが調べられた。これらのペプチドは：
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ＩＡＬＤＤＡＫＩＮＦＮＥＫＬＳＱＬＱＴＹ
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ＩＲＥＶＴＱＲＬＮＧＥＩＱＡＬＥＬＰＱＫ
ＥＶＤＶＬＴＫＹＳＱＰＥＤＳＬＩＰＦＦＥ
ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ
ＬＬＤＩＡＮＹＬＭＥＱＩＱＤＤＣＴＧＤＥ
ＣＴＧＤＥＤＹＴＹＫＩＫＲＶＩＧＮＭＧＱ
ＧＮＭＧＱＴＭＥＱＬＴＰＥＬＫＳＳＩＬＫ
ＳＳＩＬＫＣＶＱＳＴＫＰＳＬＭＩＱＫＡＡ
ＩＱＫＡＡＩＱＡＬＲＫＭＥＰＫＤＫＤＱＥ
ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
ＳＬＮＳＨＧＬＥＬＮＡＤＩＬＧＴＤＫＩＮ
ＷＩＱＮＶＤＴＫＹＱＩＲＩＱＩＱＥＫＬＱ
ＴＹＩＳＤＷＷＴＬＡＡＫＮＬＴＤＦＡＥＱ
ＥＡＴＬＱＲＩＹＳＬＷＥＨＳＴＫＮＨＬＱ
ＡＬＬＶＰＰＥＴＥＥＡＫＱＶＬＦＬＤＴＶ
ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ
ＳＧＡＳＭＫＬＴＴＮＧＲＦＲＥＨＮＡＫＦ
ＮＬＩＧＤＦＥＶＡＥＫＩＮＡＦＲＡＫＶＨ
ＧＨＳＶＬＴＡＫＧＭＡＬＦＧＥＧＫＡＥＦ
ＦＫＳＳＶＩＴＬＮＴＮＡＥＬＦＮＱＳＤＩ
ＦＰＤＬＧＱＥＶＡＬＮＡＮＴＫＮＱＫＩＲ、並びに非抗体産生ペプチド
ＡＴＲＦＫＨＬＲＫＹＴＹＮＹＱＡＱＳＳＳ
またはこれらのペプチドの一またはそれ以上の活性部位である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＭＤＡ変性ペプチド１−１００に対するＩｇＧ抗体の抗体反応を示すグラフ。
【図２】ＭＤＡ変性ペプチド１０１−２００に対するＩｇＧ抗体の抗体反応を示すグラフ。
【図３】ＭＤＡ変性ペプチド２０１−３０２に対するＩｇＧ抗体の抗体反応を示すグラフ。
【図４】ＭＤＡ変性ペプチド１−１００に対するＩｇＭ抗体の抗体反応を示すグラフ。
【図５】ＭＤＡ変性ペプチド１０１−２００に対するＩｇＭ抗体の抗体反応を示すグラフ。
【図６】ＭＤＡ変性ペプチド２０１−３０２に対するＩｇＭ抗体の抗体反応を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
材料および方法
ＬＤＬ酸化の結果免疫原性になるアポリポプロテインＢの部分を調べるために、ヒトアポリポプロテインＢの全配列をカバーする２０アミノ酸の長さのペプチドからなるポリペプチドライブラリーを形成した。これらのペプチドは、全ての配列をカバーするために破断点で５アミノ酸の重複を有するように製造した。ペプチドは、そのままの状態で、またはリン脂質リポソーム挿入した後、銅に接触させて酸化した後またはＬＤＬ酸化中に生じ得るアミノ酸の異なる変性を模したマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）変性の後に使用した。
【００２７】
ペプチド
ヒトアポリポプロテインＢの全アミノ酸配列に相当する３０２ペプチドを合成し（ユーロ−ダイアグノスティカ アクチボラゲット、マルモ、スウェーデンおよびケイアイ ロス ペターソン エイエス（KI Ross Petersen AS）、ホーホルム（Horholm）、デンマーク）、ＥＬＩＳＡで使用した。各合成ペプチドのフラクションを、０．５ＭのＭＤＡ（シグマ−アルドリッチ スウェーデン アクチボラゲット（Sigma-Aldrich Sweden AB）、ストックホルム、スウェーデン）で３７℃で３時間、そしてリポソームの存在下で、０．５ＭのＭＤＡにより３７℃で３時間または５μＭのＣｕＣｌ２（シグマ）により３７℃で１８時間変性させた。ＭＤＡで変性させたペプチドはいくつかの変更をした１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで、４℃で１８時間透析した。これらのペプチドの変性を、ペプチドの分離に適する変性ポリアクリルアミドゲル（バイオ−ラッド ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）、ハーキュリーズ（Hercules）、カリフォルニア（CA）で試験した。ペプチドは、該タンパク質のＮ末端から出発して、１−３０２の番号を付された。
【００２８】
他のアルデヒドをヒドロキシノネナール等の誘導体の製造に使用することもできる。
【００２９】
リポソーム
クロロホルム中、モル比９：１の卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）（シグマ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）（シグマ）と３ｍＭ濃度のリン脂質（ＰＬ）の混合物を、ガラス容器中、緩やかなアルゴン流の下で蒸発させた。その後、該容器を３時間真空下に置いた。滅菌濾過した１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４中、０．１０ｍＭペプチド（５ｍｌ）、１４５ｍＭのＮａＣｌおよび０．００３％のアジ化ナトリウムを含有する溶液をＥＰＣ／ＰＳ乾燥フィルムに添加し、５０℃で１５分間インキュベートした。この混合物を室温で約５分間穏やかにボルテックスミキサーで混合し、その後、氷冷浴中に入れ、１分間の間隙をおいて７．５アンプリチュードミクロンで３分間で３回超音波処理した（ソニープレップ（Sonyprep）１５０ ＭＳＥ サンヨー（Sanyo）、タムロ−メドラブ（Tamro-Medlab）、スウェーデン）。天然のまたは０．５ＭのＭＤＡにより３７℃で３時間もしくは５ｍＭのＣｕＣｌ２により３７℃で１８時間変性したＰＬペプチド混合物を、アルミホイルで封をしたガラスバイアルに４℃、アルゴン下で保存し、１週間以内に使用した。このＭＤＡ変性混合物を、貯蔵前に、いくつかの変化を加えた１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで、４℃で１８時間透析した。該混合物の変性を、ペプチドの分離に適する変性ポリアクリルアミドゲル（バイオ−ラッド ラボラトリーズ エイエス（Bio-Rad Laboratories AB）、サンドバイバーグ（Sundbyberg）、スウェーデン）で試験した。
【００３０】
血漿サンプル
心疾患の患者（ＡＨＰ）１０人および健常な血液ドナー（ＮＨＰ）５０人（女性２５人、男性２５人）からの血漿サンプルを集めプールした。二つのプールを分割し、−８０℃で貯蔵した。
【００３１】
ＥＬＩＳＡ
リポソームの存在下または不存在下でＰＢＳ、ｐＨ７．４（２０μｇ／ｍｌ）で希釈した天然のまたは変性した合成ペプチドを、マイクロタイタープレートウェル（ヌンク マキシソープ（Nunc Maxisorp）、ヌンク（Nunc）、ロスキルド（Roskilde）、デンマーク）に吸着させ、４℃で一晩インキュベートした。参考用として、ペプチドの一つ（Ｐ６）を、各プレートに流した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した後、コーティングされたプレートを、ＴＢＳ中のスーパーブロック（SuperBlock）（ピアース（Pierce）、ロックフォード（Rockford）、イリノイ（ILで室温で５分間ブロックし、続いて、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）で希釈されたプールされたヒト血漿、ＡＨＰまたはＮＨＰを室温で２時間、その後４℃で一晩インキュベートした。すすいだ後、該ペプチドに対する自己抗体の付着を、ＴＢＳ−Ｔで適当に希釈したビオチニル化ウサギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ抗体（ダコ エイ／エス（DakoA/S）、グロストラップ（Glostrup）、デンマーク）を用いることにより検出した。さらに室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、結合したビオチニル化抗体をアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（シグマ）で検出し、室温で２時間インキュベートした。着色反応を、ホスファターゼ基質キット（ピアース）を用いて展開し、室温で１時間インキュベートした後、４０５ｎｍの吸収を測定した。異なるペプチドの吸収値をＰ６の吸収値で分け、比較した。
【００３２】
アポリポプロテインＢの配列は、添付図面の配列番号１〜３７に示されている。ＡＨＰおよびＮＨＰのいずれも、大量の異なるペプチドに対する抗体を含んでいた。天然および変性ペプチドの両方に対する抗体が同定された。通常、ＭＤＡ変性ペプチドに対する抗体力価は、対応する天然型ペプチドのものより高いか等しい。天然型、ＭＤＡ変性、銅酸化ペプチドを比較すると、高い相関度を示し、ＭＤＡ変性ペプチドを用いた場合にもっとも高い抗体力価が検出された。リポソームに組み込まれたペプチドを使用すると、抗体レベルは増加しなかった。ＩｇＭサブクラスの抗体は、ＩｇＧサブタイプの抗体に比べてはるかに一般的である。
【００３３】
最も高い抗体レベルが検出されたペプチドは、一般的な特性により６グループに分けることができた（表１）：
（Ａ）ＭＤＡ変性ペプチドに対する高レベルのＩｇＧ抗体（ｎ＝３）
（Ｂ）高レベルのＩｇＭ抗体であるが、天然型およびＭＤＡ変性ペプチドに差はなかった（ｎ＝９）
（Ｃ）高レベルのＩｇＧ抗体であるが、天然型およびＭＤＡ変性ペプチドに差はなかった（ｎ＝２）
（Ｄ）ＭＤＡ変性ペプチドに対する高レベルのＩｇＧ抗体、ＡＨＰ−プールに比べて、ＮＨＰ−プールにおいて少なくとも２倍高い（ｎ＝５）
（Ｅ）ＭＤＡ変性ペプチドに対する高いレベルのＩｇＭ抗体、ＡＨＰ−プールに比べて、ＮＨＰ−プールにおいて少なくとも２倍高い（ｎ＝１１）
（Ｆ）高レベルのＩｇＧ抗体であるが、無傷のおよびＭＤＡ変性ペプチドの差はなく、ＡＨＰプール中の抗体はＮＨＰプールと比較して少なくとも２倍である（ｎ＝７）
（Ｇ）ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体がない
【００３４】
表１
Ａ． 高レベルＩｇＧ、ＭＤＡ−差
Ｐ １１． ＦＬＤＴＶＹＧＮＣＳＴＨＦＴＶＫＴＲＫＧ
Ｐ ２５． ＰＱＣＳＴＨＩＬＱＷＬＫＲＶＨＡＮＰＬＬ
Ｐ ７４． ＶＩＳＩＰＲＬＱＡＥＡＲＳＥＩＬＡＨＷＳ
Ｂ． 高レベルＩｇＭ、ＭＤＡ−差なし
Ｐ ４０． ＫＬＶＫＥＡＬＫＥＳＱＬＰＴＶＭＤＦＲＫ
Ｐ ６８． ＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫＱＴＥＡＴＭＴＦＫ
Ｐ ９４． ＤＧＳＬＲＨＫＦＬＤＳＮＩＫＦＳＨＶＥＫ
Ｐ ９９． ＫＧＴＹＧＬＳＣＱＲＤＰＮＴＧＲＬＮＧＥ
Ｐ １００． ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
Ｐ １０２． ＳＬＴＳＴＳＤＬＱＳＧＩＩＫＮＴＡＳＬＫ
Ｐ １０３． ＴＡＳＬＫＹＥＮＹＥＬＴＬＫＳＤＴＮＧＫ
Ｐ １０５． ＤＭＴＦＳＫＱＮＡＬＬＲＳＥＹＱＡＤＹＥ
Ｐ １７７． ＭＫＶＫＩＩＲＴＩＤＱＭＱＮＳＥＬＱＷＰ
Ｃ． 高レベルＩｇＧ、ＭＤＡ 差なし
Ｐ １４３． ＩＡＬＤＤＡＫＩＮＦＮＥＫＬＳＱＬＱＴＹ
Ｐ ２１０． ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫＫＮＫＨ
Ｄ． ＮＨＳ／ＡＨＰ、ＩｇＧ−ａｋ＞２、ＭＤＡ−差
Ｐ １． ＥＥＥＭＬＥＮＶＳＬＶＣＰＫＤＡＴＲＦＫ
Ｐ １２９． ＧＳＴＳＨＨＬＶＳＲＫＳＩＳＡＡＬＥＨＫ
Ｐ １４８． ＩＥＮＩＤＦＮＫＳＧＳＳＴＡＳＷＩＱＮＶ
Ｐ １６２． ＩＲＥＶＴＱＲＬＮＧＥＩＱＡＬＥＬＰＱＫ
Ｐ ２５２． ＥＶＤＶＬＴＫＹＳＱＰＥＤＳＬＩＰＦＦＥ
Ｅ． ＮＨＳ／ＡＨＰ、ＩｇＭ−ａｋ＞２、ＭＤＡ−差
Ｐ ３０１． ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ
Ｐ ３０． ＬＬＤＩＡＮＹＬＭＥＱＩＱＤＤＣＴＧＤＥ
Ｐ ３１． ＣＴＧＤＥＤＹＴＹＫＩＫＲＶＩＧＮＭＧＱ
Ｐ ３２． ＧＮＭＧＱＴＭＥＱＬＴＰＥＬＫＳＳＩＬＫ
Ｐ ３３． ＳＳＩＬＫＣＶＱＳＴＫＰＳＬＭＩＱＫＡＡ
Ｐ ３４． ＩＱＫＡＡＩＱＡＬＲＫＭＥＰＫＤＫＤＱＥ
Ｐ １００． ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
Ｐ １０７． ＳＬＮＳＨＧＬＥＬＮＡＤＩＬＧＴＤＫＩＮ
Ｐ １４９． ＷＩＱＮＶＤＴＫＹＱＩＲＩＱＩＱＥＫＬＱ
Ｐ １６９． ＴＹＩＳＤＷＷＴＬＡＡＫＮＬＴＤＦＡＥＱ
Ｐ ２３６． ＥＡＴＬＱＲＩＹＳＬＷＥＨＳＴＫＮＨＬＱ
Ｆ． ＮＨＳ／ＡＨＰ、ＩｇＧ−ａｋ＜０．５、ＭＤＡ−差なし
Ｐ １０． ＡＬＬＶＰＰＥＴＥＥＡＫＱＶＬＦＬＤＴＶ
Ｐ ４５． ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ
Ｐ １１１． ＳＧＡＳＭＫＬＴＴＮＧＲＦＲＥＨＮＡＫＦ
Ｐ １５４． ＮＬＩＧＤＦＥＶＡＥＫＩＮＡＦＲＡＫＶＨ
Ｐ １９９． ＧＨＳＶＬＴＡＫＧＭＡＬＦＧＥＧＫＡＥＦ
Ｐ ２２２． ＦＫＳＳＶＩＴＬＮＴＮＡＥＬＦＮＱＳＤＩ
Ｐ ２４０． ＦＰＤＬＧＱＥＶＡＬＮＡＮＴＫＮＱＫＩＲ
Ｇ．
Ｐ ２． ＡＴＲＦＫＨＬＲＫＹＴＹＮＹＱＡＱＳＳＳ
【００３５】
これらの３８のペプチド配列の全ては、アテローム動脈硬化症および虚血性心疾患の進展に重要な役割を果たす免疫応答の標的を表す。従って、これらのペプチドは、アポリポプロテインＢにおけるＭＤＡ変性アミノ酸の定められた配列に対する抗体レベルと心疾患の進展のリスクとの関連を決定するＥＬＩＳＡの開発に使用され得る。
【００３６】
これらのペプチドは、酸化ＬＤＬで免疫した実験動物に見られる保護免疫の可能なメディエータをも表し、アテローム動脈硬化症に対する免疫療法またはワクチンのさらなる開発における試験のために使用され得る。
【００３７】
このように、ヒトアポリポプロテインＢにおける３８の異なる配列が、ヒトにおいて免疫応答を著しく上昇させることが確認された。これらのエピトープは、酸化ＬＤＬに対する抗体としてあらかじめ記載されたものを表すと考えられる。殆どの免疫応答は、ペプチド配列を指向し、アポリポプロテインＢはＬＤＬにおける唯一のタンパク質であるので、このプロジェクトで用いられる試みは、酸化ＬＤＬ粒に対する本質的に全ての抗体についての特異的なエピトープを同定することができるであろう。カルジオリピンに対する抗体を含むリン脂質特異的抗体ファミリーが酸化ＬＤＬと反応するが、これらの抗体の特異性および役割は完全に特徴的であり続けることが記載されている。
【００３８】
多くの場合、ＭＤＡ変性ペプチドに対する抗体力価は、対応する天然型ペプチドのものより高い。ＭＤＡ変性ペプチドに対する抗体が検出された場合、それはほぼ常に天然型配列に対する抗体の存在と関連する。これに対する説明としては、アポリポプロテインＢにおいてＭＤＡ変性アミノ酸（ＬＤＬ酸化の結果生じるＭＤＡ変性）に対する免疫応答が天然型の配列に対する許容性の破壊を導くことが考えられる。他の配列については、ＭＤＡ変性と天然型配列に対する抗体力価に差はない。これは、免疫応答が天然型配列に対するものを指向していることを提案する。免疫系に通常さらされているタンパク質のアミノ酸配列に対する免疫応答はない。天然型ＬＤＬ粒において、アポリポプロテインＢの大部分はＬＤＬのリン脂質層に隠れているので、免疫系にアクセスできない。ＬＤＬの酸化の間に、アポリポプロテインＢのアミノ酸鎖は断片化され、三次元構造に変化が生じる。これにより、通常は免疫応答にアクセス不可能なペプチド配列が露出し、これらの配列に対する抗体が生成すると考えられ、これが天然型のアポリポプロテインＢに対する抗体の存在が見られることを説明するであろう。さもなければ、真の免疫応答は、ＭＤＡ変性配列に対するものであるが、天然型の配列と交差反応性を有し、結合に差がないほど大きいことが示されるであろう。
【００３９】
表２
７８人の被験者（後天的に進展した心筋梗塞、２６の健常対照群（healthy controls）および２６の疾病はないが高リスクの個体）における異なるペプチドと内膜／中膜の厚さとして評価した頸動脈におけるアテローム動脈硬化症との相関
＋、ｒ＞０．２＜０．３、ｐ＝＜０．０５；＋＋、ｒ＞０．３＜０．４、ｐ＝０．０１；＋＋＋、ｒ＞０．４、ｐ＝＜０．００１、灰色、心筋梗塞に罹患した群で顕著に増加したペプチド抗体レベル
【００４０】
酸化ＬＤＬ中の特定のエピトープに対する免疫反応と心疾患の進展の存在および／または危険性との関係を調べるために、これらのペプチド（天然型またはＭＤＡ変性型）に基づいたＥＬＩＳＡを使用し得る可能性を、予備的研究として調べた。この研究は、マルモ ダイエット キャンサー スタディ（Malmo Diet Cancer study）（人口ベースの研究）に参加した被験者について行われ、１９８９年と１９９３年の間に３０，０００以上の個体を募集した。表１に列挙した３８のペプチドのうちの２４のペプチドに対する抗体レベルを、継続期間に急性心筋梗塞が進展した２６人の被験者、年齢、性および喫煙の有無を合わせた２６の健常者対照群の基線の血漿サンプルについて調べた。年齢、性および喫煙の有無を合わせた、ＬＤＬコレステロール値が５．０ｍｍｏｌ／ｌ以上の群も、心疾患が進展していない高リスクグループ中の抗体レベルを研究するために含めた。
【００４１】
分析された２４のペプチドのうちの１９のペプチドについては、ＭＤＡ変性ペプチドに対するＩｇＭ抗体レベルと、総頚動脈の超音波調査によって評価されるような頚動脈（内膜／中膜厚さ）中のアテローム性動脈硬化症の程度の間に著しい相関性が確認された。即ち、より高い抗体レベルはより増大したアテローム性動脈硬化症となる（表２）。これらのペプチドの多くに、天然のペプチドに対する抗体のレベルと頚動脈の内膜／中膜厚さとの著しい相関性が存在した。４つのペプチドだけが、ＩｇＧ抗体と頚動脈の内膜／中膜厚さとの著しい相関性を示した。これらの観察は、アテローム性動脈硬化症が進展した患者の確認に、ＭＤＡ変性ペプチド（単独で、あるいは組み合わせて）を使用するＥＬＩＳＡを使用し得ることを示唆する。
【００４２】
試験したペプチドのうちの４つは、アテローム性動脈硬化症が進展した存在に関連するだけでなく、その後心筋梗塞を罹患した患者群においても著しく上昇した（表２）。これらのペプチドのうちの１つ（ペプチド２４０）のデータを図７に示す。これらの観察は、さらに、ペプチドベースのＥＬＩＳＡが心筋梗塞が進展する危険が増加している患者を確認するのにも使用し得ることを示す。
【００４３】
また、後に心筋梗塞に罹患した群においても、天然型のペプチド１０３、１６２および１９９、およびＭＤＡ変性ペプチド１０２に対するＩｇＧ抗体レベルの著しい増加があった。しかしながら、これらのペプチドに対するＩｇＧ抗体は、頚動脈中のアテローム性動脈硬化症の存在にはそれほど関係していなかった。
【００４４】
特に興味深い観察は、健常者対照群および高リスクグループ（５．０ｍｍｏｌ／ｌより高いＬＤＬコレステロール）において、心筋梗塞が進展したグループよりも著しく高いレベルのＩｇＭ抗体が存在したＭＤＡ変性ペプチド２１０に対する抗体に見られた。従って、ＭＤＡ変性ペプチド２１０に対する抗体は、心疾患が進展する危険性が減少した個体のためのマーカーを表わし得る。
【００４５】
天然型およびＭＤＡ変性アポＢ−１００ペプチド配列による免疫感作が実験動物にアテローム性動脈硬化症の抑制をもたらすことが示された（ノーディン フレドリクソン（Nordin Fredrikson）、（ソダーバーグ他）（Soderberg et al）、シュー他（Chyu et al）。これらのアテロームの防御免疫応答が作動するメカニズムはまだ完全には解明されていない。しかしながら、考えられる可能性は、これらのペプチド配列に対して生成された抗体によってアテロームの保護効果が媒介されるということである。これらの抗体は、例えばマクロファージＦｃ受容体による酸化的に損傷したＬＤＬ粒子の除去を促進するであろう。
【００４６】
マクロファージスカベンジャー受容体は、広範囲の酸化的損傷を伴うＬＤＬのみを認識する。最近の研究により、循環する酸化ＬＤＬの存在が確認された（１０、１１）。これらの粒子は、最小の酸化的損傷のみを有しており、スカベンジャー受容体によって認識されない。循環する酸化ＬＤＬ粒子への抗体の結合は、それらが血管組織に蓄積する前に、循環からそれらが取り除かれるのを助ける（１２）。
【００４７】
いくつかの研究は、アテローム性動脈硬化症からの保護における抗体用の役割を支持した。Ｂ細胞の再構成は、脾臓が摘出されたアポＥ ｎｕｌｌマウス（１３）におけるアテローム性動脈硬化症の進展およびＲＡＧ−１マウスにおける頚動脈の傷の後の新内膜形成を抑制した（我々の研究所からの出版されていない観察）。さらに、免疫グロブリンを繰り返し注射することによりアポＥ ｎｕｌｌマウス中のアテローム性動脈硬化症が縮小されることが示された（６）。
【００４８】
上記で論じたように、アポＢ−１００の中のＭＤＡ変性ペプチド配列に対する抗体は、合成ペプチドを用いた能動免疫感作により生じ得る。この方法は、抗体産生の完全な効果が得られるまでに、２〜３週間を要する。
【００４９】
いくつかの状況においては、より迅速な効果が必要であり得る。一例として、酸化ＬＤＬが炎症に寄与している不安定なアテローム性動脈硬化のプラークが挙げられる。これらの状況下では、天然型およびＭＤＡ変性配列に対する精製された、または遺伝子組み換えにより生産された抗体の注入による受動免疫法が、より速い効果を奏し得る。
【００５０】
精製された、または遺伝子組み換えにより生産された抗体の注入による受動免疫法が有効である別の状況として、高齢の個体における冠動脈疾患が挙げられる。我々の研究により、人が高齢となるに従ってアポＢペプチド配列に対する抗体の減少が生じ、これが酸化ＬＤＬの血漿レベルの増加に関係していることが示された（ノーディン フレドリクソン、ヘドラブ他（Hedblad et al。このことは、酸化ＬＤＬにおいて、抗原に対する抗体産生を担う免疫細胞の老化を示唆し得る。また、循環からの酸化的に損傷したＬＤＬ粒子の不完全なクリアランスに帰するかもしれない。従って、これらの患者は、アポＢ−１００ペプチド配列による能動免疫法からよりも、精製された、または遺伝子組み換えにより生産された抗体の注入による受動免疫法により、さらに利益を受け得る。
【００５１】
下記で使用される合成の天然型ペプチド（ユーロ−ダイアグノスティカ アクチボラゲット（Euro-Diagnostica AB）、マルモ（Malmo）、スウェーデン）は、最初にスクリーニングされたポリペプチドライブラリーからのペプチド１、２および３０１であった。ペプチド１（アミノ酸配列：ＥＥＥＭＬＥＮＶＳＬＶＣＰＫＤＡＴＲＦＫ、ｎ＝１０）およびペプチド３０１（アミノ酸配列：ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ、ｎ＝１０）は、各々天然型ペプチドよりも、ＭＤＡ変性ペプチドに対する高いＩｇＧまたはＩｇＭ抗体応答を有することが見出された。また、両方の力価は健常者において、より高い値であった。これらのペプチドは、これらのペプチドに対する抗体反応がアテローム性動脈硬化症に対して保護するかもしれないという仮定に基づいて選択された。
【００５２】
ペプチド２（アミノ酸配列：ＡＴＲＦＫＨＬＲＫＹＴＹＮＹＱＡＱＳＳＳ、ｎ＝１０）は、初期の抗体スクリーニングにおいて抗体反応を誘起しなかったので、コントロールペプチドとして選択された。ミョウバンを投与したマウスをコントロール（ｎ＝９）に供した。
【００５３】
アポＥ（−／−）マウスに、６−７週齢で皮下に一次免疫を受けさせ、３週間後に腹腔内ブースターを行った。マウスに、免疫感作の開始からの高コレステロール食を与え、２５週齢で屠殺するまで継続した。屠殺時に、４グループのマウス中の体重に著しい違いはなかった。また、市販のキット（シグマ）を使用して測定された血清コレステロールに統計的な有意差はなかった。それらの平均血清コレステロール値はすべて７１５ｍｇ／ｄｌより高かった。
【００５４】
アテローム性動脈硬化のプラークによって覆われた下行大動脈の領域をオイルレッドＯ染色の後のｅｎ ｆａｃｅ調製で測定した。コントロール群と比較すると、ペプチド番号２および３０１で免疫したマウスにおいては、アテローム性動脈硬化の病巣が実質的に減少した（図２）。ペプチド番号１による免疫感作は、コントロール群と比較して、アテローム性動脈硬化症の顕著な減少を生じなかった。下行大動脈とは対照的に、大動脈根中のアテローム性動脈硬化症の病巣は４つの実験群で異なることはなかった（図３）。
【００５５】
大動脈洞プラークの大きさあるいはその脂質含量については、４つのグループで差はなかった（表Ａ）。４グループのマウスにおいて、大動脈弓中の平均プラークサイズに違いはなかった。しかしながら、オイルレッドＯ染色による胸部および腹部の下行大動脈のプラークサイズのｅｎ ｆａｃｅ評価は、コントロールグループとペプチド番号１のグループが大動脈に同様の量のアテローム性動脈硬化のプラークを有するのに対し、ペプチド番号２および９のグループが大動脈に著しく縮小されたアテローム性動脈硬化の病巣を有していることを明らかにした（表Ａ）。ペプチド免疫感作は大動脈洞あるいは大動脈弓のプラークサイズに影響しなかったが、下行大動脈のプラークを縮小したという観察は興味深く、ペプチド免疫感作が新しいプラーク形成を縮小するかもしれないがプラークの進行に影響しないことを示唆する。
【００５６】
さらに、ペプチド免疫がアテローム性動脈硬化のプラークの表現型を調整するかどうか試験した。凍結切片の形態の大動脈洞プラークを単球／マクロファージ抗体（ＭＯＭＡ−２、セロテック（Serotec））で免疫組織化学的に染色した。
【００５７】
ｅｎ ｆａｃｅ観察による発見と一致して、ペプチド番号２は、マクロファージの浸潤を実質的に減少させた（図１）。三色染色により、ペプチド番号２のグループからの大動脈洞プラークにおいて、平均４０．０±７．７％のコラーゲン含量が明らかになった；ミョウバンコントロールグループ、ペプチド番号１番のグループ、ペプチド番号９のグループの平均コラーゲン含量は、それぞれ３２．３±５．３％、３５．６±８．５％および２９．４±９．６％であった。
【００５８】
各グループにおいて免疫感作したペプチドに対する抗体反応が測定された。免疫感作後の抗体価はペプチド番号１の群で６．１±３．１倍、ペプチド番号２のグループで２．４±１．０倍、ペプチド番号９のグループで１．８±０．６倍であったのに対し、ミョウバングループはペプチド番号１に対して３．９±２．７倍の増加、ペプチド番号２に対し２．０±０．５倍の増加、ペプチド番号９に対して２．０±０．９倍の増加であった。免疫グループとミョウバン処理グループの両方で免疫ペプチドに対する抗体価が並列的に増加したことは驚くべきことである。このことは、下記の可能性を意味するであろう：
（１）体液の免疫応答（細胞の免疫応答のような）以外のメカニズムは、アテローム性動脈硬化症を調整することに関与し得る；あるいは、（２）この抗体の増加は経時的コレステロール過剰血症に対するバイ−ストランダー（by-stander）反応であった。
【００５９】
なぜペプチド免疫感作がアテローム性動脈硬化症を縮小したかを説明し、および／またはプラーク表現型を調整する明瞭な推定メカニズムはないが、この発明の新規性は免疫原としてＬＤＬのペプチドを使用することおよび免疫修飾手段としてのその実現可能性の点にある。このペプチドベースの免疫手段はアテローム性動脈硬化のプラークを調節する。抗原として同族のｏｘＬＤＬあるいは天然型のＬＤＬを使用した免疫感作により、プラークサイズが縮小されることが示されたが１−３、同族のヒトＬＤＬの有用性、生産、感染および安全性の点から、このアプローチを臨床に適用するのは魅力に欠ける。我々の最終結果は、健常者におけるより高いＩｇＭまたはＩｇＧ抗体反応を有するペプチドを使用する免疫感作が、進行したアテローム性動脈硬化のプラークの進展から、実験動物を保護するかもしれないという我々の初期の仮説と異なるが、ペプチドベースの免疫療法が実現可能であることはここで実証される。
【００６０】
免疫ペプチド番号２を使用する免疫感作が下行大動脈における新しいアテローム性動脈硬化症の進展およびマクロファージ潜入の減少およびプラーク中のより高いコラーゲン含有量から動物を保護したことを見いだしたのは、そのペプチドが初期のヒトスクリーニングではなんの抗体応答をも与えなかったので、驚くべきことである。これは、（ａ）ペプチド番号２がヒトの免疫系に露出されていないアポ−Ｂ−１００蛋白質構造の一部であるからかもしれない。従って、抗体は健康なヒトの血清プールから生成されず検知されなかった；（ｂ）また、それはペプチド番号２のアミノ酸配列が、マウスにとっては外来であり、マウスは、新しいアテローム性動脈硬化症の形成を調整するこのペプチドおよびその表現形に対する免疫応答を進展させないためであるとも考えられる。
【００６１】
プラークサイズが大動脈枝の異なる部分で評価される場合、プラークサイズに対する同族のＬＤＬ免疫の効果が変動した。例えば、アメリ他（Ameli et al）は、高コレステロール血症のウサギにおいて、天然型のＬＤＬによる免疫感作により大動脈のプラーク形成が縮小されることを示し１、フレイギャング（Freigang et al）は、プラークサイズの縮小を大動脈ではなく大動脈洞で示した。彼らの発見と本発明の発見を合わせると、ペプチド免疫がプラークサイズだけでなくプラークの組成をも調整することが推測された。プラークを縮小する効果は、下行大動脈でのみ観察された。アポＥ（−／−）マウスは単一の動物の中の発展の様々な段階で、特に高コレステロール食を供給された時、アテローム性動脈硬化症を進展させることが知られている。若い動物におけるアテローム性動脈硬化症の初期の外観は大動脈洞にあり６、７、また１５週後の高脂、高コレステロール食による大動脈洞の疾病は進行したプラークであった。これに対し、アテローム性動脈硬化症の初期段階は下行大動脈にあった６。下行大動脈中のプラーク成熟および進展の一時的な進行が、大動脈洞のそれと比べて遅いので、免疫感作が下行大動脈中の疾病の大きさを縮小したが、大動脈洞中の疾病はしないという発見は、免疫感作がアテローム性動脈硬化症組成の初期の段階に影響することを示唆する。高齢の、そして血清コレステロールの値が超生理学的である動物は、コレステロール過剰血の悪影響によって免疫感作のプラーク縮小効果が打ち消される可能性がある。さらに、大動脈洞プラークが早く成熟し、２５週齢で屠殺された場合、プラークサイズになんらかの差異を検出するには遅すぎる。病巣の大きさは大動脈洞プラーク中では調整されないが、ペプチド免疫感作によりプラークの組成は調整された。本発明の実験計画は、下行大動脈の進展の初期の段階のプラークの組成を検討することを妨げた。
【００６２】
実験結果は、アテローム性動脈硬化症を防ぐ新規なアプローチのための、あるいは重篤な高脂血症の場合でも順調にプラーク表現型を調整するための免疫源として、ＬＤＬ関連アポＢ−１００のペプチド配列を使用する実現可能性を強調する。このペプチドベースの免疫感作の手法は、同族のＬＤＬの絶縁および単離および調製の必要性およびそれに付随する汚染の危険性を排除できるので、抗原として同族のｏｘＬＤＬまたは天然型ＬＤＬを使用するよりも有利である。ペプチド番号２および３０１による免疫感作のプラーク縮小効果は、下行大動脈でのみ見られた。これらの発見は、他の治療の介在も大動脈弓よりも下行大動脈で高い効果を示すという過去の報告とも矛盾せず、おそらく疾病が下行大動脈より大動脈の根および大動脈弓でより急速に進展するので１４〜１７、介在１４、１５、１６、１８、１９のためのより小さな機会を作り出すと考えられる。下行大動脈中のプラーク成熟および進展の一時的な進行が、大動脈洞および大動脈弓でのそれと比べて遅いので、免疫感作が下行大動脈中で病巣サイズを縮小するが、大動脈洞中および大動脈弓ではしないという発見は、免疫感作がアテローム性動脈硬化症組成の初期の段階を優先的に防ぐことを示唆する。高齢の、そして血清コレステロールの値が超生理学的である動物は、コレステロール過剰血の悪影響によって免疫感作のプラーク縮小効果が打ち消される可能性がある。病巣サイズは大動脈洞か大動脈弓で調整されなかったが、ペプチド番号２による免疫感作は、縮小されたマクロファージ浸潤および増加したコラーゲン量の、より安定したプラーク表現型を生じさせる好ましい方向にプラークの組成を調整しなかった。要約すると、マウスモデル中のアテローム性動脈硬化症の抑制のための新規なペプチドベースの免疫調節アプローチが実証される。
【００６３】
要約すると、新規なペプチドベースの免疫調節アプローチが、アテローム性動脈硬化のプラークを調整することが実証される。我々のモデル中のアテローム性動脈硬化症組成の変化は中程度でしかなかったが、このペプチドベースの免疫感作はアテローム性動脈硬化症の研究、予防または治療において、代替ツールを提供し得る。
【００６４】
方法
ペプチドの調製
ペプチドは、イムジェクト（Imject）（登録商標）スーパーキャリヤ（SuperCarrier）（登録商標）ＥＤＣキット（ピアース、ロックフォード、イリノイ）を用い、製造者の指示に従い、小さな変更を加えて製造した。結合バッファー５００μｌ中のペプチド１ｇを２００μｌの脱イオン水中の２ｍｇの担体と混合した。その後、この混合物を１ｍｇの結合試薬（ＥＤＣ、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドＨＣｌ）と共に室温で２時間インキュベートした。その後、０．０８３Ｍリン酸ナトリウム、０．９Ｍの塩化ナトリウムｐＨ７．２溶液で４℃で一晩透析した。この透析結合物を、Ｉｍｊｅｃｔ乾燥配合生成バッファーで希釈し、最終容量を１．５ｍｌとした。免疫アジュバントとしてミョウバンを用い、容量比１：１でペプチド結合物と混合した。各免疫感作におけるペプチドの量は、注射一回あたり３３μｇ／１００μｌであった。
【００６５】
動物プロトコル
ジャクソン ラボラトリーズ（Jackson Laboratories）（バー ハーバー（Bar Habor））、メイン（Me）からのアポＥ（−／−）マウスに、６〜７週齢で皮下投与による第一回の免疫感作を行い、続いて３週後に腹腔内ブースターを行った。免疫感作開始時からマウスに高コレステロール食を与え、２５週齢で屠殺するまで続けた。２週間後、屠殺時に血液サンプルを集めた。ミョウバンを投与したマウスをコントロールとした。実験プロトコルは、セダーズ−シナイ メディカル センターの動物管理使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）に認可された。全てのマウスを米国認定動物管理研究所（American Association of Accreditation of Laboratories Animal Care）に委託した動物施設内に入れ、１２時間の昼夜サイクルで飼育し、水および餌を制限せずに与えた。屠殺時にマウスにエンフルレンの吸入による麻酔をかけた。屠殺前に血漿をレトロオービタルブリード（retro-orbital bleeding）により採取した。
【００６６】
組織採取および分割
アテローム動脈硬化の形成に対するペプチド免疫感作の効果を評価するために、大動脈洞、大動脈弓および下行胸部および腹部大動脈のプラークの大きさを評価した。心臓および大動脈枝（tree）に生理学的な圧力で規定の食塩水をかけた後、心臓および近位の大動脈を取り出し、ＯＣＴ化合物（ティシュー−テック（Tissue-Tek））に埋め込み、冷凍した。連続的な６μｍの厚切片を少なくとも２つの大動脈弁の外観から集め、大動脈洞プラーク評価用の大動脈弁の一片を消失させた。典型的には、連続する３つの切片が１枚のスライド上に置き、合計２５−３０枚のスライドを一匹のマウスから集めた。また、スライド五枚目毎に染色のためにグループ分けした。また、左鎮骨下動脈までの上行大動脈および大動脈弓も同様に切片にし、処理した。胸部および腹部の下行大動脈を、オイルレッドＯ染色の後にプラークの組成のｅｎ ｆａｃｅ評価のために別々に処理した。
【００６７】
胸部および腹部下行大動脈のｅｎ ｆａｃｅ調製物
８ｇ／ｍｌの水中濃度の鶏卵アルブミン（シグマ）を、グリセリンと１：１で混合した。アジ化ナトリウムを添加し、アジ化ナトリウムの最終濃度を０．２％とした。胸部および腹部の大動脈から周辺の組織および脂肪を除去して清浄にした後、左側の腎臓部の動脈から鎮骨下動脈までの大動脈切片を、ヒストチョイス（Histochoice）（アムレスコ（Amresco））内で一晩定着させるために注意深く除去した。その後、大動脈は注意深く縦に開き、卵アルブミン溶液新たに被覆されたスライド上にルミナールと共にサイドアップで置いた。アルブミン溶液が乾燥したら、大動脈をオイルレッドＯで染色し、コンピューター補助組織学でアテローム性動脈硬化症の範囲を評価した。
【００６８】
免疫組織化学と組織学
大動脈洞からの切片を、標準のプロトコルを使用して、ＭＯＭＡ−２抗体（セロテック）で免疫組織化学的に染色した。コラーゲンの量およびプラークの大きさおよび脂質含有量についてのオイルレッドＯ染色を評価するためのトリクロム染色を、標準の染色プロトコルを用いて行った。コンピューター補助形態分析を、前記のように組織構造を評価するために行った８。
【００６９】
抗体力価測定
ペプチド免疫感作の後の抗体応答を測定するために、ＥＬＩＳＡを開発した。免疫化したペプチドに対する抗体力価を、ブースターの２週間後、屠殺時に集めた血液を使用して測定した。３つのペプチドに対する抗体応答を、同じタイミングのミョウバングループにおいて測定した。ＰＢＳ ｐＨ ７．４（２０μｇ／ｍｌ）で希釈した天然型の合成ペプチドを、マイクロタイタープレートウェル（ヌンク マキシソープ、ヌンク、ロスキルド、デンマーク）に吸着させ、４℃で一晩インキュベートした。０．０５０％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、コーティングしたプレートを、ＴＢＳ中のスーパーブロック（ピアース）で室温で５分間ブロックし、その後、室温で２時間、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）中、１／５０に希釈したマウス血清を室温で２時間、その後４℃で一晩インキュベートした。すすいだ後、ペプチドを指向する抗体の付着物を、ＴＢＳ−Ｔの中で適切に薄められた、該ペプチドを指向する抗体の付着物を、ＴＢＳ−Ｔで適切に希釈したビオチニル化ウサギ抗マウスＩｇ抗体（ダコ エイ／エス（Dako A/S）、グロストラップ（Glostrup）、デンマーク）を使用して検出した。さらに２時間インキュベートした後、該プレートを洗浄し、結合したビオチニル化抗体をアルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジン（シグマ）によって検出し、室温で２時間でインキュベートした。ホスファターゼ基質キット（ピアース）を用いて着色反応を展開した。４０５ｎｍにおける吸光度を、室温で１時間のインキュベートの後に測定した。バックグランドを差し引いた後、平均値を計算した。
【００７０】
当然ながら、他のアッセーモデル、例えば、放射性免疫測定のような抗体を検出するイムノアッセー、ウェスタンブロッティングおよびサザンブロッティング、並びにペプチドに結合した抗体の検出、酵素電極、および他の分析方法も同様に利用できる。
【００７１】
統計
データは平均値±Ｓｔｄ．として示される。使用される統計方法は、本文、表または図に挙げた。Ｐ＜０．０５の時、統計的に有意であるとした。
【００７２】
表Ａ 大動脈洞のプラークサイズおよびその脂質含有量、大動脈弓プラークサイズおよび下行大動脈中のプラークの比率
＊ミョウバングループとの有意差。統計分析にはＡＮＯＶＡ、続いてターキー−クラマー（Tukey-Kramer）試験を使用した。
【００７３】
アポＥノックアウトマウスのアテローム性動脈硬化症におけるアポリポプロテインＢ−１００ペプチド配列の免疫感作の効果のデータを表Ｂに示す。
【００７４】
表Ｂ
アポＥノックアウトマウスにおけるアテローム性動脈硬化症のアポリポプロテインＢ−１００ペプチド配列による免疫感作の効果
【００７５】
複数のペプチド配列の混合物を用いた免疫感作
大動脈におけるアテローム性動脈硬化症に対する効果
1. ペプチド配列 １４３および２１０ −６４．６％
2. ペプチド配列 １１、２５および７４ −５９．６％
3. ペプチド配列 １２９、１４８および１６７ −５６．８％
4. ペプチド配列 ９９、１００、１０２、１０３および１０５ −４０．１％
5. ペプチド配列 ３０、３１、３２、３３および３４ ＋６．６％
6. ペプチド配列 １０、４５、１５４、１９９および２４０ ＋１７．８％
【００７６】
単一ペプチド配列を用いた免疫感作
1. ペプチド配列 ２ −６７．７％
2. ペプチド配列 ２１０ −５７．９％
3. ペプチド配列 ３０１ −５５．２％
4. ペプチド配列 ４５ −４７．４％
5. ペプチド配列 ７４ −３１．０％
6. ペプチド配列 １ −１５．４％
7. ペプチド配列 ２４０ ０％
【００７７】
ペプチドの投与は、通常、皮下注射、静脈注射、筋肉注射あるいは腹腔内注射のような注射によって行われる。第一の免疫の投与量は、体重、年齢および他の身体的医学的条件に依存して、患者一人当たり１〜１００ｍｇであり得る。特別な状況下では、１種類またはそれ以上のペプチドを含有する溶液をカテーテルによって冠状動脈の血管に局所投与することも可能である。血流への吸収を可能にするには認めるために特別の注意を払わなければならないが、経口投与も同様に考慮され得る。注射剤は、本発明の断片またはペプチドの一種類またはそれ以上を０．５〜９９．５重量％を含有し得る。
【００７８】
ペプチドは通常、陽イオン化したウシ血清アルブミンに結合して、またアジュバントとして水酸化アルミニウムを使用して投与される。当該分野で知られている他のアジュバントも同様に使用することができる。
【００７９】
ペプチドの投与のための溶液はＥＤＴＡまたは酸化防止剤を含まない。
ペプチドは、アテローム性動脈硬化症に既に罹患している患者に治療剤として使用されてもよい。従って、本発明の断片またはペプチドの一種類またはそれ以上を加えるために、いかなる適切な投与経路を使用してもよい。
【００８０】
初期の研究は、ペプチドのどのタイプの酸化変性がヒトの血漿中で抗体によって認識されるに至るかを決定することに焦点を絞っていた。これらの研究は、ペプチド１−５および２９７−３０２を使用して行われた。ＬＤＬの酸化中に、リン脂質およびコレステロールエステル中のポリ不飽和脂肪酸は、悪玉アルデヒド（ＭＤＡ）のような高度に反応性のブレークダウン生成物の生成にいたる過酸化を進行させる。その後、ＭＤＡは、それらを高度に免疫原性にするアポＢ−１００の中のリジンおよびヒスチジン残基との共有結合付加物を形成し得る。ＬＤＬの酸化は、さらに、免疫系には通常アクセス可能でないペプチド配列を露呈させるアポＢ−１００の分割に至る。天然型のペプチドが使用された実験において、ＭＤＡ変性の後、あるいはリン脂質リポソーム中への進入およびそれに続く銅の酸化またはＭＤＡ変性の後、ＩｇＭ抗体が、天然型のＭＤＡおよびリポソーム酸化ペプチドに対して同定され、抗体力価はＭＤＡ−ペプチド＞ＭＤＡ変性リポソームペプチド＞リポソーム酸化ペプチド＞天然型ペプチドであった。特異性試験は、ＭＤＡ変性ペプチドへの抗体の結合が、ＭＤＡ−ＬＤＬと銅酸化ＬＤＬの両方と競合することを示した。
【００８１】
その後、我々は、健常者対照群由来のプールされた血漿、および抗原として、天然型およびＭＤＡ変性ペプチドを用いて、完全なペプチドライブラリーのスクリーニングを行った。アポＢ−１００中の多く部位に対する抗体が同定された。バックグラウンドコントロールの吸光度の２倍を陽性力価として切り落とし、完全なアポＢ−１００配列を構成する３０２個のペプチドのうちの１０２個に対する抗体を検出した。ＩｇＭ結合は、ＩｇＧ結合より本質的に豊富であった。一般に、結合はＭＤＡ変性ペプチド配列の方が対応する天然型ペプチド配列よりも高かったが、両者には著しい相関性があった。天然型およびＭＤＡ変性配列の両方への結合は、ＭＤＡ変性ＬＤＬおよび銅酸化ＬＤＬの添加により競合するが、天然型のＬＤＬによってはされない。これらの観察は、アポＢ−１００中のＭＤＡ変性ペプチド配列に対する免疫応答が、天然型の配列に対して交差反応性となることを示唆する。天然型のＬＤＬが天然型のアポＢ−１００ペプチド配列に結合する抗体に競合できないことは興味深いことであるが、これらの配列は単にＬＤＬ酸化の結果生じるアポＢ−１００の蛋白質分解の後に露出されるようになることを示し得る。分子の親水性と疎水性の部分のいずれも抗体により認識された。アポＢ−１００ペプチドライブラリーの第二のスクリーニングは、冠動脈疾患（ＣＨＤ、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）および不安定狭心症；ｎ＝１０）の臨床上の兆候のある患者からのプールされた血漿を使用して行われた。プールされたＣＨＤ血漿中の抗体は同じ配列に結合し、健常者対照群血漿中の抗体と全く同じ分布であった。しかしながら、ＣＨＤの患者からの血漿と比較し、コントロールの血漿ではいくつかのペプチド（＃１、３０〜３４、１００、１０７、１４８、１４９、１６２、１６９、２３６、２５２および３０１）の抗体力価は少なくとも２倍高く、少数のペプチド（＃１０、４５、１１１、１５４、１９９、２２２および２４０）に対する力価はコントロールと比較して、ＣＨＤ患者からの血漿において高かった。その後、我々は、アポＢ−１００中のＭＤＡ変性ペプチド配列に対する抗体レベルがＣＨＤの進展の危険性を予測するかどうか調査する予想臨床研究を実施した。我々は、枝分かれケースコントロールデザイン（nested case control design）を用いて、冠動脈疾患（ＣＨＤによる、ＡＭＩあるいは死）を有する７８人の患者およびマルモ ダイエット キャンサー スタディからの１４９人のコントロールを選択した。症例にもコントロール個体にもＭＩまたは脳卒中の病歴はなかった。封入から急性冠動脈疾患の平均期間は２．８年（０．１〜５．９年の範囲）であった。抗体レベルを酸化防止剤を補充した基線血漿サンプル中で測定した。基線における超音波検査法によって評価される頚動脈の内膜−中膜厚さ（ＩＭＴ）を用いて、我々はさらに抗体レベルと既存の血管疾病の程度の関連性を調べた。我々は、初期のスクリーニング研究で、８つのＭＤＡ変性ペプチド配列を研究し、高い血漿抗体レベル（７４、１０２および２１０）および／またはコントロールとＣＨＤの血漿プールの著しい差（３２、４５、１２９、１６２および２４０）を関連づけた。コントロールは、ＭＤＡペプチド７４に対するより高いＩｇＭレベルを有することが見いだされ（０．２５８、範囲０〜１．１２３の吸光度単位対０．１７８、範囲０〜０．７３２の吸光度単位、ｐ＜０．０５）、さもなければ症例とコントロールの間の抗体レベルの差はなかった。ＭＤＡペプチド１０２、１２９および１６２（それぞれｒ＝０．２３３、０．２３２および０．２３４、ｐ＜０．０５）に対する、ＩＭＴとＩｇＭの間の関連が症例において見られ、ＩＭＴとＭＤＡペプチド４５（ｒ＝０．１８、ｐ＜０．０５）との関連がコントロールにおいて見られた。ＭＤＡペプチド１２９の抗体と総およびＬＤＬコレステロール（ｒ＝０．１９およびｒ＝０．１９、ｐ＜０．０１）間で弱い相関性が見られた。さもなければ、ペプチド抗体レベルは、総血漿コレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールあるいは血漿トリグリセリドと何の関連も示さなかった。異なるペプチドに対する抗体のレベルに強い共変動（ｒ値の範囲０．６〜０．９）があった。唯一の例外は、他のペプチドに対する抗体に関連して、弱いか全くなかったＭＤＡペプチド７４に対する抗体であった。
【００８２】
ＭＤＡペプチド７４以外のすべての配列に対する抗体は、症例において年齢と逆の相関を示したが（−０．３８〜−０．５８の範囲のｒ値、ｐ＜０．０１０．００１）、コントロールではそうではなかった。酸化ＬＤＬの血漿レベルは対照的に、年齢につれて増加した。この関連もコントロールより症例においてより強かった。ＭＤＡ変性ペプチド配列に対する免疫応答と心疾患の間の関連が異なる年齢グループにおいて異なっていたかを調査するために、平均年齢（６１才）の上か下かで、症例およびコントロールについてサブグループ分析を実施した。より若い年齢群の症例については、コントロールと比較してペプチド３２および４５に対する抗体レベルが上昇し、ペプチド７４に対する抗体レベルが減少した。しかし、より高齢の年齢グループでは差は見い出されなかった。ペプチド７４を除くすべてのＭＤＡペプチド配列に対する抗体は、より若い年齢グループの中ではＩＭＴに著しく関連していたが、より高齢のグループでは関連しなかった（表）。
【００８３】
これらの研究により、ヒトの抗体によって認識されるアポＢ−１００の中の多くのＭＤＡ変性配列が同定された。ＬＤＬ酸化の結果アポＢ−１００のＭＤＡ変性が生じることは、これらの抗体が前記の酸化ＬＤＬ自己抗体のファミリーに属することを示す。この概念は、ＭＤＡ変性アポＢ−１００ペプチドに結合する抗体が酸化ＬＤＬの添加により競合されるという観察によっても支持される。ホーッコ（Horkko）らによって識別された、酸化したリン脂質と共に、これらのＭＤＡ変性ペプチド配列は、酸化ＬＤＬの中の大多数の抗原構造を構成すると考えられる。酸化ＬＤＬ抗リン脂質抗体と同様に、ＭＤＡ変性アポＢ−１００配列に対する抗体はＩｇＭ型であった。これは、さらに、後者の抗体がＴ １５天然型抗体のファミリーに属していることを提案し得る。Ｔ １５抗体は、初期の細菌感染に対するＴ細胞非依存性防御において、またアポトーシス細胞の除去において重要な役割を果たす。ここに記載したＭＤＡペプチド抗体が同様の機能を有するか調べることが残されている。多くの天然型アポＢ−１００配列に対する抗体も同定されている。しかしながら、天然型およびＭＤＡ変性された配列の抗体間の共変は、これらの抗体がＬＤＬ酸化に応じて形成されることをも提案する。さらに、ＭＤＡ変性ペプチド配列が、対応する天然型の配列と交差反応することも可能である。天然型のアポＢ−１００配列に対する抗体がさらに天然型のＬＤＬ粒子に結合する場合、これはＬＤＬの代謝にも重要な影響があると考えられる。しかしながら、天然型のＬＤＬが、天然型のアポＢ−１００に結合する抗体と競合しないという発見、および天然型アポＢ−１００の配列に対する抗体とＬＤＬコレステロール値に関連がないことは、そのような減少の存在に反する。
【００８４】
ＭＤＡ変性ペプチド配列に対する抗体は、症例においては年齢とともに次第に減少したが、コントロールにおいてはそうではなかった。ＭＤＡペプチド７４を除き、ＭＤＡペプチドに対するＩｇＭ抗体は、より若い年齢グループ（６２才未満）では頚動脈のＩＭＴに関係していたが、より高齢のグループの中ではしていなかった。これらの発見は、５０才と７０才の間に、免疫系とアテローム性動脈硬化の血管壁の相互作用の著しい変化がおきることを提案する。１つの可能性は、より若い個体では、アテローム性動脈硬化の疾病プロセスが、免疫細胞のより顕著な関与のある、より活発な段階にあるということである。別の可能性は、より高齢の患者におけるＭＤＡ変性ペプチド配列に対する抗体レベルの減少が、アテローム性動脈硬化症に関与する免疫細胞の老化を反映するということである。免疫老化（immunosenescence）により免疫細胞の機能が害されることが、高齢者における伝染および癌への感受性の増加に寄与することが提案されている。興味深いことに、免疫老化は酸化のストレスへの関与を示す酸化防止剤によって抑制される。酸化ＬＤＬの中のエピトープに相互作用する免疫細胞は酸化ストレスに特に露出されるであろう。酸化ＬＤＬが非常に若い年齢で動脈の中に既にあるので、これらの免疫応答は、数十年間の間連続的に挑戦されており、これが免疫老化の進展にさらに寄与しているのであろう。
【００８５】
アポＢ−１００内の２つの部位に対する増加した抗体は、６２歳より下の患者の心筋梗塞および冠動脈の死のための危険を予言することが見いだされた。これらの部位に対する抗体は、同じ根本的な病態生理学のプロセスに応じてそれらが生産されたことを提案する高レベルの共同変化を示した。血液のサンプリングから冠動脈疾患までの平均期間わずか２．８年であったという事実により、これらの抗体が特に増加したＣＨＤの危険のためのマーカーとして興味深くなる。ＭＤＡ変性アポＢ−１００ペプチド配列に対する抗体レベルが高脂血症、高血圧症および糖尿病のような他のＣＨＤ危険因子とは関連を示さなかったことは、これらの抗体がＣＨＤの危険性の独立したマーカーであると示唆する。本発明の研究におけるＣＨＤの症例はそれほどハイリスクの個体ではなく、この点で一般的なＣＨＤ患者の代表例であった。ＭＤＡ変性アポＢ−１００配列に対するＩｇＭにより、確立している危険因子のスクリーニングによっては高リスクであるとはされなかった個体において急性冠動脈疾患の進展の短期の危険を予測されるという発見は、それが積極的な予防治療を必要とする個体を識別する際の有用な器具となることを提案する。しかしながら、アポＢ−１００のＭＤＡ変性ペプチド配列に対する抗体を決定する臨床値を完全に確立するには、多変量解析によるかなり大規模の予測研究が必要である。本発明の臨床研究の別の制限は、我々がアポＢ−１００の中の少数の抗原部位に対する抗体を分析しただけであり、他の部位に対する抗体力価が心血管の危険のよりよいマーカーとなるかもしれないということである。
【００８６】
６０才未満の患者においては、アポＢ−１００中の多くのＭＤＡ変性部位が、頚動脈のＩＭＴによって評価されるような既存の血管疾病の範囲と関連付けられた。ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも密接に頚動脈のＩＭＴに関係していた。頚動脈のＩＭＴは一般的なアテローム性動脈硬化の程度の基準として明白な制限があるが、これらの観察は、アポＢ−１００の中のＭＤＡ変性配列に対するＩｇＭの測定が存在しているアテローム性動脈硬化症の程度を評価する方法の一つとなり得ることを提案する。これらの観察は、さらに冠動脈疾病および頚動脈疾病と酸化ＬＤＬに対するＩｇＭ抗体との関連を報告したいくつかの従来の研究に整合する。
【００８７】
ペプチド７４に対する抗体は多くの点において他のアポＢ−１００ペプチド抗体と異なっていた。それらは症例よりもコントロールにおいて高く、年齢とともに減少することがなく、頚動脈疾患の程度には関連していなかった。従って、このペプチド配列に対する抗体は、アテロームの保護免疫応答のための興味深い候補を表わす。
【００８８】
重要な疑問は、なぜこれらの関連が生じるかである。それらは、ＭＤＡ変性アポＢ−１００部位に対する免疫応答がいかにアテローム性動脈硬化の疾病プロセスに関係するかを明白に実証する。高い抗体レベルは、より重篤なアテローム性動脈硬化症およびより増加した急性冠状動脈疾患の進展の危険と関連するので、一つの明白な可能性は、これらの免疫応答がアテローム発生を促進するということである。ＨＳＰ ６５のような熱衝撃蛋白質に対する免疫応答がアテロームを発生することを実証する研究は、この概念をある程度支持する。しかしながら、動物実験研究は、酸化ＬＤＬ免疫のアテロームの保護効果を示した。脾臓摘出アポＥ ＮｕｌｌマウスのＢ細胞の再構築により、アテローム性動脈硬化症が減少した。アテローム性動脈硬化症の縮小は、免疫グロブリンを繰り返し注射したアポＥ ｎｕｌｌマウスでも見られた。本発明の観察は、必ずしも、酸化ＬＤＬに対する免疫応答のアテロームの保護役割について論じているのではない。これらの免疫応答は、ＬＤＬ酸化のような前アテローム発生のプロセスによって活性化される。従って、それらは、さらに疾病プロセスの重篤さに比例すると考えられ、疾病進行に寄与することなく、疾病の重篤さおよびＣＨＤの危険のマーカーとして寄与することができた。二つの関連文献で報告されたアポＢ−１００ペプチド配列によるアポＥ ｎｕｌｌマウスの免疫が、アテローム性動脈硬化症の進展を抑制するという発見は、症例となると考えられる。確かに、本発明の研究の最も重要な結果は、アテローム性動脈硬化症に対するワクチンコンポーネントとして使用することができる構造の同定である。年齢により生じるアポＢ−１００の中のＭＤＡ変性ペプチド配列に対する抗体の減少には、酸化ＬＤＬの血漿レベルの増加が伴うという認識は、循環からの最小に酸化されたＬＤＬのクリアランスの増加が、これらの抗体がアテローム性動脈硬化症に対して保護することができるメカニズムの一つであることを提案する。
【００８９】
方法
研究人口
研究対象、１９２６−４５の間の、マルモ（Malmo）「ダイエット アンド キャンサー（Diet and Cancer）（ＭＤＣ）」研究集団に属するボー（borr）。１９９１年１１月と１９９４年２月の間のＭＤＣ研究に入った人間の任意の５０％に、頚動脈の疫学に関する研究に参加することを依頼した。健康診断に続いて、動脈疾病、罹患率および致死率についての情報の確認用ルーチン、並びに伝統的な危険因子の定義が報告された。
【００９０】
急性冠動脈疾患の８５の症例、即ち、致命的または非致命的なＭＩまたは冠動脈疾患（ＣＨＤ）による死が確認された。心筋梗塞か脳卒中の病歴を有する参加者（ｎ＝６）は、本発明の研究に参加する資格がない。各症例について、心筋梗塞または脳卒中の病歴のないコントロール２名を、年齢、性別、喫煙習慣、高血圧症の存在、スクリーニング試験への参加月数および継続期間を個々に合わせて用いた。ロジスティックの理由（血液サンプルはペプチドの評価に十分な量で利用することはできなかった）により、７つの症例については１名のコントロールのみが利用可能であり、１つの症例にはコントロールがなかった。この症例は分析から除外された。従って、研究人口は、２２７人の患者、７８の症例および１４９のコントロールからなり、基線において年齢は４９−６７才（平均６１才）であった。
【００９１】
研究所分析
一晩絶食した血液サンプルを、総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロールおよび全血グルコースの血清値の測定のために採取した。ＬＤＬコレステロールは、フライドウォルド（Friedewald）式によりｍｍｏｌ／Ｌに計算した。酸化ＬＤＬは、ＥＬＩＳＡ（マーコーディア（Mercordia))によって測定した。Ｂモード超音波バスキュログラフィー（vasculography）ＭＨＺ変換器を備えたアキューソン１２８コンピュータ断層撮影法システム（アキューソン（Acuson）、マウンテンビュー（Mountain View）、カリフォルニア）を、前記のような右頚動脈の中で頚動脈プラークの評価に使用した。
【００９２】
アポＢ１００ペプチド配列に対するＥＬＩＳＡの開発
全ヒトアポリポプロテインＢアミノ酸配列に相当する３０２個のペプチドを合成し（ユーロ−ダイアグノスティカ アクチボラゲット、マルモ、スウェーデンおよびケイアイ ロス ペターソン エイエス、ホーホルム、デンマーク）、ＥＬＩＳＡで使用した。各合成ペプチドのフラクションを０．５ＭのＭＤＡ（シグマ−アルドリッチ スウェーデン アクチボラゲット、ストックホルム、スウェーデン）、０．５ＭのＭＤＡにより３７℃で３時間、およびリポソームの存在下で０．５ＭのＭＤＡにより３７℃で３時間または５ｍＭのＣｕＣｌ２（シグマ）により３７℃で１８時間変性した。ＭＤＡ変性ペプチドを、いくつかの変更をした１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで４℃で１８時間透析した。該ペプチドの変性を、ペプチドの分離に適する変性ポリアクリルアミドゲル（バイオ−ラッド ラボラトリーズ、ハーキュリーズ、カリフォルニア）で試験した。
【００９３】
クロロホルム溶液中、モル比９：１の卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）（シグマ）とホスファチジルセリン（ＰＳ）（シグマ）の混合物および３ｍＭのリン脂質（ＰＬ）を、ガラス血管中、穏やかなアルゴン流下で蒸発させた。その後、該溶液を真空下に３時間置いた。滅菌濾過１０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４中の０．１０ｍＭペプチド（５ｍｌ）、１４５ｍＭのＮａＣｌおよび０．００３％のナトリウムアジドをＥＰＣ／ＰＳ乾燥フィルムに添加し、５０℃で１５分間インキュベートした。この混合物を室温で５分間おだやかにボルテックスミキサーで混合し、その後氷冷浴に入れ、７．４アンプリチュードミクロンで１分間の間隙を入れて３分間で３回、超音波処理した（ソニープレップ１５０ ＭＳＥ サンヨー、タムロ−メドラブ、スウェーデン）。このＰＬペプチド混合物（天然型または０．５ＭのＭＤＡにより３７℃で３１１変性または５ｍＭのＣｕＣｌ２により３７℃で１８時間変性したもの）をガラスバイアル中にアルゴン下、４℃で、アルミホイルで封をして貯蔵し、１週間以内に使用した。このＭＤＡ変性混合物を、貯蔵前に、いくつかの変更をした１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで４℃で１８時間透析した。該混合物の変性を、ペプチドの分離に適する変性ポリアクリルアミドゲル（バイオ−ラッド ラボラトリーズ エイエス、サンドバイバーグ、スウェーデン）で試験した。
【００９４】
リポソームの存在下または不存在下でＰＢＳ、ｐＨ７．４（２０ｌｅｇ／ｍｌ）で希釈した天然のまたは変性した合成ペプチドを、マイクロタイタープレートウェル（ヌンク マキシソープ、ヌンク、ロスキルド、デンマーク）に吸着させ、４℃で一晩インキュベートした。参照用として、ペプチドの一つ（Ｐ６）を、各プレートに流した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した後、コーティングされたプレートを、ＴＢＳ中のスーパーブロック（ピアース、ロックフォード、イリノイ）で室温で５分間ブロックし、続いて、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）で希釈されたプールされたヒト血漿を室温で２時間、その後４℃で一晩インキュベートした。すすいだ後、該ペプチドに対する自己抗体の付着を、ＴＢＳ−Ｔで適当に希釈したビオチニル化ウサギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ抗体（ダコ エイ／エス、グロストラップ、デンマーク）を用いることにより検出した。さらに室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、結合したビオチニル化抗体をアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（シグマ）で検出し、室温で２時間インキュベートした。着色反応を、ホスファターゼ基質キット（ピアース）を用いて展開し、室温で１時間インキュベートした後、４０５ｎｍの吸収を測定した。異なるペプチドの吸収値をＰ６の吸収値で分け、比較した。
【００９５】
統計
ＳＰＳＳを統計分析のために使用した。適切な場合、結果は平均値と範囲として、および比率として示される。ボックスプロット（Boxplot）とスキャッタープロット（scatterplots）を、症例および対応するコントロール中の年齢と選択されたペプチドの関係を説明するために使用した。対応するグラフも、年齢と選択されたペプチドの関係を、症例およびコントロールについて、基線の平均年齢（６１才）未満または以上で、また別に平均年齢未満の症例およびコントロールについて例証するために使用した。症例とコントロールでは、別々に、年齢と性別のために調整された部分的な相関係数が、選択されたペプチドおよび血液脂質レベルと共通の頚動脈のＩＭＴの間で計算された。年齢および性別で調節した部分的な相関係数は、平均年齢以下およびそれ以上で症例およびコントロールにおける共通の頚動脈のＩＭＴと選択されたペプチドの間で計算された。独立のサンプルｔ−検定は通常分配された連続変数を評価するために、カイ二乗検定は症例とコントロールの比率を評価するために使用された。非パラメーター検定（マン−ホイットニー）は症例とコントロールの間の非通常分配された連続変数を評価するために使用された。ｐ−値はすべて両側（two-tail）である。
【００９６】
表
心筋梗塞のある若い患者（４９−６１才）および高齢の患者（６２−６７才）における、および年齢、性別、喫煙および高血圧症を一致させたそれらの対応するコントロールにおける、年齢および性別で合わせた異なる基線ＭＤＡペプチドおよび共通の頚動脈内膜中膜厚さのための相関係数
ペプチド ４９−６１才の症例およびコントロール ６２−６７才の症例およびコントロール
n=116 n=111
IGM
MDA 32 0.235t -0.101
MDA 45 0.366$ -0.030
MDA 74 0.178 0.063
MDA 102 0.255$ -0.039
MDA 129 0.330$ -0.009
MDA 162 0.2451 0.001
MDA 210 0.254 0.013
MDA 240 0.284$ 0.006
IGG
MDA215 0.119 -0.059
p<0.05;$/xO.O1
【００９７】
発明の特徴
本発明は、ヒトを含む哺乳類の免疫感作または治療のためのアポリポタンパク質Ｂ断片であって、虚血性心疾患に対する免疫源としてのまたは治療的な性質を有し、虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関する抗体の存在または不存在を分析するアポリポタンパク質Ｂ断片に関する。
該断片がアルデヒドのハプテンであり得る。
該断片がマロンジアルデヒドまたはヒドロキシノネナールを用いて変性され得る。
【００９８】
本発明は下記の群からなる天然型またはアルデヒド誘導体である断片であるペプチド：
ＦＬＤＴＶＹＧＮＣＳＴＨＦＴＶＫＴＲＫＧ
ＰＱＣＳＴＨＩＬＱＷＬＫＲＶＨＡＮＰＬＬ
ＶＩＳＩＰＲＬＱＡＥＡＲＳＥＩＬＡＨＷＳ
ＫＬＶＫＥＡＬＫＥＳＱＬＰＴＶＭＤＦＲＫ
ＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫＱＴＥＡＴＭＴＦＫ
ＤＧＳＬＲＨＫＦＬＤＳＮＩＫＦＳＨＶＥＫ
ＫＧＴＹＧＬＳＣＱＲＤＰＮＴＧＲＬＮＧＥ
ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
ＳＬＴＳＴＳＤＬＱＳＧＩＩＫＮＴＡＳＬＫ
ＴＡＳＬＫＹＥＮＹＥＬＴＬＫＳＤＴＮＧＫ
ＤＭＴＦＳＫＱＮＡＬＬＲＳＥＹＱＡＤＹＥ
ＭＫＶＫＩＩＲＴＩＤＱＭＱＮＳＥＬＱＷＰ
ＩＡＬＤＤＡＫＩＮＦＮＥＫＬＳＱＬＱＴＹ
ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫＫＮＫＨ
ＥＥＥＭＬＥＮＶＳＬＶＣＰＫＤＡＴＲＦＫ
ＧＳＴＳＨＨＬＶＳＲＫＳＩＳＡＡＬＥＨＫ
ＩＥＮＩＤＦＮＫＳＧＳＳＴＡＳＷＩＱＮＶ
ＩＲＥＶＴＱＲＬＮＧＥＩＱＡＬＥＬＰＱＫ
ＥＶＤＶＬＴＫＹＳＱＰＥＤＳＬＩＰＦＦＥ
ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ
ＬＬＤＩＡＮＹＬＭＥＱＩＱＤＤＣＴＧＤＥ
ＣＴＧＤＥＤＹＴＹＫＩＫＲＶＩＧＮＭＧＱ
ＧＮＭＧＱＴＭＥＱＬＴＰＥＬＫＳＳＩＬＫ
ＳＳＩＬＫＣＶＱＳＴＫＰＳＬＭＩＱＫＡＡ
ＩＱＫＡＡＩＱＡＬＲＫＭＥＰＫＤＫＤＱＥ
ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
ＳＬＮＳＨＧＬＥＬＮＡＤＩＬＧＴＤＫＩＮ
ＷＩＱＮＶＤＴＫＹＱＩＲＩＱＩＱＥＫＬＱ
ＴＹＩＳＤＷＷＴＬＡＡＫＮＬＴＤＦＡＥＱ
ＥＡＴＬＱＲＩＹＳＬＷＥＨＳＴＫＮＨＬＱ
ＡＬＬＶＰＰＥＴＥＥＡＫＱＶＬＦＬＤＴＶ
ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ
ＳＧＡＳＭＫＬＴＴＮＧＲＦＲＥＨＮＡＫＦ
ＮＬＩＧＤＦＥＶＡＥＫＩＮＡＦＲＡＫＶＨ
ＧＨＳＶＬＴＡＫＧＭＡＬＦＧＥＧＫＡＥＦ
ＦＫＳＳＶＩＴＬＮＴＮＡＥＬＦＮＱＳＤＩ
ＦＰＤＬＧＱＥＶＡＬＮＡＮＴＫＮＱＫＩＲ
ＡＴＲＦＫＨＬＲＫＹＴＹＮＹＱＡＱＳＳＳ
またはこれらのペプチドの一またはそれ以上の活性部位にも関する。
【００９９】
本発明は下記の群から選択されるペプチド
ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ
ＡＬＬＶＰＰＥＴＥＥＡＫＱＶＬＦＬＤＴＶ
ＦＬＤＴＶＹＧＮＣＳＴＨＦＴＶＫＴＲＫＧ
ＰＱＣＳＴＨＩＬＱＷＬKＲＶＨＡＮＰＬＬ
ＬＬＤＩＡＮＹＬＭＥＱＩＱＤＤＣＴＧＤＥ
ＣＴＧＤＥＤＹＴＹＫＩＫＲＶＩＧＮＭＧＱ
ＧＮＭＧＱＴＭＥＱＬＴＰＥＬＫＳＳＩＬＫ
ＳＳＩＬＫＣＶＱＳＴＫＰＳＬＭＩＱＫＡＡ
ＩＱＫＡＡＩＱＡＬＲＫＭＥＰＫＤＫＤＱＥ
ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ
ＶＩＳＩＰＲＬＱＡＥＡＲＳＥＩＬＡＨＷＳ
ＫＧＴＹＧＬＳＣＱＲＤＰＮＴＧＲＬＮＧＥ
ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
ＳＬＴＳＴＳＤＬＱＳＧｌＩＫＮＴＡＳＬＫ
ＴＡＳＬＫＹＥＮＹＥＬＴＬＫＳＤＴＮＧＫ
ＤＭＴＦＳKＱＮＡＬＬＲＳＥＹＱＡＤＹＥ
ＧＳＴＳＨＨＬＶＳＲＫＳＩＳＡＡＬＥＨＫ
ＩＡＬＤＤＡＫＩＮＦＮＥＫＬＳＱＬＱＴＹ
ＩＥＮＩＤＦＮＫＳＧＳＳＴＡＳＷＩＱＮＶ
ＮＬＩＧＤＦＥＶＡＥＫＩＮＡＦＲＡＫＶＨ
ＩＲＥＶＴＱＲＬＮGＥＩＱＡＬＥＬＰＱＫ
ＧＨＳＶＬＴＡＫＧＭＡＬＦＧＥＧＫＡＥＦ
ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫＫＮＫＨ
ＦＰＤＬＧＱＥＶＡＬＮＡＮＴＫＮＱＫＩＲ
ＡＴＲＦＫＨＬＲＫＹＴＹＮＹＱＡＱＳＳＳ
またはこれらのペプチドの１種類またはそれ以上の活性部位にも関する。
前記ペプチドは天然型であり得る。
前記ペプチドは酸化型であり得る。
前記ペプチドは銅を用いて酸化されていてもよい。
前記ペプチドはリン脂質リポソームとの組み合わせで存在し得る。
前記ペプチドはマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）誘導体型であり得る。
前記ペプチドはヒドロキシノネナール誘導体型であり得る。
【０１００】
本発明は、所望によりアジュバントを組み合わせた、虚血性心疾患の治療のための免疫療法または治療法を目的とする医薬組成物の調製における、天然型またはＭＤＡもしくはヒドロキシノネナール誘導体型の１種類またはそれ以上の断片／ペプチドの使用にも関する。
該使用において、免疫投与量が前記断片／ペプチド１〜１００ｍｇであり得る。
【０１０１】
本発明は、前記断片／ペプチドの１種類またはそれ以上の治療有効量を、所望により１種類またはそれ以上の薬理学的に無害の充填剤および／または助剤との組み合わせで含有する医薬組成物にも関する。
該医薬組成物において、前記断片／ペプチドがカチオン化ウシ血清アルブミンに結合して存在し得て、助剤として水酸化アルミニウムが使用され得る。
該医薬組成物において、前記組成物が注射用組成物として存在し得る。
【０１０２】
本発明は、断片／ペプチドの１種類またはそれ以上を含む、虚血性心疾患に対するヒトを含むほ乳類の免疫感作のためのワクチンにも関する。
本発明は、１種類またはそれ以上の前記天然型および／またはＭＤＡ変性配列に対する精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体の治療有効量を含む虚血性心疾患に対するヒトを含むほ乳類の免疫感作のためのワクチンにも関する。
該ワクチンにおいて、前記免疫感作のための断片／ペプチドがカチオン化ウシ血清アルブミンに結合して存在してもよく、助剤として水酸化アルミニウムが使用され得る。
【０１０３】
本発明は、天然型またはＭＤＡもしくはヒドロキシノネナール誘導体型の１種類またはそれ以上の前記断片および／またはペプチドの治療有効量をアテローム性動脈硬化症に罹患した、または虚血性心疾患が進展する危険性に面したヒトを含むほ乳類に投与する、アテローム性動脈硬化症に罹患した、または虚血性心疾患が進展する危険性に面したヒトを含むほ乳類の予防的治療または治療方法にも関する。
【０１０４】
本発明は、天然型またはＭＤＡ変性配列に対する精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体の治療有効量を投与して受動免疫を起こす、アテローム性動脈硬化症に罹患した、または虚血性心疾患が進展する危険性に面したヒトを含むほ乳類の予防的治療または治療方法にも関する。
該方法において、病態が、高齢者における、酸化ＬＤＬが炎症、細胞毒性およびプラーク破壊の危険性に寄与していると考えられる不安定なアテロームプラーク、並びに冠動脈心疾患の１またはそれ以上であり得る。
【０１０５】
本発明は、アッセーにおいて一またはそれ以上の前記断片および／またはペプチドを用いる、虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関連する抗体の存在または不存在を診断する方法にも関する。
該方法において、前記アッセーがイムノアッセーであり得る。
該方法において、前記イムノアッセーがＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティングであり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列：
ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ
を有するペプチド、そのエピトープ、酸化型、またはアルデヒドまたはマロンジアルデヒド誘導体。
【請求項２】
前記ペプチドが天然型である請求項１記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
【請求項３】
前記ペプチドが前記アルデヒド誘導体のハプテンである請求項１記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
【請求項４】
前記ペプチドが酸化型であり、前記ペプチドが銅を用いて酸化されている酸化型を含む請求項１記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
【請求項５】
前記ペプチドがマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）誘導体の形態またはヒドロキシノネナール誘導体の形態である請求項１記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
【請求項６】
前記ペプチドがリン脂質リポソームと組み合わせられる請求項１〜５いずれか１項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体に対する精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体。
【請求項８】
医薬品に使用するための、請求項１〜６いずれか１項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体、または請求項７記載の精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体。
【請求項９】
所望によりアジュバントを組み合わせて、アテローム性動脈硬化症または虚血性心疾患（冠動脈心疾患、心筋梗塞、脳卒中、および／または周辺の動脈疾患を含み得る）の免疫療法または治療法に使用するための請求項１〜６いずれか１項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体、または請求項７記載の精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体。
【請求項１０】
アテローム性動脈硬化症および／または虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関連する抗体の存在または不存在の分析に使用する請求項１〜６いずれか１項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
【請求項１１】
所望により１種類またはそれ以上の薬理学的に無害の充填剤、および／またはアジュバントを組み合わせて、１種類またはそれ以上の請求項１〜６いずれか１項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体、または請求項７記載の精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体を治療有効量含有する医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物がアテローム性動脈硬化症または虚血性心疾患（冠動脈心疾患、心筋梗塞、脳卒中、および／または周辺の動脈疾患を含み得る）に対するヒトを含むほ乳類の予防的治療および／または治療方法用であって、前記組成物は注射可能な形態である請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
所望によりアジュバントを組み合わせて、１種類またはそれ以上の請求項１〜６いずれか１項記載のペプチド、エピトープ、誘導体を含む、アテローム性動脈硬化症に対するヒトを含むほ乳類の免疫感作に使用するワクチン。
【請求項１４】
免疫投与量が前記ペプチド１〜１００ｍｇである請求項１３記載のワクチン。
【請求項１】
下記の配列：
ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ
を有するペプチド、そのエピトープ、酸化型、またはアルデヒドまたはマロンジアルデヒド誘導体。
【請求項２】
前記ペプチドが天然型である請求項１記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
【請求項３】
前記ペプチドが前記アルデヒド誘導体のハプテンである請求項１記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
【請求項４】
前記ペプチドが酸化型であり、前記ペプチドが銅を用いて酸化されている酸化型を含む請求項１記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
【請求項５】
前記ペプチドがマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）誘導体の形態またはヒドロキシノネナール誘導体の形態である請求項１記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
【請求項６】
前記ペプチドがリン脂質リポソームと組み合わせられる請求項１〜５いずれか１項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体に対する精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体。
【請求項８】
医薬品に使用するための、請求項１〜６いずれか１項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体、または請求項７記載の精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体。
【請求項９】
所望によりアジュバントを組み合わせて、アテローム性動脈硬化症または虚血性心疾患（冠動脈心疾患、心筋梗塞、脳卒中、および／または周辺の動脈疾患を含み得る）の免疫療法または治療法に使用するための請求項１〜６いずれか１項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体、または請求項７記載の精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体。
【請求項１０】
アテローム性動脈硬化症および／または虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関連する抗体の存在または不存在の分析に使用する請求項１〜６いずれか１項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
【請求項１１】
所望により１種類またはそれ以上の薬理学的に無害の充填剤、および／またはアジュバントを組み合わせて、１種類またはそれ以上の請求項１〜６いずれか１項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体、または請求項７記載の精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体を治療有効量含有する医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物がアテローム性動脈硬化症または虚血性心疾患（冠動脈心疾患、心筋梗塞、脳卒中、および／または周辺の動脈疾患を含み得る）に対するヒトを含むほ乳類の予防的治療および／または治療方法用であって、前記組成物は注射可能な形態である請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
所望によりアジュバントを組み合わせて、１種類またはそれ以上の請求項１〜６いずれか１項記載のペプチド、エピトープ、誘導体を含む、アテローム性動脈硬化症に対するヒトを含むほ乳類の免疫感作に使用するワクチン。
【請求項１４】
免疫投与量が前記ペプチド１〜１００ｍｇである請求項１３記載のワクチン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−６３５９８（Ｐ２０１１−６３５９８Ａ）
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２３９４７７（Ｐ２０１０−２３９４７７）
【出願日】平成２２年１０月２６日（２０１０．１０．２６）
【分割の表示】特願２００２−５７８９９３（Ｐ２００２−５７８９９３）の分割
【原出願日】平成１４年４月５日（２００２．４．５）
【出願人】（５０２００４９２８）フォルスカーパテント イー エスイーデー アーベー (7)
【出願人】（３９８０６２１４９）セダーズ−シナイ メディカル センター (34)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２６日（２０１０．１０．２６）
【分割の表示】特願２００２−５７８９９３（Ｐ２００２−５７８９９３）の分割
【原出願日】平成１４年４月５日（２００２．４．５）
【出願人】（５０２００４９２８）フォルスカーパテント イー エスイーデー アーベー (7)
【出願人】（３９８０６２１４９）セダーズ−シナイ メディカル センター (34)
【Ｆターム（参考）】
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