アデニル酸シクラーゼタンパク質またはその断片に挿入されたヒトパピローマウイルスエピトープを有する組換えタンパク質、およびその治療的使用
本発明は、１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有する１個または数個のポリペプチドを含む組換えタンパク質に関し、該ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されており、該ＣｙａＡ断片は、該アデニル酸シクラーゼが抗原提示細胞を標的化するという特性を保持している。本発明はまた、該組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。組換えタンパク質またはポリヌクレオチドは、ＨＰＶ感染またはその悪性作用に対する治療手段の設計ために使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、アデニル酸シクラーゼタンパク質またはその断片に挿入されたパピローマウイルスエピトープを有する組換えタンパク質に関する。
【０００２】
したがって、本発明は、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質がタンパク質ベクターとして作用して、パピローマウイルス抗原、特にヒトパピローマウイルス抗原に由来するエピトープに対する免疫応答を誘起するような、組換えタンパク質に関する。
【０００３】
本発明は、特に、エピトープを、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、特にヒト細胞に送達するための、このようにして得られたタンパク質性ベクターの使用に関する。
【０００４】
本発明はまた、本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞にも関する。
【０００５】
本発明はまた、宿主におけるヒトパピローマウイルス感染の処置または予防のための、並びに、宿主、特に哺乳動物宿主における、ヒトパピローマウイルス感染から生じる悪性作用の処置または予防のための、上記の組換えタンパク質またはポリヌクレオチドの適用にも関する。特定の実施形態において、本発明は、免疫療法、特にパピローマウイルスの腫瘍特異的抗原に対する免疫療法に適した化合物の設計に有用な手段を提供する。
【０００６】
数多くのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプの中で、ハイリスクＨＰＶと称されるものは、宿主において感染が持続した場合の上皮悪性疾患の発達に関連している（１）。世界中で２番目に最も広まっている婦人科癌である子宮頚部癌（１）では、大抵、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ ＤＮＡが検出される（＞９９％）（２）。これらのウイルスの発癌能は、初期遺伝子、すなわち、Ｅ６およびＥ７遺伝子（その発現は、ウイルスの複製全周期において検出され、悪性形質転換の発症および存続に必要である）により発現される産物に起因する。しかし、これらのハイリスク発癌性ＨＰＶタイプによる肛門性器感染が高い頻度で起こることと、ＨＰＶ関連悪性疾患を最終的に発症する個体の比率は低いこととは対照的であり、このことは、免疫応答によりハイリスクＨＰＶ感染が制御されていることを示唆する。いくつかの観察により、例えば、大半の悪性段階以前の病変の自発的減退（１）、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびマクロファージによる退行中の性器いぼの浸潤（１）、並びに、免疫抑制患者および免疫欠陥患者においてより多数の感染被験者が認められることなどにより（１）、この所説が強められた。さらに、ＨＰＶ１６−Ｅ６および／またはＥ７エピトープに対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＨＰＶ１６関連悪性疾患と診断された患者の血液（４〜８）、並びに、健康個体の血液に（９、１０）検出された。まとめると、これらの考察には、ＨＰＶ１６のＥ６および／またはＥ７タンパク質に標的化する免疫療法の開発に対する強い根拠が含まれていた。
【０００７】
Ｈ−２Ｄｂ ＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７拘束性エピトープに対する免疫応答を発生させることにより、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨＰＶ１６−Ｅ６および−Ｅ７陽性腫瘍原性細胞系の腫瘍増殖を予防するための、多くのワクチン戦略が開発されている。これらのワクチン接種アプローチは、プラスミドＤＮＡ、ウイルス性または細菌性ベクター、キメラウイルス様粒子、合成ペプチド、および組換えタンパク質を含んでいる（１１）。残念なことに、該アプローチは、臨床的退行に関しては控えめに満足できる結果しかもたらさなかった（３）。したがって、細胞性応答を誘起するために、ＨＰＶ−エピトープを免疫系に標的化させる新規ツールを評価することは依然として感心が高い。
【０００８】
したがって、宿主において前記抗原に対する体液性および／または細胞性免疫応答の誘起が可能である条件において、ＨＰＶ抗原のエピトープを標的細胞に送達するのに適した新規ベクターが必要である。本発明者らは、アデニル酸シクラーゼタンパク質が、このようなベクターを設計する上で興味深いことを見出した。Bordetella pertussisのアデニル酸シクラーゼタンパク質を使用して様々な観察がなされ、これにより、このタンパク質が、このような効率的なベクターの設計に適した基盤となる可能性があるという結論が得られた。
【０００９】
Bordetella pertussisのアデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）は、その触媒ドメインを、真核細胞のサイトゾルへと送達することができる（１２）。したがって、ＣｙａＡの触媒部位に挿入されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面において、それぞれＭＨＣクラスＩＩおよびＩ分子により処理され提示される（１３）。さらに、ＣｙａＡは、近年、αＭβ２インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）に特異的に結合し（１４、第ＷＯ０２／２２１６９号）、これにより、これらのＴ細胞エピトープをＣＤ１１ｂ＋樹状細胞亜個体群に標的化することが実証された（１５）。マウスを、適切なエピトープを有する組換えＣｙａＡで免疫化すると、強力なＣＴＬ応答、致死的なウイルス攻撃に対する完全な防御、並びに効率的な予防的および治療的抗腫瘍免疫が誘導された（１６、１７）。アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質は特徴づけられており、組換えＤＮＡ技術によるその調製に関して、特に第ＷＯ９３／２１３２４号または第ＷＯ０２／２２１６９号に開示されている。第ＷＯ０２／２２１６９号には、Ｃｙａが包含する残基３７３〜１７０６の断片は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体との相互作用に実質的に必要とされる構造を含むことが記載されている。
【００１０】
より具体的には、残基１１６６からアミノ酸残基１２８１の範囲のアミノ酸配列は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体との相互作用のための決定基を含み、より特定すると、残基１２０８から残基１２４３の範囲のアミノ酸配列は、毒素とＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の相互作用に重要であることが後記されている（第ＥＰ０３２９１４８６．３および４５）。
【００１１】
本発明者らは、今回、ＨＰＶ抗原のエピトープを、宿主（ＨＰＶ感染およびその悪性形質転換に罹患している宿主を含む）の標的細胞、特に抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達できる、該エピトープを有する、すなわち含む、組換えＣｙａＡタンパク質の作成のための条件を決定し評価した。
【００１２】
したがって、本発明は、特に、１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有する１個または数個のポリペプチドを含む組換えタンパク質に関し、該ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されており、該ＣｙａＡ断片は、ＡＰＣ、特にＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞、例えば樹状細胞などのＣｙａＡの標的細胞に標的化させるという、該アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持している。特定の実施形態において、この断片はまた、そこに挿入されたエピトープまたは該エピトープを含むポリペプチドの、標的細胞のサイトゾルへの転位を可能とするようなＣｙａＡの特性を保持している。標的細胞のサイトゾルへのエピトープまたは該エピトープを含むポリペプチドの転位は、ＣｙａＡ断片が、その触媒ドメインの転位を可能とするタンパク質ドメインを保持している場合に許容される。
【００１３】
本発明の組換えタンパク質は、組換え技術を頼りにして調製できる。それはまた、合成、特に化学合成によっても得ることができる。したがって、「組換えタンパク質」なる語句は、キメラ形態のタンパク質を意味する。
【００１４】
組換えタンパク質のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞への標的化能は、特に、第ＥＰ０３２９１４８６．３および（４５）または第ＷＯ０２／２２１６９号に開示された方法にしたがってアッセイできる。さらに、組換えタンパク質の、該エピトープまたは該エピトープ含有ポリペプチドを標的細胞のサイトゾルへと転位する能力は、第ＷＯ０２／２２１６９号に記載の方法を適用することによりアッセイできる。
【００１５】
特定の実施形態において、ＣｙａＡ断片は、天然ではＣｙａＡ中で連続していない、ＣｙａＡの２個の異なる部分から構成されることができる。一例として、ＣｙａＡの触媒ドメイン、すなわち、ＣｙａＡのＮ末端部分の４００アミノ酸残基、および、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８抗原提示細胞の標的化に必要とされるアミノ酸残基１２０８〜１２４３を含む断片を挙げることができる。
【００１６】
先の定義において、「ポリペプチド」なる表現は、翻訳後修飾を受けたアミノ酸配列、特に、少なくとも６個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列、および、特に５〜５００残基または約５〜約１００、または約５〜約２００、または約１０〜約５０残基、または約３０もしくは約５０〜２００残基、または約１００〜約２１０、または約１００〜約２００残基を有するアミノ酸配列を含む任意のアミノ酸配列（ただし、該アミノ酸配列は少なくとも１個のエピトープを含む）、すなわち、標的細胞、有利には宿主、特に哺乳動物宿主の標的細胞に送達した後に免疫応答を発生させることのできるアミノ酸配列を記載する。したがって、この定義によるポリペプチドは、エピトープ、さらには独特なエピトープに限定されても、または、数個の異なるもしくは同じエピトープを含んでいても、または、病原体の、すなわちヒトパピローマウイルスの全長抗原を包含していてもよい。本発明のエピトープは、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答、特にＴ細胞免疫応答に関与するアミノ酸配列を包含する。したがって、本発明の組換え分子のポリペプチド中のエピトープは、宿主においてＡＰＣ（抗原提示細胞）により処理されるもの、特に、クラスＩ ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）分子と会合して認識されるもの、例えば標的細胞がＣＤ８＋Ｔリンパ球であるエピトープ、またはクラスＩＩ ＭＨＣ分子と会合して認識されるエピトープ、例えば標的細胞がＣＤ４＋Ｔリンパ球細胞であるものが挙げられる。
【００１７】
特定の実施形態において、エピトープを有するポリペプチドは、様々な抗原に由来する、特に様々なＨＰＶ株の１タイプの抗原に由来する、または、様々なＨＰＶ株の数タイプの抗原に由来する、数個のエピトープを含む。したがって、ＨＰＶ抗原に由来するポリペプチドは、多価、特に二価または三価であることができ、すなわち、数個の抗原に対する免疫応答が可能となる。
【００１８】
本発明によれば、ＨＰＶ抗原（これから１個または数個のエピトープを有するポリペプチドを設計できる）は、好ましくは、特にＨＰＶ感染後の悪性作用の発症および／または存続に関与するタンパク質に由来するものであり、いわゆる腫瘍抗原、すなわち、宿主において免疫応答を誘起し、宿主において抗体またはＴ細胞と特異的に反応できる、ＨＰＶ感染に関連した腫瘍発達に関連した抗原を包含する。
【００１９】
本発明に記載のエピトープを有するポリペプチドは、ＨＰＶの天然または成熟抗原から得られることができ、これには、抗原完全体を使用することにより、あるいは、全タンパク質ではなくむしろ、断片、特に抗原性断片、特に該抗原のエピトープを選択することにより、あるいは、特に、組換え分子中のＣｙａＡタンパク質と会合させた場合に、宿主における免疫応答を誘導または誘起する能力を高めるために、該抗原またはその選択された抗原部分またはエピトープを改変することによることが含まれる。したがって、このようなエピトープの様々な可能な改変を説明するために、これらのポリペプチドは、抗原（これからエピトープが得られる）の天然または非天然フランキング配列によりフランキングされたエピトープを包含し、また、その免疫特性を高めるために化学的に改変されているエピトープまたはエピトープを含むアミノ酸配列を包含する。これらの改変は、ＣｙａＡタンパク質に関連して得られるポリペプチドの有効性を向上するために有益である可能性がある。
【００２０】
いくつかの特定の改変が、本明細書で以後に例として開示されており、特に追加の陽性荷電のアミノ酸残基の挿入によるポリペプチド荷電の変化を包含する改変が含まれる。
【００２１】
したがって、本発明のポリペプチドはまた、半合成または合成ポリペプチドも包含する。
【００２２】
特定の実施形態によれば、ＨＰＶ抗原に由来するポリペプチドは、各々または一緒になって、約５〜約５００、または約５〜約１００、または約５〜約２００、例えば約１０〜約５０アミノ酸残基、または約３０もしくは約５０〜約２００アミノ酸残基、または約１００〜約２１０、または約１００〜約２００アミノ酸残基を含む。
【００２３】
ポリペプチドは、特に、本発明の組換えタンパク質中で組換えられた場合に、抗原特異的応答を誘起できるように選択される。
【００２４】
本発明の組換えタンパク質は、特に、分断された天然ＨＰＶ抗原に存在するポリペプチドまたは数個のポリペプチドを含むように設計することができ、ここで、該分断は、該ＨＰＶ抗原の酸性領域にける１個または数個のアミノ酸残基の欠失、および／または、アデニル酸シクラーゼの少なくとも２箇所の許容部位における該ＨＰＶ抗原の少なくとも２個のポリペプチド断片の挿入からなる。
【００２５】
この定義に包含される特定の分断は、アデニル酸シクラーゼの少なくとも２箇所の許容部位への、天然ＨＰＶ抗原の少なくとも２個の断片の挿入により得られ、ここで、これらの少なくとも２個の断片は、天然抗原におけるその天然の位置と比べて逆であり、すなわち、天然抗原においてよりＮ末端側である断片は、ＣｙａＡタンパク質またはその断片に挿入されると、よりＣ末端側となり、その逆もある。
【００２６】
アミノ末端断片およびカルボキシ末端断片の逆転は、Ｅ７Δ断片（すなわち、Ｅ７抗原の断片）で示されるように、特に癌免疫療法において、強力で長く続く防御免疫を誘導する際により効果的である可能性があることが観察されている。
【００２７】
本発明によれば、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）は、先に開示したように、全長タンパク質として、またはその断片として使用される。
【００２８】
有利には、ＣｙａＡタンパク質またはその断片は、細胞、特に組換え細胞における、ｃｙａＡ遺伝子およびｃｙａＣ遺伝子の両方の同時発現の結果である、タンパク質またはその断片である。実際に、標的細胞に対する侵襲性特性を有するために、ＣｙａＡは、ｃｙａＡ遺伝子およびｃｙａＣ遺伝子の両方の発現により可能となる翻訳後修飾を受けている必要があることが示されている（第ＷＯ９３／２１３２４号）。
【００２９】
本発明の特定の実施形態において、ＣｙａＡタンパク質の断片は、少なくとも約３０個のアミノ酸残基を有する断片であり、約１３００個まで、特に約５００個までのアミノ酸残基、好ましくは約５０〜約１５０個のアミノ酸残基を有することができ；該断片は、特定の実施形態において、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８標的細胞との相互作用のために、ＣｙａＡのアミノ酸残基１１６６〜１２８１、または、ＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基１２０８〜１２４３を含む。したがって、１個の具体的な断片は、天然タンパク質のＣ末端部分の全部または一部を包含し、この部分は、細胞膜および／またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体を標的化するための該タンパク質の結合に、および、細胞サイトゾルへのポリペプチド群に含まれるエピトープのその後の送達に関与している（１２）。本発明に記載のＣｙａＡタンパク質の１個の具体的な断片は、ＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基３７２〜１７０６を含む。別の具体的な断片は、アミノ酸残基２２５〜２３４が欠失しており、これにより１〜２４４および２３５〜１７０６を含むＣｙａＡ断片を与えるような、ＣｙａＡタンパク質に相当するものである。
【００３０】
本発明の特定の実施形態において、アデニル酸シクラーゼタンパク質は、細菌性タンパク質である。好ましい実施形態において、ＣｙａＡタンパク質は、Bordetella種に由来している。
【００３１】
本発明に記載の対象のBordetella種の中で、その１つが、Bordetella pertussisである。他の対象のBordetella株は、Bordetella parapertussisまたはBordetella bronchisepticaの株である。B.parapertussisのＣｙａＡタンパク質の配列は、特にアクセッション番号ＮＣ００２９２８．３（１７４０アミノ酸の配列として）およびParkhill J.ら（Nat.Genet.DOI、10(2003）に開示されており、B.bronchisepticaについては、Betsou Fら（Gene 1995、8月30日；162(1):165-6）に開示されている。
【００３２】
Bordetella pertussisは、百日咳の原因物質であり、とりわけ、細菌の決定的な病原性因子であり、B.pertussis感染に対して防御性作用のある抗原の１つである、公知の百日咳毒素（ＰＴ）およびアデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）を含む数種の毒素を分泌している。
【００３３】
Bordetella pertussisのアデニル酸シクラーゼタンパク質は、４００アミノ酸残基のＮ末端触媒ドメインと、毒素が標的細胞膜に結合することとその後の細胞サイトゾルへの触媒部分の送達に関与している１３０６残基のＣ末端部分とを含む、１７０６残基の二機能性タンパク質として記載されている毒素である（１２）。
【００３４】
ＣｙａＡタンパク質は、不活性プロ毒素として合成され、これは、２個の内部リジン残基（リジン８６０および９８３）の翻訳後パルミトイル化により活性毒素へと変換される。この翻訳後修飾は、ｃｙａＡ遺伝子と共に、アクセサリー遺伝子、すなわち、B.pertussis染色体上のｃｙａＡの近くに位置するｃｙａＣの発現が必要とされる。
【００３５】
Bordetella pertussisのｃｙａＡは、Glaser,P.ら、1988、Molecular Microbiology2(1)、19-30により、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列として記載されている。したがって、B.pertussisのＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基もしくは配列またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列が本発明において引用される場合、その位置は、Glasserら、1988の該刊行物に開示された配列を参考にして示されている。
【００３６】
本発明に記載の組換えタンパク質では、１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、ＣｙａＡタンパク質の１個または数個の許容部位に挿入されている。
【００３７】
本発明では、「許容部位」は、実質的にＣｙａＡタンパク質の機能特性に影響を及ぼすことなく、特に実質的に細胞の標的化に、特にＣｙａＡによるＡＰＣの標的化に影響を及ぼすことなく（実質的にＣＤ１１ｂ−ＣＤ１８受容体への特異的結合に影響を及ぼすことなく、有利には、実質的に、標的細胞へのエピトープの転位の過程に関与するタンパク質のドメインに影響を及ぼすことなくを含む）、ポリペプチドを挿入できる、ＣｙａＡタンパク質の配列部位である。
【００３８】
ＣｙａＡ触媒ドメインの転位を可能とし、これによりこのような許容部位に挿入されたエピトープの転位を可能とする、Bordetella pertussisアデニル酸シクラーゼの許容部位には、残基１３７〜１３８（Ｖａｌ−Ａｌａ）、残基２２４〜２２５（Ａｒｇ−Ａｌａ）、残基２２８〜２２９（Ｇｌｕ−Ａｌａ）、残基２３５〜２３６（Ａｒｇ−Ｇｌｕ）、および残基３１７〜３１８（Ｓｅｒ−Ａｌａ）が挙げられるがこれに限定されない（（４４）Seboら、1995）。以下の追加の許容部位もまた、本発明の実施形態に含まれる：残基１０７〜１０８（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ）、残基１３２〜１３３（Ｍｅｔ−Ａｌａ）、残基２３２〜２３３（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）、３３５〜３３６（Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）および３３６〜３３７（４３）。
【００３９】
他のBordetella種における対応する許容部位は、配列の比較および対応する残基の決定により定義できる。
【００４０】
別の実施形態によれば、該ポリペプチドは、追加的にまたは代替的に、ＣｙａＡタンパク質またはその断片の一端および／または他の末端に挿入してもよい。
【００４１】
本発明の目的のために使用するＣｙａＡタンパク質の特定の断片は、１３００個までのアミノ酸または約３０〜約５００個のアミノ酸残基、有利には約５０〜約１５０個のアミノ酸残基を含むもの、特に、天然ＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基１１６６〜１２８１、有利には天然ＣｙａＡタンパク質の１２０８〜１２４３を包含するような断片である。
【００４２】
したがって、本発明によれば、「ハイブリッドタンパク質」とも呼ばれるいわゆる組換えタンパク質をもたらすＣｙａＡタンパク質へのポリペプチドの「挿入」は、特に、利用可能なＤＮＡ技術による遺伝子的挿入を包含する。または、「挿入」はまた、非遺伝子的挿入も包含され、これには、例えばＣｙａＡもしくはその断片の一端において実施する共有結合、または非共有結合などの化学的挿入が含まれる。非遺伝子的挿入は、挿入するポリペプチドが合成または半合成である場合には特に関心が高い可能性がある。薬物をポリペプチドに結合させる方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｎ−ピリジルスルホニル活性化スルフヒドリルを使用するなどのジスルフィド連結が含まれる。
【００４３】
特に、インビボで、Ｃｙａの標的細胞へ、例えばＡＣＰ、例えばＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞、特に該細胞のサイトゾルへと標的化させるために、化学的連結または遺伝子的挿入により、本発明のポリペプチドを特に含む分子を、ＣｙａＡに融合させることが可能である。実際に、所与のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに相当する分子を、解毒したＣｙａＡの触媒ドメインに、ジスルフィド結合または遺伝子的挿入により結合させると、遺伝子工学された分子は、インビボで特異的ＣＴＬ応答を誘起することができ、これにより、該ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ１１ｂ発現細胞のサイトゾルへと転位されたことが示される。
【００４４】
特定の実施形態において、タンパク質性ベクターの製造に使用される組換えアデニル酸シクラーゼは、ジスルフィド結合により、該アデニル酸シクラーゼの触媒ドメイン内に位置する遺伝子的に挿入されたシステイン残基に化学的に結合されている本発明のポリペプチドを特に含む、システイン残基含有の１個以上の分子の挿入により特に改変されている、ＣｙａＡまたはその断片である。
【００４５】
実際に、本発明のポリペプチドを特に含む複数の分子を、ジスルフィド結合により、触媒ドメイン内の様々な許容部位に位置する様々なシステイン残基に化学的に結合させることができる。
【００４６】
宿主において免疫応答、特に細胞性免疫応答を誘起できる製品の設計に適した組換えタンパク質を提案するために、また特に、ＨＰＶに感染した宿主に観察される悪性作用に対する免疫応答を誘起できるような製品を設計するために、本発明者らは、高度に発癌性のＨＰＶ株、特にＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２、またはＨＰＶ５８から選択される株に由来する抗原に由来するエピトープを有するポリペプチドを得ることを提案した。
【００４７】
これらの株の中で、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ１６が特に関心が高い。ＨＰＶ１６は、特に、哺乳動物宿主、特にヒトにおける子宮頚部癌の発症に関連しているために、ＨＰＶに感染した宿主の処置のための特定の標的である。
【００４８】
これらのＨＰＶ株から出発して、本発明者らは、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、およびＥ５タンパク質から選択される抗原に由来するエピトープを有するポリペプチドを得ることを提案する。
【００４９】
代替的にまたは組み合わせて、本発明者らはまた、ＨＰＶのＥ６またはＥ７タンパク質に由来するエピトープを有する該ポリペプチドを得ることを提案する。
【００５０】
本発明の特定の実施形態において、ＨＰＶ１６のＥ６もしくはＥ７タンパク質またはＨＰＶ１８のＥ６もしくはＥ７タンパク質が、エピトープを有するポリペプチドの設計に使用される。
【００５１】
ＨＰＶ抗原に由来するポリペプチドの設計のために言及できる特定のＨＰＶタンパク質は、ＨＰＶのＥ７タンパク質、特にＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＥ７タンパク質である。本発明の実施形態によれば、該ポリペプチドは、様々なＨＰＶ株、特にＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の数個のＥ７タンパク質から得られる。例えば、該ポリペプチドは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の全長Ｅ７タンパク質、または、ＨＰＶ１６もしくはＨＰＶ１８の各々のＥ７タンパク質の１個もしくは数個の断片（該断片の多量体、特に二量体を含む）から得られる。
【００５２】
これらのＨＰＶタンパク質およびそのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＨＰＶ１６についてはSeedorf,Kら（ヒトパピローマウイルスタイプ１６ＤＮＡ配列、Virology、145:181-185、1985）、Cole S.T.、Danos O.（ヒトパピローマウイルスタイプ１８ゲノムのヌクレオチド配列および比較解析。パピローマウイルスの系統発生並びにＥ６およびＥ７遺伝子産物の反復構造、J.Mol.Biol.193:599-606(1987))またはFernando GJら（子宮頚部癌に関連したヒトパピローマウイルスタイプ１８（ＨＰＶ１８）のＥ７形質転換タンパク質のＴヘルパーエピトープ、Virus Res.1995 Apr.36(1):1-13）に開示されている。
【００５３】
Ｅ６およびＥ７タンパク質は、ウイルスの複製全周期を通じて特にＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８により発現されている癌タンパク質であり、ＨＰＶ株による感染後の宿主細胞の悪性形質転換の発症および存続に必要とされることが示されている。それ故、これらの両方の腫瘍特異的抗原が、養子ＣＴＬ媒介免疫療法の可能性ある標的と考えられている。
【００５４】
本発明の特定の実施形態によれば、該組換えタンパク質は、複数のポリペプチドを含み、その各々が、１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有する。
【００５５】
例えば、このような複数のポリペプチドは、１個のＨＰＶ株、特にＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質から得ることができる。別の例によれば、これらの複数のポリペプチドは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方に由来する、Ｅ６またはＥ７タンパク質から得られるエピトープを包含することができる。
【００５６】
複数のポリペプチドはまた、対象のＣｙａＡタンパク質の異なる許容部位に挿入された、１個のタンパク質、例えばＥ７またはＥ６タンパク質の断片群を有する様々なエピトープからなることができる。
【００５７】
先の定義に記載の別の特定の組換えタンパク質は、エピトープを有する複数のポリペプチドが、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質の残基１〜２９を含む断片、すなわち残基１〜２９からなる断片、または残基４２〜９８を含む断片、すなわち残基４２〜９８からなる断片を包含するか、あるいは、複数のポリペプチドが、ＣｙａＡタンパク質の異なる許容部位に挿入された両方の断片を含むかまたはからなる、ＣｙａＡ組換えタンパク質である。
【００５８】
本発明に記載の別の組換えタンパク質は、複数のポリペプチドが、アミノ酸配列
【表２】
を有する断片を包含するようなタンパク質である。
【００５９】
ＣｙａＡタンパク質の許容部位に挿入されたポリペプチドのアミノ酸残基の数は、全長抗原、特にＨＰＶの全長Ｅ６またはＥ７タンパク質からなるポリペプチドを、ＣｙａＡタンパク質またはその断片に挿入できるようなものである。
【００６０】
本発明の特定の実施形態によれば、組換えＣｙａＡに含まれるポリペプチドは、ＣｙａＡのコドン２２４と２３５の間またはＣｙａＡのコドン３１９と３２０の間に挿入された、Ｅ７タンパク質、特にＨＰＶ１６のＥ７タンパク質である。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の組換えタンパク質は、複数のポリペプチド（そのいくつかは、１個または数個のＨＰＶの１個または数個のエピトープを有するポリペプチドである）および他の病原体のエピトープを有する他のポリペプチドを含む。
【００６２】
別の特定の実施形態において、本発明の組換えタンパク質はさらに、異なる病原性物質から派生した１個または数個のエピトープを含む。ChlamydiaまたはＨＩＶレトロウイルス、またはＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、アデノウイルスＥＢＶ、ヘルペスウイルス、ＨＴＬＶ．１ウイルスおよびＣＭＶから派生したエピトープと、ＨＰＶから派生したエピトープとの会合は、特に関心が高い場合がある。
【００６３】
本発明の別の特定の実施形態によれば、エピトープを有するポリペプチドは、例えば、配列内の負に荷電したアミノ酸残基の数を減少させるために、その天然アミノ酸配列と比べて改変されている。このような改変は、これらの負に荷電したアミノ酸残基のいくつかを除去することにより、または、いくつかの正に荷電したアミノ酸残基を、特にエピトープのフランキング残基として付加することによっても得ることができる。このようにより少ない数の負に荷電した残基を含むポリペプチドは、標的細胞のサイトゾルへのＣｙａＡタンパク質の触媒ドメインの転位に好ましくあり得る。
【００６４】
エピトープを有するポリペプチドはまた、ＣｙａＡに挿入される場合に折りたたまれないようにするように設計でき、これにより、標的細胞への組換えＣｙａＡタンパク質の内部移行の効率が向上する。その含有アミノ酸の結果として折りたたみを受けたポリペプチド中のこのような折りたたみ解除は、例えば、システイン残基を除去または置き換えて、ポリペプチドの折りたたみに関与している可能性があるジスルフィド結合の形成を避けることにより達成することができる。いくつかの場合において、インビボでの再折りたたみを回避することのできる還元剤の存在下でそれらを調製することによりポリペプチドの折りたたみを防ぐことが可能である。
【００６５】
特定の実施形態において、エピトープを有するポリペプチドは、潜在性エピトープであってもよい。
【００６６】
本発明の特定の態様において、本発明者らは、実際に、（ｉ）先に開示した定義に記載のアデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）またはその断片と、（ｉｉ）１個または数個の抗原の１個または数個の抗原性断片を有するポリペプチドとを含む組換えタンパク質からなる、キメラタンパク質構造物は、組換え構造物における該抗原の潜在性エピトープを、それを提示する結果、免疫原性とすることができることが決定された。特に、特に治療目的（ワクチン接種目的を含む）のための、本発明に定義したＣｙａＡまたはその断片と対象の抗原から得られたポリペプチドとを含む該キメラ構造物は、免疫原性とさせることができ、特に、宿主におけるＴ細胞応答、特にＣＴＬ応答を発生させることのできる、抗原の潜在性エピトープを含むことができる。
【００６７】
したがって、本発明はまた、１個または数個の抗原の１個または数個のエピトープを有する１個または数個のポリペプチドを含む組換えタンパク質に関し、該ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されており、該ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的化するという該アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持しており、該エピトープの少なくとも１個は、亜優性潜在性Ｔ細胞エピトープ（subdominant cryptic T-cell epitope）であり、該組換えタンパク質は、該ポリペプチドに対する抗原特異的応答を誘起できる。
【００６８】
特に、潜在性エピトープは、ＨＰＶ抗原、特にＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８抗原、特にＥ７抗原内に含まれる。
【００６９】
このように定義した組換えタンパク質は、特に、ＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質から得られたペプチド、すなわち、アミノ酸配列ＩＤＧＶＮＨＱＨＬを有するペプチドを含む。
【００７０】
特定の実施形態によれば、潜在性エピトープは改変でき、例えば、最初の２箇所の位置において置換を有することができ、例えば配列ＡＳＧＶＮＨＱＨＬを有することができる。
【００７１】
本発明は、特に、ペプチドＩＤＧＶＮＨＱＨＬに関する。
【００７２】
本発明はまた、この配列に置換を有するペプチド、特に１位および／または２位に置換を有するペプチド、特に配列ＡＳＧＶＮＨＱＨＬを有するペプチドに関する。
【００７３】
本発明はまた、免疫原性特性を有する限り、特にＴ細胞を誘起できる限り、特にＣＴＬ応答を誘起できる限りにおいて、該ペプチドの変種を含む。
【００７４】
有利には、本発明の組換えタンパク質を調製するために、ＣｙａＡタンパク質の酵素活性、すなわち、ＡＴＰからｃＡＭＰへと変換する能力は、不活性化されている。このような不活性化は、遺伝子不活性化の結果として得ることができる。一例として、遺伝子不活性化は、ジペプチドを、触媒部位の一部であるＣｙａＡのアミノ酸配列の部位（例えば１８８と１８９の間）に導入する結果として得ることができる。このような不活性化ＣｙａＡタンパク質は、以下の実施例に実例を示す。
【００７５】
本発明の組換えタンパク質は、有利には、細胞性免疫応答を誘起できる。該応答は、ＣＴＬおよびＴｈ、特にＴｈ１応答（ＣＤ４＋Ｔ細胞応答および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む）を含む。
【００７６】
組換えタンパク質がこの細胞性免疫応答を誘起できる能力は、特に、インビボにおいて腫瘍増殖を抑止するのにまたはさらには動物における腫瘍減退を可能とするのに十分であることが示された。
【００７７】
本発明はまた、先に定義した組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して、本発明の組換えタンパク質の発現に適した組換え発現ベクターを提供できる。このような発現ベクターには、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルスベクターが挙げられる。
【００７９】
組換えベクターは、原核細胞、特に細菌における発現に適したものでも、または、真核細胞、特に哺乳動物細胞、有利にはヒト細胞における発現に適した発現ベクターでもよい。
【００８０】
本発明は、特に、本発明に記載の組換えタンパク質をコードするプラスミドからなるベクターに関する、例えば：２００４年３月１８日にＣＮＣＭ Ｉ−３１９１号でＣＮＣＭ（パリ、フランス）に寄託されたｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７ＦＵＬＬ（ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７ＦＵＬＬとも称される）；２００４年３月１８日にＣＮＣＭ Ｉ−３１９０号でＣＮＣＭ（パリ、フランス）に寄託されたｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２（ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２とも称される）、または構造物ｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７４９〜５７。
【００８１】
本発明はまた、本発明に記載のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換された、宿主細胞、特に原核細胞、または真核細胞、例えば哺乳動物細胞（ヒト細胞を含む）を含む。
【００８２】
本発明は、特に、アクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３１９０号およびアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３１９１号でＣＮＣＭに寄託された宿主細胞に関する。
【００８３】
本発明はまた、活性物質として、先に定義した組換えタンパク質または先に定義したポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む、免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物の該活性物質は、宿主への投与に適した生理的に許容されるビヒクル、賦形剤、担体、もしくは希釈剤と共に、またはその組合せと共に製剤化できる。
【００８４】
免疫原性組成物は、有利には、哺乳動物宿主において、細胞性免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を誘導するように設計されている。好ましくは、細胞媒介細胞溶解免疫応答ＣＴＬ、特にＣＤ８＋を誘導できる。
【００８５】
本発明に記載の別の免疫原性組成物は、体液性免疫応答を誘導できるものである。
【００８６】
本発明の免疫組成物が免疫応答を誘導する能力を高めるために、活性物質を、アジュバントおよび／または界面活性剤および／または免疫調節物質（例えばサイトカインまたはケモカイン）と合わせることは興味深い。
【００８７】
アジュバントは、例えば、水層を含むエマルションの形態で一般に使用される、リポソーム、油層、例えばフロイントタイプのアジュバント、または、水不溶性無機塩、例えば水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、コロイド状水酸化鉄、リン酸カルシウム、または塩化カルシウムを含むことができる。
【００８８】
本発明に記載の免疫原性組成物は、有利には、特に免疫療法のために、免疫応答を抗原刺激および／またはブーストすることにより、宿主の免疫応答を誘導するために使用されている。特に、本発明の免疫原性組成物は、宿主におけるＨＰＶ感染に起因する悪性形質転換の発症または存続の予防のために、あるいは、ＨＰＶ感染、特にＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８感染に起因する悪性形質転換に罹患する患者の処置のために興味深い。
【００８９】
このような免疫治療組成物は、腫瘍誘発性状態をもたらす宿主における制御されていない細胞増殖の治療に、特に癌免疫療法に、特にＨＰＶ感染に関連した子宮頚部癌免疫療法において特に興味深い。それ故、それは、癌ウイルス感染に起因する悪性状態（腫瘍状態を含む）の処置に特に適した治療ワクチンの設計のための手段を提供する。
【００９０】
本発明に使用する場合、「処置」または「治療処置」なる表現は、処置を受けている患者に有益な効果をもたらす、本出願で開示された化合物の効果を包含し、該効果は、細胞レベルまたは臨床レベルで観察され、処置の結果、患者の容態の改善もしくは寛解状態、または健康状態の回復が含まれる。処置する悪性状態が、制御されていない細胞増殖または腫瘍の発生もしくは持続である場合、有益な効果は、制御されていない増殖の安定化を含み得、あるいは、好ましくは、その予防、停止もしくは反転、または腫瘍の減退を含み得る。
【００９１】
先に記載した悪性状態の処置を目的とした組成物は、有利には、約１〜約１０００μｇの組換えタンパク質、好ましくは約１０〜約５００μｇの組換えタンパク質の量に対応する用量の活性物質を含むことができる。該組成物が活性物質として本発明の組換えタンパク質を含む場合、用量は、約０．０５〜約１０μｇの組換えタンパク質、好ましくは約０．１〜約１μｇのタンパク質を含むことができる。
【００９２】
処置する状態に応じて、該組成物は、病変レベルで局所的に、１回または数回、例えば数日間の規則的な間隔で、例えば５〜１０日間投与できる。また全身投与してもよい。
【００９３】
本発明はまた、好ましくはヒト宿主における、先の定義に記載の組換えタンパク質、または、先に定義したポリヌクレオチド、または、該ポリヌクレオチドを含むベクター、および、適宜、免疫応答（細胞性免疫応答および／または体液性応答を含む）を誘起するための薬学的に許容されうるビヒクルを含む、ワクチン組成物、特に哺乳動物宿主、好ましくはヒトへの投与のために製剤化された組成物に関する。
【００９４】
本発明はまた、ＨＰＶ感染を予防または処置するための、本発明の組換えタンパク質またはポリヌクレオチドまたはベクターおよび薬学的に許容されうるビヒクルを含む、薬物組成物にも関する。
【００９５】
別の実施形態によれば、薬物組成物は、宿主におけるＨＰＶ感染に起因する悪性形質転換の発症または存続の予防または処置のための、本発明に記載の組換えタンパク質またはポリヌクレオチドまたはベクターを、薬学的に許容されうるビヒクルと共に含む。
【００９６】
癌免疫療法のための、組換えタンパク質またはポリヌクレオチドまたはベクターおよび薬学的に許容されうるビヒクルを含む薬物組成物。
【００９７】
本発明はまた、宿主における免疫応答、すなわち、体液性および／または細胞性免疫応答を誘起するためのベクターとして使用するに適した、細菌タンパク質、特に細菌毒素（好ましくはその類毒素形態）またはその断片を含む組換えタンパク質（該タンパク質またはその断片は、１種類の癌ウイルスによる感染の処置のために、１個または数個の癌ウイルスの１個または数個の抗原の１個または数個のエピトープの挿入により改変されている）の患者における使用に関する。このような組換えタンパク質は、特に、悪性作用、特にこのような癌ウイルスによる感染により引き起こされる腫瘍の処置に提案されている。
【００９８】
癌ウイルスの抗原のエピトープを運ぶためのベクターとして適した細菌タンパク質の例は、クレブシエラのＯｍｐＡまたは以下の毒素シガ毒素（そのβサブユニットを含む）（Haicher N.ら、J.Immunol.2000、165:3301-8）、炭素菌毒素（Goletz TJら、PNAS USA 1997、94:12059-64）、ジフテリア毒素（Stenmark H.ら、J.Cell.Biol.1991、113:1028-32）またはシュードモナス外毒素Ａ（Donnelly JJ.ら、PNAS USA 1993、90:9530-4）である。細菌タンパク質への挿入のためのポリペプチドを調製するために抗原がエピトープを提供できる癌ウイルスには、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、アデノウイルスＥＢＶ、ヘルペスウイルス、ＨＴＬＶ．１ウイルス、およびＣＭＶが挙げられる。
【００９９】
ＣｙａＡ組換えタンパク質について先に示した活性物質としての使用の記述は、他の細菌タンパク質および癌ウイルス抗原にも応用できる。
【０１００】
本発明はまた、ＨＰＶ感染の診断のための、または、このような感染を免疫モニタリングするためのキットに関し、これには、本発明に記載の組換えタンパク質、ポリヌクレオチド、または発現ベクターが含まれる。
【０１０１】
本発明はまた、患者におけるＨＰＶ感染の処置または予防のための、上記の本発明の組換えタンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクターの使用に関する。
【０１０２】
本発明はまた、患者におけるＨＰＶ感染に起因する悪性形質転換の発症または存続に対する免疫療法のための、上記の本発明の組換えタンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクターの使用に関する。
【０１０３】
本発明はまた、ＨＰＶ感染をインビトロで診断する方法またはＨＰＶ感染を免疫モニタリングする方法に関し、該方法は、
哺乳動物、特にヒト患者から得られたＴ細胞を、本発明の組換えタンパク質にさらすこと、
Ｔ細胞の活性化の改変を検出すること
を含む。
【０１０４】
特定の実施形態において、該組換えタンパク質は、ＨＰＶ感染の予防、または、ＨＰＶ感染に罹患している宿主（このような感染に起因する腫瘍を有する宿主を含む）の処置のために使用できる。
【０１０５】
本発明はまた、キメラＣｙａＡ−ポリペプチドタンパク質に含まれるポリペプチドにおける未知または亜優性潜在性Ｔ細胞エピトープのスクリーニング方法であって、
ここで、ＣｙａＡは、先に開示されているアデニル酸シクラーゼまたはその断片であり、該方法は、
該キメラタンパク質を動物宿主に投与すること、
該宿主のＴ細胞応答、特にＣＴＬ応答を決定すること
を含む。
【０１０６】
本発明は、特に、本発明内で定義された組換えタンパク質に含まれるＨＰＶ抗原のポリペプチド中の未知または亜優性または潜在性Ｔ細胞エピトープ（特にＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ）をスクリーニングする方法に関し、該方法は、
該組換えタンパク質を動物宿主（非ヒト）に投与すること、
該宿主のＴ細胞応答、特にＣＴＬ応答を決定すること
を含む。
【０１０７】
本発明を特徴づけるさらなる特徴を、以下の実施例および図面に開示し説明する。
【０１０８】
実施例
実施例１
ここで、本発明者らは、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質の全長配列またはこのポリペプチドの亜断片（特に、Ｈ−２Ｄｂ拘束性エピトープに対応するＥ７の残基４９〜５７およびＨＰＶ１６−Ｅ７残基４３〜９８と１〜２９を包含するペプチド）を含む、組換えＣｙａＡを作成した。本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注入した場合、これらのＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡは、ＩＦＮ−γの分泌により特徴づけられる特異的ＣＴＬおよびＴｈ１応答を誘導できることを示した。さらに、治療的に試験した場合、これらの構造物は、ＴＣ−１細胞の皮下移植に対して１００％以下の防御を提供できた。この研究は、初めて、インビボでの、ヒト腫瘍特異的抗原に対するＣｙａＡにより媒介される抗腫瘍治療活性の実証を示した。
【０１０９】
材料および方法
マウスおよび細胞系
特定の病原体を含まない６〜１０週令の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、CER Janvier（Le Gesnet St-Isle、フランス）またはチャールズリバー（L'Arbresle、フランス）から得た。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドへと育成したＴＡＰ１−／−（１８）、ＭＨＣクラスＩＩ−／−（１９）およびＣＤ４０−／−（２０）もこの研究に使用した。動物を、水と食料が自由にとれ、病原体の存在しない条件下で、パスツール研究所動物施設で飼った。動物の関与する実験は、動物の世話の施設ガイドラインにしたがって実施した。ＨＰＶ１６Ｅ６およびＥ７タンパク質を発現しているＴ細胞（２１）およびマウス胸腺ＥＬ４細胞（１７）を、ＡＴＣＣから得た。細胞を、１０％の熱不活性化ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．４ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ＴＣ−細胞に対してのみ）、および５×１０５Ｍの２−メルカプトエタノール（ギブコＢＲＬ、Cergy-Pointoise、フランス）を補充したグルタマックスを含むＲＰＭＩ１６４０中に維持した。
【０１１０】
ペプチド
ＨＰＶ１６−Ｅ７ Ｈ２−Ｄｂ拘束性エピトープ（２２）に対応する合成ペプチドＥ７４９〜５７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、一文字でアミノ酸をコード）並びにＥ７４９〜５７ＣＴＬエピトープ（天然フランキング配列およびＴｈエピトープ（太線）を含む）（２３）に対応するＥ７４３〜７７
【表３】
を、Neosystem（ストラスブール、フランス）から購入した。ＣｐＧ ＯＤＮ１８２６は、PROLIGO（パリ、フランス）から購入した。
【０１１１】
ＨＰＶ１６−Ｅ７エピトープを有する組換えB.pertussisアデニル酸シクラーゼの作成および精製
本文書で使用される組換えアデニル酸シクラーゼは、酵素的に不活性なＣｙａＡをコードするプラスミドｐＴＲＡＣＥ５の誘導体（図１Ａ）を使用することにより、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた（２４）（２５）。プラスミドｐＴＲＡＣＥ５は、酵素的に不活性で、それ故に細胞毒性であるB.pertussisＣｙａＡの変種のための発現ベクターである。それはまた、ＣｙａＡの翻訳後のアシル化に必要とされるB.pertussisＣｙａＣタンパク質も発現する。このプラスミドは、以前に記載されているｐＴＲＡＣＧプラスミドの誘導体である（Gmiraら、2001、Res.Mic.152:889）。それは、ｃｙａＡ ＤＮＡ配列の５’部分内に位置するＥｃｏＲＶ部位へのヘキサヌクレオチドＣＴＧＣＡＧの挿入により得られた。これにより、触媒部位の不可欠な部位内のＡｓｐ１８８とＩｌｅ１８９の間に、ジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎが枠内に挿入された（Guermonprezら、2000、Meth.Enzymol.326:527）。
【０１１２】
プラスミドｐＴＲＡＣＥ５は、ＣｏｌＥ１複製起点とアンピシリン耐性マーカーを有する。このプラスミドでは、ｃｙａＣおよび改変されたｃｙａＡ遺伝子が、λファージＰｒプロモーターの制御下で同じ転写単位に入れられている。ｐＴＲＣＡＧプラスミドはまた、３２℃より低い温度でλＰｒプロモーターにおける遺伝子転写を強力に抑制する熱感受性λリプレッサーｃＩ８５７をコードしている。
【０１１３】
Ｅ．ｃｏｌｉ株のＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン、ラホーヤ、ＣＡ州）を、標準的なプロトコルにしたがって実施した全てのＤＮＡ操作において使用した（Maniatisら）。
【０１１４】
ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７は、ＣｙａＡのコドン２２４と２３５の間に挿入された９アミノ酸長のポリペプチド配列（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）を含む。ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７の発現プラスミドは、以下のように作成した。２つの合成オリゴヌクレオチド（ＭＷＧ、Courtaboeuf、フランス）
【表４】
をアニーリングし、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＴＲＡＣＥ５にライゲートした。ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌは、ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質の全配列、すなわち、酵素的に不活性なＣｙａＡの同じ２２４位に挿入された９８アミノ酸を含む。Ｅ７タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、特異的プライマー
【表５】
を使用して、ＨＰＶ１６ ＤＮＡ（先のSeedorf Kら）から増幅した。得られたＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩで切り出したｐＴＲＡＣＥ５にライゲートした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド並びにＨＰＶ１６−Ｅ７の全配列に存在するＳｓｐＩ部位により、挿入変異体の迅速な同定が可能となった。ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２は、ＣｙａＡのコドン３１９と３２０の間に挿入されたＨＰＶ１６−Ｅ７の最初の２９アミノ酸残基、並びに、ＣｙａＡのコドン２２４と２３５の間に挿入されたＨＰＶ１６−Ｅ７の残基４３〜９８を含む。ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２のための発現プラスミドは、２ステップで作成した。ＨＰＶ１６−Ｅ７（のアミノ酸残基１〜２９）をコードする第一のＤＮＡ断片を、標的ＤＮＡとして合成ＨＰＶ１６−Ｅ７遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉにおける産生に最適化され、GTP Technologyにより設計、Labege、フランス）およびプライマー
【表６】
を使用してＰＣＲ増幅した。ＣｙａＡのコドン３２０〜３７２をコードする第二のＤＮＡ断片を、標的ＤＮＡとしてｐＴＲＡＣＥ５、および、プライマー
【表７】
を使用してＰＣＲ増幅した。これらの２個のＤＮＡ断片（一部重複する）を精製し、３回目のＰＣＲでプライマーＢＴＰ５およびＢＴＰ８と合わせ、２９４ｂｐ長のＤＮＡ断片を増幅した。この断片を、ＡｇｅＩおよびＢｓｔＢＩにより消化し、ｐＴＲＡＣＥ５の対応する部位の間に挿入して、プラスミドｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ１〜２９を得た。その後、ＨＰＶ１６−Ｅ７のアミノ酸残基４３〜９８をコードするＤＮＡ断片を、標的ＤＮＡとしての合成ＨＰＶ１６−Ｅ７遺伝子、および、プライマー
【表８】
を使用してＰＣＲ増幅した。精製ＰＣＲ断片をＮｈｅＩおよびＫｐｎＩにより消化し、同じ制限酵素により消化したプラスミドｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ７１〜２９にライゲートした。
【０１１５】
全ての組換えアデニル酸シクラーゼが、前記のように（２６）、エシェリヒア・コリ株ＢＬＲ（ノバゲン、ＷＩ州マジソン）において産生された。組換えタンパク質を、前記のように（２６）、ＤＥＡＥ−セファロースおよびフェニル−セファロースクロマトグラフィーを含む２ステップ手順により封入体から均一に近くなるまで精製した（図１Ｂ）。フェニル−セファロースクロマトグラフィーに加えて、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ、ｐＨ７．５中の６０％イソプロパノールを用いてのさらなる洗浄ステップを行ない、大半の混入ＬＰＳを排除した。ＬＰＳ含量は、キットＱＣＬ−１０００（Biowhittaker、Walkersville、ＭＤ州）を使用して決定した。精製組換えタンパク質を、ＳＤＳ−ゲル分析により分析した。タンパク質濃度は、分子吸光係数１４２，０００Ｍ−１ｃｍ−１を使用して２８０ｎｍにおける吸光度から分光学的に決定した。
【０１１６】
組換えＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質の作成および精製。
リクエストにより入手可能なＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質（GTP technology）のＤＮＡ配列をコードするＥ．ｃｏｌｉ最適化ｃＤＮＡを、ｐＩＶＥＸ２．４ｂベクター（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、Meylan、フランス）のＮｃｏＩとＸｈｏＩ制限部位の間にサブクローニングした。その後、得られたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１λＤＥ３（ノバゲン）に形質転換した。０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Euromedex、Souffelweyersheim、フランス）で誘導するとＨｉｓ−Ｔａｇ−ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質が発現され、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて製造業者の指示にしたがって精製した。ＬＰＳ混入を除去するために、記載の通りに（２７）イソプロパノールによる洗浄を使用した。
【０１１７】
イムノブロット
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ１６Ｅ７抗体（Zymed、ＣＡ州サンフランシスコ）またはＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて調製したポリクローナル抗Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＲ血清でプローブした、ニトロセルロース膜（０．４５μ、バイオラッド、Marnes la Coquette、フランス）にエレクトロトランスファーした。アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせたヤギ抗マウス免疫グロブリン（Chemicon、Temecuka、CA）を用いて免疫複合体が検出され、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）（シグマ、ＭＯ州セントルイス）を用いて明確にした。
【０１１８】
マウス免疫化および腫瘍拒絶実験
動物を、ＰＢＳ（ギブコＢＲＬ）に希釈した５０μｇの対照もしくはＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡを１回静注するか、または、２回（各回１０μｇ）皮内注射することにより免疫化した。皮内注射は、耳真皮に行なった（４７）。インビトロでの解析のために、長期の応答の解析を除いて（このためにこの手順は、注射の３ヶ月後に行なった）、注射の７日後に、麻酔した動物（ＣＯ２）の脾摘除を行なった。腫瘍拒絶実験のために、マウスは、皮下に５×１０４個のＴＣ−１細胞を投与され、腫瘍接種の１日後、５日後、または１０日後にＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡにより処置した。ＴＣ−１腫瘍増殖を、キャリパーを使用してモニタリングし、式Ｖ＝（Ｌ×ｗ２）／２（Ｌ：長さ、ｗ：幅）を使用して立方ミリメートルで表現した（４８）。
【０１１９】
インビトロでの細胞毒性アッセイ
免疫化マウスの脾臓細胞を、インビトロで、同系の照射し無処置の脾臓細胞の存在下で、完全培地（１０％の熱で不活性化されたＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールを補充したグルタマックスを含むＲＰＭＩ１６４０）中で、５日間、１μｇ／ｍｌのＥ７４９〜５７またはＥ７４３〜７７ペプチドで刺激した。これらのエフェクター細胞の細胞毒性活性を、ＴＣ−１細胞の５時間の５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。放射標識を以下のように行なった：７．５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で培養した指数関数的に増殖しているＴＣ−１細胞を、素早くトリプシン処理し（トリプシン−ＥＤＴＡ、ギブコＢＲＬ）、１００μＣｉの５１Ｃｒと共に３７℃で１時間インキュベートした。様々なＥ：Ｔ比を使用し、全てのアッセイを二重に行なった。各ウェルの上清に放出された放射能を測定した。特異的溶解率は、１００×（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）として計算した。最大放出は、１０％トリトンＸ−４０５を標的細胞に加えることにより得、自発的放出は、完全培地のみの中でインキュベートした標的細胞を用いて得られた。最も高いＥ：Ｔ比で少なくとも２０％の特異的溶解が観察された場合にマウスをレスポンダーと判断した。結果は、１群あたりのレスポンダーマウスの中間値±四分位範囲として表現した。
【０１２０】
分泌細胞のための、単一のＩＦＮ−γ産生細胞の酵素結合イムノスポットアッセイ
マルチスクリーンろ過プレート（９６ウェル；ミリポア、Molshein、フランス）を、１ｍｌあたり４μｇのラット抗マウスγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）抗体（クローンＲ４−６Ａ２；ファーミンゲン、ＣＡ州サンディエゴ）を用いて室温で一晩かけて被覆した。その後、プレートを洗浄し、完全培地で遮断した。免疫化マウスの脾臓細胞の連続２倍希釈液を、５×１０５個のγ照射された（２，５００ｒａｄ）同系支持細胞と共に加えた。細胞を、１μｇ／ｍｌのＥ７４９〜５７ペプチドと共にまたはその非存在下で３６時間インキュベートした。十分に洗浄した後、プレートを、１ｍｌあたり５μｇのビオチニル化ラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体（クローンＸＭＧ１．２；ファーミンゲン）と共にインキュベートし、その後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ファーミンゲン）と共にインキュベートすることにより明確にした。最後に、基質としてＢＣＩＰ／ＮＢＴを使用してスポットを明確にした。ＩＦＮ−γ産生細胞の数を、各ウェルにおけるスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を計測することにより決定し（Bioreader、Karben、ドイツ）、結果を、脾臓１個あたりのＳＦＣの全数として表現した（１７）。
【０１２１】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
空のベクターＣｙａＡＥ５により皮内免疫化したマウスから、３０または９０日後に採血し、個々のマウス血清を、ＥＬＩＳＡにより抗体応答について試験した。マイクロプレート（Nunc、Roskilde、デンマーク）を、ＰＢＳ中の空のベクターＣｙａＡＥ５（３μｇ／ｍｌ）を用いて一晩かけて被覆した。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）中で洗浄した後、希釈した血清を、ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄した後、プレートを、ヤギ抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（シグマ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、ｏ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素（シグマ）を使用して展開した。硫酸を用いて反応を停止し、プレートを、ＥＬＩＳＡ読取機（Dynatech、Marnes la Coquette、フランス）を用いて４９２ｎｍで解析した。結果は、希釈とＡ４９２をプロットした線形回帰分析により計算した抗体力価として表現した。力価は、１／１００に希釈されたプール対照血清の吸光度の２倍をもたらす最も高い希釈度のｌｏｇ１０であると計算された。
【０１２２】
サイトカイン産生
免疫化マウスの脾臓細胞を、インビトロで、完全培地中で、１０μｇ／ｍｌのＨｉｓＴａｇ−ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質または１μｇ／ｍｌのＥ７４３〜７７ペプチドを用いて７２時間かけて刺激した。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−５産生は、培養上清中で、前記のように（２８）、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定された。全てのアッセイは、対応する組換えネズミサイトカイン（ファーミンゲン）を用いて標準化した。
【０１２３】
ＦＡＣＳ（登録商標）解析
ＴＣ−１細胞は、特異的なＦＩＴＣ−コンジュゲートモノクローナル抗体（クローンＫＨ９５、ファーミンゲン、Le Pont de Claix、フランス）を使用するフローサイトメトリーによるＭＨＣクラスＩ分子Ｈ−２Ｄｂの発現レベルの解析についていずれかに記載されているように（２９）処理した。
【０１２４】
統計的解析
様々な試料の量が少ないことを考慮して、ソフトウェアＳｔａｔＸａｃｔ４（Cytel社、ＭＡ州ケンブリッジ）を使用するノンパラメトリック統計試験（３０）を適用した。生存曲線を、Prismソフトウェア（GraphPadソフトウェア社、ＣＡ）を使用してプロットし、ソフトウェアのビルトインのｌｏｇランク検定を用いて比較した。データは、ｐ＜０．０５で有意差があると判断した。
【０１２５】
結果
ＨＰＶ１６−Ｅ７エピトープを有する組換えアデノウイルスシクラーゼの作成および特徴づけ
ＣｙａＡのＨＰＶ１６−Ｅ７特異的Ｔ細胞応答誘導能を試験するために、本発明者らは、３個の異なる組換え分子を作成した。ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７は、酵素的に不活性な（したがって無毒性な）ＣｙａＡのコドン２２４と２３５の間に挿入された、以前に記載されたＨ−２Ｄｂ拘束性ＣＴＬエピトープ（２２）に対応する、９アミノ酸長のポリペプチド配列（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）を含む。ＣｙａＡ−Ｅ７ＦＵｌｌは、酵素的に不活性なＣｙａＡの同じ２２４位に挿入されたＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質の全配列（９８アミノ酸）を含む。ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２は、酵素的に不活性なＣｙａＡのコドン３１９と３２０の間に挿入されたＨＰＶ１６−Ｅ７の最初の２９アミノ酸残基、並びに、コドン２２４と２３５の間に挿入されたＨＰＶ１６−Ｅ７の残基４３〜９８を含む。インビトロおよびインビボでのアッセイを可能とするために、ＣｙａＡ構造物が産生され、精製されてほぼ均一とした（図１Ｂ）。ＬＰＳ排除手順を精製プロトコル（２６）に導入し、５０μｇあたり１００単位未満の内毒素を含む組換えタンパク質を得た。ＣｙａＡ−Ｅ７ＦｕｌｌおよびＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２におけるＥ７タンパク質の存在は、特異的なモノクローナル抗体（Zymed）を使用してウェスタンブロットにより確認された（図１Ｃ）。これに対し、Ｈ−２Ｄｂ拘束性エピトープのみを含むＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７は、抗ＨＰＶ１６−Ｅ７抗体により認識されなかった。３個の組換えＣｙａＡの全体的な生化学的特性は、改変されておらず、これらの分子は、野生型アデニル酸シクラーゼと類似した溶血特性を示した（１７）。
【０１２６】
ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡでの免疫化は、Ｅ７特異的ＣＴＬ応答を誘導した。
ＣｙａＡが、ＨＰＶ１６−Ｅ７エピトープに対するＣＴＬ応答を誘導できるかを試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５０μｇの様々なＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡを１回静注することにより免疫化した。脾臓細胞を収集し、インビトロで、１μｇ／ｍｌのＥ７４３〜７７ペプチドで刺激した。ＴＣ−１細胞を溶解する能力を、５日後に、５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した。図２Ａに示されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡを１回静注して免疫化することにより、ＴＣ−１細胞に対する強力で特異的なＣＴＬ応答が誘導された。完全なＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質（図２Ａ、ｂ）を含むＣｙａＡまたはその欠失形態であるＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（図２Ａ、ｃ）で免疫化することにより、最小のＨ−２Ｄｂ拘束性エピトープ（図２Ａ、ａ）のみを含むＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７により誘導されるものと比べてより高い最大ＣＴＬ活性が得られたが、本発明者らは、本発明者らのデータから統計学的有意性を実証できなかった。ペプチドＥ７４９〜５７をインビトロでの再刺激に使用した場合にも、類似の結果が得られた（データは示さず）。関連性のないエピトープ（ＯＶＡ２５７〜２６４）を有する組換えＣｙａＡでワクチン接種し、インビトロで、１μｇ／ｍｌのＥ７４３〜７７ペプチドで再刺激したマウスの脾臓細胞には、弱く非特異的なＴＣ−１細胞溶解しか認められなかった（図２Ａ、ａ）。インビボで、ＣｙａＡにより、ＯＶＡ ＣＤ８＋細胞エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）をＭＨＣクラスＩ分子に送達することは、ＴＡＰ１機能に依存していることが以前に示されている（１５）。本発明者らは、これがＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２を使用しても当てはまるかどうかを試験した。図２Ａ、ｄに示されているように、静注によりワクチン接種されたＴＡＰ１−／−マウスに由来するインビトロで刺激された脾臓細胞は、ＴＣ−１細胞を溶解できなかった。本発明者らはまた、インビボでのＨＰＶ１６Ｅ７含有組換えＣｙａＡによる、ＣＴＬ応答の刺激における、ＣＤ４＋Ｔ細胞による支持の必要性を試験した。以前の観察と一致して（１５）、本発明者らは、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２を使用したＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスの静注ワクチン接種により、ＴＣ−１細胞に対する高いレベルの特異的ＣＴＬ応答が誘導されることを観察した（図２Ａ、ｅ）。これに対し、本発明者らは、このモデルにおいて、ＣＤ４０−／−マウスにおけるＴＣ−１細胞に対するＣＴＬ応答のレベルが低いことを観察したので（図２Ａ、ｆ）、ＣＤ４０シグナル伝達への幾分の依存性を観察した。
【０１２７】
生体外での組換えＣｙａＡで免疫化したマウスにおけるＨＰＶ１６−Ｅ７特異的脾臓細胞の発生頻度を推定するために、インビトロでのＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７ペプチドでの刺激に応答してＩＦＮ−γを産生する細胞の数を、酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）により定量した。図２Ｂは、ＣｙａＥ５−ＣｙｓＯＶＡで免疫化したマウスから得られたＩＦＮ−γを特異的に産生しているＩＦＮ−γ産生脾臓細胞の数は、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７で免疫化したものと比べて、僅かな差異しかなかったことを示す。これに対し、得られたＩＦＮ−γ産生脾臓細胞は、完全なＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質またはその欠失形態を含むＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡでワクチン接種したマウスにおいて、はるかにより多かった（ｐ＜０．０５）。観察された応答は、エピトープ特異的であった。なぜなら、ＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７ペプチドにより刺激しない場合、これらのマウスの非常に僅かな脾臓細胞しか、ＩＦＮ−γを産生しなかったからである（図２Ｂ）。これらの結果は、ＣｙａＡが、処理およびＭＨＣクラスＩ経路へと提示するために、インビボにおいて、ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質の免疫優性ＣＤ８＋Ｈ−２Ｄｂ拘束性Ｔ細胞エピトープを、免疫担当性細胞のサイトゾルへと送達でき、これにより強力なＣＴＬ応答を誘起できることを示す。以前の観察によれば（２５、３１）、本発明者らは、完全なＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質またはその欠失形態および反転形態を有するＣｙａＡもまた、強力なＣＴＬ応答を誘導できたので、ＣｙａＡは、大きなポリペプチド断片の挿入に耐えられることを確認した。本発明者らのデータはまた、これらの後者の分子は、マウスにおいて、有意により高い発生頻度のＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７特異的応答を誘導したことを実証した。
【０１２８】
ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡでの免疫化は、ＨＰＶ１６−Ｅ７特異的Ｔｈ１応答を誘導した。
Ｔｈ１応答は、細胞内病原体および腫瘍発達に対する防御において重要な役割を果たす（３２、３３）。それ故、本発明者らは、ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡにより誘導されるＴ細胞応答のタイプを特徴づけた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５０μｇの３種の異なるＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡを１回静注することにより免疫化し、インビトロで脾臓細胞を１０μｇ／ｍｌの精製Ｈｉｓ−ＴａｇＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質で刺激した後に、サイトカインの合成を決定した。図３に示されているように、完全なＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質またはその欠失形態を有するＣｙａＡでの免疫化により、高いレベルのＩＦＮ−γの産生および検出可能なレベルのＩＬ−５が存在しないことにより特徴づけられる、Ｔｈ１に似たプロファイルが得られた。この応答は特異的であった。なぜなら、ＣｙａＡ−Ｅ７ＦＵｌｌまたはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で免疫化した後に得られたＩＦＮ−γレベルは、ＣｙａＡＥ５−ＣｙｓＯＶＡでニセ免疫化したマウスで得られたものよりも有意に高かったからである（ｐ＜０．０５）。しかし、これは、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７で免疫化したマウスの脾臓細胞には当てはまらなかった。１μｇ／ｍｌのＥ７４３〜７７ペプチドを用いて再刺激した場合に、類似の結果が得られた（図３Ａ、挿入図）。
【０１２９】
合わせて考えると、これらの結果により、本発明者らの条件では、クラスＩＩ Ｈ−２ｂ拘束性Ｔ細胞エピトープを含む完全ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質を有するＣｙａＡで得られたレベルは、クラス１Ｈ−２Ｄｂ拘束性エピトープしか含まないＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７で得られたレベルよりもはるかに高いので、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γの分泌において重要な役割を果たしていることが示された。
【０１３０】
ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡでの免疫化は、確立されたＨＰＶ１６を発現している腫瘍の減退を誘導した。
強い免疫応答が得られたことを考慮して、その後、本発明者らは、インビボにおいて、ＨＰＶ１６−Ｅ６およびＥ７タンパク質Ｈ−２ｂ腫瘍原性細胞系（ＴＣ−１細胞）（これはＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に注射される）からなる前臨床モデルにおいて、ＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡの治療活性を評価した。このモデルにおいては、腫瘍拒絶は、排他的に、Ｅ７４９〜５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介されることが以前に示された（２１、２２、３４、３５）。したがって、５×１０４個のＴＣ−１細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹に皮下注射し、５０μｇのＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７、−Ｅ７ｆｕｌｌ、または−Ｅ７Δ３０〜４２を、１、５、または１０日後にマウスに静注した。図４は、腫瘍移植の１０日後に治療処置したマウスにおける腫瘍増殖を示す。特に、これらの条件において、１００％の動物が、ワクチン接種を行なう時点までに、触診可能な腫瘍を発達させた。不必要な苦しみを避けるために、腫瘍サイズが１０００ｍｍ３に到達した場合には動物を屠殺した。全ての非処置動物並びにニセＣｙａＡＥ−ｃｙｓＯＶＡで処置したマウスは、最大４９日間以内に、そのサイズ（＞１０００ｍｍ３）の腫瘍を発達させた。極めて対照的には、ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡで処置した動物の大半が、実験期間中を通じて腫瘍がない状態を維持した（図４、Ｃ、Ｄ、Ｅ）。図５は、ＴＣ−１細胞を移植し、３つの異なる治療プロトコル（組換えＣｙａＡを、ＴＣ−１移植の１、５、または１０日後に注射した）を行なった、動物の生存プロットを示す。非処置またはニセ処置動物の生存時間の中間値は、３１〜４０日間であった。これに対し、ＨＰＶ１６−Ｅ７抗原を有するＣｙａＡでワクチン接種したマウスの生存は、対照動物よりも有意に優れていた（ｐ＜０．０５）。様々な構造物の防御活性の差異は確立できたが、統計学的有意性は確立できなかった。なぜなら、様々な試料のサイズが小さいからであった。ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７および−Ｅ７Ｆｕｌｌにより付与される腫瘍減退率が、認められる程には区別できなくても、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２は、腫瘍減退および増殖阻害の点において明らかに優れていた。なぜなら、３つ全ての治療スキームにおいて、防御率は、常に、９０％よりも高かったからである。
【０１３１】
ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７およびＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌでワクチン接種した何匹かの動物は、実験の経過中、より後で腫瘍を発達させるようであった（図４（＊）、データは示していない）。この現象は腫瘍エスケープ機序を反映する可能性があることを心に置き、本発明者らは、これらの動物から増殖中の腫瘍を外移植し、Ｈ−２Ｄｂ発現について、ＦＡＣＳ解析により、ＴＣ−１Ａ１およびＴＣ−１Ａ２という名称のこれらの細胞系を解析した。図６に示されているように、その天然対応物に比べて、より後で増殖してくる腫瘍から外移植したＴＣ−１Ａ１およびＡ２細胞は、Ｈ−２Ｄｂの発現を欠失しており、したがって、Ｅ７４９〜５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞により検出されることができなくなっている可能性が高い。ＴＣ−１細胞は、インビボにおいて、選択のための抗生物質の負荷がない環境で増殖させたので、本発明者らはまた、ＴＣ−１Ａ１およびＡ２細胞においてＨＰＶ１６−Ｅ７の発現についてウェスタンブロットにより確認した。本発明者らは、ＴＣ−１およびＴＣ−１Ａ１およびＡ２細胞の間にこのタンパク質の発現の差異を全く見出すことができなかった（データは示さず）。
【０１３２】
合わせて考えると、これらの結果により、前臨床モデルにおいてＨＰＶ１６を発現している腫瘍の減退を誘導するために適した治療ワクチンとしての、アデニル酸シクラーゼベクターの有効性が実証された。
【０１３３】
本発明者らは、臨床的に関心の高い別の注射経路を試験した。したがって、１０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２を、ＴＣ−１移植の１０日後から始めて７日間間隔で２回皮内注射した。興味深いことに、全ての非処置およびニセ処置動物が腫瘍を発達させたが、本発明者らは、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で処置した動物の全ての動物において腫瘍減退を観察した（図４Ｂ、ａ、ｂ）。この治療的免疫化により、９０日目においてＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２処置マウスの１００％の生存率が得られ、一方、非処置およびニセ処置動物の生存率の中間値は、それぞれ３０日および３２日であった（図４、ｃ）。
【０１３４】
ＣｙａＡ免疫化により誘導されるＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の長期持続性
ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡにより誘導される免疫応答の持続性を評価するために、３ヵ月後も治療実験にも関わらず生存しているマウスを屠殺し、その脾臓細胞を、インビトロで、１μｇ／ｍｌのＥ７４３〜７７ペプチドで５日間かけて刺激した。その後、ＴＣ−１細胞を溶解する能力を、５１Ｃｒ放出アッセイにより決定した。図７に示されているように、ＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドに対する特異的ＣＴＬ応答が、依然として、３ヵ月前に免疫化した動物の脾臓細胞から実証された。３０：１のエフェクター：標的の比での特異的溶解の最大パーセンテージに基づいて、免疫応答は、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で処置した動物においてより強力であるようであるが、これらのデータから統計学的有意性は実証できなかった。このような長く続く免疫原性の生理的関連性を評価するために、残りの動物に、１００日目に５×１０４個のＴＣ−１細胞を用いて皮下に再攻撃した。このような条件下で、全ての未処置の年齢一致対照動物が腫瘍を発達させ、３７．５日間という生存時間の中間値を示した（図８）。これに対し、ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡで３ヶ月前に免疫化したマウスは、腫瘍発達から非常に有意に防御された。先に観察されているように、ＣｙａＡＥ−ＨＰＶ１６−Ｅ７Δ３０〜４２でワクチン接種した動物が、高いレベルの防御を示した。しかし、今回、最初のセットの治療実験で得られた結果の変動では、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７で処置した動物と、ＣｙａＡ−Ｅ７ＦＵｌｌで処置した動物の間には顕著な防御の差異があり、後者の方が好ましいが、試料のサイズが少ないので、統計的有意性を明確に実証することはできなかった。これらの観察により、このモデルでは、完全なＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質を有するＣｙａＡにより提供されるＴ細胞の支持は、ＴＣ−１細胞に対する効果的で長期に持続する応答には重要であることが示唆された。
【０１３５】
合わせて考えると、本発明者らの結果により、ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質のヘルパーエピトープ（ＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）を有する５０μｇの組換えＣｙａＡの１回の静注は、少なくとも６ヶ月の期間におよび、２回のＴＣ−１腫瘍細胞攻撃に対する防御を付与できる、長期に持続するＥ７４９〜５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するのに十分であった。
【０１３６】
ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の治療効力は、ＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６と共に投与されたペプチドの治療効力に匹敵した。
抗原送達システムとしてのＣｙａＡの効力をより良く評価するために、本発明者らは、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の治療効力を、ＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６を補充したＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドの治療効力と比較した（３７）。それ故、マウスに、５×１０４個のＴＣ−１細胞を皮下注射し、１０および１７日後、皮内経路により、１０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で、または、１μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６と共に投与される１０μｇのＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドで、治療処置した。生存率は、これらの２つの群において類似していたが（図９）、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で得られた結果は、ＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６と混合されたＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドで得られた結果よりも僅かに良好であったが、統計学的に差異はなかった。特に、この結果は、モル基準で、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２に比べて５０倍多いＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドを使用して得られた。単独で使用した場合、ペプチドＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７は、ＴＣ−１腫瘍増殖に対して全く効果がなかった。
【０１３７】
ＣｙａＡベクターに対する事前免疫は、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の治療効力に僅かにしか影響を及ぼさなかった。
臨床の場面では、効果的な細胞性免疫応答を得るために、病変を有する患者に、複数回のブースター投与をおそらく行なわなければならない。それ故、ＣｙａＡベクターに対する予備免疫が、腫瘍拒絶を引き起こす能力を損なわないことを実証することが不可欠であった。そうするためには、本発明者らは、５×１０４個のＴＣ−１細胞を皮下注射する９０または３０日前に、７日間間隔で２回１０μｇの空ベクターＣｙａＡＥ５でマウスを皮内免疫化した。７日間間隔の２回の１０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の注射による治療処置を１０日目に設定した。抗体応答の解析により、空ベクターで免疫化されたマウスは、ＴＣ−１注射時にＣｙａＡに対して免疫があることが示された（図１０Ａ）。その後、本発明者らは、年齢の一致した未処置動物およびＣｙａＡ免疫動物において腫瘍拒絶を誘導する、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２処置の能力を比較した。ＣｙａＡに対するその免疫状態はどうであれ、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で処置したマウスの大半が、実験を通じて腫瘍がないままであった（図１０Ｂ）。３０日目の免疫マウス群の中で１匹のみ、９０日目の免疫マウス群において２匹のみが、腫瘍を発達させた（図１０Ｂｂ、ｄ、ｆ）。これに対し、ニセ感染動物の１００％が腫瘍を発達させ、屠殺された（図１０Ｂ、ａ、ｃ、ｅ）。本発明者らは、抗ＣｙａＡ抗体力価レベルと、ＴＣ−１腫瘍の発達の間の相関は全く観察しなかった（データは示さず）。さらに、ＣｙａＡ−Ｅ８Δ３０〜４２処置マウスの生存曲線（図１０Ｂ、ｂ、ｄ、ｆ）は、統計学的に差異はなかった（ｐ＝０．３２４）。
【０１３８】
それ故、これらのデータにより、ＣｙａＡに対する既存免疫は、このベクターがその後に外来の所与の抗原に対する効果的な応答を誘導する能力に対して、殆ど作用を及ぼさないことが示された。
【０１３９】
考察
以前の研究により、Bordetella pertussisのアデニル酸シクラーゼは、インビボにおいて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを、樹状細胞のＭＨＣ−クラスＩＩおよびＩ提示経路に送達するための強力なツールであることが実証された。実験ネズミモデルにおいて、このシステムは、抗ウイルスおよび抗腫瘍防御をもたらす効果的なＴｈ１およびＣＴＬ応答を引き起こすために使用されている（３６）。ＨＰＶ１６関連の子宮頚部悪性疾患の処置のためのヒトにおけるＣｙａＡの可能性ある適用の評価として、本発明者らは、このベクターが、インビボにおいて、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質のエピトープを効果的に送達することを実証し続けた。
【０１４０】
本発明者らは、ＨＰＶ１６の完全なＥ７タンパク質またはこのポリペプチドの亜断片（特に、残基４９〜５７に対応するＨ−２Ｄｂ拘束性最小ＣＴＬエピトープを含む）を含む様々なＨＰＶ１６組換えＣｙａＡを作成した。本発明者らは、これらの異なる組換えタンパク質が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注射された時に、特異的かつ強力なＣＴＬ応答を抗原刺激できることを示した。本発明者らのデータにより、本発明者らはＴＡＰ１−／−マウスにおいてＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の注射によりＣＴＬを刺激することができなかったので、ＣｙａＡによるＣＴＬエピトープの送達には、完全に機能的なクラスＩ提示経路が必要であることが確認された（１５）。ＣｙａＡにより媒介されるＣＴＬ刺激は、以前の結果と一致して、ＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスで得られた効果的なＣＴＬ応答により示されるように、ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在とは独立していた（１５）。ワクチンベクターとしてのこのＣｙａＡの特徴は、ＣＤ４＋Ｔ細胞数の変化を提示する免疫抑制患者または免疫欠陥患者のワクチン接種を考慮した場合に非常に重要である。しかし、ＣＤ４０−／−マウスではＣＴＬ応答は低く、このことは、ＣＴＬ刺激が、一部、ＣＤ４０シグナル伝達に依存していることを示す。これらの観察により、ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡは、プロフェッショナルＡＰＣの直接刺激により、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬを直接的に誘起することが示唆された。それにも関わらず、ＣＴＬ応答の最適な刺激を得るためには、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用が必要とされる。
【０１４１】
本発明者らは、ＨＰＶ１６−Ｅ７の最小Ｈ−２Ｄｂ拘束性ＣＴＬエピトープの免疫原性を、おそらくとりわけ記載されたヘルパーエピトープＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦを含む、完全もしくはΔ３０〜４２Ｅ７タンパク質の免疫原性と比較した。ＣＴＬ刺激並びにＣｙａＡ−Ｅ７ＦＵｌｌおよびＣｙａＡＥ−Ｅ７Δ３０〜４２により誘導されるＨＰＶ１６−Ｅ７特異的脾臓細胞の発生頻度は、ＣＴＬエピトープＥ４９〜５７のみを有するＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７により誘導されるものよりも優れていた。これらの観察により、ＣｙａＡによりＣＴＬおよびＴｈエピトープを同時に送達することにより、より強力なＣＴＬ応答がもたらされることが示された。これは、他のモデルにおいて、前臨床（３７）および臨床レベル（３８）で以前に公表されたデータと一致した。組換えＣｙａＡによるＨＰＶ１６−Ｅ７Ｔｈエピトープの送達は、さらに、インビトロで組換えＨｉｓＴａｇ−ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質またはＥ７４３〜７７ペプチドで再刺激したＨＰＶ１６−Ｅ７特異的脾臓細胞により産生されるサイトカインの解析により証明された。実際に、本発明者らは、Ｔｈエピトープを含む組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡでワクチン接種したマウスのみにおいて、ＩＦＮ−γの特異的合成を観察した。本発明者らが、ＣｙａＡ−Ｅ７ＦｕｌｌおよびＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の１回静注により免疫化した後に観察した、ＩＦＮ−γレベルが高いことおよびＩＬ−５が全く分泌されないことにより特徴づけられる典型的なＴｈ１プロファイルは、腫瘍免疫療法におけるこのベクターの関心の高さを強調する。
【０１４２】
これは、皮下で確立された腫瘍原性ＴＣ−１細胞に基づいた腫瘍拒絶モデルで試験した（２１）。ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡの免疫原性を実証する本発明者らのデータによれば、本発明者らは、これらの組換えタンパク質が、確立されたＴＣ−１腫瘍の減退を誘導できることを観察した。ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２は、９０日間の期間におよび、生存の点で、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７およびＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６−Ｅ７Ｆｕｌｌよりも優れていた。完全およびΔ３０〜４２Ｅ７タンパク質を有するＣｙａＡは、ＣＴＬ刺激能力、ＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７特異的脾臓細胞の発生頻度、およびＩＦＮγ産生の点で、匹敵する結果を与えたので、本発明者らは、生存の点で、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌは、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７よりも優れていると期待した。より多くの数の試験動物が、この一見した矛盾を除外してくれるのに役立つ可能性が高い。しかし、ＣｙａＡの生化学に関する２つの側面をここで考察すべきである。第一に、ＣｙａＡの２２４〜２３５の領域の負に荷電したアミノ酸の存在は、真核細胞のサイトゾルへのＣｙａＡの触媒ドメインの転位を阻害することが示された（３９）。これに関して、酸性Ｅ７タンパク質（ｐＫｉ＝４．１７）が、ＤＣのサイトゾルへのＣｙａＡのＮ末端ドメインの効率的な転位を妨害する可能性があった。ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２は、ＤＣへの送達に好ましいように、３０〜４２残基に位置する負に荷電したアミノ酸のストレッチ（ＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡ）を除去するように特別に設計され、さらに、２個の正に荷電したアミノ酸（ＫＲ）を、ＨＰＶ１６−Ｅ７の挿入されたＮ末端ドメインの各側に導入した。第二に、Gmiraら（２５）は、ＣｙａＡ内に挿入された異種タンパク質の折りたたみ解除は、組換えタンパク質が標的細胞へと内部移行するために必須であることを実証した。Ｅ７ポリペプチドの２個の異なる断片を、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の２個の異なる許容部位へ挿入することにより、Ｅ７の再折りたたみが防がれ、したがって、標的細胞へのその転位は促進されるはずである。
【０１４３】
腫瘍拒絶実験の時間経過中に、何匹かのマウスは、確立されたＴＣ−１腫瘍を以前に拒絶した後、より後になってＨＰＶ１６陽性腫瘍を増殖させ始めた。ＦＡＣＳ（登録商標）解析により、これらの腫瘍の細胞は、Ｈ−２Ｄｂ分子を発現していなかったことが判明した。この観察により、より著しく腫瘍細胞を根絶し、エスケープ機序による腫瘍の再発を防ぐために、組換えＣｙａＡワクチン接種の同様なブースター投与の可能性が考えられた。当該技術分野における他のチームのデータを心に置くと（３７、４０、４１）、それは、注射された組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ ＣｙａＡの全量を１００μｇ、すなわち０．５６ｎｍｏｌに上げた、マウスにおけるＣｙａＡワクチン接種のブースター投与に関連していた。この後者の観察を試験するための実験、並びに、ＣｙａＡの様々な投与法を試験するための実験を実施した。
【０１４４】
ＴＣ−１細胞で再攻撃した時、ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡで免疫化した生存マウスは、選択的に防御された。これは、これらの動物の脾臓細胞中のＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在に関連していた。この観察は、図４で観察される遅い再発は、腫瘍エスケープ機序に起因し、Ｅ７タンパク質に対する免疫が徐々に衰えていくことに起因するものではないということが強まった。Ｔｈエピトープを含む組換えＣｙａＡで免疫化したマウスのより良好な生存率により、同じ抗原に対するＴ細胞の支持が得られることにより、ＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７ＣＤ８＋Ｔ細胞が効果的に想起されることが示された。これに関して、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４０Ｌを通じて、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞に独特な分子的サインを刷り込む可能性があり、より向上した細胞機能を行なうための能力を付与する可能性があることが提唱された（４２）。
【０１４５】
ＨＰＶ関連新生物形成の処置のための新規免疫療法の試験のための確証されたモデルにおいて（２１）、本発明者らは、ＣｙａＡが、確立腫瘍の減退を誘導し、並びに、長い期間におよぶ腫瘍原性攻撃に対する防御を与えるための、効率的なベクターであることを実証した。現在開発されている他のアプローチとは異なり（１１）、ＣｙａＡを基礎とした免疫療法は、完全なタンパク質を挿入できるので、ＨＬＡ拘束性エピトープを選択する必要がなく、ウイルスベクターおよび／または発癌の可能性のあるＨＰＶ ＤＮＡ配列の使用が回避された。さらに、本発明者らは、ＣｙａＡの２個の異なる許容部位に挿入されたＨＰＶ−Ｅ７の２個の亜断片を含むＣｙａＡを用いて最善の結果を得た。
【０１４６】
この後者の構造物が、文献に記載の全てのＨＰＶ１６−Ｅ７ ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩエピトープを含むという事実により（８、４６）、ワクチン適用にＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２が選択されることが強まった。
【０１４７】
ここに提示したデータに基づいて、本発明者らは、ＨＰＶ感染に関連した子宮頚部および肛門の異常形成を標的化した臨床試験において、ＨＰＶ１６−Ｅ７を含むＣｙａＡの効力を試験する計画を立てた。
【０１４８】
実施例２
目的は、ヒトにおけるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８関連の悪性疾患を処置するための、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の両方に標的化した二価治療ワクチンを製造することであった。それ故、ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２およびＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２と呼ばれるワクチン候補を、設計し、作成し、産生し、精製した。ＨＨＤマウスは、Ｈ−２Ｄｂのα３膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（Ｄ）に連結したＨＬＡ＊０２０１のα１（Ｈ）およびα２（Ｈ）ドメインを含むＨＨＤ導入遺伝子を発現しているＨ−２Ｄ−／−β２ｍ−／−ダブルノックアウトマウスであった（α１ドメインは、ヒトβ２−ミクログロブリンに連結している）。したがって、ＨＨＤマウスにより発現されるＭＨＣクラスＩ分子のみが、改変されたＨＬＡ＊０２０１分子であった（Pascolo et Lemonnier）。
【０１４９】
この実験の目標は、
１ 組換えＣｙａＡが、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質のＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープを送達できること、
２ １個のＨＰＶ組換えｃｙａＡが他を上回る免疫優性の現象はないこと
を実証することであった。
【０１５０】
そうするために、ＨＨＤマウスに、５０μｇのＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２（３匹のマウス）、ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２（３匹のマウス）、またはＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２＋ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２（５匹のマウス）を同じ（眼窩後の）注射（２００μｌ中５０μｇ）で静脈内にワクチン接種した。７日後、プールした脾臓細胞を、インビトロで、文献に記載またはＳＹＦＰＥＩＴＨＩソフトウェアから推定される、ＨＰＶ１６Ｅ７またはＨＰＶ１８Ｅ７のＨＬＡ−Ａ２ペプチドで再刺激した。
【０１５１】
ＣＴＬ活性は、５１Ｃｒ放出を使用して５日後にアッセイした。標的細胞は、異なる関連ペプチドをのせたまたはのせていない、ＨＨＤ−ＥＬ４細胞であった。
【０１５２】
結果により、ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２またはＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２でのワクチン接種は、インビトロでの自己ペプチドによる再刺激後に、ＨＰＶ１６Ｅ７またはＨＰＶ１８Ｅ７ペプチドをのせたＥＬ４−ＨＨＤ細胞の特異的溶解を誘導したことが示された。
【０１５３】
この結果によりまた、ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２をＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２と共に注射することにより、関連ペプチドに対する類似の応答が観察されたので、いずれのＨＰＶ組換えＣｙａＡの免疫原性も損なわなかった。
【０１５４】
この結果により、ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２およびＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２は、インビボにおいて、それぞれのＥ７タンパク質のヒトＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープに対する細胞毒性応答を誘導できることが実証された。
【０１５５】
マウス
特定の病原体を含まないＨＨＤマウスを、パスツール研究所で育成した。１１匹の６〜１０週令の雄を、この実験に使用した。
【０１５６】
試薬および生物学的材料
試薬および緩衝液
ＲＰＭＩ１６４０培地−グルタマックス（インビトロジェン・ギブコ、参照番号：６１８７０１０）
エタノール７０゜（Prolabo、参照番号：ＭＣ３１１６３１）
ペニシリン−ストレプトマイシン（インビトロジェン・ギブコ、参照番号：１５１４０１２２）
ウシ血清アルブミン（ＦＢＳ）（PERBIO、参照番号：ＣＨ３０１６０．０３）
βメルカプトエタノール（バイオラッド、参照番号：１６１−０７１０）
熱分解水
ブルートリパン（シグマ、Ｔ−８１５４）
５１Ｃｒ
Triluxシンチラント（Wallac）
【０１５７】
ペプチド
５個の合成ペプチド（Neosystem、ストラスブール、フランス）を、５１Ｃｒ放出アッセイの前の脾臓細胞のインビトロでの刺激に使用した：
ＨＰＶ１６−Ｅ７ ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープ（１）に対応する、Ｅ７１１〜２０（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ、一文字でアミノ酸をコード、＃２５３）、
ＨＰＶ１６−Ｅ７ ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープ（１）に対応する、Ｅ７８２〜９０（ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ、＃２５８）、
ＨＰＶ１６−Ｅ７ ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープ（１）に対応する、Ｅ７８６〜９３（ＴＬＧＩＶＣＰＩ、＃２５５）
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩソフトウェアにより予測されるＨＰＶ１８−Ｅ７ ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープに対応する、Ｅ７７〜１５（ＴＬＱＤＩＶＬＨＬ、＃２５１）、
ＨＰＶ１８−Ｅ７ ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープ（２）に対応する、Ｅ７８６〜９４（ＦＱＱＬＦＬＮＴＬ、＃２５７）。
【０１５８】
ペプチドは、無菌で無発熱原性の水（＃２５３、＃２５５、＃２５１）または無発熱原性の水、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３；アセトニトリル（５０／５０）（＃２５７および＃２５８）で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【０１５９】
組換えアデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）
２個のＣｙａＡをこの実験において試験した：
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２。
【０１６０】
これらのＣｙａＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲにおいて、酵素的に不活性なＣｙａＡ（ＣｙａＡＥ５）をコードするプラスミドｐＴＲＡＣＥ５の誘導体を使用することにより発現させた。プラスミドの作成、全ての組換えタンパク質の産生および精製は、ＨＰＶ１６−Ｅ７エピトープを有する組換えB.pertussisアデニル酸シクラーゼの作成および精製に関する実施例１において先に記載したように製造したが、エピトープは、本実験で使用したものであった。
【０１６１】
８Ｍ尿素中にそれぞれ１．２２ｍｇ／ｍｌおよび１．３３ｍｇ／ｍｌのＣｙａＡを含むストック溶液（−２０℃で保存）を解凍し、マウスに静注内投与する前に、ＰＢＳ（ギブコＢＲＬ）で２５０μｇ／ｍｌに希釈した。したがって、尿素の最終濃度は、それぞれ、１．６Ｍから１．５Ｍの間であった。
【０１６２】
細胞系
ＥＬ４−ＨＨＤ細胞を、５１ＣｒＣＴＬアッセイにおいて標的として使用した。これらの細胞を、完全培地中に維持した：１０％熱不活性化ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および５×１０−５Ｍのβ２−メルカプトエタノール（ギブコＢＲＬ、Cergy-Pontoise、フランス）を補充したグルタマックスを含むＲＰＭＩ１６４０。
【０１６３】
方法
マウス免疫化
覚醒動物に、０．３ｍｌのインスリンシリンジ（テルモ）を用いて、（２００μｌ中５０μｇの）ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２および／またはＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２の１回の静脈内（眼窩後の）注射により免疫化した。
【０１６４】
実験計画
表１は、各群のマウスに投与するワクチン候補および処置を記載した。
【０１６５】
【表９】
【０１６６】
ＣＴＬアッセイ
免疫化により誘導される細胞性免疫応答をインビトロで評価するために、麻酔した動物（ＣＯ２）を、免疫化の７日後に脾摘除した。ＣＴＬアッセイの前に、各群の脾臓細胞をプールした。
【０１６７】
−ＣＴＬの刺激（１個の脾臓あたり２個のフラスコＴ２５を準備）
−脾臓をサンプリングし、ＲＰＭＩ１６４０−グルタマックス１％Ａｂ中でそれらを破粉した。
−デカント。
−１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離。
−細胞を、２ｍｌのＲＭＰＩ１６４０−グルタマックス１％Ａｂ−１０％ＦＣＳ−５．１０−５Ｍ β−メルカプトエタノール（完全培地：ＣＭ）に再懸濁。
−各々のＴ２５フラスコに、
１０ｍｌのＣＭ
５×１０７個のエフェクター細胞
１０μｇ／ｍｌの最終濃度の関連ペプチド
を入れた。
フラスコを動かすことなく５日間インキュベート。
【０１６８】
−細胞毒性アッセイ
１）標的細胞：
−前日、標的細胞を３分の１または２分の１に希釈して、指数関数的な増殖期のそれらを収集。
−１５ｍｌのチューブに移す。
−１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離。
−１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−１％Ａｂ中に再懸濁。
−数を数えた。
−２個のチューブを準備：１個はペプチドを含み、１個はペプチドを含まない。
−１５０μｌ中に以下を再懸濁：
２個の中の１個のチューブにペプチド（５０μモル）
３×１０６個の細胞につき１００μＣｉの５１Ｃｒ（５０μｌ）。
１５０μｌとするための培地。
−３７℃の水浴中で１時間インキュベートし、１５分毎に穏やかに振とう。
【０１６９】
２）エフェクター細胞
−約５ｍｌの上清をパスツールピペットを用いて廃棄。
−ピペッティングにより細胞を完全に再懸濁。
−１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離。
−１ｍｌのＣＭに再懸濁。数を数えた。
−１０７個の細胞／ｍｌに調整。
−次のエフェクター／標的比：２００／１、１００／１、５０／１、２５／１、１２／１、６／１が得られるように希釈。
−１００μｌ／Ｕ底マイクロタイタープレートのウェルで分配。
−標的細胞の調製を完成する間、３７℃で７．５％ＣＯ２中でインキュベート。
【０１７０】
３）アッセイ：
−標的細胞を、１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−１％Ａｂで洗浄。
−再度１０ｍｌのＣＭで洗浄。
−２ｍｌのＣＭに再懸濁。
−数を数えた。
−１０５個の細胞／ｍｌに調整。
−１００μｌ／ウェルで分配。
−自発的放出のための６個のウェルを準備（ＣＭ中１００μｌに調整）。
−最大放出のための６個のウェルを準備（１００μｌの２０％トリトンＸ−４０５を添加）
−３７℃で７．５％ＣＯ２中で４〜５時間インキュベート。
【０１７１】
４）計測：
−２０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心分離。
−１００μｌのTriluxシンチラントを、フロッピーＰ９６マイクロタイタープレートに入れた。
−５０μｌの上清をサンプリングし、それをフロッピープレートに移した。
−プレートを、プラスチックフィルムテープで封をした。
−wallacカウンターで次の日に計測した。
【０１７２】
ＨＰＶ１６Ｅ７ＣＴＬ特異的応答
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２により誘導されるＣＴＬ応答を図１１に示した。
【０１７３】
ＨＰＶ１８Ｅ７ＣＴＬ特異的応答
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２により誘導されるＣＴＬ応答を図１２に示した。
【０１７４】
結論
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２およびＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２の両方が、このキメラＨＨＤモデルにおいて、それぞれのＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドに対して特異的なＣＴＬを誘導できた。
【０１７５】
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２およびＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２の同時注射により、各々の個々のＣｙａＡがそれぞれの特異的ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドに対するＣＴＬを誘導する能力は妨害されなかった。これにより、１つの構造物が他の構造物よりも上回る免疫優性を示す現象はなかったことが示された。これには、二価ワクチンの製造戦略に関する、重要な観察が含まれていた。
【０１７６】
実施例３
ＨＰＶ１８のＥ７タンパク質並びにＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ７タンパク質を含む組換えアデニル酸シクラーゼの作成および免疫学的評価
肛門生殖管の癌は、女性における全ての癌の１２％近くを占め、子宮頚部癌（ＣｘＣａ）は世界中で二番目に最も頻繁に起こる婦人科の癌となっている。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染がＣｘＣａの原因である可能性があるという重要な観察は、その後、疫学的な研究により確認された。ＣｘＣａに関連する最も広まっているＨＰＶのタイプは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８である（それぞれ５５％および１２％の罹患率）（Clifford、2003）。より多くの人口を網羅するために、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ７を有する二価治療ワクチンを作成することが決定された。２つの可能性ある戦略が試験された：（ｉ）第一の戦略は、一方はＨＰＶ１６のＥ７を有する他方はＨＰＶ１８のＥ７を有する、等モル量の２個の組換えＣｙａＡを混合する；（ｉｉ）第二の戦略は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方のＥ７タンパク質を有する組換えＣｙａＡを作成する。本リポートは、ＨＰＶ１８のＥ７または両方のウイルスのＥ７を有する組換えＣｙａＡの作成を記載した。構造物の免疫原性は、ＣＴＬアッセイにおいて試験した。
【０１７７】
エピトープ同定
ＨＰＶ１８Ｅ７のアミノ酸配列を、Ｈ−２ｂエピトープの探索中に、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（www.syfpeithi.de）にかけた。このソフトウェアは、アルゴリズムを使用して、画定されたＭＨＣ分子に結合する可能性があるエピトープを予測する。ソフトウェアは、２５のスコアで、Ｈ−２Ｄｂ分子により拘束される推定エピトープを選出した。通常、本発明者らは、そのスコアが２２を超えた場合にエピトープであると判断した。それ故、推定ペプチドのＩＤＧＶＮＨＱＨＬが、Neosystemにより合成された。
【０１７８】
組換えＣｙａＡの作成
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８ΔＥ７を産生するためにプラスミドの作成に使用された戦略を示したスキームを、図１３および１４に示した。
【０１７９】
ＣＴＬアッセイ
この実験の目標は、インビボにおいて、完全なＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質またはその断片並びにＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質の両方を有する、組換えＣｙａＡによるＣＴＬの誘導を実証することであった。標的化されたＨ−２Ｄｂエピトープは、コンピューター予測ソフトウェアから得られたＨＰＶ１８Ｅ７４１〜４９（ＩＤＧＶＮＨＱＨＬ）およびＨＰＶ１６Ｅ７４９〜５７であった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５０μｇのＣｙａＡ−ＣｙｓＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７、またはＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８ΔＥ７（各群において２匹）を静注によりワクチン接種した。７日後、プールした脾臓細胞を、インビトロで、ペプチドＨＰＶ１８Ｅ７４１〜４９（１０μｇ／ｍｌ）、ＯＶＡ２５７〜２６４（１μｇ／ｍｌ）またはＨＰＶ１６Ｅ７４３〜７７（１μｇ／ｍｌ）で再刺激した。ＣＴＬ活性は、５１Ｃｒ放出を使用して５日後にアッセイした。標的細胞は、ＨＰＶ１８Ｅ７４１〜４９ペプチド（８ｎｍｏｌ）をのせたまたはのせていないＥＬ４細胞、あるいは、ＴＣ−１細胞であった。図中の説明文は：ワクチン接種／再刺激を示す。例：ＯＶＡ／ＯＶＡは、ＣｙａＡＥ５−ＣｙｓＯＶＡでワクチン接種し、ＯＶＡペプチドで再刺激したマウスを意味する。
【０１８０】
これらの結果（図１６）により、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Ｆｕｌｌとは対照的に、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２は、インビボにおいて、処理およびＭＨＣクラスＩ経路に提示するために、コンピューターで予測したＨＰＶ１８−Ｅ７タンパク質のＣＤ８＋Ｈ−２Ｄｂ拘束性Ｔ細胞エピトープを、免疫担当細胞のサイトゾルへと送達でき、これにより、強力なＣＴＬ応答を誘起できることが示された。ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２が、ＨＰＶ１８Ｅ７４１〜４９に対するＣＴＬ応答を刺激できることは奇妙である。なぜなら、この組換えＣｙａＡは、ペプチドＨＰＶ１８Ｅ７４１〜４９の最初の２個のアミノ酸を欠失しているからである。しかし、ＨＰＶ１８Ｅ７断片４３〜１０５の挿入部位においては、１個のアラニンおよび１個のセリンがあり、これにより、推定ペプチドは、ここで、ＩＤＧＶＮＨＱＨＬではなく、ＡＳＧＶＮＨＱＨＬであった。syfpeithiにかけると、このペプチドは、２９のスコアで出て来た（天然のものは２５）。それ故、本発明者らのクローニングにより、このペプチドの最初のアミノ酸を置換することにより、本発明者らは、潜在性から免疫原性へとすることができるようであった。これは、ＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質のエピトープが、Ｈ−２Ｄｂの関連で記載された始めてのケースであった。
【０１８１】
非特異的バックグラウンドレベルが高いにも関わらず、これらの結果によりまた、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７ＦｕｌｌおよびＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７Δは、インビボにおいて、処理およびＭＨＣクラスＩ経路に提示するために、ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質のＨ−２Ｄｂ拘束性Ｔ細胞エピトープを、免疫担当細胞のサイトゾルへと送達でき、これにより、強力なＣＴＬ応答を誘起できることが示された。ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７Δは、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７Ｆｕｌｌと比べて高いその能力を示した。これらのデータによりまた、初めて、大きなポリペプチド断片（２０３までのアミノ酸）を有するＣｙａＡは依然として免疫原性であることが示された。
【０１８２】
さらなる実験を実施し、図１６に記載のことを確認した。各群の残りの２匹のマウスを、最初のものとは別々に処置した。実験設定は類似していた。結論は、ＣＴＬによるＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２ワクチン接種マウスのＥＬ４細胞の高い非特異的溶解レベルは、過剰のＨＰＶ１８Ｅ７４１〜４９ペプチドがフラスコに残っていることに起因することを除いて、図１６のものと同一であった。
【０１８３】
またＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８ΔＥ７でワクチン接種したマウスの脾臓細胞ではＴＣ−１細胞の溶解は認められたが、今回ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７でワクチン接種したマウスには認めれられなかった。この実験において、非特異的バックグラウンドは４０％でピークに達した。それにも関わらず、図１７から導き出せる結論は、図１６から導いた結論を確認した、すなわち：
−ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２は、インビボにおいて、処理およびＭＨＣクラスＩ経路への提示のために、コンピューターで予測したＨＰＶ１８−Ｅ７タンパク質のＣＤ８＋Ｈ−２Ｄｂ拘束性Ｔ細胞エピトープを、免疫担当細胞のサイトゾルへと送達でき、これにより強力なＣＴＬ応答を誘起できる。これは、ＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質のエピトープが、Ｈ−２Ｄｂの関連で記載された最初のケースであった。
−大きなポリペプチド断片（２０３までのアミノ酸）を有する組換えＣｙａＡは、依然として免疫原性であった。
【０１８４】
結論
ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ７を有する二価治療ワクチンを作成することが決定された。２つの可能性ある戦略が考えられた：（ｉ）第一の戦略は、一方はＨＰＶ１６のＥ７を有する他方はＨＰＶ１８のＥ７を有する、等モル量の２個の組換えＣｙａＡを混合する；（ｉｉ）第二の戦略は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方のＥ７タンパク質を有する組換えＣｙａＡを作成する。本結果は、ＨＰＶ１８のＥ７または両方のウイルスのＥ７を有する組換えＣｙａＡの作成を記載した。構造物の免疫原性は、ＣＴＬアッセイにおいて試験した。
【０１８５】
本研究の主な結論は、考えられている両方の戦略が、実現可能であることである。なぜなら、ＨＰＶ１８Ｅ７の配列内に潜在性Ｈ−２Ｄｂ拘束性エピトープが初めて判明したため、ＨＰＶ１８Ｅ７亜断片を有する組換えＣｙａＡが機能的であるからである。さらに、ＨＰＶ１６および１８ウイルスの両方のＥ７タンパク質（または亜断片）を有する組換えＣｙａＡは、ＴＣ−１細胞により天然に提示されるＨ−２Ｄｂ拘束性ＨＰＶ１６Ｅ７エピトープに対するＣＴＬ応答を刺激できるので、依然として最も興味深いことに免疫原性であった。
【０１８６】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１Ａ】ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡの作成および精製。（Ａ）関連する制限酵素部位および挿入配列が示されている、ｐＴＲＡＣＥ５のマップ図。（Ｂ）ＣｙａＡの酵素活性を阻害するジペプチドＬＱの挿入部位を示すＣｙａＡの図解。ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質挿入断片の位置も示されている。ＨＰＶ１６−Ｅ７ Ｈ−２ｂ拘束性エピトープには下線を付している。
【図１Ｂ】ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡの作成および精製。（Ｃ）ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。５μｇの精製タンパク質を、４〜１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、クーマシーブルーにより染色した。レーン１：野生型ＣｙａＡ；レーン２：ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７；レーン３：ＣｙａＡ−Ｅ７ＦＵｌｌ；レーン４：ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２。（Ｄ）ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡのウェスタンブロット解析。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、精製タンパク質を、ニトロセルロース膜にエレクトロトランスファーし、続いてこれをマウスモノクローナル抗ＨＰＶ１６−Ｅ７抗体でプローブした。レーン１、２：野生型ＣｙａＡ（それぞれ２および０．４μｇ）；レーン３、４、および５：それぞれ、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７、ＣｙａＡ−Ｅ７ＦＵｌｌおよびＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２、各々０．４μｇのタンパク質。
【図２】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡによるＴ細胞応答の誘導。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６（ａ、ｂ、ｃ）、ＴＡＰ１−／−（ｄ）、ＭＨＣクラスＩＩ−／−（ｅ）、およびＣＤ４０−／−（ｆ）マウスを、０日目に、５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７（ａ）、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（ｂ）、またはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（ｃ、ｄ、ｅおよびｆ）の静注により免疫化した。数日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を、インビトロで、１μｇ／ｍｌのＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドを用いて、照射された同系脾臓細胞の存在下で５日間再刺激し、ＴＣ−１標的細胞（普通の四角）またはＥＬ４（白抜きの四角）に対するエフェクターとして使用した。非関連エピトープＯＶＡ２５７〜２６４を有するＣｙａＡＥ５−ｃｙｓＯＶＡで処置し、インビトロで１μｇ／ｍｌのＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドを用いて、照射された同系脾臓細胞の存在下で５日間再刺激したマウスの脾臓細胞も表示する（ａ、普通の三角）。標的溶解は、５１Ｃｒ放出により評価した。データは、特異的溶解値の中間パーセンテージ（ｎ＝動物の数を各グラフに示す）並びに四分位範囲を示す。（Ｂ）組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡでの免疫化後のＨＰＶ１６−Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の検出。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ａと同様に、ＣｙａＡＥ５−ｃｙｓＯＶＡ（丸）、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７（四角）、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（三角）、またはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（菱型）を用いて免疫化した。数日後、免疫化マウスから単離した脾臓細胞を、インビトロで、刺激せずに（すなわち、ペプチドなし、白抜きの記号）、または、１μｇ／ｍｌのＥ７４９〜５７ペプチド（普通の記号）を用いて刺激して、同系照射脾臓細胞の存在下で３６時間培養した。データは、脾臓１個あたりのＳＦＣの数として表現し、３回の独立した実験の個々のマウスの結果を、各群に対して示す。横棒は、各群の応答の中間値を示す。
【図３】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡは、ＨＰＶ１６Ｅ７特異的Ｔｈ１応答を誘導する。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、未処置のままにするか（四角）、または、５０μｇのＣｙａＡＥ５−ｃｙｓＯＶＡ（丸）、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７（三角）、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（逆三角）、もしくはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（菱型）を用いて静注により抗原刺激した。数日後、脾臓細胞を、インビトロで、１０μｇ／ｍｌのＨｉｓ−Ｔａｇ−ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質で刺激し、上清を、ＩＦＮ−γ含量について７２時間後に試験した。４回の独立した実験の個々のマウスの結果を示し、２個の複製ウェルの上清に放出されたＩＦＮ−γの濃度として表現する。再刺激しなかった脾臓細胞で得られたバックグラウンドを差し引く。挿入図：１μｇ／ｍｌのＥ７４３〜７７ペプチドを用いたインビトロでの刺激。横棒は、各群の応答の中間値を示す。（Ｂ）上清をＩＬ−５含有量について試験したこと以外は、（Ａ）と同様。２回の独立した実験の個々のマウスの結果を示し、２個の複製ウェルの上清中に放出されたＩＬ−５の濃度として表現する。
【図４Ａ】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡを用いた治療的ワクチン接種は、確立された腫瘍を根絶する。（実験Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目に、５×１０４個のＴＣ−１腫瘍細胞を用いて移植した。１０日目に、マウスを、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７（Ｃ）、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（Ｄ）、またはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（Ｅ）の１回の静注により処置した。未処置のままのマウス（Ａ）またはＣｙａＡＥ５−ｃｙｓＯＶＡを注射したマウス（Ｂ）を対照として採用した。腫瘍サイズが１０００ｍｍ３に達した時、または不必要な苦しみを避けるために動物の衛生状態により要求される場合にはいつでも（壊死腫瘍、２０％を超える急速な体重減少）、マウスを屠殺した。後に進行性の腫瘍を発症したＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌで処置した２匹のマウス（＊）を、さらに調べるために屠殺した（図６参照）。
【図４Ｂ】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡを用いた治療的ワクチン接種は、確立された腫瘍を根絶する。（実験Ｂ）実験設定については（実験Ａ）と同様。＋１０および＋１７日目に、１０μｇのＣｙａＡＥ５−ＣｙｓＯＶＡ（ａ、実線）または１０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（ｂ）を用いて耳真皮に治療的ワクチン接種を実施した。各曲線は、１匹の動物における腫瘍増殖を示す。２匹の未処置の動物が含まれていた（ａ、点線）。各々の四分の一区の右上には（ａ、ｂ）、屠殺動物の数と、含まれる動物の全数が示されている。これらのマウスの生存曲線を示す（ｃ）。未処置（白抜きの三角）、ＣｙａＡＥ５−ＣｙｓＯＶＡを用いたニセ処置（閉じた三角）、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２を用いた処置（丸）。
【図５】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡでの治療的ワクチン接種により、生存が延長される。治療的ワクチン接種は、図４に記載した通りに行なった。ＴＣ−１腫瘍細胞の注射時に、マウス（１群あたり５〜１０匹）を、グラフに示されているように＋１、＋５、または＋１０日目にＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡで免疫化した。マウスを未処置のまま（普通の四角、実線）、ＣｙａＡＥ５−ｃｙｓＯＶＡでニセ処置（白抜きの四角、点線）、またはＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７（白抜きの三角）、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（白抜きの丸）、もしくはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（白抜きの菱型）で処置した。＋５日目の治療実験において、ＣｙａＡ−Ｅ７ＦｕｌｌおよびＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で処置した動物の生存曲線は、完全に重ね合わさることが特筆される。どの場合においても、組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡ処置動物の生存は、未処置またはニセ処置マウスと比べて有意に延びている（ｐ＜０．０５）。
【図６】その後に増殖してきた腫瘍から外移植したＴＣ−１腫瘍細胞は、Ｈ−２Ｄｂ分子の発現を欠失している。腫瘍拒絶実験において、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌをワクチン接種した数匹の動物では、実験の時間経過中、後になって腫瘍が成長した（図４、＊）。腫瘍を外移植するために、２匹の動物を屠殺した。これらの腫瘍細胞、ＴＣ−１Ａ１およびＡ２並びに天然ＴＣ−１細胞を、Ｈ−２Ｄｂ分子の発現レベルについてＦＡＣＳ（登録商標）により解析した（太線）。蛍光強度の中間値（ＭｅｄＦｉ）を示す。アイソタイプ対照で得られた結果を示す（グレーの陰影）。
【図７】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡで処置したマウスにおけるＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の持続性。治療的実験セットにおいて、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７（Ａ）、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（Ｂ）、またはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（Ｃ）で免疫化し、ＴＣ−１移植にも関わらず生存しているＣ５７ＢＬ／６マウスを屠殺し、脾臓細胞を、インビトロで、１μｇ／ｍｌのＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドで、照射同系脾臓細胞の存在下で５日間再刺激した。標的溶解（ＴＣ−１、普通の四角；ＥＬ４、白抜きの四角）を、５１Ｃｒ放出により評価した。データは、非特異的溶解の数値のパーセンテージの中間値（各群においてｎ＝６）、並びに、四分位範囲を示す。エフェクターと標的の最大比において２０％以上の特異的溶解により決定される対応する動物の数を、四分の一区の右上部分に示す。
【図８】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡにより誘導されるＴＣ−１腫瘍増殖に対する長期防御。治療的実験セットにおいて、ＴＣ−１移植にも関わらず生存しているＣ５７ＢＬ／６マウスに、１００日目に、５×１０４個のＴＣ−１細胞を再移植した。年齢の適合した未処置マウスを、対照として採用した（Ａ）。ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ、およびＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で最初に免疫化したマウスにおける腫瘍の増殖を示す（それぞれ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）。腫瘍サイズが１０００ｍｍ３に達した時、または動物の衛生状態により要求される場合にはいつでも、マウスを屠殺した。（Ｅ）未処置（白抜きの四角）；もしくはＣｙａ−Ｅ７４９〜５７（白抜きの三角）；ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（白抜きの丸）；もしくは、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（白抜きの菱型）で免疫化し、ＴＣ−１細胞を再移植した（移植日を０とする）動物の生存曲線。いずれの場合においても、組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡ処置動物の生存は、未処置またはニセ処置マウスに比べて有意に延びた（ｐ＜０．０５）。
【図９】ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２治療活性と、ＣｐＧ ＯＤＮ１８２６アジュバントの添加されたＨＰＶ１６Ｅ７４３〜７７の治療活性との比較。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目に、５×１０４個のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下移植した。＋１０および＋１７日目に、マウスに、１０μｇのＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７（ｎ＝５、三角）、１μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６（ｎ＝５、四角）、１０μｇのＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７＋１μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６（ｎ＝５、菱型）、１０μｇのＣｙａＡ−ＣｙｓＯＶＡ（ｎ＝３、逆三角）、または１０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（ｎ＝７、丸）を１回皮内注射して処置した。腫瘍サイズが１０００ｍｍ３を超えた時、または動物の衛生状態により要求される場合にはいつでも、マウスを屠殺した。
【図１０】ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２のＴＣ−１腫瘍拒絶誘導能に対する、ＣｙａＡに対する予備免疫の効果の解析。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスは未処置のままとするか、または、９０もしくは３０日前に、７日間の間隔で１０μｇのＣｙａＡＥ５を２回皮内注射することにより免疫化した。１日前に、動物の採血をし、血清を個々に抗ＣｙａＡＥ５ ＩｇＧの存在についてＥＬＩＳＡにより評価した。結果は、希釈対Ａ４９２をプロットした線形回帰分析により計算した個々の抗体力価として表現する。横棒は、各群の応答の中間値を示す。（Ｂ）未処置（ａ、ｂ）、３０日前にＣｙａＡＥ５で免疫化（ｃ、ｄ）、および９０日前にＣｙａＡＥ５で免疫化した（ｅ、ｆ）動物に、０日目に、５×１０４個のＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、＋１０および＋１７日目に、１０μｇのＣｙａＡ−ｃｙｓＯＶＡ（ａ、ｃ、ｅ）、または１０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（ｂ、ｄ、ｆ）を１回皮内注射することにより処置した。挿入図（ｂ、ｄ、ｆ）は、０〜３５日間の期間のクローズアップであり、全ての動物が、ワクチン接種をした時点で触診できる腫瘍を有していたことを示す。各曲線は、１匹の動物における腫瘍増殖を示す。腫瘍サイズが１０００ｍｍ３を超えた時、または動物の衛生状態により要求される場合にはいつでも、マウスを屠殺した。各々の四分の一区の右上には、屠殺動物の数と、含まれる動物の全数が示されている。
【図１１】ＨＨＤマウスにおけるＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２によるＣＴＬ応答の誘導。ＥＬ４−ＨＨＤ細胞へのペプチドの添加を、各グラフの上に示す。続く表には、カラムヘッダーＶａｃｃの下で注入されたＣｙａＡのタイプ（ＨＰＶ１７Ｅ７またはＨＰＶ１８Ｅ７に関する）、および、カラムヘッダーＳｔｉｍの下でインビトロでの再刺激に使用されたペプチドが示されている。見てとれるように、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２による免疫化後、本発明者らは、ペプチド＃２５３のみに特異的なＣＴＬを誘導することができた（右パネル）。インビトロでペプチド＃２５５で再刺激した脾臓細胞は、ペプチド＃２５３で被覆したＥＬ４−ＨＨＤ細胞に対して細胞毒性ではなかったため、このＣＴＬ活性は特異的であった（右パネル）。２個のその他のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドに対するＣＴＬ特異的応答がないことは、異なる現象から生じている可能性がある：（ｉ）ペプチド＃２５３の免疫優性、（ｉｉ）ＥＬ４−ＨＨＤ細胞のプロテアソームによりペプチド＃２５５および＃２５８が処理されないこと、（ｉｉｉ）ペプチド＃２５８の溶解度が低く、このため本発明者らはアセトニトリル（５０％）を使用しなければならず、これは細胞に対して毒性である可能性がある。最も興味深いことには、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２の同時注射は、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２のＣＴＬ誘導能を妨害しなかった（右パネル）。
【図１２】ＨＨＤマウスにおけるＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２によるＣＴＬ応答の誘導。ＥＬ４−ＨＨＤ細胞へのペプチドの添加を、各グラフの上に示す。以下の表には、カラムヘッダーＶａｃｃの下で注入されたＣｙａＡのタイプ（ＨＰＶ１６Ｅ７またはＨＰＶ１８Ｅ７に関する）、および、カラムヘッダーＳｔｉｍの下でインビトロでの再刺激に使用されたペプチドが示されている。見てとれるように、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２による免疫化後、本発明者らは、ペプチド＃２５１のみに特異的なＣＴＬを誘導することができた（左パネル）。インビトロでペプチド＃２５７で再刺激した脾臓細胞は、ペプチド＃２５１で被覆したＥＬ４−ＨＨＤ細胞に対して細胞毒性ではなかったため、このＣＴＬ活性は特異的であった（左パネル）。ＨＰＶ１６Ｅ７ ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドと同様に、ＨＰＶ１８Ｅ７＃２５７ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドに対するＣＴＬ特異的応答がないことは、異なる現象から生じている可能性がある：（ｉ）ペプチド＃２５１の免疫優性、（ｉｉ）ＥＬ４−ＨＨＤ細胞のプロテアソームによりペプチド＃２５７が処理されないこと、（ｉｉｉ）ペプチド＃２５７の溶解度が低く、このため本発明者らはアセトニトリル（５０％）を使用しなければならず、これは細胞に対して毒性である可能性がある。最も興味深いことには、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２の同時注射は、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２のＣＴＬ誘導能を妨害しなかった（左パネル）。
【図１３】ｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ７ＨＰＶ１８の作成。
【図１４Ａ】ｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ７ΔＨＰＶ１６＋１８の作成。 ３つのプラスミド調製ステップを開示する。
【図１４Ｂ】ｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ７ΔＨＰＶ１６＋１８の作成。 ３つのプラスミド調製ステップを開示する。
【図１４Ｃ】ｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ７ΔＨＰＶ１６＋１８の作成。 ３つのプラスミド調製ステップを開示する。
【図１５】ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Ｆｕｌｌ ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２ ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７Ｆｕｌｌ ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７Δをコードするポリヌクレオチドのマップ。
【図１６】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨＰＶ１８Ｅ７を有する組換えＣｙａＡによるＣＴＬの誘導。
【図１７】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨＰＶ１８Ｅ７を有する組換えＣｙａＡによるＣＴＬの誘導。寄託されている材料（Ｉ−３１９０およびＩ−３１９１）は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲに含まれ、ルリアブロス（ＬＢ）培地中で増殖させることができ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢに接種し、１７５ｒｐｍで振とうし照射しながら空気中で３０℃でインキュベートできる。７〜１０％ＤＭＳＯを含むＬＢ中での一晩の保存が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、アデニル酸シクラーゼタンパク質またはその断片に挿入されたパピローマウイルスエピトープを有する組換えタンパク質に関する。
【０００２】
したがって、本発明は、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質がタンパク質ベクターとして作用して、パピローマウイルス抗原、特にヒトパピローマウイルス抗原に由来するエピトープに対する免疫応答を誘起するような、組換えタンパク質に関する。
【０００３】
本発明は、特に、エピトープを、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、特にヒト細胞に送達するための、このようにして得られたタンパク質性ベクターの使用に関する。
【０００４】
本発明はまた、本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞にも関する。
【０００５】
本発明はまた、宿主におけるヒトパピローマウイルス感染の処置または予防のための、並びに、宿主、特に哺乳動物宿主における、ヒトパピローマウイルス感染から生じる悪性作用の処置または予防のための、上記の組換えタンパク質またはポリヌクレオチドの適用にも関する。特定の実施形態において、本発明は、免疫療法、特にパピローマウイルスの腫瘍特異的抗原に対する免疫療法に適した化合物の設計に有用な手段を提供する。
【０００６】
数多くのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプの中で、ハイリスクＨＰＶと称されるものは、宿主において感染が持続した場合の上皮悪性疾患の発達に関連している（１）。世界中で２番目に最も広まっている婦人科癌である子宮頚部癌（１）では、大抵、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ ＤＮＡが検出される（＞９９％）（２）。これらのウイルスの発癌能は、初期遺伝子、すなわち、Ｅ６およびＥ７遺伝子（その発現は、ウイルスの複製全周期において検出され、悪性形質転換の発症および存続に必要である）により発現される産物に起因する。しかし、これらのハイリスク発癌性ＨＰＶタイプによる肛門性器感染が高い頻度で起こることと、ＨＰＶ関連悪性疾患を最終的に発症する個体の比率は低いこととは対照的であり、このことは、免疫応答によりハイリスクＨＰＶ感染が制御されていることを示唆する。いくつかの観察により、例えば、大半の悪性段階以前の病変の自発的減退（１）、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびマクロファージによる退行中の性器いぼの浸潤（１）、並びに、免疫抑制患者および免疫欠陥患者においてより多数の感染被験者が認められることなどにより（１）、この所説が強められた。さらに、ＨＰＶ１６−Ｅ６および／またはＥ７エピトープに対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＨＰＶ１６関連悪性疾患と診断された患者の血液（４〜８）、並びに、健康個体の血液に（９、１０）検出された。まとめると、これらの考察には、ＨＰＶ１６のＥ６および／またはＥ７タンパク質に標的化する免疫療法の開発に対する強い根拠が含まれていた。
【０００７】
Ｈ−２Ｄｂ ＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７拘束性エピトープに対する免疫応答を発生させることにより、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨＰＶ１６−Ｅ６および−Ｅ７陽性腫瘍原性細胞系の腫瘍増殖を予防するための、多くのワクチン戦略が開発されている。これらのワクチン接種アプローチは、プラスミドＤＮＡ、ウイルス性または細菌性ベクター、キメラウイルス様粒子、合成ペプチド、および組換えタンパク質を含んでいる（１１）。残念なことに、該アプローチは、臨床的退行に関しては控えめに満足できる結果しかもたらさなかった（３）。したがって、細胞性応答を誘起するために、ＨＰＶ−エピトープを免疫系に標的化させる新規ツールを評価することは依然として感心が高い。
【０００８】
したがって、宿主において前記抗原に対する体液性および／または細胞性免疫応答の誘起が可能である条件において、ＨＰＶ抗原のエピトープを標的細胞に送達するのに適した新規ベクターが必要である。本発明者らは、アデニル酸シクラーゼタンパク質が、このようなベクターを設計する上で興味深いことを見出した。Bordetella pertussisのアデニル酸シクラーゼタンパク質を使用して様々な観察がなされ、これにより、このタンパク質が、このような効率的なベクターの設計に適した基盤となる可能性があるという結論が得られた。
【０００９】
Bordetella pertussisのアデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）は、その触媒ドメインを、真核細胞のサイトゾルへと送達することができる（１２）。したがって、ＣｙａＡの触媒部位に挿入されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面において、それぞれＭＨＣクラスＩＩおよびＩ分子により処理され提示される（１３）。さらに、ＣｙａＡは、近年、αＭβ２インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）に特異的に結合し（１４、第ＷＯ０２／２２１６９号）、これにより、これらのＴ細胞エピトープをＣＤ１１ｂ＋樹状細胞亜個体群に標的化することが実証された（１５）。マウスを、適切なエピトープを有する組換えＣｙａＡで免疫化すると、強力なＣＴＬ応答、致死的なウイルス攻撃に対する完全な防御、並びに効率的な予防的および治療的抗腫瘍免疫が誘導された（１６、１７）。アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質は特徴づけられており、組換えＤＮＡ技術によるその調製に関して、特に第ＷＯ９３／２１３２４号または第ＷＯ０２／２２１６９号に開示されている。第ＷＯ０２／２２１６９号には、Ｃｙａが包含する残基３７３〜１７０６の断片は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体との相互作用に実質的に必要とされる構造を含むことが記載されている。
【００１０】
より具体的には、残基１１６６からアミノ酸残基１２８１の範囲のアミノ酸配列は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体との相互作用のための決定基を含み、より特定すると、残基１２０８から残基１２４３の範囲のアミノ酸配列は、毒素とＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の相互作用に重要であることが後記されている（第ＥＰ０３２９１４８６．３および４５）。
【００１１】
本発明者らは、今回、ＨＰＶ抗原のエピトープを、宿主（ＨＰＶ感染およびその悪性形質転換に罹患している宿主を含む）の標的細胞、特に抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達できる、該エピトープを有する、すなわち含む、組換えＣｙａＡタンパク質の作成のための条件を決定し評価した。
【００１２】
したがって、本発明は、特に、１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有する１個または数個のポリペプチドを含む組換えタンパク質に関し、該ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されており、該ＣｙａＡ断片は、ＡＰＣ、特にＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞、例えば樹状細胞などのＣｙａＡの標的細胞に標的化させるという、該アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持している。特定の実施形態において、この断片はまた、そこに挿入されたエピトープまたは該エピトープを含むポリペプチドの、標的細胞のサイトゾルへの転位を可能とするようなＣｙａＡの特性を保持している。標的細胞のサイトゾルへのエピトープまたは該エピトープを含むポリペプチドの転位は、ＣｙａＡ断片が、その触媒ドメインの転位を可能とするタンパク質ドメインを保持している場合に許容される。
【００１３】
本発明の組換えタンパク質は、組換え技術を頼りにして調製できる。それはまた、合成、特に化学合成によっても得ることができる。したがって、「組換えタンパク質」なる語句は、キメラ形態のタンパク質を意味する。
【００１４】
組換えタンパク質のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞への標的化能は、特に、第ＥＰ０３２９１４８６．３および（４５）または第ＷＯ０２／２２１６９号に開示された方法にしたがってアッセイできる。さらに、組換えタンパク質の、該エピトープまたは該エピトープ含有ポリペプチドを標的細胞のサイトゾルへと転位する能力は、第ＷＯ０２／２２１６９号に記載の方法を適用することによりアッセイできる。
【００１５】
特定の実施形態において、ＣｙａＡ断片は、天然ではＣｙａＡ中で連続していない、ＣｙａＡの２個の異なる部分から構成されることができる。一例として、ＣｙａＡの触媒ドメイン、すなわち、ＣｙａＡのＮ末端部分の４００アミノ酸残基、および、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８抗原提示細胞の標的化に必要とされるアミノ酸残基１２０８〜１２４３を含む断片を挙げることができる。
【００１６】
先の定義において、「ポリペプチド」なる表現は、翻訳後修飾を受けたアミノ酸配列、特に、少なくとも６個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列、および、特に５〜５００残基または約５〜約１００、または約５〜約２００、または約１０〜約５０残基、または約３０もしくは約５０〜２００残基、または約１００〜約２１０、または約１００〜約２００残基を有するアミノ酸配列を含む任意のアミノ酸配列（ただし、該アミノ酸配列は少なくとも１個のエピトープを含む）、すなわち、標的細胞、有利には宿主、特に哺乳動物宿主の標的細胞に送達した後に免疫応答を発生させることのできるアミノ酸配列を記載する。したがって、この定義によるポリペプチドは、エピトープ、さらには独特なエピトープに限定されても、または、数個の異なるもしくは同じエピトープを含んでいても、または、病原体の、すなわちヒトパピローマウイルスの全長抗原を包含していてもよい。本発明のエピトープは、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答、特にＴ細胞免疫応答に関与するアミノ酸配列を包含する。したがって、本発明の組換え分子のポリペプチド中のエピトープは、宿主においてＡＰＣ（抗原提示細胞）により処理されるもの、特に、クラスＩ ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）分子と会合して認識されるもの、例えば標的細胞がＣＤ８＋Ｔリンパ球であるエピトープ、またはクラスＩＩ ＭＨＣ分子と会合して認識されるエピトープ、例えば標的細胞がＣＤ４＋Ｔリンパ球細胞であるものが挙げられる。
【００１７】
特定の実施形態において、エピトープを有するポリペプチドは、様々な抗原に由来する、特に様々なＨＰＶ株の１タイプの抗原に由来する、または、様々なＨＰＶ株の数タイプの抗原に由来する、数個のエピトープを含む。したがって、ＨＰＶ抗原に由来するポリペプチドは、多価、特に二価または三価であることができ、すなわち、数個の抗原に対する免疫応答が可能となる。
【００１８】
本発明によれば、ＨＰＶ抗原（これから１個または数個のエピトープを有するポリペプチドを設計できる）は、好ましくは、特にＨＰＶ感染後の悪性作用の発症および／または存続に関与するタンパク質に由来するものであり、いわゆる腫瘍抗原、すなわち、宿主において免疫応答を誘起し、宿主において抗体またはＴ細胞と特異的に反応できる、ＨＰＶ感染に関連した腫瘍発達に関連した抗原を包含する。
【００１９】
本発明に記載のエピトープを有するポリペプチドは、ＨＰＶの天然または成熟抗原から得られることができ、これには、抗原完全体を使用することにより、あるいは、全タンパク質ではなくむしろ、断片、特に抗原性断片、特に該抗原のエピトープを選択することにより、あるいは、特に、組換え分子中のＣｙａＡタンパク質と会合させた場合に、宿主における免疫応答を誘導または誘起する能力を高めるために、該抗原またはその選択された抗原部分またはエピトープを改変することによることが含まれる。したがって、このようなエピトープの様々な可能な改変を説明するために、これらのポリペプチドは、抗原（これからエピトープが得られる）の天然または非天然フランキング配列によりフランキングされたエピトープを包含し、また、その免疫特性を高めるために化学的に改変されているエピトープまたはエピトープを含むアミノ酸配列を包含する。これらの改変は、ＣｙａＡタンパク質に関連して得られるポリペプチドの有効性を向上するために有益である可能性がある。
【００２０】
いくつかの特定の改変が、本明細書で以後に例として開示されており、特に追加の陽性荷電のアミノ酸残基の挿入によるポリペプチド荷電の変化を包含する改変が含まれる。
【００２１】
したがって、本発明のポリペプチドはまた、半合成または合成ポリペプチドも包含する。
【００２２】
特定の実施形態によれば、ＨＰＶ抗原に由来するポリペプチドは、各々または一緒になって、約５〜約５００、または約５〜約１００、または約５〜約２００、例えば約１０〜約５０アミノ酸残基、または約３０もしくは約５０〜約２００アミノ酸残基、または約１００〜約２１０、または約１００〜約２００アミノ酸残基を含む。
【００２３】
ポリペプチドは、特に、本発明の組換えタンパク質中で組換えられた場合に、抗原特異的応答を誘起できるように選択される。
【００２４】
本発明の組換えタンパク質は、特に、分断された天然ＨＰＶ抗原に存在するポリペプチドまたは数個のポリペプチドを含むように設計することができ、ここで、該分断は、該ＨＰＶ抗原の酸性領域にける１個または数個のアミノ酸残基の欠失、および／または、アデニル酸シクラーゼの少なくとも２箇所の許容部位における該ＨＰＶ抗原の少なくとも２個のポリペプチド断片の挿入からなる。
【００２５】
この定義に包含される特定の分断は、アデニル酸シクラーゼの少なくとも２箇所の許容部位への、天然ＨＰＶ抗原の少なくとも２個の断片の挿入により得られ、ここで、これらの少なくとも２個の断片は、天然抗原におけるその天然の位置と比べて逆であり、すなわち、天然抗原においてよりＮ末端側である断片は、ＣｙａＡタンパク質またはその断片に挿入されると、よりＣ末端側となり、その逆もある。
【００２６】
アミノ末端断片およびカルボキシ末端断片の逆転は、Ｅ７Δ断片（すなわち、Ｅ７抗原の断片）で示されるように、特に癌免疫療法において、強力で長く続く防御免疫を誘導する際により効果的である可能性があることが観察されている。
【００２７】
本発明によれば、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）は、先に開示したように、全長タンパク質として、またはその断片として使用される。
【００２８】
有利には、ＣｙａＡタンパク質またはその断片は、細胞、特に組換え細胞における、ｃｙａＡ遺伝子およびｃｙａＣ遺伝子の両方の同時発現の結果である、タンパク質またはその断片である。実際に、標的細胞に対する侵襲性特性を有するために、ＣｙａＡは、ｃｙａＡ遺伝子およびｃｙａＣ遺伝子の両方の発現により可能となる翻訳後修飾を受けている必要があることが示されている（第ＷＯ９３／２１３２４号）。
【００２９】
本発明の特定の実施形態において、ＣｙａＡタンパク質の断片は、少なくとも約３０個のアミノ酸残基を有する断片であり、約１３００個まで、特に約５００個までのアミノ酸残基、好ましくは約５０〜約１５０個のアミノ酸残基を有することができ；該断片は、特定の実施形態において、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８標的細胞との相互作用のために、ＣｙａＡのアミノ酸残基１１６６〜１２８１、または、ＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基１２０８〜１２４３を含む。したがって、１個の具体的な断片は、天然タンパク質のＣ末端部分の全部または一部を包含し、この部分は、細胞膜および／またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体を標的化するための該タンパク質の結合に、および、細胞サイトゾルへのポリペプチド群に含まれるエピトープのその後の送達に関与している（１２）。本発明に記載のＣｙａＡタンパク質の１個の具体的な断片は、ＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基３７２〜１７０６を含む。別の具体的な断片は、アミノ酸残基２２５〜２３４が欠失しており、これにより１〜２４４および２３５〜１７０６を含むＣｙａＡ断片を与えるような、ＣｙａＡタンパク質に相当するものである。
【００３０】
本発明の特定の実施形態において、アデニル酸シクラーゼタンパク質は、細菌性タンパク質である。好ましい実施形態において、ＣｙａＡタンパク質は、Bordetella種に由来している。
【００３１】
本発明に記載の対象のBordetella種の中で、その１つが、Bordetella pertussisである。他の対象のBordetella株は、Bordetella parapertussisまたはBordetella bronchisepticaの株である。B.parapertussisのＣｙａＡタンパク質の配列は、特にアクセッション番号ＮＣ００２９２８．３（１７４０アミノ酸の配列として）およびParkhill J.ら（Nat.Genet.DOI、10(2003）に開示されており、B.bronchisepticaについては、Betsou Fら（Gene 1995、8月30日；162(1):165-6）に開示されている。
【００３２】
Bordetella pertussisは、百日咳の原因物質であり、とりわけ、細菌の決定的な病原性因子であり、B.pertussis感染に対して防御性作用のある抗原の１つである、公知の百日咳毒素（ＰＴ）およびアデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）を含む数種の毒素を分泌している。
【００３３】
Bordetella pertussisのアデニル酸シクラーゼタンパク質は、４００アミノ酸残基のＮ末端触媒ドメインと、毒素が標的細胞膜に結合することとその後の細胞サイトゾルへの触媒部分の送達に関与している１３０６残基のＣ末端部分とを含む、１７０６残基の二機能性タンパク質として記載されている毒素である（１２）。
【００３４】
ＣｙａＡタンパク質は、不活性プロ毒素として合成され、これは、２個の内部リジン残基（リジン８６０および９８３）の翻訳後パルミトイル化により活性毒素へと変換される。この翻訳後修飾は、ｃｙａＡ遺伝子と共に、アクセサリー遺伝子、すなわち、B.pertussis染色体上のｃｙａＡの近くに位置するｃｙａＣの発現が必要とされる。
【００３５】
Bordetella pertussisのｃｙａＡは、Glaser,P.ら、1988、Molecular Microbiology2(1)、19-30により、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列として記載されている。したがって、B.pertussisのＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基もしくは配列またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列が本発明において引用される場合、その位置は、Glasserら、1988の該刊行物に開示された配列を参考にして示されている。
【００３６】
本発明に記載の組換えタンパク質では、１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、ＣｙａＡタンパク質の１個または数個の許容部位に挿入されている。
【００３７】
本発明では、「許容部位」は、実質的にＣｙａＡタンパク質の機能特性に影響を及ぼすことなく、特に実質的に細胞の標的化に、特にＣｙａＡによるＡＰＣの標的化に影響を及ぼすことなく（実質的にＣＤ１１ｂ−ＣＤ１８受容体への特異的結合に影響を及ぼすことなく、有利には、実質的に、標的細胞へのエピトープの転位の過程に関与するタンパク質のドメインに影響を及ぼすことなくを含む）、ポリペプチドを挿入できる、ＣｙａＡタンパク質の配列部位である。
【００３８】
ＣｙａＡ触媒ドメインの転位を可能とし、これによりこのような許容部位に挿入されたエピトープの転位を可能とする、Bordetella pertussisアデニル酸シクラーゼの許容部位には、残基１３７〜１３８（Ｖａｌ−Ａｌａ）、残基２２４〜２２５（Ａｒｇ−Ａｌａ）、残基２２８〜２２９（Ｇｌｕ−Ａｌａ）、残基２３５〜２３６（Ａｒｇ−Ｇｌｕ）、および残基３１７〜３１８（Ｓｅｒ−Ａｌａ）が挙げられるがこれに限定されない（（４４）Seboら、1995）。以下の追加の許容部位もまた、本発明の実施形態に含まれる：残基１０７〜１０８（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ）、残基１３２〜１３３（Ｍｅｔ−Ａｌａ）、残基２３２〜２３３（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）、３３５〜３３６（Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）および３３６〜３３７（４３）。
【００３９】
他のBordetella種における対応する許容部位は、配列の比較および対応する残基の決定により定義できる。
【００４０】
別の実施形態によれば、該ポリペプチドは、追加的にまたは代替的に、ＣｙａＡタンパク質またはその断片の一端および／または他の末端に挿入してもよい。
【００４１】
本発明の目的のために使用するＣｙａＡタンパク質の特定の断片は、１３００個までのアミノ酸または約３０〜約５００個のアミノ酸残基、有利には約５０〜約１５０個のアミノ酸残基を含むもの、特に、天然ＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基１１６６〜１２８１、有利には天然ＣｙａＡタンパク質の１２０８〜１２４３を包含するような断片である。
【００４２】
したがって、本発明によれば、「ハイブリッドタンパク質」とも呼ばれるいわゆる組換えタンパク質をもたらすＣｙａＡタンパク質へのポリペプチドの「挿入」は、特に、利用可能なＤＮＡ技術による遺伝子的挿入を包含する。または、「挿入」はまた、非遺伝子的挿入も包含され、これには、例えばＣｙａＡもしくはその断片の一端において実施する共有結合、または非共有結合などの化学的挿入が含まれる。非遺伝子的挿入は、挿入するポリペプチドが合成または半合成である場合には特に関心が高い可能性がある。薬物をポリペプチドに結合させる方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｎ−ピリジルスルホニル活性化スルフヒドリルを使用するなどのジスルフィド連結が含まれる。
【００４３】
特に、インビボで、Ｃｙａの標的細胞へ、例えばＡＣＰ、例えばＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８細胞、特に該細胞のサイトゾルへと標的化させるために、化学的連結または遺伝子的挿入により、本発明のポリペプチドを特に含む分子を、ＣｙａＡに融合させることが可能である。実際に、所与のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに相当する分子を、解毒したＣｙａＡの触媒ドメインに、ジスルフィド結合または遺伝子的挿入により結合させると、遺伝子工学された分子は、インビボで特異的ＣＴＬ応答を誘起することができ、これにより、該ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ１１ｂ発現細胞のサイトゾルへと転位されたことが示される。
【００４４】
特定の実施形態において、タンパク質性ベクターの製造に使用される組換えアデニル酸シクラーゼは、ジスルフィド結合により、該アデニル酸シクラーゼの触媒ドメイン内に位置する遺伝子的に挿入されたシステイン残基に化学的に結合されている本発明のポリペプチドを特に含む、システイン残基含有の１個以上の分子の挿入により特に改変されている、ＣｙａＡまたはその断片である。
【００４５】
実際に、本発明のポリペプチドを特に含む複数の分子を、ジスルフィド結合により、触媒ドメイン内の様々な許容部位に位置する様々なシステイン残基に化学的に結合させることができる。
【００４６】
宿主において免疫応答、特に細胞性免疫応答を誘起できる製品の設計に適した組換えタンパク質を提案するために、また特に、ＨＰＶに感染した宿主に観察される悪性作用に対する免疫応答を誘起できるような製品を設計するために、本発明者らは、高度に発癌性のＨＰＶ株、特にＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２、またはＨＰＶ５８から選択される株に由来する抗原に由来するエピトープを有するポリペプチドを得ることを提案した。
【００４７】
これらの株の中で、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ１６が特に関心が高い。ＨＰＶ１６は、特に、哺乳動物宿主、特にヒトにおける子宮頚部癌の発症に関連しているために、ＨＰＶに感染した宿主の処置のための特定の標的である。
【００４８】
これらのＨＰＶ株から出発して、本発明者らは、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、およびＥ５タンパク質から選択される抗原に由来するエピトープを有するポリペプチドを得ることを提案する。
【００４９】
代替的にまたは組み合わせて、本発明者らはまた、ＨＰＶのＥ６またはＥ７タンパク質に由来するエピトープを有する該ポリペプチドを得ることを提案する。
【００５０】
本発明の特定の実施形態において、ＨＰＶ１６のＥ６もしくはＥ７タンパク質またはＨＰＶ１８のＥ６もしくはＥ７タンパク質が、エピトープを有するポリペプチドの設計に使用される。
【００５１】
ＨＰＶ抗原に由来するポリペプチドの設計のために言及できる特定のＨＰＶタンパク質は、ＨＰＶのＥ７タンパク質、特にＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＥ７タンパク質である。本発明の実施形態によれば、該ポリペプチドは、様々なＨＰＶ株、特にＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の数個のＥ７タンパク質から得られる。例えば、該ポリペプチドは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の全長Ｅ７タンパク質、または、ＨＰＶ１６もしくはＨＰＶ１８の各々のＥ７タンパク質の１個もしくは数個の断片（該断片の多量体、特に二量体を含む）から得られる。
【００５２】
これらのＨＰＶタンパク質およびそのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＨＰＶ１６についてはSeedorf,Kら（ヒトパピローマウイルスタイプ１６ＤＮＡ配列、Virology、145:181-185、1985）、Cole S.T.、Danos O.（ヒトパピローマウイルスタイプ１８ゲノムのヌクレオチド配列および比較解析。パピローマウイルスの系統発生並びにＥ６およびＥ７遺伝子産物の反復構造、J.Mol.Biol.193:599-606(1987))またはFernando GJら（子宮頚部癌に関連したヒトパピローマウイルスタイプ１８（ＨＰＶ１８）のＥ７形質転換タンパク質のＴヘルパーエピトープ、Virus Res.1995 Apr.36(1):1-13）に開示されている。
【００５３】
Ｅ６およびＥ７タンパク質は、ウイルスの複製全周期を通じて特にＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８により発現されている癌タンパク質であり、ＨＰＶ株による感染後の宿主細胞の悪性形質転換の発症および存続に必要とされることが示されている。それ故、これらの両方の腫瘍特異的抗原が、養子ＣＴＬ媒介免疫療法の可能性ある標的と考えられている。
【００５４】
本発明の特定の実施形態によれば、該組換えタンパク質は、複数のポリペプチドを含み、その各々が、１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有する。
【００５５】
例えば、このような複数のポリペプチドは、１個のＨＰＶ株、特にＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質から得ることができる。別の例によれば、これらの複数のポリペプチドは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方に由来する、Ｅ６またはＥ７タンパク質から得られるエピトープを包含することができる。
【００５６】
複数のポリペプチドはまた、対象のＣｙａＡタンパク質の異なる許容部位に挿入された、１個のタンパク質、例えばＥ７またはＥ６タンパク質の断片群を有する様々なエピトープからなることができる。
【００５７】
先の定義に記載の別の特定の組換えタンパク質は、エピトープを有する複数のポリペプチドが、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質の残基１〜２９を含む断片、すなわち残基１〜２９からなる断片、または残基４２〜９８を含む断片、すなわち残基４２〜９８からなる断片を包含するか、あるいは、複数のポリペプチドが、ＣｙａＡタンパク質の異なる許容部位に挿入された両方の断片を含むかまたはからなる、ＣｙａＡ組換えタンパク質である。
【００５８】
本発明に記載の別の組換えタンパク質は、複数のポリペプチドが、アミノ酸配列
【表２】
を有する断片を包含するようなタンパク質である。
【００５９】
ＣｙａＡタンパク質の許容部位に挿入されたポリペプチドのアミノ酸残基の数は、全長抗原、特にＨＰＶの全長Ｅ６またはＥ７タンパク質からなるポリペプチドを、ＣｙａＡタンパク質またはその断片に挿入できるようなものである。
【００６０】
本発明の特定の実施形態によれば、組換えＣｙａＡに含まれるポリペプチドは、ＣｙａＡのコドン２２４と２３５の間またはＣｙａＡのコドン３１９と３２０の間に挿入された、Ｅ７タンパク質、特にＨＰＶ１６のＥ７タンパク質である。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の組換えタンパク質は、複数のポリペプチド（そのいくつかは、１個または数個のＨＰＶの１個または数個のエピトープを有するポリペプチドである）および他の病原体のエピトープを有する他のポリペプチドを含む。
【００６２】
別の特定の実施形態において、本発明の組換えタンパク質はさらに、異なる病原性物質から派生した１個または数個のエピトープを含む。ChlamydiaまたはＨＩＶレトロウイルス、またはＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、アデノウイルスＥＢＶ、ヘルペスウイルス、ＨＴＬＶ．１ウイルスおよびＣＭＶから派生したエピトープと、ＨＰＶから派生したエピトープとの会合は、特に関心が高い場合がある。
【００６３】
本発明の別の特定の実施形態によれば、エピトープを有するポリペプチドは、例えば、配列内の負に荷電したアミノ酸残基の数を減少させるために、その天然アミノ酸配列と比べて改変されている。このような改変は、これらの負に荷電したアミノ酸残基のいくつかを除去することにより、または、いくつかの正に荷電したアミノ酸残基を、特にエピトープのフランキング残基として付加することによっても得ることができる。このようにより少ない数の負に荷電した残基を含むポリペプチドは、標的細胞のサイトゾルへのＣｙａＡタンパク質の触媒ドメインの転位に好ましくあり得る。
【００６４】
エピトープを有するポリペプチドはまた、ＣｙａＡに挿入される場合に折りたたまれないようにするように設計でき、これにより、標的細胞への組換えＣｙａＡタンパク質の内部移行の効率が向上する。その含有アミノ酸の結果として折りたたみを受けたポリペプチド中のこのような折りたたみ解除は、例えば、システイン残基を除去または置き換えて、ポリペプチドの折りたたみに関与している可能性があるジスルフィド結合の形成を避けることにより達成することができる。いくつかの場合において、インビボでの再折りたたみを回避することのできる還元剤の存在下でそれらを調製することによりポリペプチドの折りたたみを防ぐことが可能である。
【００６５】
特定の実施形態において、エピトープを有するポリペプチドは、潜在性エピトープであってもよい。
【００６６】
本発明の特定の態様において、本発明者らは、実際に、（ｉ）先に開示した定義に記載のアデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）またはその断片と、（ｉｉ）１個または数個の抗原の１個または数個の抗原性断片を有するポリペプチドとを含む組換えタンパク質からなる、キメラタンパク質構造物は、組換え構造物における該抗原の潜在性エピトープを、それを提示する結果、免疫原性とすることができることが決定された。特に、特に治療目的（ワクチン接種目的を含む）のための、本発明に定義したＣｙａＡまたはその断片と対象の抗原から得られたポリペプチドとを含む該キメラ構造物は、免疫原性とさせることができ、特に、宿主におけるＴ細胞応答、特にＣＴＬ応答を発生させることのできる、抗原の潜在性エピトープを含むことができる。
【００６７】
したがって、本発明はまた、１個または数個の抗原の１個または数個のエピトープを有する１個または数個のポリペプチドを含む組換えタンパク質に関し、該ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されており、該ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的化するという該アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持しており、該エピトープの少なくとも１個は、亜優性潜在性Ｔ細胞エピトープ（subdominant cryptic T-cell epitope）であり、該組換えタンパク質は、該ポリペプチドに対する抗原特異的応答を誘起できる。
【００６８】
特に、潜在性エピトープは、ＨＰＶ抗原、特にＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８抗原、特にＥ７抗原内に含まれる。
【００６９】
このように定義した組換えタンパク質は、特に、ＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質から得られたペプチド、すなわち、アミノ酸配列ＩＤＧＶＮＨＱＨＬを有するペプチドを含む。
【００７０】
特定の実施形態によれば、潜在性エピトープは改変でき、例えば、最初の２箇所の位置において置換を有することができ、例えば配列ＡＳＧＶＮＨＱＨＬを有することができる。
【００７１】
本発明は、特に、ペプチドＩＤＧＶＮＨＱＨＬに関する。
【００７２】
本発明はまた、この配列に置換を有するペプチド、特に１位および／または２位に置換を有するペプチド、特に配列ＡＳＧＶＮＨＱＨＬを有するペプチドに関する。
【００７３】
本発明はまた、免疫原性特性を有する限り、特にＴ細胞を誘起できる限り、特にＣＴＬ応答を誘起できる限りにおいて、該ペプチドの変種を含む。
【００７４】
有利には、本発明の組換えタンパク質を調製するために、ＣｙａＡタンパク質の酵素活性、すなわち、ＡＴＰからｃＡＭＰへと変換する能力は、不活性化されている。このような不活性化は、遺伝子不活性化の結果として得ることができる。一例として、遺伝子不活性化は、ジペプチドを、触媒部位の一部であるＣｙａＡのアミノ酸配列の部位（例えば１８８と１８９の間）に導入する結果として得ることができる。このような不活性化ＣｙａＡタンパク質は、以下の実施例に実例を示す。
【００７５】
本発明の組換えタンパク質は、有利には、細胞性免疫応答を誘起できる。該応答は、ＣＴＬおよびＴｈ、特にＴｈ１応答（ＣＤ４＋Ｔ細胞応答および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む）を含む。
【００７６】
組換えタンパク質がこの細胞性免疫応答を誘起できる能力は、特に、インビボにおいて腫瘍増殖を抑止するのにまたはさらには動物における腫瘍減退を可能とするのに十分であることが示された。
【００７７】
本発明はまた、先に定義した組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して、本発明の組換えタンパク質の発現に適した組換え発現ベクターを提供できる。このような発現ベクターには、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルスベクターが挙げられる。
【００７９】
組換えベクターは、原核細胞、特に細菌における発現に適したものでも、または、真核細胞、特に哺乳動物細胞、有利にはヒト細胞における発現に適した発現ベクターでもよい。
【００８０】
本発明は、特に、本発明に記載の組換えタンパク質をコードするプラスミドからなるベクターに関する、例えば：２００４年３月１８日にＣＮＣＭ Ｉ−３１９１号でＣＮＣＭ（パリ、フランス）に寄託されたｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７ＦＵＬＬ（ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７ＦＵＬＬとも称される）；２００４年３月１８日にＣＮＣＭ Ｉ−３１９０号でＣＮＣＭ（パリ、フランス）に寄託されたｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２（ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２とも称される）、または構造物ｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７４９〜５７。
【００８１】
本発明はまた、本発明に記載のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換された、宿主細胞、特に原核細胞、または真核細胞、例えば哺乳動物細胞（ヒト細胞を含む）を含む。
【００８２】
本発明は、特に、アクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３１９０号およびアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ−３１９１号でＣＮＣＭに寄託された宿主細胞に関する。
【００８３】
本発明はまた、活性物質として、先に定義した組換えタンパク質または先に定義したポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む、免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物の該活性物質は、宿主への投与に適した生理的に許容されるビヒクル、賦形剤、担体、もしくは希釈剤と共に、またはその組合せと共に製剤化できる。
【００８４】
免疫原性組成物は、有利には、哺乳動物宿主において、細胞性免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を誘導するように設計されている。好ましくは、細胞媒介細胞溶解免疫応答ＣＴＬ、特にＣＤ８＋を誘導できる。
【００８５】
本発明に記載の別の免疫原性組成物は、体液性免疫応答を誘導できるものである。
【００８６】
本発明の免疫組成物が免疫応答を誘導する能力を高めるために、活性物質を、アジュバントおよび／または界面活性剤および／または免疫調節物質（例えばサイトカインまたはケモカイン）と合わせることは興味深い。
【００８７】
アジュバントは、例えば、水層を含むエマルションの形態で一般に使用される、リポソーム、油層、例えばフロイントタイプのアジュバント、または、水不溶性無機塩、例えば水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、コロイド状水酸化鉄、リン酸カルシウム、または塩化カルシウムを含むことができる。
【００８８】
本発明に記載の免疫原性組成物は、有利には、特に免疫療法のために、免疫応答を抗原刺激および／またはブーストすることにより、宿主の免疫応答を誘導するために使用されている。特に、本発明の免疫原性組成物は、宿主におけるＨＰＶ感染に起因する悪性形質転換の発症または存続の予防のために、あるいは、ＨＰＶ感染、特にＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８感染に起因する悪性形質転換に罹患する患者の処置のために興味深い。
【００８９】
このような免疫治療組成物は、腫瘍誘発性状態をもたらす宿主における制御されていない細胞増殖の治療に、特に癌免疫療法に、特にＨＰＶ感染に関連した子宮頚部癌免疫療法において特に興味深い。それ故、それは、癌ウイルス感染に起因する悪性状態（腫瘍状態を含む）の処置に特に適した治療ワクチンの設計のための手段を提供する。
【００９０】
本発明に使用する場合、「処置」または「治療処置」なる表現は、処置を受けている患者に有益な効果をもたらす、本出願で開示された化合物の効果を包含し、該効果は、細胞レベルまたは臨床レベルで観察され、処置の結果、患者の容態の改善もしくは寛解状態、または健康状態の回復が含まれる。処置する悪性状態が、制御されていない細胞増殖または腫瘍の発生もしくは持続である場合、有益な効果は、制御されていない増殖の安定化を含み得、あるいは、好ましくは、その予防、停止もしくは反転、または腫瘍の減退を含み得る。
【００９１】
先に記載した悪性状態の処置を目的とした組成物は、有利には、約１〜約１０００μｇの組換えタンパク質、好ましくは約１０〜約５００μｇの組換えタンパク質の量に対応する用量の活性物質を含むことができる。該組成物が活性物質として本発明の組換えタンパク質を含む場合、用量は、約０．０５〜約１０μｇの組換えタンパク質、好ましくは約０．１〜約１μｇのタンパク質を含むことができる。
【００９２】
処置する状態に応じて、該組成物は、病変レベルで局所的に、１回または数回、例えば数日間の規則的な間隔で、例えば５〜１０日間投与できる。また全身投与してもよい。
【００９３】
本発明はまた、好ましくはヒト宿主における、先の定義に記載の組換えタンパク質、または、先に定義したポリヌクレオチド、または、該ポリヌクレオチドを含むベクター、および、適宜、免疫応答（細胞性免疫応答および／または体液性応答を含む）を誘起するための薬学的に許容されうるビヒクルを含む、ワクチン組成物、特に哺乳動物宿主、好ましくはヒトへの投与のために製剤化された組成物に関する。
【００９４】
本発明はまた、ＨＰＶ感染を予防または処置するための、本発明の組換えタンパク質またはポリヌクレオチドまたはベクターおよび薬学的に許容されうるビヒクルを含む、薬物組成物にも関する。
【００９５】
別の実施形態によれば、薬物組成物は、宿主におけるＨＰＶ感染に起因する悪性形質転換の発症または存続の予防または処置のための、本発明に記載の組換えタンパク質またはポリヌクレオチドまたはベクターを、薬学的に許容されうるビヒクルと共に含む。
【００９６】
癌免疫療法のための、組換えタンパク質またはポリヌクレオチドまたはベクターおよび薬学的に許容されうるビヒクルを含む薬物組成物。
【００９７】
本発明はまた、宿主における免疫応答、すなわち、体液性および／または細胞性免疫応答を誘起するためのベクターとして使用するに適した、細菌タンパク質、特に細菌毒素（好ましくはその類毒素形態）またはその断片を含む組換えタンパク質（該タンパク質またはその断片は、１種類の癌ウイルスによる感染の処置のために、１個または数個の癌ウイルスの１個または数個の抗原の１個または数個のエピトープの挿入により改変されている）の患者における使用に関する。このような組換えタンパク質は、特に、悪性作用、特にこのような癌ウイルスによる感染により引き起こされる腫瘍の処置に提案されている。
【００９８】
癌ウイルスの抗原のエピトープを運ぶためのベクターとして適した細菌タンパク質の例は、クレブシエラのＯｍｐＡまたは以下の毒素シガ毒素（そのβサブユニットを含む）（Haicher N.ら、J.Immunol.2000、165:3301-8）、炭素菌毒素（Goletz TJら、PNAS USA 1997、94:12059-64）、ジフテリア毒素（Stenmark H.ら、J.Cell.Biol.1991、113:1028-32）またはシュードモナス外毒素Ａ（Donnelly JJ.ら、PNAS USA 1993、90:9530-4）である。細菌タンパク質への挿入のためのポリペプチドを調製するために抗原がエピトープを提供できる癌ウイルスには、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、アデノウイルスＥＢＶ、ヘルペスウイルス、ＨＴＬＶ．１ウイルス、およびＣＭＶが挙げられる。
【００９９】
ＣｙａＡ組換えタンパク質について先に示した活性物質としての使用の記述は、他の細菌タンパク質および癌ウイルス抗原にも応用できる。
【０１００】
本発明はまた、ＨＰＶ感染の診断のための、または、このような感染を免疫モニタリングするためのキットに関し、これには、本発明に記載の組換えタンパク質、ポリヌクレオチド、または発現ベクターが含まれる。
【０１０１】
本発明はまた、患者におけるＨＰＶ感染の処置または予防のための、上記の本発明の組換えタンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクターの使用に関する。
【０１０２】
本発明はまた、患者におけるＨＰＶ感染に起因する悪性形質転換の発症または存続に対する免疫療法のための、上記の本発明の組換えタンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクターの使用に関する。
【０１０３】
本発明はまた、ＨＰＶ感染をインビトロで診断する方法またはＨＰＶ感染を免疫モニタリングする方法に関し、該方法は、
哺乳動物、特にヒト患者から得られたＴ細胞を、本発明の組換えタンパク質にさらすこと、
Ｔ細胞の活性化の改変を検出すること
を含む。
【０１０４】
特定の実施形態において、該組換えタンパク質は、ＨＰＶ感染の予防、または、ＨＰＶ感染に罹患している宿主（このような感染に起因する腫瘍を有する宿主を含む）の処置のために使用できる。
【０１０５】
本発明はまた、キメラＣｙａＡ−ポリペプチドタンパク質に含まれるポリペプチドにおける未知または亜優性潜在性Ｔ細胞エピトープのスクリーニング方法であって、
ここで、ＣｙａＡは、先に開示されているアデニル酸シクラーゼまたはその断片であり、該方法は、
該キメラタンパク質を動物宿主に投与すること、
該宿主のＴ細胞応答、特にＣＴＬ応答を決定すること
を含む。
【０１０６】
本発明は、特に、本発明内で定義された組換えタンパク質に含まれるＨＰＶ抗原のポリペプチド中の未知または亜優性または潜在性Ｔ細胞エピトープ（特にＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ）をスクリーニングする方法に関し、該方法は、
該組換えタンパク質を動物宿主（非ヒト）に投与すること、
該宿主のＴ細胞応答、特にＣＴＬ応答を決定すること
を含む。
【０１０７】
本発明を特徴づけるさらなる特徴を、以下の実施例および図面に開示し説明する。
【０１０８】
実施例
実施例１
ここで、本発明者らは、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質の全長配列またはこのポリペプチドの亜断片（特に、Ｈ−２Ｄｂ拘束性エピトープに対応するＥ７の残基４９〜５７およびＨＰＶ１６−Ｅ７残基４３〜９８と１〜２９を包含するペプチド）を含む、組換えＣｙａＡを作成した。本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注入した場合、これらのＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡは、ＩＦＮ−γの分泌により特徴づけられる特異的ＣＴＬおよびＴｈ１応答を誘導できることを示した。さらに、治療的に試験した場合、これらの構造物は、ＴＣ−１細胞の皮下移植に対して１００％以下の防御を提供できた。この研究は、初めて、インビボでの、ヒト腫瘍特異的抗原に対するＣｙａＡにより媒介される抗腫瘍治療活性の実証を示した。
【０１０９】
材料および方法
マウスおよび細胞系
特定の病原体を含まない６〜１０週令の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、CER Janvier（Le Gesnet St-Isle、フランス）またはチャールズリバー（L'Arbresle、フランス）から得た。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドへと育成したＴＡＰ１−／−（１８）、ＭＨＣクラスＩＩ−／−（１９）およびＣＤ４０−／−（２０）もこの研究に使用した。動物を、水と食料が自由にとれ、病原体の存在しない条件下で、パスツール研究所動物施設で飼った。動物の関与する実験は、動物の世話の施設ガイドラインにしたがって実施した。ＨＰＶ１６Ｅ６およびＥ７タンパク質を発現しているＴ細胞（２１）およびマウス胸腺ＥＬ４細胞（１７）を、ＡＴＣＣから得た。細胞を、１０％の熱不活性化ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．４ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ＴＣ−細胞に対してのみ）、および５×１０５Ｍの２−メルカプトエタノール（ギブコＢＲＬ、Cergy-Pointoise、フランス）を補充したグルタマックスを含むＲＰＭＩ１６４０中に維持した。
【０１１０】
ペプチド
ＨＰＶ１６−Ｅ７ Ｈ２−Ｄｂ拘束性エピトープ（２２）に対応する合成ペプチドＥ７４９〜５７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、一文字でアミノ酸をコード）並びにＥ７４９〜５７ＣＴＬエピトープ（天然フランキング配列およびＴｈエピトープ（太線）を含む）（２３）に対応するＥ７４３〜７７
【表３】
を、Neosystem（ストラスブール、フランス）から購入した。ＣｐＧ ＯＤＮ１８２６は、PROLIGO（パリ、フランス）から購入した。
【０１１１】
ＨＰＶ１６−Ｅ７エピトープを有する組換えB.pertussisアデニル酸シクラーゼの作成および精製
本文書で使用される組換えアデニル酸シクラーゼは、酵素的に不活性なＣｙａＡをコードするプラスミドｐＴＲＡＣＥ５の誘導体（図１Ａ）を使用することにより、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた（２４）（２５）。プラスミドｐＴＲＡＣＥ５は、酵素的に不活性で、それ故に細胞毒性であるB.pertussisＣｙａＡの変種のための発現ベクターである。それはまた、ＣｙａＡの翻訳後のアシル化に必要とされるB.pertussisＣｙａＣタンパク質も発現する。このプラスミドは、以前に記載されているｐＴＲＡＣＧプラスミドの誘導体である（Gmiraら、2001、Res.Mic.152:889）。それは、ｃｙａＡ ＤＮＡ配列の５’部分内に位置するＥｃｏＲＶ部位へのヘキサヌクレオチドＣＴＧＣＡＧの挿入により得られた。これにより、触媒部位の不可欠な部位内のＡｓｐ１８８とＩｌｅ１８９の間に、ジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎが枠内に挿入された（Guermonprezら、2000、Meth.Enzymol.326:527）。
【０１１２】
プラスミドｐＴＲＡＣＥ５は、ＣｏｌＥ１複製起点とアンピシリン耐性マーカーを有する。このプラスミドでは、ｃｙａＣおよび改変されたｃｙａＡ遺伝子が、λファージＰｒプロモーターの制御下で同じ転写単位に入れられている。ｐＴＲＣＡＧプラスミドはまた、３２℃より低い温度でλＰｒプロモーターにおける遺伝子転写を強力に抑制する熱感受性λリプレッサーｃＩ８５７をコードしている。
【０１１３】
Ｅ．ｃｏｌｉ株のＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン、ラホーヤ、ＣＡ州）を、標準的なプロトコルにしたがって実施した全てのＤＮＡ操作において使用した（Maniatisら）。
【０１１４】
ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７は、ＣｙａＡのコドン２２４と２３５の間に挿入された９アミノ酸長のポリペプチド配列（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）を含む。ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７の発現プラスミドは、以下のように作成した。２つの合成オリゴヌクレオチド（ＭＷＧ、Courtaboeuf、フランス）
【表４】
をアニーリングし、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＴＲＡＣＥ５にライゲートした。ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌは、ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質の全配列、すなわち、酵素的に不活性なＣｙａＡの同じ２２４位に挿入された９８アミノ酸を含む。Ｅ７タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、特異的プライマー
【表５】
を使用して、ＨＰＶ１６ ＤＮＡ（先のSeedorf Kら）から増幅した。得られたＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩで切り出したｐＴＲＡＣＥ５にライゲートした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド並びにＨＰＶ１６−Ｅ７の全配列に存在するＳｓｐＩ部位により、挿入変異体の迅速な同定が可能となった。ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２は、ＣｙａＡのコドン３１９と３２０の間に挿入されたＨＰＶ１６−Ｅ７の最初の２９アミノ酸残基、並びに、ＣｙａＡのコドン２２４と２３５の間に挿入されたＨＰＶ１６−Ｅ７の残基４３〜９８を含む。ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２のための発現プラスミドは、２ステップで作成した。ＨＰＶ１６−Ｅ７（のアミノ酸残基１〜２９）をコードする第一のＤＮＡ断片を、標的ＤＮＡとして合成ＨＰＶ１６−Ｅ７遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉにおける産生に最適化され、GTP Technologyにより設計、Labege、フランス）およびプライマー
【表６】
を使用してＰＣＲ増幅した。ＣｙａＡのコドン３２０〜３７２をコードする第二のＤＮＡ断片を、標的ＤＮＡとしてｐＴＲＡＣＥ５、および、プライマー
【表７】
を使用してＰＣＲ増幅した。これらの２個のＤＮＡ断片（一部重複する）を精製し、３回目のＰＣＲでプライマーＢＴＰ５およびＢＴＰ８と合わせ、２９４ｂｐ長のＤＮＡ断片を増幅した。この断片を、ＡｇｅＩおよびＢｓｔＢＩにより消化し、ｐＴＲＡＣＥ５の対応する部位の間に挿入して、プラスミドｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ１〜２９を得た。その後、ＨＰＶ１６−Ｅ７のアミノ酸残基４３〜９８をコードするＤＮＡ断片を、標的ＤＮＡとしての合成ＨＰＶ１６−Ｅ７遺伝子、および、プライマー
【表８】
を使用してＰＣＲ増幅した。精製ＰＣＲ断片をＮｈｅＩおよびＫｐｎＩにより消化し、同じ制限酵素により消化したプラスミドｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ７１〜２９にライゲートした。
【０１１５】
全ての組換えアデニル酸シクラーゼが、前記のように（２６）、エシェリヒア・コリ株ＢＬＲ（ノバゲン、ＷＩ州マジソン）において産生された。組換えタンパク質を、前記のように（２６）、ＤＥＡＥ−セファロースおよびフェニル−セファロースクロマトグラフィーを含む２ステップ手順により封入体から均一に近くなるまで精製した（図１Ｂ）。フェニル−セファロースクロマトグラフィーに加えて、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ、ｐＨ７．５中の６０％イソプロパノールを用いてのさらなる洗浄ステップを行ない、大半の混入ＬＰＳを排除した。ＬＰＳ含量は、キットＱＣＬ−１０００（Biowhittaker、Walkersville、ＭＤ州）を使用して決定した。精製組換えタンパク質を、ＳＤＳ−ゲル分析により分析した。タンパク質濃度は、分子吸光係数１４２，０００Ｍ−１ｃｍ−１を使用して２８０ｎｍにおける吸光度から分光学的に決定した。
【０１１６】
組換えＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質の作成および精製。
リクエストにより入手可能なＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質（GTP technology）のＤＮＡ配列をコードするＥ．ｃｏｌｉ最適化ｃＤＮＡを、ｐＩＶＥＸ２．４ｂベクター（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、Meylan、フランス）のＮｃｏＩとＸｈｏＩ制限部位の間にサブクローニングした。その後、得られたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１λＤＥ３（ノバゲン）に形質転換した。０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Euromedex、Souffelweyersheim、フランス）で誘導するとＨｉｓ−Ｔａｇ−ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質が発現され、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて製造業者の指示にしたがって精製した。ＬＰＳ混入を除去するために、記載の通りに（２７）イソプロパノールによる洗浄を使用した。
【０１１７】
イムノブロット
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ１６Ｅ７抗体（Zymed、ＣＡ州サンフランシスコ）またはＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて調製したポリクローナル抗Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＲ血清でプローブした、ニトロセルロース膜（０．４５μ、バイオラッド、Marnes la Coquette、フランス）にエレクトロトランスファーした。アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせたヤギ抗マウス免疫グロブリン（Chemicon、Temecuka、CA）を用いて免疫複合体が検出され、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）（シグマ、ＭＯ州セントルイス）を用いて明確にした。
【０１１８】
マウス免疫化および腫瘍拒絶実験
動物を、ＰＢＳ（ギブコＢＲＬ）に希釈した５０μｇの対照もしくはＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡを１回静注するか、または、２回（各回１０μｇ）皮内注射することにより免疫化した。皮内注射は、耳真皮に行なった（４７）。インビトロでの解析のために、長期の応答の解析を除いて（このためにこの手順は、注射の３ヶ月後に行なった）、注射の７日後に、麻酔した動物（ＣＯ２）の脾摘除を行なった。腫瘍拒絶実験のために、マウスは、皮下に５×１０４個のＴＣ−１細胞を投与され、腫瘍接種の１日後、５日後、または１０日後にＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡにより処置した。ＴＣ−１腫瘍増殖を、キャリパーを使用してモニタリングし、式Ｖ＝（Ｌ×ｗ２）／２（Ｌ：長さ、ｗ：幅）を使用して立方ミリメートルで表現した（４８）。
【０１１９】
インビトロでの細胞毒性アッセイ
免疫化マウスの脾臓細胞を、インビトロで、同系の照射し無処置の脾臓細胞の存在下で、完全培地（１０％の熱で不活性化されたＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールを補充したグルタマックスを含むＲＰＭＩ１６４０）中で、５日間、１μｇ／ｍｌのＥ７４９〜５７またはＥ７４３〜７７ペプチドで刺激した。これらのエフェクター細胞の細胞毒性活性を、ＴＣ−１細胞の５時間の５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。放射標識を以下のように行なった：７．５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で培養した指数関数的に増殖しているＴＣ−１細胞を、素早くトリプシン処理し（トリプシン−ＥＤＴＡ、ギブコＢＲＬ）、１００μＣｉの５１Ｃｒと共に３７℃で１時間インキュベートした。様々なＥ：Ｔ比を使用し、全てのアッセイを二重に行なった。各ウェルの上清に放出された放射能を測定した。特異的溶解率は、１００×（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）として計算した。最大放出は、１０％トリトンＸ−４０５を標的細胞に加えることにより得、自発的放出は、完全培地のみの中でインキュベートした標的細胞を用いて得られた。最も高いＥ：Ｔ比で少なくとも２０％の特異的溶解が観察された場合にマウスをレスポンダーと判断した。結果は、１群あたりのレスポンダーマウスの中間値±四分位範囲として表現した。
【０１２０】
分泌細胞のための、単一のＩＦＮ−γ産生細胞の酵素結合イムノスポットアッセイ
マルチスクリーンろ過プレート（９６ウェル；ミリポア、Molshein、フランス）を、１ｍｌあたり４μｇのラット抗マウスγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）抗体（クローンＲ４−６Ａ２；ファーミンゲン、ＣＡ州サンディエゴ）を用いて室温で一晩かけて被覆した。その後、プレートを洗浄し、完全培地で遮断した。免疫化マウスの脾臓細胞の連続２倍希釈液を、５×１０５個のγ照射された（２，５００ｒａｄ）同系支持細胞と共に加えた。細胞を、１μｇ／ｍｌのＥ７４９〜５７ペプチドと共にまたはその非存在下で３６時間インキュベートした。十分に洗浄した後、プレートを、１ｍｌあたり５μｇのビオチニル化ラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体（クローンＸＭＧ１．２；ファーミンゲン）と共にインキュベートし、その後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ファーミンゲン）と共にインキュベートすることにより明確にした。最後に、基質としてＢＣＩＰ／ＮＢＴを使用してスポットを明確にした。ＩＦＮ−γ産生細胞の数を、各ウェルにおけるスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を計測することにより決定し（Bioreader、Karben、ドイツ）、結果を、脾臓１個あたりのＳＦＣの全数として表現した（１７）。
【０１２１】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
空のベクターＣｙａＡＥ５により皮内免疫化したマウスから、３０または９０日後に採血し、個々のマウス血清を、ＥＬＩＳＡにより抗体応答について試験した。マイクロプレート（Nunc、Roskilde、デンマーク）を、ＰＢＳ中の空のベクターＣｙａＡＥ５（３μｇ／ｍｌ）を用いて一晩かけて被覆した。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）中で洗浄した後、希釈した血清を、ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄した後、プレートを、ヤギ抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（シグマ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、ｏ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素（シグマ）を使用して展開した。硫酸を用いて反応を停止し、プレートを、ＥＬＩＳＡ読取機（Dynatech、Marnes la Coquette、フランス）を用いて４９２ｎｍで解析した。結果は、希釈とＡ４９２をプロットした線形回帰分析により計算した抗体力価として表現した。力価は、１／１００に希釈されたプール対照血清の吸光度の２倍をもたらす最も高い希釈度のｌｏｇ１０であると計算された。
【０１２２】
サイトカイン産生
免疫化マウスの脾臓細胞を、インビトロで、完全培地中で、１０μｇ／ｍｌのＨｉｓＴａｇ−ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質または１μｇ／ｍｌのＥ７４３〜７７ペプチドを用いて７２時間かけて刺激した。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−５産生は、培養上清中で、前記のように（２８）、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定された。全てのアッセイは、対応する組換えネズミサイトカイン（ファーミンゲン）を用いて標準化した。
【０１２３】
ＦＡＣＳ（登録商標）解析
ＴＣ−１細胞は、特異的なＦＩＴＣ−コンジュゲートモノクローナル抗体（クローンＫＨ９５、ファーミンゲン、Le Pont de Claix、フランス）を使用するフローサイトメトリーによるＭＨＣクラスＩ分子Ｈ−２Ｄｂの発現レベルの解析についていずれかに記載されているように（２９）処理した。
【０１２４】
統計的解析
様々な試料の量が少ないことを考慮して、ソフトウェアＳｔａｔＸａｃｔ４（Cytel社、ＭＡ州ケンブリッジ）を使用するノンパラメトリック統計試験（３０）を適用した。生存曲線を、Prismソフトウェア（GraphPadソフトウェア社、ＣＡ）を使用してプロットし、ソフトウェアのビルトインのｌｏｇランク検定を用いて比較した。データは、ｐ＜０．０５で有意差があると判断した。
【０１２５】
結果
ＨＰＶ１６−Ｅ７エピトープを有する組換えアデノウイルスシクラーゼの作成および特徴づけ
ＣｙａＡのＨＰＶ１６−Ｅ７特異的Ｔ細胞応答誘導能を試験するために、本発明者らは、３個の異なる組換え分子を作成した。ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７は、酵素的に不活性な（したがって無毒性な）ＣｙａＡのコドン２２４と２３５の間に挿入された、以前に記載されたＨ−２Ｄｂ拘束性ＣＴＬエピトープ（２２）に対応する、９アミノ酸長のポリペプチド配列（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）を含む。ＣｙａＡ−Ｅ７ＦＵｌｌは、酵素的に不活性なＣｙａＡの同じ２２４位に挿入されたＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質の全配列（９８アミノ酸）を含む。ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２は、酵素的に不活性なＣｙａＡのコドン３１９と３２０の間に挿入されたＨＰＶ１６−Ｅ７の最初の２９アミノ酸残基、並びに、コドン２２４と２３５の間に挿入されたＨＰＶ１６−Ｅ７の残基４３〜９８を含む。インビトロおよびインビボでのアッセイを可能とするために、ＣｙａＡ構造物が産生され、精製されてほぼ均一とした（図１Ｂ）。ＬＰＳ排除手順を精製プロトコル（２６）に導入し、５０μｇあたり１００単位未満の内毒素を含む組換えタンパク質を得た。ＣｙａＡ−Ｅ７ＦｕｌｌおよびＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２におけるＥ７タンパク質の存在は、特異的なモノクローナル抗体（Zymed）を使用してウェスタンブロットにより確認された（図１Ｃ）。これに対し、Ｈ−２Ｄｂ拘束性エピトープのみを含むＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７は、抗ＨＰＶ１６−Ｅ７抗体により認識されなかった。３個の組換えＣｙａＡの全体的な生化学的特性は、改変されておらず、これらの分子は、野生型アデニル酸シクラーゼと類似した溶血特性を示した（１７）。
【０１２６】
ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡでの免疫化は、Ｅ７特異的ＣＴＬ応答を誘導した。
ＣｙａＡが、ＨＰＶ１６−Ｅ７エピトープに対するＣＴＬ応答を誘導できるかを試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５０μｇの様々なＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡを１回静注することにより免疫化した。脾臓細胞を収集し、インビトロで、１μｇ／ｍｌのＥ７４３〜７７ペプチドで刺激した。ＴＣ−１細胞を溶解する能力を、５日後に、５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した。図２Ａに示されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡを１回静注して免疫化することにより、ＴＣ−１細胞に対する強力で特異的なＣＴＬ応答が誘導された。完全なＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質（図２Ａ、ｂ）を含むＣｙａＡまたはその欠失形態であるＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（図２Ａ、ｃ）で免疫化することにより、最小のＨ−２Ｄｂ拘束性エピトープ（図２Ａ、ａ）のみを含むＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７により誘導されるものと比べてより高い最大ＣＴＬ活性が得られたが、本発明者らは、本発明者らのデータから統計学的有意性を実証できなかった。ペプチドＥ７４９〜５７をインビトロでの再刺激に使用した場合にも、類似の結果が得られた（データは示さず）。関連性のないエピトープ（ＯＶＡ２５７〜２６４）を有する組換えＣｙａＡでワクチン接種し、インビトロで、１μｇ／ｍｌのＥ７４３〜７７ペプチドで再刺激したマウスの脾臓細胞には、弱く非特異的なＴＣ−１細胞溶解しか認められなかった（図２Ａ、ａ）。インビボで、ＣｙａＡにより、ＯＶＡ ＣＤ８＋細胞エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）をＭＨＣクラスＩ分子に送達することは、ＴＡＰ１機能に依存していることが以前に示されている（１５）。本発明者らは、これがＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２を使用しても当てはまるかどうかを試験した。図２Ａ、ｄに示されているように、静注によりワクチン接種されたＴＡＰ１−／−マウスに由来するインビトロで刺激された脾臓細胞は、ＴＣ−１細胞を溶解できなかった。本発明者らはまた、インビボでのＨＰＶ１６Ｅ７含有組換えＣｙａＡによる、ＣＴＬ応答の刺激における、ＣＤ４＋Ｔ細胞による支持の必要性を試験した。以前の観察と一致して（１５）、本発明者らは、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２を使用したＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスの静注ワクチン接種により、ＴＣ−１細胞に対する高いレベルの特異的ＣＴＬ応答が誘導されることを観察した（図２Ａ、ｅ）。これに対し、本発明者らは、このモデルにおいて、ＣＤ４０−／−マウスにおけるＴＣ−１細胞に対するＣＴＬ応答のレベルが低いことを観察したので（図２Ａ、ｆ）、ＣＤ４０シグナル伝達への幾分の依存性を観察した。
【０１２７】
生体外での組換えＣｙａＡで免疫化したマウスにおけるＨＰＶ１６−Ｅ７特異的脾臓細胞の発生頻度を推定するために、インビトロでのＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７ペプチドでの刺激に応答してＩＦＮ−γを産生する細胞の数を、酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）により定量した。図２Ｂは、ＣｙａＥ５−ＣｙｓＯＶＡで免疫化したマウスから得られたＩＦＮ−γを特異的に産生しているＩＦＮ−γ産生脾臓細胞の数は、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７で免疫化したものと比べて、僅かな差異しかなかったことを示す。これに対し、得られたＩＦＮ−γ産生脾臓細胞は、完全なＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質またはその欠失形態を含むＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡでワクチン接種したマウスにおいて、はるかにより多かった（ｐ＜０．０５）。観察された応答は、エピトープ特異的であった。なぜなら、ＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７ペプチドにより刺激しない場合、これらのマウスの非常に僅かな脾臓細胞しか、ＩＦＮ−γを産生しなかったからである（図２Ｂ）。これらの結果は、ＣｙａＡが、処理およびＭＨＣクラスＩ経路へと提示するために、インビボにおいて、ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質の免疫優性ＣＤ８＋Ｈ−２Ｄｂ拘束性Ｔ細胞エピトープを、免疫担当性細胞のサイトゾルへと送達でき、これにより強力なＣＴＬ応答を誘起できることを示す。以前の観察によれば（２５、３１）、本発明者らは、完全なＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質またはその欠失形態および反転形態を有するＣｙａＡもまた、強力なＣＴＬ応答を誘導できたので、ＣｙａＡは、大きなポリペプチド断片の挿入に耐えられることを確認した。本発明者らのデータはまた、これらの後者の分子は、マウスにおいて、有意により高い発生頻度のＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７特異的応答を誘導したことを実証した。
【０１２８】
ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡでの免疫化は、ＨＰＶ１６−Ｅ７特異的Ｔｈ１応答を誘導した。
Ｔｈ１応答は、細胞内病原体および腫瘍発達に対する防御において重要な役割を果たす（３２、３３）。それ故、本発明者らは、ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡにより誘導されるＴ細胞応答のタイプを特徴づけた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５０μｇの３種の異なるＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡを１回静注することにより免疫化し、インビトロで脾臓細胞を１０μｇ／ｍｌの精製Ｈｉｓ−ＴａｇＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質で刺激した後に、サイトカインの合成を決定した。図３に示されているように、完全なＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質またはその欠失形態を有するＣｙａＡでの免疫化により、高いレベルのＩＦＮ−γの産生および検出可能なレベルのＩＬ−５が存在しないことにより特徴づけられる、Ｔｈ１に似たプロファイルが得られた。この応答は特異的であった。なぜなら、ＣｙａＡ−Ｅ７ＦＵｌｌまたはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で免疫化した後に得られたＩＦＮ−γレベルは、ＣｙａＡＥ５−ＣｙｓＯＶＡでニセ免疫化したマウスで得られたものよりも有意に高かったからである（ｐ＜０．０５）。しかし、これは、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７で免疫化したマウスの脾臓細胞には当てはまらなかった。１μｇ／ｍｌのＥ７４３〜７７ペプチドを用いて再刺激した場合に、類似の結果が得られた（図３Ａ、挿入図）。
【０１２９】
合わせて考えると、これらの結果により、本発明者らの条件では、クラスＩＩ Ｈ−２ｂ拘束性Ｔ細胞エピトープを含む完全ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質を有するＣｙａＡで得られたレベルは、クラス１Ｈ−２Ｄｂ拘束性エピトープしか含まないＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７で得られたレベルよりもはるかに高いので、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γの分泌において重要な役割を果たしていることが示された。
【０１３０】
ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡでの免疫化は、確立されたＨＰＶ１６を発現している腫瘍の減退を誘導した。
強い免疫応答が得られたことを考慮して、その後、本発明者らは、インビボにおいて、ＨＰＶ１６−Ｅ６およびＥ７タンパク質Ｈ−２ｂ腫瘍原性細胞系（ＴＣ−１細胞）（これはＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に注射される）からなる前臨床モデルにおいて、ＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡの治療活性を評価した。このモデルにおいては、腫瘍拒絶は、排他的に、Ｅ７４９〜５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介されることが以前に示された（２１、２２、３４、３５）。したがって、５×１０４個のＴＣ−１細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹に皮下注射し、５０μｇのＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７、−Ｅ７ｆｕｌｌ、または−Ｅ７Δ３０〜４２を、１、５、または１０日後にマウスに静注した。図４は、腫瘍移植の１０日後に治療処置したマウスにおける腫瘍増殖を示す。特に、これらの条件において、１００％の動物が、ワクチン接種を行なう時点までに、触診可能な腫瘍を発達させた。不必要な苦しみを避けるために、腫瘍サイズが１０００ｍｍ３に到達した場合には動物を屠殺した。全ての非処置動物並びにニセＣｙａＡＥ−ｃｙｓＯＶＡで処置したマウスは、最大４９日間以内に、そのサイズ（＞１０００ｍｍ３）の腫瘍を発達させた。極めて対照的には、ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡで処置した動物の大半が、実験期間中を通じて腫瘍がない状態を維持した（図４、Ｃ、Ｄ、Ｅ）。図５は、ＴＣ−１細胞を移植し、３つの異なる治療プロトコル（組換えＣｙａＡを、ＴＣ−１移植の１、５、または１０日後に注射した）を行なった、動物の生存プロットを示す。非処置またはニセ処置動物の生存時間の中間値は、３１〜４０日間であった。これに対し、ＨＰＶ１６−Ｅ７抗原を有するＣｙａＡでワクチン接種したマウスの生存は、対照動物よりも有意に優れていた（ｐ＜０．０５）。様々な構造物の防御活性の差異は確立できたが、統計学的有意性は確立できなかった。なぜなら、様々な試料のサイズが小さいからであった。ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７および−Ｅ７Ｆｕｌｌにより付与される腫瘍減退率が、認められる程には区別できなくても、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２は、腫瘍減退および増殖阻害の点において明らかに優れていた。なぜなら、３つ全ての治療スキームにおいて、防御率は、常に、９０％よりも高かったからである。
【０１３１】
ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７およびＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌでワクチン接種した何匹かの動物は、実験の経過中、より後で腫瘍を発達させるようであった（図４（＊）、データは示していない）。この現象は腫瘍エスケープ機序を反映する可能性があることを心に置き、本発明者らは、これらの動物から増殖中の腫瘍を外移植し、Ｈ−２Ｄｂ発現について、ＦＡＣＳ解析により、ＴＣ−１Ａ１およびＴＣ−１Ａ２という名称のこれらの細胞系を解析した。図６に示されているように、その天然対応物に比べて、より後で増殖してくる腫瘍から外移植したＴＣ−１Ａ１およびＡ２細胞は、Ｈ−２Ｄｂの発現を欠失しており、したがって、Ｅ７４９〜５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞により検出されることができなくなっている可能性が高い。ＴＣ−１細胞は、インビボにおいて、選択のための抗生物質の負荷がない環境で増殖させたので、本発明者らはまた、ＴＣ−１Ａ１およびＡ２細胞においてＨＰＶ１６−Ｅ７の発現についてウェスタンブロットにより確認した。本発明者らは、ＴＣ−１およびＴＣ−１Ａ１およびＡ２細胞の間にこのタンパク質の発現の差異を全く見出すことができなかった（データは示さず）。
【０１３２】
合わせて考えると、これらの結果により、前臨床モデルにおいてＨＰＶ１６を発現している腫瘍の減退を誘導するために適した治療ワクチンとしての、アデニル酸シクラーゼベクターの有効性が実証された。
【０１３３】
本発明者らは、臨床的に関心の高い別の注射経路を試験した。したがって、１０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２を、ＴＣ−１移植の１０日後から始めて７日間間隔で２回皮内注射した。興味深いことに、全ての非処置およびニセ処置動物が腫瘍を発達させたが、本発明者らは、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で処置した動物の全ての動物において腫瘍減退を観察した（図４Ｂ、ａ、ｂ）。この治療的免疫化により、９０日目においてＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２処置マウスの１００％の生存率が得られ、一方、非処置およびニセ処置動物の生存率の中間値は、それぞれ３０日および３２日であった（図４、ｃ）。
【０１３４】
ＣｙａＡ免疫化により誘導されるＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の長期持続性
ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡにより誘導される免疫応答の持続性を評価するために、３ヵ月後も治療実験にも関わらず生存しているマウスを屠殺し、その脾臓細胞を、インビトロで、１μｇ／ｍｌのＥ７４３〜７７ペプチドで５日間かけて刺激した。その後、ＴＣ−１細胞を溶解する能力を、５１Ｃｒ放出アッセイにより決定した。図７に示されているように、ＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドに対する特異的ＣＴＬ応答が、依然として、３ヵ月前に免疫化した動物の脾臓細胞から実証された。３０：１のエフェクター：標的の比での特異的溶解の最大パーセンテージに基づいて、免疫応答は、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で処置した動物においてより強力であるようであるが、これらのデータから統計学的有意性は実証できなかった。このような長く続く免疫原性の生理的関連性を評価するために、残りの動物に、１００日目に５×１０４個のＴＣ−１細胞を用いて皮下に再攻撃した。このような条件下で、全ての未処置の年齢一致対照動物が腫瘍を発達させ、３７．５日間という生存時間の中間値を示した（図８）。これに対し、ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡで３ヶ月前に免疫化したマウスは、腫瘍発達から非常に有意に防御された。先に観察されているように、ＣｙａＡＥ−ＨＰＶ１６−Ｅ７Δ３０〜４２でワクチン接種した動物が、高いレベルの防御を示した。しかし、今回、最初のセットの治療実験で得られた結果の変動では、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７で処置した動物と、ＣｙａＡ−Ｅ７ＦＵｌｌで処置した動物の間には顕著な防御の差異があり、後者の方が好ましいが、試料のサイズが少ないので、統計的有意性を明確に実証することはできなかった。これらの観察により、このモデルでは、完全なＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質を有するＣｙａＡにより提供されるＴ細胞の支持は、ＴＣ−１細胞に対する効果的で長期に持続する応答には重要であることが示唆された。
【０１３５】
合わせて考えると、本発明者らの結果により、ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質のヘルパーエピトープ（ＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）を有する５０μｇの組換えＣｙａＡの１回の静注は、少なくとも６ヶ月の期間におよび、２回のＴＣ−１腫瘍細胞攻撃に対する防御を付与できる、長期に持続するＥ７４９〜５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するのに十分であった。
【０１３６】
ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の治療効力は、ＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６と共に投与されたペプチドの治療効力に匹敵した。
抗原送達システムとしてのＣｙａＡの効力をより良く評価するために、本発明者らは、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の治療効力を、ＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６を補充したＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドの治療効力と比較した（３７）。それ故、マウスに、５×１０４個のＴＣ−１細胞を皮下注射し、１０および１７日後、皮内経路により、１０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で、または、１μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６と共に投与される１０μｇのＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドで、治療処置した。生存率は、これらの２つの群において類似していたが（図９）、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で得られた結果は、ＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６と混合されたＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドで得られた結果よりも僅かに良好であったが、統計学的に差異はなかった。特に、この結果は、モル基準で、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２に比べて５０倍多いＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドを使用して得られた。単独で使用した場合、ペプチドＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７は、ＴＣ−１腫瘍増殖に対して全く効果がなかった。
【０１３７】
ＣｙａＡベクターに対する事前免疫は、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の治療効力に僅かにしか影響を及ぼさなかった。
臨床の場面では、効果的な細胞性免疫応答を得るために、病変を有する患者に、複数回のブースター投与をおそらく行なわなければならない。それ故、ＣｙａＡベクターに対する予備免疫が、腫瘍拒絶を引き起こす能力を損なわないことを実証することが不可欠であった。そうするためには、本発明者らは、５×１０４個のＴＣ−１細胞を皮下注射する９０または３０日前に、７日間間隔で２回１０μｇの空ベクターＣｙａＡＥ５でマウスを皮内免疫化した。７日間間隔の２回の１０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の注射による治療処置を１０日目に設定した。抗体応答の解析により、空ベクターで免疫化されたマウスは、ＴＣ−１注射時にＣｙａＡに対して免疫があることが示された（図１０Ａ）。その後、本発明者らは、年齢の一致した未処置動物およびＣｙａＡ免疫動物において腫瘍拒絶を誘導する、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２処置の能力を比較した。ＣｙａＡに対するその免疫状態はどうであれ、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で処置したマウスの大半が、実験を通じて腫瘍がないままであった（図１０Ｂ）。３０日目の免疫マウス群の中で１匹のみ、９０日目の免疫マウス群において２匹のみが、腫瘍を発達させた（図１０Ｂｂ、ｄ、ｆ）。これに対し、ニセ感染動物の１００％が腫瘍を発達させ、屠殺された（図１０Ｂ、ａ、ｃ、ｅ）。本発明者らは、抗ＣｙａＡ抗体力価レベルと、ＴＣ−１腫瘍の発達の間の相関は全く観察しなかった（データは示さず）。さらに、ＣｙａＡ−Ｅ８Δ３０〜４２処置マウスの生存曲線（図１０Ｂ、ｂ、ｄ、ｆ）は、統計学的に差異はなかった（ｐ＝０．３２４）。
【０１３８】
それ故、これらのデータにより、ＣｙａＡに対する既存免疫は、このベクターがその後に外来の所与の抗原に対する効果的な応答を誘導する能力に対して、殆ど作用を及ぼさないことが示された。
【０１３９】
考察
以前の研究により、Bordetella pertussisのアデニル酸シクラーゼは、インビボにおいて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを、樹状細胞のＭＨＣ−クラスＩＩおよびＩ提示経路に送達するための強力なツールであることが実証された。実験ネズミモデルにおいて、このシステムは、抗ウイルスおよび抗腫瘍防御をもたらす効果的なＴｈ１およびＣＴＬ応答を引き起こすために使用されている（３６）。ＨＰＶ１６関連の子宮頚部悪性疾患の処置のためのヒトにおけるＣｙａＡの可能性ある適用の評価として、本発明者らは、このベクターが、インビボにおいて、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質のエピトープを効果的に送達することを実証し続けた。
【０１４０】
本発明者らは、ＨＰＶ１６の完全なＥ７タンパク質またはこのポリペプチドの亜断片（特に、残基４９〜５７に対応するＨ−２Ｄｂ拘束性最小ＣＴＬエピトープを含む）を含む様々なＨＰＶ１６組換えＣｙａＡを作成した。本発明者らは、これらの異なる組換えタンパク質が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注射された時に、特異的かつ強力なＣＴＬ応答を抗原刺激できることを示した。本発明者らのデータにより、本発明者らはＴＡＰ１−／−マウスにおいてＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の注射によりＣＴＬを刺激することができなかったので、ＣｙａＡによるＣＴＬエピトープの送達には、完全に機能的なクラスＩ提示経路が必要であることが確認された（１５）。ＣｙａＡにより媒介されるＣＴＬ刺激は、以前の結果と一致して、ＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスで得られた効果的なＣＴＬ応答により示されるように、ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在とは独立していた（１５）。ワクチンベクターとしてのこのＣｙａＡの特徴は、ＣＤ４＋Ｔ細胞数の変化を提示する免疫抑制患者または免疫欠陥患者のワクチン接種を考慮した場合に非常に重要である。しかし、ＣＤ４０−／−マウスではＣＴＬ応答は低く、このことは、ＣＴＬ刺激が、一部、ＣＤ４０シグナル伝達に依存していることを示す。これらの観察により、ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡは、プロフェッショナルＡＰＣの直接刺激により、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬを直接的に誘起することが示唆された。それにも関わらず、ＣＴＬ応答の最適な刺激を得るためには、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用が必要とされる。
【０１４１】
本発明者らは、ＨＰＶ１６−Ｅ７の最小Ｈ−２Ｄｂ拘束性ＣＴＬエピトープの免疫原性を、おそらくとりわけ記載されたヘルパーエピトープＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦを含む、完全もしくはΔ３０〜４２Ｅ７タンパク質の免疫原性と比較した。ＣＴＬ刺激並びにＣｙａＡ−Ｅ７ＦＵｌｌおよびＣｙａＡＥ−Ｅ７Δ３０〜４２により誘導されるＨＰＶ１６−Ｅ７特異的脾臓細胞の発生頻度は、ＣＴＬエピトープＥ４９〜５７のみを有するＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７により誘導されるものよりも優れていた。これらの観察により、ＣｙａＡによりＣＴＬおよびＴｈエピトープを同時に送達することにより、より強力なＣＴＬ応答がもたらされることが示された。これは、他のモデルにおいて、前臨床（３７）および臨床レベル（３８）で以前に公表されたデータと一致した。組換えＣｙａＡによるＨＰＶ１６−Ｅ７Ｔｈエピトープの送達は、さらに、インビトロで組換えＨｉｓＴａｇ−ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質またはＥ７４３〜７７ペプチドで再刺激したＨＰＶ１６−Ｅ７特異的脾臓細胞により産生されるサイトカインの解析により証明された。実際に、本発明者らは、Ｔｈエピトープを含む組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡでワクチン接種したマウスのみにおいて、ＩＦＮ−γの特異的合成を観察した。本発明者らが、ＣｙａＡ−Ｅ７ＦｕｌｌおよびＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の１回静注により免疫化した後に観察した、ＩＦＮ−γレベルが高いことおよびＩＬ−５が全く分泌されないことにより特徴づけられる典型的なＴｈ１プロファイルは、腫瘍免疫療法におけるこのベクターの関心の高さを強調する。
【０１４２】
これは、皮下で確立された腫瘍原性ＴＣ−１細胞に基づいた腫瘍拒絶モデルで試験した（２１）。ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡの免疫原性を実証する本発明者らのデータによれば、本発明者らは、これらの組換えタンパク質が、確立されたＴＣ−１腫瘍の減退を誘導できることを観察した。ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２は、９０日間の期間におよび、生存の点で、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７およびＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６−Ｅ７Ｆｕｌｌよりも優れていた。完全およびΔ３０〜４２Ｅ７タンパク質を有するＣｙａＡは、ＣＴＬ刺激能力、ＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７特異的脾臓細胞の発生頻度、およびＩＦＮγ産生の点で、匹敵する結果を与えたので、本発明者らは、生存の点で、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌは、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７よりも優れていると期待した。より多くの数の試験動物が、この一見した矛盾を除外してくれるのに役立つ可能性が高い。しかし、ＣｙａＡの生化学に関する２つの側面をここで考察すべきである。第一に、ＣｙａＡの２２４〜２３５の領域の負に荷電したアミノ酸の存在は、真核細胞のサイトゾルへのＣｙａＡの触媒ドメインの転位を阻害することが示された（３９）。これに関して、酸性Ｅ７タンパク質（ｐＫｉ＝４．１７）が、ＤＣのサイトゾルへのＣｙａＡのＮ末端ドメインの効率的な転位を妨害する可能性があった。ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２は、ＤＣへの送達に好ましいように、３０〜４２残基に位置する負に荷電したアミノ酸のストレッチ（ＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡ）を除去するように特別に設計され、さらに、２個の正に荷電したアミノ酸（ＫＲ）を、ＨＰＶ１６−Ｅ７の挿入されたＮ末端ドメインの各側に導入した。第二に、Gmiraら（２５）は、ＣｙａＡ内に挿入された異種タンパク質の折りたたみ解除は、組換えタンパク質が標的細胞へと内部移行するために必須であることを実証した。Ｅ７ポリペプチドの２個の異なる断片を、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２の２個の異なる許容部位へ挿入することにより、Ｅ７の再折りたたみが防がれ、したがって、標的細胞へのその転位は促進されるはずである。
【０１４３】
腫瘍拒絶実験の時間経過中に、何匹かのマウスは、確立されたＴＣ−１腫瘍を以前に拒絶した後、より後になってＨＰＶ１６陽性腫瘍を増殖させ始めた。ＦＡＣＳ（登録商標）解析により、これらの腫瘍の細胞は、Ｈ−２Ｄｂ分子を発現していなかったことが判明した。この観察により、より著しく腫瘍細胞を根絶し、エスケープ機序による腫瘍の再発を防ぐために、組換えＣｙａＡワクチン接種の同様なブースター投与の可能性が考えられた。当該技術分野における他のチームのデータを心に置くと（３７、４０、４１）、それは、注射された組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ ＣｙａＡの全量を１００μｇ、すなわち０．５６ｎｍｏｌに上げた、マウスにおけるＣｙａＡワクチン接種のブースター投与に関連していた。この後者の観察を試験するための実験、並びに、ＣｙａＡの様々な投与法を試験するための実験を実施した。
【０１４４】
ＴＣ−１細胞で再攻撃した時、ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡで免疫化した生存マウスは、選択的に防御された。これは、これらの動物の脾臓細胞中のＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在に関連していた。この観察は、図４で観察される遅い再発は、腫瘍エスケープ機序に起因し、Ｅ７タンパク質に対する免疫が徐々に衰えていくことに起因するものではないということが強まった。Ｔｈエピトープを含む組換えＣｙａＡで免疫化したマウスのより良好な生存率により、同じ抗原に対するＴ細胞の支持が得られることにより、ＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７ＣＤ８＋Ｔ細胞が効果的に想起されることが示された。これに関して、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４０Ｌを通じて、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞に独特な分子的サインを刷り込む可能性があり、より向上した細胞機能を行なうための能力を付与する可能性があることが提唱された（４２）。
【０１４５】
ＨＰＶ関連新生物形成の処置のための新規免疫療法の試験のための確証されたモデルにおいて（２１）、本発明者らは、ＣｙａＡが、確立腫瘍の減退を誘導し、並びに、長い期間におよぶ腫瘍原性攻撃に対する防御を与えるための、効率的なベクターであることを実証した。現在開発されている他のアプローチとは異なり（１１）、ＣｙａＡを基礎とした免疫療法は、完全なタンパク質を挿入できるので、ＨＬＡ拘束性エピトープを選択する必要がなく、ウイルスベクターおよび／または発癌の可能性のあるＨＰＶ ＤＮＡ配列の使用が回避された。さらに、本発明者らは、ＣｙａＡの２個の異なる許容部位に挿入されたＨＰＶ−Ｅ７の２個の亜断片を含むＣｙａＡを用いて最善の結果を得た。
【０１４６】
この後者の構造物が、文献に記載の全てのＨＰＶ１６−Ｅ７ ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩエピトープを含むという事実により（８、４６）、ワクチン適用にＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２が選択されることが強まった。
【０１４７】
ここに提示したデータに基づいて、本発明者らは、ＨＰＶ感染に関連した子宮頚部および肛門の異常形成を標的化した臨床試験において、ＨＰＶ１６−Ｅ７を含むＣｙａＡの効力を試験する計画を立てた。
【０１４８】
実施例２
目的は、ヒトにおけるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８関連の悪性疾患を処置するための、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の両方に標的化した二価治療ワクチンを製造することであった。それ故、ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２およびＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２と呼ばれるワクチン候補を、設計し、作成し、産生し、精製した。ＨＨＤマウスは、Ｈ−２Ｄｂのα３膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（Ｄ）に連結したＨＬＡ＊０２０１のα１（Ｈ）およびα２（Ｈ）ドメインを含むＨＨＤ導入遺伝子を発現しているＨ−２Ｄ−／−β２ｍ−／−ダブルノックアウトマウスであった（α１ドメインは、ヒトβ２−ミクログロブリンに連結している）。したがって、ＨＨＤマウスにより発現されるＭＨＣクラスＩ分子のみが、改変されたＨＬＡ＊０２０１分子であった（Pascolo et Lemonnier）。
【０１４９】
この実験の目標は、
１ 組換えＣｙａＡが、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質のＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープを送達できること、
２ １個のＨＰＶ組換えｃｙａＡが他を上回る免疫優性の現象はないこと
を実証することであった。
【０１５０】
そうするために、ＨＨＤマウスに、５０μｇのＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２（３匹のマウス）、ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２（３匹のマウス）、またはＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２＋ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２（５匹のマウス）を同じ（眼窩後の）注射（２００μｌ中５０μｇ）で静脈内にワクチン接種した。７日後、プールした脾臓細胞を、インビトロで、文献に記載またはＳＹＦＰＥＩＴＨＩソフトウェアから推定される、ＨＰＶ１６Ｅ７またはＨＰＶ１８Ｅ７のＨＬＡ−Ａ２ペプチドで再刺激した。
【０１５１】
ＣＴＬ活性は、５１Ｃｒ放出を使用して５日後にアッセイした。標的細胞は、異なる関連ペプチドをのせたまたはのせていない、ＨＨＤ−ＥＬ４細胞であった。
【０１５２】
結果により、ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２またはＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２でのワクチン接種は、インビトロでの自己ペプチドによる再刺激後に、ＨＰＶ１６Ｅ７またはＨＰＶ１８Ｅ７ペプチドをのせたＥＬ４−ＨＨＤ細胞の特異的溶解を誘導したことが示された。
【０１５３】
この結果によりまた、ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２をＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２と共に注射することにより、関連ペプチドに対する類似の応答が観察されたので、いずれのＨＰＶ組換えＣｙａＡの免疫原性も損なわなかった。
【０１５４】
この結果により、ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２およびＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２は、インビボにおいて、それぞれのＥ７タンパク質のヒトＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープに対する細胞毒性応答を誘導できることが実証された。
【０１５５】
マウス
特定の病原体を含まないＨＨＤマウスを、パスツール研究所で育成した。１１匹の６〜１０週令の雄を、この実験に使用した。
【０１５６】
試薬および生物学的材料
試薬および緩衝液
ＲＰＭＩ１６４０培地−グルタマックス（インビトロジェン・ギブコ、参照番号：６１８７０１０）
エタノール７０゜（Prolabo、参照番号：ＭＣ３１１６３１）
ペニシリン−ストレプトマイシン（インビトロジェン・ギブコ、参照番号：１５１４０１２２）
ウシ血清アルブミン（ＦＢＳ）（PERBIO、参照番号：ＣＨ３０１６０．０３）
βメルカプトエタノール（バイオラッド、参照番号：１６１−０７１０）
熱分解水
ブルートリパン（シグマ、Ｔ−８１５４）
５１Ｃｒ
Triluxシンチラント（Wallac）
【０１５７】
ペプチド
５個の合成ペプチド（Neosystem、ストラスブール、フランス）を、５１Ｃｒ放出アッセイの前の脾臓細胞のインビトロでの刺激に使用した：
ＨＰＶ１６−Ｅ７ ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープ（１）に対応する、Ｅ７１１〜２０（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ、一文字でアミノ酸をコード、＃２５３）、
ＨＰＶ１６−Ｅ７ ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープ（１）に対応する、Ｅ７８２〜９０（ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ、＃２５８）、
ＨＰＶ１６−Ｅ７ ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープ（１）に対応する、Ｅ７８６〜９３（ＴＬＧＩＶＣＰＩ、＃２５５）
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩソフトウェアにより予測されるＨＰＶ１８−Ｅ７ ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープに対応する、Ｅ７７〜１５（ＴＬＱＤＩＶＬＨＬ、＃２５１）、
ＨＰＶ１８−Ｅ７ ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープ（２）に対応する、Ｅ７８６〜９４（ＦＱＱＬＦＬＮＴＬ、＃２５７）。
【０１５８】
ペプチドは、無菌で無発熱原性の水（＃２５３、＃２５５、＃２５１）または無発熱原性の水、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３；アセトニトリル（５０／５０）（＃２５７および＃２５８）で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【０１５９】
組換えアデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）
２個のＣｙａＡをこの実験において試験した：
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２。
【０１６０】
これらのＣｙａＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲにおいて、酵素的に不活性なＣｙａＡ（ＣｙａＡＥ５）をコードするプラスミドｐＴＲＡＣＥ５の誘導体を使用することにより発現させた。プラスミドの作成、全ての組換えタンパク質の産生および精製は、ＨＰＶ１６−Ｅ７エピトープを有する組換えB.pertussisアデニル酸シクラーゼの作成および精製に関する実施例１において先に記載したように製造したが、エピトープは、本実験で使用したものであった。
【０１６１】
８Ｍ尿素中にそれぞれ１．２２ｍｇ／ｍｌおよび１．３３ｍｇ／ｍｌのＣｙａＡを含むストック溶液（−２０℃で保存）を解凍し、マウスに静注内投与する前に、ＰＢＳ（ギブコＢＲＬ）で２５０μｇ／ｍｌに希釈した。したがって、尿素の最終濃度は、それぞれ、１．６Ｍから１．５Ｍの間であった。
【０１６２】
細胞系
ＥＬ４−ＨＨＤ細胞を、５１ＣｒＣＴＬアッセイにおいて標的として使用した。これらの細胞を、完全培地中に維持した：１０％熱不活性化ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および５×１０−５Ｍのβ２−メルカプトエタノール（ギブコＢＲＬ、Cergy-Pontoise、フランス）を補充したグルタマックスを含むＲＰＭＩ１６４０。
【０１６３】
方法
マウス免疫化
覚醒動物に、０．３ｍｌのインスリンシリンジ（テルモ）を用いて、（２００μｌ中５０μｇの）ＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２および／またはＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２の１回の静脈内（眼窩後の）注射により免疫化した。
【０１６４】
実験計画
表１は、各群のマウスに投与するワクチン候補および処置を記載した。
【０１６５】
【表９】
【０１６６】
ＣＴＬアッセイ
免疫化により誘導される細胞性免疫応答をインビトロで評価するために、麻酔した動物（ＣＯ２）を、免疫化の７日後に脾摘除した。ＣＴＬアッセイの前に、各群の脾臓細胞をプールした。
【０１６７】
−ＣＴＬの刺激（１個の脾臓あたり２個のフラスコＴ２５を準備）
−脾臓をサンプリングし、ＲＰＭＩ１６４０−グルタマックス１％Ａｂ中でそれらを破粉した。
−デカント。
−１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離。
−細胞を、２ｍｌのＲＭＰＩ１６４０−グルタマックス１％Ａｂ−１０％ＦＣＳ−５．１０−５Ｍ β−メルカプトエタノール（完全培地：ＣＭ）に再懸濁。
−各々のＴ２５フラスコに、
１０ｍｌのＣＭ
５×１０７個のエフェクター細胞
１０μｇ／ｍｌの最終濃度の関連ペプチド
を入れた。
フラスコを動かすことなく５日間インキュベート。
【０１６８】
−細胞毒性アッセイ
１）標的細胞：
−前日、標的細胞を３分の１または２分の１に希釈して、指数関数的な増殖期のそれらを収集。
−１５ｍｌのチューブに移す。
−１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離。
−１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−１％Ａｂ中に再懸濁。
−数を数えた。
−２個のチューブを準備：１個はペプチドを含み、１個はペプチドを含まない。
−１５０μｌ中に以下を再懸濁：
２個の中の１個のチューブにペプチド（５０μモル）
３×１０６個の細胞につき１００μＣｉの５１Ｃｒ（５０μｌ）。
１５０μｌとするための培地。
−３７℃の水浴中で１時間インキュベートし、１５分毎に穏やかに振とう。
【０１６９】
２）エフェクター細胞
−約５ｍｌの上清をパスツールピペットを用いて廃棄。
−ピペッティングにより細胞を完全に再懸濁。
−１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離。
−１ｍｌのＣＭに再懸濁。数を数えた。
−１０７個の細胞／ｍｌに調整。
−次のエフェクター／標的比：２００／１、１００／１、５０／１、２５／１、１２／１、６／１が得られるように希釈。
−１００μｌ／Ｕ底マイクロタイタープレートのウェルで分配。
−標的細胞の調製を完成する間、３７℃で７．５％ＣＯ２中でインキュベート。
【０１７０】
３）アッセイ：
−標的細胞を、１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−１％Ａｂで洗浄。
−再度１０ｍｌのＣＭで洗浄。
−２ｍｌのＣＭに再懸濁。
−数を数えた。
−１０５個の細胞／ｍｌに調整。
−１００μｌ／ウェルで分配。
−自発的放出のための６個のウェルを準備（ＣＭ中１００μｌに調整）。
−最大放出のための６個のウェルを準備（１００μｌの２０％トリトンＸ−４０５を添加）
−３７℃で７．５％ＣＯ２中で４〜５時間インキュベート。
【０１７１】
４）計測：
−２０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心分離。
−１００μｌのTriluxシンチラントを、フロッピーＰ９６マイクロタイタープレートに入れた。
−５０μｌの上清をサンプリングし、それをフロッピープレートに移した。
−プレートを、プラスチックフィルムテープで封をした。
−wallacカウンターで次の日に計測した。
【０１７２】
ＨＰＶ１６Ｅ７ＣＴＬ特異的応答
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２により誘導されるＣＴＬ応答を図１１に示した。
【０１７３】
ＨＰＶ１８Ｅ７ＣＴＬ特異的応答
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２により誘導されるＣＴＬ応答を図１２に示した。
【０１７４】
結論
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２およびＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２の両方が、このキメラＨＨＤモデルにおいて、それぞれのＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドに対して特異的なＣＴＬを誘導できた。
【０１７５】
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２およびＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２の同時注射により、各々の個々のＣｙａＡがそれぞれの特異的ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドに対するＣＴＬを誘導する能力は妨害されなかった。これにより、１つの構造物が他の構造物よりも上回る免疫優性を示す現象はなかったことが示された。これには、二価ワクチンの製造戦略に関する、重要な観察が含まれていた。
【０１７６】
実施例３
ＨＰＶ１８のＥ７タンパク質並びにＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ７タンパク質を含む組換えアデニル酸シクラーゼの作成および免疫学的評価
肛門生殖管の癌は、女性における全ての癌の１２％近くを占め、子宮頚部癌（ＣｘＣａ）は世界中で二番目に最も頻繁に起こる婦人科の癌となっている。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染がＣｘＣａの原因である可能性があるという重要な観察は、その後、疫学的な研究により確認された。ＣｘＣａに関連する最も広まっているＨＰＶのタイプは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８である（それぞれ５５％および１２％の罹患率）（Clifford、2003）。より多くの人口を網羅するために、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ７を有する二価治療ワクチンを作成することが決定された。２つの可能性ある戦略が試験された：（ｉ）第一の戦略は、一方はＨＰＶ１６のＥ７を有する他方はＨＰＶ１８のＥ７を有する、等モル量の２個の組換えＣｙａＡを混合する；（ｉｉ）第二の戦略は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方のＥ７タンパク質を有する組換えＣｙａＡを作成する。本リポートは、ＨＰＶ１８のＥ７または両方のウイルスのＥ７を有する組換えＣｙａＡの作成を記載した。構造物の免疫原性は、ＣＴＬアッセイにおいて試験した。
【０１７７】
エピトープ同定
ＨＰＶ１８Ｅ７のアミノ酸配列を、Ｈ−２ｂエピトープの探索中に、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（www.syfpeithi.de）にかけた。このソフトウェアは、アルゴリズムを使用して、画定されたＭＨＣ分子に結合する可能性があるエピトープを予測する。ソフトウェアは、２５のスコアで、Ｈ−２Ｄｂ分子により拘束される推定エピトープを選出した。通常、本発明者らは、そのスコアが２２を超えた場合にエピトープであると判断した。それ故、推定ペプチドのＩＤＧＶＮＨＱＨＬが、Neosystemにより合成された。
【０１７８】
組換えＣｙａＡの作成
ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８ΔＥ７を産生するためにプラスミドの作成に使用された戦略を示したスキームを、図１３および１４に示した。
【０１７９】
ＣＴＬアッセイ
この実験の目標は、インビボにおいて、完全なＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質またはその断片並びにＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質の両方を有する、組換えＣｙａＡによるＣＴＬの誘導を実証することであった。標的化されたＨ−２Ｄｂエピトープは、コンピューター予測ソフトウェアから得られたＨＰＶ１８Ｅ７４１〜４９（ＩＤＧＶＮＨＱＨＬ）およびＨＰＶ１６Ｅ７４９〜５７であった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５０μｇのＣｙａＡ−ＣｙｓＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７、またはＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８ΔＥ７（各群において２匹）を静注によりワクチン接種した。７日後、プールした脾臓細胞を、インビトロで、ペプチドＨＰＶ１８Ｅ７４１〜４９（１０μｇ／ｍｌ）、ＯＶＡ２５７〜２６４（１μｇ／ｍｌ）またはＨＰＶ１６Ｅ７４３〜７７（１μｇ／ｍｌ）で再刺激した。ＣＴＬ活性は、５１Ｃｒ放出を使用して５日後にアッセイした。標的細胞は、ＨＰＶ１８Ｅ７４１〜４９ペプチド（８ｎｍｏｌ）をのせたまたはのせていないＥＬ４細胞、あるいは、ＴＣ−１細胞であった。図中の説明文は：ワクチン接種／再刺激を示す。例：ＯＶＡ／ＯＶＡは、ＣｙａＡＥ５−ＣｙｓＯＶＡでワクチン接種し、ＯＶＡペプチドで再刺激したマウスを意味する。
【０１８０】
これらの結果（図１６）により、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Ｆｕｌｌとは対照的に、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２は、インビボにおいて、処理およびＭＨＣクラスＩ経路に提示するために、コンピューターで予測したＨＰＶ１８−Ｅ７タンパク質のＣＤ８＋Ｈ−２Ｄｂ拘束性Ｔ細胞エピトープを、免疫担当細胞のサイトゾルへと送達でき、これにより、強力なＣＴＬ応答を誘起できることが示された。ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２が、ＨＰＶ１８Ｅ７４１〜４９に対するＣＴＬ応答を刺激できることは奇妙である。なぜなら、この組換えＣｙａＡは、ペプチドＨＰＶ１８Ｅ７４１〜４９の最初の２個のアミノ酸を欠失しているからである。しかし、ＨＰＶ１８Ｅ７断片４３〜１０５の挿入部位においては、１個のアラニンおよび１個のセリンがあり、これにより、推定ペプチドは、ここで、ＩＤＧＶＮＨＱＨＬではなく、ＡＳＧＶＮＨＱＨＬであった。syfpeithiにかけると、このペプチドは、２９のスコアで出て来た（天然のものは２５）。それ故、本発明者らのクローニングにより、このペプチドの最初のアミノ酸を置換することにより、本発明者らは、潜在性から免疫原性へとすることができるようであった。これは、ＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質のエピトープが、Ｈ−２Ｄｂの関連で記載された始めてのケースであった。
【０１８１】
非特異的バックグラウンドレベルが高いにも関わらず、これらの結果によりまた、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７ＦｕｌｌおよびＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７Δは、インビボにおいて、処理およびＭＨＣクラスＩ経路に提示するために、ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質のＨ−２Ｄｂ拘束性Ｔ細胞エピトープを、免疫担当細胞のサイトゾルへと送達でき、これにより、強力なＣＴＬ応答を誘起できることが示された。ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７Δは、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７Ｆｕｌｌと比べて高いその能力を示した。これらのデータによりまた、初めて、大きなポリペプチド断片（２０３までのアミノ酸）を有するＣｙａＡは依然として免疫原性であることが示された。
【０１８２】
さらなる実験を実施し、図１６に記載のことを確認した。各群の残りの２匹のマウスを、最初のものとは別々に処置した。実験設定は類似していた。結論は、ＣＴＬによるＣｙａＡＥ５−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２ワクチン接種マウスのＥＬ４細胞の高い非特異的溶解レベルは、過剰のＨＰＶ１８Ｅ７４１〜４９ペプチドがフラスコに残っていることに起因することを除いて、図１６のものと同一であった。
【０１８３】
またＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８ΔＥ７でワクチン接種したマウスの脾臓細胞ではＴＣ−１細胞の溶解は認められたが、今回ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７でワクチン接種したマウスには認めれられなかった。この実験において、非特異的バックグラウンドは４０％でピークに達した。それにも関わらず、図１７から導き出せる結論は、図１６から導いた結論を確認した、すなわち：
−ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２は、インビボにおいて、処理およびＭＨＣクラスＩ経路への提示のために、コンピューターで予測したＨＰＶ１８−Ｅ７タンパク質のＣＤ８＋Ｈ−２Ｄｂ拘束性Ｔ細胞エピトープを、免疫担当細胞のサイトゾルへと送達でき、これにより強力なＣＴＬ応答を誘起できる。これは、ＨＰＶ１８Ｅ７タンパク質のエピトープが、Ｈ−２Ｄｂの関連で記載された最初のケースであった。
−大きなポリペプチド断片（２０３までのアミノ酸）を有する組換えＣｙａＡは、依然として免疫原性であった。
【０１８４】
結論
ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ７を有する二価治療ワクチンを作成することが決定された。２つの可能性ある戦略が考えられた：（ｉ）第一の戦略は、一方はＨＰＶ１６のＥ７を有する他方はＨＰＶ１８のＥ７を有する、等モル量の２個の組換えＣｙａＡを混合する；（ｉｉ）第二の戦略は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方のＥ７タンパク質を有する組換えＣｙａＡを作成する。本結果は、ＨＰＶ１８のＥ７または両方のウイルスのＥ７を有する組換えＣｙａＡの作成を記載した。構造物の免疫原性は、ＣＴＬアッセイにおいて試験した。
【０１８５】
本研究の主な結論は、考えられている両方の戦略が、実現可能であることである。なぜなら、ＨＰＶ１８Ｅ７の配列内に潜在性Ｈ−２Ｄｂ拘束性エピトープが初めて判明したため、ＨＰＶ１８Ｅ７亜断片を有する組換えＣｙａＡが機能的であるからである。さらに、ＨＰＶ１６および１８ウイルスの両方のＥ７タンパク質（または亜断片）を有する組換えＣｙａＡは、ＴＣ−１細胞により天然に提示されるＨ−２Ｄｂ拘束性ＨＰＶ１６Ｅ７エピトープに対するＣＴＬ応答を刺激できるので、依然として最も興味深いことに免疫原性であった。
【０１８６】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１Ａ】ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡの作成および精製。（Ａ）関連する制限酵素部位および挿入配列が示されている、ｐＴＲＡＣＥ５のマップ図。（Ｂ）ＣｙａＡの酵素活性を阻害するジペプチドＬＱの挿入部位を示すＣｙａＡの図解。ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質挿入断片の位置も示されている。ＨＰＶ１６−Ｅ７ Ｈ−２ｂ拘束性エピトープには下線を付している。
【図１Ｂ】ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡの作成および精製。（Ｃ）ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。５μｇの精製タンパク質を、４〜１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、クーマシーブルーにより染色した。レーン１：野生型ＣｙａＡ；レーン２：ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７；レーン３：ＣｙａＡ−Ｅ７ＦＵｌｌ；レーン４：ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２。（Ｄ）ＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡのウェスタンブロット解析。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、精製タンパク質を、ニトロセルロース膜にエレクトロトランスファーし、続いてこれをマウスモノクローナル抗ＨＰＶ１６−Ｅ７抗体でプローブした。レーン１、２：野生型ＣｙａＡ（それぞれ２および０．４μｇ）；レーン３、４、および５：それぞれ、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７、ＣｙａＡ−Ｅ７ＦＵｌｌおよびＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２、各々０．４μｇのタンパク質。
【図２】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡによるＴ細胞応答の誘導。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６（ａ、ｂ、ｃ）、ＴＡＰ１−／−（ｄ）、ＭＨＣクラスＩＩ−／−（ｅ）、およびＣＤ４０−／−（ｆ）マウスを、０日目に、５０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７（ａ）、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（ｂ）、またはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（ｃ、ｄ、ｅおよびｆ）の静注により免疫化した。数日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を、インビトロで、１μｇ／ｍｌのＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドを用いて、照射された同系脾臓細胞の存在下で５日間再刺激し、ＴＣ−１標的細胞（普通の四角）またはＥＬ４（白抜きの四角）に対するエフェクターとして使用した。非関連エピトープＯＶＡ２５７〜２６４を有するＣｙａＡＥ５−ｃｙｓＯＶＡで処置し、インビトロで１μｇ／ｍｌのＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドを用いて、照射された同系脾臓細胞の存在下で５日間再刺激したマウスの脾臓細胞も表示する（ａ、普通の三角）。標的溶解は、５１Ｃｒ放出により評価した。データは、特異的溶解値の中間パーセンテージ（ｎ＝動物の数を各グラフに示す）並びに四分位範囲を示す。（Ｂ）組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡでの免疫化後のＨＰＶ１６−Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の検出。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ａと同様に、ＣｙａＡＥ５−ｃｙｓＯＶＡ（丸）、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７（四角）、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（三角）、またはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（菱型）を用いて免疫化した。数日後、免疫化マウスから単離した脾臓細胞を、インビトロで、刺激せずに（すなわち、ペプチドなし、白抜きの記号）、または、１μｇ／ｍｌのＥ７４９〜５７ペプチド（普通の記号）を用いて刺激して、同系照射脾臓細胞の存在下で３６時間培養した。データは、脾臓１個あたりのＳＦＣの数として表現し、３回の独立した実験の個々のマウスの結果を、各群に対して示す。横棒は、各群の応答の中間値を示す。
【図３】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡは、ＨＰＶ１６Ｅ７特異的Ｔｈ１応答を誘導する。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、未処置のままにするか（四角）、または、５０μｇのＣｙａＡＥ５−ｃｙｓＯＶＡ（丸）、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７（三角）、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（逆三角）、もしくはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（菱型）を用いて静注により抗原刺激した。数日後、脾臓細胞を、インビトロで、１０μｇ／ｍｌのＨｉｓ−Ｔａｇ−ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質で刺激し、上清を、ＩＦＮ−γ含量について７２時間後に試験した。４回の独立した実験の個々のマウスの結果を示し、２個の複製ウェルの上清に放出されたＩＦＮ−γの濃度として表現する。再刺激しなかった脾臓細胞で得られたバックグラウンドを差し引く。挿入図：１μｇ／ｍｌのＥ７４３〜７７ペプチドを用いたインビトロでの刺激。横棒は、各群の応答の中間値を示す。（Ｂ）上清をＩＬ−５含有量について試験したこと以外は、（Ａ）と同様。２回の独立した実験の個々のマウスの結果を示し、２個の複製ウェルの上清中に放出されたＩＬ−５の濃度として表現する。
【図４Ａ】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡを用いた治療的ワクチン接種は、確立された腫瘍を根絶する。（実験Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目に、５×１０４個のＴＣ−１腫瘍細胞を用いて移植した。１０日目に、マウスを、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７（Ｃ）、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（Ｄ）、またはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（Ｅ）の１回の静注により処置した。未処置のままのマウス（Ａ）またはＣｙａＡＥ５−ｃｙｓＯＶＡを注射したマウス（Ｂ）を対照として採用した。腫瘍サイズが１０００ｍｍ３に達した時、または不必要な苦しみを避けるために動物の衛生状態により要求される場合にはいつでも（壊死腫瘍、２０％を超える急速な体重減少）、マウスを屠殺した。後に進行性の腫瘍を発症したＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌで処置した２匹のマウス（＊）を、さらに調べるために屠殺した（図６参照）。
【図４Ｂ】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡを用いた治療的ワクチン接種は、確立された腫瘍を根絶する。（実験Ｂ）実験設定については（実験Ａ）と同様。＋１０および＋１７日目に、１０μｇのＣｙａＡＥ５−ＣｙｓＯＶＡ（ａ、実線）または１０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（ｂ）を用いて耳真皮に治療的ワクチン接種を実施した。各曲線は、１匹の動物における腫瘍増殖を示す。２匹の未処置の動物が含まれていた（ａ、点線）。各々の四分の一区の右上には（ａ、ｂ）、屠殺動物の数と、含まれる動物の全数が示されている。これらのマウスの生存曲線を示す（ｃ）。未処置（白抜きの三角）、ＣｙａＡＥ５−ＣｙｓＯＶＡを用いたニセ処置（閉じた三角）、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２を用いた処置（丸）。
【図５】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡでの治療的ワクチン接種により、生存が延長される。治療的ワクチン接種は、図４に記載した通りに行なった。ＴＣ−１腫瘍細胞の注射時に、マウス（１群あたり５〜１０匹）を、グラフに示されているように＋１、＋５、または＋１０日目にＨＰＶ１６−Ｅ７組換えＣｙａＡで免疫化した。マウスを未処置のまま（普通の四角、実線）、ＣｙａＡＥ５−ｃｙｓＯＶＡでニセ処置（白抜きの四角、点線）、またはＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７（白抜きの三角）、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（白抜きの丸）、もしくはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（白抜きの菱型）で処置した。＋５日目の治療実験において、ＣｙａＡ−Ｅ７ＦｕｌｌおよびＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で処置した動物の生存曲線は、完全に重ね合わさることが特筆される。どの場合においても、組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡ処置動物の生存は、未処置またはニセ処置マウスと比べて有意に延びている（ｐ＜０．０５）。
【図６】その後に増殖してきた腫瘍から外移植したＴＣ−１腫瘍細胞は、Ｈ−２Ｄｂ分子の発現を欠失している。腫瘍拒絶実験において、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌをワクチン接種した数匹の動物では、実験の時間経過中、後になって腫瘍が成長した（図４、＊）。腫瘍を外移植するために、２匹の動物を屠殺した。これらの腫瘍細胞、ＴＣ−１Ａ１およびＡ２並びに天然ＴＣ−１細胞を、Ｈ−２Ｄｂ分子の発現レベルについてＦＡＣＳ（登録商標）により解析した（太線）。蛍光強度の中間値（ＭｅｄＦｉ）を示す。アイソタイプ対照で得られた結果を示す（グレーの陰影）。
【図７】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡで処置したマウスにおけるＨＰＶ１６−Ｅ７４９〜５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の持続性。治療的実験セットにおいて、ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７（Ａ）、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（Ｂ）、またはＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（Ｃ）で免疫化し、ＴＣ−１移植にも関わらず生存しているＣ５７ＢＬ／６マウスを屠殺し、脾臓細胞を、インビトロで、１μｇ／ｍｌのＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７ペプチドで、照射同系脾臓細胞の存在下で５日間再刺激した。標的溶解（ＴＣ−１、普通の四角；ＥＬ４、白抜きの四角）を、５１Ｃｒ放出により評価した。データは、非特異的溶解の数値のパーセンテージの中間値（各群においてｎ＝６）、並びに、四分位範囲を示す。エフェクターと標的の最大比において２０％以上の特異的溶解により決定される対応する動物の数を、四分の一区の右上部分に示す。
【図８】組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡにより誘導されるＴＣ−１腫瘍増殖に対する長期防御。治療的実験セットにおいて、ＴＣ−１移植にも関わらず生存しているＣ５７ＢＬ／６マウスに、１００日目に、５×１０４個のＴＣ−１細胞を再移植した。年齢の適合した未処置マウスを、対照として採用した（Ａ）。ＣｙａＡ−Ｅ７４９〜５７、ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ、およびＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２で最初に免疫化したマウスにおける腫瘍の増殖を示す（それぞれ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）。腫瘍サイズが１０００ｍｍ３に達した時、または動物の衛生状態により要求される場合にはいつでも、マウスを屠殺した。（Ｅ）未処置（白抜きの四角）；もしくはＣｙａ−Ｅ７４９〜５７（白抜きの三角）；ＣｙａＡ−Ｅ７Ｆｕｌｌ（白抜きの丸）；もしくは、ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（白抜きの菱型）で免疫化し、ＴＣ−１細胞を再移植した（移植日を０とする）動物の生存曲線。いずれの場合においても、組換えＨＰＶ１６−Ｅ７ＣｙａＡ処置動物の生存は、未処置またはニセ処置マウスに比べて有意に延びた（ｐ＜０．０５）。
【図９】ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２治療活性と、ＣｐＧ ＯＤＮ１８２６アジュバントの添加されたＨＰＶ１６Ｅ７４３〜７７の治療活性との比較。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目に、５×１０４個のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下移植した。＋１０および＋１７日目に、マウスに、１０μｇのＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７（ｎ＝５、三角）、１μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６（ｎ＝５、四角）、１０μｇのＨＰＶ１６−Ｅ７４３〜７７＋１μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６（ｎ＝５、菱型）、１０μｇのＣｙａＡ−ＣｙｓＯＶＡ（ｎ＝３、逆三角）、または１０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（ｎ＝７、丸）を１回皮内注射して処置した。腫瘍サイズが１０００ｍｍ３を超えた時、または動物の衛生状態により要求される場合にはいつでも、マウスを屠殺した。
【図１０】ＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２のＴＣ−１腫瘍拒絶誘導能に対する、ＣｙａＡに対する予備免疫の効果の解析。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスは未処置のままとするか、または、９０もしくは３０日前に、７日間の間隔で１０μｇのＣｙａＡＥ５を２回皮内注射することにより免疫化した。１日前に、動物の採血をし、血清を個々に抗ＣｙａＡＥ５ ＩｇＧの存在についてＥＬＩＳＡにより評価した。結果は、希釈対Ａ４９２をプロットした線形回帰分析により計算した個々の抗体力価として表現する。横棒は、各群の応答の中間値を示す。（Ｂ）未処置（ａ、ｂ）、３０日前にＣｙａＡＥ５で免疫化（ｃ、ｄ）、および９０日前にＣｙａＡＥ５で免疫化した（ｅ、ｆ）動物に、０日目に、５×１０４個のＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、＋１０および＋１７日目に、１０μｇのＣｙａＡ−ｃｙｓＯＶＡ（ａ、ｃ、ｅ）、または１０μｇのＣｙａＡ−Ｅ７Δ３０〜４２（ｂ、ｄ、ｆ）を１回皮内注射することにより処置した。挿入図（ｂ、ｄ、ｆ）は、０〜３５日間の期間のクローズアップであり、全ての動物が、ワクチン接種をした時点で触診できる腫瘍を有していたことを示す。各曲線は、１匹の動物における腫瘍増殖を示す。腫瘍サイズが１０００ｍｍ３を超えた時、または動物の衛生状態により要求される場合にはいつでも、マウスを屠殺した。各々の四分の一区の右上には、屠殺動物の数と、含まれる動物の全数が示されている。
【図１１】ＨＨＤマウスにおけるＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２によるＣＴＬ応答の誘導。ＥＬ４−ＨＨＤ細胞へのペプチドの添加を、各グラフの上に示す。続く表には、カラムヘッダーＶａｃｃの下で注入されたＣｙａＡのタイプ（ＨＰＶ１７Ｅ７またはＨＰＶ１８Ｅ７に関する）、および、カラムヘッダーＳｔｉｍの下でインビトロでの再刺激に使用されたペプチドが示されている。見てとれるように、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２による免疫化後、本発明者らは、ペプチド＃２５３のみに特異的なＣＴＬを誘導することができた（右パネル）。インビトロでペプチド＃２５５で再刺激した脾臓細胞は、ペプチド＃２５３で被覆したＥＬ４−ＨＨＤ細胞に対して細胞毒性ではなかったため、このＣＴＬ活性は特異的であった（右パネル）。２個のその他のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドに対するＣＴＬ特異的応答がないことは、異なる現象から生じている可能性がある：（ｉ）ペプチド＃２５３の免疫優性、（ｉｉ）ＥＬ４−ＨＨＤ細胞のプロテアソームによりペプチド＃２５５および＃２５８が処理されないこと、（ｉｉｉ）ペプチド＃２５８の溶解度が低く、このため本発明者らはアセトニトリル（５０％）を使用しなければならず、これは細胞に対して毒性である可能性がある。最も興味深いことには、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２の同時注射は、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２のＣＴＬ誘導能を妨害しなかった（右パネル）。
【図１２】ＨＨＤマウスにおけるＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２によるＣＴＬ応答の誘導。ＥＬ４−ＨＨＤ細胞へのペプチドの添加を、各グラフの上に示す。以下の表には、カラムヘッダーＶａｃｃの下で注入されたＣｙａＡのタイプ（ＨＰＶ１６Ｅ７またはＨＰＶ１８Ｅ７に関する）、および、カラムヘッダーＳｔｉｍの下でインビトロでの再刺激に使用されたペプチドが示されている。見てとれるように、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２による免疫化後、本発明者らは、ペプチド＃２５１のみに特異的なＣＴＬを誘導することができた（左パネル）。インビトロでペプチド＃２５７で再刺激した脾臓細胞は、ペプチド＃２５１で被覆したＥＬ４−ＨＨＤ細胞に対して細胞毒性ではなかったため、このＣＴＬ活性は特異的であった（左パネル）。ＨＰＶ１６Ｅ７ ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドと同様に、ＨＰＶ１８Ｅ７＃２５７ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドに対するＣＴＬ特異的応答がないことは、異なる現象から生じている可能性がある：（ｉ）ペプチド＃２５１の免疫優性、（ｉｉ）ＥＬ４−ＨＨＤ細胞のプロテアソームによりペプチド＃２５７が処理されないこと、（ｉｉｉ）ペプチド＃２５７の溶解度が低く、このため本発明者らはアセトニトリル（５０％）を使用しなければならず、これは細胞に対して毒性である可能性がある。最も興味深いことには、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２の同時注射は、ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２のＣＴＬ誘導能を妨害しなかった（左パネル）。
【図１３】ｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ７ＨＰＶ１８の作成。
【図１４Ａ】ｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ７ΔＨＰＶ１６＋１８の作成。 ３つのプラスミド調製ステップを開示する。
【図１４Ｂ】ｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ７ΔＨＰＶ１６＋１８の作成。 ３つのプラスミド調製ステップを開示する。
【図１４Ｃ】ｐＴＲＡＣＥ５−Ｅ７ΔＨＰＶ１６＋１８の作成。 ３つのプラスミド調製ステップを開示する。
【図１５】ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Ｆｕｌｌ ＣｙａＡ−ＨＰＶ１８Ｅ７Δ３２〜４２ ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７Ｆｕｌｌ ＣｙａＡ−ＨＰＶ１６＋１８Ｅ７Δをコードするポリヌクレオチドのマップ。
【図１６】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨＰＶ１８Ｅ７を有する組換えＣｙａＡによるＣＴＬの誘導。
【図１７】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨＰＶ１８Ｅ７を有する組換えＣｙａＡによるＣＴＬの誘導。寄託されている材料（Ｉ−３１９０およびＩ−３１９１）は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲに含まれ、ルリアブロス（ＬＢ）培地中で増殖させることができ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢに接種し、１７５ｒｐｍで振とうし照射しながら空気中で３０℃でインキュベートできる。７〜１０％ＤＭＳＯを含むＬＢ中での一晩の保存が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有する１個または数個のポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的化するという前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持している、前記組換えタンパク質。
【請求項２】
ＣｙａＡタンパク質断片は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８抗原提示細胞を標的化するという前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持している、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
ＣｙａＡタンパク質断片は、標的化細胞のサイトゾルへの前記ポリペプチドのエピトープの転位または前記ポリペプチドの転位を可能とするというＣｙａＡの特性を保持している、請求項１または２に記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
ＣｙａＡタンパク質断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されている１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有するポリペプチドを含む請求項１〜３のいずれかに記載の組換えタンパク質であって、前記断片は、約３０〜約１３００アミノ酸残基を含み、前記断片は、ＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基１２０８〜１２４３またはＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基１１６６〜１２８１を包含する、前記組換えタンパク質。
【請求項５】
前記ポリペプチドおよび／または数個のポリペプチドが一緒になって、約５〜約５００、または約５〜約２００、または約１０〜約５０アミノ酸残基、または約３０もしくは５０〜２００アミノ酸残基を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項６】
前記ポリペプチドに対する抗原特異的応答を誘起することのできる、請求項５に記載の組換えタンパク質。
【請求項７】
１個または数個のエピトープを有する少なくとも１個のポリペプチドが、発癌性ＨＰＶに由来している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項８】
１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２、またはＨＰＶ５８に由来している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項９】
１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、およびＥ５タンパク質から選択されるＨＰＶ抗原に由来している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１０】
１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８のＥ６またはＥ７タンパク質に由来している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１１】
１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有する複数のポリペプチドを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１２】
１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質に由来している、請求項９または１１に記載の組換えタンパク質。
【請求項１３】
１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、ＨＰＶ１８のＥ７タンパク質に由来している、請求項９または１１に記載の組換えタンパク質。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、全長Ｅ６またはＥ７タンパク質である、請求項９または１１に記載の組換えタンパク質。
【請求項１５】
ＣｙａＡ配列またはその断片の異なる許容部位に挿入されている複数のポリペプチドを含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１６】
複数のポリペプチドが、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質の残基１〜２９を含む断片もしくは残基４２〜９８を含む断片、または両方の断片を包含し、前記ポリペプチドは、ＣｙａＡタンパク質の異なる許容部位に挿入されている、請求項１５に記載の組換えタンパク質。
【請求項１７】
ポリペプチドが、アミノ酸配列
【表１】
を有する断片を包含する、請求項１２に記載の組換えタンパク質。
【請求項１８】
前記ポリペプチドまたはポリペプチド群が、分断された天然ＨＰＶ抗原に存在し、前記分断は、前記ＨＰＶ抗原の酸性領域における１個または数個のアミノ酸残基の欠失、および／または、アデニル酸シクラーゼの少なくとも２箇所の許容部位への前記ＨＰＶ抗原の少なくとも２個のポリペプチド断片の挿入からなる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１９】
１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、得られる組換えタンパク質の免疫原性を高めるために改変されている、請求項１〜１３または１８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２０】
ＣｙａＡタンパク質が、細菌性タンパク質である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２１】
ＣｙａＡタンパク質が、Bordetella属に由来する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２２】
ＣｙａＡタンパク質が、Bordetella pertussisに由来する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２３】
ＣｙａＡタンパク質の酵素活性が不活性化されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２４】
ＣｙａＡタンパク質の酵素活性が遺伝子的に不活性化されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２５】
ＣｙａＡタンパク質の酵素活性が、シクラーゼ活性に関与するＣｙａＡのアミノ酸配列部位にジペプチドが挿入されている結果、不活性化されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２６】
哺乳動物宿主において細胞性免疫応答を誘起できる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２７】
哺乳動物宿主において体液性免疫応答を誘起できる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２８】
ＣｙａＡタンパク質またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されている、様々なＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有する数個のポリペプチドを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、それぞれＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に由来する全長Ｅ７ポリペプチドであり、前記ポリペプチドは、ＣｙａＡタンパク質の異なる許容部位に挿入されている、請求項２８に記載の組換えタンパク質。
【請求項３０】
ｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７ＦＵＬＬ（ＣＮＣＭ Ｉ−３１９１）またはｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２（ＣＮＣＭ Ｉ−３１９０）から選択されるプラスミドに含まれる挿入物によりコードされる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項３１】
１個または数個の抗原の１個または数個のエピトープを有する１個または数個のポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的化するという前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持しており、前記エピトープの少なくとも１個は、亜優性潜在性Ｔ細胞エピトープであり、前記組換えタンパク質は、前記ポリペプチドに対する抗原特異的応答を誘起できる、前記組換えタンパク質。
【請求項３２】
潜在性エピトープが、ＨＰＶのエピトープ、特にＨＰＶのＥ７タンパク質のエピトープである、請求項３１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３３】
潜在性エピトープは、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質のエピトープ、特に配列ＩＤＧＶＮＨＱＨＬを有するエピトープである、請求項３２に記載の組換えタンパク質。
【請求項３４】
請求項１２〜３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドが、ベクターｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７ＦＵＬＬ（ＣＮＣＭ Ｉ−３１９１）またはｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２（ＣＮＣＭ Ｉ−３１９０）に含まれる、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項３４に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え発現ベクター。
【請求項３７】
細菌で発現させるのに適した請求項３６に記載の組換えベクター。
【請求項３８】
真核細胞、特に哺乳動物細胞での発現に適した請求項３６に記載の組換え発現ベクター。
【請求項３９】
ｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７ＦＵＬＬ（ＣＮＣＭ Ｉ−３１９１）またはｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２（ＣＮＣＭ Ｉ−３１９０）から選択される、請求項３６に記載の組換えベクター。
【請求項４０】
請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４１】
前記組換え宿主細胞が、Ｉ−３１９０またはＩ−３１９１号でＣＮＣＭに寄託されているＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項４０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４２】
生理的に許容されるビヒクル、賦形剤、担体、および／または希釈剤と共に、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項４３】
哺乳動物宿主において細胞性免疫応答を誘導する、請求項４２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
細胞媒介細胞溶解免疫応答を誘導する、請求項４３に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
免疫応答が、体液性免疫応答を含む、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
アジュバントおよび／または界面活性剤および／または免疫調節物質をさらに含む、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
ＨＰＶ感染を予防または処置するための、請求項４２〜４６に記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
癌免疫療法のための請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
宿主におけるＨＰＶ感染に起因する悪性形質転換の発症または存続の予防または処置のための、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
患者におけるＨＰＶ感染の処置または予防のための、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項５１】
患者におけるＨＰＶ感染に起因する悪性形質転換の発症または存続に対する免疫療法のための請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
宿主において細胞性および／または体液性免疫応答を誘起するのに適した、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のベクターを含む、ワクチン組成物。
【請求項５３】
ＨＰＶ感染を予防または処置するための、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のベクターを含む、薬物組成物。
【請求項５４】
宿主におけるＨＰＶ感染に起因する悪性形質転換の発症または存続の予防または処置のための、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のベクターを含む、薬物組成物。
【請求項５５】
癌免疫療法のための、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のベクターを含む、薬物組成物。
【請求項５６】
請求項１〜３３のいずれかに記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれかに記載のベクターを含む、ＨＰＶ感染の診断キット、またはＨＰＶ感染を免疫モニタリングするためのキット。
【請求項５７】
−哺乳動物、特にヒト患者から得られたＴ細胞を、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質にさらすこと、
−Ｔ細胞の活性化の改変を検出すること
を含む、ＨＰＶ感染をインビトロで診断する方法または免疫モニタリングする方法。
【請求項５８】
癌ウイルス感染の処置もしくは予防のための、または、このよう癌ウイルス感染に起因する悪性作用の処置もしくは予防のための、１個または数個の癌ウイルスの１個または数個の抗原の１個または数個のエピトープの挿入により改変される、細菌性タンパク質またはその断片を含む組換えタンパク質の使用。
【請求項５９】
細菌性タンパク質は、毒素または類毒素である、請求項５８に記載の組換えタンパク質の使用。
【請求項６０】
キメラＣｙａＡ−ポリペプチドタンパク質に含まれるポリペプチド中の未知または亜優性潜在性Ｔ細胞エピトープのスクリーニング方法であって、
ここで、ＣｙａＡは、請求項１〜３０のいずれかに開示されているアデニル酸シクラーゼまたはその断片であり、この方法は、
−前記キメラタンパク質を動物宿主に投与すること、
−前記宿主のＴ細胞応答、特にＣＴＬ応答を決定すること
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項６１】
前記ポリペプチドが、ＨＰＶ抗原、特にＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に由来する、請求項６０に記載の方法。
【請求項１】
１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有する１個または数個のポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的化するという前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持している、前記組換えタンパク質。
【請求項２】
ＣｙａＡタンパク質断片は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８抗原提示細胞を標的化するという前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持している、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
ＣｙａＡタンパク質断片は、標的化細胞のサイトゾルへの前記ポリペプチドのエピトープの転位または前記ポリペプチドの転位を可能とするというＣｙａＡの特性を保持している、請求項１または２に記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
ＣｙａＡタンパク質断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されている１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有するポリペプチドを含む請求項１〜３のいずれかに記載の組換えタンパク質であって、前記断片は、約３０〜約１３００アミノ酸残基を含み、前記断片は、ＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基１２０８〜１２４３またはＣｙａＡタンパク質のアミノ酸残基１１６６〜１２８１を包含する、前記組換えタンパク質。
【請求項５】
前記ポリペプチドおよび／または数個のポリペプチドが一緒になって、約５〜約５００、または約５〜約２００、または約１０〜約５０アミノ酸残基、または約３０もしくは５０〜２００アミノ酸残基を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項６】
前記ポリペプチドに対する抗原特異的応答を誘起することのできる、請求項５に記載の組換えタンパク質。
【請求項７】
１個または数個のエピトープを有する少なくとも１個のポリペプチドが、発癌性ＨＰＶに由来している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項８】
１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２、またはＨＰＶ５８に由来している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項９】
１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、およびＥ５タンパク質から選択されるＨＰＶ抗原に由来している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１０】
１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８のＥ６またはＥ７タンパク質に由来している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１１】
１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有する複数のポリペプチドを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１２】
１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質に由来している、請求項９または１１に記載の組換えタンパク質。
【請求項１３】
１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、ＨＰＶ１８のＥ７タンパク質に由来している、請求項９または１１に記載の組換えタンパク質。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、全長Ｅ６またはＥ７タンパク質である、請求項９または１１に記載の組換えタンパク質。
【請求項１５】
ＣｙａＡ配列またはその断片の異なる許容部位に挿入されている複数のポリペプチドを含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１６】
複数のポリペプチドが、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質の残基１〜２９を含む断片もしくは残基４２〜９８を含む断片、または両方の断片を包含し、前記ポリペプチドは、ＣｙａＡタンパク質の異なる許容部位に挿入されている、請求項１５に記載の組換えタンパク質。
【請求項１７】
ポリペプチドが、アミノ酸配列
【表１】
を有する断片を包含する、請求項１２に記載の組換えタンパク質。
【請求項１８】
前記ポリペプチドまたはポリペプチド群が、分断された天然ＨＰＶ抗原に存在し、前記分断は、前記ＨＰＶ抗原の酸性領域における１個または数個のアミノ酸残基の欠失、および／または、アデニル酸シクラーゼの少なくとも２箇所の許容部位への前記ＨＰＶ抗原の少なくとも２個のポリペプチド断片の挿入からなる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１９】
１個または数個のＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有するポリペプチドが、得られる組換えタンパク質の免疫原性を高めるために改変されている、請求項１〜１３または１８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２０】
ＣｙａＡタンパク質が、細菌性タンパク質である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２１】
ＣｙａＡタンパク質が、Bordetella属に由来する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２２】
ＣｙａＡタンパク質が、Bordetella pertussisに由来する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２３】
ＣｙａＡタンパク質の酵素活性が不活性化されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２４】
ＣｙａＡタンパク質の酵素活性が遺伝子的に不活性化されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２５】
ＣｙａＡタンパク質の酵素活性が、シクラーゼ活性に関与するＣｙａＡのアミノ酸配列部位にジペプチドが挿入されている結果、不活性化されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２６】
哺乳動物宿主において細胞性免疫応答を誘起できる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２７】
哺乳動物宿主において体液性免疫応答を誘起できる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２８】
ＣｙａＡタンパク質またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されている、様々なＨＰＶ抗原の１個または数個のエピトープを有する数個のポリペプチドを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、それぞれＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に由来する全長Ｅ７ポリペプチドであり、前記ポリペプチドは、ＣｙａＡタンパク質の異なる許容部位に挿入されている、請求項２８に記載の組換えタンパク質。
【請求項３０】
ｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７ＦＵＬＬ（ＣＮＣＭ Ｉ−３１９１）またはｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２（ＣＮＣＭ Ｉ−３１９０）から選択されるプラスミドに含まれる挿入物によりコードされる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項３１】
１個または数個の抗原の１個または数個のエピトープを有する１個または数個のポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、前記ポリペプチドは、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）タンパク質またはその断片の同じまたは異なる許容部位に挿入されており、前記ＣｙａＡ断片は、抗原提示細胞を標的化するという前記アデニル酸シクラーゼタンパク質の特性を保持しており、前記エピトープの少なくとも１個は、亜優性潜在性Ｔ細胞エピトープであり、前記組換えタンパク質は、前記ポリペプチドに対する抗原特異的応答を誘起できる、前記組換えタンパク質。
【請求項３２】
潜在性エピトープが、ＨＰＶのエピトープ、特にＨＰＶのＥ７タンパク質のエピトープである、請求項３１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３３】
潜在性エピトープは、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質のエピトープ、特に配列ＩＤＧＶＮＨＱＨＬを有するエピトープである、請求項３２に記載の組換えタンパク質。
【請求項３４】
請求項１２〜３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドが、ベクターｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７ＦＵＬＬ（ＣＮＣＭ Ｉ−３１９１）またはｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２（ＣＮＣＭ Ｉ−３１９０）に含まれる、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項３４に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え発現ベクター。
【請求項３７】
細菌で発現させるのに適した請求項３６に記載の組換えベクター。
【請求項３８】
真核細胞、特に哺乳動物細胞での発現に適した請求項３６に記載の組換え発現ベクター。
【請求項３９】
ｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７ＦＵＬＬ（ＣＮＣＭ Ｉ−３１９１）またはｐＴＲＡＣＥ５−ＨＰＶ１６Ｅ７Δ３０〜４２（ＣＮＣＭ Ｉ−３１９０）から選択される、請求項３６に記載の組換えベクター。
【請求項４０】
請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４１】
前記組換え宿主細胞が、Ｉ−３１９０またはＩ−３１９１号でＣＮＣＭに寄託されているＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項４０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４２】
生理的に許容されるビヒクル、賦形剤、担体、および／または希釈剤と共に、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項４３】
哺乳動物宿主において細胞性免疫応答を誘導する、請求項４２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
細胞媒介細胞溶解免疫応答を誘導する、請求項４３に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
免疫応答が、体液性免疫応答を含む、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
アジュバントおよび／または界面活性剤および／または免疫調節物質をさらに含む、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
ＨＰＶ感染を予防または処置するための、請求項４２〜４６に記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
癌免疫療法のための請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
宿主におけるＨＰＶ感染に起因する悪性形質転換の発症または存続の予防または処置のための、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
患者におけるＨＰＶ感染の処置または予防のための、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項５１】
患者におけるＨＰＶ感染に起因する悪性形質転換の発症または存続に対する免疫療法のための請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
宿主において細胞性および／または体液性免疫応答を誘起するのに適した、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のベクターを含む、ワクチン組成物。
【請求項５３】
ＨＰＶ感染を予防または処置するための、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のベクターを含む、薬物組成物。
【請求項５４】
宿主におけるＨＰＶ感染に起因する悪性形質転換の発症または存続の予防または処置のための、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のベクターを含む、薬物組成物。
【請求項５５】
癌免疫療法のための、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のベクターを含む、薬物組成物。
【請求項５６】
請求項１〜３３のいずれかに記載の組換えタンパク質または請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３６〜３９のいずれかに記載のベクターを含む、ＨＰＶ感染の診断キット、またはＨＰＶ感染を免疫モニタリングするためのキット。
【請求項５７】
−哺乳動物、特にヒト患者から得られたＴ細胞を、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質にさらすこと、
−Ｔ細胞の活性化の改変を検出すること
を含む、ＨＰＶ感染をインビトロで診断する方法または免疫モニタリングする方法。
【請求項５８】
癌ウイルス感染の処置もしくは予防のための、または、このよう癌ウイルス感染に起因する悪性作用の処置もしくは予防のための、１個または数個の癌ウイルスの１個または数個の抗原の１個または数個のエピトープの挿入により改変される、細菌性タンパク質またはその断片を含む組換えタンパク質の使用。
【請求項５９】
細菌性タンパク質は、毒素または類毒素である、請求項５８に記載の組換えタンパク質の使用。
【請求項６０】
キメラＣｙａＡ−ポリペプチドタンパク質に含まれるポリペプチド中の未知または亜優性潜在性Ｔ細胞エピトープのスクリーニング方法であって、
ここで、ＣｙａＡは、請求項１〜３０のいずれかに開示されているアデニル酸シクラーゼまたはその断片であり、この方法は、
−前記キメラタンパク質を動物宿主に投与すること、
−前記宿主のＴ細胞応答、特にＣＴＬ応答を決定すること
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項６１】
前記ポリペプチドが、ＨＰＶ抗原、特にＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に由来する、請求項６０に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１（Ｂ）】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１（Ｂ）】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００７−５３３３０７（Ｐ２００７−５３３３０７Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０３３０８（Ｐ２００７−５０３３０８）
【出願日】平成１７年３月１８日（２００５．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００３４５２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９７９２
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
【出願人】（５９３２１８４６２）インスティチュート・パスツール (19)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ
【出願人】（５０６３１５８７１）
【氏名又は名称原語表記】ＢＴ ＰＨＡＲＭＡ
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１８日（２００５．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００３４５２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９７９２
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
【出願人】（５９３２１８４６２）インスティチュート・パスツール (19)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ
【出願人】（５０６３１５８７１）
【氏名又は名称原語表記】ＢＴ ＰＨＡＲＭＡ
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
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