【課題】アデノ随伴ウイルスおよびその使用方法を提供する。
【解決手段】アデノ随伴ウイルスキャプシドのアミノ酸およびヌクレオチド配列、ならびにこれらのヌクレオチド配列を含有するベクターおよび宿主細胞。ｒＡＡＶ粒子の製造における宿主細胞およびベクターの使用方法。該ベクターを使用する治療的および免疫原性遺伝子のＡＡＶ媒介性の送達。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびその使用に関する。より具体的には、ＡＡＶキャプシドおよび異種分子を含んでなる血清型９のＡＡＶおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルス科の１メンバー、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロ塩基対（ｋｂ）ないし６ｋｂの一本鎖の直鎖状ＤＮＡゲノムを有する小型のエンベロープを持たない２０面体ウイルスである。ＡＡＶは、精製したアデノウイルスストック中の感染物質に随伴する異質な物質として発見されたため、該ウイルスはデペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に割り当てられている。ＡＡＶの生活環は、感染後のＡＡＶゲノムが宿主染色体に部位特異的に組み込まれる潜伏期、および、アデノウイルス若しくは単純疱疹ウイルスいずれかの感染後に組み込まれたゲノムがその後レスキューされ、複製されかつ感染性ウイルスにパッケージングされる感染期を包含する。非病原性の特性、非分裂細胞を包含する感染性の広範な宿主範囲、および潜在的な部位特異的染色体組み込みが、ＡＡＶを遺伝子移入のための魅力的なツールとしている。
【０００３】
最近の研究は、ＡＡＶベクターが遺伝子送達に好ましい運搬媒体でありうることを示唆している。今日まで、ヒト若しくはヒト以外の霊長類（ＮＨＰ）から単離された数種の異なる十分に特徴づけられたＡＡＶが存在する。
【０００４】
異なる血清型のＡＡＶが異なるトランスフェクション効率を表しかつまた異なる細胞若しくは組織に対する向性も表すことが見出された。しかしながら、これらの異なる血清型間の関係は以前に探求されていなかった。
【０００５】
望ましいものは、異種分子の送達のためのＡＡＶに基づく構築物である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、系統分類学的に関連づけられた配列のＡＡＶの「スーパーファミリー」すなわち「同源系統群」を提供する。これらのＡＡＶ同源系統群は、所望の標的細胞若しくは組織に分子の標的を定めそして／もしくはそれらを送達するのに有用なＡＡＶ配列の一供給源を提供する。
【０００７】
一局面において、本発明は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアライメントに基づき、ネイバー−ジョイニング ヒューリスティック（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ ｈｅｕｒｉｓｔｉｃ）を用いて決定した場合に、少なくとも７５％（少なくとも１０００個の複製物に基づく）のブーツストラップ値および０．０５を超えないポアソン補正距離測定値（Ｐｏｉｓｓｏｎ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）により系統分類学的に関連づけられる、少なくとも３種のＡＡＶメンバーを有する１ＡＡＶ同源系統群を提供する。適するのは、該ＡＡＶ同源系統群はベクターの生成で有用なＡＡＶ配列から構成される。
【０００８】
本発明はさらに、本明細書でクローン２８．４／ｈｕ．１４、あるいはＡＡＶ血清型９と命名される、以前に未知の１種のヒトＡＡＶ血清型を提供する。従って、別の局面において、本発明は、配列番号１２３のアミノ酸１ないし７３６の配列のキャプシドに血清学的に関連づけられかつＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、
ＡＡＶ７若しくはＡＡＶ８のいずれのキャプシドタンパク質とも血清学的に異なるＡＡＶキャプシドから構成される血清型９の１種のＡＡＶを提供する。
【０００９】
このｈｕＡＡＶ９のキャプシドを用いて構築したベクターは、肝においてＡＡＶ８に類似の、筋においてＡＡＶ１より優れた、および肺においてＡＡＶ５より２００倍より高い遺伝子移入効率を表した。さらに、本新規ヒトＡＡＶ血清型は、以前に記述されたＡＡＶ１からＡＡＶ８に対する８５％未満の配列の同一性を共有し、そしてこれらのＡＡＶのいずれによっても交差中和されない。
【００１０】
本発明はまた、他の新規ＡＡＶ配列、これらの配列を含有する組成物、およびそれらの用途も提供する。有利には、これらの組成物は、治療若しくは予防の目的上ＡＡＶベクターの再投与を必要とする組成物中での使用にとりわけ十分に適する。
【００１１】
本発明のこれらおよび他の局面は、本発明の以下の詳述された記述から容易に明らかであろう。
【００１２】
［発明の詳細な記述］
治療若しくは予防で有用なベクターのいずれの保有庫においても、標的細胞に巨大分子を運搬することが可能な多様な異なるベクターが、所望の応用のためのベクター供給源の選択を可能にするために望ましい。今日まで、ベクターとしてのＡＡＶの使用に関する懸念の１つは、多様な異なるウイルス供給源の欠如であった。本発明がこの問題を克服する一方法は、系統分類学的に関連づけられる、若しくは選択されたレジメンに所望の場合は系統分類学的に異なるＡＡＶを選択しかつ機能を予測するのに有用であるＡＡＶの同源系統群を提供することによる。本発明はさらに新規ＡＡＶウイルスを提供する。
【００１３】
核酸若しくはそのフラグメントを指す場合の「実質的相同性」若しくは「実質的類似性」という用語は、適切なヌクレオチドの挿入若しくは欠失を伴い別の核酸（若しくはその相補鎖）と至適に整列した場合に、該整列した配列の少なくとも約９５ないし９９％にヌクレオチド配列の同一性が存在することを示す。好ましくは、相同性は、完全長配列、若しくはその１オープンリーディングフレーム、または長さ少なくとも１５ヌクレオチドである別の適するフラグメントにわたる。適するフラグメントの例が本明細書に記述される。
【００１４】
核酸配列の情況での「配列の同一性」「配列の同一性パーセント」若しくは「同一性パーセント」という用語は、最大の対応のため整列した場合に同一である２配列中の残基を指す。配列の同一性の比較の長さは、ゲノムの完全長、遺伝子コーディング配列の完全長にわたりうるか、若しくは少なくとも約５００ないし５０００ヌクレオチドのフラグメントが望ましい。しかしながら、例えば少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０ないし２４ヌクレオチド、少なくとも約２８ないし３２ヌクレオチド、少なくとも約３６若しくはそれより多くのヌクレオチドのより小さいフラグメント間の同一性もまた望ましいことができる。同様に、「配列の同一性パーセント」は、タンパク質の完全長若しくはその１フラグメントにわたるアミノ酸配列について容易に決定しうる。適してはフラグメントは長さ少なくとも約８アミノ酸であり、かつ、約７００アミノ酸まででありうる。適するフラグメントの例が本明細書に記述される。
【００１５】
アミノ酸若しくはそれらのフラグメントを指す場合の「実質的相同性」若しくは「実質的類似性」という用語は、適切なアミノ酸の挿入若しくは欠失を伴い別のアミノ酸（若しくはその相補鎖）と至適に整列した場合に、該整列した配列の少なくとも約９５ないし９９％のアミノ酸配列の同一性が存在することを示す。好ましくは、相同性は完全長配列、若しくはその１タンパク質、例えばｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、または長さ少
なくとも８アミノ酸、若しくはより望ましくは少なくとも１５アミノ酸であるそのフラグメントにわたる。適するフラグメントの例が本明細書に記述される。
【００１６】
「高度に保存された」という用語により、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、およびより好ましくは９７％を超える同一性を意味している。同一性は、当業者により既知のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを用いることにより当業者により容易に決定される。
【００１７】
一般に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」若しくは「類似性」を指す場合、「同一性」、「相同性」若しくは「類似性」は「整列した」に配列に関して決定される。「整列した」配列若しくは「アライメント」は、参照配列に比較して欠けている若しくは付加的な塩基若しくはアミノ酸についての補正をしばしば含有する複数の核酸配列若しくはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。該例において、ＡＡＶのアライメントは、公表されたＡＡＶ２若しくはＡＡＶ１配列を参照点として使用して実施する。しかしながら、当業者は、別のＡＡＶ配列を参照として容易に選択し得る。
【００１８】
アライメントは、多様な公的に若しくは商業的に入手可能な複数の配列アライメントプログラムのいずれかを使用して実施する。こうしたプログラムの例は、「Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」および「ＭＥＭＥ」を包含し、これらはインターネット上のウェブサーバーを通じてアクセス可能である。こうしたプログラムの他の供給源は当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティーもまた使用される。上述されたプログラムに含有されるものを包含する、ヌクレオチド配列の同一性を測定するのに使用し得る当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムもまた存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１中のプログラムＦａｓｔａ^ＴＭを使用して比較し得る。Ｆａｓｔａ^ＴＭはクエリ配列と参照配列の間の最良のオーバーラップ領域のアライメントおよび配列の同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列の同一性パーセントは、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１（引用することにより本明細書に組み込まれる）で提供されるところのそのデフォルトのパラメータ（６のｗｏｒｄ ｓｉｚｅおよびスコアリングマトリックスについてのＮＯＰＡＭ係数）を用いるＦａｓｔａ^ＴＭを使用して決定し得る。複数の配列アライメントプログラム、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」および「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムもまたアミノ酸配列に利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれもデフォルトの設定で使用されるとは言え、当業者はこれらの設定を必要とされるように変更し得る。あるいは、当業者は、少なくとも引用されたアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性若しくはアライメントのレベルを提供する別のアリゴリズム若しくはコンピュータプログラムを利用し得る。例えばＪ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、「Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ“、２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。
【００１９】
「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に異なるキャプシドを有するＡＡＶに関する差違である。血清学的特殊性は、他のＡＡＶと比較して該ＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づき決定される。
【００２０】
交差反応性は典型的には中和抗体アッセイで測定する。このアッセイのためには、ウサギ若しくは他の適する動物モデルで該アデノ随伴ウイルスを使用して特定のＡＡＶに対するポリクローナル血清を生成させる。このアッセイでは、特定のＡＡＶに対し生成させた血清をその後、同一（同種）若しくは異種いずれかのＡＡＶを中和するその能力において試験する。５０％中和を達成する希釈を中和抗体力価とみなす。２つのＡＡＶについて、
同種の力価により除算した異種の力価の商が相反する様式で１６より低い場合は、それら２種のベクターは同一血清型とみなす。逆に、同種の力価に対する異種の力価の比が相反する様式で１６若しくはそれより多くである場合、該２種のＡＡＶは異なる血清型とみなす。
【００２１】
本明細書で定義されるとおり、血清型９を形成するために、選択したＡＡＶキャプシドに対し生成させた抗体は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７若しくはＡＡＶ８のいずれとも交差反応性であってはならない。一態様において、本発明は、ヒトＡＡＶ血清型９として本明細書で同定される新規血清型のＡＡＶキャプシドを提供する。
【００２２】
本明細および請求の範囲を通じて使用されるところの「含んでなること」および「包含すること」という用語は、他の成分、要素、整数、段階などの包括的なものである。逆に、「なること」という用語およびその変形は、他の成分、要素、整数、段階などを除外する。
【００２３】
Ｉ．同源系統群
一局面において、本発明はＡＡＶの同源系統群を提供する。同源系統群は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアライメントに基づいて、ネイバー−ジョイニング アルゴリズムを用いて決定した場合に、（少なくとも１０００個の複製物の）少なくとも７５％のブーツストラップ値および０．０５を超えないポアソン補正距離測定値により相互に系統分類学的に関連づけられるＡＡＶの一群である。
【００２４】
ネイバー−ジョイニングアルゴリズムは文献に広範囲に記述されている。例えばＭ．ＮｅｉとＳ．Ｋｕｍａｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実行するのに使用し得るコンピュータプログラムは入手可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムはＮｅｉ−Ｇｏｊｏｂｏｒｉの変法を実行する。これらの技術およびコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１キャプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択したＡＡＶが本明細書で同定される同源系統群の１つに含有されるか、別の同源系統群に含有されるか、若しくはこれらの同源系統群の外側にあるかどうかを容易に決定し得る。
【００２５】
本明細書で定義される同源系統群は、天然に存在するＡＡＶ ｖｐ１キャプシドに主として基づく一方、同源系統群は天然に存在するＡＡＶに制限されない。同源系統群は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアライメントに基づいて、ネイバー−ジョイニング アルゴリズムを用いて決定した場合に、（少なくとも１０００個の複製物の）少なくとも７５％のおよび０．０５を超えないポアソン補正距離測定値により系統分類学的に関連づけられる、組換え、修飾若しくは変更、キメラ、ハイブリッド、合成、人工などのＡＡＶを制限なしに包含する天然に存在しないＡＡＶを包含し得る。
【００２６】
本明細書に記述される同源系統群は、同源系統群Ａ（ＡＡＶ１およびＡＡＶ６により代表される）、同源系統群Ｂ（ＡＡＶ２により代表される）ならびに同源系統群Ｃ（ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッドにより代表される）、同源系統群Ｄ（ＡＡＶ７により代表される）、同源系統群Ｅ（ＡＡＶ８により代表される）ならびに同源系統群Ｆ（ヒトＡＡＶ９により代表される）を包含する。これらの同源系統群は、以前に記述されたＡＡＶ血清型である同源系統群の１メンバーにより代表される。以前に記述されたＡＡＶ１およびＡＡＶ６は、４種の単離物が３例のヒトから回収された単一同源系統群（同源系統群Ａ）のメンバーである。以前に記述されたＡＡＶ３およびＡＡＶ５血清型は相互と明確に異なるが、しかし本明細書に記述されるスクリーニングで検出されず、また、これらの同源系統群
のいずれにも包含されない。
【００２７】
同源系統群Ｂ（ＡＡＶ２）および同源系統群Ｃ（ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッド）は、ヒトで見出されたもののうちもっとも豊富なものである（ＡＡＶ２について１２個体から２２種の単離物、および同源系統群Ｃについて８個体から１７種の単離物）。
【００２８】
同源系統群Ｄ（ＡＡＶ７）若しくは同源系統群Ｅ（ＡＡＶ８）いずれかにグループ化される多数の配列が存在する。興味深いことに、これらの同源系統群の双方は異なる種で優勢である。同源系統群Ｄはアカゲザルおよびカニクイザルに独特であり、１０種の異なる動物から１５メンバーが単離された。同源系統群Ｅは、ヒトおよびヒト以外の霊長類の双方で見出されるため興味深い（９種の単離物が７例のヒトから回収され、また、２１種の単離物が、アカゲザル、ヒヒおよびブタオザルを包含する９種の異なるヒト以外の霊長類で得られた）。
【００２９】
２種の他の動物において、ある種の配列のハイブリッドの性質が判明したとは言え、この場合の全配列が、２種の共感染させるウイルスの個別のかつ異なる組換えにより発したと思われる（双方の動物で、同源系統群Ｅのウイルスを含む同源系統群Ｄ）これらの組換え体のいずれも、他の動物若しくは被験体で同定されなかった。
【００３０】
同源系統群Ｃ（ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッド）の同源系統群が６例の異なるヒト被験体で同定されたため、該組換え事象は適合子孫（ｆｉｔ ｐｒｏｇｅｎｙ）をもたらした。他方、ＡＡＶ７−ＡＡＶ８ハイブリッドの場合は、ＡＡＶの進化における組換えの意味に関してわずかな結論のみが引き出され得る。これらの組換え事象は、ＡＡＶが組換えすることが可能であり、それによりインフレーム遺伝子およびいくつかの場合にはパッケージング可能かつ／若しくは感染性のキャプシド構造を創製することを示す。同源系統群Ｃ（ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッドの同源系統群）は、他方、それらにある種の環境圧を持ちこたえさせる組換えにより選択的利点を獲得したウイルスの一群である。
【００３１】
Ａ．同源系統群Ａ（ＡＡＶ１およびＡＡＶ６により代表される）：
別の局面において、本発明は、以前に公表されたＡＡＶ１およびＡＡＶ６を含有することを特徴とする同源系統群Ａを提供する。例えば、国際特許公開第ＷＯ ００／２８０６１号明細書、２０００年５月１８日；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７２（１）：３０９−３１９（１９９８年１月）を参照されたい。加えて、本同源系統群は、１２８．１／ｈｕ．４３［配列番号８０および１６０］；１２８．３／ｈｕ．４４［配列番号８１および１５８］；１３０．４／ｈｕ．４８［配列番号７８および１５７］；ならびにｈｕ．４６［配列番号８２および１５９］を制限なしに包含する新規ＡＡＶを含有する。本発明はさらに、改変ｈｕ．４３キャプシド［配列番号２３６］および改変ｈｕ．４６キャプシド［配列番号２２４］を提供する。
【００３２】
一態様において、本同源系統群のメンバーの１つ若しくはそれより多くは、ＡＡＶ１および／若しくはＡＡＶ６のキャプシドのｖｐ１、ｖｐ２若しくはｖｐ３の完全長にわたり少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性若しくは少なくとも９７％の同一性のアミノ酸同一性をもつキャプシドを有する。
【００３３】
別の態様において、本発明は同源系統群Ａの新規ＡＡＶを提供するが、但し、該新規ＡＡＶのいずれもＡＡＶ１若しくはＡＡＶ６のいずれのキャプシドも含まない。これらのＡＡＶは、１２８．１／ｈｕ．４３［配列番号８０および１６０］；改変ｈｕ．４３［配列番号２３６］１２８．３／ｈｕ．４４［配列番号８１および１５８］；ｈｕ．４６［配列番号８２および１５９］；改変ｈｕ．４６［配列番号２２４］；ならびに１３０．４／ｈｕ．４８［配列番号７８および１５７］の１種若しくはそれより多く由来のキャプシドを
有するＡＡＶを制限なしに包含しうる。
【００３４】
Ｂ．同源系統群Ｂ（ＡＡＶ２同源系統群）：
別の態様において、本発明は同源系統群Ｂを提供する。
【００３５】
本同源系統群は、少なくとも、以前に記述されたＡＡＶ２、ならびに５２／ｈｕ．１９［配列番号６２および１３３］、５２．１／ｈｕ．２０［配列番号６３および１３４］、５４．５／ｈｕ．２３［配列番号６０および１３７］、５４．２／ｈｕ．２２［配列番号６７および１３８］、５４．７／ｈｕ．２４［配列番号６６および１３６］、５４．１／ｈｕ．２１［配列番号６５および１３５］、５４．４Ｒ／ｈｕ．２７［配列番号６４および１４０］；４６．２／ｈｕ．２８［配列番号６８および１３０］；４６．６／ｈｕ．２９［配列番号６９および１３２］；改変ｈｕ．２９［配列番号２２５］；１７２．１／ｈｕ．６３［配列番号１７１および１９５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６２４］；１７２．２／ｈｕ．６４［配列番号１７２および１９６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６２５］；２４．５／ｈｕ．１３［配列番号７１および１２９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５７８］；１４５．６／ｈｕ．５６［配列番号１６８および１９２］；ｈｕ．５７［配列番号１６９および１９３］；１３６．１／ｈｕ．４９［配列番号１６５および１８９］；１５６．１／ｈｕ．５８［配列番号１７９および１９４］；７２．２／ｈｕ．３４［配列番号７２および１２５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５９８］；７２．３／ｈｕ．３５［配列番号７３および１６４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５９９］；１３０．１／ｈｕ．４７［配列番号７７および１２８］；１２９．１／ｈｕ．４５（配列番号７６および１２７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６０８）；１４０．１／ｈｕ．５１［配列番号１６１および１９０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６１３］；ならびに１４０．２／ｈｕ．５２［配列番号１６７および１９１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６１４］を包含する本発明の新規ＡＡＶを含有することを特徴とする。
【００３６】
一態様において、本同源系統群のメンバーの１つ若しくはそれより多くは、ＡＡＶ２キャプシドのｖｐ１、ｖｐ２若しくはｖｐ３の完全長にわたる少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、若しくは少なくとも９７％の同一性のアミノ酸同一性をもつキャプシドを有する。
【００３７】
別の態様において、本発明は同源系統群Ｂの新規ＡＡＶを提供するが、但し、該ＡＡＶのいずれもＡＡＶ２キャプシドを有しない。これらのＡＡＶは、以下、すなわち５２／ｈｕ．１９［配列番号６２および１３３］、５２．１／ｈｕ．２０［配列番号６３および１３４］、５４．５／ｈｕ．２３［配列番号６０および１３７］、５４．２／ｈｕ．２２［配列番号６７および１３８］、５４．７／ｈｕ．２４［配列番号６６および１３６］、５４．１／ｈｕ．２１［配列番号６５および１３５］、５４．４Ｒ／ｈｕ．２７［配列番号６４および１４０］；４６．２／ｈｕ．２８［配列番号６８および１３０］；４６．６／ｈｕ．２９［配列番号６９および１３２］；改変ｈｕ．２９［配列番号２２５］；１７２．１／ｈｕ．６３［配列番号１７１および１９５］；１７２．２／ｈｕ．６４［配列番号１７２および１９６］；２４．５／ｈｕ．１３［配列番号７１および１２９］；１４５．６／ｈｕ．５６［配列番号１６８および１９２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６１８］；ｈｕ．５７［配列番号１６９および１９３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６１９］；１３６．１／ｈｕ．４９［配列番号１６５および１８９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６１２］；１５６．１／ｈｕ．５８［配列番号１７９および１９４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６２０］；７２．２／ｈｕ．３４［配列番号７２および１２５］；７２．３／ｈｕ．３５［配列番号７３および１６４］；１２９．１／ｈｕ．４５［配列番号７６および１２７］；１３０．１／ｈｕ．４７［配列番号７７および１２８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６１０］；１４０．１／ｈｕ．５１［配列番号１６１お
よび１９０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６１３］；ならびに１４０．２／ｈｕ．５２［配列番号１６７および１９１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６１４］の１種若しくはそれより多く由来のキャプシドを有するＡＡＶを制限なしに包含しうる。
【００３８】
Ｃ．同源系統群Ｃ（ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッドの同源系統群）
別の局面において、本発明は、Ｈ−６／ｈｕ．４；Ｈ−２／ｈｕ．２［米国特許出願第２００３／０１３８７７２号明細書（２００３年６月２４日）のような以前に公表されたＡＡＶ２およびＡＡＶ３のハイブリッドであるＡＡＶを含有することを特徴とする同源系統群Ｃを提供する。加えて、本同源系統群は、３．１／ｈｕ．９［配列番号５８および１５５］；１６．８／ｈｕ．１０［配列番号５６および１５６］；１６．１２／ｈｕ．１１［配列番号５７および１５３］；１４５．１／ｈｕ．５３［配列番号１７６および１８６］；１４５．６／ｈｕ．５５［配列番号１７８および１８７］；１４５．５／ｈｕ．５４［配列番号１７７および１８８］；７．３／ｈｕ．７［配列番号５５および１５０；現在ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６２８として寄託されている］；改変ｈｕ．７［配列番号２２６］；３３．４／ｈｕ．１５［配列番号５０および１４７］；３３．８／ｈｕ．１６［配列番号５１および１４８］；ｈｕ．１８［配列番号５２および１４９］；５８．２／ｈｕ．２５［配列番号４９および１４６］；１６１．１０／ｈｕ．６０［配列番号１７０および１８４］；Ｈ−５／ｈｕ．３［配列番号４４および１４５］；Ｈ−１／ｈｕ．１［配列番号４６および１４４］；ならびに１６１．６／ｈｕ．６１［配列番号１７４および１８５］を制限なしに包含する新規ＡＡＶを含有する。
【００３９】
一態様において、本同源系統群のメンバーの１つ若しくはそれより多くは、ｈｕ．４および／若しくはｈｕ．２キャプシドのｖｐ１、ｖｐ２若しくはｖｐ３の完全長にわたり少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、若しくは少なくとも９７％の同一性のアミノ酸同一性をもつキャプシドを有する。
【００４０】
別の態様において、本発明は同源系統群Ｃ（ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッドの同源系統群）の新規ＡＡＶを提供するが、但し、該新規ＡＡＶのいずれもｈｕ．２若しくはｈｕ．４のキャプシドを含まない。これらのＡＡＶは、３．１／ｈｕ．９［配列番号５８および１５５］；１６．８／ｈｕ．１０［配列番号５６および１５６］；１６．１２／ｈｕ．１１［配列番号５７および１５３］；１４５．１／ｈｕ．５３［配列番号１７６および１８６］；１４５．６／ｈｕ．５５［配列番号１７８および１８７］；１４５．５／ｈｕ．５４［配列番号１７７および１８８］；７．３／ｈｕ．７［配列番号５５および１５０］；改変ｈｕ．７［配列番号２２６］；３３．４／ｈｕ．１５［配列番号５０および１４７］；３３．８／ｈｕ．１６［配列番号５１および１４８］；５８．２／ｈｕ．２５［配列番号４９および１４６］；１６１．１０／ｈｕ．６０［配列番号１７０および１８４］；Ｈ−５／ｈｕ．３［配列番号４４および１４５］；Ｈ−１／ｈｕ．１［配列番号４６および１４４］；ならびに１６１．６／ｈｕ．６１［配列番号１７４および１８５］の１種若しくはそれより多く由来のキャプシドを有するＡＡＶを制限なしに包含しうる。
【００４１】
Ｄ．同源系統群Ｄ（ＡＡＶ７同源系統群）
別の態様において、本発明は同源系統群Ｄを提供する。本同源系統群は以前に記述されたＡＡＶ７［Ｇ．Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９：１１８５４−９（２００２年９月３日）を含有することを特徴とする。ＡＡＶ７のキャプシドをコードする核酸配列が配列番号１８４に再現されており；ＡＡＶ７キャプシドのアミノ酸配列は配列番号１８５に再現されている。加えて、該同源系統群は：ｃｙ．２；ｃｙ．３；ｃｙ．４；ｃｙ．５；ｃｙ．６；ｒｈ．１３；ｒｈ．３７；ｒｈ．３６；およびｒｈ．３５［米国特許出願公開第ＵＳ ２００３／０１３８７７２ Ａ１号明細書（２００３年７月２４日）］を包含する、多数の以前に記述されたＡＡＶ配列を含有する。加えて、該ＡＡＶ７同源系統群は、２−１５／ｒｈ．６２［配列番号３３および１１４］；１−
７／ｒｈ．４８［配列番号３２および１１５］；４−９／ｒｈ．５４［配列番号４０および１１６］；ならびに４−１９／ｒｈ．５５［配列番号３７および１１７］を制限なしに包含する新規ＡＡＶ配列を含有する。本発明はさらに、改変ｃｙ．５［配列番号２２７］；改変ｒｈ．１３［配列番号２２８］；および改変ｒｈ．３７［配列番号２２９］を包含する。
【００４２】
一態様において、本同源系統群のメンバーの１種若しくはそれより多くは、ＡＡＶ７キャプシド、配列番号１８４および１８５のｖｐ１、ｖｐ２若しくはｖｐ３の完全長にわたる少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性若しくは少なくとも９７％の同一性のアミノ酸同一性をもつキャプシドを有する。
【００４３】
別の態様において、本発明は同源系統群Ｄの新規ＡＡＶを提供するが、但し、該新規ＡＡＶのいずれも、ｃｙ．２；ｃｙ．３；ｃｙ．４；ｃｙ．５；ｃｙ．６；ｒｈ．１３；ｒｈ．３７；ｒｈ．３６；およびｒｈ．３５のいずれのキャプシドも含まない。これらのＡＡＶは、以下の２−１５／ｒｈ．６２［配列番号３３および１１４］；１−７／ｒｈ．４８［配列番号３２および１１５］；４−９／ｒｈ．５４［配列番号４０および１１６］；ならびに４−１９／ｒｈ．５５［配列番号３７および１１７］の１種若しくはそれより多く由来のキャプシドを有するＡＡＶを制限なしに包含しうる。
【００４４】
Ｅ．同源系統群Ｅ（ＡＡＶ８同源系統群）
一局面において、本発明は同源系統群Ｅを提供する。本同源系統群は以前に記述されたＡＡＶ８［Ｇ．Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．９９：１１８５４−９（２００２年９月３日）］；４３．１／ｒｈ．２；４４．２／ｒｈ．１０；ｒｈ．２５；２９．３／ｂｂ．１；および２９．５／ｂｂ．２［米国特許出願公開第ＵＳ ２００３／０１３８７７２ Ａ１号明細書（２００３年７月２４日）］を含有することを特徴とする。
【００４５】
さらに、例えば３０．１０／ｐｉ．１［配列番号２８および９３］；３０．１２／ｐｉ．２［配列番号３０および９５、３０．１９／ｐｉ．３［配列番号２９および９４］、ＬＧ−４／ｒｈ．３８［配列番号７および８６］；ＬＧ−１０／ｒｈ．４０［配列番号１４および９２］；Ｎ７２１−８／ｒｈ．４３［配列番号４３および１６３］；１−８／ｒｈ．４９［配列番号２５および１０３］；２−４／ｒｈ．５０［配列番号２３および１０８］；２−５／ｒｈ．５１［配列番号２２および１０４］；３−９／ｒｈ．５２［配列番号１８および９６］；３−１１／ｒｈ．５３［配列番号１７および９７］；５−３／ｒｈ．５７［配列番号２６および１０５］；５−２２／ｒｈ．５８［配列番号２７および５８］；２−３／ｒｈ．６１［配列番号２１および１０７］；４−８／ｒｈ．６４［配列番号１５および９９］；３．１／ｈｕ．６［配列番号５および８４］；３３．１２／ｈｕ．１７［配列番号４および８３］；１０６．１／ｈｕ．３７［配列番号１０および８８］；ＬＧ−９／ｈｕ．３９［配列番号２４および１０２］；１１４．３／ｈｕ．４０［配列番号１１および８７］；１２７．２／ｈｕ．４１［配列番号６および９１］；１２７．５／ｈｕ．４２［配列番号８および８５］；ｈｕ．６６［配列番号１７３および１９７］；ならびにｈｕ．６７［配列番号１７４および１９８］を包含する制限なしに包含する同源系統群新規ＡＡＶ配列。本同源系統群はさらに、改変ｒｈ．２［配列番号２３１］；改変ｒｈ．５８［配列番号２３２］；改変ｒｈ．６４［配列番号２３３］を包含する。
【００４６】
一態様において、本同源系統群のメンバーの１種若しくはそれより多くは、ＡＡＶ８キャプシドのｖｐ１、ｖｐ２若しくはｖｐ３の完全長にわたる少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性若しくは少なくとも９７％の同一性のアミノ酸同一性をもつキャプシドを有する。ＡＡＶ８キャプシドをコードする核酸配列は配列番号１８６に再現されており、また、該キャプシドのアミノ酸配列は配列番号１
８７に再現されている。
【００４７】
別の態様において、本発明は同源系統群Ｅの新規ＡＡＶを提供するが、但し、該新規ＡＡＶのいずれもＡＡＶ８、ｒｈ．８；４４．２／ｒｈ．１０；ｒｈ．２５；２９．３／ｂｂ．１；および２９．５／ｂｂ．２［米国特許出願公開第ＵＳ ２００３／０１３８７７２ Ａ１号明細書（２００３年７月２４日）］のいずれのキャプシドも含まない。これらのＡＡＶは、以下、すなわち３０．１０／ｐｉ．１［配列番号２８および９３］、３０．１２／ｐｉ．２［配列番号３０および９５、３０．１９／ｐｉ．３［配列番号２９および９４］、ＬＧ−４／ｒｈ．３８［配列番号７および８６］；ＬＧ−１０／ｒｈ．４０［配列番号１４および９２］；Ｎ７２１−８／ｒｈ．４３［配列番号４３および１６３］；１−８／ｒｈ．４９［配列番号２５および１０３］；２−４／ｒｈ．５０［配列番号２３および１０８］；２−５／ｒｈ．５１［配列番号２２および１０４］；３−９／ｒｈ．５２［配列番号１８および９６］；３−１１／ｒｈ．５３［配列番号１７および９７］；５−３／ｒｈ．５７［配列番号２６および１０５］；５−２２／ｒｈ．５８［配列番号２７および５８］；改変ｒｈ．５８［配列番号２３２］；２−３／ｒｈ．６１［配列番号２１および１０７］；４−８／ｒｈ．６４［配列番号１５および９９］；改変ｒｈ．６４［配列番号２３３］；３．１／ｈｕ．６［配列番号５および８４］；３３．１２／ｈｕ．１７［配列番号４および８３］；１０６．１／ｈｕ．３７［配列番号１０および８８］；ＬＧ−９／ｈｕ．３９［配列番号２４および１０２］；１１４．３／ｈｕ．４０［配列番号１１および８７］；１２７．２／ｈｕ．４１［配列番号６および９１］；１２７．５／ｈｕ．４２［配列番号８および８５］；ｈｕ．６６［配列番号１７３および１９７］；ならびにｈｕ．６７［配列番号１７４および１９８］の１種若しくはそれより多く由来のキャプシドを有するＡＡＶを制限なしに包含しうる。
【００４８】
Ｆ．同源系統群Ｆ（ＡＡＶ９同源系統群）
本同源系統群は本明細書でｈｕ．１４／ＡＡＶ９［配列番号３および１２３］として同定される新規ＡＡＶ血清型の名称により同定される。加えて、本同源系統群は、ｈｕ．３１［配列番号１および１２１］；ならびにｈｕ．３２［配列番号２および１２２］を包含する他の新規配列を含有する。
【００４９】
一態様において、本同源系統群のメンバーの１つ若しくはそれより多くは、ＡＡＶ９キャプシド、配列番号３および１２３のｖｐ１、ｖｐ２若しくはｖｐ３の完全長にわたる少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、若しくは少なくとも９７％の同一性のアミノ酸同一性をもつキャプシドを有する。
【００５０】
別の態様において、本発明は、ｈｕ．１４／ＡＡＶ９［配列番号３および１２３］、ｈｕ．３１［配列番号１および１２１］ならびにｈｕ．３２［配列番号１および１２２］の１種若しくはそれより多く由来のキャプシドを有するＡＡＶを制限なしに包含する同源系統群Ｆの新規ＡＡＶを提供する。
【００５１】
本発明のＡＡＶ同源系統群は、ウイルスベクターを生成させるためおよびターゲッティング分子を生成させるための関係するＡＡＶのすぐに使える集合物を提供することを包含する多様な目的上有用である。これらの同源系統群は、当業者に容易に明らかであろう多様な目的上のツールとしてもまた使用しうる。
【００５２】
ＩＩ．新規ＡＡＶ配列
本発明は、クローンｈｕ．１４／２８．４およびｈｕＡＡＶ９と本明細書で互換性に命名される新規ＡＡＶ血清型の核酸配列およびアミノ酸を提供する。これらの配列は、肝、筋および肺の形質導入で高度に効率的であるベクターを構築するために有用である。本新規ＡＡＶおよびその配列は多様な他の目的上もまた有用である。これらの配列はＧｅｎＢ
ａｎｋに提出されており、そして本明細書で同定される受託番号を割り当てられた。
【００５３】
本発明はさらに、多数の新規ＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。これらの配列の多くは、下に要約されるとおり１同源系統群のメンバーとして上述されたものを包含する。
【００５４】
１２８．１／ｈｕ．４３［配列番号８０および１６０ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６０６］；改変ｈｕ．４３［配列番号２３６］；１２８．３／ｈｕ．４４［配列番号８１および１５８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６０７］ならびに１３０．４／ｈｕ．４８［配列番号７８および１５７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６１１］；同源系統群Ａから；
５２／ｈｕ．１９［配列番号６２および１３３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５８４］、５２．１／ｈｕ．２０［配列番号６３および１３４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５８６］、５４．５／ｈｕ．２３［配列番号６０および１３７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５８９］、５４．２／ｈｕ．２２［配列番号６７および１３８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５８８］、５４．７／ｈｕ．２４［配列番号６６および１３６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５９０］、５４．１／ｈｕ．２１［配列番号６５および１３５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５８７］、５４．４Ｒ／ｈｕ．２７［配列番号６４および１４０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５９２］；４６．２／ｈｕ．２８［配列番号６８および１３０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５９３］；４６．６／ｈｕ．２９［配列番号６９および１３２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５９４］；改変ｈｕ．２９［配列番号２２５］；１７２．１／ｈｕ．６３［配列番号１７１および１９５］；ならびに１４０．２／ｈｕ．５２（配列番号１６７および１９１；同源系統群Ｂから；
同源系統群Ｃからの３．１／ｈｕ．９［配列番号５８および１５５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６２６］；１６．８／ｈｕ．１０［配列番号５６および１５６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５７６］；１６．１２／ｈｕ．１１［配列番号５７および１５３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５７７］；１４５．１／ｈｕ．５３［配列番号１７６および１８６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６１５］；１４５．６／ｈｕ．５５［配列番号１７８および１８７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６１７］；１４５．５／ｈｕ．５４［配列番号１７７および１８８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６１６］；７．３／ｈｕ．７［配列番号５５および１５０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６２８］；改変ｈｕ．７［配列番号２２６］；ｈｕ．１８［配列番号５２および１４９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５８３］；３３．４／ｈｕ．１５［配列番号５０および１４７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５８０］；３３．８／ｈｕ．１６［配列番号５１および１４８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５８１］；５８．２／ｈｕ．２５［配列番号４９および１４６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５９１］；１６１．１０／ｈｕ．６０［配列番号１７０および１８４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６２２］；Ｈ−５／ｈｕ．３［配列番号４４および１４５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５９５］；Ｈ−１／ｈｕ．１［配列番号４６および１４４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５７５］；ならびに１６１．６／ｈｕ．６１［配列番号１７４および１８５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６２３］；
同源系統群Ｄからの２−１５／ｒｈ．６２［配列番号３３および１１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５７３］；１−７／ｒｈ．４８［配列番号３２および１１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５６１］；４−９／ｒｈ．５４［配列番号４０および１１６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５６７］；ならびに４−１９／ｒｈ．５５［配列番号３７および１１７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５６８］；改変ｃｙ．５［配列番号２２７］；改変ｒｈ．１３［配列番号２２８］；ならびに改変ｒｈ．３７［配列番号２２９］；
３０．１０／ｐｉ．１［配列番号２８および９３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０
５５］、３０．１２／ｐｉ．２［配列番号３０および９５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５４］、３０．１９／ｐｉ．３［配列番号２９および９４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５５］、ＬＧ−４／ｒｈ．３８［配列番号７および８６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５８］；ＬＧ−１０／ｒｈ．４０［配列番号１４および９２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５９］；Ｎ７２１−８／ｒｈ．４３［配列番号４３および１６３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５６０］；１−８／ｒｈ．４９［配列番号２５および１０３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５６１］；２−４／ｒｈ．５０［配列番号２３および１０８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５６３］；２−５／ｒｈ．５１［配列番号２２および１０４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号５３０５６４］；３−９／ｒｈ．５２［配列番号１８および９６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５６５］；３−１１／ｒｈ．５３［配列番号１７および９７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５６６］；５−３／ｒｈ．５７［配列番号２６および１０５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５６９］；５−２２／ｒｈ．５８［配列番号２７および５８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号５３０５７０］；改変ｒｈ．５８［配列番号２３２］；２−３／ｒｈ．６１［配列番号２１および１０７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５７２］；４−８／ｒｈ．６４［配列番号１５および９９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５７４］；改変ｒｈ．６４［配列番号２３３］；３．１／ｈｕ．６［配列番号５および８４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６２１］；３３．１２／ｈｕ．１７［配列番号４および８３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５８２］；１０６．１／ｈｕ．３７［配列番号１０および８８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６００］；ＬＧ−９／ｈｕ．３９［配列番号２４および１０２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６０１］；１１４．３／ｈｕ．４０［配列番号１１および８７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６０３］；１２７．２／ｈｕ．４１［配列番号６および９１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６０４］；１２７．５／ｈｕ．４２［配列番号８および８５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６０５］；ならびにｈｕ．６６［配列番号１７３および１９７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６２６］；ならびにｈｕ．６７［配列番号１７４および１９８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０６２７］；ならびに改変ｒｈ．２［配列番号２３１］；同源系統群Ｅから；
同源系統群Ｆからのｈｕ．１４／ＡＡＶ９［配列番号３および１２３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５７９］、ｈｕ．３１［配列番号１および１２１；ＡＹ５３０５９６］ならびにｈｕ．３２［配列番号１および１２２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５９７］。
【００５５】
加えて、本発明は、上述された同源系統群の定義の外側にある、ｒｈ．５９［配列番号４９および１１０］；ｒｈ．６０［配列番号３１および１２０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５７１］、改変ｃｈ．５［配列番号２３４］；ならびに改変ｒｈ．８［配列番号２３５］を包含するＡＡＶ配列を提供する。
【００５６】
本発明のＡＡＶ配列のフラグメントもまた提供される。これらのフラグメントのそれぞれは多様なベクター系および宿主細胞で容易に利用しうる。ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３および超可変領域を包含するｃａｐタンパク質が望ましいＡＡＶフラグメントである。所望の場合は、公開された米国特許公開第ＵＳ ２００３／０１３８７７２ Ａ１号明細書（２００３年７月２４日）］に記述される方法論を使用して、上で同定されたＡＡＶクローンのｒｅｐ配列を得ることができる。こうしたｒｅｐ配列は、例えば、ｒｅｐ ７８、ｒｅｐ ６８、ｒｅｐ ５２およびｒｅｐ ４０、ならびにこれらのタンパク質をコードする配列を包含する。同様に、ＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、ＡＡＶ Ｐ１９配列、ＡＡＶ Ｐ４０配列、ｒｅｐ結合部位および末端決定部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｅ ｓｉｔｅ）（ＴＲＳ）を包含するこれらのクローンの他のフラグメントは、引用される特許刊行物に記述される技術を使用して得ることができる。なお他の適するフラグメントは当業者に容易に明らかであろう。
【００５７】
本発明のキャプシドおよび他のフラグメントは、多様なベクター系および宿主細胞中で容易に利用し得る。こうしたフラグメントは、単独で、他のＡＡＶ配列若しくはフラグメントとともに、または他のＡＡＶ若しくはＡＡＶ以外のウイルス配列からの要素とともに使用しうる。特定の望ましい一態様において、ベクターは本発明のＡＡＶ ｃａｐおよび／若しくはｒｅｐ配列を含有する。
【００５８】
ＡＡＶ配列およびそれらのフラグメントはｒＡＡＶの製造において有用であり、そしてまたアンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクター若しくはワクチンベクターとしても有用である。本発明はさらに、本発明のＡＡＶ配列を含有する核酸分子、遺伝子送達ベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００５９】
適するフラグメントは本明細書に提供される情報を使用して決定し得る。
【００６０】
本明細書に記述されるとおり、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質を含有する本発明のベクターは、他のＡＡＶ血清型に基づくベクターならびに他のウイルスベクターの有効性を中和抗体が消失させる応用での使用にとりわけ良好に適する。本発明のｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶの再投与および反復遺伝子治療でとりわけ有利である。
【００６１】
本発明のこれらおよび他の態様および利点を下により詳細に記述する。
Ａ．ＡＡＶ血清型９／ｈｕ１４配列
本発明は、本明細書でクローンｈｕ．１４（以前は２８．４と命名されていた）およびｈｕＡＡＶ９と互換性の命名される新規ＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸を提供する。本明細書に定義されるとおり、新規血清型ＡＡＶ９は、ｈｕ．１４の配列［配列番号１２３］を有するキャプシドと血清学的に交差反応しかつＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７若しくはＡＡＶ８のいずれのキャプシドに対して生成させた抗体とも血清学的に交差反応しない抗体を生成させるキャプシドを有するＡＡＶを指す。
【００６２】
１．核酸配列
本発明のＡＡＶ９核酸配列は、２２１１ヌクレオチドよりなる配列番号３のＤＮＡ配列を包含する。
【００６３】
本発明の核酸配列は、配列番号３に相補的である鎖、ならびに配列番号３に対応するＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列、ならびにそれらの相補鎖をさらに包含する。配列番号３の天然のバリアントおよび工作した修飾ならびにそれらの相補鎖もまた本発明の核酸配列に包含される。こうした修飾は、例えば、当該技術分野で既知である標識、メチル化、ならびに天然に存在するヌクレオチドの１個若しくはそれより多くの縮重ヌクレオチドでの置換を包含する。
【００６４】
配列番号３に対し約９０％以上、より好ましくは少なくとも約９５％、および最も好ましくは少なくとも約９８ないし９９％同一若しくは相同である核酸配列が本発明にさらに包含される。
【００６５】
配列番号３のフラグメント、その相補鎖、ならびにそれに対し相補的なｃＤＮＡおよびＲＮＡもまた本発明内に包含される。適するフラグメントは長さ少なくとも１５ヌクレオチドであり、そして機能的フラグメント、すなわち生物学的に興味深いフラグメントを包含する。こうしたフラグメントは、選択的スプライスバリアントであるＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドの３個の可変タンパク質（ｖｐ）すなわちｖｐ１［配列番号３のｎｔ１ないし２２１１］；ｖｐ２［配列番号３のｎｔ４１１ないし２２１１］；およびｖｐ３［配列番号３の約ｎｔ６０９ないし２２１１］をコードする配列を包含する。配列番号３の他
の適するフラグメントは、ＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドタンパク質の開始コドンを含有するフラグメント、およびｖｐ１キャプシドタンパク質の超可変領域をコードするフラグメントを包含し、これらは本明細書に記述される。
【００６６】
図面および配列表に提供される核酸配列を包含することに加え、本発明は、本発明のＡＡＶ血清型のアミノ酸配列、タンパク質およびペプチドを発現するよう設計されている核酸分子および配列を包含する。従って、本発明は、以下の新規ＡＡＶアミノ酸配列、ならびにこれらの配列および／若しくはそれらの独特のフラグメントを使用して生成される人工的ＡＡＶ血清型をコードする核酸配列を包含する。
【００６７】
本明細書で使用されるところの人工的ＡＡＶ血清型は、天然に存在しないキャプシドタンパク質をもつＡＡＶを制限なしに包含する。こうした人工的キャプシドは、別のＡＡＶ血清型（既知若しくは新規）、同一のＡＡＶ血清型の連続しない部分、ＡＡＶ以外のウイルス供給源、またはウイルス以外の供給源から得ることができる異種配列とともに本発明の新規ＡＡＶ配列（例えばｖｐ１キャプシドタンパク質のフラグメント）を使用して、いずれの適する方法により生成させてもよい。人工的ＡＡＶ血清型は、制限なしにキメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド若しくは「ヒト化」ＡＡＶキャプシドでありうる。
【００６８】
２．ＨＵ．１４／ＡＡＶ９のアミノ酸配列、タンパク質およびペプチド
本発明はさらに、本発明のｈｕ．１４／ＡＡＶ９核酸によりコードされるタンパク質およびそれらのフラグメント、ならびに他の方法により生成されるｈｕ．１４／ＡＡＶ９タンパク質およびフラグメントを提供する。本明細書で使用されるところのこれらのタンパク質は集成されたキャプシドを包含する。本発明はさらに、合成、組換え、若しくは当業者に既知の他の技術を使用して生成される本発明の新規ＡＡＶ血清型の配列を使用して生成されるＡＡＶ血清型を包含する。本発明は、本発明の新規ＡＡＶ核酸配列から発現された新規ＡＡＶアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質に制限されないが、しかし、例えば化学合成、他の合成技術若しくは他の方法によるを包含する当該技術分野で既知の他の方法により生成されるアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質を包含する。本明細書に提供されるＡＡＶキャプシドのいずれの配列も、多様な技術を使用して容易に生成させ得る。
【００６９】
適する製造後術は当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）を参照されたい。あるいは、ペプチドは公知の固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９（１９６２）；ＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ、サンフランシスコ、１９６９）ｐｐ．２７−６２）によってもまた合成し得る。これらおよび他の適する製造方法は当業者の知識内にあり、そして本発明の制限でない。
【００７０】
とりわけ望ましいタンパク質は、上で同定されたヌクレオチド配列によりコードされるＡＡＶキャプシドタンパク質を包含する。ＡＡＶキャプシドは、選択的スプライスバリアントである３種のタンパク質ｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３から構成される。図２に提供される完全長の配列はｖｐ１のものである。ＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドタンパク質は、ｖｐ１［配列番号１２３のアミノ酸（ａａ）１ないし７３６］、ｖｐ２［配列番号１２３の約ａａ１３８ないし７３６］、ｖｐ３［配列番号１２３の約ａａ２０３ないし７３６］、およびそれらの機能的フラグメントを包含する。該キャプシドタンパク質の他の所望のフラグメントは、超可変領域（ＨＶＲ）の間に配置される定常および可変領域を包含する。キャプシドタンパク質の他の所望のフラグメントはＨＶＲそれら自身を包含する。
【００７１】
ＡＡＶ２中の配列の異なる領域を決定するために開発されたアルゴリズムは１２個の超可変領域（ＨＶＲ）を生じ、そのうち５個は４種の以前に記述された可変領域とオーバーラップするかもしくはそれらの一部である。［Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７３：１３０９−１９（１９９９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：３０９−３１９］このアルゴリズムおよび／若しくは本明細書に記述されるアライメント技術を使用して、新規ＡＡＶ血清型のＨＶＲを決定する。例えば、該ＨＶＲは以下のとおり配置される。すなわち、ＨＶＲ１、ａａ１４６−１５２；ＨＶＲ２、ａａ１８２−１８６；ＨＶＲ３、ａａ２６２−２６４；ＨＶＲ４、ａａ３８１−３８３；ＨＶＲ５、ａａ４５０−４７４；ＨＶＲ６、ａａ４９０−４９５；ＨＶＲ７、ａａ５００−５０４；ＨＶＲ８、ａａ５１４−５２２；ＨＶＲ９、ａａ５３４−５５５；ＨＶＲ１０、ａａ５８１−５９４；ＨＶＲ１１、ａａ６５８−６６７；およびＨＶＲ１２、ａａ７０５−７１９［番号付け体系は、ＡＡＶ２ ｖｐ１を参照の点として使用するアライメントに基づく］。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘプログラムをデフォルトの設定で使用して実施した本明細書に提供されるアライメントを使用して、または、他の商業的に若しくは公的に入手可能なアライメントプログラムを本明細書に記述されるようなデフォルトの設定で使用して、当業者は、本発明の新規ＡＡＶキャプシドの対応するフラグメントを容易に決定し得る。
【００７２】
ＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドタンパク質のなお他の所望のフラグメントは、配列番号１２３のアミノ酸１ないし１８４、アミノ酸１９９ないし２５９；アミノ酸２７４ないし４４６；アミノ酸６０３ないし６５９；アミノ酸６７０ないし７０６；配列番号１２３のアミノ酸７２４ないし７３６；ａａ１８５−１９８；ａａ２６０−２７３；ａａ４４７−４７７；ａａ４９５−６０２；ａａ６６０−６６９；およびａａ７０７−７２３を包含する。加えて、ＡＡＶキャプシドの他の適するフラグメントの例は、ＡＡＶ９［配列番号１２３］の番号付けに関して、ａａ２４−４２、ａａ２５−２８；ａａ８１−８５；ａａ１３３−１６５；ａａ１３４−１６５；ａａ１３７−１４３；ａａ１５４−１５６；ａａ１９４−２０８；ａａ２６１−２７４；ａａ２６２−２７４；ａａ１７１−１７３；ａａ４１３−４１７；ａａ４４９−４７８；ａａ４９４−５２５；ａａ５３４−５７１；ａａ５８１−６０１；ａａ６６０−６７１；ａａ７０９−７２３を包含する。Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｘプログラムをデフォルトの設定で使用して実施した本明細書に提供されるアライメントを使用して、または、他の商業的に若しくは公的に入手可能なアライメントプログラムをデフォルトの設定で使用して、当業者は、本発明の新規ＡＡＶキャプシドの対応するフラグメントを容易に決定し得る。
【００７３】
なお他の所望のＡＡＶ９／ＨＵ．１４タンパク質はｒｅｐタンパク質を包含するはｒｅｐ６８／７８およびｒｅｐ４０／５２を包含する。
【００７４】
適しては、フラグメントは長さ少なくとも８アミノ酸である。しかしながら、他の所望の長さのフラグメントを容易に利用しうる。こうしたフラグメントは、組換えで、若しくは他の適する手段例えば化学合成により製造しうる。
【００７５】
本発明はさらに、本明細書に提供される配列情報を使用して同定される他のＡＡＶ９／ＨＵ．１４配列を提供する。例えば、本明細書に提供されるＡＡＶ９／ＨＵ．１４配列を与えられれば、ゲノム歩行技術（Ｓｉｅｂｅｒｔら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３：１０８７−１０８８、Ｆｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇｅｎら、１９８６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６９７２−６９８５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）を使用して、感染性のＡＡＶ９／ＨＵ．１４を単離しうる。ゲノム歩行は、本発明の方法により同定される新規配列に隣接する配列を同定および単離するのにとりわけ十分に適する。本技術は、本明細書に提供される新規ＡＡＶキャプシドおよびｒｅｐ配列に基づいて新規ＡＡＶ９／ＨＵ．１
４血清型の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を単離するためにもまた有用である。
【００７６】
本発明の配列、タンパク質およびフラグメントは、組換え製造、化学合成若しくは他の合成手段を包含するいずれの適する手段によっても製造しうる。こうした製造方法は当業者の知識内にありかつ本発明の制限でない。
【００７７】
ＩＩＩ．新規ＡＡＶキャプシドをもつｒＡＡＶの製造
本発明は、これらのウイルスが本来会合しているＤＮＡおよび／若しくは細胞物質を含まない新規ＡＡＶキャプシド配列を包含する。本明細書に提供される新規ＡＡＶキャプシドの全部を反復することを回避するため、言及はこれおよび以下の節を通じてｈｕ．１４／ＡＡＶ９キャプシドに対しなされる。しかしながら、本発明の他の新規ＡＡＶキャプシド配列を類似の様式で使用し得ることが認識されるべきである。
【００７８】
別の局面において、本発明は、異種遺伝子若しくは他の核酸配列の標的細胞への送達において有用な分子の製造のためにそれらのフラグメントを包含する本発明の新規ＡＡＶ配列を利用する分子を提供する。
【００７９】
別の局面において、本発明は、異種遺伝子若しくは他の核酸配列の標的細胞への送達において有用なウイルスベクターの製造のためのそれらのフラグメントを包含する本発明のＡＡＶ配列を利用する分子を提供する。
【００８０】
ＡＡＶ配列を含有する本発明の分子は、宿主細胞に送達されうるいかなる遺伝因子（ベクター）、例えば、その上に運搬される配列を移入する裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、ウイルス以外の送達ベヒクル（例えば脂質に基づく担体）中のタンパク質、ウイルスなども包含する。選択されたベクターは、トランスフェクション、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含するいずれの適する方法によっても送達しうる。本発明のいずれの態様を構築するのに使用される方法も、核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包含する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。
【００８１】
一態様において、本発明のベクターは、とりわけ、本発明のＡＡＶキャプシド若しくはそのフラグメントをコードする配列を含有する。別の態様において、本発明のベクターは少なくともＡＡＶ ｒｅｐタンパク質若しくはそのフラグメントをコードする配列を含有する。場合によっては、本発明のベクターはＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐタンパク質双方を含有しうる。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ双方が提供されるベクターにおいて、ＡＡＶ
ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐ配列は同一の同源系統群のＡＡＶから発し得る。あるいは、本発明は、ｒｅｐ配列がｃａｐ配列を提供しているＡＡＶ供給源と異なるＡＡＶ供給源からであるベクターを提供する。一態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は別個の供給源（例えば別個のベクター、若しくは宿主細胞およびベクター）から発現される。別の態様において、これらのｒｅｐ配列は、異なるＡＡＶ供給源のｃａｐ配列にインフレームで融合されてキメラＡＡＶベクターを形成する。場合によっては、本発明のベクターは本発明のＡＡＶキャプシドにパッケージングされたベクターである。これらのベクター、および本明細書に記述される他のベクターは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ ３’ＩＴＲにより隣接される選択された導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子をさらに含有し得る。
【００８２】
従って、一態様において、本明細書に記述されるベクターは、単一のＡＡＶ配列（例えばＡＡＶ９／ＨＵ．１４）からでありうる無傷のＡＡＶキャプシドをコードする核酸配列
を含有する。こうしたキャプシドは配列番号１２３のアミノ酸１ないし７３６を含みうる。あるいは、これらのベクターは、異種ＡＡＶ若しくはＡＡＶ以外のキャプシドタンパク質（またはそれらのフラグメント）に融合されたＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドの１種若しくはそれより多くのフラグメントを含有する人工的キャプシドをコードする配列を含有する。これらの人工的キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドの連続しない部分若しくは他のＡＡＶのキャプシドから選択される。例えば、ｒＡＡＶは、ｖｐ２および／若しくはｖｐ３、またはｖｐ１、あるいはＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシド、配列番号１２３のアミノ酸１ないし１８４、アミノ酸１９９ないし２５９；アミノ酸２７４ないし４４６；アミノ酸６０３ないし６５９；アミノ酸６７０ないし７０６；アミノ酸７２４ないし７３８から選択されるそれらのフラグメントから選択されるＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシド領域の１種若しくはそれより多くを含んでなるキャプシドタンパク質を有しうる。別の例において、ｖｐ３タンパク質の開始コドンをＧＴＧに変えることが望ましいことがある。あるいは、ｒＡＡＶは、本明細書で同定されるＡＡＶ血清型９キャプシドタンパク質の超可変領域、若しくはＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドのａａ１８５−１９８；ａａ２６０−２７３；ａａ４４７−４７７；ａａ４９５−６０２；ａａ６６０−６６９；およびａａ７０７−７２３を制限なしに包含する他のフラグメントの１種若しくはそれより多くを含有しうる。配列番号１２３を参照されたい。これらの改変は、選択された発現系において、または別の所望の目的上（例えば向性を変える、すなわち中和抗体のエピトープを変える）、発現、収量を増大させかつ／若しくは精製を向上させるはずでありうる。
【００８３】
本明細書に記述されるベクター、例えばプラスミドは多様な目的上有用であるが、しかし、ＡＡＶ配列若しくはそれらのフラグメントを含んでなるキャプシドを含有するｒＡＡＶの製造における使用にとりわけ良好に適する。ｒＡＡＶを包含するこれらのベクター、それらの要素、構築および用途は本明細書に詳細に記述される。
【００８４】
一局面において、本発明は、ＡＡＶ血清型９キャプシド若しくはその一部分を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法を提供する。こうした方法は、本明細書で定義されるところのＡＡＶ血清型９キャプシドタンパク質若しくはそのフラグメント；機能的ｒｅｐ遺伝子；少なくともＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）および導入遺伝子から構成されるミニ遺伝子；ならびに該ミニ遺伝子のＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドタンパク質中へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能をコードする核酸配列を含有する宿主細胞を培養することを必要とする。
【００８５】
ＡＡＶミニ遺伝子をＡＡＶキャプシドにパッケージングするために宿主細胞中で培養されることが必要とされる成分は宿主細胞にｔｒａｎｓで供給しうる。あるいは、必要とされる成分（例えばミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／若しくはヘルパー機能）のいずれか１種若しくはそれより多くは、必要とされる成分の１種若しくはそれより多くを含有するように当業者に既知の方法を使用して工作された安定な宿主細胞により提供しうる。最も適しては、こうした安定な宿主細胞は誘導可能なプロモーターの制御下に必要とされる成分（１種若しくは複数）を含有することができる。しかしながら、該必要とされる成分（１種若しくは複数）は構成的プロモーターの制御下にありうる。適する誘導可能なおよび構成的プロモーターの例は、導入遺伝子との使用に適する調節エレメントの論考において本明細書に提供される。なお別の代替において、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下の選択された成分（１種若しくは複数）および１種若しくはそれより多くの誘導可能なプロモーターの制御下の他の選択された成分（１種若しくは複数）を含有しうる。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にＥ１ヘルパー機能を含有する）由来であるがしかし誘導可能なプロモーターの制御下にｒｅｐおよび／若しくはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞を生成させうる。なお他の安定な宿主細胞を当業者により生成しうる。
【００８６】
本発明のｒＡＡＶを製造するのに必要とされるミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、その上に運搬される配列を移入するいずれかの遺伝因子の形態でパッケージング宿主細胞に送達しうる。選択された遺伝因子は、本明細書に記述されるものを包含するいずれの適する方法によっても送達しうる。本発明のいずれの態様を構築するのに使用される方法も核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包含する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンの生成方法は公知であり、また、適する方法の選択は本発明に対する制限でない。例えばＫ．Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照されたい。
【００８７】
別の方法で明記されない限り、ＡＡＶ ＩＴＲおよび本明細書に記述される他の選択されたＡＡＶ成分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９および本発明の他の新規ＡＡＶ配列の１種を制限なしに包含するいかなるＡＡＶの中からも容易に選択しうる。これらのＩＴＲ若しくは他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用してＡＡＶ配列から容易に単離しうる。こうしたＡＡＶは、単離しうるか、または学術的、商業的若しくは公的な供給源（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナサス）から得ることができる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献、または例えばＧｅｎＢａｎｋ^（Ｒ）、ＰｕｂＭｅｄ^（Ｒ）などのようなデータベースで入手可能であるような公表された配列を参照することにより、合成若しくは他の適する手段により得ることができる。
【００８８】
Ａ．ミニ遺伝子
ミニ遺伝子は、少なくとも導入遺伝子およびその制御配列、ならびに５’および３’のＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）から構成される。所望の一態様において、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲを使用する。しかしながら他の適する供給源からのＩＴＲを選択しうる。キャプシドタンパク質にパッケージングされかつ選択された宿主細胞に送達されるのはこのミニ遺伝子である。
【００８９】
１．導入遺伝子
導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質若しくは他の産物をコードする、導入遺伝子に隣接するベクター配列に対し異種の核酸配列である。該核酸コーディング配列は、宿主細胞中での導入遺伝子の転写、翻訳および／若しくは発現を可能にする様式で調節成分に効果的に連結される。
【００９０】
導入遺伝子配列の組成は、生じるベクターが置かれるであろう使用に依存することができる。例えば、１つの型の導入遺伝子配列は、発現に際して検出可能なシグナルを生じるレポーター配列を包含する。こうしたレポーター遺伝子は、それに向けられた高親和性抗体が存在するか若しくは慣習的手段により製造され得るβ−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を包含する膜結合タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質および当該技術分野で公知の他者、ならびにとりわけヘマグルチニン若しくはＭｙｃからの抗原タグドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を制限なしに包含する。
【００９１】
これらのコーディング配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントと会合される場
合に、酵素、Ｘ線撮影、比色、蛍光若しくは他の分光学的アッセイ、蛍光標示式細胞分取アッセイ、ならびに酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を包含する免疫学的アッセイを包含する慣習的手段により検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、該シグナルを運搬するベクターの存在はβ−ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイにより検出する。導入遺伝子が緑色結合タンパク質若しくはルシフェラーゼである場合、該シグナルを運搬するベクターは、ルミノメーターで色若しくは光の産生により視覚的に測定しうる。
【００９２】
しかしながら、望ましくは、導入遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、ドミナントネガティブの変異体若しくは触媒的ＲＮＡのような生物学および医学で有用である産物をコードするマーカー以外の配列である。所望のＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒的ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、小分子ヘアピン型ＲＮＡ、ｔｒａｎｓスプライシングＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを包含する。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置した動物で標的とされた核酸配列の発現を阻害若しくは消失させる配列である。典型的には、適する標的配列は腫瘍学的標的およびウイルス性疾患を包含する。こうした標的の例については、下で免疫原に関する節にて同定される腫瘍学的標的およびウイルスを参照されたい。
【００９３】
導入遺伝子は、正常な遺伝子が正常レベルより少なく発現されている欠損、若しくは機能的遺伝子産物が発現されない欠損を包含しうる遺伝子欠損を是正若しくは改善するのに使用しうる。あるいは、導入遺伝子は、該細胞型若しくは宿主中で本来発現されない産物を細胞に提供しうる。好ましい型の導入遺伝子配列は、宿主細胞中で発現される治療的タンパク質若しくはポリペプチドをコードする。本発明は複数の導入遺伝子を使用することをさらに包含する。ある状況では、１タンパク質の各サブユニットをコードするため、または異なるペプチド若しくはタンパク質をコードするために異なる導入遺伝子を使用しうる。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡの大きさが大きい場合、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子若しくはジストロフィンタンパク質に望ましい。細胞が多サブユニットタンパク質を産生するためには、異なるサブユニットのそれぞれを含有する組換えウイルスに細胞を感染させる。あるいは、タンパク質の異なるサブユニットを同一の導入遺伝子によりコードしうる。この場合、単一の導入遺伝子がサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを包含し、各サブユニットのＤＮＡは配列内リボザイム進入部（ＩＲＥＳ）により分離される。これは、サブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡの大きさが小さい、例えばサブユニットおよびＩＲＥＳをコードするＤＮＡの大きさの合計が５キロ塩基対未満である場合に望ましい。ＩＲＥＳに対する一代替として、ＤＮＡは、翻訳後事象で自己切断する２Ａペプチドをコードする配列により分離しうる。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７８（Ｐｔ １）：１３−２１（１９９７年１月）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、８（１１）：８６４−８７３（２００１年６月）；Ｋｌｕｍｐ Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、８（１０）：８１１−８１７（２００１年５月）を参照されたい。この２ＡペプチドはＩＲＥＳより有意により小さく、空間が制限要因である使用にそれを良好に適するようにする。よりしばしば、導入遺伝子が大きく多サブユニットよりなるか、若しくは２種の導入遺伝子を共送達する場合、所望の導入遺伝子（１種若しくは複数）またはサブユニットを運搬するｒＡＡＶを共投与して、それらをｉｎ ｖｉｖｏで鎖状体化させて単一のベクターゲノムを形成させる。こうした一態様において、第一のＡＡＶは単一の導入遺伝子を発現する発現カセットを運搬することができ、また、第二のＡＡＶは、宿主細胞中での共発現のための異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを運搬しうる。しかしながら、選択された導入遺伝子は、いかなる生物学的活性産物若しくは他の産物、例えば研究に所望の産物もコードしうる。
【００９４】
適する導入遺伝子は当業者により容易に選択されうる。導入遺伝子の選択は本発明の制
限であると考えられない。
【００９５】
２．調節エレメント
ミニ遺伝子について上で同定された主要エレメントに加え、ベクターは、該プラスミドベクターでトランスフェクトしたか若しくは本発明により製造したウイルスに感染させた細胞中での導入遺伝子の転写、翻訳および／若しくは発現を可能にする様式で導入遺伝子に作動可能に連結されている慣習的調節領域もまた包含する。本明細書で使用されるところの「作動可能に連結されている」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列およびｔｒａｎｓで若しくは離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の双方を包含する。
【００９６】
発現制御配列は、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに、所望の場合はコードされる産物の分泌を高める配列を包含する。生来、構成的、誘導可能および／若しくは組織特異的であるプロモーターを包含する多数の発現制御配列が当該技術分野で既知でありかつ利用しうる。
【００９７】
構成的プロモーターの例は、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によってはＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によってはＣＭＶエンハンサーを伴う）［例えばＢｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１プロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を制限なしに包含する。誘導可能なプロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、そして外因性に供給される化合物、温度のような環境因子、または特定の生理学的状態（例えば急性期、細胞の特定の分化状態、若しくは複製細胞のみ中）の存在により調節し得る。誘導可能なプロモーターおよび誘導可能な系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを制限なしに包含する多様な商業的供給元から入手可能である。多くの他の系が記述されておりかつ当業者により容易に選択され得る。外因性に供給される化合物により調節される誘導可能なプロモーターの例は、亜鉛で誘導可能なヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメサゾン（Ｄｅｘ）で誘導可能なマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［国際特許公開第ＷＯ ９８／１００８８号明細書］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリンで抑制可能な系［Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリンで誘導可能な系［Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２−５１８（１９９８）もまた参照されたい］、ＲＵ４８６で誘導可能な系［Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４：４３２−４４１（１９９７）］、ならびにラパマイシンで誘導可能な系［Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５−２８７２（１９９７）］を包含する。この情況で有用でありうる他の型の誘導可能なプロモーターは、特定の生理学的状態（例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態、若しくは複製細胞のみ中）により調節されるものである。
【００９８】
別の態様において、導入遺伝子の本来のプロモーターを使用することができる。本来のプロモーターは、導入遺伝子の発現が本来の発現を模倣すべきであることが望ましい場合
に好ましいことがある。本来のプロモーターは、導入遺伝子の発現が一時的に若しくは発達的に、または組織特異的様式で、あるいは特定の転写刺激に応答して調節されなければならない場合に使用しうる。さらなる一態様において、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位若しくはコザックコンセンサス配列のような他の本来の発現調節領域を、本来の発現を模倣するのにもまた使用しうる。
【００９９】
導入遺伝子の別の態様は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を包含する。例えば、骨格筋中での発現が望ましい場合は筋中で活性のプロモーターを使用すべきである。これらは、骨格β−アクチン、ミオシンＬ鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのプロモーター、ならびに天然に存在するプロモーターよりも高い活性をもつ合成の筋プロモーターを包含する（Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：２４１−２４５（１９９９）を参照されたい）。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：１００２−９（１９９６）；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７：１５０３−１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリンＨ鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３−１５（１９９３））、神経細糸Ｌ鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１−５（１９９１））、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３−８４（１９９５））のような神経のについて既知である。
【０１００】
場合によっては、治療上有用な導入遺伝子を運搬するプラスミドは選択可能なマーカーもまた包含しうるか、または、レポーター遺伝子はとりわけジェネチシン、ハイグロマイシン若しくはピューリマイシン耐性をコードする配列を包含しうる。アンピシリン耐性のような、こうした選択可能なレポーター若しくはマーカー遺伝子（好ましくは本発明の方法によりレスキューされるためにウイルスゲノムの外側に配置される）を、細菌細胞中のプラスミドの存在を知らせるのに使用し得る。該プラスミドの他成分は複製起点を包含しうる。これらおよび他のプロモーターおよびベクター要素の選択は慣習的であり、そして多くのこうした配列が利用可能である［例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、およびその中で引用される参考文献を参照されたい］。
【０１０１】
導入遺伝子、プロモーター／エンハンサー、ならびに５’および３’のＡＡＶ ＩＴＲの組み合わせは、言及の容易さのため本明細書で「ミニ遺伝子」と称される。本発明の教示とともに提供されるこうしたミニ遺伝子の設計は、慣習的技術を用いることによりなし得る。
【０１０２】
３．パッケージング宿主細胞へのミニ遺伝子の送達
ミニ遺伝子は、宿主細胞に送達されるいかなる適するベクター、例えばプラスミド上でも運搬され得る。本発明で有用なプラスミドは、それらが複製および場合によっては原核生物細胞、哺乳動物細胞、若しくは双方への組込みに適するように工作しうる。これらのプラスミド（若しくは５’ＡＡＶ ＩＴＲ−異種分子−３’ＡＡＶ ＩＴＲを運搬する他のベクター）は、真核生物および／若しくは原核生物中でのミニ遺伝子ならびにこれらの系の選択マーカーの複製を可能にする配列を含有する。選択可能なマーカー若しくはレポーター遺伝子は、とりわけ、ジェネチシン、ハイグロマイシン若しくはピューリマイシン
耐性をコードする配列を包含しうる。該プラスミドは、アンピシリン耐性のような、細菌細胞中のベクターの存在を知らせるのに使用し得るある種の選択可能なレポーター若しくはマーカー遺伝子もまた含有しうる。プラスミドの他成分は複製起点、およびエプスタイン−バーウイルスの核抗原を使用するアンプリコン系のようなアンプリコンを包含しうる。このアンプリコン系若しくは他の類似のアンプリコン成分は、細胞中での高コピーのエピソーム複製を可能にする。好ましくは、ミニ遺伝子を運搬する分子を細胞にトランスフェクトし、それはそこで一過性に存在しうる。あるいは、ミニ遺伝子（５’ＡＡＶ ＩＴＲ−異種分子−３’ＡＡＶ ＩＴＲを運搬する）は、染色体に若しくはエピソームとしてのいずれかで宿主細胞のゲノムに安定に組込まれうる。ある態様において、ミニ遺伝子は、場合によっては頭から頭、頭から尾若しくは尾から尾の鎖状体で複数コピーで存在しうる。適するトランスフェクション技術は既知であり、そして宿主細胞にミニ遺伝子を送達させるのに容易に利用しうる。
【０１０３】
一般に、ミニ遺伝子を含んでなるベクターをトランスフェクションにより送達する場合、該ベクターは、約５μｇから約１００μｇまでのＤＮＡ、約１０μｇないし約５０μｇのＤＮＡの量で、約１×１０^４細胞ないし約１×１０^１３細胞、若しくは約１×１０^５細胞に送達する。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択したベクター、送達方法および選択した宿主細胞のような因子を考慮に入れて調節しうる。
【０１０４】
Ｂ．ｒｅｐおよびｃａｐ配列
ミニ遺伝子に加え、宿主細胞は、宿主細胞中での本発明の新規ＡＡＶキャプシドタンパク質（若しくはそのフラグメントを含んでなるキャプシドタンパク質）の発現を駆動する配列、およびミニ遺伝子中で見出されるＡＡＶ ＩＴＲの供給源若しくは交差相補する供給源と同一の供給源のｒｅｐ配列を含有する。ＡＡＶのｃａｐおよびｒｅｐ配列は、上述されたところのＡＡＶ供給源から独立に得ることができ、そして、上述されたところの当業者に既知のいずれかの様式で宿主細胞に導入しうる。加えて、（例えばＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシド）でＡＡＶベクターをシュードタイピングする場合、不可欠のｒｅｐタンパク質のそれぞれをコードする配列を異なるＡＡＶ供給源（例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８）により供給しうる。例えば、ｒｅｐ７８／６８配列はＡＡＶ２からであってよい一方、ｒｅｐ５２／４０配列はＡＡＶ８からであってよい。
【０１０５】
一態様において、宿主細胞は、上述されたもののような適するプロモーターの制御下にキャプシドタンパク質を安定に含有する。最も望ましくは、本態様において、キャプシドタンパク質は誘導可能なプロモーターの制御下に発現される。別の態様において、キャプシドタンパク質はｔｒａｎｓで宿主細胞に供給される。宿主細胞にｔｒａｎｓで送達される場合、キャプシドタンパク質は、選択されたキャプシドタンパク質の宿主細胞中での発現を指図するのに必要な配列を含有するプラスミドを介して送達しうる。最も望ましくは、宿主細胞にｔｒａｎｓで送達される場合、キャプシドタンパク質を運搬するプラスミドはｒＡＡＶをパッケージングするのに必要とされる他の配列、例えばｒｅｐ配列もまた運搬する。
【０１０６】
別の態様において、宿主細胞は、上述されたもののごとく適するプロモーターの制御下にｒｅｐタンパク質を安定に含有する。最も望ましくは、本態様において、不可欠のｒｅｐタンパク質が誘導可能なプロモーターの制御下に発現される。別の態様において、ｒｅｐタンパク質はｔｒａｎｓで宿主細胞に供給される。宿主細胞にｔｒａｎｓで送達される場合、ｒｅｐタンパク質は、選択されたｒｅｐタンパク質の宿主細胞中での発現を指図するのに必要な配列を含有するプラスミドを介して送達しうる。最も望ましくは、宿主細胞にｔｒａｎｓで送達される場合、キャプシドタンパク質を運搬するプラスミドはｒＡＡＶをパッケージングするのに必要とされる他の配列、例えばｒｅｐおよびｃａｐ配列もまた
運搬する。
【０１０７】
従って、一態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、単一の核酸分子上で宿主細胞にトランスフェクトされることができ、そして該細胞中で１個のエピソームとして安定に存在しうる。別の態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は細胞の染色体中に安定に組み込まれる。別の態様は、宿主細胞中で一過性に発現されるｒｅｐおよびｃａｐ配列を有する。例えば、こうしたトランスフェクションのための有用な核酸分子は、５’から３’へ、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に挿入された任意のスペーサー、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子配列、およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列を含んでなる。
【０１０８】
場合によっては、ｒｅｐおよび／若しくはｃａｐ配列は、宿主細胞中に導入されるべきである他のＤＮＡ配列を含有する１ベクター上で供給しうる。例えば、ベクターはミニ遺伝子を含んでなるｒＡＡＶ構築物を含有しうる。ベクターは、ヘルパー機能をコードする遺伝子、例えばアデノウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ４ ＯＲＦ６、ならびにＶＡＩ ＲＮＡの遺伝子の１種若しくはそれより多くを含みうる。
【０１０９】
好ましくは、本構築物で使用されるプロモーターは、当業者に既知の若しくは上で論考されたところの構成的、誘導可能な若しくは本来のプロモーターのいずれでもありうる。一態様において、ＡＡＶ Ｐ５プロモーター配列を使用する。これらの配列のいずれかを提供するためのＡＡＶの選択は本発明を制限しない。
【０１１０】
別の好ましい態様において、ｒｅｐのプロモーターは、導入遺伝子の調節エレメントに関して上で論考されたような誘導可能なプロモーターである。ｒｅｐ発現のための１種の好ましいプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含んでなるベクターを、Ｔ７ポリメラーゼを構成的に若しくは誘導可能にのいずれかで発現する細胞にトランスフェクト若しくは形質転換する。１９９８年３月１２日公開の国際特許公開第ＷＯ ９８／１００８８号明細書を参照されたい。
【０１１１】
スペーサーはベクターの設計における任意の一要素である。スペーサーは、プロモーターとｒｅｐ遺伝子のＡＴＧ開始部位との間に挿入されるＤＮＡ配列である。スペーサーはいかなる所望の設計を有してもよい。すなわち、それはヌクレオチドの無作為の配列でありうるか、あるいは、それはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードしうる。スペーサーは開始／終止およびポリＡ部位を典型的に組み込む遺伝子を含有しうる。スペーサーは、原核生物若しくは真核生物からの非コーディングＤＮＡ配列、反復非コーディング配列、転写制御を伴わないコーティング配列若しくは転写制御を伴うコーディング配列でありうる。スペーサー配列の２種の例示的供給源はファージラダー配列若しくは酵母ラダー配列であり、それらは例えばとりわけＧｉｂｃｏ若しくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商業的に入手可能である。スペーサーは、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０およびｃａｐ遺伝子産物を正常レベルで発現されるままにしてｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８遺伝子産物の発現を低下させるのに十分ないかなる大きさのものであってもよい。スペーサーの長さは、従って約１０ｂｐから約１０．０ｋｂｐまで、好ましくは約１００ｂｐないし約８．０ｋｂｐの範囲の範囲にわたりうる。組換えの可能性を低下させるため、スペーサーは、好ましくは長さ２ｋｂｐ未満であるが；しかしながら、本発明はそのように制限されない。
【０１１２】
ｒｅｐおよびｃａｐを提供する分子（１種若しくは複数）が宿主細胞中に一過性に存在しうる（すなわちトランスフェクションにより）とは言え、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の一方若しくは双方およびそれらの発現を制御するプロモーター（１種若しくは複数）が、例えばエピソームとして若しくは宿主細胞の染色体中への組み込みにより宿主細胞中で安定に発現されることが好ましい。本発明の態様を構築するために使用される方法は、
上の参考文献に記述されるもののような慣習的な遺伝子工学若しくは組換え工学技術である。本明細は本明細書に提供される情報を使用して特定の構築物の具体的に説明する例を提供する一方、当業者は、スペーサー、Ｐ５プロモーター、ならびに少なくとも１個の翻訳開始および終止シグナルを包含する他のエレメントの選択、ならびにポリアデニル化部位の任意の付加を使用して、他の適する構築物を選択かつ設計しうる。
【０１１３】
本発明の別の態様において、ｒｅｐ若しくはｃａｐタンパク質は宿主細胞により安定に提供されうる。
【０１１４】
Ｃ．ヘルパー機能
パッケージング宿主細胞は、本発明のｒＡＡＶをパッケージングするためにヘルパー機能をもまた必要とする。場合によっては、これらの機能はヘルペスウイルスにより供給しうる。最も望ましくは、必要なヘルパー機能は、上述されたものおよび／若しくはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサス（米国）を包含する多様な供給元から入手可能であるようなヒト若しくはヒト以外の霊長類のアデノウイルス供給源からそれぞれ提供される。現在好ましい一態様において、宿主細胞は、Ｅ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物、および／若しくはＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物を提供されかつ／若しくは含有する。宿主細胞はＶＡＩ ＲＮＡのような他のアデノウイルス遺伝子を含有しうるが、しかしこれらの遺伝子は必要とされない。好ましい一態様において、他のアデノウイルス遺伝子若しくは遺伝子機能が宿主細胞中に存在しない。
【０１１５】
「Ｅ１ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ」により、それはＥ１ａ若しくはいずれかの機能的Ｅ１ａ部分をコードするいかなるアデノウイルス配列も意味している。Ｅ２ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡおよびＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡが同様に定義される。アデノウイルス遺伝子若しくはその機能的部分のいかなる対立遺伝子若しくは他の改変もまた包含される。こうした改変は、アデノウイルスの機能を何らかの様式で高めるための慣習的な遺伝子工学若しくは変異原性技術を用いて意図的に導入することができ、ならびにそれらの天然に存在する対立遺伝子バリアントでありうる。これらのアデノウイルス遺伝子の機能を達成するようにＤＮＡを操作するためのこうした改変および方法は当業者に既知である。
【０１１６】
アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／若しくはＥ４ＯＲＦ６遺伝子産物、ならびにいずれかの他の所望のヘルパー機能は、細胞中でのそれらの発現を可能にするいずれの手段を使用しても提供し得る。これらの産物をコードする配列のそれぞれは別個のベクター上にありうるか、または１種若しくはそれより多くの遺伝子が同一ベクター上にありうる。ベクターは、プラスミド、コスミドおよびウイルスを包含する当該技術分野で既知若しくは上で開示されたいずれかのベクターでありうる。ベクターの宿主細胞中への導入は、とりわけ、トランスフェクション、感染、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含する当該技術分野で既知若しくは上で開示されたところのいずれの手段によっても達成しうる。アデノウイルス遺伝子の１種若しくはそれより多くが宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれうるか、エピソームとして安定に発現されうるか、若しくは一過性に発現されうる。遺伝子産物は全部、エピソーム上で一過性に発現されうるか、若しくは安定に組込まれうるか、または遺伝子産物のいくつかが安定に発現されうる一方で他者が一過性に発現される。さらに、アデノウイルス遺伝子のそれぞれのプロモーターは、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーター若しくは本来のアデノウイルスプロモーターから独立に選択しうる。プロモーターは、生物体若しくは細胞の特定の生理学的状態（すなわち分化状態により、または複製若しくは静止期細胞で）により、あるいは例えば外因性に添加した因子により調節しうる。
【０１１７】
Ｄ．宿主細胞およびパッケージング細胞株
宿主細胞それ自身は、原核生物（例えば細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を包含する真核生物細胞を包含するいずれの生物学的生物体からも選択しうる。とりわけ望ましい宿主細胞は、Ａ５４９、ＷＥＨ１、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを包含する哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のような細胞を制限なしに包含するいずれかの哺乳動物種のなかから選択する。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明の制限でなく；また、哺乳動物細胞の型、すなわち筋芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などもそうでない。使用される細胞に対する要件は、それがＥ１、Ｅ２ａおよび／若しくはＥ４ ＯＲＦ６以外のいかなるアデノウイルス遺伝子も運搬せず；それがｒＡＡＶの産生の間に汚染するウイルスの相同的組換えをもたらし得るいかなる他のウイルス遺伝子も含有せず；そしてそれがＤＮＡの感染若しくはトランスフェクションおよびトランスフェクトされたＤＮＡの発現が可能であることである。好ましい一態様において、宿主細胞は細胞中でｒｅｐおよびｃａｐが安定にトランスフェクトされているものである。
【０１１８】
本発明で有用な一宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする配列で安定に形質転換されかつアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６ ＤＮＡならびに上述されたところのミニ遺伝子を運搬する構築物でトランスフェクトされている宿主細胞である。Ｂ−５０（国際特許出願公開第ＷＯ ９９／１５６８５号明細書）若しくは米国特許第５，６５８，７８５号明細書に記述されるもののような安定なｒｅｐおよび／若しくはｃａｐを発現する細胞株もまた同様に使用しうる。別の所望の宿主細胞はＥ４ ＯＲＦ６を発現するのに十分である最少のアデノウイルスＤＮＡを含有する。なお他の細胞株を、本発明の新規ＡＡＶ９ ｃａｐ配列を使用して構築し得る。
【０１１９】
本発明の宿主細胞の製造は選択されたＤＮＡ配列の集成のような技術を必要とする。この集成は慣習的技術を利用して達成しうる。こうした技術は、公知でありかつ上で引用されたＳａｍｂｒｏｏｋらに記述されるｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組合せたアデノウイルスおよびＡＡＶゲノムのオーバーラップオリゴヌクレオチド配列の使用、合成の方法、ならびに所望のヌクレオチド配列を提供するいずれかの他の適する方法を包含する。
【０１２０】
宿主細胞中への（プラスミド若しくはウイルスとしての）分子の導入は、当業者に既知かつ本明細を通じて論考されるところの技術を使用してもまた達成しうる。好ましい態様において、標準的トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ_４トランスフェクション若しくは電気穿孔法、および／またはヒト胎児由来腎臓細胞株ＨＥＫ２９３（ｔｒａｎｓに作用するＥ１タンパク質を提供する機能的アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するヒト腎細胞株）のような細胞株中へのハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによる感染を使用する。
【０１２１】
当業者により生成されるＡＡＶ９／ＨＵ．１４に基づくベクターは、ＡＡＶ９／ＨＵ．１４に対する中和抗体がヒト集団で見出されていないため、選択される宿主細胞への遺伝子送達および遺伝子治療患者に有益である。当業者は、当業者に既知の多様な技術を使用して、本明細書に提供されるＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドタンパク質を含有する他のｒＡＡＶウイルスベクターを容易に製造しうる。ＡＡＶ９／ＨＵ．１４配列および別の供給源からのＡＡＶキャプシドを含有するなお他のｒＡＡＶウイルスベクターを同様に製造しうる。
【０１２２】
当業者は、本発明の新規ＡＡＶ配列を、これらおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達のための他のウイルスベクター系での使用に容易に適合させ得ることを理解するであろう。同様に、当業者は、多様なｒＡＡＶおよびｒＡＡＶ以外のベクター系での使用のために本発明のＡＡＶゲノムの他のフラグメントを容易に選択し得る。こうしたベクター系は、例えば、とりわけレンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス系を包含しうる。これらのベクター系の選択は本発明の制限でない。
【０１２３】
従って、本発明はさらに、本発明の新規ＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列を使用して生成されるベクターを提供する。こうしたベクターは、治療的分子の送達およびワクチンレジメンでの使用のためを包含する多様な目的上有用である。本発明の新規ＡＡＶのキャプシドを含有する組換えＡＡＶが治療的分子の送達にとりわけ望ましい。これら、若しくは本発明の新規ＡＡＶ配列を含有する他のベクター構築物を、ワクチンレジメン、例えばサイトカインの共送達、若しくは免疫原それ自身の送達に使用しうる。
【０１２４】
ＩＶ．組換えウイルスおよびそれらの用途
本明細書に記述される技術を使用して、当業者は、本発明のＡＡＶのキャプシドを有する、または本発明のＡＡＶの１種若しくはそれより多くのフラグメントを含有するキャプシドを有するｒＡＡＶを生成し得る。一態様において、単一のＡＡＶ、例えばｈｕ．１４／ＡＡＶ９［配列番号１２３］からの完全長のキャプシドを利用し得る。別の態様において、別の選択されたＡＡＶ若しくは同一のＡＡＶの異種の（すなわち連続しない）部分からの配列とインフレームで融合した本発明の新規ＡＡＶキャプシドの１種若しくはそれより多くのフラグメントを含有する完全長のキャプシドを生成しうる。例えば、ｒＡＡＶはＡＡＶ９／ＨＵ．１４の新規超可変領域配列の１種若しくはそれより多くを含有しうる。あるいは、本発明の独特のＡＡＶ配列を他のウイルス若しくはウイルス以外の配列を含有する構築物で使用しうる。場合によっては、組換えウイルスはＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の１種若しくはそれより多くをコードするＡＡＶ ｒｅｐ配列を運搬しうる。
【０１２５】
Ａ．ウイルスの送達
別の局面において、本発明は、本発明のＡＡＶ９／ＨＵ．１４配列（若しくはその機能的フラグメント）を用いて生成した組換えウイルスベクターで選択された宿主細胞をトランスフェクト若しくは感染させることを必要とする、宿主への導入遺伝子の送達方法を提供する。送達方法は当業者に公知でありかつ本発明の制限でない。
【０１２６】
望ましい一態様において、本発明は宿主への導入遺伝子のＡＡＶに媒介される送達方法を提供する。本方法は、選択された導入遺伝子の発現を指図する配列の制御下に選択された導入遺伝子およびＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含有する組換えウイルスベクターで、選択された宿主細胞をトランスフェクト若しくは感染させることを必要とする。
【０１２７】
場合によっては、宿主からのサンプルを、選択されたＡＡＶ供給源（例えば血清型）に対する抗体の存在について最初にアッセイしうる。中和抗体を検出するための多様なアッセイ形式が当業者に公知である。こうしたアッセイの選択は本発明の制限でない。例えば、Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、３（３）：３０６−３１２（１９９７年３月）およびＷ．Ｃ．Ｍａｎｎｉｎｇら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、９：４７７−４８５（１９９８年３月１日）を参照されたい。本アッセイの結果を使用して、特定の１供給源のキャプシドタンパク質を含有するどのＡＡＶベクターが送達に好ましいかを、例えばそのキャプシド供給源に特異的な中和抗体の非存在により決定しうる。
【０１２８】
本方法の一局面において、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むベクターの送達
は、異なるＡＡＶキャプシドタンパク質を含むベクターを介する遺伝子の送達に先行しても若しくはその後に続いてもよい。従って、ｒＡＡＶベクターを介する遺伝子送達を、選択された宿主細胞への反復遺伝子送達に使用しうる。望ましくは、その後投与されるｒＡＡＶベクターは第一のｒＡＡＶベクターと同一の導入遺伝子を運搬するが、しかし、その後投与されるベクターは第一のベクターと異なる供給源（および好ましくは異なる血清型）のキャプシドタンパク質を含有する。例えば、第一のベクターがＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドタンパク質を有する場合、その後投与されるベクターは他のＡＡＶのなかから、場合によっては別の血清型若しくは別の同源系統群から選択されるキャプシドタンパク質を有しうる。
【０１２９】
場合によっては、複数のｒＡＡＶベクターを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで鎖状体化して単一のベクターゲノムを形成するｒＡＡＶベクターの共投与により大型の導入遺伝子若しくは複数の導入遺伝子を送達し得る。こうした一態様において、第一のＡＡＶは単一導入遺伝子（若しくはその１サブユニット）を発現する発現カセットを運搬することができ、そして、第二のＡＡＶは宿主細胞中での共発現のため第二の導入遺伝子（若しくは異なるサブユニット）を発現する発現カセットを運搬しうる。第一のＡＡＶは多シストロン性の構築物の第一の一片（例えばプロモーターおよび導入遺伝子若しくはサブユニット）である発現カセットを運搬することができ、そして第二のＡＡＶは多シストロン性の構築物の第二の一片（例えば導入遺伝子若しくはサブユニットおよびポリＡ配列）である発現カセットを運搬しうる。多シストロン性の構築物のこれら二片がｉｎ ｖｉｖｏで鎖状体化して、第一および第二のＡＡＶにより送達される導入遺伝子を共発現する単一のベクターゲノムを形成する。こうした態様において、第一の発現カセットを運搬するｒＡＡＶベクターおよび第二の発現カセットを運搬するｒＡＡＶベクターを単一の製薬学的組成物中で送達し得る。他の態様において、２種若しくはそれより多くのｒＡＡＶベクターは、実質的に同時にまたは相互の直前若しくは後に投与し得る別個の製薬学的組成物として送達される。
【０１３０】
上述された組換えベクターは、公表された方法に従って宿主細胞に送達しうる。好ましくは生理学的に適合性の担体に懸濁したｒＡＡＶを、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物患者に投与しうる。適する担体は、移入ウイルスが向けられる適応症を鑑みて当業者により容易に選択されうる。例えば、１種の適する担体は、多様な緩衝溶液とともに処方されうる生理的食塩水を包含する（例えばリン酸緩衝生理的食塩水）。他の例示的担体は、滅菌生理的食塩水、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、アガー、ペクチン、ラッカセイ油、ゴマ油および水を包含する。担体の選択は本発明の制限でない。
【０１３１】
場合によっては、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（１種若しくは複数）に加え、保存剤若しくは化学的安定剤のような他の慣習的製薬学的成分を含有しうる。適する例示的保存剤はクロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを包含する。適する化学的安定剤はゼラチンおよびアルブミンを包含する。
【０１３２】
該ベクターは、細胞をトランスフェクトしかつ過度の有害な影響を伴わずに若しくは医学の技術分野の当業者により決定され得る医学的に許容可能な生理学的効果を伴い治療上の利益を提供するのに十分なレベルの遺伝子移入および発現を提供するのに十分な量で投与される。慣習的および製薬学的に許容可能な投与経路は、限定されるものでないが所望の器官（例えば肝（場合によっては肝動脈を介して）若しくは肺）への直接送達、経口、吸入、鼻内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口投与経路を挙げることができる。投与経路は所望の場合に組み合わせうる。
【０１３３】
ウイルスベクターの投薬量は、主として、治療されている状態、患者の齢、体重および
健康状態のような因子に依存することができ、そして従って患者間で異なりうる。例えば、ウイルスベクターの治療上有効なヒト投薬量は、一般に、約１×１０^９から１×１０^１６までのゲノムウイルスベクターの濃度を含有する約０．１ｍＬから約１００ｍＬまでの溶液の範囲にある。大型の器官（例えば肝、筋、心および肺）への送達に好ましいヒト投薬量は、約１ないし１００ｍＬの容量で１ｋｇあたり約５×１０^１０ないし５×１０^１３ＡＡＶゲノムでありうる。眼への送達に好ましい投薬量は、約０．１ｍＬないし１ｍＬの容量で約５×１０^９ないし５×１０^１２ゲノムコピーである。投薬量は、いかなる副作用に対しても治療上の利益の均衡を図るように調節することができ、そして、こうした投薬量は組換えベクターを使用する治療的応用に依存して変動しうる。導入遺伝子の発現のレベルをモニターして、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクターをもたらす投薬頻度を決定し得る。場合によっては、治療の目的上記述されるものに類似の投薬量レジメンを、本発明の組成物を使用する免疫化に利用しうる。
【０１３４】
本発明のＡＡＶ含有ベクターによる送達のための治療的製品および免疫原性製品の例を下に提供する。これらのベクターは、本明細書に記述されるところの多様な治療若しくはワクチンレジメンに使用しうる。加えて、これらのベクターは所望の治療および／若しくはワクチンレジメン中で１種若しくはそれより多くの他のベクター若しくは有効成分と組合せで送達しうる。
【０１３５】
Ｂ．治療的導入遺伝子
導入遺伝子によりコードされる有用な治療的製品は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦα、アクチビン、インヒビンを包含するトランスフォーミング成長因子αスーパーファミリーのいずれか１種、若しくは骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１〜１５のいずれか、成長因子のヘレグルイン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１種、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、絨毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか１種、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグならびにチロシン加水分解酵素を制限なしに包含するホルモンならびに増殖および分化因子を包含する。
【０１３６】
他の有用な導入遺伝子産物は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬ−２５（例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を包含する）、単球化学遊走物質タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドのようなサイトカインおよびリンホカインを制限なしに包含する免疫系を調節するタンパク質を包含する。免疫系により産生される遺伝子産物もまた本発明で有用である。これらは、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子、ならびに工作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子を制限なしに包含する。有用な遺伝子産物は、補体調節タンパク質、膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９のような補体調節タンパク質もまた包含す
る。
【０１３７】
なお他の有用な遺伝子産物は、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の受容体のいずれか１種を包含する。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体およびスカベンジャー受容体を包含するコレステロール調節および／若しくは脂質調節のための受容体を包含する。本発明はまた、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体ならびに他の核受容体を包含するステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーのような遺伝子産物も包含する。加えて、有用な遺伝子産物は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、ならびに翼状らせんタンパク質のフォークヘッドファミリーのような転写因子を包含する。
【０１３８】
他の有用な遺伝子産物は、カルバモイル合成酵素１、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸合成酵素、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニン水酸化酵素、α−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素、シスタチオンβ−合成酵素、分枝状鎖ケト酸脱炭酸酵素、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡ脱水素酵素、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシン脱炭酸酵素、Ｈ−プロテイン、Ｔ−プロテイン、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィン遺伝子産物［例えばミニ若しくはミクロジストロフィン］を包含する。なお他の有用な遺伝子産物は、酵素の不足した活性から生じる多様な状態で有用である酵素補充療法で有用でありうるような酵素を包含する。例えば、マンノース−６−リン酸を含有する酵素は、リソゾーム蓄積症（例えば適する遺伝子はβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードするものを包含する）の治療で利用しうる。
【０１３９】
なお他の有用な遺伝子産物は、血友病Ｂ（第ＩＸ因子を包含する）ならびに血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子ならびにヘテロ二量体のＬ鎖およびＨ鎖ならびにＢ欠損ドメインのようなそのバリアントを包含する；米国特許第６，２００，５６０号および同第６，２２１，３４９号明細書）を包含する血友病の処置に使用されるものを包含する。第ＶＩＩＩ因子遺伝子は２３５１アミノ酸をコードし、そして該タンパク質は６ドメインを有し、アミノから末端のカルボキシ末端までＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と呼称される［Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：３３０（１９８４）；Ｖｅｈａｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３７（１９８４）；およびＴｏｏｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：３３７（１９８４）］。ヒト第ＶＩＩＩ因子は細胞内でプロセシングされて、Ａ１、Ａ２およびＢドメインを含有するＨ鎖ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含有するＬ鎖を主として含んでなるヘテロ二量体を生じる。一本鎖ポリペプチドおよびヘテロ二量体の双方が、Ｂドメインを遊離しかつＡ１およびＡ２ドメインよりなるＨ鎖をもたらすＡ２ドメインとＢドメインの間のトロンビン切断により活性化されるまで、不活性前駆体として血漿中を循環する。Ｂドメインは活性化された凝血原の形態のタンパク質では除去されている。加えて、本来のタンパク質中でＢドメインに隣接する２本のポリペプチド鎖（「ａ」および「ｂ」）は二価のカルシウム陽イオンに結合している。
【０１４０】
いくつかの態様において、ミニ遺伝子は、１０アミノ酸のシグナル配列をコードする第
ＶＩＩＩ因子Ｈ鎖の最初の５７塩基対、ならびにヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列を含んでなる。代替の態様において、ミニ遺伝子は、Ａ１およびＡ２ドメイン、ならびにＢドメインのＮ末端からの５アミノ酸および／若しくはＢドメインのＣ末端の８５アミノ酸、ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインをさらに含んでなる。なお他の態様において、第ＶＩＩＩ因子Ｈ鎖およびＬ鎖をコードする核酸が、Ｂドメインの１４アミノ酸をコードする４２核酸により分離される単一のミニ遺伝子で提供される［米国特許第６，２００，５６０号明細書］。
【０１４１】
本明細書で使用されるところの治療上有効な量は、被験体の血液が凝固するのにそれがかかる時間を短縮するのに十分な量の第ＶＩＩＩ因子を産生するＡＡＶベクターの量である。一般に、正常レベルの第ＶＩＩＩ因子の１％未満を有する重症の血友病患者は、非血友病患者についてのおよそ１０分に比較して６０分より長い全血凝固時間を有する。
【０１４２】
本発明はいずれかの特定の第ＶＩＩＩ因子配列に制限されない。多くの天然のおよび組換えの形態の第ＶＩＩＩ因子が単離かつ生成されている。天然に存在するおよび組換えの形態の第ＶＩＩ因子の例は、米国特許第５，５６３，０４５号、同第５，４５１，５２１号、同第５，４２２，２６０号、同第５，００４，８０３号、同第４，７５７，００６号、同第５，６６１，００８号、同第５，７８９，２０３号、同第５，６８１，７４６号、同第５，５９５，８８６号、同第５，０４５，４５５号、同第５，６６８，１０８号、同第５，６３３，１５０号、同第５，６９３，４９９号、同第５，５８７，３１０号、同第５，１７１，８４４号、同第５，１４９，６３７号、同第５，１１２，９５０号、同第４，８８６，８７６号明細書；国際特許公開第ＷＯ ９４／１１５０３号、同第ＷＯ ８７／０７１４４号、同第ＷＯ ９２／１６５５７号、同第ＷＯ ９１／０９１２２号、同第ＷＯ ９７／０３１９５号、同第ＷＯ ９６／２１０３５号および同第ＷＯ ９１／０７４９０号明細書；欧州特許出願第ＥＰ ０ ６７２ １３８号、同第ＥＰ ０ ２７０ ６１８号、同第ＥＰ ０ １８２ ４４８号、同第ＥＰ ０ １６２ ０６７号、同第ＥＰ ０ ７８６ ４７４号、同第ＥＰ ０ ５３３ ８６２号、同第ＥＰ ０ ５０６ ７５７号、同第ＥＰ ０ ８７４ ０５７号、同第ＥＰ ０ ７９５ ０２１号、同第ＥＰ ０ ６７０ ３３２号、同第ＥＰ ０ ５００ ７３４号、同第ＥＰ ０ ２３２ １１２号および同第ＥＰ ０ １６０ ４５７号明細書；Ｓａｎｂｅｒｇら、ＸＸｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｆｅｄ．Ｏｆ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ（１９９２）、ならびにＬｉｎｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３２：１９（１９９５）を包含する特許および学術文献に見出し得る。
【０１４３】
上述された第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列は、組換えの方法を使用して、若しくは該配列を包含することが既知のベクターからそれを派生させることにより得ることができる。さらに、所望の配列を、フェノール抽出およびｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡのＰＣＲのような標準的技術を使用して、それを含有する細胞および組織から直接単離し得る［例えばＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい］。ヌクレオチド配列はまた、クローン化されるよりはむしろ合成で製造し得る。完全な配列は、標準的方法により製造したオーバーラップオリゴヌクレオチドから集成し得、そして完全なコーディング配列に集成し得る［例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５７（１９８１）；Ｎａｍｂａｒｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９（１９８４）；およびＪａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１（１９８４）を参照されたい。
【０１４４】
さらに、本発明はヒト第ＶＩＩＩ因子に制限されない。事実、本発明は、限定されるものでないがコンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコおよびウマ）、家畜（例えばウシ、ヤギおよびヒツジ）、実験動物、海棲哺乳類、大型のネコなどを挙げることができるヒト以外の動物からの第ＶＩＩＩ因子を包含することを意図している。
【０１４５】
ＡＡＶベクターは、それ自身生物学的に活性でないがそれでもなお被験体に投与される場合に血液凝固時間を改良若しくは復帰させる第ＶＩＩＩ因子のフラグメントをコードする核酸を含有しうる。例えば、上で論考されたとおり、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は２個のポリペプチド鎖、すなわちプロセシングの間に切断されるＢドメインにより分離されたＨ鎖およびＬ鎖を含んでなる。本発明により示されるとおり、第ＶＩＩＩ因子のＨおよびＬ鎖でレシピエント細胞を共形質導入することは、生物学的に活性の第ＶＩＩＩ因子の発現に至る。大部分の血友病患者は該鎖の一方（例えばＨ若しくはＬ鎖）のみに突然変異若しくは欠失を含有するため、患者において欠損の鎖のみを投与して他方の鎖を供給することが可能でありうる。
【０１４６】
他の有用な遺伝子産物は、挿入、欠失若しくはアミノ酸置換を含有する天然に存在しないアミノ酸配列を有するキメラ若しくはハイブリッドポリペプチドのような天然に存在しないポリペプチドを包含する。例えば、一本鎖の工作された免疫グロブリンはある種の免疫無防備状態の患者で有用であり得る。他の型の天然に存在しない遺伝子配列は、アンチセンス分子、および標的の過剰発現を低下させるのに使用し得るリボザイムのような触媒的核酸を包含する。
【０１４７】
遺伝子の発現の低下および／若しくは調節は、癌および乾癬がそうであるように、過剰増殖する細胞を特徴とする過剰増殖状態の処置にとりわけ望ましい。標的ポリペプチドは、正常細胞に比較して過剰増殖細胞中で独占的に若しくはより高レベルで産生されるポリペプチドを包含する。標的抗原は、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのような癌遺伝子、ならびに転位遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦによりコードされるポリペプチドを包含する。標的抗原としての癌遺伝子産物に加え、抗癌処置および保護的レジメンの標的ポリペプチドは、Ｂ細胞リンパ腫により作成される抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を包含し、それらは、いくつかの態様において自己免疫疾患の標的抗原としてもまた使用される。モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるポリペプチドおよび葉酸結合ポリペプチドを包含する、腫瘍細胞中でより高レベルで見出されるポリペプチドのような、他の腫瘍関連ポリペプチドを標的ポリペプチドとして使用し得る。
【０１４８】
他の適する治療的ポリペプチドおよびタンパク質は、細胞受容体および「自己」に向けられた抗体を産生する細胞を包含する自己免疫と関連する標的に対する広範囲にわたる保護免疫応答を与えることにより、自己免疫疾患および障害に苦しめられている個体を処置するのに有用でありうるものを包含する。Ｔ細胞媒介性の自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する。これらの疾患のそれぞれは、内因性抗原に結合しかつ自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特徴とする。
【０１４９】
Ｃ．免疫原性導入遺伝子
適しては、本発明のＡＡＶベクターは、該ベクター内に含有されるＡＡＶ配列に対する免疫応答の生成を回避する。しかしながら、これらのベクターは、それにもかかわらず、該ベクターにより運搬される導入遺伝子の発現を可能にして選択された抗原に対する免疫応答を誘導する様式で処方しうる。例えば、免疫応答を促進するため、導入遺伝子は構成的プロモーターから発現させることができ、該ベクターは本明細書に記述されるとおり免疫増強し（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）得、かつ／若しくは該ベクターを変性組織に置くことができる。
【０１５０】
適する免疫原性導入遺伝子の例は多様なウイルス科から選択されるものを包含する。免
疫応答が望ましいとみられる所望のウイルス科の例は、一般的な風邪の症例の約５０％の原因であるライノウイルス属を包含するピコルナウイルス科；ポリオウイルス、コックサッキーウイルス、エコーウイルスおよびＡ型肝炎ウイルスのようなヒトエンテロウイルスを包含するエンテロウイルス属；ならびに主としてヒト以外の動物での口蹄疫の原因であるアプトウイルス属を包含する。ウイルスのピコルナウイルス科内で、標的抗原はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＧを包含する。他のウイルス科はアストロウイルスおよびカルシウイルス科を包含する。カルシウイルス科は、流行性胃腸炎の重要な原因病原体であるノーウォーク群のウイルスを包含する。ヒトおよびヒト以外の動物で免疫応答を誘導するための抗原の標的設定での使用に望ましいなお別のウイルス科は、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、ならびにベネズエラ、東部および西部ウマ脳炎ウイルスを包含するアルファウイルス属、ならびに風疹ウイルスを包含するルビウイルス属を包含するトガウイルス科である。フラビウイルス科は、デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介脳炎ウイルスを包含する。他の標的抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス、または感染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸ウイルス（ブタ）、ブタヘマグルチナチン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎ）脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）のような多数のヒト以外のウイルス、ならびに、一般的な風邪および／または非Ａ、Ｂ若しくはＣ型肝炎を引き起こすことがありかつ重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の推定の原因を包含するヒト呼吸器コロナウイルスを包含するコロナウイルス科から生成しうる。コロナウイルス科内で、標的抗原は、Ｅ１（Ｍすなわちマトリックスタンパク質ともまた呼ばれる）、Ｅ２（Ｓすなわちスパイクタンパク質ともまた呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥすなわちヘマグルチン−エルテロース（ｅｌｔｅｒｏｓｅ）ともまた呼ばれる）糖タンパク質（全部のコロナウイルスに存在するわけではない）若しくはＮ（ヌクレオキャプシド）を包含する。なお他の抗原はアルテリウイルス科およびラブドウイルス科を標的としうる。ラブドウイルス科は、ベシクロウイルス属（例えば水疱性口内炎ウイルス）および一般的なリッサウイルス（例えば狂犬病）を包含する。ラブドウイルス科内で、適する抗原はＧタンパク質若しくはＮタンパク質に由来しうる。マルブルクおよびエボラウイルスのような出血性熱ウイルスを包含するフィロウイルス科が抗原の適する供給源となりうる。パラミクソウイルス科は、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹およびイヌジステンパーを包含するモルビリウイルス、ならびにＲＳウイルスを包含するニューモウイルスを包含する。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科内で分類され、そして抗原の適する供給源である（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）。ブニヤウイルス科は、ブニヤウイルス（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス（ケニヤ出血熱）、ハンタウイルス（プレマラはヘマハギン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス（ナイロビ羊病）属および多様な割り当てられていないブンガウイルス（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓｅ）を包含する。アレナウイルス科はＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。抗原の別の供給源はボルナウイルス科である。レオウイルス科は、レオウイルス、ロタウイルス（小児で急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルスおよびクルチウイルス（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）（コロラドダニ熱、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）属を包含する。レトロウイルス科は、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩ、レンチビリナル（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）（ＨＩＶ、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルスおよびスプマビリナル（ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｌ）を包含する）のようなヒトおよび家畜の疾患を包含するオンコウイルス（ｏｎｃｏｖｉｒｉｎａｌ）亜科を包含する。パボーバウイルス科は、ポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス）ならびにパピローマウイルス亜科（癌若しくは乳頭腫の悪性の進行と関連する）を包含する。アデノウイルス科は呼吸器疾患および／若しくは腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を包含する。パルボウ
イルス科はネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルスを包含する。ヘルペスウイルス科は、シンプレックスウイルス（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、ワリセロウイルス（偽性狂犬病、帯状疱疹）属を包含するアルファヘルペスウイルス亜科、およびサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）を包含するベータヘルペスウイルス亜科、ならびに、リンホクリプトウイルス、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、６Ａ、６Ｂおよび７型ヒトヘルペスウイルス、カポシ肉腫関連のヘルペスウイルスならびにセルコピテシン（ｃｅｔｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ）ヘルペスウイルス（Ｂウイルス）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルスならびにラディノウイルス属を包含するガンマヘルペスウイルス亜科を包含する。ポックスウイルス科は、オルトポックスウイルス（大疱瘡（天然痘）およびワクシニア（牛痘））、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス属を包含するチョルドポックスウイルス亜科、ならびにエントモポックスウイルス亜科を包含する。ヘパドナウイルス科はＢ型肝炎ウイルスを包含する。抗原の適する供給源となりうる１種の分類されないウイルスは、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスおよびプリオンである。抗原の供給源となる別のウイルスはニパンウイルスである。なお他のウイルス供給源は、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスおよびブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスを包含しうる。アルファウイルス科はウマ動脈炎ウイルスおよび多様な脳炎ウイルスを包含する。
【０１５１】
本発明は、ヒトおよびヒト以外の脊椎動物を感染させる細菌、真菌、寄生性微生物若しくは多細胞寄生生物を包含する他の病原体に対しヒト若しくはヒト以外の動物を免疫するのに有用であるか、または癌細胞若しくは腫瘍細胞からである免疫原もまた包含しうる。細菌性病原体の例は、病原性グラム陽性球菌は肺炎球菌；ブドウ球菌（およびそれにより産生されるトキシン、例えばエンテロトキシンＢ）；ならびに連鎖球菌を包含するを包含する。病原性のグラム陰性球菌は、髄膜炎菌；淋菌を包含する。病原性の腸グラム陰性桿菌は、腸内細菌科；シュードモナス、アシネトバクテリア（ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびエイケネラ（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疽；サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；シゲラ（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；ヘモフィルス（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）；モラクセラ（ｍｏｒａｘｅｌｌａ）；軟性下疳菌（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）、ブルセラ（ｂｒｕｃｅｌｌａ）種（ブルセラ症）；野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）および他のエルジニア（ｙｅｒｓｉｎｉａ）（パスツレラ）；ストレプトバチルス モニリフォルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびスピリルムを包含し；グラム陽性桿菌はリステリア モノシトゲネス（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；エリジペロスリックス ルシパチエ（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァン症（鼠径部肉芽腫）；およびバルトネラ症を包含する。病原性嫌気性細菌により引き起こされる疾患は、破傷風；ボツリヌス中毒（クロストリズム ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびそのトキシン）；ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのεトキシン；他のクロストリジウム属；結核；らい；ならびに他のミコバクテリアを包含する。病原性のスピロヘータ疾患は梅毒；トレポネーマ症；イチゴ腫、ピンタおよび風土病性梅毒；ならびにレプトスピラ症を包含する。より高病原性の細菌および病原性真菌により引き起こされる他の感染症は、鼻疽（バークホルデリア マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ））；放線菌症；ノカルジア症；クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症およびコクシジオイデス真菌症；カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症；スポロトリクス症；パラコクシジオイデス真菌症、ペトリエリジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫およびクロモミコーシス；ならびに皮膚糸状菌症を包含する。リケッチア感染症は、発
疹チフス、ロッキー山熱、Ｑ熱（コクシエラ ブルネティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ））およびリケッチア痘を包含する。マイコプラスマおよびクラミジア感染症の例は：マイコプラスマ肺炎；性病性リンパ肉芽腫；オウム病；および周産期クラミジア感染症を包含する。病原性真核生物は病原性原生動物および蠕虫を包含し、また、それらにより生じられる感染症は：アメーバ症；マラリア；リーシュマニア；トリパノソーマ症；トキソプラスマ症；ニューモシスチス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）；Ｔｒｉｃｈａｎｓ；トキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）；バベシア症；ジアルジア症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）すなわち吸虫（ｆｌｕｋｅｓ）；および条虫（ｃｅｓｔｏｄｅ）（条虫（ｔａｐｅｗｏｒｍ））感染症を包含する。
【０１５２】
これらの生物体および／若しくはそれらにより産生されるトキシンの多くは、生物学的攻撃での使用のための潜在性を有する剤として疾病対策センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）［（ＣＤＣ）、米国保健省の部門］により同定された。例えば、これらの生物学的剤のいくつかは、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびそのトキシン（ボツリヌス中毒）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）、大疱瘡（天然痘）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）、ならびにウイルス性出血熱［フィロウイルス（例えばエボラ、マルブルク］、ならびにアレナウイルス［例えばラッサ、マチュポ］）（それらの全部は現在カテゴリーＡの剤に分類されている）；コクシエラ ブルネティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）の種（ブルセラ症）、バークホルデリア マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、バークホルデリア シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（類鼻疽）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびそのトキシン（リシントキシン）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのトキシン（εトキシン）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の種およびそれらのトキシン（エンテロトキシンＢ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）（オウム病）、水の安全性に対する脅威（例えばコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｌｅｒａｅ）、クリトスポリジウム パルブム（Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ））、発疹チフス（発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ ｐｏｗａｚｅｋｋｉ））、ならびにウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えばベネズエラウマ脳炎；東部ウマ脳炎；西部ウマ脳炎）；（それらの全部は現在カテゴリーＢの剤として分類されている）；ならびにニパンウイルスおよびハンタウイルス（現在カテゴリーＣの剤として分類されている）を包含する。加えて、そのように分類されるか若しくは異なって分類される他の生物体が、将来同定かつ／若しくはこうした目的上使用されうる。本明細書に記述されるウイルスベクターおよび他の構築物が、これらの生物学的剤への感染症若しくはそれらとの他の有害反応を予防かつ／若しくは処置することができるこれらの生物体、ウイルス、それらのトキシン若しくは他の副生成物からの抗原を送達するのに有用であることが容易に理解されるであろう。
【０１５３】
Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するための本発明のベクターの投与はそれらのＴ細胞を排除するためのＣＴＬを包含する免疫応答を導き出す。慢性関節リウマチ（ＲＡ）において、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特異的可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７およびＶ−１７を包含する。従って、これらのポリペプチドの少なくとも１種をコードする核酸配列の送達は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。多発性硬化症（ＭＳ）において、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特異的可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−７およびＶ−１０を包含する。従って、これらのポリペプチドの少なくとも１種をコードする核酸配列の送達は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とすることができる免
疫応答を導き出すことができる。強皮症において、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特異的可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４およびＶ−１６、Ｖ−３Ｃ、Ｖ−７、Ｖ−１４、Ｖ−１５、Ｖ−１６、Ｖ−２８およびＶ−１２を包含する。従って、これらのポリペプチドの少なくとも１種をコードする核酸分子の送達は、強皮症に関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。
【０１５４】
従って、本発明のｒＡＡＶ由来の組換えウイルスベクターは、生物体が１種若しくはそれより多くのＡＡＶ供給源に対する中和抗体を有する場合であっても、選択した導入遺伝子を選択した宿主細胞にｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏで送達し得る効率的な遺伝子移入ベヒクルを提供する。一態様において、ｒＡＡＶおよび細胞をｅｘ ｖｉｖｏで混合し；感染した細胞を慣習的方法論を使用して培養し；そして形質導入された細胞を患者に再注入する。
【０１５５】
これらの組成物は、保護免疫を誘導することを包含する治療的目的上および免疫感作のための遺伝子送達にとりわけ良好に適する。さらに、本発明の組成物は所望の遺伝子産物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生にもまた使用しうる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生のため、所望の産物（例えばタンパク質）は、所望の産物をコードする分子を含有するｒＡＡＶでの宿主細胞のトランスフェクション、および発現を可能にする条件下で細胞培養物を培養することの後に所望の培養物から得ることができる。発現された産物をその後、所望のとおり精製かつ単離しうる。適するトランスフェクション、細胞培養、精製および単離技術は当業者に既知である。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】ポアソン補正距離測定値とともにネイバー−ジョイニング ヒューリスティックを使用して構築した系統分類学的関係を示す樹状図である。該関係は単離されたＡＡＶ ｖｐ１キャプシドタンパク質に基づいて決定され、単離されたＡＡＶは同源系統群にグルーピングした。個々のキャプシドクローンの群は、それらの共通の祖先に基づき同源系統群に分類されている。同源系統群の命名法はＡからＦに進み；サブタイプは同源系統群文字、次いで数字により表す。
【図２Ａ−２ＡＥ】本発明のＡＡＶ ｖｐ１キャプシドタンパク質（個々の配列の番号付けを報告する）、ならびに以前に公表されたＡＡＶ１［配列番号２１９］；ＡＡＶ２［配列番号２２１］；ＡＡＶ３−３［配列番号２１７］；ＡＡＶ４−４［配列番号２１８］；ＡＡＶ５［配列番号２１６］；ＡＡＶ６［配列番号２２０］；ＡＡＶ７［配列番号２２２］；ＡＡＶ８［配列番号２２３］、ならびに；ｒｈ．２５／４２−１５；２９．３／ｂｂ．１；ｃｙ．２；２９．５／ｂｂ．２；ｒｈ．３２、ｒｈ．３３、ｒｈ．３４、ｒｈ．１０；ｒｈ．２４；ｒｈ１４；ｒｈ．１６；ｒｈ．１７、ｒｈ．１２、ｒｈ．１８、ｒｈ．２１（以前は４１．１０と命名された）；ｒｈ．２５（以前は４１．１５と命名された）；ｒｈ２；ｒｈ．３１；ｃｙ．３；ｃｙ．５；ｒｈ．１３；ｃｙ．４；ｃｙ．６；ｒｈ．２２；ｒｈ．１９；ｒｈ．３５；ｒｈ．３７；ｒｈ．３６；ｒｈ．２３；ｒｈ．８；ならびにｃｈ．５［米国特許出願公開第２００３／０１３８７７２ Ａ１号（２００３年７月２４日）］のアミノ酸配列のアライメントである。本発明の配列は、ｈｕ．１４／ＡＡＶ９［配列番号１２３］；ｈｕ．１７［配列番号８３］、ｈｕ．６［配列番号８４］、ｈｕ．４２［配列番号８５］、ｒｈ．３８［配列番号８６］、ｈｕ．４０［配列番号８７］、ｈｕ．３７［配列番号８８］、ｒｈ．４０［配列番号９２］、ｒｈ．５２［配列番号９６］；ｒｈ．５３［配列番号９７］；ｒｈ．４９［配列番号１０３］；ｒｈ．５１［配列番号１０４］；ｒｈ．５７［配列番号１０５］；ｒｈ．５８［配列番号１０６］、ｒｈ．６１［配列番号１０７］；ｒｈ．５０［配列番号１０８］；ｒｈ．４３［配列番号１６３］；ｒｈ．６２［配列番号１１４］；ｒｈ．４８［配列番号１１５］；４−９／ｒｈ．５４（配列番号１１６）；および４−１９／ｒｈ．５５（配列番号１１７）；ｈｕ．３１［配列番号１２１］；ｈｕ．３２［配列番号１２２］；ｈｕ．３４［配列番号１２５］；ｈｕ．４５［配列番号１２７］；ｈｕ．４７［配列番号１２８］；ｈｕ．１３［配列番号１２９］；ｈｕ．２８［配列番号１３０］；ｈｕ．２９［配列番号１３２］；ｈｕ．１９［配列番号１３３］；ｈｕ．２０［配列番号１３４］；ｈｕ．２１［配列番号１３５］；ｈｕ．２３．２［配列番号１３７］；ｈｕ．２２［配列番号１３８］；ｈｕ．２７［配列番号１４０］；ｈｕ．４［配列番号１４１］；ｈｕ．２［配列番号１４３］；ｈｕ．１［配列番号１４４］；ｈｕ．３［配列番号１４５］；ｈｕ．２５［配列番号１４６］；ｈｕ．１５［配列番号１４７］；ｈｕ．１６［配列番号１４８］；ｈｕ．１８［配列番号１４９］；ｈｕ．７［配列番号１５０］；ｈｕ．１１［配列番号１５３］；ｈｕ．９［配列番号１５５］；ｈｕ．１０［配列番号１５６］；ｈｕ．４８［配列番号１５７］；ｈｕ．４４［配列番号１５８］；ｈｕ．４６［配列番号１５９］；ｈｕ．４３［配列番号１６０］；ｈｕ．３５［配列番号１６４］；ｈｕ．２４［配列番号１３６］；ｒｈ．６４［配列番号９９］；ｈｕ．４１［配列番号９１］；ｈｕ．３９［配列番号１０２］；ｈｕ．６７［配列番号１９８］；ｈｕ．６６［配列番号１９７］；ｈｕ．５１［配列番号１９０］；ｈｕ．５２［配列番号１９１］；ｈｕ．４９［配列番号１８９］；ｈｕ．５６［配列番号１９２］；ｈｕ．５７［配列番号１９３］；ｈｕ．５８［配列番号１９４］；ｈｕ．６３［配列番号１９５］；ｈｕ．６４［配列番号１９６］；ｈｕ．６０［配列番号１８４］；ｈｕ．６１［配列番号１８５］；ｈｕ．５３［配列番号１８６］；ｈｕ．５５［配列番号１８７］；ｈｕ．５４［配列番号１８８］；ｈｕ．６［配列番号８４］；およびｒｈ．５６［配列番号１５２］を包含する。これらのキャプシド配列は配列表（引用することにより本明細書に組み込まれる）にもまた再現されている。
【図３Ａ−３ＣＮ】本発明のＡＡＶ ｖｐ１キャプシドタンパク質（個々の配列の番号付けを報告する）、ならびに以前に公表されたＡＡＶ５（配列番号１９９）；ＡＡＶ３−３（配列番号２００）；ＡＡＶ４−４（配列番号２０１）；ＡＡＶ１（配列番号２０２）；ＡＡＶ６（配列番号２０３）；ＡＡＶ２（配列番号２１１）；ＡＡＶ７（配列番号２１３）およびＡＡＶ８（配列番号２１４）；ｒｈ．２５／４２−１５；２９．３／ｂｂ．１；ｃｙ．２；２９．５／ｂｂ．２；ｒｈ．３２、ｒｈ．３３、ｒｈ．３４、ｒｈ．１０；ｒｈ．２４；ｒｈ．１４、ｒｈ．１６、ｒｈ．１７、ｒｈ．１２、ｒｈ．１８、ｒｈ．２１（以前は４１．１０と命名された）；ｒｈ．２５（以前は４１．１５と命名された；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５７）；ｒｈ．２；ｒｈ．３１；ｃｙ．３；ｃｙ．５；ｒｈ．１３；ｃｙ．４；ｃｙ．６；ｒｈ．２２；ｒｈ．１９；ｒｈ．３５；ｒｈ．３７；ｒｈ．３６；ｒｈ．２３；ｒｈ．８；ならびにｃｈ．５［米国特許出願公開第２００３／０１３８７７２ Ａ１号（２００３年７月２４日）］の核酸配列のアライメントである。本発明の核酸配列は、ｈｕ．１４／ＡＡＶ９（配列番号３）；ＬＧ−４／ｒｈ．３８（配列番号７）；ＬＧ−１０／ｒｈ．４０（配列番号１４）；Ｎ７２１−８／ｒｈ．４３（配列番号４３）；１−８／ｒｈ．４９（配列番号２５）；２−４／ｒｈ．５０（配列番号２３）；２−５／ｒｈ．５１（配列番号２２）；３−９／ｒｈ．５２（配列番号１８）；３−１１／ｒｈ．５３（配列番号１７）；５−３／ｒｈ．５７（配列番号２６）；５−２２／ｒｈ．５８（配列番号２７）；２−３／ｒｈ．６１（配列番号２１）；４−８／ｒｈ．６４（配列番号１５）；３．１／ｈｕ．６（配列番号５）；３３．１２／ｈｕ．１７（配列番号４）；１０６．１／ｈｕ．３７（配列番号１０）；ＬＧ−９／ｒｈ．３９（配列番号２４）；１１４．３／ｈｕ．４０（配列番号１１）、１２７．２／ｈｕ．４１（配列番号６）；１２７．５／ｈｕ．４２（配列番号８）；およびｈｕ．６６（配列番号１７３）；２−１５／ｒｈ．６２（配列番号３３）；１−７／ｒｈ．４８（配列番号３２）；４−９／ｒｈ．５４（配列番号４０）；４−１９／ｒｈ．５５（配列番号３７）；５２／ｈｕ．１９（配列番号６２）、５２．１／ｈｕ．２０（配列番号６３）、５４．５／ｈｕ．２３（配列番号６０）、５４．２／ｈｕ．２２（配列番号６７）、５４．７／ｈｕ．２４（配列番号６６）、５４．１／ｈｕ．２１（配列番号６５）、５４．４Ｒ／ｈｕ．２７（配列番号６４）；４６．２／ｈｕ．２８（配列番号６８）；４６．６／ｈｕ．２９（配列番号６９）；１２８．１／ｈｕ．４３（配列番号８０）；１２８．３／ｈｕ．４４（配列番号８１）ならびに１３０．４／ｈｕ．４８（配列番号７８）；３．１／ｈｕ．９（配列番号５８）；１６．８／ｈｕ．１０（配列番号５６）；１６．１２／ｈｕ．１１（配列番号５７）；１４５．１／ｈｕ．５３（配列番号１７６）；１４５．６／ｈｕ．５５（配列番号１７８）；１４５．５／ｈｕ．５４（配列番号１７７）；７．３／ｈｕ．７（配列番号５５）；５２／ｈｕ．１９（配列番号６２）；３３．４／ｈｕ．１５（配列番号５０）；３３．８／ｈｕ．１６（配列番号５１）；５８．２／ｈｕ．２５（配列番号４９）；１６１．１０／ｈｕ．６０（配列番号１７０）；Ｈ−５／ｈｕ．３（配列番号４４）；Ｈ−１／ｈｕ．１（配列番号４６）；１６１．６／ｈｕ．６１（配列番号１７４）；ｈｕ．３１（配列番号１）；ｈｕ．３２（配列番号２）；ｈｕ．４６（配列番号８２）；ｈｕ．３４（配列番号７２）；ｈｕ．４７（配列番号７７）；ｈｕ．６３（配列番号２０４）；ｈｕ．５６（配列番号２０５）；ｈｕ．４５（配列番号７６）；ｈｕ．５７（配列番号２０６）；ｈｕ．３５（配列番号７３）；ｈｕ．５８（配列番号２０７）；ｈｕ．５１（配列番号２０８）；ｈｕ．４９（配列番号２０９）；ｈｕ．５２（配列番号２１０）；ｈｕ．１３（配列番号７１）；ｈｕ．４６（配列番号２１２）；ｈｕ．５６（配列番号５４）；ｈｕ．２（配列番号４８）；ｈｕ．１８（配列番号５２）；ｈｕ．４（配列番号４７）；ならびにｈｕ．６７（配列番号２１５）を包含する。これらの配列は配列表（引用することにより本明細書に組み込まれる）でもまた再現されている。
【図４Ａ−４Ｄ】新規の霊長類ＡＡＶに基づくベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子移入効率の評価を提供する。ＡＡＶベクターを、ＡＡＶ１、２、５、７、８および６、ならびにｃｈ．５、ｒｈ．３４、ｃｙ．５、ｒｈ．２０、ｒｈ．８およびＡＡＶ９のキャプシドを用いて、記述された［Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９：１１８５４−１１８５９（２００２年９月３日）］とおりシュードタイピングした。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究（図４Ａ）のため、９５ウェルプレートに接種した８４−３２細胞（アデノウイルス血清型のＥ４を発現する２９３細胞）に、シュードタイピングしたＡＡＶＣＭＶＥＧＦＰベクターを細胞あたり１×１０^４ＧＣのＭＯＩで感染させた。相対的ＥＧＦＰ形質導入効率を、感染後４８時間にＵＶ顕微鏡を使用して緑色細胞のパーセントとして推定し、そしてＹ軸上に示した。ｉｎ ｖｉｖｏ研究のため、分泌型レポーター遺伝子Ａ１ＡＴを発現するベクターを、ＮＣＲヌードマウス（４〜６週齢）の肝（図４Ｂ）、肺（図４Ｃ）および筋（図４Ｄ）に、動物あたり１×１０^１１ＧＣの用量でそれぞれ門脈内（図４Ｂ）、気管内（図４Ｃ）および筋肉内注入（図４Ｄ）により投与した。血清Ａ１ＡＴ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を遺伝子移入後第２８日に比較し、そしてＹ軸上に提示した。Ｘ軸は分析したＡＡＶおよびそれらが属する同源系統群を示す。
【０１５７】
以下の実施例は本発明のいくつかの局面および態様を具体的に説明する。
実施例
【実施例１】
【０１５８】
霊長類ＡＡＶ配列のコンピュータ解析
Ａ．霊長類組織の収集
ヒト以外の霊長類の組織の供給源は以前に記述された［Ｎ．Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｋ．Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ編（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｌｋｉｎｓ、フィラデルフィア、２００１）、ｖｏｌ．２中、ｐｐ．２３２７−２３５９］。ヒト組織は、２つの主要な国のヒト組織提供元すなわちＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｄｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）により外科的処置若しくは死後の検査若しくは臓器ドナーのいずれかから収集した。本研究に使用したヒト組織は、結腸、肝、肺、脾、腎、脳、小腸、骨髄、心、リンパ節、骨格筋、卵巣、膵、胃、食道、子宮頚部、精巣および前立腺を包含した１８種の異なる組織型から構成された。組織サンプルは、異なる性別、人種（白人、アフリカ系米国人、アジア人およびヒスパニック）ならびに年齢（２
３〜８３歳）の個体の多彩な群からであった。分析した２５０例の個体からの２５９サンプルのうち、およそ２８％の組織が病変を伴った。
【０１５９】
Ｂ．ＡＡＶ配列の検出および単離
全細胞ＤＮＡを、以前に記述された［Ｒ．Ｗ．Ａｔｃｈｉｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９４、７５４−７５６（１９６５）］とおりヒトおよびヒト以外の霊長類の組織から抽出した。ヒトにおけるＡＡＶの分子頻度および組織分布は、ヒト以外の霊長類の分析に使用したものに類似であったプライマーおよび条件を使用するシグネチャ若しくは完全長いずれかのｃａｐ ＰＣＲにより決定した。ヒト以外の霊長類でのＡＡＶの拡張された一ファミリーの単離および特徴づけに使用した同一のＰＣＲクローニング戦略を、選択したヒト組織からのＡＡＶの単離で使用した。簡潔には、ｒｅｐの一部および完全長のｃａｐ配列を含有する３．１ｋｂのフラグメントをＰＣＲにより組織ＤＮＡから増幅しかつＴｏｐｏクローン化した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ヒトＡＡＶクローンを最初にＡＡＶ配列の多様性を同定するのを助ける制限マッピングにより分析し、それをその後、９９．９％の正確度を伴うＳｅｑＷｒｉｇｈｔ（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ、テキサス州ヒューストン）による完全配列分析にかけた。ヒト組織から単離した合計６７種のキャプシドクローンを特徴づけした（ｈｕ．１〜ｈｕ．６７）。ヒト以外の霊長類の組織から８６種のｃａｐクローンをシークェンシングし、そのなかで７０種のクローンはアカゲザルから、６クローンはカニクイザルから、３クローンはブタオザルから、２クローンはヒヒから、および５クローンはチンパンジーからであった。
【０１６０】
Ｃ．ＡＡＶ配列の分析
全部の連続した配列から、ＡＡＶキャプシドウイルスタンパク質（ｖｐ１）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を分析した。ＡＡＶキャプシドＶＰ１タンパク質配列を、ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８１^ＴＭプログラム［Ｈ．Ｄ．Ｍａｙｏｒ、Ｊ．Ｌ．Ｍｅｌｎｉｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ ２１０、３３１−３３２（１９９６）］を用いて整列し、そして、インフレームのＤＮＡアライメントを、ＢｉｏＥｄｉｔ^ＴＭ［Ｕ．Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ、Ｈ．Ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３４、５２−６３（１９８４）］ソフトウェアパッケージを用いて生じさせた。系統分類学は、ＭＥＧＡ^ＴＭｖ２．１およびＴｒｅｅＰｕｚｚｌｅ^ＴＭパッケージを用いて推論した。ネイバー−ジョイニング、最大節減および最尤度［Ｍ．Ｎｅｉ、Ｓ．Ｋｕｍａｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、２０００）；Ｈ．Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｋ．Ｓｔｒｉｍｍｅｒ、Ｍ．Ｖｉｎｇｒｏｎ、Ａ．ｖｏｎ Ｈａｅｓｅｌｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １８、５０２−４（２００２年３月）；Ｎ．Ｓａｉｔｏｕ，Ｍ．Ｎｅｉ、Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ４、４０６−２５（１９８７年７月）］アルゴリズムを使用して、単系統性（ｍｏｎｏｐｈｙｌｉｃ）群における配列の類似のクラスター形成を確認した。
【０１６１】
その後、全タンパク質配列のネイバー−ジョイニング系統樹から同源系統群を定義した。アミノ酸距離は、ポアソン補正を利用することにより推定した。ブーツストラップ分析を１０００個の複製物を用いて実施した。配列は、それらが０．０５遺伝距離以内に結合節を有した場合に単系統性とみなした。３個若しくはそれより多くの供給源から発する配列の一群を１同源系統群とみなした。ＡＡＶの系統分類学を、配列分析により組換えの証拠についてさらに評価した。ホモプラシーを分割分解（ｓｐｌｉｔ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）アルゴリズム［Ｈ．Ｊ．Ｂａｎｄｅｌｔ、Ａ．Ｗ．Ｄｒｅｓｓ、Ｍｏｌ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔ Ｅｖｏｌ １、２４２−５２（１９９２年９月）］の実行によりスクリーニングした。この様式で獲得された分割をその後、Ｓｉｍｐｌｏｔソフトウェアのブートスキャンアルゴリズム［Ｍ．ＮｅｉとＳ．Ｋｕｍａｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、２０００）］を利用して組換えについてさらに解析した。４００ｎｔのスライディング窓（ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ）（１０ｎｔ／段階）を使用して、１００のブーツストラップ複製物ネイバー−ジョイニング樹を得た。その後、分割分解およびネイバー−ジョイニング系統分類学を推定の組換えフラグメントから推論した。ブーツストラップ値の有意の改善、分割の減少およびそれらの親供給源を含むハイブリッド配列の再グルーピングを組換えの基準とみなした。
【０１６２】
８例の異なるヒト被験体から増幅した多数の多様なｃａｐ配列は、組換えおよびハイブリッドウイルスの形成と矛盾せず、Ｃａｐ ＤＮＡ配列の位置１４００の共通の破壊点周辺でＡＡＶ２（５’）およびＡＡＶ３（３’）に対する系統分類学的関係を示した。これは、アカゲザルの腸間膜リンパ節からの単離物から組換えが検出された、ｃａｐ遺伝子の一般的領域である［Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１００、６０８１−６０８６（２００２年５月１３日）］。選択のための全体的コドンに基づくＺ試験を、Ｎｅｉｂ−Ｇｏｊｏｂｏｒｉの方法［Ｒ．Ｍ．Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５、７９３−８０１（１９９４年７月）］を実行して実施した。
【０１６３】
系統分類学的解析を、ハイブリッドとして正に同定されたクローンを除外して反復した。この解析では、ガチョウおよびトリのＡＡＶを外集団として包含した［（Ｉ．Ｂｏｓｓｉｓ，Ｊ．Ａ．Ｃｈｉｏｒｉｎｉ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７、６７９９−８１０（２００３年６月）］。図１はネイバー−ジョイニング樹であり；類似の関係が最大節減および最大可能性解析を使用して得られた。
【０１６４】
本解析は１１の系統群を示し、それらを表１に要約する。６種のＡＡＶ同源系統群および５種の個別のＡＡＶクローン（若しくはクローンの組）の種の起源は、該配列がサンプリングで取得された数若しくは供給源ごとに表す。種およびグルーピングあたり集められた配列の総数をカッコ内に示す。同源系統群あたりの以前に記述された配列の参照が右の欄にある。Ｒｈｅｓｕｓ−アカゲザル；ｃｙｎｏ−カニクイザル；ｃｈｉｍｐ−チンパンジー；ｐｉｇｒａｉｌ−ブタオザル。
【０１６５】
【表１】

【０１６６】
上に示されたとおり、使用した標準的系統発生アルゴリズムで組換えが実行されないため、適正な系統樹を構成するために、それらの配列を解析から除外し、それらのうちそれらの組換えの祖先を確立した。全部の非組換え配列のネイバー−ジョイニング解析を、組換えを利用して進化した同源系統群と並べて表す。類似の出力を、異なるアルゴリズムを使用しかつ入力としてヌクレオチド配列を用いて生成させた。
【０１６７】
追加実験を実施して、以下の実施例に記述されるとおり、血清学的活性および向性により測定されるところの機能への系統分類学的関連性の関係を評価した。
【実施例２】
【０１６８】
新規ヒトＡＡＶの血清学的分析
先行する実施例で記述されたとおり得られた最後の同源系統群は、３例のヒトの単離物由来であり、そして以前に記述された血清型を含有しなかった。本同源系統群の代表的１メンバーに対しポリクローナル抗血清を生成させ、そして、以前に記述された血清型間の血清学的交差反応性の包括的研究を実施した。これは、新しいヒト同源系統群が他の既知の血清型と血清学的に別個であることを示し、そして従って同源系統群Ｆ（ＡＡＶ９により代表される）と呼ばれる。
【０１６９】
ＡＡＶ血清型１〜９に対するウサギポリクローナル抗体を、等しい容量のフロイントの不完全アジュバントと一緒にそれぞれ１×１０^１３ゲノムコピーのＡＡＶベクターを動物に筋肉内接種することにより生成させた。注入を第３４日に反復して抗体力価を促進した。ＡＡＶ１〜９間の血清学的交差反応性は、異なるＡＡＶ供給源由来のキャプシドでシュードタイピングしたレポーター遺伝子（ＡＡＶＣＭＶＥＧＦＰ、強化緑色蛍光タンパク質を運搬する）を運搬するベクターによる２９３細胞の形質導入に対するウサギ抗血清の阻害効果を評価することにより決定した。ＡＡＶＣＭＶＥＧＦＰベクターによる８４−３１細胞の形質導入をＵＶ顕微鏡下で評価した。２種のＡＡＶ間の血清学的関係の評価におい
て、異種および同種双方の血清の各ＡＡＶからのベクターを中和する能力を試験した。血清による中和が、同種ベクターよりも異種ベクターに対して相反する様式で少なくとも１６倍より低かった場合は、該２種のＡＡＶは別個の血清型とみなす。中和力価は以前に記述された［（Ｇ．Ｐ．Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９、１１８５４−９（２００２年９月３日）］とおり定義した。
【０１７０】
【表２】

【０１７１】
これらのデータは、構造的に異なるＡＡＶ５およびＡＡ１血清型の予期されない血清学的反応性（すなわち、異種／同種力価の比は逆滴定で１／４および１／８であった）を除き、異なるクローンおよび同源系統群の系統分類学的グルーピングを確認する。
【０１７２】
該結果は、ＡＡＶｈｕ．１４が独自の血清学的特性を有しかついずれかの既知のＡＡＶ血清型から生成した抗血清と有意の交差反応性を有しなかったことをさらに示した。ＡＡＶｈｕ．１４の血清学的独自性は、この試験で比較した全部の他のＡＡＶ血清型と８５％未満のアミノ酸配列の同一性を共有したキャプシド構造のその独自性によりさらに裏付けられた。それらの知見は、われわれがＡＡＶｈｕ．１４を新たな血清型ＡＡＶ９として命名するための根拠を提供した。
【実施例３】
【０１７３】
遺伝子移入ベクターとしての霊長類ＡＡＶの評価
ＧＦＰ若しくは分泌型レポーター遺伝子α−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）のいずれかを発現する組換えＡＡＶ２ゲノムを多様なクローンおよび比較のためそれぞれの霊長類ＡＡＶ同源系統群からの１種の代表的なメンバー由来のキャプシドでパッケージングした、シュードタイピングしたベクターを生成させることにより、ＡＡＶの生物学的向性を研究した。例えば、ＡＡＶ１から得られたデータは同源系統群Ａを、次いでＡＡＶ２を同源系統群Ｂ、Ｒｈ．３４をＡＡＶ４、ＡＡＶ７を同源系統群Ｄ、ＡＡＶ８を同源系統群Ｅ、そしてＡＡＶＨｕ．１４を同源系統群Ｆを代表するのに使用した。ＡＡＶ５、ＡＡＶＣｈ．５およびＡＡＶＲｈ．８は比較のための単一のＡＡＶ遺伝子型としてである。
【０１７４】
ベクターを、ＧＦＰ形質導入に基づきｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入効率について、ま
た、肝、筋若しくは肺でｉｎ ｖｉｖｏ形質導入効率について評価した（図４）。
【０１７５】
Ａ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ
強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現するベクターを使用して、８４−３１細胞中でのそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入効率を検査し、かつ、それらの血清学的特性を研究した。機能解析のため、多様なＡＡＶＣＭＶＥＧＦＰベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入を、９６ウェルプレートに接種しかつ細胞あたり１×１０^４ＧＣのＭＯＩのシュードタイピングしたＡＡＶＣＭＶＥＧＦＰベクターに感染させた８４−３１細胞で測定した。ＡＡＶベクターは、Ｇ．Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９、１１８５４−９（２００２年９月３日）に記述される技術を使用して、ＡＡＶ１、２、５、７、８、ならびに６種の他の新規ＡＡＶ（Ｃｈ．５、Ｒｈ．３４、Ｃｙ５、ｒｈ．２０、Ｒｈ．８およびＡＡＶ９）のキャプシドでシュードタイピングした。相対ＥＧＦＰ形質導入効率を、感染後４８時間にＵＶ顕微鏡を使用して推定した緑色細胞の０〜１０％、１０〜３０％、３０〜７０％および７０〜１００％に対応する０、１、２および３として評価した。
【０１７６】
Ｂ．ｉｎ ｖｉｖｏ
ｉｎ ｖｉｖｏ研究のため、ヒトα−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）をベクター中での感受性かつ定量的レポーター遺伝子として選択し、そしてＣＭＶ増強ニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下で発現させた。ＣＢプロモーターの使用は、高レベルの組織非特異的および構成的Ａ１ＡＴ遺伝子移入が達成されることを可能にし、かつ、目的のいかなる組織中でも遺伝子移入研究のための同一のベクター調製物の使用もまた可能にする。４ないし６週齢のＮＣＲヌードマウスを、肝、肺および筋に向けた遺伝子移入のためそれぞれ門脈内、気管内および筋肉内注入により動物あたり１×１０^１１ゲノムコピーの用量の新規ＡＡＶベクター（ＡＡＶＣＢｈＡ１ＡＴ）で処置した。遺伝子移入後異なる時点で血清サンプルを収集し、そしてＡ１ＡＴ濃度をＥＬＩＳＡに基づくアッセイにより測定し、そして、ベクターの投与経路に依存して、遺伝子移入後第２８日に多様な血清Ａ１ＡＴレベルに関して０、１、２および３として評価した（肝：０＝Ａ１ＡＴ＜４００ｎｇ／ｍｌ、１＝Ａ１ＡＴ ４００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、２＝Ａ１ＡＴ １０００〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ、３＝Ａ１ＡＴ＞１０，０００ｎｇ／ｍｌ；肺：０＝Ａ１ＡＴ＜２００ｎｇ／ｍｌ、１＝Ａ１ＡＴ ２００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、２＝Ａ１ＡＴ １０００〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ、３＝Ａ１ＡＴ＞１０，０００ｎｇ／ｍｌ；筋：０＝Ａ１ＡＴ＜１００ｎｇ／ｍｌ、１＝Ａ１ＡＴ １００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、２＝Ａ１ＡＴ １０００〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ、３＝Ａ１ＡＴ＞１０，０００ｎｇ／ｍｌ）。
【０１７７】
１種のヒトＡＡＶクローン２８．４／ｈｕ．１４（現在ＡＡＶ９と命名される）は、肝をＡＡＶ８に類似の効率で、肺をＡＡＶ５より２対数より良好に、そして筋をＡＡＶ１より優れて形質導入する能力を有する一方、２種の他のヒトクローン、２４．５および１６．１２（ｈｕ．１２およびｈｕ．１３）の成績は全３標的組織中でわずかであった。クローンＮ７２１．８（ＡＡＶｒｈ．４３）もまた全３組織中で高性能体である。
【０１７８】
ＡＡＶ９およびｒｈ ４３の遺伝子移入効率を、肝（ＡＡＶ８）、肺（ＡＡＶ５）および筋（ＡＡＶ１）の基準体（ｂｅｎｃｈ ｍａｒｋｅｒ）のものと比較してさらに分析するために、用量応答実験を実施した。双方の新しいベクターは、筋でＡＡＶ１より少なくとも１０倍より多い遺伝子移入を、肝でＡＡＶ８と類似の成績を、および肺でＡＡＶ５より２対数より効率的を示した。
【０１７９】
ＡＡＶの一群は、全３組織で、各組織中でそれらの基準体の成績に類似若しくはより優れた効率的な遺伝子効率を示したが出現した。今日まで、３種の新規ＡＡＶ（２種がアカゲザル（ｒｈ１０および４３）からならびに１種がヒト（ｈｕ．１４すなわちＡＡＶ９）
から）がこの範疇に入った。ネズミの肝、肺および筋におけるそれらの基準体に対するそれら３種のＡＡＶの相対遺伝子移入効率の直接比較は、最良の適合を伴う数種の霊長類ＡＡＶが厳格な生物学的選択および進化から「超」ウイルスとして進化したかもしれないことを示唆している。これらは遺伝子移入の応用にとりわけ良好に適する。
【０１８０】
Ｃ．生物学的活性のプロファイル
遺伝子移入の効率に関して生物学的活性の独特のプロファイルが、一組のクローンすなわち同源系統群のメンバー内で実質的な一致を伴い多様なＡＡＶについて示された。しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入はｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子移入の効率を予測しなかった。２種の異なるＡＡＶシュードタイプ間の生物学的活性を比較するためのアルゴリズムを、導入遺伝子発現のレベルおよび差違の累積解析の相対評価に基づいて開発した。
【０１８１】
ＡＡＶ対間のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子移入スコアの累積的差違を、以下の式、ベクターＡとＢとの間のスコアに関しての累積的機能的差違＝ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ａ−Ｂ）＋肺（Ａ−Ｂ）＋肝（Ａ−Ｂ）＋筋（Ａ−Ｂ）に従って計算しそして表（ＮＤ＝決定されない）に提示した。該数が小さくなるほど、機能ＡＡＶがより類似する。灰色で影を付けた領域に、配列中の差違のパーセントを太字斜体で表す。ｃａｐ構造中の差違のパーセントは、ギャップの対にした削除後のアミノ酸の差違の数を７５０（ＶＰ１タンパク質配列のアライメントの長さ）により除算することにより決定した。
【０１８２】
【表３】

【０１８３】
これらの研究はヒトにおけるパルボウイルスの研究に関する多数の問題を指摘する。広範囲のヒト組織中での内因性ＡＡＶ配列の頻度は、この群のウイルスへの天然の感染が極めて一般的であることを示唆している。ウイルス配列の広範な組織分布ならびに肝、脾および腸における頻繁な検出は、伝播が胃腸路を介して起こることおよびウイルス血症が該感染の一特徴でありうることを示す。
【０１８４】
ヒトおよびヒト以外の霊長類の双方に存在する配列の夥しい多様性は向性および血清学に関して機能的相関を有し、それが免疫エスケープのような現実の生物学的圧により駆動されることを示唆している。明らかに、組換えは、２種の以前に記述されたＡＡＶのハイブリッドである第二の最も一般的なヒト同源系統群により証明されるとおりこの多様性に寄与している。
【０１８５】
系統解析のトポロジーの検査は、ウイルスの進化とその宿主の制限の間の関係への洞察を示す。デペンドウイルス属全体がトリＡＡＶ由来であるようであり、Ｌｕｋａｓｈｏｖ
とＧｏｕｄｓｍｉｔ［（Ｖ．Ｖ．Ｌｕｋａｓｈｏｖ、Ｊ．Ｇｏｕｄｓｍｉｔ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５、２７２９−４０（２００１年３月）］と一致する。ＡＡＶ４およびＡＡＶ５単離物は他のＡＡＶのその後の発達から早期に分岐した。次の重要な節は種を２つの主要な単系統群に分割する。第一の群は単にヒトから単離されたクローンを含有し、そして同源系統群Ｂ、ＡＡＶ３クローン、同源系統群Ｃおよび同源系統群Ａを包含し；この群の種の制限に対する唯一の例外はｃｈ．５と呼ばれるチンパンジーからの単一クローンである。該属の残存するメンバーを表す他の単系統群はヒトおよびヒト以外の霊長類の双方由来である。この群は、サルから独占的に単離された同源系統群Ｄおよびｒｈ．８クローン、ならびにヒト特異的である同源系統群Ｆを包含する。この群内の残存する同源系統群（すなわち同源系統群Ｅ）はヒトおよび多数のヒト以外の霊長類種の双方からのメンバーを有し、種の障壁を越えた本同源系統群の伝播を示唆している。若干のヒトから単離された同源系統群Ｅのメンバーのキャプシド構造がヒト以外の霊長類からの若干に本質的に同一であり、宿主適応がほとんど起こらなかったことを示していることは興味深い。ＡＡＶ８由来ベクターの生物学の解析は、高レベルの遺伝子移入を伴う広範な組織向性を示し、これは感染性のより有望な範囲と矛盾せず、そしてその見かけの動物原性感染症を説明しうる。遺伝子移入のなおより広い範囲および効率が同源系統群Ｆについて示され、今日まで検出されていなかった交差種伝播の潜在性を強調した。
【０１８６】
潜伏期ＡＡＶの存在はヒトおよびヒト以外の霊長類全体に広範に散在し、そして、組換えおよび交差種障壁に対するそれらの見かけの素因は重要な問題を提起する。この組換え事象は、改変された毒性をもつ新たな感染性病原体の出現に至る潜在性を有する。この潜在性を評価することは、霊長類におけるＡＡＶ感染の臨床的続発症が未だ定義されなければならないという事実により混乱されている。加えて、肝でのＡＡＶ配列の高い頻度は、同種異系および異種肝移植の状況のヒト集団におけるウイルスの広まりに寄与しうる。最後に、ヒトにおける内因性ＡＡＶの知見は、ヒト遺伝子治療のためのＡＡＶの使用において意義を有する。野性型ＡＡＶが、これまで悪性と関連することなく霊長類において非常に高頻度であるという事実は、それがとりわけ癌原性ではないことを示唆している。事実、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の発現は形質転換を抑制することが示されたＰ．Ｌ．Ｈｅｒｍｏｎａｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７２、２５３−６１（１９８９年９月）］。
【実施例４】
【０１８７】
嚢胞性線維症気道疾患の処置のためのＡＡＶ２／９ベクター
今日まで、ＣＦ気道疾患の処置のための肺へのＣＦＴＲ遺伝子移入は、効果的な遺伝子移入に対して気道上皮が課す大きな障壁と組み合わさった乏しいベクターの性能により制限されていた。ＡＡＶ９キャプシドにパッケージングしたＡＡＶ２ゲノム（ＡＡＶ２／９）を多様な気道モデル系でＡＡＶ２／５と比較した。
【０１８８】
ニワトリβ−アクチンプロモーターの転写制御下に核を標的としたβ−ガラクトシダーゼ（ｎＬａｃＺ）遺伝子若しくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子いずれかを発現するＡＡＶ２／９の１×１０^１１ゲノムコピー（ｇｃ）の５０μｌの単回投与を、ヌードおよびまたＣ５７Ｂｌ／６マウスに鼻内に点滴注入した。２１日後に肺および鼻を遺伝子発現のため処理した。ＡＡＶ２／９−ＧＦＰで形質導入した対照動物においてはＬａｃＺ陽性細胞がみられなかった。ＡＡＶ２／９−ｎＬａｃＺは主として気道を成功裏に形質導入した一方、ＡＡＶ２／５−ｎＬａｃＺは主として肺胞および若干の気道に形質導入した。鼻気道上皮を横断して、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／９双方が、繊毛性および非繊毛性上皮細胞に形質導入した。
【０１８９】
上皮細胞特異的プロモーターが現在、ｉｎ ｖｉｖｏで気道細胞へのターゲッティングを改良することを評価されている。ｉｎ ｖｉｖｏの知見に基づき、ヒト気道上皮細胞へのＡＡＶ２／９の遺伝子移入効率を次に試験した。気道上皮細胞をヒト気管および気管支
から単離し、そしてコラーゲン被覆した膜支持体上の空気−液体界面（ＡＬＩ）で増殖させた。細胞が一旦分極しかつ分化したら、それらを尖部ならびに基底外側からＧＦＰを発現するＡＡＶ２／９若しくはＡＡＶ２／５で形質導入した。ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／９双方が基底外側表面からの上皮細胞の形質導入に成功した。しかしながら尖部表面に適用した場合に、ＡＡＶ２／９はＡＡＶ２／５に比較して形質導入された細胞の数の１０倍の増大をもたらした。現在、ヒト以外の霊長類の肺および鼻気道でのＡＡＶ２／９の遺伝子移入成績を評価中である。
【０１９０】
本実験は、ＡＡＶ２／９がネズミ肺の気道およびＡＬＩで増殖させた十分に分化したヒト気道上皮細胞に効率的に形質導入し得ることを示す。
【実施例５】
【０１９１】
成体ラット心におけるＡＡＶ１（２／１）およびＡＡＶ９（２／９）の直接注入の比較
２匹の成体（３月齢）ラットが、５×１０^１１粒子のＡＡＶ２／１若しくはＡＡＶ２／９の左室への単回注入を受領した。
【０１９２】
結果は目を見張らせるものであり、ｌａｃＺ組織化学により評価されるとおり、有意により多い発現がＡＡＶ２／１に比較してＡＡＶ２／９ベクターで成体ラット心において観察された。ＡＡＶ２／９は新生マウス心においてもまた優れた遺伝子移入を示す。
【実施例６】
【０１９３】
血友病Ｂ遺伝子治療のためのＡＡＶ２／９ベクター
本研究で、ＡＡＶ２／９ベクターが、従来のＡＡＶ供給源よりも血友病Ｂの肝および筋双方に向けた遺伝子治療のためのより効率的かつより少なく免疫原性のベクターであることが示される。
【０１９４】
肝に向けたアプローチのため、ＡＡＶ２／９のシュードタイピングしたベクターの評価をマウスおよびイヌ血友病モデルで実施した。免疫適格の血友病Ｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６背景の）で、長期の生理学的レベル超のイヌ第ＩＸ因子（ｃＦＩＸ、４１〜７０μｇ／ｍｌ）、および短縮された活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）が、肝特異的プロモーター（ＬＳＰ）およびウッドチャックＢ型肝炎転写後応答配列（ＷＰＲＥ）の下でｃＦＩＸが発現されるＡＡＶ２／７、２／８および２／９ベクターの１×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）／マウスの門脈内注入後に達成された。１０倍より低い用量（１×１０^１０ＧＣ／マウス）のＡＡＶ２／８ベクターは正常レベルのｃＦＩＸおよびａＰＴＴ時間を生じた。ノースカロリン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎｅ）（ＵＮＣ）の血友病Ｂイヌで、ＡＡＶ２ベクターで以前に処置したイヌへのＡＡＶ２／８ベクターの投与が成功裏であったことが以前に示され；ｃＦＩＸ発現は第二の門脈内注入（用量＝５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）後第６日に１０μｇ／ｍｌでピークに達し、その後徐々に減少しかつ試験中（１ １／２年）約７００ｎｇ／ｍｌ（正常レベルの１６％）で安定した。このレベルは、類似の用量のＡＡＶ２−ｃＦＩＸの単回注入を受領した血友病Ｂイヌからのものより約３倍より高かった。最近、２匹のナイーブな血友病Ｂイヌに５．２５×１０^１２ＧＣ／ｋｇの用量でＡＡＶ２／８ベクターを門脈内注入した。１匹のイヌ（雄性）のｃＦＩＸレベルは注入１０週後に正常レベルの３０％（１．５μｇ／ｍｌ）に達しそして１．３〜１．５μｇ／ｍｌで持続した一方、第二のイヌ（雌性）は正常レベルの約１０％のｃＦＩＸ発現を維持した。全血凝固時間（ＷＢＣＴ）およびａＰＴＴは双方とも注入後に短縮され、抗原が生物学的に活性であったことを示唆した。双方のイヌでの肝酵素（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＳＧＯＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＳＧＰＴ）は、外科手術後正常範囲に留まった。これらのＡＡＶを血友病Ｂの筋に向けた遺伝子治療についてもまた評価した。６種の異なるＡＡＶ供給源でパッケージングしたＡＡＶ−ＣＭＶ−ｃＦＩＸ−ＷＰＲＥ［ＣＭＶプロモーターの制御下
にｃＦＩＸを運搬しかつＷＰＲＥを含有するＡＡＶ］を、１×１０^１１ＧＣ／マウスの用量での筋肉内注入後に免疫適格の血友病Ｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６背景の）で比較した。ｃＦＩＸ遺伝子発現および抗体形成をモニターした。最高の発現は、ＡＡＶ２／８ベクターを注入したマウスの血漿で検出され（第４２日に１４６０±３９２ｎｇ／ｍｌ）、次いでＡＡＶ２／９（第４２日に７７３±１７１ｎｇ／ｍｌ）およびＡＡＶ２／７（第４２日に５００±３１１ｎｇ／ｍｌ）であった。レベルは５か月間維持された。驚くべきことに、ＡＡＶ２／１によるｃＦＩＸ発現は０〜２５３ｎｇ／ｍｌ（平均：６６±８２ｎｇ／ｍｌ）からの範囲にわたった。抗ｃＦＩＸ阻害物質（ＩｇＧ）が、ＡＡＶ２／１を注入したマウスの若干で検出された。これらのマウスでのｃＦＩＸ発現レベルは阻害物質レベルと良好に相関した。阻害物質形成のさらなるスクリーニングを、第２８日のサンプルで全ＡＡＶについて実施した。血友病ＢマウスはＡＡＶ２／２に対する最高の阻害物質形成を示し、次いでＡＡＶ２／５、そしてＡＡＶ２／１であった。散発的かつ低レベルのみの阻害物質がＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９を注入した動物で検出された。従って、いかなる有意の抗ＦＩＸ抗体形成も導き出さないより効率的かつ安全なベクターとしての血友病Ｂの筋に向けた遺伝子治療のための新たなＡＡＶ血清型２／９ベクターの利点が示される。
【実施例７】
【０１９５】
本発明の新規ｒｈ．４３ベクター
Ａ．ＡＡＶｒｈ．４３に基づくＡ１ＡＴ発現ベクターのマウス肝に向けた遺伝子移入におけるＡＡＶ８およびＡＡＶ９との比較
系統解析により同源系統群Ｅに属する新規ＡＡＶｒｈ．４３のベクターを、マウス肝への門脈内注入後のｈＡ１ＡＴレベルについてＡＡＶ８および新規ＡＡＶ９と比較した。より具体的には、シュードタイピングしたＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９ベクタ―をマウス肝に向けた遺伝子移入で比較した。動物あたり１×１０^１１ＧＣ、３×１０^１０ＧＣおよび１×１０^１０ＧＣの用量のシュードタイピングしたベクターを、４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに筋肉内投与した。血清サンプルを、ヒトα１アンチトリプシン（ｈＡ１ＡＴ）アッセイのためのベクター注入後第２８日に動物から収集した。
【０１９６】
該データは、新規ＡＡＶｒｈ．４３ベクターが実際にマウスモデルにおいてＡＡＶ９のものに類似の成績を有したことを示した。
【０１９７】
Ｂ．シュードタイピングしたＡＡＶベクターにより媒介されるマウス肝および筋への核標的ＬａｃＺ遺伝子移入。
本発明の新規ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．４３に基づくベクターをＡＡＶ１およびＡＡＶ２に基づくベクターと比較した。ベクターは、マウスあたり１×１０^１１ＧＣの用量で、肝を標的とするため門脈内に、若しくは筋肉内にＣ５７ＢＬ／６マウスの右前脛骨筋に筋肉内のいずれかで注入した。動物を遺伝子移入後第２８日に殺し、そしてＸ−ｇａｌ組織化学的染色のため目的の組織を収集した。
【０１９８】
ＡＡＶｒｈ．４３ベクターは、ＡＡＶ９に近いがしかしＡＡＶ１より少なくとも５倍より高かった遺伝子移入効率を示した。ＡＡＶｒｈ．４３の適正性を、遺伝子移入の広がりを組織化学的に可視化するためのレポーターとして核を標的とするＬａｃＺ遺伝子を使用して肝および筋双方でさらに解析した。
【０１９９】
Ｃ．ＡＡＶｒｈ．４３に基づくＡ１ＡＴ発現ベクターのマウス肺に向けた遺伝子移入におけるＡＡＶ５との比較
本発明の新規ｒｈ．４３に基づくベクターは、肺組織中ですばらしい遺伝子移入効力もまた示した。多様な用量（動物あたり１×１０^１０、３×１０^１０および１×１０^１１Ｇ
Ｃ）のシュードタイピングしたベクターを、４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス肺に気管内投与した。血清サンプルをｈＡ１ＡＴアッセイのため多様な時点で動物から収集した。
【０２００】
このベクターを、マウス肺への気管内点滴注入後に全身で検出されるｈＡ１ＡＴのレベルについて、多様な用量のＡＡＶ５と比較した。該データは、この新規ベクターがマウスモデルにおいてＡＡＶ５より少なくとも１００倍より効率的であったことを示した。
【実施例８】
【０２０１】
肝および肺に向けた遺伝子移入のためのマウスモデルにおける新規ヒトＡＡＶに基づくベクター
ヒトクローンＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．４１およびＡＡＶｈｕ．４７をシュードタイピングし、そして遺伝子移入の効力についてマウス組織中で試験した。ｈｕ．３７、ｈｕ．４１およびｈｕ．４７のキャプシドでシュードタイピングしたＡＡＶＣＢＡ１ＡＴベクターを、本明細書に記述される方法を使用して製造し、そして、４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに門脈内および気管内注入により投与した。血清サンプルをｈＡ１ＡＴアッセイのためベクター注入後第１４日に動物から収集し、アッセイは公表された技術に従って実施した。ＡＡＶｈｕ．４７はＡＡＶ２ファミリー（同源系統群Ｂ）のＡＡＶ２に属し、そしてヒト骨髄サンプルから単離した。ＡＡＶｈｕ．３７およびＡＡＶｈｕ．４１はそれぞれヒト精巣組織およびヒト骨髄サンプルからであった。系統分類学的に、それらはＡＡＶ８の同源系統群（同源系統群Ｅ）にある。
【０２０２】
注入した動物の血清Ａ１ＡＴ分析は、ＡＡＶｈｕ．４１およびＡＡＶｈｕ．４７が試験した３組織で不十分に機能したことを示した。しかしながら、ＡＡＶｈｕ．３７由来ベクターの遺伝子移入効力は、肝でＡＡＶ８および肺でＡＡＶ９のものに類似であった。
【０２０３】
本発明の主たる特徴または態様を以下に挙げる。
【０２０４】
態様１：少なくとも３種のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）メンバーを含んでなるＡＡＶ同源系統群であって、前記ＡＡＶ同源系統群の各メンバーが、ネイバー−ジョイニング ヒューリスティック（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ ｈｅｕｒｉｓｔｉｃ）で決定した場合に、１０００個の単離物当り少なくとも７５％のブーツストラップ（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）値および０．０５を超えないポアソン補正距離測定値により系統分類学的に関連づけられる、上記同源系統群。
【０２０５】
態様２：同源系統群が、１メンバーとしてＡＡＶ８を含んでなる同源系統群Ｅ、１メンバーとしてＡＡＶ７を含んでなる同源系統群Ｄ、１メンバーとしてＡＡＶ９を含んでなる同源系統群Ｆ、１メンバーとしてＡＡＶ２を含んでなる同源系統群Ｂ、および１メンバーとしてＨ２を含んでなる同源系統群Ｃよりなる群から選択される、態様１に記載のＡＡＶ同源系統群。
【０２０６】
態様３：前記ＡＡＶメンバーの１若しくはそれより多くが天然に存在しないＡＡＶである、態様１に記載の同源系統群。
【０２０７】
態様４：前記ＡＡＶメンバーの２若しくはそれより多くが天然に存在するＡＡＶである、態様１に記載の同源系統群。
【０２０８】
態様５：ＡＡＶ８および少なくとも２つの付加的なＡＡＶメンバーを含んでなるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）同源系統群Ｅであって、ネイバー−ジョイニング ヒューリスティックを用いて決定した場合に、１０００個の単離物あたり少なくとも７５％のブーツストラップ値および０．０５を超えないポアソン補正距離測定値により前記ＡＡＶ同源系統群
の各メンバー。
【０２０９】
態様６：前記ＡＡＶメンバーの１若しくはそれより多くが、ＡＡＶ８のキャプシド、配列番号１８３との少なくとも８５％のアミノ酸同一性をもつキャプシドを有する、態様５に記載のＡＡＶ同源系統群Ｅ。
【０２１０】
態様７：前記同源系統群が、少なくともＡＡＶ８ 配列番号１８３、４３．１／ｒｈ．２；ｒｈ．４；ｒｈ．８；４４．２／ｒｈ．１０；ｒｈ．２５；２９．３／ｂｂ．１；２９．５／ｂｂ．２；３０．１０／ｐｉ．１（配列番号２８および９３）、３０．１２／ｐｉ．２（配列番号３０および９５）、３０．１９／ｐｉ．３（配列番号２９および９４）、ＬＧ−４／ｒｈ．３８（配列番号７および８６）；ＬＧ−１０／ｒｈ．４０（配列番号１４および９２）；Ｎ７２１−８／ｒｈ．４３（配列番号４３および１６３）；１−８／ｒｈ．４９（配列番号２５および１０３）；２−４／ｒｈ．５０（配列番号２３および１０８）；２−５／ｒｈ．５１（配列番号２２および１０４）；３−９／ｒｈ．５２（配列番号１８および９６）；３−１１／ｒｈ．５３（配列番号１７および９７）；５−３／ｒｈ．５７（配列番号２６および１０５）；５−２２／ｒｈ．５８（配列２７および５８）；改変ｒｈ．５８（配列番号２３２）；２−３／ｒｈ．６１（配列番号２１および１０７）；４−８／ｒｈ．６４（配列番号１５および９９）；改変ｒｈ．６４（配列番号２３３）；３．１／ｈｕ．６（配列番号５および８４）；３３．１２／ｈｕ．１７（配列番号４および８３）；１０６．１／ｈｕ．３７（配列番号１０および８８）；ＬＧ−９／ｈｕ．３９（配列番号２４および１０２）；１１４．３／ｈｕ．４０（配列番号１１および８７）；１２７．２／ｈｕ．４１（配列番号６および９１）；１２７．５／ｈｕ．４２（配列番号８および８５）；ｈｕ．６６（配列番号１７３および１９７）；改変ｒｈ．２（配列番号２３１）；ならびにｈｕ．６７（配列番号１７４および１９８）を含んでなる、態様５に記載のＡＡＶ同源系統群Ｅ。
【０２１１】
態様８：態様５に記載の同源系統群Ｅの１つのＡＡＶ、但し、前記同源系統群のＡＡＶのいずれもＡＡＶ８のキャプシド、４３．１／ｒｈ．２；ｒｈ．４；ｒｈ．８；４４．２／ｒｈ．１０；ｒｈ．２５；２９．３／ｂｂ．１；若しくは２９．５／ｂｂ．２を含まない、上記ＡＡＶ。
【０２１２】
態様９：３０．１０／ｐｉ．１（配列番号２８および９３）、３０．１２／ｐｉ．２（配列番号３０および９５）、３０．１９／ｐｉ．３（配列番号２９および９４）、ＬＧ−４／ｒｈ．３８（配列番号７および８６）；ＬＧ−１０／ｒｈ．４０（配列番号１４および９２）；Ｎ７２１−８／ｒｈ．４３（配列番号４３および１６３）；１−８／ｒｈ．４９（配列番号２５および１０３）；２−４／ｒｈ．５０（配列番号２３および１０８）；２−５／ｒｈ．５１（配列番号２２および１０４）；３−９／ｒｈ．５２（配列番号１８および９６）；３−１１／ｒｈ．５３（配列番号１７および９７）；５−３／ｒｈ．５７（配列番号２６および１０５）；５−２２／ｒｈ．５８（配列番号２７および５８）；改変ｒｈ．５８（配列番号２３２）；２−３／ｒｈ．６１（配列番号２１および１０７）；４−８／ｒｈ．６４（配列番号１５および９９）；改変ｒｈ．６４（配列番号２３３）；３．１／ｈｕ．６（配列番号５および８４）；３３．１２／ｈｕ．１７（配列番号４および８３）；１０６．１／ｈｕ．３７（配列番号１０および８８）；ＬＧ−９／ｈｕ．３９（配列番号２４および１０２）；１１４．３／ｈｕ．４０（配列番号１１および８７）；１２７．２／ｈｕ．４１（配列番号６および９１）；１２７．５／ｈｕ．４２（配列番号８および８５）；ｈｕ．６６（配列番号１７３および１９７）；改変ｒｈ．２（配列番号２３１）；ならびにｈｕ．６７（配列番号１７４および１９８）よりなる群から選択される、態様８に記載のＡＡＶ。
【０２１３】
態様１０：ＡＡＶ７および少なくとも２種の付加的なＡＡＶメンバーを含んでなるアデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ）同源系統群Ｄであって、前記ＡＡＶ同源系統群の各メンバーが、ネイバー−ジョイニング ヒューリスティックを用いて決定した場合に、１０００個の単離物あたり少なくとも７５％のブーツストラップ値および０．０５を超えないポアソン補正距離測定値により系統分類学的に関連づけられる、上記ＡＡＶ同源系統群Ｄ。
【０２１４】
態様１１：前記同源系統群が、少なくともＡＡＶ供給源、すなわち、ＡＡＶ７；ｃｙ．２；ｃｙ．３；ｃｙ．４；ｃｙ．５；ｃｙ．６；ｒｈ．１３；ｒｈ．３７；ｒｈ．３６；ｒｈ．３５；２−１５／ｒｈ．６２（配列番号３３および１１４）；１−７／ｒｈ．４８（配列番号３２および１１５）；４−９／ｒｈ．５４（配列番号４０および１１６）；ならびに４−１９／ｒｈ．５５（配列番号３７および１１７）改変ｃｙ．５（配列番号２２７）；改変ｒｈ．１３（配列番号２２８）；ならびに改変ｒｈ．３７（配列番号２２９）を含んでなる、態様１０に記載のＡＡＶ同源系統群Ｄ。
【０２１５】
態様１２：態様１０に記載のＡＡＶ同源系統群Ｄの１つのＡＡＶ、但し、前記同源系統群のＡＡＶのいずれも、ＡＡＶ７のキャプシド 配列番号１８０および１８１；ＡＡＶ７；ｃｙ．２；ｃｙ．３；ｃｙ．４；ｃｙ．５；ｃｙ．６；ｒｈ．１３；ｒｈ．３７；ｒｈ．３６；ｒｈ．３５を含まない、上記ＡＡＶ。
【０２１６】
態様１３：２−１５／ｒｈ．６２（配列番号３３および１１４）；１−７／ｒｈ．４８（配列番号３２および１１５）；４−９／ｒｈ．５４（配列番号４０および１１６）；ならびに４−１９／ｒｈ．５５（配列番号３７および１１７）；改変ｃｙ．５（配列番号２２７）；改変ｒｈ．１３（配列番号２２８）；ならびに改変ｒｈ．３７（配列番号２２９）よりなる群から選択される、態様１２に記載のＡＡＶ。
【０２１７】
態様１４：ＡＡＶ２および少なくとも２つの付加的なＡＡＶメンバーを含んでなるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）同源系統群Ｂであって、前記ＡＡＶ同源系統群の各メンバーが、ネイバー−ジョイニング ヒューリスティックを用いて決定した場合に、１０００個の単離物あたり少なくとも７５％のブーツストラップ値および０．０５を超えないポアソン補正距離測定値により系統分類学的に関連づけられる、上記のＡＡＶ同源系統群Ｂ。
【０２１８】
態様１５：前記同源系統群が、少なくともＡＡＶ、すなわちＡＡＶ２、５２／ｈｕ．１９（配列番号６２および１３３）、５２．１／ｈｕ．２０（配列番号６３および１３４）、５４．５／ｈｕ．２３（配列番号６０および１３７）、５４．２／ｈｕ．２２（配列番号６７および１３８）、５４．７／ｈｕ．２４（配列番号６６および１３６）、５４．１／ｈｕ．２１（配列番号６５および１３５）、５４．４Ｒ／ｈｕ．２７（配列番号６４および１４０）；４６．２／ｈｕ．２８（配列番号６８および１３０）；４６．６／ｈｕ．２９（配列番号６９および１３２）；改変ｈｕ．２９（配列番号２２５）；１７２．１／ｈｕ．６３（配列番号１７１および１９５）；１７２．２／ｈｕ．６４（配列番号１７２および１９６）；２４．５／ｈｕ．１３（配列番号７１および１２９）；１４５．６／ｈｕ．５６（配列番号１６８および１９２）；ｈｕ．５７（配列番号１６９および１９３）；１３６．１／ｈｕ．４９（配列番号１６５および１８９）；１５６．１／ｈｕ．５８（配列番号１７９および１９４）；７２．２／ｈｕ．３４（配列番号７２および１２５）；７２．３／ｈｕ．３５（配列番号７３および１６４）；１２９．１／ｈｕ．４５（配列番号７６および１２７）；１３０．１／ｈｕ．４７（配列番号７７および１２８）；１４０．１／ｈｕ．５１（配列番号１６１および１９０）；ならびに１４０．２／ｈｕ．５２（配列番号１６７および１９１）を含んでなる、態様１４に記載のＡＡＶ同源系統群Ｂ。
【０２１９】
態様１６：態様１４に記載のＡＡＶ同源系統群Ｂの１メンバーＡＡＶ、但し、前記同源系統群のＡＡＶのいずれもＡＡＶ２のキャプシドを含まない、上記の１メンバーＡＡＶ。
【０２２０】
態様１７：５２／ｈｕ．１９（配列番号６２および１３３）、５２．１／ｈｕ．２０（配列番号６３および１３４）、５４．５／ｈｕ．２３（配列番号６０および１３７）、５４．２／ｈｕ．２２（配列番号６７および１３８）、５４．７／ｈｕ．２４（配列番号６６および１３６）、５４．１／ｈｕ．２１（配列番号６５および１３５）、５４．４Ｒ／ｈｕ．２７（配列番号６４および１４０）；４６．２／ｈｕ．２８（配列番号６８および１３０）；４６．６／ｈｕ．２９（配列番号６９および１３２）；改変ｈｕ．２９（配列番号２２５）；１７２．１／ｈｕ．６３（配列番号１７１および１９５）；１７２．２／ｈｕ．６４（配列番号１７２および１９６）；２４．５／ｈｕ．１３（配列番号７１および１２９）；１４５．６／ｈｕ．５６（配列番号１６８および１９２）；ｈｕ．５７（配列番号１６９および１９３）；１３６．１／ｈｕ．４９（配列番号１６５および１８９）；１５６．１／ｈｕ．５８（配列番号１７９および１９４）；７２．２／ｈｕ．３４（配列番号７２および１２５）；７２．３／ｈｕ．３５（配列番号７３および１６４）；１２９．１／ｈｕ．４５（配列番号７６および１２７）；１３０．１／ｈｕ．４７（配列番号７７および１２８）；１４０．１／ｈｕ．５１（配列番号１６１および１９０）；ならびに１４０．２／ｈｕ．５２（配列番号１６７および１９１）よりなる群から選択される、態様１６に記載のメンバーＡＡＶ。
【０２２１】
態様１８：ＡＡＶ１、ＡＡＶ６および少なくとも１つの付加的なメンバーＡＡＶを含んでなるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）同源系統群Ａであって、前記ＡＡＶ同源系統群の各メンバーが、ネイバー−ジョイニング ヒューリスティックを用いて決定した場合に、１０００個の単離物あたり少なくとも７５％のブーツストラップ値および０．０５を超えないポアソン補正距離測定値により系統分類学的に関連づけられる、上記ＡＡＶ同源系統群Ａ。
【０２２２】
態様１９：前記同源系統群が、少なくともＡＡＶ、すなわちＡＡＶ１；ＡＡＶ６；１２８．１／ｈｕ．４３；改変ｈｕ．４３（配列番号２３６）；１２８．３／ｈｕ．４４（配列番号８１および１５８）；ｈｕ．４６（配列番号８２および１５９）；改変ｈｕ．４６（配列番号２２４）；ならびに１３０．４／ｈｕ．４８（配列番号７８および１５７）を含んでなる、態様１８に記載のＡＡＶ同源系統群Ａ。
【０２２３】
態様２０：態様１９に記載のＡＡＶ同源系統群Ａの１メンバーＡＡＶ、但し、前記同源系統群のＡＡＶのいずれもＡＡＶ１若しくはＡＡＶ６のキャプシドを含まない、上記１メンバーＡＡＶ。
【０２２４】
態様２１：１２８．１／ｈｕ．４３；改変ｈｕ．４３（配列番号２３６）；１２８．３／ｈｕ．４４（配列番号８１および１５８）；ｈｕ．４６（配列番号８２および１５９）；改変ｈｕ．４６（配列番号２２４）；ならびに１３０．４／ｈｕ．４８（配列番号７８および１５７）よりなる群から選択される、態様１９に記載のメンバーＡＡＶ。
【０２２５】
態様２２：Ａ３．１／ｃｈ．５；Ｈ−６／ｈｕ．４；Ｈ−２／ｈｕ．２および少なくとも１種のさらなるメンバーＡＡＶを含んでなるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）同源系統群Ｃであって、前記ＡＡＶ同源系統群の各メンバーが、ネイバー−ジョイニング ヒューリスティックを用いて決定した場合に、１０００個の単離物あたり少なくとも７５％のブーツストラップ値および０．０５を超えないポアソン補正距離測定値により系統分類学的に関連づけられる、上記ＡＡＶ同源系統群Ｃ。
【０２２６】
態様２３：前記同源系統群が、少なくともＡＡＶ、すなわちＨ−６／ｈｕ．４；Ｈ−２／ｈｕ．２；３．１／ｈｕ．９（配列番号５８および１５５）；１６．８／ｈｕ．１０（配列番号５６および１５６）；１６．１２／ｈｕ．１１（配列番号５７および１５３）；１４５．１／ｈｕ．５３（配列番号１７６および１８６）；１４５．６／ｈｕ．５５（配列
番号１７８および１８７）；１４５．５／ｈｕ．５４（配列番号１７７および１８８）；７．３／ｈｕ．７（配列番号５５および１５０）；改変ｈｕ．７（配列番号２２６）；３３．４／ｈｕ．１５（配列番号５０および１４７）；３３．８／ｈｕ．１６（配列番号５１および１４８）；５８．２／ｈｕ．２５（配列番号４９および１４６）；１６１．１０／ｈｕ．６０（配列番号１７０および１８４）；Ｈ−５／ｈｕ．３（配列番号４４および１４５）；ｈｕ．１８（配列番号５２および１４９）；Ｈ−１／ｈｕ．１（配列番号４６および１４４）；ならびに１６１．６／ｈｕ．６１（配列番号１７４および１８５）を含んでなる、態様２１に記載のＡＡＶ同源系統群Ｃ。
【０２２７】
態様２４：態様２１に記載の同源系統群Ｃの１メンバーＡＡＶ、但し、前記同源系統群のＡＡＶのいずれも、Ａ３．１／ｃｈ．５；Ｈ−６／ｈｕ．４；若しくはＨ−２／ｈｕ．２のキャプシドを含まない、上記１メンバーＡＡＶ。
【０２２８】
態様２５：ＡＡＶが、３．１／ｈｕ．９（配列番号５８および１５５）；１６．８／ｈｕ．１０（配列番号５６および１５６）；１６．１２／ｈｕ．１１（配列番号５７および１５３）；１４５．１／ｈｕ．５３（配列番号１７６および１８６）；１４５．６／ｈｕ．５５（配列番号１７８および１８７）；１４５．５／ｈｕ．５４（配列番号１７７および１８８）；７．３／ｈｕ．７（配列番号５５および１５０）；改変ｈｕ．７（配列番号２２６）；３３．４／ｈｕ．１５（配列番号５０および１４７）；３３．８／ｈｕ．１６（配列番号５１および１４８）；５８．２／ｈｕ．２５（配列番号４９および１４６）；１６１．１０／ｈｕ．６０（配列番号１７０および１８４）；Ｈ−５／ｈｕ．３（配列番号４４および１４５）；Ｈ−１／ｈｕ．１（配列番号４６および１４４）；ｈｕ．１８（配列番号５２および１４９）；ならびに１６１．６／ｈｕ．６１（配列番号１７４および１８５）よりなる群から選択される、態様２４に記載のメンバーＡＡＶ。
【０２２９】
態様２６：ＡＡＶ９および少なくともさらに２つのメンバーＡＡＶを含んでなるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）同源系統群Ｆであって、前記ＡＡＶ同源系統群の各メンバーが、ネイバー−ジョイニング ヒューリスティックを用いて決定した場合に、１０００個の単離物あたり少なくとも７５％のブーツストラップ値および０．０５を超えないポアソン補正距離測定値により系統分類学的に関連づけられる、上記ＡＡＶ同源系統群Ｆ。
【０２３０】
態様２７：前記同源系統群が、少なくともＡＡＶ ｈｕ．１４／ＡＡＶ９（配列番号３および１２３）、ｈｕ．３１（配列番号１および１２１）ならびにｈｕ．３２（配列番号２および１２２）を含んでなる、態様２６に記載のＡＡＶ同源系統群Ｆ。
【０２３１】
態様２８：態様２６に記載のＡＡＶ同源系統群Ｆの１メンバーＡＡＶ。
【０２３２】
態様２９：ＡＡＶが、ｈｕ．１４／ＡＡＶ９（配列番号３および１２３）、ｈｕ．３１（配列番号１および１２１）ならびにｈｕ．３２（配列番号２および１２２）よりなる群から選択される、態様２８に記載のメンバーＡＡＶ。
【０２３３】
態様３０：ＡＡＶキャプシドおよび細胞への送達のための異種分子を含んでなる血清型９のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって；該ＡＡＶキャプシドが、配列番号１２３のアミノ酸１ないし７３６の配列のキャプシドに血清学的に関連づけられ、かつ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７若しくはＡＡＶ８のいずれのキャプシドタンパク質とも血清学的に異なる、上記ＡＡＶ。
【０２３４】
態様３１：前記ウイルスが配列番号３の核酸配列を有する、態様３０に記載のＡＡＶ。
【０２３５】
態様３２：前記ＡＡＶが、ＡＡＶ逆方向末端反復配列および宿主細胞中でのその発現を指
図する制御配列に作動可能に連結された宿異種遺伝子を有するミニ遺伝子をさらに含んでなる、態様３０に記載のＡＡＶ。
【０２３６】
態様３３：（ａ）ｖｐ１キャプシドタンパク質、アミノ酸（ａａ）１ないし７３６、配列番号１２３；ｖｐ２キャプシドタンパク質、ａａ１３８ないし７３６、配列番号１２３；ｖｐ３キャプシドタンパク質、ａａ２０３ないし７３６、配列番号１２３；ａａ１４６ないし１５２；ａａ１８２ないし１８７；ａａ２６２ないし２６４；ａａ２６３ないし２６６；ａａ２６３ないし２６６；ａａ３８１ないし３８３；３８３ないし３８５；ａａ４５０ないし４７４；ａａ４５１ないし４７５；ａａ４９０ないし４９５；ａａ４９１ないし４９６；ａａ５００ないし５０４；ａａ５０１ないし５０５；ａａ５１４ないし５２２；ａａ５３３ないし５５４；ａａ５３４ないし５５５；ａａ５８１ないし５９４；ａａ５８３ないし５９６；ａａ６５８ないし６６７；ａａ６６０ないし６６９；およびａａ７０５ないし７１９；ａａ７０７ないし７２３；ａａ２４ないし４２、ａａ２５ないし２８；ａａ８１ないし８５；ａａ１３３ないし１６５；ａａ１３４ないし１６５；ａａ１３７ないし１４３；ａａ１５４ないし１５６；ａａ１９４ないし２０８；ａａ２６１ないし２７４；ａａ２６２ないし２７４；ａａ１７１ないし１７３；ａａ１８５ないし１９８；ａａ４１３ないし４１７；ａａ４４９ないし４７８；ａａ４９４ないし５２５；ａａ５３４ないし５７１；ａａ５８１ないし６０１；ａａ６６０ないし６７１；ａａ７０９ないし７２３；ならびにａａ１ないし１８４、ａａ１９９ないし２５９；ａａ２７４ないし４４６；ａａ６０３ないし６５９；ａａ６７０ないし７０６；ａａ７２４ないし７３６；ａａ１８５ないし１９８；ａａ２６０ないし２７３；ａａ４４７ないし４７７；ａａ４９５ないし６０２；ａａ６０３ないし６５９；ａａ６６０ないし６６９；ならびにａａ７０７ないし７２３（ここで、アミノ酸番号はＡＡＶ２キャプシド、配列番号４およびＡＡＶ９／ＨＵ．１４、配列番号１２３のキャプシド中の対応する領域のものである）よりなる群を選択した超可変領域（ＨＶＲ）１から１２を包含するフラグメント若しくはそのより小さいフラグメントよりなる群から選択されるＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドタンパク質若しくはそのフラグメントよりなる群から選択されるＡＡＶ９／ＨＵ．１４タンパク質若しくはそのフラグメントを含んでなるタンパク質。
【０２３７】
態様３４：人工的アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、態様３３ａに記載のＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドタンパク質フラグメントの１つ若しくはそれより多くを含んでなる、上記キャプシドタンパク質。
【０２３８】
態様３５：態様３４に記載の人工的キャプシドを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【０２３９】
態様３６：態様３４に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる分子。
【０２４０】
態様３７：前記核酸配列が、ｖｐ１、ｎｔ１ないし２２１１；ｖｐ２、ｎｔ２５３２ないし２２１１；およびｖｐ３、ｎｔ２７３０ないし２２１１；（ここで、該ヌクレオチド番号はＡＡＶ９／ＨＵ．１４、配列番号３のものである）よりなる群から選択される、態様３６に記載の分子。
【０２４１】
態様３８：前記分子が、ＡＡＶキャプシドタンパク質および機能的ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ配列を含んでなる、態様３７に記載の分子。
【０２４２】
態様３９：前記分子がプラスミドである、態様３７に記載の分子。
【０２４３】
態様４０：ＡＡＶキャプシドを含んでなる組換えＡＡＶの生成方法であって、（ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードする分子；（ｂ）機能的ｒｅｐ
遺伝子；（ｃ）ＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）および導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子；ならびに（ｄ）該ミニ遺伝子のＡＡＶキャプシドタンパク質中へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養する段階を含んでなり、前記宿主細胞は態様３７に記載の分子を含んでなる、上記方法。
【０２４４】
態様４１：態様３０に記載のアデノ随伴ウイルスでトランスフェクトした宿主細胞。
【０２４５】
態様４２：態様３３に記載の分子でトランスフェクトした宿主細胞。
【０２４６】
態様４３：態様３０に記載のＡＡＶおよび生理学的に適合性の担体を含んでなる組成物。
【０２４７】
態様４４：態様３６に記載の分子および生理学的に適合性の担体を含んでなる組成物。
【０２４８】
態様４５：細胞への導入遺伝子の送達方法であって、前記方法が、細胞を態様３０に記載のＡＡＶと接触させる段階を含んでなり、前記ｒＡＡＶが導入遺伝子を含んでなる、上記方法。
【０２４９】
態様４６：天然に存在しないアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、同源系統群Ｅからの３０．１０／ｐｉ．１（配列番号９３）、３０．１２／ｐｉ．２（配列番号９５）、３０．１９／ｐｉ．３（配列番号９４）、ＬＧ−４／ｒｈ．３８（配列番号８６）；ＬＧ−１０／ｒｈ．４０（配列番号９２）；Ｎ７２１−８／ｒｈ．４３（配列番号１６３）；１−８／ｒｈ．４９（配列番号１０３）；２−４／ｒｈ．５０（配列番号１０８）；２−５／ｒｈ．５１（配列番号１０４）；３−９／ｒｈ．５２（配列番号９６）；３−１１／ｒｈ．５３（配列番号９７）；５−３／ｒｈ．５７（配列番号１０５）；５−２２／ｒｈ．５８（配列番号５８）；２−３／ｒｈ．６１（配列番号１０７）；４−８／ｒｈ．６４（配列番号９９）；３．１／ｈｕ．６（配列番号８４）；３３．１２／ｈｕ．１７（配列番号８３）；１０６．１／ｈｕ．３７（配列番号８８）；ＬＧ−９／ｈｕ．３９（配列番号１０２）；１１４．３／ｈｕ．４０（配列番号８７）；１２７．２／ｈｕ．４１（配列番号９１）；１２７．５／ｈｕ．４２（配列番号８５）；ｈｕ．６６（配列番号１９７）；改変ｒｈ．２（配列番号２３１）；およびｈｕ．６７（配列番号１９８）；同源系統群Ｄからの２−１５／ｒｈ．６２（配列番号１１４）；１−７／ｒｈ．４８（配列番号１１５）；４−９／ｒｈ．５４（配列番号１１６）；および４−１９／ｒｈ．５５（配列番号１１７）；改変ｃｙ．５（配列番号２２７）；改変ｒｈ．１３（配列番号２２８）；ならびに改変ｒｈ．３７（配列番号２２９）；同源系統群Ｂからの５２／ｈｕ．１９（配列番号１３３）、５２．１／ｈｕ．２０（配列番号１３４）、５４．５／ｈｕ．２３（配列番号１３７）、５４．２／ｈｕ．２２（配列番号１３８）、５４．７／ｈｕ．２４（配列番号１３６）、５４．１／ｈｕ．２１（配列番号１３５）、５４．４Ｒ／ｈｕ．２７（配列番号１４０）；４６．２／ｈｕ．２８（配列番号１３０）；４６．６／ｈｕ．２９（配列番号１３２）；改変ｈｕ．２９（配列番号２２５）；１７２．１／ｈｕ．６３（配列番号１９５）；１７２．２／ｈｕ．６４（配列番号１９６）；２４．５／ｈｕ．１３（配列番号１２９）；１４５．６／ｈｕ．５６（配列番号１９２）；ｈｕ．５７（配列番号１９３）；１３６．１／ｈｕ．４９（配列番号１８９）；１５６．１／ｈｕ．５８（配列番号１９４）；７２．２／ｈｕ．３４（配列番号１２５）；７２．３／ｈｕ．３５（配列番号１６４）；１２９．１／ｈｕ．４５（配列番号１２７）；１３０．１／ｈｕ．４７（配列番号１２８）；１４０．１／ｈｕ．５１（配列番号１９０）；ならびに１４０．２／ｈｕ．５２（配列番号１９１）；同源系統群Ａからの１２８．１／ｈｕ．４３（配列番号１６０）；改変ｈｕ．４３（配列番号２３６）；１２８．３／ｈｕ．４４（配列番号１５８）；ｈｕ．４６（配列番号１５９）；改変ｈｕ．４６（配列番号２２４）；および１３０．４／ｈｕ．４８（配列番号１５７）；同源系統群Ｃからの３．１／ｈｕ．９（配列番号１５５）；１６．８／ｈｕ．１０（配列番号１５６）；１６．１２／ｈｕ．１１（配列番号１５
３）；１４５．１／ｈｕ．５３（配列番号１８６）；１４５．６／ｈｕ．５５（配列番号１８７）；１４５．５／ｈｕ．５４（配列番号１８８）；７．３／ｈｕ．７（配列番号１５０）；改変ｈｕ．７（配列番号２２６）；３３．４／ｈｕ．１５（配列番号１４７）；３３．８／ｈｕ．１６（配列番号１４８）；５８．２／ｈｕ．２５（配列番号１４６）；１６１．１０／ｈｕ．６０（配列番号１８４）；Ｈ−５／ｈｕ．３（配列番号１４５）；Ｈ−１／ｈｕ．１（配列番号１４４）；ｈｕ．１８（配列番号５２および１４９）；ならびに１６１．６／ｈｕ．６１（配列番号１８５）；同源系統群Ｆからのｈｕ．３１（配列番号１２１）およびｈｕ．３２（配列番号１２２）；ならびにｒｈ．５９（配列番号１１０）およびｒｈ．６０（配列番号１２０）；若しくはそれらの独特の機能的フラグメントよりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＡＡＶキャプシドを含んでなる、上記ＡＡＶ。
【０２５０】
態様４７：フラグメントが：ａａ１４６ないし１５２；ａａ１８２ないし１８７；ａａ２６２ないし２６４；ａａ２６３ないし２６６；ａａ２６３ないし２６６；ａａ３８１ないし３８３；３８３ないし３８５；ａａ４５０ないし４７４；ａａ４５１ないし４７５；ａａ４９０ないし４９５；ａａ４９１ないし４９６；ａａ５００ないし５０４；ａａ５０１ないし５０５；ａａ５１４ないし５２２；ａａ５３３ないし５５４；ａａ５３４ないし５５５；ａａ５８１ないし５９４；ａａ５８３ないし５９６；ａａ６５８ないし６６７；ａａ６６０ないし６６９；およびａａ７０５ないし７１９；ａａ７０７ないし７２３；ａａ２４ないし４２、ａａ２５ないし２８；ａａ８１ないし８５；ａａ１３３ないし１６５；ａａ１３４ないし１６５；ａａ１３７ないし１４３；ａａ１５４ないし１５６；ａａ１９４ないし２０８；ａａ２６１ないし２７４；ａａ２６２ないし２７４；ａａ１７１ないし１７３；ａａ１８５ないし１９８；ａａ４１３ないし４１７；ａａ４４９ないし４７８；ａａ４９４ないし５２５；ａａ５３４ないし５７１；ａａ５８１ないし６０１；ａａ６６０ないし６７１；ａａ７０９ないし７２３；ならびにａａ１ないし１８４、ａａ１９９ないし２５９；ａａ２７４ないし４４６；ａａ６０３ないし６５９；ａａ６７０ないし７０６；ａａ７２４ないし７３６；ａａ１８５ないし１９８；ａａ２６０ないし２７３；ａａ４４７ないし４７７；ａａ４９５ないし６０２；ａａ６０３ないし６５９；ａａ６６０ないし６６９；ならびにａａ７０７ないし７２３よりなる群を選択した超可変領域（ＨＶＲ）１から１２を包含するフラグメント若しくはそのより小さいフラグメント、よりなる群から選択され、ここで、アミノ酸番号は、ＡＡＶ２キャプシド、配列番号４、ならびに、同源系統群Ｅからの３０．１０／ｐｉ．１（配列番号９３）、３０．１２／ｐｉ．２（配列番号９５）、３０．１９／ｐｉ．３（配列番号９４）、ＬＧ−４／ｒｈ．３８（配列番号８６）；ＬＧ−１０／ｒｈ．４０（配列番号９２）；Ｎ７２１−８／ｒｈ．４３（配列番号１６３）；１−８／ｒｈ．４９（配列番号１０３）；２−４／ｒｈ．５０（配列番号１０８）；２−５／ｒｈ．５１（配列番号１０４）；３−９／ｒｈ．５２（配列番号９６）；３−１１／ｒｈ．５３（配列番号９７）；５−３／ｒｈ．５７（配列番号１０５）；５−２２／ｒｈ．５８（配列番号５８）；改変ｒｈ．５８（配列番号２３２）；２−３／ｒｈ．６１（配列番号１０７）；４−８／ｒｈ．６４（配列番号９９）；改変ｒｈ．６４（配列番号２３３）；３．１／ｈｕ．６（配列番号８４）；３３．１２／ｈｕ．１７（配列番号８３）；１０６．１／ｈｕ．３７（配列番号８８）；ＬＧ−９／ｈｕ．３９（配列番号１０２）；１１４．３／ｈｕ．４０（配列番号８７）；１２７．２／ｈｕ．４１（配列番号９１）；１２７．５／ｈｕ．４２（配列番号８５）；ｈｕ．６６（配列番号１９７）；改変ｒｈ．２（配列番号２３１）；およびｈｕ．６７（配列番号１９８）；同源系統群Ｄからの２−１５／ｒｈ．６２（配列番号１１４）；１−７／ｒｈ．４８（配列番号１１５）；４−９／ｒｈ．５４（配列番号１１６）；および４−１９／ｒｈ．５５（配列番号１１７）；改変ｃｙ．５（配列番号２２７）；改変ｒｈ．１３（配列番号２２８）；ならびに改変ｒｈ．３７（配列番号２２９）；同源系統群Ｂからの５２／ｈｕ．１９（配列番号１３３）、５２．１／ｈｕ．２０（配列番号１３４）、５４．５／ｈｕ．２３（配列番号１３７）、５４．２／ｈｕ．２２（配列番号１３８）、５４．７／ｈｕ．２４（配列
番号１３６）、５４．１／ｈｕ．２１（配列番号１３５）、５４．４Ｒ／ｈｕ．２７（配列番号１４０）；４６．２／ｈｕ．２８（配列番号１３０）；４６．６／ｈｕ．２９（配列番号１３２）；改変ｈｕ．２９（配列番号２２５）；１７２．１／ｈｕ．６３（配列番号１９５）；１７２．２／ｈｕ．６４（配列番号１９６）；２４．５／ｈｕ．１３（配列番号１２９）；１４５．６／ｈｕ．５６（配列番号１９２）；ｈｕ．５７（配列番号１９３）；１３６．１／ｈｕ．４９（配列番号１８９）；１５６．１／ｈｕ．５８（配列番号１９４）；７２．２／ｈｕ．３４（配列番号１２５）；７２．３／ｈｕ．３５（配列番号１６４）；１２９．１／ｈｕ．４５（配列番号１２７）；１３０．１／ｈｕ．４７（配列番号１２８）；１４０．１／ｈｕ．５１（配列番号１９０）；ならびに１４０．２／ｈｕ．５２（配列番号１９１）；同源系統群Ａからの１２８．１／ｈｕ．４３（配列番号１６０）；改変ｈｕ．４３（配列番号２３６）；１２８．３／ｈｕ．４４（配列番号１５８）；ｈｕ．４６（配列番号１５９）；改変ｈｕ．４６（配列番号２２４）；および１３０．４／ｈｕ．４８（配列番号１５７）；同源系統群Ｃからの３．１／ｈｕ．９（配列番号１５５）；１６．８／ｈｕ．１０（配列番号１５６）；１６．１２／ｈｕ．１１（配列番号１５３）；１４５．１／ｈｕ．５３（配列番号１８６）；１４５．６／ｈｕ．５５（配列番号１８７）；１４５．５／ｈｕ．５４（配列番号１８８）；７．３／ｈｕ．７（配列番号１５０）；改変ｈｕ．７（［配列番号２２６）；３３．４／ｈｕ．１５（配列番号１４７）；３３．８／ｈｕ．１６（配列番号１４８）；５８．２／ｈｕ．２５（配列番号１４６）；１６１．１０／ｈｕ．６０（配列番号１８４）；Ｈ−５／ｈｕ．３（配列番号１４５）；Ｈ−１／ｈｕ．１（配列番号１４４）；ｈｕ．１８（配列番号１４９）ならびに１６１．６／ｈｕ．６１（配列番号１８５）；同源系統群Ｆからのｈｕ．３１（配列番号１２１）およびｈｕ．３２（配列番号１２２）；ならびにｒｈ．５９（配列番号１１０）およびｒｈ．６０（配列番号１２０）のキャプシドの対応する領域のものである、態様４６に記載のＡＡＶ。
【０２５１】
態様４８：人工的アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、態様４７ａに記載のＡＡＶキャプシドタンパク質フラグメントの１つ若しくはそれより多くを含んでなる、上記キャプシドタンパク質。
【０２５２】
態様４９：態様４８に記載の人工的キャプシドを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【０２５３】
態様５０：ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする異種核酸配列を含んでなる分子であって、前記核酸配列が：同源系統群Ｅからの３０．１０／ｐｉ．１（配列番号２８）、３０．１２／ｐｉ．２（配列番号３０）、３０．１９／ｐｉ．３（配列番号２９）、ＬＧ−４／ｒｈ．３８（配列番号７）；ＬＧ−１０／ｒｈ．４０（配列番号１４）；Ｎ７２１−８／ｒｈ．４３（配列番号４３；１−８／ｒｈ．４９（配列番号２５）；２−４／ｒｈ．５０（配列番号２３）；２−５／ｒｈ．５１（配列番号２２）；３−９／ｒｈ．５２（配列番号１８）；３−１１／ｒｈ．５３（配列番号１７）；５−３／ｒｈ．５７（配列番号２６）；５−２２／ｒｈ．５８（配列番号２７）；改変ｒｈ．５８（配列番号２３２）；２−３／ｒｈ．６１（配列番号２１）；４−８／ｒｈ．６４（配列番号１５）；３．１／ｈｕ．６（配列番号５）；３３．１２／ｈｕ．１７（配列番号４）；１０６．１／ｈｕ．３７（配列番号１０）；ＬＧ−９／ｈｕ．３９（配列番号２４）；１１４．３／ｈｕ．４０（配列番号１１）；１２７．２／ｈｕ．４１（配列番号６）；１２７．５／ｈｕ．４２（配列番号８）；ｈｕ．６６（配列番号１７３）；改変ｒｈ．２（配列番号２３１）；およびｈｕ．６７（配列番号１７４）；同源系統群Ｄからの２−１５／ｒｈ．６２（配列番号３３）；１−７／ｒｈ．４８（配列番号３２）；４−９／ｒｈ．５４（配列番号４０）；および４−１９／ｒｈ．５５（配列番号３７および１１７）；改変ｃｙ．５（配列番号２２７）；改変ｒｈ．１３（配列番号２２８）；ならびに改変ｒｈ．３７（配列番号２２９）；同源系統群Ｂからの５２／ｈｕ．１９（配列番号６２および１３３）、５２．１／
ｈｕ．２０（配列番号６３および１３４）、５４．５／ｈｕ．２３（配列番号６０）、５４．２／ｈｕ．２２（配列番号６７）、５４．７／ｈｕ．２４（配列番号６６）、５４．１／ｈｕ．２１（配列番号６５）、５４．４Ｒ／ｈｕ．２７（配列番号６４）；４６．２／ｈｕ．２８（配列番号６８）；４６．６／ｈｕ．２９（配列番号６９）；改変ｈｕ．２９（配列番号２２５）；同源系統群Ａからの１２８．１／ｈｕ．４３（配列番号８０）；１２８．３／ｈｕ．４４（配列番号８１）；ｈｕ．４６（配列番号８２）；および１３０．４／ｈｕ．４８（配列番号７８）；同源系統群Ｃからの３．１／ｈｕ．９（配列番号５８）；１６．８／ｈｕ．１０（配列番号５６）；１６．１２／ｈｕ．１１（配列番号５７）；１４５．１／ｈｕ．５３（配列番号１７６）；１４５．６／ｈｕ．５５（配列番号１７８）；１４５．５／ｈｕ．５４（配列番号１７７）；７．３／ｈｕ．７（配列番号５５）；改変ｈｕ．７（配列番号２２６）；３３．４／ｈｕ．１５（配列番号５０）；３３．８／ｈｕ．１６（配列番号５１）；５８．２／ｈｕ．２５（配列番号４９）；１６１．１０／ｈｕ．６０（配列番号１７０）；Ｈ−５／ｈｕ．３（配列番号４４）；ｈｕ．１８（配列番号１４９）；Ｈ−１／ｈｕ．１（配列番号４６）；ならびに１６１．６／ｈｕ．６１（配列番号１７４）；同源系統群Ｆからのｈｕ．１４／ＡＡＶ９（配列番号３）、ｈｕ．３１（配列番号１）およびｈｕ．３２（配列番号２）；ｒｈ．５９（配列番号４９）およびｒｈ．６０（配列番号３１）；若しくはそれらの独特の機能的フラグメントよりなる群から選択される、上記分子。
【０２５４】
態様５１：前記分子が、ＡＡＶキャプシドタンパク質および機能的ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ配列を含んでなる、態様５０に記載の分子。
【０２５５】
態様５２：前記分子がプラスミドである、態様５０に記載の分子。
【０２５６】
態様５３：ＡＡＶキャプシドを含んでなる組換えＡＡＶの生成方法であって、（ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードする分子；（ｂ）機能的ｒｅｐ遺伝子；（ｃ）ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）および導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子；ならびに（ｄ）該ミニ遺伝子のＡＡＶキャプシドタンパク質中へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養する段階を含んでなり、前記宿主細胞が態様５０に記載の分子を含んでなる、上記方法。
【０２５７】
態様５４：態様３０に記載のアデノ随伴ウイルスでトランスフェクトした宿主細胞。
【０２５８】
態様５５：態様５０に記載の分子でトランスフェクトした宿主細胞。
【０２５９】
態様５６：態様４７に記載のＡＡＶおよび生理学的に適合性の担体を含んでなる組成物。
【０２６０】
態様５７：態様５０に記載の分子および生理学的に適合性の担体を含んでなる組成物。
【０２６１】
態様５８：細胞への導入遺伝子の送達方法であって、前記方法が、態様４７に記載のＡＡＶと細胞を接触させる段階を含んでなり、前記ｒＡＡＶが導入遺伝子を含んでなる、上記方法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドおよび細胞への送達のための異種分子を含んでなる血清型９のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、
該ＡＡＶキャプシドが、配列番号１２３のアミノ酸１ないし７３６の配列のキャプシドに血清学的に関連付けられ、かつ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７若しくはＡＡＶ８のいずれかのキャプシドタンパク質とも血清学的に異なる、上記ＡＡＶ。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図２Ｅ】

【図２Ｆ】

【図２Ｇ】

【図２Ｈ】

【図２Ｉ】

【図２Ｊ】

【図２Ｋ】

【図２Ｌ】

【図２Ｍ】

【図２Ｎ】

【図２Ｏ】

【図２Ｐ】

【図２Ｑ】

【図２Ｒ】

【図２Ｓ】

【図２Ｔ】

【図２Ｕ】

【図２Ｖ】

【図２Ｗ】

【図２Ｘ】

【図２Ｙ】

【図２Ｚ】

【図２ＡＡ】

【図２ＡＢ】

【図２ＡＣ】

【図２ＡＤ】

【図２ＡＥ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図３Ｅ】

【図３Ｆ】

【図３Ｇ】

【図３Ｈ】

【図３Ｉ】

【図３Ｊ】

【図３Ｋ】

【図３Ｌ】

【図３Ｍ】

【図３Ｎ】

【図３Ｏ】

【図３Ｐ】

【図３Ｑ】

【図３Ｒ】

【図３Ｓ】

【図３Ｔ】

【図３Ｕ】

【図３Ｖ】

【図３Ｗ】

【図３Ｘ】

【図３Ｙ】

【図３Ｚ】

【図３ＡＡ】

【図３ＡＢ】

【図３ＡＣ】

【図３ＡＤ】

【図３ＡＥ】

【図３ＡＦ】

【図３ＡＧ】

【図３ＡＨ】

【図３ＡＩ】

【図３ＡＪ】

【図３ＡＫ】

【図３ＡＬ】

【図３ＡＭ】

【図３ＡＮ】

【図３ＡＯ】

【図３ＡＰ】

【図３ＡＱ】

【図３ＡＲ】

【図３ＡＳ】

【図３ＡＴ】

【図３ＡＵ】

【図３ＡＶ】

【図３ＡＷ】

【図３ＡＸ】

【図３ＡＹ】

【図３ＡＺ】

【図３ＢＡ】

【図３ＢＢ】

【図３ＢＣ】

【図３ＢＤ】

【図３ＢＥ】

【図３ＢＦ】

【図３ＢＧ】

【図３ＢＨ】

【図３ＢＩ】

【図３ＢＪ】

【図３ＢＫ】

【図３ＢＬ】

【図３ＢＭ】

【図３ＢＮ】

【図３ＢＯ】

【図３ＢＰ】

【図３ＢＱ】

【図３ＢＲ】

【図３ＢＳ】

【図３ＢＴ】

【図３ＢＵ】

【図３ＢＶ】

【図３ＢＷ】

【図３ＢＸ】

【図３ＢＹ】

【図３ＢＺ】

【図３ＣＡ】

【図３ＣＢ】

【図３ＣＣ】

【図３ＣＤ】

【図３ＣＥ】

【図３ＣＦ】

【図３ＣＧ】

【図３ＣＨ】

【図３ＣＩ】

【図３ＣＪ】

【図３ＣＫ】

【図３ＣＬ】

【図３ＣＭ】

【図３ＣＮ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【公開番号】特開２０１２−１７５９７４（Ｐ２０１２−１７５９７４Ａ）
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３００３（Ｐ２０１２−５３００３）
【出願日】平成２４年３月９日（２０１２．３．９）
【分割の表示】特願２００６−５３３８７９（Ｐ２００６−５３３８７９）の分割
【原出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５０２４０９８１３）ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア (37)
【Ｆターム（参考）】