アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物
【課題】より効率的かつ汎用的にアミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化等させた、遺伝的に改変された微生物を提供する。
【解決手段】本発明は、アミダーゼ活性及び／又はニトリラーゼ活性を有する微生物におけるアミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子が、欠失若しくは不活性化された微生物である。当該欠失若しくは不活性化は、ドナー微生物からアミダーゼ活性及び／又はニトリラーゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法を用いることを含む、アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子の欠失若しくは不活性化方法であって、所定の工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする前記方法により行われ得る。
【解決手段】本発明は、アミダーゼ活性及び／又はニトリラーゼ活性を有する微生物におけるアミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子が、欠失若しくは不活性化された微生物である。当該欠失若しくは不活性化は、ドナー微生物からアミダーゼ活性及び／又はニトリラーゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法を用いることを含む、アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子の欠失若しくは不活性化方法であって、所定の工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする前記方法により行われ得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物に関する。また、当該微生物を利用した、ニトリルヒドラターゼの製造方法及びアミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素または該酵素を含有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が開示されている。この製造方法は、従来の化学合成法と比較し、ニトリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いことで知られている。
ニトリルヒドラターゼを生産する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレビシエラ(Klebsiella)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属、ノカルディア（Nocardia）属等に属する細菌（微生物）を挙げることができる。中でも、ロドコッカス属細菌の一種であるロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株（以下、Ｊ１株と称する）は、アクリルアミドの工業的生産に使用されており、有用性が実証されている。また、その菌株が産生するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子も明らかとなっている（特許文献１参照）。
【０００３】
一般にニトリルヒドラターゼを有している微生物はニトリル分解に関連するアミダーゼやニトリラーゼの遺伝子を有している。アミド化合物の製造において、アミダーゼ活性を有している微生物を使用した場合、アミダーゼによりアミド化合物がカルボン酸に変換される副反応が起こり、アミド化合物の製造が妨げられる（特許文献２参照）。また、ニトリラーゼ活性を有している微生物を使用した場合、ニトリラーゼによりニトリル化合物がカルボン酸に変換される副反応が起こり、アミド化合物の製造が妨げられる。このような場合、アミダーゼ活性やニトリラーゼ活性を有しない微生物を用いる、あるいは微生物からアミダーゼ活性やニトリラーゼ活性を欠失させた変異株を用いることが有効である。
【０００４】
変異株を用いる例としては、NTG（N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）やEMS（エチルメタンスルホン酸）等の変異誘起化合物を用いてアミダーゼ活性を有する微生物からアミダーゼの生産を低下又は阻害させた例が報告されている（特許文献３参照）。しかしながら、変異誘起化合物を用いたアミダーゼ遺伝子の変異（欠失や不活性化等）は、植え継ぎ（継代）により当該変異が復帰する（活性を有する状態に戻る）ことがあるため、変異体を長期に安定して使用することは容易なことではなかった。
また、相同組換えを用いた遺伝子欠損も有効な手法であり、アミダーゼ欠失に関しては、ロドコッカス・ルーバー（Rhodococcus ruber）TH3についての報告がある。この報告の例では、宿主微生物がアミダーゼを複数有しているため、1つのアミダーゼを欠失させただけでは副反応は完全に抑えられていない（非特許文献１）。また、当該報告の方法ではゲノム上にマーカーが残るため、複数の遺伝子欠失は複数のマーカー遺伝子が必要となる。
【０００５】
これらとは別の方法として、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ及びニトリラーゼの発現は、それぞれ、誘導剤であるニトリル化合物、アミド化合物及びカルボン酸化合物により制御されているため、当該誘導剤の調節で酵素発現を制御することが可能である。しかしながら、誘導剤のみで酵素発現を完全に制御することは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第3162091号
【特許文献２】国際公開第09/117843号
【特許文献３】特開2001/120259号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bioresource Technology. Vol. 101(2010) p.285-291
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ロドコッカス属細菌をより有効に活用するためには、目的に応じてロドコッカス属細菌のゲノム上の遺伝子を特異的に欠失又は不活性化等することにより、改変することが効果的である。
ところで、ゲノム上に存在する遺伝子を欠失又は不活性化等する手法としては、相同組換え（Homologous recombination）を利用する方法が挙げられる。これは、標的遺伝子の塩基配列中に薬剤耐性マーカー遺伝子等を相同組換えにより挿入し、当該遺伝子が機能発現しない状態にする、又は（標的遺伝子を当該遺伝子の一部若しくは全部を含まない配列に置換することにより）標的遺伝子自体を欠失させて、その発現そのものを阻害する方法である。大腸菌や酵母等のいくつかの微生物では、効率的な相同組換え技術が確立しているため（例えば、SOE-PCR法（例えば、SOE-PCR（Gene, vol. 77, p. 61-68（1989））、比較的容易に標的遺伝子の欠失又は不活性化を行うことができる。
【０００９】
ロドコッカス属細菌において相同組換えにより遺伝子欠失又は不活性化を行う場合、エレクトロポレーション法等が知られている。しかしながら、ロドコッカス属細菌及びその類縁属細菌は非相同組換えが起こり易いという特徴を有しているため、目的の相同組換え株が極めて低確率でしか得られないという問題がある。
従って、ロドコッカス属細菌等の、もともとアミダーゼ活性やニトリラーゼ活性を有する微生物について、アミダーゼ遺伝子やニトリラーゼ遺伝子が欠失又は不活性化等されたもの（特に、より効率的且つ汎用的に当該耐性遺伝子が欠失又は不活性化等されたもの）は、十分に得られていないのが現状である。
【００１０】
このような状況下において、より効率的かつ汎用的にアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化等させた、遺伝的に改変された微生物の取得及び開発が望まれていた。より詳細には、ロドコッカス属細菌等の微生物における相同組換え技術を開発及び確立し、当該微生物（宿主）由来のアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化等させた改変微生物をより効率的かつ汎用的に得ること、さらには、低コストかつ高効率でアミド化合物を製造することが望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物、当該微生物を用いたニトリルヒドラターゼの製造方法、及び当該微生物を用いたアミド化合物の製造方法等を提供するものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１２】
（１）ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物であって、前記欠失又は不活性化が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われるものである、前記欠失又は不活性化された微生物。
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中のアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）前記（ｂ）で作製されたドナー微生物から前記（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）前記（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【００１３】
上記(1)の微生物において、前記ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物及び前記レシピエント微生物としては、例えばロドコッカス属細菌が挙げられる。ここで、ロドコッカス属細菌としては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株又はその変異株が挙げられる。
上記(1)の微生物において、ドナー微生物としては、例えば大腸菌が挙げられる。また、ドナー微生物が感受性を示す薬剤としては、例えば、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラシクリン、カルベニシン及びナルジクス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、レシピエント微生物が感受性を示す薬剤としては、例えば、カナマイシンが挙げられる。
【００１４】
上記(1)の微生物において、欠失又は不活性化させるアミダーゼ遺伝子としては、例えば、配列番号１に示す塩基配列を含むものが挙げられ、欠失又は不活性化させるニトリラーゼ遺伝子としては、例えば、配列番号３に示す塩基配列を含むものが挙げられる。
【００１５】
（２）上記(1)の微生物を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
（３）上記(1)の微生物を培養して得られる培養物又は当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させ、当該接触により生成されるアミド化合物を採取することを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物のうち、アミダーゼ活性及び／又はニトリラーゼ活性を有する微生物、特にロドコッカス属細菌等の微生物について、当該微生物ゲノム上のアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物を、より一層効率的かつ汎用的に提供することができる。
また、本発明によれば、ロドコッカス属細菌等の微生物における相同組換え技術を確立し、上記のような遺伝的に改変した微生物を効率的かつ汎用的に得ることができる。さらには、当該改変微生物を用いてニトリルヒドラターゼを効率的に産生し得る微生物を作製し、当該微生物を微生物触媒として用いて様々なニトリル化合物から低コストかつ高効率でアミド化合物を製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本実施例における、プラスミドpK19mobsacB1の構造を示す模式図である。
【図２】本実施例における、プラスミドpBKAMD01の構造を示す模式図である。
【図３】本実施例における、プラスミドpBKNTR01の構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１９】
１．アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子が改変された微生物
本発明に係るアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が改変（欠失又は不活性化（以下、「欠失等」と称することがある））された微生物（以下、「本発明の微生物」と称することがある）は、前述した通り、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物である。
【００２０】
本発明の微生物が得られる前の、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物（対象微生物）としては、ニトリルヒドラターゼの他、アミダーゼ及び／又はニトリラーゼを産生し、それらの活性を示すものであればよく、特に限定はされない。例えば、ロドコッカス属細菌、バチルス属細菌、シュードノカルディア属細菌、ジオバチルス属細菌、シュードモナス属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌等が好ましく挙げられる。中でもロドコッカス属細菌は、細胞壁が強固で反応液中へタンパク質などの菌体内容物が漏れないため、産業的に微生物触媒としての使用等に適している点でより好ましい。
ここで、ロドコッカス属細菌としては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）及びロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス・ピリジノボランス（Rhodococcus pyridinivorans）等が好ましく挙げられる。
【００２１】
ロドコッカス・ロドクロウスとしては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスJ1、ロドコッカス・ロドクロウスM8(SU1731814)、ロドコッカス・ロドクロウスM33（VKM Ac-1515D）及びロドコッカス・ロドクロウスNCIMB41164（国際公開第05/054456号）等が好ましく挙げられる。ロドコッカス・ピリジノボランスとしては、例えば、ロドコッカス・ピリジノボランス S85-2（国際公開第03/066800号）、ロドコッカス・ピリジノボランス MS-38（特願2004-151508号）等が好ましく挙げられる。
また、バチルス属細菌としては、例えば、バチルス・スミシ（Bacillus smithii）(特開平09-248188号)等が好ましく挙げられる。シュードノカルディア属細菌としては、例えば、シュードノカルディア・サーモフィラJCM3095(特開平09-275978号)、等が好ましく挙げられる。ジオバチルス属細菌としては、例えば、ジオバチルス・サーモグルコシダシアス（国際公開第04/108942号）、ジオバチルス・カルドキシロシチリカスM16（特開2006-158323号）等が好ましく挙げられる。シュードモナス属細菌としては、例えば、シュードモナス・クロロラフィスB23（特開昭58- 86093）シュードモナス プチダ DSM16276（国際公開第05/2689号）、シュードモナス マルギナリス DSM16275（国際公開第05/2689号）、ノカルディア属細菌としては、例えばノカルディア・YS-2002株（CN1584024）、ノカルディア・sp.JBRs（GenBank:AY141130）が好ましく挙げられる。
【００２２】
アミダーゼは、以下の反応式に示すように、アミド化合物のアミド基に作用し、対応するカルボン酸に変換する水和反応を触媒する酵素である。
R-CONH2+ H2O → R-COOH + NH3
(式中、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは置換又は無置換の飽和又は不飽和複素環基を表す。)
ここで、「アミダーゼ活性」とは、アミド化合物のアミド基に作用して対応するカルボン酸化合物に変換させる活性を意味する。本発明の微生物のアミダーゼ活性の測定方法としては、例えば、アミド化合物の１種であるアクリルアミドを用いる方法が挙げられる。この方法では、アミダーゼ活性の結果としてアクリルアミドに対応するカルボン酸化合物、すなわちアクリル酸が得られる。従って、本発明の微生物をアクリルアミドに接触させ、生成するアクリル酸の量の増加を定量することで、アミダーゼ活性を測定することができる。あるいは、アクリルアミドの消費量を定量することによってもアミダーゼ活性を測定することができる。
【００２３】
ニトリラーゼは、以下の反応式に示すように、ニトリル化合物のニトリル基に作用し、対応するカルボン酸に変換する水和反応を触媒する酵素である。
R-CN + 2H2O → R-COOH + NH3
(式中、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは置換若しくは無置換の飽和又は不飽和複素環基を表す。)
ここで、「ニトリラーゼ活性」とは、ニトリル化合物のニトリル基に作用して対応するカルボン酸化合物に変換する活性を意味する。本発明の微生物のニトリラーゼ活性の測定方法としては、例えば、二トリル化合物の１種であるアクリロニトリルを用いる方法が挙げられる。この方法では、ニトリラーゼ活性の結果としてアクリロニトリルに対応するカルボン酸化合物、すなわちアクリル酸が得られる。従って、本発明の微生物をアクリロニトリルに接触させ、生成するアクリル酸の量の増加を定量することで、ニトリラーゼ活性を測定することができる。あるいは、アクリロニトリルの消費量を定量することによってもニトリラーゼ活性を測定することができる。
【００２４】
ニトリルヒドラターゼは、以下の反応式に示すように、ニトリル化合物のニトリル基に作用し、対応するアミド化合物に変換する水和反応を触媒する酵素である。
R-CN + H2O → R-CONH2
(式中、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは置換若しくは無置換の飽和又は不飽和複素環基を表す。)
ここで、「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、ニトリル化合物のニトリル基に作用して対応するアミド化合物に変換させる活性を意味する。本発明の微生物のニトリルヒドラターゼ活性の測定方法としては、例えば、ニトリル化合物の１種であるアクリロニトリルを用いる方法が挙げられる。この方法では、ニトリルヒドラターゼ活性の結果としてアクリロニトリルに対応するアミド化合物、すなわちアクリルアミドが得られる。従って、本発明の微生物をアクリロニトリルに接触させ、生成するアクリルアミドの量の増加を定量することで、ニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。あるいは、アクリロニトリルの消費量を定量することによってもニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。
【００２５】
本発明の微生物は、本来有するアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されたものであるが、この欠失等される遺伝子（標的遺伝子）としては、対象微生物のゲノムDNAにコードされるアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子の一部又は全部が欠失等されたもの、プロモーター配列の一部又は全部が欠失等されたもの、発現調節に関連する遺伝子の一部又は全部が欠失等されたものなどが挙げられる。これらの欠失等された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。
なお、本発明においては、例えば、上記対象微生物がロドコッカス・ロドクロウスＪ１株の場合は、アミダーゼ遺伝子（配列番号１；アミノ酸配列は配列番号２）とニトリラーゼ遺伝子（配列番号３；アミノ酸配列は配列番号４）を有しているため、標的遺伝子としては、これらのいずれか一方でもよいし、両方でもよく、限定はされない。
【００２６】
２．アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子が改変された微生物の製造
本発明の微生物を製造するための、アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化する方法は、以下の通りである。
すなわち、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法を用いることを含む、アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子の欠失又は不活性化方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする方法である。
【００２７】
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、下記(i)〜(v)：
(i) レシピエント微生物中のアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子（標的遺伝子）とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、
(ii) 当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、
(iii) 当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、
(iv) レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び
(v) レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子
を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）工程（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【００２８】
上記欠失又は不活性化方法において用いるレシピエント微生物としては、ニトリルヒドラターゼ活性を有し、アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子を有する微生物であれば限定はされない。中でもロドコッカス属細菌が、前述した理由でより好ましい。ロドコッカス属細菌等の具体例についても、前述と同様のものが挙げられる。
一方、ドナー微生物としては、上記レシピエント微生物と接合伝達可能な微生物であれば限定はされない。例えば、大腸菌が好ましい。
【００２９】
2.1. 工程（ａ）
工程（ａ）では、接合伝達に供するレシピエント微生物として、接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性を強化した微生物を作製する。「薬剤への耐性を強化する」とは、レシピエント微生物が薬剤耐性を有していない場合には、薬剤耐性を付与することをいい、レシピエント微生物が薬剤耐性の乏しい場合には、当該耐性をより強くすることをいう。
接合伝達法を使用する場合、レシピエントとなる微生物には薬剤耐性マーカーが必要である。よって、薬剤耐性を有していない微生物、又は薬剤耐性の乏しい微生物を使用する場合、薬剤選択可能な程度の十分な薬剤耐性を有する株（レシピエント）の作製が必要となる。ここで、薬剤としては、接合伝達法を使用することを考慮し、接合伝達に供するドナー微生物（接合伝達時のドナー微生物）が感受性を示す薬剤が好ましい。当該薬剤としては、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、トリメトプリム、ゲンタマイシン、ナルジクス酸、カルベニシン、チオストレプトン、テトラサイクリン及びストレプトマイシン等が好ましく、クロラムフェニコール及びアンピシリンがより好ましい。
【００３０】
上述のように薬剤耐性を強化したレシピエント微生物を作製する方法としては、特には限定されない。例えば、自然変異誘発法、紫外線照射や変異誘発剤を用いる突然変異誘発法、EZ-Tn5（Epicentre社製）のようなランダム変異導入ツール等を用いることにより、本来レシピエント微生物が持たない薬剤耐性遺伝子を人為的に当該微生物ゲノム上に導入する方法、あらかじめ遺伝子改変用プラスミドとは別の、抗生物質耐性獲得用のプラスミドを導入する方法等が好ましい。これらの中でも自然変異誘発法がより好ましい。
【００３１】
自然変異誘発法は、所望の薬剤を含有する培地中で対象とする微生物を継代培養等することにより、もともとは当該培地中で生育不可又は困難な微生物に自然変異を誘発させて、より高濃度の薬剤を含有する当該培地中でも生育し得る株を取得する方法である。どの程度まで薬剤耐性を強化するかは、使用するレシピエント微生物、ドナー微生物、選択する薬剤により異なるが、レシピエント微生物の生育が抑制されない、且つ、ドナー微生物の生育が阻害される薬剤濃度を選ぶことが好ましい。例えば、レシピエント微生物としてロドコッカス属細菌を、ドナー微生物として大腸菌を、選択用薬剤としてクロラムフェニコールを用いる場合、自然突然変異によりクロラムフェニコール1〜200 mg/L、好ましくは10〜100 mg/Lを含有する培地において生育可能なレシピエント微生物（クロラムフェニコール耐性強化株）を得ることが望ましい。
【００３２】
2.2. 工程（ｂ）
工程（ｂ）では、接合伝達に供するドナー微生物として、所定の遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する。遺伝子改変用プラスミド、すなわちレシピエント微生物中のアミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子を改変するためのプラスミドDNAとしては、前述の(i)〜(v)の構成（遺伝子・塩基配列）を含むものを用いる。
ここで、前記(i)の塩基配列領域は、改変の対象とするレシピエント微生物中のアミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼーゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列において、当該アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼーゼ遺伝子を欠失又はさせた塩基配列領域である。当該塩基配列領域の作製は、レシピエント微生物のゲノムから、アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列の単離（クローニング）及び遺伝子ライブラリー作製やPCR等の公知技術を用いて行うことができる。
【００３３】
なお、アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子の周辺の塩基配列としては、限定はされない。例えば、当該遺伝子に加え、発現調節に関連する遺伝子の上流及び下流の相同領域が両端からそれぞれ100〜3000 bpの塩基配列を含む配列であることが好まし。より好ましくは500〜2000 bpの塩基配列を含む配列である。単離した塩基配列を用いて、前述(i)を作製する方法は特に限定されず、PCR法や制限酵素を用いた標的遺伝子部分の切除もしくは置換等の公知技術を用いて行うことができる。
単離したアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化する方法としては、限定はされず、如何なる方法を適用してもよい。例えば、SOE-PCR法や、ゲノムDNAの相同領域を有するプラスミドを形質転換する方法を用いることができる。さらに、形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や接合伝達法が使用できる。
【００３４】
上記欠失又は不活性化されたアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子としては、レシピエント微生物のゲノムDNAにコードされる当該アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子の一部又は全部が欠失等されたもの、プロモーター配列の一部又は全部が欠失等されたもの、発現調節に関連する遺伝子の一部又は全部が欠失等されたものなどが挙げられる。これらの欠失等された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。
前記(ii)の接合伝達開始領域は、使用するドナー微生物中において接合伝達の開始点となる塩基配列を含む領域であれば、限定はされない。例えば、プラスミドRP4由来のoriTが好ましい。
前記(iii)の複製開始領域は、使用するドナー微生物中において前記遺伝子改変用プラスミドの自己複製起点として機能し得る塩基配列を含む領域であれば、限定はされない。例えば、oriVが好ましい。
【００３５】
前記(iv)の薬剤耐性遺伝子は、接合伝達に供するレシピエント微生物（例えばロドコッカス属細菌等）が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子であれば、限定はされない。例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、トリメトプリム耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ナルジクス酸耐性遺伝子、カルベニシン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子等が好ましく挙げられる。レシピエント微生物がこれらの薬剤耐性を有していない場合、所望の薬剤耐性を有する変異株を作製し、使用することができる。
前記(v)の条件致死遺伝子は、レシピエント微生物のゲノム上に導入された場合に、当該微生物を死に至らしめる作用を有し得る遺伝子であれば、限定はされない。例えば、sacB遺伝子が好ましい。sacB遺伝子は、当該遺伝子を保有し発現する微生物（例えばロドコッカス属細菌等）をスクロース含有培地で培養した場合に、スクロースを基質とし当該微生物に対して致死作用を有する有害物質を産生する酵素をコードする遺伝子である。
【００３６】
接合伝達に用いる前記遺伝子改変用プラスミドは、如何なるベクターをベースとして構築されたものであってもよく、限定はされない。例えば、レシピエント微生物がロドコッカス属細菌の場合は、pK19mobベクター（Schaefer et al, Gene1, vol. 45, p. 69-73(1994)）等を用いることが好ましい。
前記遺伝子改変用プラスミドにおける(i)〜(v)の構成は、例えば、上流から順に、前記(i)の塩基配列領域、前記(iv)の耐性遺伝子、前記(v)の条件致死遺伝子、前記(ii)の接合伝達開始領域、前記(iii)の複製開始領域の順で配されていることが好ましい。前記(i)〜(v)の構成を含む遺伝子改変用プラスミドの構築は、公知の遺伝子組換え技術を用いて実施することができる。
工程（ｂ）では、上述したような各構成を有する遺伝子改変用プラスミドをドナー微生物内に導入して形質転換された微生物、すなわち接合伝達に供するドナー微生物を作製する。その際、形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法やカルシウム法（アルカリSDS法）等の、微生物の形質転換方法として公知の方法を用いることができる。
【００３７】
2.3. 工程（ｃ）
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行う。通常は、ドナー微生物及びレシピエント微生物のそれぞれの細胞懸濁液を混合し、適当なプレート培地（LB培地等）上に均一に広げて、両微生物の接合を行わせる。
当該接合においては、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドがレシピエント微生物内に移動し、レシピエント微生物のゲノムと上記プラスミドとの相同配列で2重交叉が起こり当該ゲノム中のアミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子が欠失される。この接合により、レシピエント微生物の形質転換体が作製される。すなわち、当該形質転換体は、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドの一部が相同組換えによりレシピエント微生物のゲノム上に導入されたものである。
所望の形質転換体であるかどうかの確認は、レシピエント微生物自体の薬剤耐性、及び前記遺伝子改変用プラスミド由来の薬剤耐性を利用して行うことができる。具体的には、両薬剤を含む培地（例えば、カナマイシン及びクロラムフェニコール含有培地等）において上記接合後の微生物を培養することにより、所望の形質転換体を選択することができる。
【００３８】
2.4. 工程（ｄ）
工程（ｄ）では、工程（ｃ）で作製されたレシピエント微生物の形質転換体（形質転換微生物）を、前記遺伝子改変用プラスミド由来の条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養（継代培養）する。条件致死遺伝子が機能し得る培養条件としては、限定はされないが、例えば条件致死遺伝子がsacB遺伝子の場合は、スクロース含有培地を用いた培養が好ましく挙げられる。
当該培養においては、上記条件致死遺伝子を有する形質転換微生物は生育困難であるため、継代培養により、自然誘発的に、当該微生物のゲノム上から相同組換えにより上記致死遺伝子を含む塩基配列領域が除かれた（脱落した）形質転換微生物を得ることができる。
【００３９】
ただし、当該得られた微生物の中には、レシピエント微生物中のアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が、当初の目的通り欠失又は不活性化しているものと、そうでないもの（上記脱落の際の相同組換えにより元のアミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子の機能が復活したもの）が含まれている。
よって、通常は、さらに別の培養条件でも培養したり、培養物を用いてアミダーゼ活性及び／又はニトリラーゼ活性測定や各種タンパク質分析法を適用して分析することにより、所望の形質転換微生物を選択することがより好ましい。
【００４０】
３．ニトリルヒドラターゼの製造方法
本発明のニトリルヒドラターゼの製造方法は、前述した本発明の微生物を培養し、得られる培養物から当該ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする方法である。
ここで、当該製造方法に用いる本発明の微生物としては、上記アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子が改変された微生物に、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を当該微生物の遺伝子に挿入（付加）させたものであってもよいし、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む組換えベクターを導入することによりなされたものであってもよいし、その両方を兼ね備えてあるものであってもよい。
組換えベクターを用いる場合は、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が、形質転換される本発明の微生物において発現可能なように、ベクターに組み込まれることが必要である。例えば、ニトリルヒドラターゼを産生し得る微生物のゲノム等からニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むPCR断片を得て、得られた断片を発現ベクターに連結することで、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む発現ベクターを得ることができる。
【００４１】
発現ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられ、中でもプラスミドDNAが好ましい。異種ニトリルヒドラターゼを発現させるためのベクター（プラスミドDNA）としては、限定されないが、例えば、ロドコッカス属細菌を宿主とする場合は、pSJ034、pSJ041、pSJ042、pSJ043等が好ましい。pSJ034は、ロドコッカス属細菌においてニトリルヒドラターゼを発現するベクターであり、特開平10-337185号公報に示す方法でpSJ023より作製することができる。このpSJ023は、形質転換体 ATCC16274/pSJ023（FERM BP-6232）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成９年３月４日付けで国際寄託されている。
当該発現ベクターには、ニトリルヒドラターゼ遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４２】
前述の通り、本発明においては、ニトリルヒドラターゼは、上記形質転換微生物を培養し、得られる培養物から採取することにより製造することができる。
本発明において、「培養物」とは、培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換微生物を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的のニトリルヒドラターゼは、上記培養物中に蓄積される。
形質転換微生物を培養する培地は、宿主菌となる本発明の微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅若しくは炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。さらに、培地にはニトリルヒドラターゼの補欠分子であるコバルトイオンや鉄イオンを添加し、酵素の誘導剤となるニトリル類やアミド類を添加してもよい。
【００４３】
培養中、発現ベクターや目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、発現ベクター等における選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合には相当する薬剤を培地に添加したり、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合には相当する栄養因子を培地から除いたりしてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合には、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した微生物を培養する場合、培養中、必要に応じてアンピシリンを添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養するときには、IPTG等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養するときには、IAA等を培地に添加することができる。
【００４４】
形質転換微生物の培養条件は、発現目的のニトリルヒドラターゼの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば、特段限定されるものではない。通常、10℃〜45℃、好ましくは10℃〜40℃の温度下で、5〜120時間、好ましくは5〜100時間程度行うことができる。pHの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて、適時調整を行うことが好ましい。
培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられるが、振盪培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましい。
また、場合により、本培養に先立ち、少量の前培養を行うこともできる。例えば、ロドコッカス属細菌の形質転換微生物を培養する場合は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30〜40℃の温度下で行うことが好ましい。
上記培養条件で培養すると、高収率でニトリルヒドラターゼを上記培養物中、すなわち培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積することができる。これらニトリルヒドラターゼを含有する「培養物」は、後述するアミド化合物の製造方法に使用することができる。
【００４５】
培養後、ニトリルヒドラターゼが菌体内に生産される場合には、菌体を破砕することにより、目的のニトリルヒドラターゼを採取することができる。菌体の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。
破砕後、必要に応じて菌体の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製したニトリルヒドラターゼ溶液とすることができる。
また、ニトリルヒドラターゼが菌体内に生産される場合、菌体そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。
【００４６】
ニトリルヒドラターゼが菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から異種ニトリルヒドラターゼを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。
形質転換微生物を培養して得られたニトリルヒドラターゼの生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、SDS-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）やニトリルヒドラターゼ活性測定などにより確認することができるが、特段限定されるものではない。SDS-PAGEは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。また、ニトリルヒドラターゼ活性は、上述した活性の値を適用することができる。
【００４７】
４．アミド化合物の製造方法
上述のように製造されたニトリルヒドラターゼ（前述した培養物を含む）は、酵素触媒（菌体のまま利用する微生物触媒等を含む）として物質生産に利用することができる。例えば、ニトリル化合物に、ニトリルヒドラターゼを接触させることにより、当該接触によりニトリル化合物が変換されてアミド化合物を製造することができる。
酵素触媒としては、前述のように適当な宿主内でニトリルヒドラターゼ遺伝子が発現するように遺伝子導入を行い、宿主を培養した後の培養物、又は当該培養物の処理物を利用することができる。処理物としては、例えば、培養後の菌体をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。
【００４８】
基質として使用されるニトリル化合物は、酵素の基質特異性、酵素の基質に対する安定性等を考慮して選択される。ニトリル化合物としては、アクリロニトリルが好ましい。
反応方法、及び反応終了後のアミド化合物の採取方法は限定されず、基質及び酵素触媒の特性により適宜選択することができる。例えば、当該反応において、基質となるニトリル化合物の濃度は、0.1〜10% (W/V)が好ましく、5％ (W/V)程度が特に好ましい。また、当該反応は、pH 5〜10の緩衝液又は水中で行うことが好ましく、例えば、50 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）中で行うことができる。
反応後の酵素触媒は、その活性が失活しない限り、リサイクル使用することが好ましい。失活の防止やリサイクルを容易にすることに鑑み、酵素触媒は処理物の形態で使用されることが好ましい。
上記反応により生成したアクリルアミドは、ガスクロマトグラフィーなどの公知の方法を用いて定量することができる。また、アクリルアミドの産生量から前記酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性を換算することができる。
【００４９】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
アミダーゼ欠失用プラスミド及びニトリラーゼ欠失用プラスミドの作製
（１）接合伝達プラスミド（pK19mobsacB1）の作製
pDNR-1r（clontech社製）中のsacB遺伝子を、NspV切断サイトを付加したプライマーSAC-01（配列番号５）及びSAC-02（配列番号６）を使用したPCRにより増幅し、約1.9 kbのsacB遺伝子断片を得た。PCRは以下の反応条件で行った。
【００５１】
プライマー：
SAC-01： 5'-GGTTCGAATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTG-3'（配列番号５）
SAC-02： 5'-GGTTCGAATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTG-3'（配列番号６）
【００５２】
反応液組成：
滅菌水 22μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
SAC-01(10μM)（配列番号５） 1μl
SAC-02(10μM)（配列番号６） 1μl
pDNR-1r（100ng）（clontech社製） 1μl
総量 50μl
【００５３】
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 20秒の反応を30サイクル
【００５４】
sacB遺伝子断片を制限酵素NspV（タカラバイオ社製）で消化後、pK19mobのNspVサイトに接続し、sacB遺伝子が正方向に導入されたプラスミドpK19mobsacB1を構築した。pK19mob NspV切断断片とsacB遺伝子断片及びsacB遺伝子NspV切断断片の精製にはGFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit（GE Healthcare社製）、両断片の接続にはDNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞、プラスミドの抽出にはQIAprep miniprep kit（QIAGEN社製）を用いた。
【００５５】
（２）J1株ゲノムDNAの調製
ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J1株を100mlのMYK培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、１％ グルコース、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4、pH 7.0）中、30℃にて72時間振盪培養した。
培養後、集菌し、集菌された菌体をSaline-EDTA溶液（0.1M EDTA、0.15M NaCl(pH 8.0)）4 mlに懸濁した。懸濁液にリゾチーム40 mgを加えて、37℃で1〜2時間振盪した後、-20℃で凍結した。
次に、10mlのTris-SDS液（1％SDS、0.1M NaCl、0.1M Tris-HCl(pH 9.0)）を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼK（メルク社）を10μl（終濃度10mg/ｍｌ）加えて37℃で1時間振盪した。
【００５６】
次に、等量のTE (10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 8.0)) 飽和フェノールを加え、撹拌した後遠心した。遠心後、上層をとり2倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でDNAを巻きとり、90％、80％、70％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
次に、DNAを3mlのTE緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼA溶液(100℃、15分間の加熱処理済)を10μg/mlになるよう加え、37℃で30分間振盪した。さらに、プロテイナーゼKを加え37℃で30分間振盪した後、等量のTE飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルム（4％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に2倍量のエタノールを加え、ガラス棒でDNAを巻きとり回収し、Ｊ１株ゲノムゲノムDNAを得た。このゲノムDNAは、配列番号１に示すアミダーゼ遺伝子を有している。
【００５７】
（３）アミダーゼ遺伝子の増幅と発現プラスミドの構築
アミダーゼ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてPCRを行った。
【００５８】
プライマー：
AMD-01： 5'-ggCCTGCAGG GAATTCCTCG GCTACGCCGT-3'（配列番号７）
AMD-02： 5'-TAGGGGAGGG TGGGCATCAC TCTTTCACGG CGACCGTTCG-3'（配列番号８）
【００５９】
反応液組成：
滅菌水 22μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
AMD-01(10μM)（配列番号７） 1μl
AMD-02(10μM)（配列番号８） 1μl
J1株ゲノムDNA（100ng） 1μl
総量 50μl
【００６０】
温度サイクル：
98℃:10秒、55℃：15秒及び72℃：20秒の反応を30サイクル
【００６１】
同様に、下記プライマーAMD-03（配列番号９）及びAMD-04（配列番号１０）を使用し、上記と同じ条件でPCRを実施した。
【００６２】
プライマー：
AMD-03： 5'-cgaacggtcg ccgtgaaaga gtgatgccca ccctccccta-3'（配列番号９）
AMD-04： 5'-ccTCTAGA GCATGCGGAGTCCTTCGTTCGGCA-3'（配列番号１０）
【００６３】
PCR終了後、反応液2μlを0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約500 bpのPCR産物の検出を行った。PCR産物を確認した後、反応液をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【００６４】
次に、上記で増幅した2つのPCR断片を連結するため、以下の条件でAssembly PCRを行った。
【００６５】
反応液組成：
滅菌水 21μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
AMD-01(10μM)（配列番号７） 1μl
AMD-04(10μM)（配列番号１０） 1μl
AMD-01とAMD-02の増幅産物（50ng） 1μl
AMD-03とAMD-04の増幅産物（50ng） 1μl
総量 50μl
温度サイクル：
98℃:10秒、55℃：15秒及び72℃：40秒の反応を30サイクル
【００６６】
PCR終了後、約1Kbの増幅産物をアガロース電気泳動で確認し、Mighty Cloning Kit(Blunt End)（タカラバイオ）でpUC118にクローニングした。
【００６７】
続いて、上記でクローニングした断片を制限酵素XbaI及びSse8387Iで切断し、約1kbの断片を回収し、接合伝達用のプラスミド（pK19mobsacB1）のXbaI-Sse8387I部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドはアミダーゼ遺伝子欠失プラスミド：pBKAMD01と名付けた。図１に、プラスミドpK19mobsacB1の構造を示す模式図を、図２に、プラスミドpBKAMD01の構造を示す模式図を示した。
【００６８】
（４）ニトリラーゼ遺伝子の増幅と発現プラスミドの構築
ニトリラーゼ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてPCRを行った。
【００６９】
プライマー：
NTR-01: 5'-GGCCTGCAGG GAATGCCAGG ACCCTTGTCA-3'（配列番号１１）
NTR-02: 5'-TTCAGCGACA GCACATCCGG AGCGCACAGC GAACTTCGCC-3'（配列番号１２）
【００７０】
反応液組成：
滅菌水 22μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
NTR-01(10μM)（配列番号１１） 1μl
NTR-02(10μM)（配列番号１２） 1μl
J1株ゲノムDNA（100ng） 1μl
総量 50μl
【００７１】
温度サイクル：
98℃:10秒、55℃：15秒及び72℃：20秒の反応を30サイクル
【００７２】
同様にプライマーNTR-03（配列番号１３）及びNTR-04（配列番号１４）を使用し、上記を同じ条件でPCRを実施した。
【００７３】
プライマー：
NTR-03: 5'-ggcgaagttc gctgtgcgct gtgatgccca ccctccccta-3'（配列番号１３）
NTR-04: 5'-CCTCTAGA CGATCGACGATGCGTT-3'（配列番号１４）
【００７４】
PCR終了後、反応液2μlを0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約300 bpのPCR産物の検出を行った。PCR産物を確認した後、反応液をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【００７５】
次に、上記で増幅した2つのPCR断片を連結するため、以下の条件でAssembly PCRを行った。
【００７６】
反応液組成：
滅菌水 21μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
NTR-01(10μM)（配列番号１１） 1μl
NTR-04(10μM)（配列番号１４） 1μl
NTR-01とNTR-02の増幅産物（50ng） 1μl
NTR-03とNTR-04の増幅産物（50ng） 1μl
総量 50μl
【００７７】
温度サイクル：
98℃:10秒、55℃：15秒及び72℃：40秒の反応を30サイクル
【００７８】
PCR終了後、約600bpの増幅産物をアガロース電気泳動で確認し、Mighty Cloning Kit(Blunt End)（タカラバイオ）でpUC118にクローニングした。
続いて、上記でクローニングした断片を制限酵素XbaI及びSse8387Iで切断し、約600 bpの断片を回収し、接合伝達用のプラスミド（pK19mobsacB1）のXbaI-Sse8387I部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドは、ニトリラーゼ遺伝子欠失プラスミド：pBKNTR01と名付けた。図３に、プラスミドpBKNTR01の構造を示す模式図を示した。
【実施例２】
【００７９】
薬剤耐性を有するＪ１株の作製
接合伝達に使用するドナーは、遺伝子欠失株のセレクションに薬剤耐性が必要である。そこで、種々の薬剤耐性株の取得を試み、アンピシリン耐性を有するＪ１株の変異株を下記の方法で取得した。
2μg／mlのアンピシリンを含んだMYKプレート（0.5%ポリペプトン、0.3%バクトイーストエキス、0.3%マルツエキス、0.2% KH2PO4、0.2% K2HPO4、1.5%寒天）にＪ１株をストリークし、コロニーが生育するまで30℃で保温した。約２週間後、アンピシリン耐性株が生育してきたので、再度2μg／mlのアンピシリンプレートにストリークして、30℃で保温した。
次に、2μg／mlのアンピシリンプレートから生育したコロニーを、５μg/mlのアンピシリンプレートにストリークし、耐性株が出現するまで30℃で保温した。以下、同様の操作を、アンピシリン濃度を10μg/ml→15μg/ml→50μg/ml→100μg/mlに高めながら繰り返し、100μg/mlのアンピシリン濃度で生育するアンピシリン耐性株（J1-Amp株）を得た。
【実施例３】
【００８０】
接合伝達によるアミダーゼ遺伝子の欠失
（１）ドナーの調製
乾熱滅菌した試験管に大腸菌S17-1λpirのコンピテントセル20μlにプラスミドpBKAMD01 1μlを加え、氷上で30分静置した。42℃で30秒ヒートショック後、SOC培地を180μl添加し、37℃で1時間振とう培養を行った。その後、50μg/mlカナマイシンを含んだLBプレートに塗布し、37℃で一晩静置した。
翌日、プレートに生育したコロニーをLB培地1ｍｌで回収し、遠心分離により菌体を回収し、遠心上清を除去した。同様の操作をもう一度繰り返し、最後に0.5 mlのLB培地を添加し、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液をドナー溶液とした。
【００８１】
（２）レシピエントの調整
J1−Amp株をMYKプレートにストリークし、30℃で2日生育させた。生育したコロニーは実施例３（１）と同様の方法で回収、洗浄し、レシピエントとなる菌体懸濁液を調製した。
【００８２】
（３）接合伝達
実施例３（１）で調製したドナー溶液と、実施例３（２）で調製したレシピエント溶液を100μlずつ混合し、抗生物質を含まないMYKプレートに塗布し、30℃で一晩静置した。
翌日、生育したコロニーは１mlのLB培地で回収し、100μlずつカナマイシン濃度を10、30、50μg/mlとした選抜プレート（すべて100μg/mlアンピシリンを含む）に塗布した。塗布したプレートは組み換え菌コロニーが出現するまで30℃で1週間保温した。
その結果、100μg/mlアンピシリン、10μg/mlカナマイシンを含んだプレートにのみ3個のコロニーが出現した。得られたコロニーの一つを＃A1と命名し、以後の実験に使用した。
【００８３】
（４）アミダーゼ遺伝子の欠失
接合伝達により得られた組み換え菌＃A1は、ゲノムのアミダーゼ遺伝子の領域に相同組換えによりプラスミドが挿入されているが、アミダーゼ遺伝子を欠失するには2段階の相同組換えが必要である。そこで、次に、sacB遺伝子を利用した選抜を実施した。
10％ショ糖を含んだMYKプレートを作製し、＃A1のコロニーを滅菌水に懸濁した液を適度に希釈して塗布し、30℃で静置した。生育したコロニーについて10個のコロニーからゲノムDNAを調製し、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてPCRを行って、得られた断片（PCR産物）のサイズを電気泳動で調べた。なお、プライマーAMD-01及びAMD-04は、実施例１で用いたものと同様である。
【００８４】
反応液組成：
滅菌水 22μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
AMD-01(10μM)（配列番号７） 1μl
AMD-04(10μM)（配列番号１０） 1μl
ゲノムDNA（100ng） 1μl
総量 50μl
【００８５】
温度サイクル：
98℃:10秒、55℃：15秒及び72℃：20秒の反応を30サイクル
【００８６】
その結果、10個の内、5個のコロニーはアミダーゼ遺伝子が欠失していることが確認された。得られたアミダーゼ遺伝子欠失株を、それぞれDA１〜DA5株と命名した。
【実施例４】
【００８７】
DA1〜DA5株の培養
DA1〜DA5株とＪ１株を下記の培地で培養し、アミダーゼ活性を確認した。本培養の培地は、ニトリルヒドラターゼの誘導剤である尿素とコバルト、及びアミダーゼの誘導剤であるコバルトとシクロヘキサンカルボアミドを含むものを用いた。前培養は30℃で3日間、本培養は30℃で2日間、振とう培養した。
【００８８】
［前培養培地組成］（pH 7.0）
グルコース 20 g/L
味液 20 g/L
ポリペプトン 5 g/L
酵母エキス 3 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1 g/L
【００８９】
［本培養液組成］（pH 7.0）
グルコース 15 g/L
ポリペプトン 3 g/L
酵母エキス 3 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1 g/L
エタノール 2 g/L
CoCl2・6H2O 0.025 g/L
チアミン 0.002 g/L
ビタミンK 0.002 g/L
尿素 15 g/L
シクロヘキサンカルボアミド 2 g/L
【００９０】
菌体を含む培養液のアミダーゼ活性の測定は、以下の方法に従って行った。
まず、本培養後に得られた培養液1 mlと50 mMリン酸緩衝液（pH 7.7）4 mlとを混合し、さらに1 Mのアクリロニトリルを含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7.7）5 mlを混合液に加えて、10 ℃で2時間反応させた。反応液から遠心分離によって、菌体を除いた後、HPLC（カラム：Inertsil ODS-3V 4.6×250mm、GLサイエンス社製；溶離液：10 mM KH2P04・H3P04 (pH 2.8)/acetonitrile=3:2；流速：1.0 ml/分；検出：UV 254nm）にて分析し、アクリルアミドおよびアクリル酸の量からアミダーゼ活性を評価した。
反応終了後の液中の組成を評価した結果、J1株の場合は0.78 M アクリルアミドと0.22 Mアクリル酸が生成したが、アミダーゼ遺伝子を欠失させたDA1〜DA5株ではアクリルアミドのみ生成した。
【実施例５】
【００９１】
DA1における、接合伝達によるニトリラーゼ遺伝子の欠失
（１）ドナーの調製
実施例３と同様に実施した。
【００９２】
（２）レシピエントの調整
DA1株をMYKプレートにストリークし、30℃で2日生育させた。生育したコロニーは実施例３（１）と同様の方法で回収、洗浄し、レシピエントとなる菌体懸濁液を調製した。
【００９３】
（３）接合伝達
実施例５（１）で調製したドナー溶液と、実施例５（２）で調製したレシピエント溶液を100μlずつ混合し、抗生物質を含まないMYKプレートに塗布し、30℃で一晩静置した。
翌日、生育したコロニーは1 mlのLB培地で回収し、100μlずつカナマイシン濃度を10、30、50μg/mlとした選抜プレート（すべて100μg/mlアンピシリンを含む）に塗布した。塗布したプレートは組み換え菌コロニーが出現するまで30℃で1週間保温した。
その結果、100μg/mlアンピシリン、10μg/mlカナマイシンを含んだプレートにのみ2個のコロニーが出現した。得られたコロニーの一つを＃AN1と命名し、以後の実験に使用した。
【００９４】
（４）ニトリラーゼ遺伝子の欠失
実施例３（４）と同様の方法で実施した。
接合伝達により得られた組み換え菌＃AN1は、ゲノムのアミダーゼ遺伝子の領域に相同組換えによりプラスミドが挿入されているが、アミダーゼ遺伝子を欠失するには2段階の相同組換えが必要である。そこで次に、sacB遺伝子を利用した選抜を実施した。
10％ショ糖を含んだMYKプレートを作製し、＃A1のコロニーを滅菌水に懸濁した液を適度に希釈して塗布し、30℃で静置した。生育したコロニーについて10個のコロニーからゲノムDNAを調製し、PCR断片のサイズを電気泳動で調べた。
【００９５】
反応液組成：
滅菌水 22μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
NTR-01(10μM)（配列番号１１） 1μl
NTR-04(10μM)（配列番号１４） 1μl
ゲノムDNA（100ng） 1μl
総量 50μl
【００９６】
温度サイクル：
98℃:10秒、55℃：15秒及び72℃：20秒の反応を30サイクル
【００９７】
その結果、10個の内、4個のコロニーはニトリラーゼ遺伝子が欠失していることが確認された。得られたニトリラーゼ遺伝子欠失株をDAN１〜DAN4株と命名した。
【実施例６】
【００９８】
DAN1〜DAN4株の培養
DAN1〜DAN4株とJ1株を下記の培地で培養し、ニトリラーゼ活性を確認した。本培養の培地は、ニトリルヒドラターゼの誘導剤である尿素とコバルト、及びニトリラーゼの誘導剤であるイソバレロニトリルを含むものを用いた。前培養は30℃で3日間、本培養は30℃で2日間、振とう培養した。
【００９９】
［前培養培地組成］（pH 7.0）
グルコース 20 g/L
味液 20 g/L
ポリペプトン 5 g/L
酵母エキス 3 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1 g/L
【０１００】
［本培養液組成］（pH 7.0）
グルコース 15 g/L
ポリペプトン 3 g/L
酵母エキス 3 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1 g/L
エタノール 2 g/L
CoCl2・6H2O 0.025 g/L
チアミン 0.002 g/L
ビタミンK 0.002 g/L
尿素 15 g/L
イソバレロニトリル 2 g/L
【０１０１】
菌体を含む培養液のニトリラーゼ活性の測定は、以下の方法に従って行った。
まず、本培養後に得られた培養液1 mlと50 mMリン酸緩衝液（pH 7.7）4 mlとを混合し、さらに1 Mのアクリロニトリルを含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7.7）5 mlを混合液に加えて、10 ℃で2時間反応させた。次いで、菌体を濾別して、HPLCを用いて、生成したアクリル酸の量を定量し、アクリル酸の量からニトリラーゼ活性を換算した。なお、分析条件は、実施例４と同様とした。
反応終了後の液中の組成を評価した結果、J1株の場合は0.65 Mアクリルアミドと0.35 Mアクリル酸が生成したが、ニトリラーゼ遺伝子を欠失させたDAN1〜DAN5株ではアクリルアミドのみ生成した。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号９：合成DNA
配列番号１０：合成DNA
配列番号１１：合成DNA
配列番号１２：合成DNA
配列番号１３：合成DNA
配列番号１４：合成DNA
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物に関する。また、当該微生物を利用した、ニトリルヒドラターゼの製造方法及びアミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素または該酵素を含有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が開示されている。この製造方法は、従来の化学合成法と比較し、ニトリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いことで知られている。
ニトリルヒドラターゼを生産する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレビシエラ(Klebsiella)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属、ノカルディア（Nocardia）属等に属する細菌（微生物）を挙げることができる。中でも、ロドコッカス属細菌の一種であるロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株（以下、Ｊ１株と称する）は、アクリルアミドの工業的生産に使用されており、有用性が実証されている。また、その菌株が産生するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子も明らかとなっている（特許文献１参照）。
【０００３】
一般にニトリルヒドラターゼを有している微生物はニトリル分解に関連するアミダーゼやニトリラーゼの遺伝子を有している。アミド化合物の製造において、アミダーゼ活性を有している微生物を使用した場合、アミダーゼによりアミド化合物がカルボン酸に変換される副反応が起こり、アミド化合物の製造が妨げられる（特許文献２参照）。また、ニトリラーゼ活性を有している微生物を使用した場合、ニトリラーゼによりニトリル化合物がカルボン酸に変換される副反応が起こり、アミド化合物の製造が妨げられる。このような場合、アミダーゼ活性やニトリラーゼ活性を有しない微生物を用いる、あるいは微生物からアミダーゼ活性やニトリラーゼ活性を欠失させた変異株を用いることが有効である。
【０００４】
変異株を用いる例としては、NTG（N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）やEMS（エチルメタンスルホン酸）等の変異誘起化合物を用いてアミダーゼ活性を有する微生物からアミダーゼの生産を低下又は阻害させた例が報告されている（特許文献３参照）。しかしながら、変異誘起化合物を用いたアミダーゼ遺伝子の変異（欠失や不活性化等）は、植え継ぎ（継代）により当該変異が復帰する（活性を有する状態に戻る）ことがあるため、変異体を長期に安定して使用することは容易なことではなかった。
また、相同組換えを用いた遺伝子欠損も有効な手法であり、アミダーゼ欠失に関しては、ロドコッカス・ルーバー（Rhodococcus ruber）TH3についての報告がある。この報告の例では、宿主微生物がアミダーゼを複数有しているため、1つのアミダーゼを欠失させただけでは副反応は完全に抑えられていない（非特許文献１）。また、当該報告の方法ではゲノム上にマーカーが残るため、複数の遺伝子欠失は複数のマーカー遺伝子が必要となる。
【０００５】
これらとは別の方法として、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ及びニトリラーゼの発現は、それぞれ、誘導剤であるニトリル化合物、アミド化合物及びカルボン酸化合物により制御されているため、当該誘導剤の調節で酵素発現を制御することが可能である。しかしながら、誘導剤のみで酵素発現を完全に制御することは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第3162091号
【特許文献２】国際公開第09/117843号
【特許文献３】特開2001/120259号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bioresource Technology. Vol. 101(2010) p.285-291
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ロドコッカス属細菌をより有効に活用するためには、目的に応じてロドコッカス属細菌のゲノム上の遺伝子を特異的に欠失又は不活性化等することにより、改変することが効果的である。
ところで、ゲノム上に存在する遺伝子を欠失又は不活性化等する手法としては、相同組換え（Homologous recombination）を利用する方法が挙げられる。これは、標的遺伝子の塩基配列中に薬剤耐性マーカー遺伝子等を相同組換えにより挿入し、当該遺伝子が機能発現しない状態にする、又は（標的遺伝子を当該遺伝子の一部若しくは全部を含まない配列に置換することにより）標的遺伝子自体を欠失させて、その発現そのものを阻害する方法である。大腸菌や酵母等のいくつかの微生物では、効率的な相同組換え技術が確立しているため（例えば、SOE-PCR法（例えば、SOE-PCR（Gene, vol. 77, p. 61-68（1989））、比較的容易に標的遺伝子の欠失又は不活性化を行うことができる。
【０００９】
ロドコッカス属細菌において相同組換えにより遺伝子欠失又は不活性化を行う場合、エレクトロポレーション法等が知られている。しかしながら、ロドコッカス属細菌及びその類縁属細菌は非相同組換えが起こり易いという特徴を有しているため、目的の相同組換え株が極めて低確率でしか得られないという問題がある。
従って、ロドコッカス属細菌等の、もともとアミダーゼ活性やニトリラーゼ活性を有する微生物について、アミダーゼ遺伝子やニトリラーゼ遺伝子が欠失又は不活性化等されたもの（特に、より効率的且つ汎用的に当該耐性遺伝子が欠失又は不活性化等されたもの）は、十分に得られていないのが現状である。
【００１０】
このような状況下において、より効率的かつ汎用的にアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化等させた、遺伝的に改変された微生物の取得及び開発が望まれていた。より詳細には、ロドコッカス属細菌等の微生物における相同組換え技術を開発及び確立し、当該微生物（宿主）由来のアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化等させた改変微生物をより効率的かつ汎用的に得ること、さらには、低コストかつ高効率でアミド化合物を製造することが望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物、当該微生物を用いたニトリルヒドラターゼの製造方法、及び当該微生物を用いたアミド化合物の製造方法等を提供するものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１２】
（１）ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物であって、前記欠失又は不活性化が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われるものである、前記欠失又は不活性化された微生物。
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中のアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）前記（ｂ）で作製されたドナー微生物から前記（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）前記（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【００１３】
上記(1)の微生物において、前記ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物及び前記レシピエント微生物としては、例えばロドコッカス属細菌が挙げられる。ここで、ロドコッカス属細菌としては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株又はその変異株が挙げられる。
上記(1)の微生物において、ドナー微生物としては、例えば大腸菌が挙げられる。また、ドナー微生物が感受性を示す薬剤としては、例えば、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラシクリン、カルベニシン及びナルジクス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、レシピエント微生物が感受性を示す薬剤としては、例えば、カナマイシンが挙げられる。
【００１４】
上記(1)の微生物において、欠失又は不活性化させるアミダーゼ遺伝子としては、例えば、配列番号１に示す塩基配列を含むものが挙げられ、欠失又は不活性化させるニトリラーゼ遺伝子としては、例えば、配列番号３に示す塩基配列を含むものが挙げられる。
【００１５】
（２）上記(1)の微生物を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
（３）上記(1)の微生物を培養して得られる培養物又は当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させ、当該接触により生成されるアミド化合物を採取することを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物のうち、アミダーゼ活性及び／又はニトリラーゼ活性を有する微生物、特にロドコッカス属細菌等の微生物について、当該微生物ゲノム上のアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物を、より一層効率的かつ汎用的に提供することができる。
また、本発明によれば、ロドコッカス属細菌等の微生物における相同組換え技術を確立し、上記のような遺伝的に改変した微生物を効率的かつ汎用的に得ることができる。さらには、当該改変微生物を用いてニトリルヒドラターゼを効率的に産生し得る微生物を作製し、当該微生物を微生物触媒として用いて様々なニトリル化合物から低コストかつ高効率でアミド化合物を製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本実施例における、プラスミドpK19mobsacB1の構造を示す模式図である。
【図２】本実施例における、プラスミドpBKAMD01の構造を示す模式図である。
【図３】本実施例における、プラスミドpBKNTR01の構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１９】
１．アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子が改変された微生物
本発明に係るアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が改変（欠失又は不活性化（以下、「欠失等」と称することがある））された微生物（以下、「本発明の微生物」と称することがある）は、前述した通り、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物である。
【００２０】
本発明の微生物が得られる前の、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物（対象微生物）としては、ニトリルヒドラターゼの他、アミダーゼ及び／又はニトリラーゼを産生し、それらの活性を示すものであればよく、特に限定はされない。例えば、ロドコッカス属細菌、バチルス属細菌、シュードノカルディア属細菌、ジオバチルス属細菌、シュードモナス属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌等が好ましく挙げられる。中でもロドコッカス属細菌は、細胞壁が強固で反応液中へタンパク質などの菌体内容物が漏れないため、産業的に微生物触媒としての使用等に適している点でより好ましい。
ここで、ロドコッカス属細菌としては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）及びロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス・ピリジノボランス（Rhodococcus pyridinivorans）等が好ましく挙げられる。
【００２１】
ロドコッカス・ロドクロウスとしては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスJ1、ロドコッカス・ロドクロウスM8(SU1731814)、ロドコッカス・ロドクロウスM33（VKM Ac-1515D）及びロドコッカス・ロドクロウスNCIMB41164（国際公開第05/054456号）等が好ましく挙げられる。ロドコッカス・ピリジノボランスとしては、例えば、ロドコッカス・ピリジノボランス S85-2（国際公開第03/066800号）、ロドコッカス・ピリジノボランス MS-38（特願2004-151508号）等が好ましく挙げられる。
また、バチルス属細菌としては、例えば、バチルス・スミシ（Bacillus smithii）(特開平09-248188号)等が好ましく挙げられる。シュードノカルディア属細菌としては、例えば、シュードノカルディア・サーモフィラJCM3095(特開平09-275978号)、等が好ましく挙げられる。ジオバチルス属細菌としては、例えば、ジオバチルス・サーモグルコシダシアス（国際公開第04/108942号）、ジオバチルス・カルドキシロシチリカスM16（特開2006-158323号）等が好ましく挙げられる。シュードモナス属細菌としては、例えば、シュードモナス・クロロラフィスB23（特開昭58- 86093）シュードモナス プチダ DSM16276（国際公開第05/2689号）、シュードモナス マルギナリス DSM16275（国際公開第05/2689号）、ノカルディア属細菌としては、例えばノカルディア・YS-2002株（CN1584024）、ノカルディア・sp.JBRs（GenBank:AY141130）が好ましく挙げられる。
【００２２】
アミダーゼは、以下の反応式に示すように、アミド化合物のアミド基に作用し、対応するカルボン酸に変換する水和反応を触媒する酵素である。
R-CONH2+ H2O → R-COOH + NH3
(式中、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは置換又は無置換の飽和又は不飽和複素環基を表す。)
ここで、「アミダーゼ活性」とは、アミド化合物のアミド基に作用して対応するカルボン酸化合物に変換させる活性を意味する。本発明の微生物のアミダーゼ活性の測定方法としては、例えば、アミド化合物の１種であるアクリルアミドを用いる方法が挙げられる。この方法では、アミダーゼ活性の結果としてアクリルアミドに対応するカルボン酸化合物、すなわちアクリル酸が得られる。従って、本発明の微生物をアクリルアミドに接触させ、生成するアクリル酸の量の増加を定量することで、アミダーゼ活性を測定することができる。あるいは、アクリルアミドの消費量を定量することによってもアミダーゼ活性を測定することができる。
【００２３】
ニトリラーゼは、以下の反応式に示すように、ニトリル化合物のニトリル基に作用し、対応するカルボン酸に変換する水和反応を触媒する酵素である。
R-CN + 2H2O → R-COOH + NH3
(式中、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは置換若しくは無置換の飽和又は不飽和複素環基を表す。)
ここで、「ニトリラーゼ活性」とは、ニトリル化合物のニトリル基に作用して対応するカルボン酸化合物に変換する活性を意味する。本発明の微生物のニトリラーゼ活性の測定方法としては、例えば、二トリル化合物の１種であるアクリロニトリルを用いる方法が挙げられる。この方法では、ニトリラーゼ活性の結果としてアクリロニトリルに対応するカルボン酸化合物、すなわちアクリル酸が得られる。従って、本発明の微生物をアクリロニトリルに接触させ、生成するアクリル酸の量の増加を定量することで、ニトリラーゼ活性を測定することができる。あるいは、アクリロニトリルの消費量を定量することによってもニトリラーゼ活性を測定することができる。
【００２４】
ニトリルヒドラターゼは、以下の反応式に示すように、ニトリル化合物のニトリル基に作用し、対応するアミド化合物に変換する水和反応を触媒する酵素である。
R-CN + H2O → R-CONH2
(式中、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは置換若しくは無置換の飽和又は不飽和複素環基を表す。)
ここで、「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、ニトリル化合物のニトリル基に作用して対応するアミド化合物に変換させる活性を意味する。本発明の微生物のニトリルヒドラターゼ活性の測定方法としては、例えば、ニトリル化合物の１種であるアクリロニトリルを用いる方法が挙げられる。この方法では、ニトリルヒドラターゼ活性の結果としてアクリロニトリルに対応するアミド化合物、すなわちアクリルアミドが得られる。従って、本発明の微生物をアクリロニトリルに接触させ、生成するアクリルアミドの量の増加を定量することで、ニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。あるいは、アクリロニトリルの消費量を定量することによってもニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。
【００２５】
本発明の微生物は、本来有するアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されたものであるが、この欠失等される遺伝子（標的遺伝子）としては、対象微生物のゲノムDNAにコードされるアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子の一部又は全部が欠失等されたもの、プロモーター配列の一部又は全部が欠失等されたもの、発現調節に関連する遺伝子の一部又は全部が欠失等されたものなどが挙げられる。これらの欠失等された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。
なお、本発明においては、例えば、上記対象微生物がロドコッカス・ロドクロウスＪ１株の場合は、アミダーゼ遺伝子（配列番号１；アミノ酸配列は配列番号２）とニトリラーゼ遺伝子（配列番号３；アミノ酸配列は配列番号４）を有しているため、標的遺伝子としては、これらのいずれか一方でもよいし、両方でもよく、限定はされない。
【００２６】
２．アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子が改変された微生物の製造
本発明の微生物を製造するための、アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化する方法は、以下の通りである。
すなわち、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法を用いることを含む、アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子の欠失又は不活性化方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする方法である。
【００２７】
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、下記(i)〜(v)：
(i) レシピエント微生物中のアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子（標的遺伝子）とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、
(ii) 当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、
(iii) 当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、
(iv) レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び
(v) レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子
を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）工程（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【００２８】
上記欠失又は不活性化方法において用いるレシピエント微生物としては、ニトリルヒドラターゼ活性を有し、アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子を有する微生物であれば限定はされない。中でもロドコッカス属細菌が、前述した理由でより好ましい。ロドコッカス属細菌等の具体例についても、前述と同様のものが挙げられる。
一方、ドナー微生物としては、上記レシピエント微生物と接合伝達可能な微生物であれば限定はされない。例えば、大腸菌が好ましい。
【００２９】
2.1. 工程（ａ）
工程（ａ）では、接合伝達に供するレシピエント微生物として、接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性を強化した微生物を作製する。「薬剤への耐性を強化する」とは、レシピエント微生物が薬剤耐性を有していない場合には、薬剤耐性を付与することをいい、レシピエント微生物が薬剤耐性の乏しい場合には、当該耐性をより強くすることをいう。
接合伝達法を使用する場合、レシピエントとなる微生物には薬剤耐性マーカーが必要である。よって、薬剤耐性を有していない微生物、又は薬剤耐性の乏しい微生物を使用する場合、薬剤選択可能な程度の十分な薬剤耐性を有する株（レシピエント）の作製が必要となる。ここで、薬剤としては、接合伝達法を使用することを考慮し、接合伝達に供するドナー微生物（接合伝達時のドナー微生物）が感受性を示す薬剤が好ましい。当該薬剤としては、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、トリメトプリム、ゲンタマイシン、ナルジクス酸、カルベニシン、チオストレプトン、テトラサイクリン及びストレプトマイシン等が好ましく、クロラムフェニコール及びアンピシリンがより好ましい。
【００３０】
上述のように薬剤耐性を強化したレシピエント微生物を作製する方法としては、特には限定されない。例えば、自然変異誘発法、紫外線照射や変異誘発剤を用いる突然変異誘発法、EZ-Tn5（Epicentre社製）のようなランダム変異導入ツール等を用いることにより、本来レシピエント微生物が持たない薬剤耐性遺伝子を人為的に当該微生物ゲノム上に導入する方法、あらかじめ遺伝子改変用プラスミドとは別の、抗生物質耐性獲得用のプラスミドを導入する方法等が好ましい。これらの中でも自然変異誘発法がより好ましい。
【００３１】
自然変異誘発法は、所望の薬剤を含有する培地中で対象とする微生物を継代培養等することにより、もともとは当該培地中で生育不可又は困難な微生物に自然変異を誘発させて、より高濃度の薬剤を含有する当該培地中でも生育し得る株を取得する方法である。どの程度まで薬剤耐性を強化するかは、使用するレシピエント微生物、ドナー微生物、選択する薬剤により異なるが、レシピエント微生物の生育が抑制されない、且つ、ドナー微生物の生育が阻害される薬剤濃度を選ぶことが好ましい。例えば、レシピエント微生物としてロドコッカス属細菌を、ドナー微生物として大腸菌を、選択用薬剤としてクロラムフェニコールを用いる場合、自然突然変異によりクロラムフェニコール1〜200 mg/L、好ましくは10〜100 mg/Lを含有する培地において生育可能なレシピエント微生物（クロラムフェニコール耐性強化株）を得ることが望ましい。
【００３２】
2.2. 工程（ｂ）
工程（ｂ）では、接合伝達に供するドナー微生物として、所定の遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する。遺伝子改変用プラスミド、すなわちレシピエント微生物中のアミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子を改変するためのプラスミドDNAとしては、前述の(i)〜(v)の構成（遺伝子・塩基配列）を含むものを用いる。
ここで、前記(i)の塩基配列領域は、改変の対象とするレシピエント微生物中のアミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼーゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列において、当該アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼーゼ遺伝子を欠失又はさせた塩基配列領域である。当該塩基配列領域の作製は、レシピエント微生物のゲノムから、アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列の単離（クローニング）及び遺伝子ライブラリー作製やPCR等の公知技術を用いて行うことができる。
【００３３】
なお、アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子の周辺の塩基配列としては、限定はされない。例えば、当該遺伝子に加え、発現調節に関連する遺伝子の上流及び下流の相同領域が両端からそれぞれ100〜3000 bpの塩基配列を含む配列であることが好まし。より好ましくは500〜2000 bpの塩基配列を含む配列である。単離した塩基配列を用いて、前述(i)を作製する方法は特に限定されず、PCR法や制限酵素を用いた標的遺伝子部分の切除もしくは置換等の公知技術を用いて行うことができる。
単離したアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化する方法としては、限定はされず、如何なる方法を適用してもよい。例えば、SOE-PCR法や、ゲノムDNAの相同領域を有するプラスミドを形質転換する方法を用いることができる。さらに、形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や接合伝達法が使用できる。
【００３４】
上記欠失又は不活性化されたアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子としては、レシピエント微生物のゲノムDNAにコードされる当該アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子の一部又は全部が欠失等されたもの、プロモーター配列の一部又は全部が欠失等されたもの、発現調節に関連する遺伝子の一部又は全部が欠失等されたものなどが挙げられる。これらの欠失等された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。
前記(ii)の接合伝達開始領域は、使用するドナー微生物中において接合伝達の開始点となる塩基配列を含む領域であれば、限定はされない。例えば、プラスミドRP4由来のoriTが好ましい。
前記(iii)の複製開始領域は、使用するドナー微生物中において前記遺伝子改変用プラスミドの自己複製起点として機能し得る塩基配列を含む領域であれば、限定はされない。例えば、oriVが好ましい。
【００３５】
前記(iv)の薬剤耐性遺伝子は、接合伝達に供するレシピエント微生物（例えばロドコッカス属細菌等）が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子であれば、限定はされない。例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、トリメトプリム耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ナルジクス酸耐性遺伝子、カルベニシン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子等が好ましく挙げられる。レシピエント微生物がこれらの薬剤耐性を有していない場合、所望の薬剤耐性を有する変異株を作製し、使用することができる。
前記(v)の条件致死遺伝子は、レシピエント微生物のゲノム上に導入された場合に、当該微生物を死に至らしめる作用を有し得る遺伝子であれば、限定はされない。例えば、sacB遺伝子が好ましい。sacB遺伝子は、当該遺伝子を保有し発現する微生物（例えばロドコッカス属細菌等）をスクロース含有培地で培養した場合に、スクロースを基質とし当該微生物に対して致死作用を有する有害物質を産生する酵素をコードする遺伝子である。
【００３６】
接合伝達に用いる前記遺伝子改変用プラスミドは、如何なるベクターをベースとして構築されたものであってもよく、限定はされない。例えば、レシピエント微生物がロドコッカス属細菌の場合は、pK19mobベクター（Schaefer et al, Gene1, vol. 45, p. 69-73(1994)）等を用いることが好ましい。
前記遺伝子改変用プラスミドにおける(i)〜(v)の構成は、例えば、上流から順に、前記(i)の塩基配列領域、前記(iv)の耐性遺伝子、前記(v)の条件致死遺伝子、前記(ii)の接合伝達開始領域、前記(iii)の複製開始領域の順で配されていることが好ましい。前記(i)〜(v)の構成を含む遺伝子改変用プラスミドの構築は、公知の遺伝子組換え技術を用いて実施することができる。
工程（ｂ）では、上述したような各構成を有する遺伝子改変用プラスミドをドナー微生物内に導入して形質転換された微生物、すなわち接合伝達に供するドナー微生物を作製する。その際、形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法やカルシウム法（アルカリSDS法）等の、微生物の形質転換方法として公知の方法を用いることができる。
【００３７】
2.3. 工程（ｃ）
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行う。通常は、ドナー微生物及びレシピエント微生物のそれぞれの細胞懸濁液を混合し、適当なプレート培地（LB培地等）上に均一に広げて、両微生物の接合を行わせる。
当該接合においては、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドがレシピエント微生物内に移動し、レシピエント微生物のゲノムと上記プラスミドとの相同配列で2重交叉が起こり当該ゲノム中のアミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子が欠失される。この接合により、レシピエント微生物の形質転換体が作製される。すなわち、当該形質転換体は、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドの一部が相同組換えによりレシピエント微生物のゲノム上に導入されたものである。
所望の形質転換体であるかどうかの確認は、レシピエント微生物自体の薬剤耐性、及び前記遺伝子改変用プラスミド由来の薬剤耐性を利用して行うことができる。具体的には、両薬剤を含む培地（例えば、カナマイシン及びクロラムフェニコール含有培地等）において上記接合後の微生物を培養することにより、所望の形質転換体を選択することができる。
【００３８】
2.4. 工程（ｄ）
工程（ｄ）では、工程（ｃ）で作製されたレシピエント微生物の形質転換体（形質転換微生物）を、前記遺伝子改変用プラスミド由来の条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養（継代培養）する。条件致死遺伝子が機能し得る培養条件としては、限定はされないが、例えば条件致死遺伝子がsacB遺伝子の場合は、スクロース含有培地を用いた培養が好ましく挙げられる。
当該培養においては、上記条件致死遺伝子を有する形質転換微生物は生育困難であるため、継代培養により、自然誘発的に、当該微生物のゲノム上から相同組換えにより上記致死遺伝子を含む塩基配列領域が除かれた（脱落した）形質転換微生物を得ることができる。
【００３９】
ただし、当該得られた微生物の中には、レシピエント微生物中のアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が、当初の目的通り欠失又は不活性化しているものと、そうでないもの（上記脱落の際の相同組換えにより元のアミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子の機能が復活したもの）が含まれている。
よって、通常は、さらに別の培養条件でも培養したり、培養物を用いてアミダーゼ活性及び／又はニトリラーゼ活性測定や各種タンパク質分析法を適用して分析することにより、所望の形質転換微生物を選択することがより好ましい。
【００４０】
３．ニトリルヒドラターゼの製造方法
本発明のニトリルヒドラターゼの製造方法は、前述した本発明の微生物を培養し、得られる培養物から当該ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする方法である。
ここで、当該製造方法に用いる本発明の微生物としては、上記アミダーゼ遺伝子及び／又はニトリラーゼ遺伝子が改変された微生物に、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を当該微生物の遺伝子に挿入（付加）させたものであってもよいし、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む組換えベクターを導入することによりなされたものであってもよいし、その両方を兼ね備えてあるものであってもよい。
組換えベクターを用いる場合は、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が、形質転換される本発明の微生物において発現可能なように、ベクターに組み込まれることが必要である。例えば、ニトリルヒドラターゼを産生し得る微生物のゲノム等からニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むPCR断片を得て、得られた断片を発現ベクターに連結することで、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む発現ベクターを得ることができる。
【００４１】
発現ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられ、中でもプラスミドDNAが好ましい。異種ニトリルヒドラターゼを発現させるためのベクター（プラスミドDNA）としては、限定されないが、例えば、ロドコッカス属細菌を宿主とする場合は、pSJ034、pSJ041、pSJ042、pSJ043等が好ましい。pSJ034は、ロドコッカス属細菌においてニトリルヒドラターゼを発現するベクターであり、特開平10-337185号公報に示す方法でpSJ023より作製することができる。このpSJ023は、形質転換体 ATCC16274/pSJ023（FERM BP-6232）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成９年３月４日付けで国際寄託されている。
当該発現ベクターには、ニトリルヒドラターゼ遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４２】
前述の通り、本発明においては、ニトリルヒドラターゼは、上記形質転換微生物を培養し、得られる培養物から採取することにより製造することができる。
本発明において、「培養物」とは、培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換微生物を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的のニトリルヒドラターゼは、上記培養物中に蓄積される。
形質転換微生物を培養する培地は、宿主菌となる本発明の微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅若しくは炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。さらに、培地にはニトリルヒドラターゼの補欠分子であるコバルトイオンや鉄イオンを添加し、酵素の誘導剤となるニトリル類やアミド類を添加してもよい。
【００４３】
培養中、発現ベクターや目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、発現ベクター等における選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合には相当する薬剤を培地に添加したり、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合には相当する栄養因子を培地から除いたりしてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合には、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した微生物を培養する場合、培養中、必要に応じてアンピシリンを添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養するときには、IPTG等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養するときには、IAA等を培地に添加することができる。
【００４４】
形質転換微生物の培養条件は、発現目的のニトリルヒドラターゼの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば、特段限定されるものではない。通常、10℃〜45℃、好ましくは10℃〜40℃の温度下で、5〜120時間、好ましくは5〜100時間程度行うことができる。pHの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて、適時調整を行うことが好ましい。
培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられるが、振盪培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましい。
また、場合により、本培養に先立ち、少量の前培養を行うこともできる。例えば、ロドコッカス属細菌の形質転換微生物を培養する場合は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30〜40℃の温度下で行うことが好ましい。
上記培養条件で培養すると、高収率でニトリルヒドラターゼを上記培養物中、すなわち培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積することができる。これらニトリルヒドラターゼを含有する「培養物」は、後述するアミド化合物の製造方法に使用することができる。
【００４５】
培養後、ニトリルヒドラターゼが菌体内に生産される場合には、菌体を破砕することにより、目的のニトリルヒドラターゼを採取することができる。菌体の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。
破砕後、必要に応じて菌体の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製したニトリルヒドラターゼ溶液とすることができる。
また、ニトリルヒドラターゼが菌体内に生産される場合、菌体そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。
【００４６】
ニトリルヒドラターゼが菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から異種ニトリルヒドラターゼを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。
形質転換微生物を培養して得られたニトリルヒドラターゼの生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、SDS-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）やニトリルヒドラターゼ活性測定などにより確認することができるが、特段限定されるものではない。SDS-PAGEは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。また、ニトリルヒドラターゼ活性は、上述した活性の値を適用することができる。
【００４７】
４．アミド化合物の製造方法
上述のように製造されたニトリルヒドラターゼ（前述した培養物を含む）は、酵素触媒（菌体のまま利用する微生物触媒等を含む）として物質生産に利用することができる。例えば、ニトリル化合物に、ニトリルヒドラターゼを接触させることにより、当該接触によりニトリル化合物が変換されてアミド化合物を製造することができる。
酵素触媒としては、前述のように適当な宿主内でニトリルヒドラターゼ遺伝子が発現するように遺伝子導入を行い、宿主を培養した後の培養物、又は当該培養物の処理物を利用することができる。処理物としては、例えば、培養後の菌体をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。
【００４８】
基質として使用されるニトリル化合物は、酵素の基質特異性、酵素の基質に対する安定性等を考慮して選択される。ニトリル化合物としては、アクリロニトリルが好ましい。
反応方法、及び反応終了後のアミド化合物の採取方法は限定されず、基質及び酵素触媒の特性により適宜選択することができる。例えば、当該反応において、基質となるニトリル化合物の濃度は、0.1〜10% (W/V)が好ましく、5％ (W/V)程度が特に好ましい。また、当該反応は、pH 5〜10の緩衝液又は水中で行うことが好ましく、例えば、50 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）中で行うことができる。
反応後の酵素触媒は、その活性が失活しない限り、リサイクル使用することが好ましい。失活の防止やリサイクルを容易にすることに鑑み、酵素触媒は処理物の形態で使用されることが好ましい。
上記反応により生成したアクリルアミドは、ガスクロマトグラフィーなどの公知の方法を用いて定量することができる。また、アクリルアミドの産生量から前記酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性を換算することができる。
【００４９】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
アミダーゼ欠失用プラスミド及びニトリラーゼ欠失用プラスミドの作製
（１）接合伝達プラスミド（pK19mobsacB1）の作製
pDNR-1r（clontech社製）中のsacB遺伝子を、NspV切断サイトを付加したプライマーSAC-01（配列番号５）及びSAC-02（配列番号６）を使用したPCRにより増幅し、約1.9 kbのsacB遺伝子断片を得た。PCRは以下の反応条件で行った。
【００５１】
プライマー：
SAC-01： 5'-GGTTCGAATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTG-3'（配列番号５）
SAC-02： 5'-GGTTCGAATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTG-3'（配列番号６）
【００５２】
反応液組成：
滅菌水 22μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
SAC-01(10μM)（配列番号５） 1μl
SAC-02(10μM)（配列番号６） 1μl
pDNR-1r（100ng）（clontech社製） 1μl
総量 50μl
【００５３】
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 20秒の反応を30サイクル
【００５４】
sacB遺伝子断片を制限酵素NspV（タカラバイオ社製）で消化後、pK19mobのNspVサイトに接続し、sacB遺伝子が正方向に導入されたプラスミドpK19mobsacB1を構築した。pK19mob NspV切断断片とsacB遺伝子断片及びsacB遺伝子NspV切断断片の精製にはGFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit（GE Healthcare社製）、両断片の接続にはDNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞、プラスミドの抽出にはQIAprep miniprep kit（QIAGEN社製）を用いた。
【００５５】
（２）J1株ゲノムDNAの調製
ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J1株を100mlのMYK培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、１％ グルコース、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4、pH 7.0）中、30℃にて72時間振盪培養した。
培養後、集菌し、集菌された菌体をSaline-EDTA溶液（0.1M EDTA、0.15M NaCl(pH 8.0)）4 mlに懸濁した。懸濁液にリゾチーム40 mgを加えて、37℃で1〜2時間振盪した後、-20℃で凍結した。
次に、10mlのTris-SDS液（1％SDS、0.1M NaCl、0.1M Tris-HCl(pH 9.0)）を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼK（メルク社）を10μl（終濃度10mg/ｍｌ）加えて37℃で1時間振盪した。
【００５６】
次に、等量のTE (10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 8.0)) 飽和フェノールを加え、撹拌した後遠心した。遠心後、上層をとり2倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でDNAを巻きとり、90％、80％、70％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
次に、DNAを3mlのTE緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼA溶液(100℃、15分間の加熱処理済)を10μg/mlになるよう加え、37℃で30分間振盪した。さらに、プロテイナーゼKを加え37℃で30分間振盪した後、等量のTE飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルム（4％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に2倍量のエタノールを加え、ガラス棒でDNAを巻きとり回収し、Ｊ１株ゲノムゲノムDNAを得た。このゲノムDNAは、配列番号１に示すアミダーゼ遺伝子を有している。
【００５７】
（３）アミダーゼ遺伝子の増幅と発現プラスミドの構築
アミダーゼ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてPCRを行った。
【００５８】
プライマー：
AMD-01： 5'-ggCCTGCAGG GAATTCCTCG GCTACGCCGT-3'（配列番号７）
AMD-02： 5'-TAGGGGAGGG TGGGCATCAC TCTTTCACGG CGACCGTTCG-3'（配列番号８）
【００５９】
反応液組成：
滅菌水 22μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
AMD-01(10μM)（配列番号７） 1μl
AMD-02(10μM)（配列番号８） 1μl
J1株ゲノムDNA（100ng） 1μl
総量 50μl
【００６０】
温度サイクル：
98℃:10秒、55℃：15秒及び72℃：20秒の反応を30サイクル
【００６１】
同様に、下記プライマーAMD-03（配列番号９）及びAMD-04（配列番号１０）を使用し、上記と同じ条件でPCRを実施した。
【００６２】
プライマー：
AMD-03： 5'-cgaacggtcg ccgtgaaaga gtgatgccca ccctccccta-3'（配列番号９）
AMD-04： 5'-ccTCTAGA GCATGCGGAGTCCTTCGTTCGGCA-3'（配列番号１０）
【００６３】
PCR終了後、反応液2μlを0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約500 bpのPCR産物の検出を行った。PCR産物を確認した後、反応液をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【００６４】
次に、上記で増幅した2つのPCR断片を連結するため、以下の条件でAssembly PCRを行った。
【００６５】
反応液組成：
滅菌水 21μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
AMD-01(10μM)（配列番号７） 1μl
AMD-04(10μM)（配列番号１０） 1μl
AMD-01とAMD-02の増幅産物（50ng） 1μl
AMD-03とAMD-04の増幅産物（50ng） 1μl
総量 50μl
温度サイクル：
98℃:10秒、55℃：15秒及び72℃：40秒の反応を30サイクル
【００６６】
PCR終了後、約1Kbの増幅産物をアガロース電気泳動で確認し、Mighty Cloning Kit(Blunt End)（タカラバイオ）でpUC118にクローニングした。
【００６７】
続いて、上記でクローニングした断片を制限酵素XbaI及びSse8387Iで切断し、約1kbの断片を回収し、接合伝達用のプラスミド（pK19mobsacB1）のXbaI-Sse8387I部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドはアミダーゼ遺伝子欠失プラスミド：pBKAMD01と名付けた。図１に、プラスミドpK19mobsacB1の構造を示す模式図を、図２に、プラスミドpBKAMD01の構造を示す模式図を示した。
【００６８】
（４）ニトリラーゼ遺伝子の増幅と発現プラスミドの構築
ニトリラーゼ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてPCRを行った。
【００６９】
プライマー：
NTR-01: 5'-GGCCTGCAGG GAATGCCAGG ACCCTTGTCA-3'（配列番号１１）
NTR-02: 5'-TTCAGCGACA GCACATCCGG AGCGCACAGC GAACTTCGCC-3'（配列番号１２）
【００７０】
反応液組成：
滅菌水 22μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
NTR-01(10μM)（配列番号１１） 1μl
NTR-02(10μM)（配列番号１２） 1μl
J1株ゲノムDNA（100ng） 1μl
総量 50μl
【００７１】
温度サイクル：
98℃:10秒、55℃：15秒及び72℃：20秒の反応を30サイクル
【００７２】
同様にプライマーNTR-03（配列番号１３）及びNTR-04（配列番号１４）を使用し、上記を同じ条件でPCRを実施した。
【００７３】
プライマー：
NTR-03: 5'-ggcgaagttc gctgtgcgct gtgatgccca ccctccccta-3'（配列番号１３）
NTR-04: 5'-CCTCTAGA CGATCGACGATGCGTT-3'（配列番号１４）
【００７４】
PCR終了後、反応液2μlを0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約300 bpのPCR産物の検出を行った。PCR産物を確認した後、反応液をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【００７５】
次に、上記で増幅した2つのPCR断片を連結するため、以下の条件でAssembly PCRを行った。
【００７６】
反応液組成：
滅菌水 21μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
NTR-01(10μM)（配列番号１１） 1μl
NTR-04(10μM)（配列番号１４） 1μl
NTR-01とNTR-02の増幅産物（50ng） 1μl
NTR-03とNTR-04の増幅産物（50ng） 1μl
総量 50μl
【００７７】
温度サイクル：
98℃:10秒、55℃：15秒及び72℃：40秒の反応を30サイクル
【００７８】
PCR終了後、約600bpの増幅産物をアガロース電気泳動で確認し、Mighty Cloning Kit(Blunt End)（タカラバイオ）でpUC118にクローニングした。
続いて、上記でクローニングした断片を制限酵素XbaI及びSse8387Iで切断し、約600 bpの断片を回収し、接合伝達用のプラスミド（pK19mobsacB1）のXbaI-Sse8387I部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドは、ニトリラーゼ遺伝子欠失プラスミド：pBKNTR01と名付けた。図３に、プラスミドpBKNTR01の構造を示す模式図を示した。
【実施例２】
【００７９】
薬剤耐性を有するＪ１株の作製
接合伝達に使用するドナーは、遺伝子欠失株のセレクションに薬剤耐性が必要である。そこで、種々の薬剤耐性株の取得を試み、アンピシリン耐性を有するＪ１株の変異株を下記の方法で取得した。
2μg／mlのアンピシリンを含んだMYKプレート（0.5%ポリペプトン、0.3%バクトイーストエキス、0.3%マルツエキス、0.2% KH2PO4、0.2% K2HPO4、1.5%寒天）にＪ１株をストリークし、コロニーが生育するまで30℃で保温した。約２週間後、アンピシリン耐性株が生育してきたので、再度2μg／mlのアンピシリンプレートにストリークして、30℃で保温した。
次に、2μg／mlのアンピシリンプレートから生育したコロニーを、５μg/mlのアンピシリンプレートにストリークし、耐性株が出現するまで30℃で保温した。以下、同様の操作を、アンピシリン濃度を10μg/ml→15μg/ml→50μg/ml→100μg/mlに高めながら繰り返し、100μg/mlのアンピシリン濃度で生育するアンピシリン耐性株（J1-Amp株）を得た。
【実施例３】
【００８０】
接合伝達によるアミダーゼ遺伝子の欠失
（１）ドナーの調製
乾熱滅菌した試験管に大腸菌S17-1λpirのコンピテントセル20μlにプラスミドpBKAMD01 1μlを加え、氷上で30分静置した。42℃で30秒ヒートショック後、SOC培地を180μl添加し、37℃で1時間振とう培養を行った。その後、50μg/mlカナマイシンを含んだLBプレートに塗布し、37℃で一晩静置した。
翌日、プレートに生育したコロニーをLB培地1ｍｌで回収し、遠心分離により菌体を回収し、遠心上清を除去した。同様の操作をもう一度繰り返し、最後に0.5 mlのLB培地を添加し、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液をドナー溶液とした。
【００８１】
（２）レシピエントの調整
J1−Amp株をMYKプレートにストリークし、30℃で2日生育させた。生育したコロニーは実施例３（１）と同様の方法で回収、洗浄し、レシピエントとなる菌体懸濁液を調製した。
【００８２】
（３）接合伝達
実施例３（１）で調製したドナー溶液と、実施例３（２）で調製したレシピエント溶液を100μlずつ混合し、抗生物質を含まないMYKプレートに塗布し、30℃で一晩静置した。
翌日、生育したコロニーは１mlのLB培地で回収し、100μlずつカナマイシン濃度を10、30、50μg/mlとした選抜プレート（すべて100μg/mlアンピシリンを含む）に塗布した。塗布したプレートは組み換え菌コロニーが出現するまで30℃で1週間保温した。
その結果、100μg/mlアンピシリン、10μg/mlカナマイシンを含んだプレートにのみ3個のコロニーが出現した。得られたコロニーの一つを＃A1と命名し、以後の実験に使用した。
【００８３】
（４）アミダーゼ遺伝子の欠失
接合伝達により得られた組み換え菌＃A1は、ゲノムのアミダーゼ遺伝子の領域に相同組換えによりプラスミドが挿入されているが、アミダーゼ遺伝子を欠失するには2段階の相同組換えが必要である。そこで、次に、sacB遺伝子を利用した選抜を実施した。
10％ショ糖を含んだMYKプレートを作製し、＃A1のコロニーを滅菌水に懸濁した液を適度に希釈して塗布し、30℃で静置した。生育したコロニーについて10個のコロニーからゲノムDNAを調製し、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてPCRを行って、得られた断片（PCR産物）のサイズを電気泳動で調べた。なお、プライマーAMD-01及びAMD-04は、実施例１で用いたものと同様である。
【００８４】
反応液組成：
滅菌水 22μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
AMD-01(10μM)（配列番号７） 1μl
AMD-04(10μM)（配列番号１０） 1μl
ゲノムDNA（100ng） 1μl
総量 50μl
【００８５】
温度サイクル：
98℃:10秒、55℃：15秒及び72℃：20秒の反応を30サイクル
【００８６】
その結果、10個の内、5個のコロニーはアミダーゼ遺伝子が欠失していることが確認された。得られたアミダーゼ遺伝子欠失株を、それぞれDA１〜DA5株と命名した。
【実施例４】
【００８７】
DA1〜DA5株の培養
DA1〜DA5株とＪ１株を下記の培地で培養し、アミダーゼ活性を確認した。本培養の培地は、ニトリルヒドラターゼの誘導剤である尿素とコバルト、及びアミダーゼの誘導剤であるコバルトとシクロヘキサンカルボアミドを含むものを用いた。前培養は30℃で3日間、本培養は30℃で2日間、振とう培養した。
【００８８】
［前培養培地組成］（pH 7.0）
グルコース 20 g/L
味液 20 g/L
ポリペプトン 5 g/L
酵母エキス 3 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1 g/L
【００８９】
［本培養液組成］（pH 7.0）
グルコース 15 g/L
ポリペプトン 3 g/L
酵母エキス 3 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1 g/L
エタノール 2 g/L
CoCl2・6H2O 0.025 g/L
チアミン 0.002 g/L
ビタミンK 0.002 g/L
尿素 15 g/L
シクロヘキサンカルボアミド 2 g/L
【００９０】
菌体を含む培養液のアミダーゼ活性の測定は、以下の方法に従って行った。
まず、本培養後に得られた培養液1 mlと50 mMリン酸緩衝液（pH 7.7）4 mlとを混合し、さらに1 Mのアクリロニトリルを含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7.7）5 mlを混合液に加えて、10 ℃で2時間反応させた。反応液から遠心分離によって、菌体を除いた後、HPLC（カラム：Inertsil ODS-3V 4.6×250mm、GLサイエンス社製；溶離液：10 mM KH2P04・H3P04 (pH 2.8)/acetonitrile=3:2；流速：1.0 ml/分；検出：UV 254nm）にて分析し、アクリルアミドおよびアクリル酸の量からアミダーゼ活性を評価した。
反応終了後の液中の組成を評価した結果、J1株の場合は0.78 M アクリルアミドと0.22 Mアクリル酸が生成したが、アミダーゼ遺伝子を欠失させたDA1〜DA5株ではアクリルアミドのみ生成した。
【実施例５】
【００９１】
DA1における、接合伝達によるニトリラーゼ遺伝子の欠失
（１）ドナーの調製
実施例３と同様に実施した。
【００９２】
（２）レシピエントの調整
DA1株をMYKプレートにストリークし、30℃で2日生育させた。生育したコロニーは実施例３（１）と同様の方法で回収、洗浄し、レシピエントとなる菌体懸濁液を調製した。
【００９３】
（３）接合伝達
実施例５（１）で調製したドナー溶液と、実施例５（２）で調製したレシピエント溶液を100μlずつ混合し、抗生物質を含まないMYKプレートに塗布し、30℃で一晩静置した。
翌日、生育したコロニーは1 mlのLB培地で回収し、100μlずつカナマイシン濃度を10、30、50μg/mlとした選抜プレート（すべて100μg/mlアンピシリンを含む）に塗布した。塗布したプレートは組み換え菌コロニーが出現するまで30℃で1週間保温した。
その結果、100μg/mlアンピシリン、10μg/mlカナマイシンを含んだプレートにのみ2個のコロニーが出現した。得られたコロニーの一つを＃AN1と命名し、以後の実験に使用した。
【００９４】
（４）ニトリラーゼ遺伝子の欠失
実施例３（４）と同様の方法で実施した。
接合伝達により得られた組み換え菌＃AN1は、ゲノムのアミダーゼ遺伝子の領域に相同組換えによりプラスミドが挿入されているが、アミダーゼ遺伝子を欠失するには2段階の相同組換えが必要である。そこで次に、sacB遺伝子を利用した選抜を実施した。
10％ショ糖を含んだMYKプレートを作製し、＃A1のコロニーを滅菌水に懸濁した液を適度に希釈して塗布し、30℃で静置した。生育したコロニーについて10個のコロニーからゲノムDNAを調製し、PCR断片のサイズを電気泳動で調べた。
【００９５】
反応液組成：
滅菌水 22μl
PrimeSTAR（登録商標） Max Premix（2×）
（タカラバイオ社製） 25μl
NTR-01(10μM)（配列番号１１） 1μl
NTR-04(10μM)（配列番号１４） 1μl
ゲノムDNA（100ng） 1μl
総量 50μl
【００９６】
温度サイクル：
98℃:10秒、55℃：15秒及び72℃：20秒の反応を30サイクル
【００９７】
その結果、10個の内、4個のコロニーはニトリラーゼ遺伝子が欠失していることが確認された。得られたニトリラーゼ遺伝子欠失株をDAN１〜DAN4株と命名した。
【実施例６】
【００９８】
DAN1〜DAN4株の培養
DAN1〜DAN4株とJ1株を下記の培地で培養し、ニトリラーゼ活性を確認した。本培養の培地は、ニトリルヒドラターゼの誘導剤である尿素とコバルト、及びニトリラーゼの誘導剤であるイソバレロニトリルを含むものを用いた。前培養は30℃で3日間、本培養は30℃で2日間、振とう培養した。
【００９９】
［前培養培地組成］（pH 7.0）
グルコース 20 g/L
味液 20 g/L
ポリペプトン 5 g/L
酵母エキス 3 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1 g/L
【０１００】
［本培養液組成］（pH 7.0）
グルコース 15 g/L
ポリペプトン 3 g/L
酵母エキス 3 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1 g/L
エタノール 2 g/L
CoCl2・6H2O 0.025 g/L
チアミン 0.002 g/L
ビタミンK 0.002 g/L
尿素 15 g/L
イソバレロニトリル 2 g/L
【０１０１】
菌体を含む培養液のニトリラーゼ活性の測定は、以下の方法に従って行った。
まず、本培養後に得られた培養液1 mlと50 mMリン酸緩衝液（pH 7.7）4 mlとを混合し、さらに1 Mのアクリロニトリルを含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7.7）5 mlを混合液に加えて、10 ℃で2時間反応させた。次いで、菌体を濾別して、HPLCを用いて、生成したアクリル酸の量を定量し、アクリル酸の量からニトリラーゼ活性を換算した。なお、分析条件は、実施例４と同様とした。
反応終了後の液中の組成を評価した結果、J1株の場合は0.65 Mアクリルアミドと0.35 Mアクリル酸が生成したが、ニトリラーゼ遺伝子を欠失させたDAN1〜DAN5株ではアクリルアミドのみ生成した。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号９：合成DNA
配列番号１０：合成DNA
配列番号１１：合成DNA
配列番号１２：合成DNA
配列番号１３：合成DNA
配列番号１４：合成DNA
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物であって、前記欠失又は不活性化が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われるものである、前記欠失又は不活性化された微生物。
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中のアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）前記（ｂ）で作製されたドナー微生物から前記（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）前記（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【請求項２】
前記ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物及び前記レシピエント微生物が、ロドコッカス属細菌である、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株又はその変異株である、請求項２記載の微生物。
【請求項４】
ドナー微生物が大腸菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
ドナー微生物が感受性を示す薬剤が、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラシクリン、カルベニシン及びナルジクス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項６】
レシピエント微生物が感受性を示す薬剤が、カナマイシンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
欠失又は不活性化させるアミダーゼ遺伝子が、配列番号１に示す塩基配列を含むものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
欠失又は不活性化させるニトリラーゼ遺伝子が、配列番号３に示す塩基配列を含むものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物を培養して得られる培養物又は当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させ、当該接触により生成されるアミド化合物を採取することを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物であって、前記欠失又は不活性化が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われるものである、前記欠失又は不活性化された微生物。
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中のアミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該アミダーゼ遺伝子及び／若しくはニトリラーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）前記（ｂ）で作製されたドナー微生物から前記（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）前記（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【請求項２】
前記ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物及び前記レシピエント微生物が、ロドコッカス属細菌である、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株又はその変異株である、請求項２記載の微生物。
【請求項４】
ドナー微生物が大腸菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
ドナー微生物が感受性を示す薬剤が、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラシクリン、カルベニシン及びナルジクス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項６】
レシピエント微生物が感受性を示す薬剤が、カナマイシンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
欠失又は不活性化させるアミダーゼ遺伝子が、配列番号１に示す塩基配列を含むものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
欠失又は不活性化させるニトリラーゼ遺伝子が、配列番号３に示す塩基配列を含むものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物を培養して得られる培養物又は当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させ、当該接触により生成されるアミド化合物を採取することを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−２５０７３１（Ｐ２０１１−２５０７３１Ａ）
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１２５９０１（Ｐ２０１０−１２５９０１）
【出願日】平成２２年６月１日（２０１０．６．１）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１日（２０１０．６．１）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
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