アミド化合物の製造方法
【課題】ニトリルヒドラターゼを利用した反応により、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率的に製造する方法を提供する。
【解決手段】ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒の存在下、水性媒体中でニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法において、水性媒体中のベンゼン濃度が４．０ｐｐｍ以下であることを特徴とする。たとえばニトリルヒドラターゼはシュードノカルディア属由来、またはロドコッカス属由来ニトリルヒドラターゼである。
【解決手段】ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒の存在下、水性媒体中でニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法において、水性媒体中のベンゼン濃度が４．０ｐｐｍ以下であることを特徴とする。たとえばニトリルヒドラターゼはシュードノカルディア属由来、またはロドコッカス属由来ニトリルヒドラターゼである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミド化合物の製造方法に関する。
本発明（第一の発明）は、より詳しくは、アミド化合物、およびアミド系重合体を製造する方法に関し、さらに詳しくは、ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒を用いて、効率的に水性媒体中でニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法、およびこのアミド化合物により高品位なアミド系重合体を製造する方法に関する。また、本発明（第二の発明）は、より詳しくは、アクリルアミド、およびアクリルアミド系重合体を製造する方法に関し、さらに詳しくは、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の菌体等によりアクリロニトリルを水和して、高品位なアクリルアミドを製造する方法、およびこのアクリルアミドにより高品位なアクリルアミド系重合体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
工業的に有用なアミド化合物については、以下に述べるように、種々の製造方法が開示されている。
近年ニトリル基を水和してアミド基に変換するニトリル水和活性を有するニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素または該酵素を有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が既に開示されている。この製造方法は従来の科学的な方法と比べて、ニトリル化合物からの対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いなどのメリットが知られている。
【０００３】
これらのニトリルヒドラターゼを利用してアミド化合物を工業的に製造する際には、触媒となるニトリルヒドラターゼのアミド化合物生産性（１分子のニトリルヒドラターゼが生産するアミド化合物の分子数）を最大化することが重要である。そのため、酵素活性の維持や向上、活性低下の抑制、低下した酵素の活性向上などを目的とした提案が多数報告されている。例えば、細胞の増殖を伴わない条件下で、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体またはその菌体処理物を酸化剤と接触させることにより酵素活性を維持または向上させることが公知である（特許文献１参照）。また、含有される青酸濃度を低減させたニトリル化合物を使用することにより、ニトリルヒドラターゼの活性低下が抑制されることも公知である（特許文献２参照）。その他にも、グルタルアルデヒドで架橋処理した菌体を用いて反応を行う方法（特許文献３参照）、高級不飽和脂肪酸もしくはその塩類の存在下で反応を行う方法（特許文献４参照）、有機溶媒で処理した菌体、または処理物を用いて反応を行う方法（特許文献５参照）等が知られている。以上が第一の発明の背景技術である。
【０００４】
また、上述したように、アクリルアミドの主要な製造方法の一つとして、アクリロニトリルを水和反応する方法が挙げられ、例えば、ラネー銅等の金属銅触媒により水和反応する方法、あるいはニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体およびその菌体処理物等を触媒として水和反応する方法が知られている。
【０００５】
これらの中でも、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体等を触媒とするアクリルアミドの製造方法では、従来の金属銅触媒等により水和反応する方法に比べて、アクリロニトリルの転化率、および選択率が高いことから工業的製造方法としても注目を浴びている。
【０００６】
このニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体等を触媒として、より高品質なアクリルアミドを効率よく製造するためには、微生物菌体等の触媒作用を阻害する不純物をできる限り除去する必要がある。
【０００７】
またこのような反応により得られるアクリルアミドは、主としてアクリルアミド系重合体の原料として用いられるが、近年、このアクリルアミド系重合体にはより一層の高品質化が求められている。例えば、アクリルアミド系重合体の用途には凝集剤があるが、凝集剤として用いられるアクリルアミド系重合体は、近年、性能向上の要求に伴い、水溶性を維持しながらより一層の高分子量化が求められている。またアクリルアミド系重合体には、製紙用添加剤等の用途があるが、この製紙用添加剤としては、得られる紙の品質をさらに向上させるために、より色相の優れた重合体が求められている。
【０００８】
ニトリルヒドラターゼを含む菌体触媒等により得られるアクリルアミドの品質、あるいはポリアクリルアミドの品質を改善する方法として、上述したように、ニトリル化合物中の青酸濃度を化学的方法により低減させた後、ニトリル化合物にニトリルヒドラターゼを作用させるアミド化合物の製造方法（例えば、特許文献２参照。）、アクリロニトリル中に不純物として含まれるオキサゾールおよび青酸を低減して、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換し、このアクリルアミドからアクリルアミド系ポリマーを製造する方法（例えば、特許文献６）が知られている。以上が第二の発明の背景技術である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−３５０５７３号公報
【特許文献２】特開１１−１２３０９８号公報
【特許文献３】特開平７−２６５０９１号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０９０号公報
【特許文献５】特開平５−３０８９８０号公報
【特許文献６】国際公開第二００４／０９０１４８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、ニトリルヒドラターゼを利用してアミド化合物を効率的に製造するにあたって、第一の発明の背景技術で述べた従来技術では解決できない別の要因によってもニトリルヒドラターゼのアミド化合物生産性低下の現象が存在しており、その要因の解決も望まれていた。
【００１１】
したがって、第一の発明の目的は、ニトリルヒドラターゼを利用した反応において、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率的に製造する方法を提供することにある。また、上述の方法により製造されたアミド化合物を用いて、高品質なアミド系重合体を製造する方法を提供することにある。
【００１２】
また、第二の発明の背景技術で述べた方法では、ニトリルヒドラターゼを含む微生物菌体等の触媒作用を阻害する因子を排除して効率よくアクリロニトリルの水和反応をするという観点からは、必ずしも十分な効果が得られない。またアクリルアミド、およびアクリルアミド系重合体の品質向上という観点からもいまだ改善の余地があった。
【００１３】
したがって、第二の発明の目的は、ニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒等により、より効率よく、しかもより高品位なアクリルアミドを製造する方法、およびこのアクリルアミドを用いて、色相に優れ、水溶性と高分子量化が両立した、品質に優れたアクリルアミド系重合体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記第一の発明の課題を解決するために、本発明者らはアミド化合物の製造方法について鋭意検討を行ったところ、ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒を用いて水性媒体中でニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法において、水性媒体中のベンゼン濃度を特定濃度以下に低減することにより、ニトリルヒドラターゼの反応速度を低下させることなくアミド化合物を効率的に製造できることを見出した。なお、水性媒体中のベンゼンは、一般的には原料であるニトリル化合物に由来しているが、他の要因により混入した場合にも、同様の濃度条件に低減することにより、アミド化合物は効率的に製造される。また、上述の方法によりベンゼン濃度を抑制した反応条件下で製造されたアミド化合物を用いて、アミド系重合体を製造することにより、色相に優れたアミド系重合体を得ることができる。
【００１５】
すなわち、第一の発明は、以下の通りである。
[１]ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒の存在下、水性媒体中でニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法において、水性媒体中のベンゼン濃度が４．０ｐｐｍ以下であることを特徴とするアミド化合物の製造方法。
【００１６】
[２]ニトリルヒドラターゼがシュードノカルディア属由来ニトリルヒドラターゼまたはロドコッカス属由来ニトリルヒドラターゼを産生する微生物である[１]記載のアミド化合物の製造方法。
【００１７】
[３]ニトリル化合物がアクリロニトリルまたはメタクリロニトリルである[１]または[２]に記載のアミド化合物の製造方法。
[４][１]に記載のアミド化合物を単独重合、または上記アミド化合物を、アミド化合物と共重合可能な少なくとも一種の不飽和単量体と共重合して、アミド系重合体を製造する方法。
【００１８】
[５]上記アミド化合物がアクリルアミドまたはメタクリルアミドである[４]に記載のアミド系重合体を製造する方法。
また、本発明者らは上記第二の発明の課題を検討し、アクリロニトリル中に含まれるアクロレイン濃度を低減することで、ニトリルヒドラターゼの触媒活性を維持することができ、しかも高品位なアクリルアミドを得ることができ、さらにはこのアクリルアミドにより、色相に優れ、水溶性と高分子量化の両立が可能なアクリルアミド系重合体を得ることができることを見出し、第二の発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、第二の発明のアクリルアミドの製造方法は、
アクロレインの濃度が１ｐｐｍ以下であるアクリルニトリルを、水性媒体中で、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の菌体、またはその菌体処理物により水和反応させることに特徴がある。
【００２０】
上記アクリロニトリル中に含まれる青酸の濃度は５ｐｐｍ以下であることが好ましい。
また、上記アクリロニトリル中に含まれるオキサゾールの濃度が１０ｐｐｍ以下であることも好ましい。
【００２１】
さらに、上記アクリロニトリル中に含まれる青酸の濃度が５ｐｐｍ以下であり、かつオキサゾールの濃度が１０ｐｐｍ以下であることも好ましい。
第二の発明のアクリルアミド系重合体の製造方法は上記アクリルアミドを単独重合、または上記アクリルアミドを、アクリルアミドと共重合可能な少なくとも一種の不飽和単量体と共重合することに特徴がある。
【発明の効果】
【００２２】
第一の発明によれば、ニトリルヒドラターゼを利用した反応において、ニトリル化合物含有水性媒体中のベンゼン濃度を特定濃度以下に低減することにより、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率的に製造することができる。また、上述の方法によりベンゼン濃度を抑制した反応条件下で製造されたアミド化合物を用いてアミド系重合体を製造することにより、色相に優れたアミド系重合体を得ることができる。
【００２３】
また、第二の発明によれば、ニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒等により、より効率よく、しかもより高品位なアクリルアミドを製造できる。また第二の発明によれば、色相に優れ、水溶性と高分子量化が両立した、品質の優れたアクリルアミド系重合体を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
１．第一の発明
以下、第一の発明について詳細に説明する。
第一の発明において使用されるニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒とは、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物である。ここでいうニトリルヒドラターゼとはニトリル化合物を水和する能力を有するたんぱく質である。ニトリルヒドラターゼを産生する微生物としてはノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属、バイテリジューム（Bacteridium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）に属する微生物などが挙げられる。好ましくは、シュードノカルディア属やロドコッカス属に属する微生物が挙げられ、特にシュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardiathermophila）ＪＣＭ３０９５、または、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ−１が好ましい。
【００２５】
また、該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体も第一の発明でいうニトリルヒドラターゼを産生する微生物に含まれる。尚、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌(Bacillussubtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アミド化合物耐性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も第一の発明でいうニトリルヒドラターゼを産生する微生物に含まれる。
【００２６】
上述のニトリルヒドラターゼを産生する微生物を第一の発明の製造方法に使用するに際しては、該微生物の菌体あるいは菌体処理物を用いる。菌体は、分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用して調製すればよい。たとえば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい。）で生育させ、続いて、該微生物を遠心分離によって培養液より分離・回収して得る方法が挙げられる。
【００２７】
また、微生物の菌体処理物とは、その形状に特に制限はなく、上記微生物菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離精製して得られる後分離物、該微生物菌体や該菌体の抽出物・磨砕物・後分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらはニトリルヒドラターゼの活性を有している限りは第一の発明でいう菌体処理物に相当する。
【００２８】
これらニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物は、製造直後に反応に用いることは勿論、製造後に保管し、必要に応じて使用することもできる。
第一の発明におけるニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物は、回分反応に供することもできるし、連続反応に供することもできる。また、反応形式は、懸濁床、固定床、流動床など、微生物の菌体または菌体処理物の形態に応じた、適切な形式を選択すればよい。その際の反応液中での該触媒濃度は、水性媒体とニトリル化合物の混合に支障をきたさない限り特に制限はされるものではない。
【００２９】
第一の発明における水性媒体とは、水、または、リン酸塩等の緩衝剤、硫酸塩や炭酸塩等の無機塩、アルカリ金属の水酸化物、アミド化合物、ニトリル化合物、ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒等を適当な濃度で溶解させた水溶液（反応液全体）を指す。第一の発明では、ニトリル化合物が水溶液に対し飽和濃度内である均一系であっても、飽和濃度以上でニトリル相と水相の二相系であっても、その溶液全体を水性媒体と定義する。なお、本明細書において、第一の発明における水性媒体を「水性媒体(I）」ともいう。二相系の場合は、回転翼やラインミキサーなどの適当な混合装置を使用して、静置下において二相に分離する水相とニトリル相を十分に混和させることも重要である。
【００３０】
第一の発明において、反応時の水性媒体(I)中のニトリル化合物濃度は、水性媒体(I)中のベンゼン濃度によって反応速度の低下を招かない範囲またはニトリル化合物によってニトリルヒドラターゼが失活しない範囲であれば、特に限定されない。好ましくはニトリル化合物の重量％が５０重量％以下である。
【００３１】
第一の発明で使用されるニトリル化合物とは、水性媒体(I)中でニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒によりアミド化合物へ変換される化合物であれば特に限定されない。好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、クロトノニトリル、α−ヒドロキシイソブチロニトリル等の炭素数２〜４のニトリル化合物がその代表例として挙げられる。より好ましくは、アクリロニトリル、メタクリロニトリルが用いられる。
【００３２】
これらニトリル化合物は精製工程を経て市販製品となるが、微量の不純物が含まれている。不純物の一つとしてベンゼンが挙げられ、例えばアクリロニトリルでは、プロピレンのアンモオキシデーション法によって工業的に製造されているが、プロピレンに含有される微量のベンゼンがアクリロニトリル製品中に持ち込まれるなどの理由により、市販のアクリロニトリル製品中にベンゼンが含まれている。
【００３３】
水性媒体(I)中に含まれるベンゼン濃度は反応速度の低下が抑制される濃度であればよく、通常４．０ｐｐｍ以下、好ましくは２．２ｐｐｍ以下である。ここで、反応速度の低下が抑制される範囲とは、水性媒体(I)中に含まれるベンゼン濃度が２．２ｐｐｍ以下の反応で得られる反応速度を１００％として、相対反応速度が８０％以上となる範囲である。また、水性媒体(I)中に含まれるベンゼン濃度が４．０ｐｐｍ以下とは水性媒体(I)の１ｋｇ中に含まれるベンゼンの量が４ｍｇ以下であることを意味している。ニトリル化合物からベンゼンを除去する方法、又は、水性媒体(I)中からベンゼンを除去する方法は、如何なる方法でもよく、例えば、蒸留、活性炭による吸着処理、超強酸であるヘテロポリ酸など固体酸による吸着処理、カラムクロマトグラフィーによる処理、スルホランでの抽出、ベンゼンの資化が可能な微生物による生物的分解、ベンゼンの揮発性を利用したばっ気処理などが挙げられる。
【００３４】
第一の発明における反応は、一般的には常圧下で行われるが、水性媒体(I)中へのアクリル化合物の溶解度を高めるために加圧下で行うこともできる。また、反応温度に関しては特に限定されないが、好ましくは該ニトリルヒドラターゼが失活しない温度範囲であり、さらに好ましくは、０〜５０℃である。一方、ｐＨはニトリルヒドラターゼ活性が維持されている限りは特に制限はないが、好ましくはｐＨ５からｐＨ１０の範囲内である。
【００３５】
第一の発明のアミド系重合体は、上述のようにして得られたアミド化合物を単独重合、またはアミド化合物を、アミド化合物と共重合可能な少なくとも一種の不飽和単量体と共重合することにより、製造できる。ここで、アミド化合物は、第一の発明のアミド化合物の製造方法によって得られたアクリルアミドまたはメタクリルアミドであることが好ましい。
【００３６】
アミド化合物と共重合可能な不飽和単量体としては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸などの不飽和カルボン酸およびそれらの塩；
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸およびそれらの塩；
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレートなどの（メタ）アクリル酸のアルキルアミノアルキルエステル、またはそれらの第４級アンモニウム誘導体；
Ｎ−Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドなどのN−N−ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、またはそれらの４級アンモニウム誘導体；
アセトンアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−プロピルアクリルアミドなどの親水性アクリルアミド；
Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン；
ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート；
メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン；メタクリルアミド；
Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキシルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキシルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクチルメタクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−ドデシルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ドデシルメタクリルアミドなどのＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド誘導体；
Ｎ，Ｎ−ジグリシジルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジグリシジルメタクリルアミド、Ｎ−（４−グリシドキシブチル）アクリルアミド、Ｎ−（４−グリシドキシブチル）メタクリルアミド、Ｎ−（５−グリシドキシペンチル）アクリルアミド、Ｎ−（６−グリシドキシヘキシル）アクリルアミドなどのＮ−（ω−グリシドキシアルキル）（メタ）アクリルアミド誘導体；
メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリレート誘導体；
アクリロニトリル、メタクリロニトリル、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、ブテン等のオレフィン類、スチレン、α−メチルスチレン、ブタジエン、イソプレンなどが挙げられる。
【００３７】
これら単量体は、１種単独で用いてもよいが、２種以上併用してもよい。
これら単量体の重合方法としては、例えば、水溶液重合、乳化重合などがある。
これらの中でも水溶液重合の場合は、通常、アミド化合物と必要に応じて添加する不飽和単量体との合計濃度が５〜９０重量％である。
【００３８】
重合開始剤としては例えば、ラジカル重合開始剤を用いることができる。
ラジカル重合開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過酸化水素、過酸化ベンゾイル等の過酸化物；アゾビスイソブチロニトリル、２・２'−アゾビス（４−アミジノプロパン）２塩酸塩、４・４'−アゾビス（４−シアノバレリアン酸ナトリウム）などのアゾ系遊離基開始剤；上記過酸化物と重亜硫酸ナトリウム、トリエタノールアミン、硫酸第一鉄アンモニウム等の還元剤を併用するいわゆるレドックス系触媒が挙げられる。
【００３９】
上記した重合開始剤は１種単独で用いてもよいが、２種以上併用してもよい。重合開始剤の量は、通常、単量体の総重量に対し、０．００１〜５重量％の範囲である。
重合温度は単一重合開始剤の場合には、通常０〜１２０℃の範囲であり、より好ましくは５〜９０℃の範囲である。また、重合温度は常に一定の温度に保つ必要はなく、重合の進行に伴い適宜変更してもよいが、通常は重合の進行に伴い、重合熱が発生して重合温度が上昇する傾向にあるため、必要に応じ、冷却する場合もある。
【００４０】
重合時の雰囲気は特に限定はないが、重合を速やかに進行する観点からは、例えば窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気下で重合することが好ましい。
重合時間は特に限定はないが、通常１〜２０時間の範囲である。
【００４１】
また重合時の水溶液のｐＨも特に限定はないが、必要に応じｐＨを調整して重合してもよい。その場合使用可能なｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどのアルカリ；リン酸、硫酸、塩酸などの鉱酸；蟻酸、酢酸等の有機酸などが挙げられる。
【００４２】
第一の発明により得られる重合体の分子量は特に制限はないが、通常１０万〜５０００万の範囲であり、好ましくは５０万〜３０００万の範囲である。
この様にして得られた第一の発明のアミド系重合体は、水溶性と高分子量化が両立された重合体であり、しかも色相に優れたものであり、凝集剤、製紙用添加剤、石油回収剤、などとして好適に使用することができる。
【００４３】
２．第二の発明
以下、第二の発明について詳細に説明する。
まず第二の発明のアクリルアミドの製造方法に用いる原料について説明する。
【００４４】
〔アクリロニトリル〕
第二の発明では、アクロレインの濃度が１ｐｐｍ以下のアクリロニトリルを用いる。ここで、アクロレインの濃度が１ｐｐｍ以下のアクリロニトリルとは、第二の発明の原料として用いるアクリロニトリルの１ｋｇ中に含まれるアクロレインの量が１ｍｇ以下であることを意味している。
【００４５】
アクリロニトリル中に含まれている、アクロレインの濃度を１ｐｐｍ以下とする方法については、アセチルアセトン等とアクリロニトリル中のアクロレインとを反応させ、蒸留等により、その反応生成物とアクリロニトリルを分離する方法、１級および／または２級アミノ基を交換基として有するポーラス形イオン交換樹脂と接触させることによりアクリロニトリル中のアクロレインを除去する方法、１級および／または２級アミノ官能基を有するゲル型の弱塩基性イオン交換樹脂と接触させることによりアクリロニトリル中のアルデヒド類、実質的にアクロレインを低減させる方法が挙げられる。
【００４６】
アクリロニトリル中に含まれるアクロレインの濃度は、ガスクロマトグラフ法、高速液体クロマトグラフ法などで定量することができる。
第二の発明において、原料アクリロニトリル中のアクロレインの濃度は１ｐｐｍ以下であるが、０．５ｐｐｍ以下がより好ましい。
【００４７】
アクロレインの濃度が上記範囲内にあると、ニトリルヒドラターゼによる触媒作用に対して、アクロレインの反応阻害が起こらず、かつ、得られたアクリルアミドを用いて、色相に優れ、水溶性と高分子量化が両立した、品質に優れたアクリルアミド系重合体の製造が可能となる。
【００４８】
第二の発明で用いるアクリロニトリルに含まれるアクロレインの濃度は１ｐｐｍ以下であるが、さらにこのアクリロニトリルニトリル中に含まれる青酸の濃度が５ｐｐｍ以下であることが好ましい。
【００４９】
ここで、アクリロニトリル中に含まれる青酸の濃度が５ｐｐｍ以下とは、第二の発明の原料として用いるアクリロニトリルの１ｋｇ中に含まれる青酸の量が５ｍｇ以下であることを意味している。
【００５０】
アクリロニトリル中に含まれている、青酸の濃度を１ｐｐｍ以下とする方法については、例えば特開平１１−１２３０９８号公報に記載されているように、青酸を金属錯体として除く方法、イオン交換樹脂を用いる方法、アルカリ条件下でアクリロニトリルに青酸を付加する方法などが挙げられる。
【００５１】
また、アクリロニトリル中に含まれる青酸の濃度は、アルカリ溶液で抽出したあと硝酸銀を用いた滴定法により求めることができる。
第二の発明において、アクリロニトリル中の青酸の濃度は５ｐｐｍ以下が好ましいが、３ｐｐｍ以下がより好ましく、１ｐｐｍ以下がさらに好ましい。
【００５２】
さらに第二の発明においては、アクリロニトリルに含まれるアクロレインの濃度は１ｐｐｍ以下であることに加えて、アクリロニトリルニトリル中に含まれるオキサゾールの濃度が１０ｐｐｍ以下であることも好ましい。
【００５３】
ここで、アクリロニトリル中に含まれるオキサゾールの濃度が１０ｐｐｍ以下とは、第二の発明の原料として用いるアクリロニトリルの１ｋｇ中に含まれるオキサゾールの量が１０ｍｇ以下であることを意味している。
【００５４】
アクリロニトリル中に含まれている、オキサゾールの濃度を１０ｐｐｍ以下とする方法については、例えば、特開昭６３−１１８３０５号公報記載の、アクリロニトリル中のオキサゾールを、Ｈ型のカチオン交換樹脂と接触させる方法を挙げることができる。
【００５５】
またアクリロニトリル中に含まれるオキサゾールの濃度は、ガスクロマトグラフ法、高速液体クロマトグラフ法などで定量することができる。
第二の発明において、アクリロニトリル中のオキサゾールの濃度は１０ｐｐｍ以下が好ましいが、５ｐｐｍ以下がより好ましく、１ｐｐｍ以下がさらに好ましい。
【００５６】
また第二の発明においては、第二の発明で用いるアクリロニトリルに含まれるアクロレインの濃度が上記範囲内であり、青酸の濃度が５ｐｐｍ以下、好ましくは３ｐｐｍ以下、より好ましくは１ｐｐｍ以下、かつ、オキサゾールの濃度が１０ｐｐｍ以下、好ましくは５ｐｐｍ以下、より好ましくは１ｐｐｍ以下であることが好ましい。
【００５７】
〔ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体等〕
第二の発明では上記アクリロニトリルを原料とし、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体およびその菌体処理物等を触媒として水和反応することで、第二の発明のアクリルアミドを得ることができる。
【００５８】
第二の発明でニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力をもつ酵素をいう。ここで、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物としては、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力を有するニトリルヒドラターゼを産生し、かつアクリルアミド水溶液中でニトリルヒドラターゼの活性を保持している微生物であれば、特に制限されるものではない。
【００５９】
具体的には、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム( Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物を好適な例として挙げることができる。
【００６０】
また、該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体も第二の発明でいう微生物に含まれる。なお、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、特に大腸菌に限定されるのものではなく、枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アクリルアミド耐性やアクリロニトリル耐性、温度耐性をさらに向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も、第二の発明でいう微生物に含まれる。
【００６１】
上記したような微生物を用い、アミド化合物を製造するに際しては通常、該微生物の菌体あるいは菌体処理物を用いる。菌体は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用して調製すればよい。例えば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい）で生育させ、続いて、該微生物を遠心分離によって培養液より分離、回収して得る方法が挙げられる。
【００６２】
また、第二の発明における微生物の菌体処理物は、上記微生物菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離精製して得られる後分離物、該微生物菌体や該菌体の抽出物、磨砕物、後分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらはニトリルヒドラターゼの活性を有している限りは第二の発明の菌体処理物に相当するものである。これらは、単一の種類を用いてもよいし、２種類以上の異なる形態のものを同時あるいは交互に用いてもよい。
【００６３】
〔水性媒体〕
また、第二の発明における水性媒体とは、水、またはリン酸塩等の緩衝剤、硫酸塩や炭酸塩等の無機塩、アルカリ金属の水酸化物、もしくはアミド化合物等を適当な濃度で溶解させた水溶液をいう。なお、本明細書において、第二の発明における水性媒体を「水性媒体(II）」ともいう。
【００６４】
〔反応条件〕
第二の発明において、水性媒体(II)中のアクリロニトリルの濃度は、反応開始時において該ニトリル化合物の飽和濃度以上の濃度である。その濃度の上限は特に制限されるものではないが、あまりに大過剰のニトリル化合物の供給は、反応を完結させるために多くの触媒量および過大な容積をもつ反応器、および除熱のための過大な熱交換器等が必要となり、設備面での経済的負担が大きくなる。このため、アクリロニトリルの供給濃度としては、それが全て対応するアクリルアミドに転化したときにその理論的な生成液濃度が、アクリルアミドの場合は４０〜８０重量％の範囲となるように、より具体的には水１重量部に対しアクリロニトリル０．４〜１．５重量部の範囲で供給することが好ましい。
【００６５】
また、上記反応での反応時間は触媒使用量や温度等の条件にも左右され得るが、通常は１〜８０時間の範囲であり、好ましくは２〜４０時間の範囲である。
反応形式については、特に限定するものではなく、回分式、半回分式でもよいし、連続式の反応を行ってもよい。また、懸濁床、固定床、移動床などいずれでもよいが、通常は撹拌機を備えた槽型反応器、プラグフロー反応器での反応がより好ましく、また、複数の形式の反応器を組み合わせてもよい。
【００６６】
触媒の使用量については、反応条件や触媒の種類、およびその形態にも依存するが、通常は該微生物乾燥菌体重量換算で、反応液の重量に対し、１０〜５００００ｐｐｍ、好ましくは５０〜３００００ｐｐｍである。
【００６７】
また、水和反応は通常は常圧あるいは常圧近辺で行われるが、水性媒体(II)中へのニトリル化合物の溶解度を高めるために加圧下で行うこともできる。また、反応温度に関しては、水性媒体(II)の氷点以上であれば特に制限されるものではないが、通常は０〜５０℃の範囲で行うのが好ましく、より好ましくは１０〜４０℃の範囲である。また、生成物が反応液中に晶出したスラリー状態でも反応を行うことができる。また、上記水和反応時における反応液のｐＨは、ニトリルヒドラターゼ活性が維持されている限りは特に制限されるものではないが、好ましくはｐＨ６〜１０の範囲であり、より好ましくはｐＨ７〜９の範囲である。
【００６８】
また、ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得を部位特異的な変異によって行うことも可能であるが、特定の変異点と置換される塩基の種類に基づいて、部位特異的な変異以外の方法で組替えプラスミドを構築し、それを宿主細胞に導入することでも、同様の結果を得ることが可能である。
【００６９】
例えば、変異点に相当する領域のＤＮＡの塩基配列がアミノ酸置換後の配列となるような塩基配列を有するＤＮＡフラグメントをＤＮＡシンセサイザー等で合成し、得られたフラグメントと別途分離しておいたｐＰＴ−ＤＢ１の該フラグメントに相当する領域とを置換することにより、目的とする組替えプラスミドを取得することができる。
【００７０】
〔アクリルアミド系重合体の製造〕
第二の発明のアクリルアミド系重合体は、上述のようにして得られたアクリルアミドを単独重合、またはアクリルアミドを、アクリルアミドと共重合可能な少なくとも一種の不飽和単量体と共重合することにより、製造できる。
【００７１】
アクリルアミドと共重合可能な不飽和単量体としては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸などの不飽和カルボン酸およびそれらの塩；
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸およびそれらの塩；
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレートなどの（メタ）アクリル酸のアルキルアミノアルキルエステル、またはそれらの第４級アンモニウム誘導体；
Ｎ−Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドなどのN−N−ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、またはそれらの４級アンモニウム誘導体；
アセトンアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−プロピルアクリルアミドなどの親水性アクリルアミド；
Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン；
ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート；
メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン；メタクリルアミド；
Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキシルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキシルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクチルメタクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−ドデシルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ドデシルメタクリルアミドなどのＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド誘導体；
Ｎ，Ｎ−ジグリシジルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジグリシジルメタクリルアミド、Ｎ−（４−グリシドキシブチル）アクリルアミド、Ｎ−（４−グリシドキシブチル）メタクリルアミド、Ｎ−（５−グリシドキシペンチル）アクリルアミド、Ｎ−（６−グリシドキシヘキシル）アクリルアミドなどのＮ−（ω−グリシドキシアルキル）（メタ）アクリルアミド誘導体；
メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリレート誘導体；
アクリロニトリル、メタクリロニトリル、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、ブテン等のオレフィン類、スチレン、α−メチルスチレン、ブタジエン、イソプレンなどが挙げられる。
【００７２】
これら単量体は、１種単独で用いてもよいが、２種以上併用してもよい。
これら単量体の重合方法としては、例えば、水溶液重合、乳化重合などがある。
これらの中でも水溶液重合の場合は、通常、アクリルアミドと必要に応じて添加する不飽和単量体との合計濃度が５〜９０重量％である。
【００７３】
重合開始剤としては例えば、ラジカル重合開始剤を用いることができる。
ラジカル重合開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過酸化水素、過酸化ベンゾイル等の過酸化物；アゾビスイソブチロニトリル、２・２'−アゾビス（４−アミジノプロパン）２塩酸塩、４・４'−アゾビス（４−シアノバレリアン酸ナトリウム）などのアゾ系遊離基開始剤；上記過酸化物と重亜硫酸ナトリウム、トリエタノールアミン、硫酸第一鉄アンモニウム等の還元剤を併用するいわゆるレドックス系触媒が挙げられる。
【００７４】
上記した重合開始剤は１種単独で用いてもよいが、２種以上併用してもよい。重合開始剤の量は、通常、単量体の総重量に対し、０．００１〜５重量％の範囲である。
重合温度は単一重合開始剤の場合には、通常０〜１２０℃の範囲であり、より好ましくは５〜９０℃の範囲である。また、重合温度は常に一定の温度に保つ必要はなく、重合の進行に伴い適宜変更してもよいが、通常は重合の進行に伴い、重合熱が発生して重合温度が上昇する傾向にあるため、必要に応じ、冷却する場合もある。
【００７５】
重合時の雰囲気は特に限定はないが、重合を速やかに進行する観点からは、例えば窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気下で重合することが好ましい。
重合時間は特に限定はないが、通常１〜２０時間の範囲である。
【００７６】
また重合時の水溶液のｐＨも特に限定はないが、必要に応じｐＨを調整して重合してもよい。その場合使用可能なｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどのアルカリ；リン酸、硫酸、塩酸などの鉱酸；蟻酸、酢酸等の有機酸などが挙げられる。
【００７７】
第二の発明により得られる重合体の分子量は特に制限はないが、通常１０万〜５０００万の範囲であり、好ましくは５０万〜３０００万の範囲である。
この様にして得られた第二の発明のアクリルアミド系重合体は、水溶性と高分子量化が両立された重合体であり、しかも色相に優れたものであり、凝集剤、製紙用添加剤、石油回収剤、などとして好適に使用することができる。
【００７８】
［実施例］
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７９】
１．第一の発明の実施例
なお、ベンゼン濃度の測定は、ガスクロ分析に拠った。ガスクロ分析の測定カラムは化学物質評価研究機構 Ｇ−９５０ １．２ｍｍ×４０ｍ（２５μｍ）を用い、キャリヤガスとしてＨｅを使用、ＦＩＤ検出器により検出した。
【００８０】
また、各実施例及び比較例におけるＨＰＬＣ分析は、カラムとして日本分光製のＦｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ Ｃ１８−５（２５０×４．６φｍｍ）を用い、４体積％のアセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用した。また、アクリルアミド、メタクリルアミドは２２０ｎｍの吸光度により検出した。
【００８１】
［製造例１−１］
反応容器に活性炭（内部表面積１０００ｍ２／ｋｇ）１ｋｇを有する活性炭固定床吸着剤を装入した。ベンゼン濃度が２６ｐｐｍのアクリロニトリルａを温度１０℃、および流速２００ｍ／ｈｒで下方から上方へポンプで送って吸着剤を通過させた。通過後の該アクリロニトリル中のベンゼン濃度を測定した結果、ベンゼン濃度は４．０ｐｐｍであった。以後、活性炭吸着処理後のアクリロニトリルをアクリロニトリルｂと呼ぶ。
［製造例１−２］
含有するベンゼン濃度が１１ｐｐｍであるアクリロニトリルｃをそのまま用いた。
［製造例１−３］
含有するベンゼン濃度が８ｐｐｍであるメタクリロニトリルをそのまま用いた。
【００８２】
菌体の調製
［調製例１−１］
シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５由来ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の培養
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに培地組成１−１に示す組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌後、終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加したものを３０本用意した。各々のバッフル付三角フラスコにＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５）を一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。各バッフル付三角フラスコ中の培養液を一まとめにしたのち、遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００８３】
［培地組成１−１］
５．０ｇ／Ｌ 酵母エキストラクト
１０．０ｇ／Ｌ ポリペプトン
５．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ
１０．０ｍｇ／Ｌ 塩化コバルト・六水和物
４０．０ｍｇ／Ｌ 硫酸第二鉄・七水和物
ｐＨ７．５
【００８４】
［調製例１−２］
ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株由来ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の培養
特公平０６−５５１４８号記載のロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として、前記の寄託機関に特許手続き上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されており、万人に対し請求により分譲される）を用いて、湿菌体を得た。
【００８５】
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに培地組成１−２に示す組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に特公平０６−５５１４８号記載のロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として、前記の寄託機関に特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されており、万人に対し請求により分譲される）を一白菌耳植菌し、３０℃・１３０ｒｐｍにて７２時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００８６】
［培地組成１−２］
１０．０ｇ／Ｌ グルコース
０．５ｇ／Ｌ リン酸二水素一カリウム
０．５ｇ／Ｌ リン酸一水素二カリウム
０．５ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム・七水和物
１．０ｇ／Ｌ 酵母エキストラクト
７．５ｇ／Ｌ ペプトン
７．５ｇ／Ｌ 尿素
１０．０ｍｇ／Ｌ 塩化コバルト・六水和物
ｐＨ７．２
【００８７】
［実施例１−１］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（１）
調製例１−１で得られた湿菌体を２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）により適当に希釈し、これに製造例１−１に記載したアクリロニトリルｂを、反応液全体のアクリロニトリル濃度が２０重量％となるよう添加し、２０℃で１０分間反応させた。このとき、水性媒体(I)（反応液全体）中のベンゼン濃度は、０．８ｐｐｍである。反応後、反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度をＨＰＬＣ分析により測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。結果を表１−１に示す。得られた反応速度を１００％として、実施例１−２及び実施例１−３、比較例１−１、比較例１−２と比較した。
【００８８】
［実施例１−２］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（２）
調製例１−１で得られた湿菌体を２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）により適当に希釈し、これに製造例１−２に記載したアクリロニトリルｃを２０重量％となるよう添加して２０℃で１０分間反応させた。このとき、水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、２．２ｐｐｍであった。以下実施例１−１と同様に操作した。結果を表１−１に示す。
【００８９】
［実施例１−３］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（３）
製造例１−１記載のアクリロニトリルｂにベンゼンを添加し、アクリロニトリル中のベンゼン濃度が２０ｐｐｍとなるよう調製した。使用するアクリロニトリルを該アクリロニトリルへ代えて、実施例１−１と同様に操作した。このとき、水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、４．０ｐｐｍである。結果を表１−１に示す。
【００９０】
［比較例１−１］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（１）
使用するアクリロニトリルを製造例１−１記載のアクリロニトリルａへ代えて、実施例１−１と同様に操作した。このとき、水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、５．２ｐｐｍであった。結果を表１−１に示す。
【００９１】
［比較例１−２］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（２）
製造例１−１記載のアクリロニトリルｂにベンゼンを添加し、アクリロニトリル中のベンゼン濃度が２６ｐｐｍとなるよう調製した。使用するアクリロニトリルを該アクリロニトリルへ代えて、実施例１−１と同様に操作した。このとき、水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、５．２ｐｐｍである。結果を表１−１に示す。
【００９２】
表１−１より、水性媒体(I)中のベンゼン濃度を４．０ｐｐｍ以下にすることによって反応速度の低下を抑制でき、かつ、反応速度の低下を招く原因物質がベンゼンであることがわかる。
【００９３】
［実施例１−４］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（４）
使用する湿菌体を調製例１−２で得られた湿菌体へ代えて、実施例１−１と同様に操作した。結果を表１−２に示す。得られた反応速度を１００％として、実施例１−５、比較例１−３と比較した。
【００９４】
［実施例１−５］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（５）
使用する湿菌体を調製例１−２で得られた湿菌体へ代えて、実施例１−３と同様に操作した。結果を表１−２に示す。
【００９５】
［比較例１−３］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（３）
使用する湿菌体を調製例１−２で得られた湿菌体へ代えて、比較例１−１と同様に操作した。結果を表１−２に示す。
【００９６】
［実施例１−６］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（６）
調製例１−１で得られた湿菌体を２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）により適当に希釈し、これに製造例１−３に記載したメタクリロニトリルを２０重量％となるよう添加して２０℃で１０分間反応させた。この際、水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、１．６ｐｐｍである。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したメタクリルアミド濃度をＨＰＬＣ分析により測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのメタクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。結果を表１−３に示す。得られた反応速度を１００％として、実施例１−７、比較例１−４と比較した。
【００９７】
［実施例１−７］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（７）
製造例１−３で記載したメタクリロニトリルにベンゼンを添加し、メタクリロニトリル中のベンゼン濃度が２０ｐｐｍとなるよう調製した。使用するメタクリロニトリルを該メタクリロニトリルへ代えて、実施例１−６と同様に操作した。このときの水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、４．０ｐｐｍである。結果を表１−３に示す。
【００９８】
［比較例１−４］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（４）
製造例１−３で記載したメタクリロニトリルにベンゼンを添加し、メタクリロニトリル中のベンゼン濃度が２５ｐｐｍとなるよう調製した。使用するメタクリロニトリルを該メタクリロニトリルへ代えて、実施例１−６と同様に操作した。このときの水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、５．０ｐｐｍである。結果を表１−３に示す。
【００９９】
［実施例１−８］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（８）
使用する湿菌体を調製例１−２で得られた湿菌体へ代えて、実施例１−６と同様に操作した。結果を表１−４に示す。得られた反応速度を１００％として、実施例１−９、比較例１−５と比較した。
【０１００】
［実施例１−９］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（９）
使用する湿菌体を調製例１−２で得られた湿菌体へ代えて、実施例１−７と同様に操作した。結果を表１−４に示す。
【０１０１】
［比較例１−５］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（５）
使用する湿菌体を調製例１−２で得られた湿菌体へ代えて、比較例１−４と同様に操作した。結果を表１−４に示す。
【０１０２】
【表１−１】
【０１０３】
使用ニトリル化合物：アクリロニトリル
使用菌体：シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ含有微生物菌体
【０１０４】
【表１−２】
【０１０５】
使用ニトリル化合物：アクリロニトリル
使用菌体：ロドコッカス・ロドクロウス由来ニトリルヒドラターゼ含有微生物菌体
【０１０６】
【表１−３】
【０１０７】
使用ニトリル化合物：メタクリロニトリル
使用菌体：シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ含有微生物菌
体
【０１０８】
【表１−４】
【０１０９】
使用ニトリル化合物：メタクリロニトリル
使用菌体：ロドコッカス・ロドクロウス由来ニトリルヒドラターゼ含有微生物菌体
【０１１０】
［実施例１−１０］
アクリルアミドの製造
第１反応器として攪拌器を備えた１Lガラス製フラスコ、第二反応器として内径５ｍｍのテフロン（登録商標）製チューブ２０ｍを準備した。第一反応器には、予め４００ｇの水を仕込んだ。
【０１１１】
特開２００１−３４００９１号に記載の方法に従い、ニトロリルヒドラターゼを含む菌体の培養を行い、得られた湿菌体を０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に懸濁した。この懸濁液とアクリロニトリルｂとを、おのおの４９ｇ／ｈ、３１ｇ／ｈの速度で、攪拌を行いながら、第１反応器に連続的にフィードした。さらに、第１反応器の液面レベルを一定に保つように、反応液を第１反応器から８０ｇ／ｈの速度で連続的に抜き出した。この抜き出した液を８０ｇ／ｈの速度で第２反応器に連続的にフィードして、第２反応器内でさらに反応を進行させた。
【０１１２】
第１反応器および第２反応器とも１０〜２０℃の温度の水浴中に浸漬し、各反応器内部の液温が１５℃となるように温度制御を行った。
湿菌体の０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対する添加量を、第１反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が９０％以上となり、かつ第二反応器出口でのアクリルニトリル濃度が検出限界以下（１００ppm以下）となるように調整した。アクリルアミドへの転化率はＨＰＬＣの分析結果から求めた。
その結果、０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対し、湿菌体２．５重量％で、目的の転化率を達成できた。
【０１１３】
〔比較例１−６〕
使用するアクリロニトリルをアクリロニトリルaへ代えて、実施例１−１０と同様の操作を行った。その結果、目的の転化率を達成するために必要な湿菌体の添加量は、０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対し、湿菌体３．０重量％であった。湿菌体の添加量は実施例１−１０よりも多く、ベンゼンの反応阻害が確認された。
【０１１４】
〔比較例１−７〕
アクリロニトリルｂにベンゼンを添加し、アクリロニトリル中のベンゼン濃度が２６ｐｐｍとなるよう調整した。使用するアクリロニトリルを該アクリロニトリルへ代えて、実施例１−１０と同様の操作を行った。その結果、目的の転化率を達成するために必要な湿菌体の添加量は、０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対し、湿菌体３．０重量％であった。湿菌体の添加量は実施例１−１０よりも多く、ベンゼンの反応阻害が確認された。
【０１１５】
〔実施例１−１１〕
実施例１−１０の反応液を、酸性下（ＰＨ＝５）で活性炭により処理してから湿菌体を除去し、さらに、１Ｎ−ＮａＯＨにより中和して５０重量％のアクリルアミド水溶液を得た。
【０１１６】
得られたアクリルアミド水溶液に水を加えて濃度２０重量％のアクリルアミド水溶液とした。この２０重量％アクリルアミド水溶液５００ｇを１ｌポリエチレン容器に入れ、１８℃に保ちながら、窒素を通じて液中の溶存酸素を除き、直ちに、発泡スチロール製の保温用ブロックの中に入れた。
【０１１７】
ついで、２００×１０-6ｍｐｍ（アクリルアミドに対するモル比）の４，４'−アゾビス（４−シアノバレリアン酸ナトリウム）、２００×１０-6ｍｐｍのジメチルアミノプロピオニトリル、および８０×１０-6ｍｐｍの過硫酸アンモニウムを各々小量の水に溶解して、この順序に１ｌポリエチレン容器中に素早く注入した。これらの試薬には、予め窒素ガスを通じておき、また、注入およびその前後には、上記ポリエチレン容器にも少量の窒素ガスを通じ、酸素ガスの混入を防止した。
【０１１８】
試薬を注入すると、数分間の誘導期の後、ポリエチレン容器の内部の温度が上昇するのが認められたので窒素ガスの供給をとめた。約１００分間、保温用ブロック中で、そのままの状態でポリエチレン容器を保持したところ、ポリエチレン容器の内部の温度が約７０℃に達した。そこで、ポリエチレン容器を保温用ブロックから取りだし、９７℃の水に２時間浸漬しさらに重合反応を進めた。その後冷水に浸漬して冷却し、重合反応を停止した。
【０１１９】
このようにして得られたアクリルアミドポリマーの含水ゲルをポリエチレン容器から取り出し、小塊にわけ、肉挽器ですりつぶした。このすりつぶしたアクリルアミドポリマーの含水ゲルを、１００℃の熱風で２時間乾燥し、さらに、高速回転刃粉砕器で粉砕して乾燥粉末状のアクリルアミドポリマーを得た。得られた乾燥粉末状のアクリルアミドポリマーを篩にかけ、３２〜４２メッシュのものを分取し、以後の試験に供するポリマーサンプルとした。
【０１２０】
〔比較例１−８〕
実施例１−１１と同様にして、比較例１−６で得られた反応液から２０重量％アクリルアミド水溶液を得て、さらに、このアクリルアミド水溶液を重合してポリマ−サンプルを得た。
【０１２１】
〔比較例１−９〕
実施例１−１１と同様にして、比較例１−７で得られた反応液から２０重量％アクリルアミド水溶液を得て、さらに、このアクリルアミド水溶液を重合してポリマ−サンプルを得た。
【０１２２】
＜アクリルアミドポリマーの試験法＞
上記実施例１−１１、比較例１−８、比較例１−９で得られたポリマーサンプルの色調の評価を以下の方法で行った。
水溶性：水溶性は、１ ｌビーカーに水６００ｍｌを入れ、定められた形状の攪拌羽根を用いて２５℃で攪拌しながらポリマーサンプル０．６６ｇ（純分０．６ｇ）を添加し、４００ｒｐｍで２時間攪拌を行い、得られた溶液を１５０メッシュの金網で濾過し、不溶解分の多少と濾過性から、水溶性を判断した。即ち、完溶のものを◎、完溶に近いものを○、不溶解分があるが、それを濾別する事ができるものを△、濾液の通過が遅く、不溶解分の濾過が事実上出来ないものを×とした。
色調：ポリマーの色調についてはポリマ−粉体を目視で評価した。
評価結果を表１−５に示した。
【０１２３】
【表１−５】
【０１２４】
２．第二の発明の実施例
以下、特に断りのない限り、％、ppmは重量基準である。
【０１２５】
〔実施例２−１〕
［ニトロリルヒドラターゼを含む菌体の培養］
特開２００１−３４００９１号に記載の方法に従い、ニトロリルヒドラターゼを含む菌体の培養を行い、湿菌体を得た。
【０１２６】
［アクリロニトリルの精製］
１級および／または２級アミノ基を有する樹脂ダイヤイオンＷＡ−２０（商品名、三菱化成社製）０．３ｌを水洗したのち、内径４０ｍｍ、長さ４００ｍｍのＳＵＳ−３０４製カラムに充填した。このカラムにアクロレイン２ｐｐｍを含むアクリロニトリルを６ ｌ／ｈｒの流量で通液した。カラム通液後の精製アクリロニトリルのアクロレイン濃度を、下記の高速液体クロマトグラフ法（検出下限０．１ppm）にて測定したところ、０．９ｐｐｍであった。
【０１２７】
分析条件：
高速液体クロマトグラフ装置：ＬＣ−６Ａシステム（株式会社島津製作所製）
（ＵＶ検出器波長210nm、カラム温度40℃）
分離カラム ：Ｌ−Column ODS Type-Waters
（（財）化学品検査協会製）
（カラムサイズ：4.6mm×250mm）
溶離液 ：20%（容積基準）−アセトニトリル水溶液
（リン酸にてpH2.5に調整）
【０１２８】
［アクリルアミドの製造］
第１反応器として攪拌器を備えた１Lガラス製フラスコ、第二反応器として内径５ｍｍのテフロン（登録商標）製チューブ２０ｍを準備した。第一反応器には、予め４００ｇの水を仕込んだ。
【０１２９】
上記の培養方法で得られた湿菌体を０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に懸濁した。この懸濁液とアクリロニトリルとを、おのおの４９ｇ／ｈ、３１ｇ／ｈの速度で、攪拌を行いながら、第１反応器に連続的にフィードした。さらに、第１反応器の液面レベルを一定に保つように、反応液を第１反応器から８０ｇ／ｈの速度で連続的に抜き出した。この抜き出した液を８０ｇ／ｈの速度で第２反応器に連続的にフィードして、第２反応器内でさらに反応を進行させた。
【０１３０】
第１反応器および第２反応器とも１０〜２０℃の温度の水浴中に浸漬し、各反応器内部の液温が１５℃となるように温度制御を行った。
湿菌体の０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対する添加量を、第１反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が９０％以上となり、かつ第二反応器出口でのアクリルニトリル濃度が検出限界以下（１００ppm以下）となるように調整した。アクリルアミドへの転化率はＨＰＬＣの分析結果から求めた。
その結果、０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対し、湿菌体２．５重量％で、目的の転化率を達成できた。
【０１３１】
〔比較例２−１〕
原料アクリロニトリルをイオン交換処理しないで用いた以外は、実施例２−１と同様の操作を行った。その結果、目的の転化率を達成するために必要な湿菌体の添加量は、０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対し、湿菌体２．８重量％であった。湿菌体の添加量は実施例２−１よりも多く、アクロレインの反応阻害が確認された。
【０１３２】
〔比較例２−２〕
実施例２−１で得られた精製アクリロニトリルにアクロレインを添加し、アクリロニトリル中のアクロレイン濃度が２ｐｐｍとなるよう調整した。このアクリロニトリルを使用して、実施例２−１と同様にアクリルアミドの製造を実施した。その結果、目的の転化率を達成するために必要な湿菌体の添加量は、０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対し、湿菌体２．８重量％であった。湿菌体の添加量は実施例２−１よりも多く、アクロレインの反応阻害が確認された。
【０１３３】
〔実施例２−２〕
実施例２−１の反応液を、酸性下（ＰＨ＝５）で活性炭により処理してから湿菌体を除去し、さらに、１Ｎ−ＮａＯＨにより中和して５０重量％のアクリルアミド水溶液を得た。
【０１３４】
得られたアクリルアミド水溶液に水を加えて濃度２０重量％のアクリルアミド水溶液とした。この２０重量％アクリルアミド水溶液５００ｇを１Lポリエチレン容器に入れ、１８℃に保ちながら、窒素を通じて液中の溶存酸素を除き、直ちに、発泡スチロール製の保温用ブロックの中に入れた。
【０１３５】
ついで、２００×１０-6ｍｐｍ（アクリルアミドに対するモル比）の４，４'−アゾビス（４−シアノバレリアン酸ナトリウム）、２００×１０-6ｍｐｍのジメチルアミノプロピオニトリル、および８０×１０-6ｍｐｍの過硫酸アンモニウムを各々小量の水に溶解して、この順序に１ｌポリエチレン容器中に素早く注入した。これらの試薬には、予め窒素ガスを通じておき、また、注入およびその前後には、上記ポリエチレン容器にも少量の窒素ガスを通じ、酸素ガスの混入を防止した。
【０１３６】
試薬を注入すると、数分間の誘導期の後、ポリエチレン容器の内部の温度が上昇するのが認められたので窒素ガスの供給をとめた。約１００分間、保温用ブロック中で、そのままの状態でポリエチレン容器を保持したところ、ポリエチレン容器の内部の温度が約７０℃に達した。そこで、ポリエチレン容器を保温用ブロックから取りだし、９７℃の水に２時間浸漬しさらに重合反応を進めた。その後冷水に浸漬して冷却し、重合反応を停止した。
【０１３７】
このようにして得られたアクリルアミドポリマーの含水ゲルをポリエチレン容器から取り出し、小塊にわけ、肉挽器ですりつぶした。このすりつぶしたアクリルアミドポリマーの含水ゲルを、１００℃の熱風で２時間乾燥し、さらに、高速回転刃粉砕器で粉砕して乾燥粉末状のアクリルアミドポリマーを得た。得られた乾燥粉末状のアクリルアミドポリマーを篩にかけ、３２〜４２メッシュのものを分取し、以後の試験に供するポリマーサンプルとした。
【０１３８】
〔実施例２−３〕
実施例２−１の反応で用いた精製アクリロニトリルを、さらに、６ｌ／ｈｒの流量で、水洗した０．３ｌのダイヤイオンWA−２０を充填した内径４０ｍｍ、長さ４００ｍｍのＳＵＳ−３０４製カラムに通液した。カラム通液後の精製アクリロニトリル中のアクロレイン濃度は０．４ｐｐｍであった。
【０１３９】
このアクリロニトリルを使用し、実施例２−１および実施例２−２と同様にして、２０重量％アクリルアミド水溶液を得て、さらにこのアクリルアミド水溶液を重合してポリマーサンプルを得た。
【０１４０】
〔比較例２−３〕
実施例２−２と同様にして、比較例２−１で得られた反応液から２０重量％アクリルアミド水溶液を得て、さらに、このアクリルアミド水溶液を重合してポリマ−サンプルを得た。
【０１４１】
〔比較例２−４〕
実施例２−２と同様にして、比較例２−２で得られた反応液から２０重量％アクリルアミド水溶液を得て、さらに、このアクリルアミド水溶液を重合してポリマ−サンプルを得た。
【０１４２】
＜アクリルアミドポリマーの試験法＞
上記実施例２−２、実施例２−３、比較例２−２で得られたポリマーサンプルの水溶性の評価、標準粘度の測定、および色調の評価を以下の方法で行った。
水溶性：水溶性は、１ Lビーカーに水６００ｍｌを入れ、定められた形状の攪拌羽根で２５℃で攪拌しながらポリマーサンプル０．６６ｇ（純分０．６ｇ）を添加し、４００ｒｐｍで２時間攪拌を行い、得られた溶液を１５０メッシュの金網で濾過し、不溶解分の多少と濾過性から、水溶性を判断した。即ち、完溶のものを◎、完溶に近いものを○、不溶解分があるが、それを濾別する事ができるものを△、濾液の通過が遅く、不溶解分の濾過が事実上出来ないものを×とした。
標準粘度：上記の水溶性試験により得られる濾液は、濃度０．１重量％のポリマー水溶液であるが、これに１Ｍ濃度相当の塩化ナトリウムを加え、ＢＬ型粘度計でＢＬアダプターを用いて２５℃、ローター回転数６０ｒｐｍで粘度を測定した（標準粘度）。このような方法で得られる標準粘度は分子量に相関のある値として慣用される。
色調：ポリマーの色調についてはポリマ−粉体を目視で評価した。
評価結果を表２−１に示した。
【０１４３】
【表２−１】
*）濾液の通過が遅く、事実上濾過が不可能な為、濾液の粘度は測定不能
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
第一の発明によれば、ニトリルヒドラターゼを利用した反応により、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率的に製造することができるので、工業的に実施するのに有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミド化合物の製造方法に関する。
本発明（第一の発明）は、より詳しくは、アミド化合物、およびアミド系重合体を製造する方法に関し、さらに詳しくは、ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒を用いて、効率的に水性媒体中でニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法、およびこのアミド化合物により高品位なアミド系重合体を製造する方法に関する。また、本発明（第二の発明）は、より詳しくは、アクリルアミド、およびアクリルアミド系重合体を製造する方法に関し、さらに詳しくは、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の菌体等によりアクリロニトリルを水和して、高品位なアクリルアミドを製造する方法、およびこのアクリルアミドにより高品位なアクリルアミド系重合体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
工業的に有用なアミド化合物については、以下に述べるように、種々の製造方法が開示されている。
近年ニトリル基を水和してアミド基に変換するニトリル水和活性を有するニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素または該酵素を有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が既に開示されている。この製造方法は従来の科学的な方法と比べて、ニトリル化合物からの対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いなどのメリットが知られている。
【０００３】
これらのニトリルヒドラターゼを利用してアミド化合物を工業的に製造する際には、触媒となるニトリルヒドラターゼのアミド化合物生産性（１分子のニトリルヒドラターゼが生産するアミド化合物の分子数）を最大化することが重要である。そのため、酵素活性の維持や向上、活性低下の抑制、低下した酵素の活性向上などを目的とした提案が多数報告されている。例えば、細胞の増殖を伴わない条件下で、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体またはその菌体処理物を酸化剤と接触させることにより酵素活性を維持または向上させることが公知である（特許文献１参照）。また、含有される青酸濃度を低減させたニトリル化合物を使用することにより、ニトリルヒドラターゼの活性低下が抑制されることも公知である（特許文献２参照）。その他にも、グルタルアルデヒドで架橋処理した菌体を用いて反応を行う方法（特許文献３参照）、高級不飽和脂肪酸もしくはその塩類の存在下で反応を行う方法（特許文献４参照）、有機溶媒で処理した菌体、または処理物を用いて反応を行う方法（特許文献５参照）等が知られている。以上が第一の発明の背景技術である。
【０００４】
また、上述したように、アクリルアミドの主要な製造方法の一つとして、アクリロニトリルを水和反応する方法が挙げられ、例えば、ラネー銅等の金属銅触媒により水和反応する方法、あるいはニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体およびその菌体処理物等を触媒として水和反応する方法が知られている。
【０００５】
これらの中でも、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体等を触媒とするアクリルアミドの製造方法では、従来の金属銅触媒等により水和反応する方法に比べて、アクリロニトリルの転化率、および選択率が高いことから工業的製造方法としても注目を浴びている。
【０００６】
このニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体等を触媒として、より高品質なアクリルアミドを効率よく製造するためには、微生物菌体等の触媒作用を阻害する不純物をできる限り除去する必要がある。
【０００７】
またこのような反応により得られるアクリルアミドは、主としてアクリルアミド系重合体の原料として用いられるが、近年、このアクリルアミド系重合体にはより一層の高品質化が求められている。例えば、アクリルアミド系重合体の用途には凝集剤があるが、凝集剤として用いられるアクリルアミド系重合体は、近年、性能向上の要求に伴い、水溶性を維持しながらより一層の高分子量化が求められている。またアクリルアミド系重合体には、製紙用添加剤等の用途があるが、この製紙用添加剤としては、得られる紙の品質をさらに向上させるために、より色相の優れた重合体が求められている。
【０００８】
ニトリルヒドラターゼを含む菌体触媒等により得られるアクリルアミドの品質、あるいはポリアクリルアミドの品質を改善する方法として、上述したように、ニトリル化合物中の青酸濃度を化学的方法により低減させた後、ニトリル化合物にニトリルヒドラターゼを作用させるアミド化合物の製造方法（例えば、特許文献２参照。）、アクリロニトリル中に不純物として含まれるオキサゾールおよび青酸を低減して、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換し、このアクリルアミドからアクリルアミド系ポリマーを製造する方法（例えば、特許文献６）が知られている。以上が第二の発明の背景技術である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−３５０５７３号公報
【特許文献２】特開１１−１２３０９８号公報
【特許文献３】特開平７−２６５０９１号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０９０号公報
【特許文献５】特開平５−３０８９８０号公報
【特許文献６】国際公開第二００４／０９０１４８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、ニトリルヒドラターゼを利用してアミド化合物を効率的に製造するにあたって、第一の発明の背景技術で述べた従来技術では解決できない別の要因によってもニトリルヒドラターゼのアミド化合物生産性低下の現象が存在しており、その要因の解決も望まれていた。
【００１１】
したがって、第一の発明の目的は、ニトリルヒドラターゼを利用した反応において、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率的に製造する方法を提供することにある。また、上述の方法により製造されたアミド化合物を用いて、高品質なアミド系重合体を製造する方法を提供することにある。
【００１２】
また、第二の発明の背景技術で述べた方法では、ニトリルヒドラターゼを含む微生物菌体等の触媒作用を阻害する因子を排除して効率よくアクリロニトリルの水和反応をするという観点からは、必ずしも十分な効果が得られない。またアクリルアミド、およびアクリルアミド系重合体の品質向上という観点からもいまだ改善の余地があった。
【００１３】
したがって、第二の発明の目的は、ニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒等により、より効率よく、しかもより高品位なアクリルアミドを製造する方法、およびこのアクリルアミドを用いて、色相に優れ、水溶性と高分子量化が両立した、品質に優れたアクリルアミド系重合体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記第一の発明の課題を解決するために、本発明者らはアミド化合物の製造方法について鋭意検討を行ったところ、ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒を用いて水性媒体中でニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法において、水性媒体中のベンゼン濃度を特定濃度以下に低減することにより、ニトリルヒドラターゼの反応速度を低下させることなくアミド化合物を効率的に製造できることを見出した。なお、水性媒体中のベンゼンは、一般的には原料であるニトリル化合物に由来しているが、他の要因により混入した場合にも、同様の濃度条件に低減することにより、アミド化合物は効率的に製造される。また、上述の方法によりベンゼン濃度を抑制した反応条件下で製造されたアミド化合物を用いて、アミド系重合体を製造することにより、色相に優れたアミド系重合体を得ることができる。
【００１５】
すなわち、第一の発明は、以下の通りである。
[１]ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒の存在下、水性媒体中でニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法において、水性媒体中のベンゼン濃度が４．０ｐｐｍ以下であることを特徴とするアミド化合物の製造方法。
【００１６】
[２]ニトリルヒドラターゼがシュードノカルディア属由来ニトリルヒドラターゼまたはロドコッカス属由来ニトリルヒドラターゼを産生する微生物である[１]記載のアミド化合物の製造方法。
【００１７】
[３]ニトリル化合物がアクリロニトリルまたはメタクリロニトリルである[１]または[２]に記載のアミド化合物の製造方法。
[４][１]に記載のアミド化合物を単独重合、または上記アミド化合物を、アミド化合物と共重合可能な少なくとも一種の不飽和単量体と共重合して、アミド系重合体を製造する方法。
【００１８】
[５]上記アミド化合物がアクリルアミドまたはメタクリルアミドである[４]に記載のアミド系重合体を製造する方法。
また、本発明者らは上記第二の発明の課題を検討し、アクリロニトリル中に含まれるアクロレイン濃度を低減することで、ニトリルヒドラターゼの触媒活性を維持することができ、しかも高品位なアクリルアミドを得ることができ、さらにはこのアクリルアミドにより、色相に優れ、水溶性と高分子量化の両立が可能なアクリルアミド系重合体を得ることができることを見出し、第二の発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、第二の発明のアクリルアミドの製造方法は、
アクロレインの濃度が１ｐｐｍ以下であるアクリルニトリルを、水性媒体中で、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の菌体、またはその菌体処理物により水和反応させることに特徴がある。
【００２０】
上記アクリロニトリル中に含まれる青酸の濃度は５ｐｐｍ以下であることが好ましい。
また、上記アクリロニトリル中に含まれるオキサゾールの濃度が１０ｐｐｍ以下であることも好ましい。
【００２１】
さらに、上記アクリロニトリル中に含まれる青酸の濃度が５ｐｐｍ以下であり、かつオキサゾールの濃度が１０ｐｐｍ以下であることも好ましい。
第二の発明のアクリルアミド系重合体の製造方法は上記アクリルアミドを単独重合、または上記アクリルアミドを、アクリルアミドと共重合可能な少なくとも一種の不飽和単量体と共重合することに特徴がある。
【発明の効果】
【００２２】
第一の発明によれば、ニトリルヒドラターゼを利用した反応において、ニトリル化合物含有水性媒体中のベンゼン濃度を特定濃度以下に低減することにより、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率的に製造することができる。また、上述の方法によりベンゼン濃度を抑制した反応条件下で製造されたアミド化合物を用いてアミド系重合体を製造することにより、色相に優れたアミド系重合体を得ることができる。
【００２３】
また、第二の発明によれば、ニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒等により、より効率よく、しかもより高品位なアクリルアミドを製造できる。また第二の発明によれば、色相に優れ、水溶性と高分子量化が両立した、品質の優れたアクリルアミド系重合体を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
１．第一の発明
以下、第一の発明について詳細に説明する。
第一の発明において使用されるニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒とは、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物である。ここでいうニトリルヒドラターゼとはニトリル化合物を水和する能力を有するたんぱく質である。ニトリルヒドラターゼを産生する微生物としてはノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属、バイテリジューム（Bacteridium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）に属する微生物などが挙げられる。好ましくは、シュードノカルディア属やロドコッカス属に属する微生物が挙げられ、特にシュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardiathermophila）ＪＣＭ３０９５、または、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ−１が好ましい。
【００２５】
また、該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体も第一の発明でいうニトリルヒドラターゼを産生する微生物に含まれる。尚、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌(Bacillussubtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アミド化合物耐性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も第一の発明でいうニトリルヒドラターゼを産生する微生物に含まれる。
【００２６】
上述のニトリルヒドラターゼを産生する微生物を第一の発明の製造方法に使用するに際しては、該微生物の菌体あるいは菌体処理物を用いる。菌体は、分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用して調製すればよい。たとえば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい。）で生育させ、続いて、該微生物を遠心分離によって培養液より分離・回収して得る方法が挙げられる。
【００２７】
また、微生物の菌体処理物とは、その形状に特に制限はなく、上記微生物菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離精製して得られる後分離物、該微生物菌体や該菌体の抽出物・磨砕物・後分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらはニトリルヒドラターゼの活性を有している限りは第一の発明でいう菌体処理物に相当する。
【００２８】
これらニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物は、製造直後に反応に用いることは勿論、製造後に保管し、必要に応じて使用することもできる。
第一の発明におけるニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物は、回分反応に供することもできるし、連続反応に供することもできる。また、反応形式は、懸濁床、固定床、流動床など、微生物の菌体または菌体処理物の形態に応じた、適切な形式を選択すればよい。その際の反応液中での該触媒濃度は、水性媒体とニトリル化合物の混合に支障をきたさない限り特に制限はされるものではない。
【００２９】
第一の発明における水性媒体とは、水、または、リン酸塩等の緩衝剤、硫酸塩や炭酸塩等の無機塩、アルカリ金属の水酸化物、アミド化合物、ニトリル化合物、ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒等を適当な濃度で溶解させた水溶液（反応液全体）を指す。第一の発明では、ニトリル化合物が水溶液に対し飽和濃度内である均一系であっても、飽和濃度以上でニトリル相と水相の二相系であっても、その溶液全体を水性媒体と定義する。なお、本明細書において、第一の発明における水性媒体を「水性媒体(I）」ともいう。二相系の場合は、回転翼やラインミキサーなどの適当な混合装置を使用して、静置下において二相に分離する水相とニトリル相を十分に混和させることも重要である。
【００３０】
第一の発明において、反応時の水性媒体(I)中のニトリル化合物濃度は、水性媒体(I)中のベンゼン濃度によって反応速度の低下を招かない範囲またはニトリル化合物によってニトリルヒドラターゼが失活しない範囲であれば、特に限定されない。好ましくはニトリル化合物の重量％が５０重量％以下である。
【００３１】
第一の発明で使用されるニトリル化合物とは、水性媒体(I)中でニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒によりアミド化合物へ変換される化合物であれば特に限定されない。好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、クロトノニトリル、α−ヒドロキシイソブチロニトリル等の炭素数２〜４のニトリル化合物がその代表例として挙げられる。より好ましくは、アクリロニトリル、メタクリロニトリルが用いられる。
【００３２】
これらニトリル化合物は精製工程を経て市販製品となるが、微量の不純物が含まれている。不純物の一つとしてベンゼンが挙げられ、例えばアクリロニトリルでは、プロピレンのアンモオキシデーション法によって工業的に製造されているが、プロピレンに含有される微量のベンゼンがアクリロニトリル製品中に持ち込まれるなどの理由により、市販のアクリロニトリル製品中にベンゼンが含まれている。
【００３３】
水性媒体(I)中に含まれるベンゼン濃度は反応速度の低下が抑制される濃度であればよく、通常４．０ｐｐｍ以下、好ましくは２．２ｐｐｍ以下である。ここで、反応速度の低下が抑制される範囲とは、水性媒体(I)中に含まれるベンゼン濃度が２．２ｐｐｍ以下の反応で得られる反応速度を１００％として、相対反応速度が８０％以上となる範囲である。また、水性媒体(I)中に含まれるベンゼン濃度が４．０ｐｐｍ以下とは水性媒体(I)の１ｋｇ中に含まれるベンゼンの量が４ｍｇ以下であることを意味している。ニトリル化合物からベンゼンを除去する方法、又は、水性媒体(I)中からベンゼンを除去する方法は、如何なる方法でもよく、例えば、蒸留、活性炭による吸着処理、超強酸であるヘテロポリ酸など固体酸による吸着処理、カラムクロマトグラフィーによる処理、スルホランでの抽出、ベンゼンの資化が可能な微生物による生物的分解、ベンゼンの揮発性を利用したばっ気処理などが挙げられる。
【００３４】
第一の発明における反応は、一般的には常圧下で行われるが、水性媒体(I)中へのアクリル化合物の溶解度を高めるために加圧下で行うこともできる。また、反応温度に関しては特に限定されないが、好ましくは該ニトリルヒドラターゼが失活しない温度範囲であり、さらに好ましくは、０〜５０℃である。一方、ｐＨはニトリルヒドラターゼ活性が維持されている限りは特に制限はないが、好ましくはｐＨ５からｐＨ１０の範囲内である。
【００３５】
第一の発明のアミド系重合体は、上述のようにして得られたアミド化合物を単独重合、またはアミド化合物を、アミド化合物と共重合可能な少なくとも一種の不飽和単量体と共重合することにより、製造できる。ここで、アミド化合物は、第一の発明のアミド化合物の製造方法によって得られたアクリルアミドまたはメタクリルアミドであることが好ましい。
【００３６】
アミド化合物と共重合可能な不飽和単量体としては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸などの不飽和カルボン酸およびそれらの塩；
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸およびそれらの塩；
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレートなどの（メタ）アクリル酸のアルキルアミノアルキルエステル、またはそれらの第４級アンモニウム誘導体；
Ｎ−Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドなどのN−N−ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、またはそれらの４級アンモニウム誘導体；
アセトンアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−プロピルアクリルアミドなどの親水性アクリルアミド；
Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン；
ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート；
メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン；メタクリルアミド；
Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキシルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキシルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクチルメタクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−ドデシルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ドデシルメタクリルアミドなどのＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド誘導体；
Ｎ，Ｎ−ジグリシジルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジグリシジルメタクリルアミド、Ｎ−（４−グリシドキシブチル）アクリルアミド、Ｎ−（４−グリシドキシブチル）メタクリルアミド、Ｎ−（５−グリシドキシペンチル）アクリルアミド、Ｎ−（６−グリシドキシヘキシル）アクリルアミドなどのＮ−（ω−グリシドキシアルキル）（メタ）アクリルアミド誘導体；
メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリレート誘導体；
アクリロニトリル、メタクリロニトリル、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、ブテン等のオレフィン類、スチレン、α−メチルスチレン、ブタジエン、イソプレンなどが挙げられる。
【００３７】
これら単量体は、１種単独で用いてもよいが、２種以上併用してもよい。
これら単量体の重合方法としては、例えば、水溶液重合、乳化重合などがある。
これらの中でも水溶液重合の場合は、通常、アミド化合物と必要に応じて添加する不飽和単量体との合計濃度が５〜９０重量％である。
【００３８】
重合開始剤としては例えば、ラジカル重合開始剤を用いることができる。
ラジカル重合開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過酸化水素、過酸化ベンゾイル等の過酸化物；アゾビスイソブチロニトリル、２・２'−アゾビス（４−アミジノプロパン）２塩酸塩、４・４'−アゾビス（４−シアノバレリアン酸ナトリウム）などのアゾ系遊離基開始剤；上記過酸化物と重亜硫酸ナトリウム、トリエタノールアミン、硫酸第一鉄アンモニウム等の還元剤を併用するいわゆるレドックス系触媒が挙げられる。
【００３９】
上記した重合開始剤は１種単独で用いてもよいが、２種以上併用してもよい。重合開始剤の量は、通常、単量体の総重量に対し、０．００１〜５重量％の範囲である。
重合温度は単一重合開始剤の場合には、通常０〜１２０℃の範囲であり、より好ましくは５〜９０℃の範囲である。また、重合温度は常に一定の温度に保つ必要はなく、重合の進行に伴い適宜変更してもよいが、通常は重合の進行に伴い、重合熱が発生して重合温度が上昇する傾向にあるため、必要に応じ、冷却する場合もある。
【００４０】
重合時の雰囲気は特に限定はないが、重合を速やかに進行する観点からは、例えば窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気下で重合することが好ましい。
重合時間は特に限定はないが、通常１〜２０時間の範囲である。
【００４１】
また重合時の水溶液のｐＨも特に限定はないが、必要に応じｐＨを調整して重合してもよい。その場合使用可能なｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどのアルカリ；リン酸、硫酸、塩酸などの鉱酸；蟻酸、酢酸等の有機酸などが挙げられる。
【００４２】
第一の発明により得られる重合体の分子量は特に制限はないが、通常１０万〜５０００万の範囲であり、好ましくは５０万〜３０００万の範囲である。
この様にして得られた第一の発明のアミド系重合体は、水溶性と高分子量化が両立された重合体であり、しかも色相に優れたものであり、凝集剤、製紙用添加剤、石油回収剤、などとして好適に使用することができる。
【００４３】
２．第二の発明
以下、第二の発明について詳細に説明する。
まず第二の発明のアクリルアミドの製造方法に用いる原料について説明する。
【００４４】
〔アクリロニトリル〕
第二の発明では、アクロレインの濃度が１ｐｐｍ以下のアクリロニトリルを用いる。ここで、アクロレインの濃度が１ｐｐｍ以下のアクリロニトリルとは、第二の発明の原料として用いるアクリロニトリルの１ｋｇ中に含まれるアクロレインの量が１ｍｇ以下であることを意味している。
【００４５】
アクリロニトリル中に含まれている、アクロレインの濃度を１ｐｐｍ以下とする方法については、アセチルアセトン等とアクリロニトリル中のアクロレインとを反応させ、蒸留等により、その反応生成物とアクリロニトリルを分離する方法、１級および／または２級アミノ基を交換基として有するポーラス形イオン交換樹脂と接触させることによりアクリロニトリル中のアクロレインを除去する方法、１級および／または２級アミノ官能基を有するゲル型の弱塩基性イオン交換樹脂と接触させることによりアクリロニトリル中のアルデヒド類、実質的にアクロレインを低減させる方法が挙げられる。
【００４６】
アクリロニトリル中に含まれるアクロレインの濃度は、ガスクロマトグラフ法、高速液体クロマトグラフ法などで定量することができる。
第二の発明において、原料アクリロニトリル中のアクロレインの濃度は１ｐｐｍ以下であるが、０．５ｐｐｍ以下がより好ましい。
【００４７】
アクロレインの濃度が上記範囲内にあると、ニトリルヒドラターゼによる触媒作用に対して、アクロレインの反応阻害が起こらず、かつ、得られたアクリルアミドを用いて、色相に優れ、水溶性と高分子量化が両立した、品質に優れたアクリルアミド系重合体の製造が可能となる。
【００４８】
第二の発明で用いるアクリロニトリルに含まれるアクロレインの濃度は１ｐｐｍ以下であるが、さらにこのアクリロニトリルニトリル中に含まれる青酸の濃度が５ｐｐｍ以下であることが好ましい。
【００４９】
ここで、アクリロニトリル中に含まれる青酸の濃度が５ｐｐｍ以下とは、第二の発明の原料として用いるアクリロニトリルの１ｋｇ中に含まれる青酸の量が５ｍｇ以下であることを意味している。
【００５０】
アクリロニトリル中に含まれている、青酸の濃度を１ｐｐｍ以下とする方法については、例えば特開平１１−１２３０９８号公報に記載されているように、青酸を金属錯体として除く方法、イオン交換樹脂を用いる方法、アルカリ条件下でアクリロニトリルに青酸を付加する方法などが挙げられる。
【００５１】
また、アクリロニトリル中に含まれる青酸の濃度は、アルカリ溶液で抽出したあと硝酸銀を用いた滴定法により求めることができる。
第二の発明において、アクリロニトリル中の青酸の濃度は５ｐｐｍ以下が好ましいが、３ｐｐｍ以下がより好ましく、１ｐｐｍ以下がさらに好ましい。
【００５２】
さらに第二の発明においては、アクリロニトリルに含まれるアクロレインの濃度は１ｐｐｍ以下であることに加えて、アクリロニトリルニトリル中に含まれるオキサゾールの濃度が１０ｐｐｍ以下であることも好ましい。
【００５３】
ここで、アクリロニトリル中に含まれるオキサゾールの濃度が１０ｐｐｍ以下とは、第二の発明の原料として用いるアクリロニトリルの１ｋｇ中に含まれるオキサゾールの量が１０ｍｇ以下であることを意味している。
【００５４】
アクリロニトリル中に含まれている、オキサゾールの濃度を１０ｐｐｍ以下とする方法については、例えば、特開昭６３−１１８３０５号公報記載の、アクリロニトリル中のオキサゾールを、Ｈ型のカチオン交換樹脂と接触させる方法を挙げることができる。
【００５５】
またアクリロニトリル中に含まれるオキサゾールの濃度は、ガスクロマトグラフ法、高速液体クロマトグラフ法などで定量することができる。
第二の発明において、アクリロニトリル中のオキサゾールの濃度は１０ｐｐｍ以下が好ましいが、５ｐｐｍ以下がより好ましく、１ｐｐｍ以下がさらに好ましい。
【００５６】
また第二の発明においては、第二の発明で用いるアクリロニトリルに含まれるアクロレインの濃度が上記範囲内であり、青酸の濃度が５ｐｐｍ以下、好ましくは３ｐｐｍ以下、より好ましくは１ｐｐｍ以下、かつ、オキサゾールの濃度が１０ｐｐｍ以下、好ましくは５ｐｐｍ以下、より好ましくは１ｐｐｍ以下であることが好ましい。
【００５７】
〔ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体等〕
第二の発明では上記アクリロニトリルを原料とし、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体およびその菌体処理物等を触媒として水和反応することで、第二の発明のアクリルアミドを得ることができる。
【００５８】
第二の発明でニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力をもつ酵素をいう。ここで、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物としては、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力を有するニトリルヒドラターゼを産生し、かつアクリルアミド水溶液中でニトリルヒドラターゼの活性を保持している微生物であれば、特に制限されるものではない。
【００５９】
具体的には、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム( Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物を好適な例として挙げることができる。
【００６０】
また、該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体も第二の発明でいう微生物に含まれる。なお、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、特に大腸菌に限定されるのものではなく、枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アクリルアミド耐性やアクリロニトリル耐性、温度耐性をさらに向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も、第二の発明でいう微生物に含まれる。
【００６１】
上記したような微生物を用い、アミド化合物を製造するに際しては通常、該微生物の菌体あるいは菌体処理物を用いる。菌体は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用して調製すればよい。例えば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい）で生育させ、続いて、該微生物を遠心分離によって培養液より分離、回収して得る方法が挙げられる。
【００６２】
また、第二の発明における微生物の菌体処理物は、上記微生物菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離精製して得られる後分離物、該微生物菌体や該菌体の抽出物、磨砕物、後分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらはニトリルヒドラターゼの活性を有している限りは第二の発明の菌体処理物に相当するものである。これらは、単一の種類を用いてもよいし、２種類以上の異なる形態のものを同時あるいは交互に用いてもよい。
【００６３】
〔水性媒体〕
また、第二の発明における水性媒体とは、水、またはリン酸塩等の緩衝剤、硫酸塩や炭酸塩等の無機塩、アルカリ金属の水酸化物、もしくはアミド化合物等を適当な濃度で溶解させた水溶液をいう。なお、本明細書において、第二の発明における水性媒体を「水性媒体(II）」ともいう。
【００６４】
〔反応条件〕
第二の発明において、水性媒体(II)中のアクリロニトリルの濃度は、反応開始時において該ニトリル化合物の飽和濃度以上の濃度である。その濃度の上限は特に制限されるものではないが、あまりに大過剰のニトリル化合物の供給は、反応を完結させるために多くの触媒量および過大な容積をもつ反応器、および除熱のための過大な熱交換器等が必要となり、設備面での経済的負担が大きくなる。このため、アクリロニトリルの供給濃度としては、それが全て対応するアクリルアミドに転化したときにその理論的な生成液濃度が、アクリルアミドの場合は４０〜８０重量％の範囲となるように、より具体的には水１重量部に対しアクリロニトリル０．４〜１．５重量部の範囲で供給することが好ましい。
【００６５】
また、上記反応での反応時間は触媒使用量や温度等の条件にも左右され得るが、通常は１〜８０時間の範囲であり、好ましくは２〜４０時間の範囲である。
反応形式については、特に限定するものではなく、回分式、半回分式でもよいし、連続式の反応を行ってもよい。また、懸濁床、固定床、移動床などいずれでもよいが、通常は撹拌機を備えた槽型反応器、プラグフロー反応器での反応がより好ましく、また、複数の形式の反応器を組み合わせてもよい。
【００６６】
触媒の使用量については、反応条件や触媒の種類、およびその形態にも依存するが、通常は該微生物乾燥菌体重量換算で、反応液の重量に対し、１０〜５００００ｐｐｍ、好ましくは５０〜３００００ｐｐｍである。
【００６７】
また、水和反応は通常は常圧あるいは常圧近辺で行われるが、水性媒体(II)中へのニトリル化合物の溶解度を高めるために加圧下で行うこともできる。また、反応温度に関しては、水性媒体(II)の氷点以上であれば特に制限されるものではないが、通常は０〜５０℃の範囲で行うのが好ましく、より好ましくは１０〜４０℃の範囲である。また、生成物が反応液中に晶出したスラリー状態でも反応を行うことができる。また、上記水和反応時における反応液のｐＨは、ニトリルヒドラターゼ活性が維持されている限りは特に制限されるものではないが、好ましくはｐＨ６〜１０の範囲であり、より好ましくはｐＨ７〜９の範囲である。
【００６８】
また、ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得を部位特異的な変異によって行うことも可能であるが、特定の変異点と置換される塩基の種類に基づいて、部位特異的な変異以外の方法で組替えプラスミドを構築し、それを宿主細胞に導入することでも、同様の結果を得ることが可能である。
【００６９】
例えば、変異点に相当する領域のＤＮＡの塩基配列がアミノ酸置換後の配列となるような塩基配列を有するＤＮＡフラグメントをＤＮＡシンセサイザー等で合成し、得られたフラグメントと別途分離しておいたｐＰＴ−ＤＢ１の該フラグメントに相当する領域とを置換することにより、目的とする組替えプラスミドを取得することができる。
【００７０】
〔アクリルアミド系重合体の製造〕
第二の発明のアクリルアミド系重合体は、上述のようにして得られたアクリルアミドを単独重合、またはアクリルアミドを、アクリルアミドと共重合可能な少なくとも一種の不飽和単量体と共重合することにより、製造できる。
【００７１】
アクリルアミドと共重合可能な不飽和単量体としては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸などの不飽和カルボン酸およびそれらの塩；
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸およびそれらの塩；
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレートなどの（メタ）アクリル酸のアルキルアミノアルキルエステル、またはそれらの第４級アンモニウム誘導体；
Ｎ−Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドなどのN−N−ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、またはそれらの４級アンモニウム誘導体；
アセトンアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−プロピルアクリルアミドなどの親水性アクリルアミド；
Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン；
ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート；
メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン；メタクリルアミド；
Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキシルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキシルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクチルメタクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−ドデシルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ドデシルメタクリルアミドなどのＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド誘導体；
Ｎ，Ｎ−ジグリシジルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジグリシジルメタクリルアミド、Ｎ−（４−グリシドキシブチル）アクリルアミド、Ｎ−（４−グリシドキシブチル）メタクリルアミド、Ｎ−（５−グリシドキシペンチル）アクリルアミド、Ｎ−（６−グリシドキシヘキシル）アクリルアミドなどのＮ−（ω−グリシドキシアルキル）（メタ）アクリルアミド誘導体；
メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリレート誘導体；
アクリロニトリル、メタクリロニトリル、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、ブテン等のオレフィン類、スチレン、α−メチルスチレン、ブタジエン、イソプレンなどが挙げられる。
【００７２】
これら単量体は、１種単独で用いてもよいが、２種以上併用してもよい。
これら単量体の重合方法としては、例えば、水溶液重合、乳化重合などがある。
これらの中でも水溶液重合の場合は、通常、アクリルアミドと必要に応じて添加する不飽和単量体との合計濃度が５〜９０重量％である。
【００７３】
重合開始剤としては例えば、ラジカル重合開始剤を用いることができる。
ラジカル重合開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過酸化水素、過酸化ベンゾイル等の過酸化物；アゾビスイソブチロニトリル、２・２'−アゾビス（４−アミジノプロパン）２塩酸塩、４・４'−アゾビス（４−シアノバレリアン酸ナトリウム）などのアゾ系遊離基開始剤；上記過酸化物と重亜硫酸ナトリウム、トリエタノールアミン、硫酸第一鉄アンモニウム等の還元剤を併用するいわゆるレドックス系触媒が挙げられる。
【００７４】
上記した重合開始剤は１種単独で用いてもよいが、２種以上併用してもよい。重合開始剤の量は、通常、単量体の総重量に対し、０．００１〜５重量％の範囲である。
重合温度は単一重合開始剤の場合には、通常０〜１２０℃の範囲であり、より好ましくは５〜９０℃の範囲である。また、重合温度は常に一定の温度に保つ必要はなく、重合の進行に伴い適宜変更してもよいが、通常は重合の進行に伴い、重合熱が発生して重合温度が上昇する傾向にあるため、必要に応じ、冷却する場合もある。
【００７５】
重合時の雰囲気は特に限定はないが、重合を速やかに進行する観点からは、例えば窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気下で重合することが好ましい。
重合時間は特に限定はないが、通常１〜２０時間の範囲である。
【００７６】
また重合時の水溶液のｐＨも特に限定はないが、必要に応じｐＨを調整して重合してもよい。その場合使用可能なｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどのアルカリ；リン酸、硫酸、塩酸などの鉱酸；蟻酸、酢酸等の有機酸などが挙げられる。
【００７７】
第二の発明により得られる重合体の分子量は特に制限はないが、通常１０万〜５０００万の範囲であり、好ましくは５０万〜３０００万の範囲である。
この様にして得られた第二の発明のアクリルアミド系重合体は、水溶性と高分子量化が両立された重合体であり、しかも色相に優れたものであり、凝集剤、製紙用添加剤、石油回収剤、などとして好適に使用することができる。
【００７８】
［実施例］
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７９】
１．第一の発明の実施例
なお、ベンゼン濃度の測定は、ガスクロ分析に拠った。ガスクロ分析の測定カラムは化学物質評価研究機構 Ｇ−９５０ １．２ｍｍ×４０ｍ（２５μｍ）を用い、キャリヤガスとしてＨｅを使用、ＦＩＤ検出器により検出した。
【００８０】
また、各実施例及び比較例におけるＨＰＬＣ分析は、カラムとして日本分光製のＦｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ Ｃ１８−５（２５０×４．６φｍｍ）を用い、４体積％のアセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用した。また、アクリルアミド、メタクリルアミドは２２０ｎｍの吸光度により検出した。
【００８１】
［製造例１−１］
反応容器に活性炭（内部表面積１０００ｍ２／ｋｇ）１ｋｇを有する活性炭固定床吸着剤を装入した。ベンゼン濃度が２６ｐｐｍのアクリロニトリルａを温度１０℃、および流速２００ｍ／ｈｒで下方から上方へポンプで送って吸着剤を通過させた。通過後の該アクリロニトリル中のベンゼン濃度を測定した結果、ベンゼン濃度は４．０ｐｐｍであった。以後、活性炭吸着処理後のアクリロニトリルをアクリロニトリルｂと呼ぶ。
［製造例１−２］
含有するベンゼン濃度が１１ｐｐｍであるアクリロニトリルｃをそのまま用いた。
［製造例１−３］
含有するベンゼン濃度が８ｐｐｍであるメタクリロニトリルをそのまま用いた。
【００８２】
菌体の調製
［調製例１−１］
シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５由来ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の培養
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに培地組成１−１に示す組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌後、終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加したものを３０本用意した。各々のバッフル付三角フラスコにＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５）を一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。各バッフル付三角フラスコ中の培養液を一まとめにしたのち、遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００８３】
［培地組成１−１］
５．０ｇ／Ｌ 酵母エキストラクト
１０．０ｇ／Ｌ ポリペプトン
５．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ
１０．０ｍｇ／Ｌ 塩化コバルト・六水和物
４０．０ｍｇ／Ｌ 硫酸第二鉄・七水和物
ｐＨ７．５
【００８４】
［調製例１−２］
ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株由来ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の培養
特公平０６−５５１４８号記載のロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として、前記の寄託機関に特許手続き上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されており、万人に対し請求により分譲される）を用いて、湿菌体を得た。
【００８５】
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに培地組成１−２に示す組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に特公平０６−５５１４８号記載のロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として、前記の寄託機関に特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されており、万人に対し請求により分譲される）を一白菌耳植菌し、３０℃・１３０ｒｐｍにて７２時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００８６】
［培地組成１−２］
１０．０ｇ／Ｌ グルコース
０．５ｇ／Ｌ リン酸二水素一カリウム
０．５ｇ／Ｌ リン酸一水素二カリウム
０．５ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム・七水和物
１．０ｇ／Ｌ 酵母エキストラクト
７．５ｇ／Ｌ ペプトン
７．５ｇ／Ｌ 尿素
１０．０ｍｇ／Ｌ 塩化コバルト・六水和物
ｐＨ７．２
【００８７】
［実施例１−１］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（１）
調製例１−１で得られた湿菌体を２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）により適当に希釈し、これに製造例１−１に記載したアクリロニトリルｂを、反応液全体のアクリロニトリル濃度が２０重量％となるよう添加し、２０℃で１０分間反応させた。このとき、水性媒体(I)（反応液全体）中のベンゼン濃度は、０．８ｐｐｍである。反応後、反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度をＨＰＬＣ分析により測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。結果を表１−１に示す。得られた反応速度を１００％として、実施例１−２及び実施例１−３、比較例１−１、比較例１−２と比較した。
【００８８】
［実施例１−２］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（２）
調製例１−１で得られた湿菌体を２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）により適当に希釈し、これに製造例１−２に記載したアクリロニトリルｃを２０重量％となるよう添加して２０℃で１０分間反応させた。このとき、水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、２．２ｐｐｍであった。以下実施例１−１と同様に操作した。結果を表１−１に示す。
【００８９】
［実施例１−３］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（３）
製造例１−１記載のアクリロニトリルｂにベンゼンを添加し、アクリロニトリル中のベンゼン濃度が２０ｐｐｍとなるよう調製した。使用するアクリロニトリルを該アクリロニトリルへ代えて、実施例１−１と同様に操作した。このとき、水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、４．０ｐｐｍである。結果を表１−１に示す。
【００９０】
［比較例１−１］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（１）
使用するアクリロニトリルを製造例１−１記載のアクリロニトリルａへ代えて、実施例１−１と同様に操作した。このとき、水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、５．２ｐｐｍであった。結果を表１−１に示す。
【００９１】
［比較例１−２］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（２）
製造例１−１記載のアクリロニトリルｂにベンゼンを添加し、アクリロニトリル中のベンゼン濃度が２６ｐｐｍとなるよう調製した。使用するアクリロニトリルを該アクリロニトリルへ代えて、実施例１−１と同様に操作した。このとき、水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、５．２ｐｐｍである。結果を表１−１に示す。
【００９２】
表１−１より、水性媒体(I)中のベンゼン濃度を４．０ｐｐｍ以下にすることによって反応速度の低下を抑制でき、かつ、反応速度の低下を招く原因物質がベンゼンであることがわかる。
【００９３】
［実施例１−４］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（４）
使用する湿菌体を調製例１−２で得られた湿菌体へ代えて、実施例１−１と同様に操作した。結果を表１−２に示す。得られた反応速度を１００％として、実施例１−５、比較例１−３と比較した。
【００９４】
［実施例１−５］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（５）
使用する湿菌体を調製例１−２で得られた湿菌体へ代えて、実施例１−３と同様に操作した。結果を表１−２に示す。
【００９５】
［比較例１−３］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（３）
使用する湿菌体を調製例１−２で得られた湿菌体へ代えて、比較例１−１と同様に操作した。結果を表１−２に示す。
【００９６】
［実施例１−６］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（６）
調製例１−１で得られた湿菌体を２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）により適当に希釈し、これに製造例１−３に記載したメタクリロニトリルを２０重量％となるよう添加して２０℃で１０分間反応させた。この際、水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、１．６ｐｐｍである。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したメタクリルアミド濃度をＨＰＬＣ分析により測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのメタクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。結果を表１−３に示す。得られた反応速度を１００％として、実施例１−７、比較例１−４と比較した。
【００９７】
［実施例１−７］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（７）
製造例１−３で記載したメタクリロニトリルにベンゼンを添加し、メタクリロニトリル中のベンゼン濃度が２０ｐｐｍとなるよう調製した。使用するメタクリロニトリルを該メタクリロニトリルへ代えて、実施例１−６と同様に操作した。このときの水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、４．０ｐｐｍである。結果を表１−３に示す。
【００９８】
［比較例１−４］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（４）
製造例１−３で記載したメタクリロニトリルにベンゼンを添加し、メタクリロニトリル中のベンゼン濃度が２５ｐｐｍとなるよう調製した。使用するメタクリロニトリルを該メタクリロニトリルへ代えて、実施例１−６と同様に操作した。このときの水性媒体(I)中のベンゼン濃度は、５．０ｐｐｍである。結果を表１−３に示す。
【００９９】
［実施例１−８］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（８）
使用する湿菌体を調製例１−２で得られた湿菌体へ代えて、実施例１−６と同様に操作した。結果を表１−４に示す。得られた反応速度を１００％として、実施例１−９、比較例１−５と比較した。
【０１００】
［実施例１−９］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（９）
使用する湿菌体を調製例１−２で得られた湿菌体へ代えて、実施例１−７と同様に操作した。結果を表１−４に示す。
【０１０１】
［比較例１−５］
ニトリル化合物のアミド化合物への変換（５）
使用する湿菌体を調製例１−２で得られた湿菌体へ代えて、比較例１−４と同様に操作した。結果を表１−４に示す。
【０１０２】
【表１−１】
【０１０３】
使用ニトリル化合物：アクリロニトリル
使用菌体：シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ含有微生物菌体
【０１０４】
【表１−２】
【０１０５】
使用ニトリル化合物：アクリロニトリル
使用菌体：ロドコッカス・ロドクロウス由来ニトリルヒドラターゼ含有微生物菌体
【０１０６】
【表１−３】
【０１０７】
使用ニトリル化合物：メタクリロニトリル
使用菌体：シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ含有微生物菌
体
【０１０８】
【表１−４】
【０１０９】
使用ニトリル化合物：メタクリロニトリル
使用菌体：ロドコッカス・ロドクロウス由来ニトリルヒドラターゼ含有微生物菌体
【０１１０】
［実施例１−１０］
アクリルアミドの製造
第１反応器として攪拌器を備えた１Lガラス製フラスコ、第二反応器として内径５ｍｍのテフロン（登録商標）製チューブ２０ｍを準備した。第一反応器には、予め４００ｇの水を仕込んだ。
【０１１１】
特開２００１−３４００９１号に記載の方法に従い、ニトロリルヒドラターゼを含む菌体の培養を行い、得られた湿菌体を０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に懸濁した。この懸濁液とアクリロニトリルｂとを、おのおの４９ｇ／ｈ、３１ｇ／ｈの速度で、攪拌を行いながら、第１反応器に連続的にフィードした。さらに、第１反応器の液面レベルを一定に保つように、反応液を第１反応器から８０ｇ／ｈの速度で連続的に抜き出した。この抜き出した液を８０ｇ／ｈの速度で第２反応器に連続的にフィードして、第２反応器内でさらに反応を進行させた。
【０１１２】
第１反応器および第２反応器とも１０〜２０℃の温度の水浴中に浸漬し、各反応器内部の液温が１５℃となるように温度制御を行った。
湿菌体の０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対する添加量を、第１反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が９０％以上となり、かつ第二反応器出口でのアクリルニトリル濃度が検出限界以下（１００ppm以下）となるように調整した。アクリルアミドへの転化率はＨＰＬＣの分析結果から求めた。
その結果、０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対し、湿菌体２．５重量％で、目的の転化率を達成できた。
【０１１３】
〔比較例１−６〕
使用するアクリロニトリルをアクリロニトリルaへ代えて、実施例１−１０と同様の操作を行った。その結果、目的の転化率を達成するために必要な湿菌体の添加量は、０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対し、湿菌体３．０重量％であった。湿菌体の添加量は実施例１−１０よりも多く、ベンゼンの反応阻害が確認された。
【０１１４】
〔比較例１−７〕
アクリロニトリルｂにベンゼンを添加し、アクリロニトリル中のベンゼン濃度が２６ｐｐｍとなるよう調整した。使用するアクリロニトリルを該アクリロニトリルへ代えて、実施例１−１０と同様の操作を行った。その結果、目的の転化率を達成するために必要な湿菌体の添加量は、０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対し、湿菌体３．０重量％であった。湿菌体の添加量は実施例１−１０よりも多く、ベンゼンの反応阻害が確認された。
【０１１５】
〔実施例１−１１〕
実施例１−１０の反応液を、酸性下（ＰＨ＝５）で活性炭により処理してから湿菌体を除去し、さらに、１Ｎ−ＮａＯＨにより中和して５０重量％のアクリルアミド水溶液を得た。
【０１１６】
得られたアクリルアミド水溶液に水を加えて濃度２０重量％のアクリルアミド水溶液とした。この２０重量％アクリルアミド水溶液５００ｇを１ｌポリエチレン容器に入れ、１８℃に保ちながら、窒素を通じて液中の溶存酸素を除き、直ちに、発泡スチロール製の保温用ブロックの中に入れた。
【０１１７】
ついで、２００×１０-6ｍｐｍ（アクリルアミドに対するモル比）の４，４'−アゾビス（４−シアノバレリアン酸ナトリウム）、２００×１０-6ｍｐｍのジメチルアミノプロピオニトリル、および８０×１０-6ｍｐｍの過硫酸アンモニウムを各々小量の水に溶解して、この順序に１ｌポリエチレン容器中に素早く注入した。これらの試薬には、予め窒素ガスを通じておき、また、注入およびその前後には、上記ポリエチレン容器にも少量の窒素ガスを通じ、酸素ガスの混入を防止した。
【０１１８】
試薬を注入すると、数分間の誘導期の後、ポリエチレン容器の内部の温度が上昇するのが認められたので窒素ガスの供給をとめた。約１００分間、保温用ブロック中で、そのままの状態でポリエチレン容器を保持したところ、ポリエチレン容器の内部の温度が約７０℃に達した。そこで、ポリエチレン容器を保温用ブロックから取りだし、９７℃の水に２時間浸漬しさらに重合反応を進めた。その後冷水に浸漬して冷却し、重合反応を停止した。
【０１１９】
このようにして得られたアクリルアミドポリマーの含水ゲルをポリエチレン容器から取り出し、小塊にわけ、肉挽器ですりつぶした。このすりつぶしたアクリルアミドポリマーの含水ゲルを、１００℃の熱風で２時間乾燥し、さらに、高速回転刃粉砕器で粉砕して乾燥粉末状のアクリルアミドポリマーを得た。得られた乾燥粉末状のアクリルアミドポリマーを篩にかけ、３２〜４２メッシュのものを分取し、以後の試験に供するポリマーサンプルとした。
【０１２０】
〔比較例１−８〕
実施例１−１１と同様にして、比較例１−６で得られた反応液から２０重量％アクリルアミド水溶液を得て、さらに、このアクリルアミド水溶液を重合してポリマ−サンプルを得た。
【０１２１】
〔比較例１−９〕
実施例１−１１と同様にして、比較例１−７で得られた反応液から２０重量％アクリルアミド水溶液を得て、さらに、このアクリルアミド水溶液を重合してポリマ−サンプルを得た。
【０１２２】
＜アクリルアミドポリマーの試験法＞
上記実施例１−１１、比較例１−８、比較例１−９で得られたポリマーサンプルの色調の評価を以下の方法で行った。
水溶性：水溶性は、１ ｌビーカーに水６００ｍｌを入れ、定められた形状の攪拌羽根を用いて２５℃で攪拌しながらポリマーサンプル０．６６ｇ（純分０．６ｇ）を添加し、４００ｒｐｍで２時間攪拌を行い、得られた溶液を１５０メッシュの金網で濾過し、不溶解分の多少と濾過性から、水溶性を判断した。即ち、完溶のものを◎、完溶に近いものを○、不溶解分があるが、それを濾別する事ができるものを△、濾液の通過が遅く、不溶解分の濾過が事実上出来ないものを×とした。
色調：ポリマーの色調についてはポリマ−粉体を目視で評価した。
評価結果を表１−５に示した。
【０１２３】
【表１−５】
【０１２４】
２．第二の発明の実施例
以下、特に断りのない限り、％、ppmは重量基準である。
【０１２５】
〔実施例２−１〕
［ニトロリルヒドラターゼを含む菌体の培養］
特開２００１−３４００９１号に記載の方法に従い、ニトロリルヒドラターゼを含む菌体の培養を行い、湿菌体を得た。
【０１２６】
［アクリロニトリルの精製］
１級および／または２級アミノ基を有する樹脂ダイヤイオンＷＡ−２０（商品名、三菱化成社製）０．３ｌを水洗したのち、内径４０ｍｍ、長さ４００ｍｍのＳＵＳ−３０４製カラムに充填した。このカラムにアクロレイン２ｐｐｍを含むアクリロニトリルを６ ｌ／ｈｒの流量で通液した。カラム通液後の精製アクリロニトリルのアクロレイン濃度を、下記の高速液体クロマトグラフ法（検出下限０．１ppm）にて測定したところ、０．９ｐｐｍであった。
【０１２７】
分析条件：
高速液体クロマトグラフ装置：ＬＣ−６Ａシステム（株式会社島津製作所製）
（ＵＶ検出器波長210nm、カラム温度40℃）
分離カラム ：Ｌ−Column ODS Type-Waters
（（財）化学品検査協会製）
（カラムサイズ：4.6mm×250mm）
溶離液 ：20%（容積基準）−アセトニトリル水溶液
（リン酸にてpH2.5に調整）
【０１２８】
［アクリルアミドの製造］
第１反応器として攪拌器を備えた１Lガラス製フラスコ、第二反応器として内径５ｍｍのテフロン（登録商標）製チューブ２０ｍを準備した。第一反応器には、予め４００ｇの水を仕込んだ。
【０１２９】
上記の培養方法で得られた湿菌体を０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に懸濁した。この懸濁液とアクリロニトリルとを、おのおの４９ｇ／ｈ、３１ｇ／ｈの速度で、攪拌を行いながら、第１反応器に連続的にフィードした。さらに、第１反応器の液面レベルを一定に保つように、反応液を第１反応器から８０ｇ／ｈの速度で連続的に抜き出した。この抜き出した液を８０ｇ／ｈの速度で第２反応器に連続的にフィードして、第２反応器内でさらに反応を進行させた。
【０１３０】
第１反応器および第２反応器とも１０〜２０℃の温度の水浴中に浸漬し、各反応器内部の液温が１５℃となるように温度制御を行った。
湿菌体の０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対する添加量を、第１反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が９０％以上となり、かつ第二反応器出口でのアクリルニトリル濃度が検出限界以下（１００ppm以下）となるように調整した。アクリルアミドへの転化率はＨＰＬＣの分析結果から求めた。
その結果、０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対し、湿菌体２．５重量％で、目的の転化率を達成できた。
【０１３１】
〔比較例２−１〕
原料アクリロニトリルをイオン交換処理しないで用いた以外は、実施例２−１と同様の操作を行った。その結果、目的の転化率を達成するために必要な湿菌体の添加量は、０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対し、湿菌体２．８重量％であった。湿菌体の添加量は実施例２−１よりも多く、アクロレインの反応阻害が確認された。
【０１３２】
〔比較例２−２〕
実施例２−１で得られた精製アクリロニトリルにアクロレインを添加し、アクリロニトリル中のアクロレイン濃度が２ｐｐｍとなるよう調整した。このアクリロニトリルを使用して、実施例２−１と同様にアクリルアミドの製造を実施した。その結果、目的の転化率を達成するために必要な湿菌体の添加量は、０．３ｍＭ−ＮａＯＨ水溶液に対し、湿菌体２．８重量％であった。湿菌体の添加量は実施例２−１よりも多く、アクロレインの反応阻害が確認された。
【０１３３】
〔実施例２−２〕
実施例２−１の反応液を、酸性下（ＰＨ＝５）で活性炭により処理してから湿菌体を除去し、さらに、１Ｎ−ＮａＯＨにより中和して５０重量％のアクリルアミド水溶液を得た。
【０１３４】
得られたアクリルアミド水溶液に水を加えて濃度２０重量％のアクリルアミド水溶液とした。この２０重量％アクリルアミド水溶液５００ｇを１Lポリエチレン容器に入れ、１８℃に保ちながら、窒素を通じて液中の溶存酸素を除き、直ちに、発泡スチロール製の保温用ブロックの中に入れた。
【０１３５】
ついで、２００×１０-6ｍｐｍ（アクリルアミドに対するモル比）の４，４'−アゾビス（４−シアノバレリアン酸ナトリウム）、２００×１０-6ｍｐｍのジメチルアミノプロピオニトリル、および８０×１０-6ｍｐｍの過硫酸アンモニウムを各々小量の水に溶解して、この順序に１ｌポリエチレン容器中に素早く注入した。これらの試薬には、予め窒素ガスを通じておき、また、注入およびその前後には、上記ポリエチレン容器にも少量の窒素ガスを通じ、酸素ガスの混入を防止した。
【０１３６】
試薬を注入すると、数分間の誘導期の後、ポリエチレン容器の内部の温度が上昇するのが認められたので窒素ガスの供給をとめた。約１００分間、保温用ブロック中で、そのままの状態でポリエチレン容器を保持したところ、ポリエチレン容器の内部の温度が約７０℃に達した。そこで、ポリエチレン容器を保温用ブロックから取りだし、９７℃の水に２時間浸漬しさらに重合反応を進めた。その後冷水に浸漬して冷却し、重合反応を停止した。
【０１３７】
このようにして得られたアクリルアミドポリマーの含水ゲルをポリエチレン容器から取り出し、小塊にわけ、肉挽器ですりつぶした。このすりつぶしたアクリルアミドポリマーの含水ゲルを、１００℃の熱風で２時間乾燥し、さらに、高速回転刃粉砕器で粉砕して乾燥粉末状のアクリルアミドポリマーを得た。得られた乾燥粉末状のアクリルアミドポリマーを篩にかけ、３２〜４２メッシュのものを分取し、以後の試験に供するポリマーサンプルとした。
【０１３８】
〔実施例２−３〕
実施例２−１の反応で用いた精製アクリロニトリルを、さらに、６ｌ／ｈｒの流量で、水洗した０．３ｌのダイヤイオンWA−２０を充填した内径４０ｍｍ、長さ４００ｍｍのＳＵＳ−３０４製カラムに通液した。カラム通液後の精製アクリロニトリル中のアクロレイン濃度は０．４ｐｐｍであった。
【０１３９】
このアクリロニトリルを使用し、実施例２−１および実施例２−２と同様にして、２０重量％アクリルアミド水溶液を得て、さらにこのアクリルアミド水溶液を重合してポリマーサンプルを得た。
【０１４０】
〔比較例２−３〕
実施例２−２と同様にして、比較例２−１で得られた反応液から２０重量％アクリルアミド水溶液を得て、さらに、このアクリルアミド水溶液を重合してポリマ−サンプルを得た。
【０１４１】
〔比較例２−４〕
実施例２−２と同様にして、比較例２−２で得られた反応液から２０重量％アクリルアミド水溶液を得て、さらに、このアクリルアミド水溶液を重合してポリマ−サンプルを得た。
【０１４２】
＜アクリルアミドポリマーの試験法＞
上記実施例２−２、実施例２−３、比較例２−２で得られたポリマーサンプルの水溶性の評価、標準粘度の測定、および色調の評価を以下の方法で行った。
水溶性：水溶性は、１ Lビーカーに水６００ｍｌを入れ、定められた形状の攪拌羽根で２５℃で攪拌しながらポリマーサンプル０．６６ｇ（純分０．６ｇ）を添加し、４００ｒｐｍで２時間攪拌を行い、得られた溶液を１５０メッシュの金網で濾過し、不溶解分の多少と濾過性から、水溶性を判断した。即ち、完溶のものを◎、完溶に近いものを○、不溶解分があるが、それを濾別する事ができるものを△、濾液の通過が遅く、不溶解分の濾過が事実上出来ないものを×とした。
標準粘度：上記の水溶性試験により得られる濾液は、濃度０．１重量％のポリマー水溶液であるが、これに１Ｍ濃度相当の塩化ナトリウムを加え、ＢＬ型粘度計でＢＬアダプターを用いて２５℃、ローター回転数６０ｒｐｍで粘度を測定した（標準粘度）。このような方法で得られる標準粘度は分子量に相関のある値として慣用される。
色調：ポリマーの色調についてはポリマ−粉体を目視で評価した。
評価結果を表２−１に示した。
【０１４３】
【表２−１】
*）濾液の通過が遅く、事実上濾過が不可能な為、濾液の粘度は測定不能
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
第一の発明によれば、ニトリルヒドラターゼを利用した反応により、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率的に製造することができるので、工業的に実施するのに有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒の存在下、水性媒体中でニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法において、水性媒体中のベンゼン濃度が４．０ｐｐｍ以下であることを特徴とするアミド化合物の製造方法。
【請求項２】
ニトリルヒドラターゼがシュードノカルディア属由来、またはロドコッカス属由来ニトリルヒドラターゼである請求項１記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項３】
ニトリル化合物がアクリロニトリルまたはメタクリロニトリルである請求項１または２に記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載のアミド化合物を単独重合、または前記アミド化合物を、アミド化合物と共重合可能な少なくとも一種の不飽和単量体と共重合して、アミド系重合体を製造する方法。
【請求項５】
前記アミド化合物がアクリルアミドまたはメタクリルアミドである請求項４に記載のアミド系重合体を製造する方法。
【請求項６】
アクロレインの濃度が１ｐｐｍ以下であるアクリロニトリルを、水性媒体中で、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の菌体、またはその菌体処理物により水和反応させ、アクリルアミドを製造する方法。
【請求項７】
請求項６に記載のアクリルアミドを単独重合、または前記アクリルアミドを、アクリルアミドと共重合可能な少なくとも一種の不飽和単量体と共重合して、アクリルアミド系重合体を製造する方法。
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒の存在下、水性媒体中でニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法において、水性媒体中のベンゼン濃度が４．０ｐｐｍ以下であることを特徴とするアミド化合物の製造方法。
【請求項２】
ニトリルヒドラターゼがシュードノカルディア属由来、またはロドコッカス属由来ニトリルヒドラターゼである請求項１記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項３】
ニトリル化合物がアクリロニトリルまたはメタクリロニトリルである請求項１または２に記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載のアミド化合物を単独重合、または前記アミド化合物を、アミド化合物と共重合可能な少なくとも一種の不飽和単量体と共重合して、アミド系重合体を製造する方法。
【請求項５】
前記アミド化合物がアクリルアミドまたはメタクリルアミドである請求項４に記載のアミド系重合体を製造する方法。
【請求項６】
アクロレインの濃度が１ｐｐｍ以下であるアクリロニトリルを、水性媒体中で、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の菌体、またはその菌体処理物により水和反応させ、アクリルアミドを製造する方法。
【請求項７】
請求項６に記載のアクリルアミドを単独重合、または前記アクリルアミドを、アクリルアミドと共重合可能な少なくとも一種の不飽和単量体と共重合して、アクリルアミド系重合体を製造する方法。
【公開番号】特開２０１２−２９６９５（Ｐ２０１２−２９６９５Ａ）
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２０８２７（Ｐ２０１１−２２０８２７）
【出願日】平成２３年１０月５日（２０１１．１０．５）
【分割の表示】特願２００７−５３９９１９（Ｐ２００７−５３９９１９）の分割
【原出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【出願人】（０００００５８８７）三井化学株式会社 (2,318)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月５日（２０１１．１０．５）
【分割の表示】特願２００７−５３９９１９（Ｐ２００７−５３９９１９）の分割
【原出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【出願人】（０００００５８８７）三井化学株式会社 (2,318)
【Ｆターム（参考）】
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