アミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体の分割のための酵素および方法
アミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体およびその塩の調製および単離、鏡像異性体を分割する方法ならびにラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる組成物および/または酵素を特定する方法。本発明の態様は、1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割する方法を含む。その実施形態は:1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと;前記1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を細胞構成要素に暴露するステップを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表
本願は、サイズが10,952バイトであり、「CPS3_4−009_SequenceListing_ST25.txt」という名前の、ASCII文章として2010年7月1日に作成された、本明細書とともに電子的に提出された配列表を含む。これは、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【0002】
緒言
本発明の態様は、アミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体およびその塩の調製および単離、鏡像異性体を分割する方法、およびラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる組成物および/または酵素を特定する方法に関する。複数の態様では、アミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体の塩を、追加的な緩衝能力を必要とすることなく、ヒドロラーゼ触媒による生物学的分割プロセスで使用して、鏡像異性体的に富化された1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体を製造する。
【背景技術】
【0003】
多くの化合物の化学合成は、所望の鏡像異性体を選択的に製造するのに失敗しており、したがって、さらに加工する前に、分離または分割しなければならないラセミ混合物または鏡像異性体混合物がもたらされる。アミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体は、C型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼの阻害剤の調製のための主要中間体であると教示されている。非特許文献1を参照されたい。
【0004】
Beaulieuらの論文は、ベンズアルデヒドとグリシン酸エチル塩酸塩を縮合し、次いで、トランス−1,4−ジブロモブタ−2−エンと反応させてラセミ型アミノビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステル(1)を形成させるステップを含む、そうした誘導体を製造するアプローチを教示している。次いでこの化合物上のアミン官能基を、窒素原子上でのBOC基(すなわち、−C(O)OC(CH3)3基)の付加によって保護する。保護された化合物(2)を酵素的分割に供し、任意選択でトシラート塩に転換させる。Beaulieuらは、アミノエステル(1)の溶液を扱う場合、溶媒を減圧下、室温で除去すべきであると教示している。
【0005】
【化1】
保護されていない化合物を用いた直接分割法は、そうした誘導体へのより簡単で効率的な経路を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】P. L. Beaulieuら、「Synthesis of (1R,2S)−1−Amino−2−vinylcyclopropanecarboxylic Acid Vinyl−ACCA) Derivatives: Key Intermediates for the Preparation of Inhibitors of the Hepatitis C Virus NS3 Protease」、Journal of Organic Chemistry、70巻(15号)、5869〜5879頁、2005年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
要旨
鏡像異性体的に富化されたアミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体を製造するための代替的アプローチを見出した。具体的には、1つのアプローチは、アミノエステル(3)のヒドロラーゼ触媒による生物学的分割を含む。
【0008】
【化2】
大量のアミノエステル(3)を得るために、酵素的分割の前に、溶媒および反応混合物から前記化合物を分離するのに蒸留を考慮するかもしれない。しかし、溶媒からのアミノエステル(3)の室温での真空分離は、効率的な大規模生産には適していない。さらに、最近、1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エステル、例えば(3)(Rはメチルまたはエチルである)は比較的低い熱安定性を有し、加速速度熱量計(ARC)により、50℃で発熱を示すことが発見されている。これらの要素は、大規模生産で使用するのに一般に望ましい加工上の選択肢を限定することになる。
【0009】
本発明の出願人らは、効率的な大規模生産を可能にするいくつかの新規な塩を発見した。驚くべきことに、これらの塩は、エナンチオが豊富なアミノエステル(3)のための実行可能な製造プロセスを可能にする特定の利点を有することが分かった。これらの利点は、以下の1つまたは複数を含む:塩の融点(代表的に>100℃)を超える温度に対する高い熱安定性;高価なBOC無水物反応物の回避;取扱いおよび貯蔵をより簡単にする改善された化合物形態(遊離アミンまたはBOC保護アミンが油状形態であるのに対して、固体である);多大な時間を必要とする低温真空分離ステップの回避;低熱安定性化合物の温度を高める蒸留ステップの回避;次の生物学的分割ステップにおける、追加の緩衝剤を必要としない塩の直接使用への適切性。
【課題を解決するための手段】
【0010】
一態様では、本発明は、式(4)の化合物
【0011】
【化3】
(式中、Rはアルキル基であり、nは1〜3の整数であり、HXは、リン酸、硫酸、β,β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸などの酸である)
を含む。
【0012】
一態様では、本発明は、式(3)の化合物
【0013】
【化4】
を上で規定した酸HXと反応させることによって、上記化合物(4)を作製する方法を含む。
【0014】
本発明の他の態様は、上記塩化合物(4)を、溶媒中で適切な(E)−N−フェニルメチレングリシンアルキルエステルをトランス−1,4−ジハロブタ−2−エンでジアルキル化し、式(5)の中間体イミノエステルを酸HXで加水分解し、得られた塩を濾過などにより単離することによって作製する方法を含む。
【0015】
【化5】
本発明の他の態様は、ヒドロラーゼ触媒による生物学的分割プロセスにおいて、追加の緩衝剤を必要とすることなく上記塩化合物(4)を使用することを含む。
【0016】
本発明の他の態様は、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる酵素を特定する方法を含む。その方法の実施形態は:ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと;細胞構成要素をラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に暴露するステップと;ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を、鏡像異性体比の変化について試験するステップと;ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に対して分割活性を有する酵素を単離するステップと;前記酵素を特定するステップとを含む。
【0017】
本発明の態様は、1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割する方法を含む。その実施形態は:1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと;前記1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を細胞構成要素に暴露するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図1は、アキラル高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて測定した、様々な酵素を用いた、50g/Lの1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルの加水分解速度を示すグラフである。
【図2】図2は、Leuwenhoekiella blandensisから誘導され、鏡像異性体的に富化されたアミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体を製造するのに有用なタンパク質の配列表である。
【図3】図3は、Crocibacter atlanticusから誘導され、鏡像異性体的に富化されたアミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体を製造するのに有用なタンパク質の配列表である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
第1の実施形態によれば、本発明は、式(4)の化合物
【0020】
【化6】
(式中、Rはアルキル基である)
を含む。複数の実施形態では、Rは1〜約20個の炭素原子もしくは1〜約6個の炭素原子を有するか、またはRはメチルもしくはエチルである。特定の実施形態では、Rが2個超の炭素原子を有する場合、Rはn−アルキル基である。HXは、リン酸、硫酸、β,β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸などの酸であり、nは約1〜3の整数である。
【0021】
塩は、式HXの酸と式(3)の化合物
【0022】
【化7】
を含む溶液を反応させることによって作製できる。
【0023】
遊離アミノエステル(3)の濃度は、少なくとも約20g/L、少なくとも約50g/Lまたは少なくとも約75g/Lであってよく、一般に約200g/L未満または約100g/L未満であってよい。加える酸の量は、アミノエステルのモル当たり約0.3〜2モル当量、約0.5〜1.5モル当量または約1モル当量である。
【0024】
塩の形成は有機溶媒中でなされる。適切な溶媒は、その中で遊離塩基(すなわち、遊離アミノエステル)が良好な溶解性をもつが、その塩は低い溶解性をもつ溶媒である。有用な溶媒には、これらに限定されないが、メチルt−ブチルエーテル(MTBE)などのエーテル、酢酸エチルおよび酢酸イソプロピルなどのエステル、ジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素およびトルエンなどの炭化水素が含まれる。塩の形成は、溶媒と水溶性共溶媒(例えば、メタノール、エタノール、アセトンなど)との組合せを用いて実施することができる。共溶媒の量は一般に溶媒の全量に対して約5〜20%である。
【0025】
したがって、複数の実施形態によれば、化合物(4)は以下のスキーム1のようにして作製することができる:
【0026】
【化8】
1つのアプローチによれば、(E)−N−フェニルメチレングリシンアルキルエステルおよびトランス−1,4−ジハロブタ−2−エンから出発して、化合物(4)を、溶媒中で適切な(E)−N−フェニルメチレングリシンアルキルエステルをトランス−1,4−ジハロブタ−2−エンでジアルキル化し、酸を用いて中間体イミノエステルを加水分解し(ただし、所望のHX以外の酸を使用する場合、その加水分解ステップの後、pHを約8〜9に調節する)、溶媒抽出し、低級アルコールおよび酸HXを添加し;遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって塩を単離することによって作製することができる。このアプローチを、具体的な特定の試薬を示す以下のスキーム2に例示する。
【0027】
【化9】
ジアルキル化ステップは塩基によって促進される。有用な塩基には、これらに限定されないが、水酸化カリウム、ナトリウムt−ブトキシド、カリウムt−ブトキシド、リチウムt−ブトキシド、リチウムヘキサメチルシラザン、ナトリウムヘキサメチルシラザンおよびカリウムヘキサメチルシラザンなどが含まれる。トランス−1,4−ジハロブタ−2−エンはトランス−1,4−ジブロモブタ−2−エンであってよい。
【0028】
ジアルキル化ステップは代表的に適切な溶媒中で行う。そうした溶媒の非限定的な例はトルエン、MTBE、ヘキサンおよびテトラヒドロフラン(THF)である。有用な溶媒の例は、50〜70容量%のMTBEを含むトルエンとMTBEとの混合物である。
【0029】
トランス−1,4−ジブロモブタ−2−エンのモル当たりのリチウムt−ブトキシドまたは他の塩基の有用な量は、約2.1〜2.6モル当量であり、トランス−1,4−ジブロモブタ−2−エンのモル当たりの(E)−N−フェニルメチレングリシンアルキルエステルの有用な量は、約1.05〜1.5モル当量である。
【0030】
次いでジアルキル化ステップから得られたイミノエステル(5)の溶液を加水分解する。1つのアプローチによれば、加水分解ステップは、これらに限定されないが、0.1M〜12Mまたは2M〜6Mの濃度のHCl水溶液を含む塩酸、硫酸、硝酸またはリン酸などの適切な酸を用いることを含む。
【0031】
加水分解後、有機相を廃棄し、塩基を加えてpHを約8〜9に上げる。適切な塩基には、これらに限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムが含まれる。次いでアミノエステルを、MTBEなどの適切な有機溶媒に抽出することができる。このアプローチ(所望のHX以外の酸を用いる)では、次いで、上記した手順にしたがって酸HXを加えて塩を形成させる。
【0032】
スキーム3に例示する代替のアプローチによれば、HXを用いて5の加水分解を直接行って対応する塩を形成させることができる。このアプローチにおいて、アミノエステルのモル当たりの加える酸HXの量は、約0.3〜2モル当量もしくは約0.5〜1.5モル当量の範囲または約1モル当量である。
【0033】
【化10】
次いで塩を、遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、熱的に安定であり、その後の反応で扱うのに容易である固体として単離する。スキーム4で示すように、化合物(4)を、ラセミ種の酵素的分割において用いて、所望の単一鏡像異性体を優先的に得ることができる。
【0034】
【化11】
これらの塩は、塩を水に溶解し、塩基を加えてpHを6〜9の範囲に調節し、ヒドロラーゼ酵素を加えることによって、ヒドロラーゼ触媒による酵素的分割において直接使用することができる。追加の緩衝剤は必要でない。生物体であって、適切な酵素をそれから得ることができる生物体の例には、Formosa sp.、Psychroserpens sp.、Shewanella sp.、Winogradskyella sp.、Leeuwenhoekiella blandensis、Croceibacter atlanticus、Leeuwenhoekiella aequoreaおよびAquamarina,sp. が含まれる。
【0035】
さらなる態様では、本発明は、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる組成物および/または酵素を特定する方法に関する。
【0036】
複数の実施形態では、スキーム5に概略的に示すように、1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる組成物および/または酵素を特定する方法を提供する。
【0037】
【化12】
特定の実施形態では、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を、1つまたは複数の生物体から細胞構成要素へ暴露させることができる。他の実施形態では、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を試験して、その混合物の鏡像異性体比または分割に変化があるかどうかを判定することができる。
【0038】
代替の実施形態では、分割活性を有する1つもしくは複数の酵素を単離または特定するために、分割活性を有することが示されている細胞構成要素を、分画または分離し、分割活性についてさらに試験することができる。追加の実施形態では、分割活性を有する1つもしくは複数の酵素は、酵素に加えて非限定的な例を挙げると、ペプチドまたはRNAであってよい。本発明の特定の実施形態では、分割活性を有する1つもしくは複数の酵素をコード化する遺伝子を、当該分野で標準的な手法を用いて特定しクローン化することができる。例えば、J.Sambrookら、(eds)、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1.84〜1.88、2001年を参照されたい。
【0039】
本明細書で用いる分割は、鏡像異性体のペアの一方の他方に対するレベル(鏡像異性体比)の変化に関する。したがって、分割は、一方の鏡像異性体を改変させて、それをもはや鏡像異性体ペアの一部でないようにするか、または一方の鏡像異性体を他方の鏡像異性体に転換させることによってもたらされる。分割の1つの非限定的な例は、エステルを切断して1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸を形成させることを含む。
【0040】
本明細書で用いる、鏡像異性体的に富化された混合物は、鏡像異性体比が1:1以外である鏡像異性体のペアを含む混合物を指す。
【0041】
本発明の複数の実施形態では、ラセミ混合物または鏡像異性体的に富化された混合物は、鏡像異性体ペアの2つの種を含む任意の組成物または溶液を含むことができる。さらなる実施形態では、鏡像異性体ペアの1つまたは複数の基を、例えばBOC基で保護することができる。他の実施形態では、鏡像異性体ペアの分子は、塩の一部であっても一部として存在してもよい。その塩の非限定的な例はリン酸塩、ナトリウム塩、硝酸塩またはカルシウム塩である。さらなる実施形態では、鏡像異性体ペアの分子は、遊離アミンの形態であってよい。特定の実施形態では、鏡像異性体ペアを含む混合物または溶液は、任意の溶媒または溶液を含むことができる。溶媒または溶液の例には、これらに限定されないが、水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水および/またはポリソルベート界面活性剤(例えば、TWEEN(登録商標)製品)を含む溶液が含まれる。
【0042】
本発明の特定の実施形態では、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を細胞構成要素に暴露することは、混合物と細胞構成要素を互いに接触させ、それによって細胞構成要素が少なくとも部分的に混合物を分割できるようにする任意の方法または手法を含むことができる。暴露の方法の例は、これらに限定されないが、流体接触および物理的接触を含む。
【0043】
細胞構成要素への暴露は、統計的に有意な鏡像異性体比の変化が認められるまたは判定されるのに必要な任意の時間行うことができる。暴露時間の例は、これらに限定されないが、約0.1時間〜約72時間、約1時間〜約48時間、約8時間〜約30時間、約30時間および約12時間を含む。
【0044】
暴露はまた任意の温度で行うことができる。複数の実施形態では、暴露を、おおよそ、生物体の通常の生存環境(細胞構成要素がそれから得られる)の温度で行う。暴露を行うことができる温度の例は、これらに限定されないが、約1℃〜約99℃、約10℃〜約50℃および約30℃を含む。
【0045】
細胞構成要素への暴露は任意のpH値で行うことができる。暴露を行うことができるpH値の例は、これらに限定されないが、約pH1〜約pH12、約pH3〜約pH11、約pH6〜約pH9、約pH9および約pH7を含む。
【0046】
本発明の特定の実施形態では、細胞構成要素は、これらに限定されないが、細胞抽出物、細胞ペースト、細胞溶解物、無細胞抽出物、凍結乾燥された無細胞抽出物、凍結乾燥された細胞抽出物、凍結乾燥された細胞ペースト、凍結乾燥された細胞溶解物、超音波処理された細胞、単離されたタンパク質および/またはその組合せおよび/または画分および/またはフラグメントを含むことができる。
【0047】
細胞構成要素は、任意の生物体または生物体の組合せ由来のものであってよい。生物体であって、細胞構成要素がそれから得られる生物体の例は、これらに限定されないが、動物、植物、細菌、古細菌、菌類、海洋生物、海藻、Formosa sp.、Psychroserpens sp.、Shewanella sp.、Winogradskyella sp.、Leeuwenhoekiella blandensis、Croceibacter atlanticusおよびLeeuwenhoekiella aequorea、Aquamarina,sp.、AQP317およびAQP383を含む。
【0048】
AQP317は、ブダペスト条約に基づいて、2007年3月9日付けのNCIMB41475として工業用、食品用および海洋細菌の国立コレクション(National Collection of Industrial,Food and Marine Bacteria(「NCIMB」))、Aberdeen、Scotlandで供託されたものであり、AQP383は、2007年3月9日付けのNCIMB41476としてNCIMBで供託されたものである。
【0049】
Leewenhoekiella blandensisは、ブダペスト条約に基づいて、2010年にNCIMBで供託されたものである。Croceibacter atlanticusは、ブダペスト条約に基づいて、2010年にNCIMBで供託されたものである。Leewenhoekiella aquoreaは、ブダペスト条約に基づいて、2010年にNCIMBで供託されたものである。
【0050】
本発明の代替の実施形態では、細胞構成要素はさらに分画または分離することができる。分画または分離の方法は、これらに限定されないが、様々な形態のクロマトグラフィー法、サイズ排除法、ゲル電気泳動法、等電点および沈殿分離法を含む。細胞構成要素は、硫酸アンモニウム沈殿法で分画することができる。
【0051】
他の実施形態では、分割活性を有する酵素を、約30%〜40%またはそれを超える硫酸アンモニウム濃度で優先的に沈殿させることができ、かつ/または約50%〜60%またはそれを超える硫酸アンモニウム濃度で優先的に沈殿させることができる。
【0052】
以下の実施例で、特定の具体的な態様および実施形態をさらに例示する。これらの実施例は例示を目的としたのに過ぎず、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでは全くない。
【実施例】
【0053】
(実施例1)
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルの合成。
【0054】
MTBE(1.5L)中のトランス−1,4−ジブロモ−2−ブテン(340.6g、1.33mol)の撹拌溶液に、リチウムtert−ブトキシド(318g、3.325mol)を加える。得られた懸濁液を15℃未満に冷却し、反応温度を確実に15〜20℃に保持しながら、トルエン(875mL)中の(E)−N−フェニルメチレングリシンメチルエステル(310g、1.75mol)の溶液を60分間かけて徐々に加える。20〜25℃でさらに2時間撹拌した後、NaCl溶液(20重量%、2L)を加えて反応をクエンチする。有機相を1M HCl溶液(1.75L、1.75mol)と混合し、20℃で2時間激しく撹拌する。その塊から一定分量を取って中間体イミンがすべて加水分解されていることを確認する。次いで相を分離し、水相を500ml MTBEで洗浄する。次いで水相を13℃に冷却し、pHをNaOH溶液(6M、200mL)で約9に調節する。次いで混合物をMTBE(5L)で抽出し、186gの1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルを含む溶液を得る。
【0055】
(実施例2)
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩の合成。
【0056】
オーバーヘッドスターラーを備えた丸底フラスコに、MTBE(110mL)中の1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステル(7g)の溶液を入れる。次いでメタノール(10mL)を加え、混合物を室温で撹拌する。オルトリン酸(3.5mL)を滴下し、沈殿物を形成させる。添加が完了した後、撹拌をさらに60分間続行する。次いでリン酸塩を濾過により回収し、真空下で乾燥する。リン酸塩を11.72g(約98%)のベージュ色粉末として得る。
【0057】
1H NMR (D4−MeOH): δ 5.82−5.70 (m,1H),5.42 (dd,J=17&1,1H),5.22 (dd,J=10&1,1H),3.86 (s,3H),2.49 (q,J=9,1H),1.85−1.80(m,1H),1.80−1.73(m,1H)。
【0058】
(実施例3)
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩の合成。
【0059】
グラスライン製反応器中で、実施例1に記載した合成手順によって、MTBE(566Kg)中のほぼ1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステル(70Kg)の溶液を調製する。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し濾過した後、メタノール(40Kg)を加える。15℃未満の温度で80%リン酸(60Kg)を40分間かけて徐々に加える。この間に沈殿物が形成する。添加が完了したら、スラリーを10℃未満で少なくともさらに1時間撹拌する。固体を濾過により収集し、MTBEで洗浄し、フィルターから貯蔵容器へ、代表的に23%MTBE含量を有する湿潤した灰白色濾過ケーキとして排出する。約138.5kgの湿潤濾過ケーキを単離する。これは、無溶媒ベースで約106.5kg(約90%収率)の1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルホスフェートに相当する。
【0060】
(実施例4)
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩の合成。
【0061】
丸底フラスコに、MTBE(100mL)中の1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステル(8.5g)の溶液を入れる。次いでメタノール(12mL)を加え、混合物を室温で撹拌する。オルトリン酸(6mL)を滴下すると、沈殿物の形成が始まる。添加が完了した後、撹拌をさらに2時間続行する。濾過によりリン酸塩を回収し、MTBEで洗浄し、真空下で乾燥する。約9.4g(70%収率)の灰白色固体を得る。
【0062】
1H NMR (D4−MeOH): δ 5.81−5.67(m,1H),5.38 (dd,J=16&1,1H),5.19(dd,J=11&1,1H),4.28(q,J=7,2H),2.43(q,J=9,1H),1.80−1.68(m,2H),1.31(t,J=7,3H)。
【0063】
(実施例5)
N−フェニルメチレングリシンメチルエステルからの1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩の合成。
【0064】
MTBE(50mL)中にスラリー化したリチウムt−ブトキシド(31.8g)に、MTBE(100mL)に溶解したトランス−1,4−ジブロモ−2−ブテン(34g)を加える。次いでこの撹拌した反応混合物に、トルエン(90g)中のN−フェニルメチレングリシンメチルエステル(31g)の溶液を加える。添加の間、温度を15℃未満に保持し、続いて反応物を周囲温度で2時間撹拌する。NaCl溶液(20重量%、200mL)を加えて反応物をクエンチする。水相を廃棄し、有機相に約15容量%のメタノールを加える。溶液を5℃未満に冷却し、1モル当量の85%リン酸を徐々に加えてリン酸塩を沈澱させる。混合物を60分間撹拌し、沈殿物を濾過により回収し、MTBEで洗浄する。HPLCで約97%の純度を有する、32.3gの量の1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩(トランス−1,4−ジブロモ−2−ブテンに基づいて85%収率)を得る。
【0065】
(実施例6)
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩のエステラーゼ触媒による生物学的分割。
【0066】
20mLのステムブロック管(stem block tube)に、脱イオン水(4mL)に溶解した1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩(0.5g、2mmol)を入れる。1M NaOH溶液(2mL)を滴下して溶液のpHを8に調節する。混合物を25℃で連続的に撹拌し、凍結乾燥したAQP317(Formosa algae)(200mg)を加える。撹拌を25℃で41時間続行し、次いでHPLC分析により転換率が約50%に達したことを判定する。ガスクロマトグラフィー(GC)分析により、残留エステルの鏡像異性体過剰率が99%に達していることが示される。
【0067】
(実施例7)
エステラーゼ活性のための一次スクリーニング。
【0068】
基質、1−アミノ−2−ビニル−シクロプロパンカルボン酸メチルエステル(200μL、リン酸緩衝生理食塩水中に10g/L)を、ウェル当たり1mgの凍結乾燥された細胞ペーストを含むスクリーニングプレートに塗布する。30℃で終夜インキュベーションした後、反応物をHPLC移動相中にサンプリングし、アミノ酸の形成を分析する。疑わしいヒットのさらなる分析を、キラルGCによりChirasil Dex CBカラム、830KPa(20p.s.i.)のヘリウムキャリアガスで、100℃のオーブン温度(等温)で、トリフルオロアセテートとしての残留エステルの分析により実施する。230の海洋微生物のスクリーニングにより、残留エステル鏡像異性体過剰率90%を超える12のヒットが確認された微生物を特定する。
【0069】
(実施例8)
Aquapharm(商標)生物体スクリーニング。
【0070】
凍結乾燥された生物体調製品(Aquapharm Biodiscovery Ltd.から入手)の12のヒットが確認されたもののうちの8つからなる約4mgのサブセットを、リン酸緩衝生理食塩水+0.1容量%のTween80(pH7)中、またはリン酸緩衝液pH9中、1mLの10g/Lの1−アミノ−2−ビニル−シクロプロパンカルボン酸メチルエステルと一緒に、ガラス製のシンチレーションバイアル瓶に量り込む。これらの混合物を30℃、300rpmで30時間インキュベートする。反応後の残留エステルをGCによりトリフルオロ酢酸誘導体として分析する。結果を表1に示す。すべての試料は、pH9よりpH7でより活性である。
【0071】
一次培養プレートからの回収を試みて、AQP250は不可能であることが判明する。類似した形態を有し同じ供給源から単離された、Psyhcroserpens spと特定されておりAQP383と指定した他の生物体を代替品として使用する。アッセイすると、これも所望の活性を有することが実証される。
【0072】
【表1】
(実施例9)
50g/Lの基質濃度での活性。
【0073】
200mgの凍結乾燥された細胞ペーストと250mgのメチル−1−アミノ−2−ビニル−シクロプロパンカルボキシレートリン酸塩を含む反応物を合計5mLのリン酸緩衝生理食塩水中に調製し、アキラルHPLCを用いて経時的にその転換をモニターする。2つの生物体、AQP317およびAQP383は、アキラルHPLCで判断して、他の確認済みヒットと比較して著しく高い活性度を示し、これらの濃度で基質を完全に分割している。結果を図1にプロットする。
【0074】
(実施例10)
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩のAlcalase触媒による生物学的分割
脱イオン水(45mL)中の1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩(2g、7.9mmol)をジャケット付き容器に入れ、2M水酸化ナトリウム溶液(5mL)を加えることでpHを8に調節する。混合物を35℃で連続的に撹拌し、Novozymesから販売されているAlcalase(登録商標)酵素溶液(6mL)を加える。混合物を連続的に撹拌し、pHを8.15に保持する。一定分量(100μL)を定期的に取る。GC分析はe.e.(鏡像体過剰率)=5.7%(t=24時間)、e.e.=14.3%(t=48時間)およびe.e.=21.4%(t=72時間)を示す。72時間後でも有意の転換は起こっておらず、反応は停止している。反応はスキーム5で表される。
【0075】
(実施例11)
Formosa algae AQP317の無細胞抽出物の調製。
【0076】
AQP317、Formosa algaeの無細胞抽出物を、500mL培養液から(ex of)の500mgの凍結乾燥された細胞ペーストを50mLのPBSに再懸濁させて調製する。細胞懸濁液を、15μmの振幅、4℃で、10秒間オン15秒間オフで30分間、超音波処理する。残渣を4℃、10,000Gで10分間遠心分離により除去する。
【0077】
無細胞抽出物を一連の硫酸アンモニウム沈澱法に供し、沈殿物を4℃、10,000Gで20分間遠心分離により回収する。R. M. C. Dawsonら、eds.、Data for Biochemical Research、Third Edition、537〜539頁、1986年を参照されたい。各ペレットを5mLのリン酸緩衝生理食塩水(Sigma P4417)に再懸濁する。タンパク質含量を、PierceからのCoomassie Plus試薬を用いてアッセイする。同様の実験をPsychroserpens AQP383を用いて実施する。活性は30〜40%で降下することが示される。
【0078】
(実施例12)
生体内変換アッセイ。
【0079】
活性を、リン酸緩衝生理食塩水中に10mMの1−アミノ2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩を含む1mLシンチレーションバイアル瓶でアッセイする。2.5時間後に反応物をサンプリングし、HPLC移動相に1:5で希釈し次いで分析する。次いで転換率を、存在する酵素活性単位数を算出するために用いる。結果を表2に示す。
【0080】
(実施例13)
分割活性の単離。
【0081】
AQP317およびAQP383の無細胞抽出物を標準的な手法を用いて分画する。種々の画分を、1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に暴露し、30℃で30時間インキュベートする。次いで異なる画分を、上記に説明したような鏡像異性体比の変化について試験する。分割活性を有する画分を、ゲル電気泳動によりさらに分画および/または分離する。さらなる画分およびゲル単離物を分割活性について試験する。分割活性を有する単一化合物をエステラーゼとして単離し特定する。単離したエステラーゼを、カルボキシルおよび/もしくはアミノペプチド配列決定またはタンパク質質量分析にかける。次いで配列情報を用いて、エステラーゼをコードする遺伝子の単離のための推定プライマー対を作り出すか、または全遺伝子の合成ができるようにする。AQP317およびAQP383、Leuwenhoekiella blandensis、Croceibacter atlanticusならびにLeuwenhoekiella aquoreaのDNA抽出物を作製し、PCRを、推定プライマー対を用いて実施する。PCR産生物を分析し、エステラーゼをコード化する配列を単離し、ベクター中にクローン化し、次いで配列決定する。
【0082】
(実施例14)
クローン化したポリペプチドの活性の実証
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、当業者に公知の標準的な手法を用いて、Pseudomonas発現系にクローン化する。
【0083】
組み換えエステラーゼの培養物を25℃で成長させ、24時間の成長後に誘発させ、誘発後に間隔を置いて1mL試料を取り、マイクロ遠心分離にかける。ペレットを1mL、20g/Lの1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩pH7に再懸濁させ、25℃でインキュベートする。144時間反応させた後、残留エステルをMTBEで抽出し、トリフルオロ酢酸無水物で誘導化し、ガスクロマトグラフィーで分析する。残留エステルは87%の鏡像異性体過剰率を有する。
【0084】
【表2】
【図2−1】
【図2−2】
【図2−3】
【図2−4】
【図3−1】
【図3−2】
【図3−3】
【図3−4】
【技術分野】
【0001】
配列表
本願は、サイズが10,952バイトであり、「CPS3_4−009_SequenceListing_ST25.txt」という名前の、ASCII文章として2010年7月1日に作成された、本明細書とともに電子的に提出された配列表を含む。これは、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【0002】
緒言
本発明の態様は、アミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体およびその塩の調製および単離、鏡像異性体を分割する方法、およびラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる組成物および/または酵素を特定する方法に関する。複数の態様では、アミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体の塩を、追加的な緩衝能力を必要とすることなく、ヒドロラーゼ触媒による生物学的分割プロセスで使用して、鏡像異性体的に富化された1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体を製造する。
【背景技術】
【0003】
多くの化合物の化学合成は、所望の鏡像異性体を選択的に製造するのに失敗しており、したがって、さらに加工する前に、分離または分割しなければならないラセミ混合物または鏡像異性体混合物がもたらされる。アミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体は、C型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼの阻害剤の調製のための主要中間体であると教示されている。非特許文献1を参照されたい。
【0004】
Beaulieuらの論文は、ベンズアルデヒドとグリシン酸エチル塩酸塩を縮合し、次いで、トランス−1,4−ジブロモブタ−2−エンと反応させてラセミ型アミノビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステル(1)を形成させるステップを含む、そうした誘導体を製造するアプローチを教示している。次いでこの化合物上のアミン官能基を、窒素原子上でのBOC基(すなわち、−C(O)OC(CH3)3基)の付加によって保護する。保護された化合物(2)を酵素的分割に供し、任意選択でトシラート塩に転換させる。Beaulieuらは、アミノエステル(1)の溶液を扱う場合、溶媒を減圧下、室温で除去すべきであると教示している。
【0005】
【化1】
保護されていない化合物を用いた直接分割法は、そうした誘導体へのより簡単で効率的な経路を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】P. L. Beaulieuら、「Synthesis of (1R,2S)−1−Amino−2−vinylcyclopropanecarboxylic Acid Vinyl−ACCA) Derivatives: Key Intermediates for the Preparation of Inhibitors of the Hepatitis C Virus NS3 Protease」、Journal of Organic Chemistry、70巻(15号)、5869〜5879頁、2005年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
要旨
鏡像異性体的に富化されたアミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体を製造するための代替的アプローチを見出した。具体的には、1つのアプローチは、アミノエステル(3)のヒドロラーゼ触媒による生物学的分割を含む。
【0008】
【化2】
大量のアミノエステル(3)を得るために、酵素的分割の前に、溶媒および反応混合物から前記化合物を分離するのに蒸留を考慮するかもしれない。しかし、溶媒からのアミノエステル(3)の室温での真空分離は、効率的な大規模生産には適していない。さらに、最近、1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エステル、例えば(3)(Rはメチルまたはエチルである)は比較的低い熱安定性を有し、加速速度熱量計(ARC)により、50℃で発熱を示すことが発見されている。これらの要素は、大規模生産で使用するのに一般に望ましい加工上の選択肢を限定することになる。
【0009】
本発明の出願人らは、効率的な大規模生産を可能にするいくつかの新規な塩を発見した。驚くべきことに、これらの塩は、エナンチオが豊富なアミノエステル(3)のための実行可能な製造プロセスを可能にする特定の利点を有することが分かった。これらの利点は、以下の1つまたは複数を含む:塩の融点(代表的に>100℃)を超える温度に対する高い熱安定性;高価なBOC無水物反応物の回避;取扱いおよび貯蔵をより簡単にする改善された化合物形態(遊離アミンまたはBOC保護アミンが油状形態であるのに対して、固体である);多大な時間を必要とする低温真空分離ステップの回避;低熱安定性化合物の温度を高める蒸留ステップの回避;次の生物学的分割ステップにおける、追加の緩衝剤を必要としない塩の直接使用への適切性。
【課題を解決するための手段】
【0010】
一態様では、本発明は、式(4)の化合物
【0011】
【化3】
(式中、Rはアルキル基であり、nは1〜3の整数であり、HXは、リン酸、硫酸、β,β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸などの酸である)
を含む。
【0012】
一態様では、本発明は、式(3)の化合物
【0013】
【化4】
を上で規定した酸HXと反応させることによって、上記化合物(4)を作製する方法を含む。
【0014】
本発明の他の態様は、上記塩化合物(4)を、溶媒中で適切な(E)−N−フェニルメチレングリシンアルキルエステルをトランス−1,4−ジハロブタ−2−エンでジアルキル化し、式(5)の中間体イミノエステルを酸HXで加水分解し、得られた塩を濾過などにより単離することによって作製する方法を含む。
【0015】
【化5】
本発明の他の態様は、ヒドロラーゼ触媒による生物学的分割プロセスにおいて、追加の緩衝剤を必要とすることなく上記塩化合物(4)を使用することを含む。
【0016】
本発明の他の態様は、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる酵素を特定する方法を含む。その方法の実施形態は:ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと;細胞構成要素をラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に暴露するステップと;ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を、鏡像異性体比の変化について試験するステップと;ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に対して分割活性を有する酵素を単離するステップと;前記酵素を特定するステップとを含む。
【0017】
本発明の態様は、1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割する方法を含む。その実施形態は:1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと;前記1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を細胞構成要素に暴露するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図1は、アキラル高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて測定した、様々な酵素を用いた、50g/Lの1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルの加水分解速度を示すグラフである。
【図2】図2は、Leuwenhoekiella blandensisから誘導され、鏡像異性体的に富化されたアミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体を製造するのに有用なタンパク質の配列表である。
【図3】図3は、Crocibacter atlanticusから誘導され、鏡像異性体的に富化されたアミノビニルシクロプロパンカルボン酸誘導体を製造するのに有用なタンパク質の配列表である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
第1の実施形態によれば、本発明は、式(4)の化合物
【0020】
【化6】
(式中、Rはアルキル基である)
を含む。複数の実施形態では、Rは1〜約20個の炭素原子もしくは1〜約6個の炭素原子を有するか、またはRはメチルもしくはエチルである。特定の実施形態では、Rが2個超の炭素原子を有する場合、Rはn−アルキル基である。HXは、リン酸、硫酸、β,β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸などの酸であり、nは約1〜3の整数である。
【0021】
塩は、式HXの酸と式(3)の化合物
【0022】
【化7】
を含む溶液を反応させることによって作製できる。
【0023】
遊離アミノエステル(3)の濃度は、少なくとも約20g/L、少なくとも約50g/Lまたは少なくとも約75g/Lであってよく、一般に約200g/L未満または約100g/L未満であってよい。加える酸の量は、アミノエステルのモル当たり約0.3〜2モル当量、約0.5〜1.5モル当量または約1モル当量である。
【0024】
塩の形成は有機溶媒中でなされる。適切な溶媒は、その中で遊離塩基(すなわち、遊離アミノエステル)が良好な溶解性をもつが、その塩は低い溶解性をもつ溶媒である。有用な溶媒には、これらに限定されないが、メチルt−ブチルエーテル(MTBE)などのエーテル、酢酸エチルおよび酢酸イソプロピルなどのエステル、ジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素およびトルエンなどの炭化水素が含まれる。塩の形成は、溶媒と水溶性共溶媒(例えば、メタノール、エタノール、アセトンなど)との組合せを用いて実施することができる。共溶媒の量は一般に溶媒の全量に対して約5〜20%である。
【0025】
したがって、複数の実施形態によれば、化合物(4)は以下のスキーム1のようにして作製することができる:
【0026】
【化8】
1つのアプローチによれば、(E)−N−フェニルメチレングリシンアルキルエステルおよびトランス−1,4−ジハロブタ−2−エンから出発して、化合物(4)を、溶媒中で適切な(E)−N−フェニルメチレングリシンアルキルエステルをトランス−1,4−ジハロブタ−2−エンでジアルキル化し、酸を用いて中間体イミノエステルを加水分解し(ただし、所望のHX以外の酸を使用する場合、その加水分解ステップの後、pHを約8〜9に調節する)、溶媒抽出し、低級アルコールおよび酸HXを添加し;遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって塩を単離することによって作製することができる。このアプローチを、具体的な特定の試薬を示す以下のスキーム2に例示する。
【0027】
【化9】
ジアルキル化ステップは塩基によって促進される。有用な塩基には、これらに限定されないが、水酸化カリウム、ナトリウムt−ブトキシド、カリウムt−ブトキシド、リチウムt−ブトキシド、リチウムヘキサメチルシラザン、ナトリウムヘキサメチルシラザンおよびカリウムヘキサメチルシラザンなどが含まれる。トランス−1,4−ジハロブタ−2−エンはトランス−1,4−ジブロモブタ−2−エンであってよい。
【0028】
ジアルキル化ステップは代表的に適切な溶媒中で行う。そうした溶媒の非限定的な例はトルエン、MTBE、ヘキサンおよびテトラヒドロフラン(THF)である。有用な溶媒の例は、50〜70容量%のMTBEを含むトルエンとMTBEとの混合物である。
【0029】
トランス−1,4−ジブロモブタ−2−エンのモル当たりのリチウムt−ブトキシドまたは他の塩基の有用な量は、約2.1〜2.6モル当量であり、トランス−1,4−ジブロモブタ−2−エンのモル当たりの(E)−N−フェニルメチレングリシンアルキルエステルの有用な量は、約1.05〜1.5モル当量である。
【0030】
次いでジアルキル化ステップから得られたイミノエステル(5)の溶液を加水分解する。1つのアプローチによれば、加水分解ステップは、これらに限定されないが、0.1M〜12Mまたは2M〜6Mの濃度のHCl水溶液を含む塩酸、硫酸、硝酸またはリン酸などの適切な酸を用いることを含む。
【0031】
加水分解後、有機相を廃棄し、塩基を加えてpHを約8〜9に上げる。適切な塩基には、これらに限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムが含まれる。次いでアミノエステルを、MTBEなどの適切な有機溶媒に抽出することができる。このアプローチ(所望のHX以外の酸を用いる)では、次いで、上記した手順にしたがって酸HXを加えて塩を形成させる。
【0032】
スキーム3に例示する代替のアプローチによれば、HXを用いて5の加水分解を直接行って対応する塩を形成させることができる。このアプローチにおいて、アミノエステルのモル当たりの加える酸HXの量は、約0.3〜2モル当量もしくは約0.5〜1.5モル当量の範囲または約1モル当量である。
【0033】
【化10】
次いで塩を、遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、熱的に安定であり、その後の反応で扱うのに容易である固体として単離する。スキーム4で示すように、化合物(4)を、ラセミ種の酵素的分割において用いて、所望の単一鏡像異性体を優先的に得ることができる。
【0034】
【化11】
これらの塩は、塩を水に溶解し、塩基を加えてpHを6〜9の範囲に調節し、ヒドロラーゼ酵素を加えることによって、ヒドロラーゼ触媒による酵素的分割において直接使用することができる。追加の緩衝剤は必要でない。生物体であって、適切な酵素をそれから得ることができる生物体の例には、Formosa sp.、Psychroserpens sp.、Shewanella sp.、Winogradskyella sp.、Leeuwenhoekiella blandensis、Croceibacter atlanticus、Leeuwenhoekiella aequoreaおよびAquamarina,sp. が含まれる。
【0035】
さらなる態様では、本発明は、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる組成物および/または酵素を特定する方法に関する。
【0036】
複数の実施形態では、スキーム5に概略的に示すように、1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる組成物および/または酵素を特定する方法を提供する。
【0037】
【化12】
特定の実施形態では、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を、1つまたは複数の生物体から細胞構成要素へ暴露させることができる。他の実施形態では、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を試験して、その混合物の鏡像異性体比または分割に変化があるかどうかを判定することができる。
【0038】
代替の実施形態では、分割活性を有する1つもしくは複数の酵素を単離または特定するために、分割活性を有することが示されている細胞構成要素を、分画または分離し、分割活性についてさらに試験することができる。追加の実施形態では、分割活性を有する1つもしくは複数の酵素は、酵素に加えて非限定的な例を挙げると、ペプチドまたはRNAであってよい。本発明の特定の実施形態では、分割活性を有する1つもしくは複数の酵素をコード化する遺伝子を、当該分野で標準的な手法を用いて特定しクローン化することができる。例えば、J.Sambrookら、(eds)、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1.84〜1.88、2001年を参照されたい。
【0039】
本明細書で用いる分割は、鏡像異性体のペアの一方の他方に対するレベル(鏡像異性体比)の変化に関する。したがって、分割は、一方の鏡像異性体を改変させて、それをもはや鏡像異性体ペアの一部でないようにするか、または一方の鏡像異性体を他方の鏡像異性体に転換させることによってもたらされる。分割の1つの非限定的な例は、エステルを切断して1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸を形成させることを含む。
【0040】
本明細書で用いる、鏡像異性体的に富化された混合物は、鏡像異性体比が1:1以外である鏡像異性体のペアを含む混合物を指す。
【0041】
本発明の複数の実施形態では、ラセミ混合物または鏡像異性体的に富化された混合物は、鏡像異性体ペアの2つの種を含む任意の組成物または溶液を含むことができる。さらなる実施形態では、鏡像異性体ペアの1つまたは複数の基を、例えばBOC基で保護することができる。他の実施形態では、鏡像異性体ペアの分子は、塩の一部であっても一部として存在してもよい。その塩の非限定的な例はリン酸塩、ナトリウム塩、硝酸塩またはカルシウム塩である。さらなる実施形態では、鏡像異性体ペアの分子は、遊離アミンの形態であってよい。特定の実施形態では、鏡像異性体ペアを含む混合物または溶液は、任意の溶媒または溶液を含むことができる。溶媒または溶液の例には、これらに限定されないが、水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水および/またはポリソルベート界面活性剤(例えば、TWEEN(登録商標)製品)を含む溶液が含まれる。
【0042】
本発明の特定の実施形態では、ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を細胞構成要素に暴露することは、混合物と細胞構成要素を互いに接触させ、それによって細胞構成要素が少なくとも部分的に混合物を分割できるようにする任意の方法または手法を含むことができる。暴露の方法の例は、これらに限定されないが、流体接触および物理的接触を含む。
【0043】
細胞構成要素への暴露は、統計的に有意な鏡像異性体比の変化が認められるまたは判定されるのに必要な任意の時間行うことができる。暴露時間の例は、これらに限定されないが、約0.1時間〜約72時間、約1時間〜約48時間、約8時間〜約30時間、約30時間および約12時間を含む。
【0044】
暴露はまた任意の温度で行うことができる。複数の実施形態では、暴露を、おおよそ、生物体の通常の生存環境(細胞構成要素がそれから得られる)の温度で行う。暴露を行うことができる温度の例は、これらに限定されないが、約1℃〜約99℃、約10℃〜約50℃および約30℃を含む。
【0045】
細胞構成要素への暴露は任意のpH値で行うことができる。暴露を行うことができるpH値の例は、これらに限定されないが、約pH1〜約pH12、約pH3〜約pH11、約pH6〜約pH9、約pH9および約pH7を含む。
【0046】
本発明の特定の実施形態では、細胞構成要素は、これらに限定されないが、細胞抽出物、細胞ペースト、細胞溶解物、無細胞抽出物、凍結乾燥された無細胞抽出物、凍結乾燥された細胞抽出物、凍結乾燥された細胞ペースト、凍結乾燥された細胞溶解物、超音波処理された細胞、単離されたタンパク質および/またはその組合せおよび/または画分および/またはフラグメントを含むことができる。
【0047】
細胞構成要素は、任意の生物体または生物体の組合せ由来のものであってよい。生物体であって、細胞構成要素がそれから得られる生物体の例は、これらに限定されないが、動物、植物、細菌、古細菌、菌類、海洋生物、海藻、Formosa sp.、Psychroserpens sp.、Shewanella sp.、Winogradskyella sp.、Leeuwenhoekiella blandensis、Croceibacter atlanticusおよびLeeuwenhoekiella aequorea、Aquamarina,sp.、AQP317およびAQP383を含む。
【0048】
AQP317は、ブダペスト条約に基づいて、2007年3月9日付けのNCIMB41475として工業用、食品用および海洋細菌の国立コレクション(National Collection of Industrial,Food and Marine Bacteria(「NCIMB」))、Aberdeen、Scotlandで供託されたものであり、AQP383は、2007年3月9日付けのNCIMB41476としてNCIMBで供託されたものである。
【0049】
Leewenhoekiella blandensisは、ブダペスト条約に基づいて、2010年にNCIMBで供託されたものである。Croceibacter atlanticusは、ブダペスト条約に基づいて、2010年にNCIMBで供託されたものである。Leewenhoekiella aquoreaは、ブダペスト条約に基づいて、2010年にNCIMBで供託されたものである。
【0050】
本発明の代替の実施形態では、細胞構成要素はさらに分画または分離することができる。分画または分離の方法は、これらに限定されないが、様々な形態のクロマトグラフィー法、サイズ排除法、ゲル電気泳動法、等電点および沈殿分離法を含む。細胞構成要素は、硫酸アンモニウム沈殿法で分画することができる。
【0051】
他の実施形態では、分割活性を有する酵素を、約30%〜40%またはそれを超える硫酸アンモニウム濃度で優先的に沈殿させることができ、かつ/または約50%〜60%またはそれを超える硫酸アンモニウム濃度で優先的に沈殿させることができる。
【0052】
以下の実施例で、特定の具体的な態様および実施形態をさらに例示する。これらの実施例は例示を目的としたのに過ぎず、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでは全くない。
【実施例】
【0053】
(実施例1)
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルの合成。
【0054】
MTBE(1.5L)中のトランス−1,4−ジブロモ−2−ブテン(340.6g、1.33mol)の撹拌溶液に、リチウムtert−ブトキシド(318g、3.325mol)を加える。得られた懸濁液を15℃未満に冷却し、反応温度を確実に15〜20℃に保持しながら、トルエン(875mL)中の(E)−N−フェニルメチレングリシンメチルエステル(310g、1.75mol)の溶液を60分間かけて徐々に加える。20〜25℃でさらに2時間撹拌した後、NaCl溶液(20重量%、2L)を加えて反応をクエンチする。有機相を1M HCl溶液(1.75L、1.75mol)と混合し、20℃で2時間激しく撹拌する。その塊から一定分量を取って中間体イミンがすべて加水分解されていることを確認する。次いで相を分離し、水相を500ml MTBEで洗浄する。次いで水相を13℃に冷却し、pHをNaOH溶液(6M、200mL)で約9に調節する。次いで混合物をMTBE(5L)で抽出し、186gの1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルを含む溶液を得る。
【0055】
(実施例2)
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩の合成。
【0056】
オーバーヘッドスターラーを備えた丸底フラスコに、MTBE(110mL)中の1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステル(7g)の溶液を入れる。次いでメタノール(10mL)を加え、混合物を室温で撹拌する。オルトリン酸(3.5mL)を滴下し、沈殿物を形成させる。添加が完了した後、撹拌をさらに60分間続行する。次いでリン酸塩を濾過により回収し、真空下で乾燥する。リン酸塩を11.72g(約98%)のベージュ色粉末として得る。
【0057】
1H NMR (D4−MeOH): δ 5.82−5.70 (m,1H),5.42 (dd,J=17&1,1H),5.22 (dd,J=10&1,1H),3.86 (s,3H),2.49 (q,J=9,1H),1.85−1.80(m,1H),1.80−1.73(m,1H)。
【0058】
(実施例3)
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩の合成。
【0059】
グラスライン製反応器中で、実施例1に記載した合成手順によって、MTBE(566Kg)中のほぼ1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステル(70Kg)の溶液を調製する。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し濾過した後、メタノール(40Kg)を加える。15℃未満の温度で80%リン酸(60Kg)を40分間かけて徐々に加える。この間に沈殿物が形成する。添加が完了したら、スラリーを10℃未満で少なくともさらに1時間撹拌する。固体を濾過により収集し、MTBEで洗浄し、フィルターから貯蔵容器へ、代表的に23%MTBE含量を有する湿潤した灰白色濾過ケーキとして排出する。約138.5kgの湿潤濾過ケーキを単離する。これは、無溶媒ベースで約106.5kg(約90%収率)の1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルホスフェートに相当する。
【0060】
(実施例4)
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩の合成。
【0061】
丸底フラスコに、MTBE(100mL)中の1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステル(8.5g)の溶液を入れる。次いでメタノール(12mL)を加え、混合物を室温で撹拌する。オルトリン酸(6mL)を滴下すると、沈殿物の形成が始まる。添加が完了した後、撹拌をさらに2時間続行する。濾過によりリン酸塩を回収し、MTBEで洗浄し、真空下で乾燥する。約9.4g(70%収率)の灰白色固体を得る。
【0062】
1H NMR (D4−MeOH): δ 5.81−5.67(m,1H),5.38 (dd,J=16&1,1H),5.19(dd,J=11&1,1H),4.28(q,J=7,2H),2.43(q,J=9,1H),1.80−1.68(m,2H),1.31(t,J=7,3H)。
【0063】
(実施例5)
N−フェニルメチレングリシンメチルエステルからの1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩の合成。
【0064】
MTBE(50mL)中にスラリー化したリチウムt−ブトキシド(31.8g)に、MTBE(100mL)に溶解したトランス−1,4−ジブロモ−2−ブテン(34g)を加える。次いでこの撹拌した反応混合物に、トルエン(90g)中のN−フェニルメチレングリシンメチルエステル(31g)の溶液を加える。添加の間、温度を15℃未満に保持し、続いて反応物を周囲温度で2時間撹拌する。NaCl溶液(20重量%、200mL)を加えて反応物をクエンチする。水相を廃棄し、有機相に約15容量%のメタノールを加える。溶液を5℃未満に冷却し、1モル当量の85%リン酸を徐々に加えてリン酸塩を沈澱させる。混合物を60分間撹拌し、沈殿物を濾過により回収し、MTBEで洗浄する。HPLCで約97%の純度を有する、32.3gの量の1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩(トランス−1,4−ジブロモ−2−ブテンに基づいて85%収率)を得る。
【0065】
(実施例6)
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩のエステラーゼ触媒による生物学的分割。
【0066】
20mLのステムブロック管(stem block tube)に、脱イオン水(4mL)に溶解した1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩(0.5g、2mmol)を入れる。1M NaOH溶液(2mL)を滴下して溶液のpHを8に調節する。混合物を25℃で連続的に撹拌し、凍結乾燥したAQP317(Formosa algae)(200mg)を加える。撹拌を25℃で41時間続行し、次いでHPLC分析により転換率が約50%に達したことを判定する。ガスクロマトグラフィー(GC)分析により、残留エステルの鏡像異性体過剰率が99%に達していることが示される。
【0067】
(実施例7)
エステラーゼ活性のための一次スクリーニング。
【0068】
基質、1−アミノ−2−ビニル−シクロプロパンカルボン酸メチルエステル(200μL、リン酸緩衝生理食塩水中に10g/L)を、ウェル当たり1mgの凍結乾燥された細胞ペーストを含むスクリーニングプレートに塗布する。30℃で終夜インキュベーションした後、反応物をHPLC移動相中にサンプリングし、アミノ酸の形成を分析する。疑わしいヒットのさらなる分析を、キラルGCによりChirasil Dex CBカラム、830KPa(20p.s.i.)のヘリウムキャリアガスで、100℃のオーブン温度(等温)で、トリフルオロアセテートとしての残留エステルの分析により実施する。230の海洋微生物のスクリーニングにより、残留エステル鏡像異性体過剰率90%を超える12のヒットが確認された微生物を特定する。
【0069】
(実施例8)
Aquapharm(商標)生物体スクリーニング。
【0070】
凍結乾燥された生物体調製品(Aquapharm Biodiscovery Ltd.から入手)の12のヒットが確認されたもののうちの8つからなる約4mgのサブセットを、リン酸緩衝生理食塩水+0.1容量%のTween80(pH7)中、またはリン酸緩衝液pH9中、1mLの10g/Lの1−アミノ−2−ビニル−シクロプロパンカルボン酸メチルエステルと一緒に、ガラス製のシンチレーションバイアル瓶に量り込む。これらの混合物を30℃、300rpmで30時間インキュベートする。反応後の残留エステルをGCによりトリフルオロ酢酸誘導体として分析する。結果を表1に示す。すべての試料は、pH9よりpH7でより活性である。
【0071】
一次培養プレートからの回収を試みて、AQP250は不可能であることが判明する。類似した形態を有し同じ供給源から単離された、Psyhcroserpens spと特定されておりAQP383と指定した他の生物体を代替品として使用する。アッセイすると、これも所望の活性を有することが実証される。
【0072】
【表1】
(実施例9)
50g/Lの基質濃度での活性。
【0073】
200mgの凍結乾燥された細胞ペーストと250mgのメチル−1−アミノ−2−ビニル−シクロプロパンカルボキシレートリン酸塩を含む反応物を合計5mLのリン酸緩衝生理食塩水中に調製し、アキラルHPLCを用いて経時的にその転換をモニターする。2つの生物体、AQP317およびAQP383は、アキラルHPLCで判断して、他の確認済みヒットと比較して著しく高い活性度を示し、これらの濃度で基質を完全に分割している。結果を図1にプロットする。
【0074】
(実施例10)
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩のAlcalase触媒による生物学的分割
脱イオン水(45mL)中の1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩(2g、7.9mmol)をジャケット付き容器に入れ、2M水酸化ナトリウム溶液(5mL)を加えることでpHを8に調節する。混合物を35℃で連続的に撹拌し、Novozymesから販売されているAlcalase(登録商標)酵素溶液(6mL)を加える。混合物を連続的に撹拌し、pHを8.15に保持する。一定分量(100μL)を定期的に取る。GC分析はe.e.(鏡像体過剰率)=5.7%(t=24時間)、e.e.=14.3%(t=48時間)およびe.e.=21.4%(t=72時間)を示す。72時間後でも有意の転換は起こっておらず、反応は停止している。反応はスキーム5で表される。
【0075】
(実施例11)
Formosa algae AQP317の無細胞抽出物の調製。
【0076】
AQP317、Formosa algaeの無細胞抽出物を、500mL培養液から(ex of)の500mgの凍結乾燥された細胞ペーストを50mLのPBSに再懸濁させて調製する。細胞懸濁液を、15μmの振幅、4℃で、10秒間オン15秒間オフで30分間、超音波処理する。残渣を4℃、10,000Gで10分間遠心分離により除去する。
【0077】
無細胞抽出物を一連の硫酸アンモニウム沈澱法に供し、沈殿物を4℃、10,000Gで20分間遠心分離により回収する。R. M. C. Dawsonら、eds.、Data for Biochemical Research、Third Edition、537〜539頁、1986年を参照されたい。各ペレットを5mLのリン酸緩衝生理食塩水(Sigma P4417)に再懸濁する。タンパク質含量を、PierceからのCoomassie Plus試薬を用いてアッセイする。同様の実験をPsychroserpens AQP383を用いて実施する。活性は30〜40%で降下することが示される。
【0078】
(実施例12)
生体内変換アッセイ。
【0079】
活性を、リン酸緩衝生理食塩水中に10mMの1−アミノ2−ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルリン酸塩を含む1mLシンチレーションバイアル瓶でアッセイする。2.5時間後に反応物をサンプリングし、HPLC移動相に1:5で希釈し次いで分析する。次いで転換率を、存在する酵素活性単位数を算出するために用いる。結果を表2に示す。
【0080】
(実施例13)
分割活性の単離。
【0081】
AQP317およびAQP383の無細胞抽出物を標準的な手法を用いて分画する。種々の画分を、1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に暴露し、30℃で30時間インキュベートする。次いで異なる画分を、上記に説明したような鏡像異性体比の変化について試験する。分割活性を有する画分を、ゲル電気泳動によりさらに分画および/または分離する。さらなる画分およびゲル単離物を分割活性について試験する。分割活性を有する単一化合物をエステラーゼとして単離し特定する。単離したエステラーゼを、カルボキシルおよび/もしくはアミノペプチド配列決定またはタンパク質質量分析にかける。次いで配列情報を用いて、エステラーゼをコードする遺伝子の単離のための推定プライマー対を作り出すか、または全遺伝子の合成ができるようにする。AQP317およびAQP383、Leuwenhoekiella blandensis、Croceibacter atlanticusならびにLeuwenhoekiella aquoreaのDNA抽出物を作製し、PCRを、推定プライマー対を用いて実施する。PCR産生物を分析し、エステラーゼをコード化する配列を単離し、ベクター中にクローン化し、次いで配列決定する。
【0082】
(実施例14)
クローン化したポリペプチドの活性の実証
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、当業者に公知の標準的な手法を用いて、Pseudomonas発現系にクローン化する。
【0083】
組み換えエステラーゼの培養物を25℃で成長させ、24時間の成長後に誘発させ、誘発後に間隔を置いて1mL試料を取り、マイクロ遠心分離にかける。ペレットを1mL、20g/Lの1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸メチルエステルリン酸塩pH7に再懸濁させ、25℃でインキュベートする。144時間反応させた後、残留エステルをMTBEで抽出し、トリフルオロ酢酸無水物で誘導化し、ガスクロマトグラフィーで分析する。残留エステルは87%の鏡像異性体過剰率を有する。
【0084】
【表2】
【図2−1】
【図2−2】
【図2−3】
【図2−4】
【図3−1】
【図3−2】
【図3−3】
【図3−4】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式(4)の化合物
【化13】
(式中、Rはアルキル基であり、nは1〜3の整数であり、HXは、リン酸、硫酸、β,β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸または4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸である)。
【請求項2】
Rがメチルまたはエチルである、請求項1に記載の化合物。
【請求項3】
Rがメチルであり、HXがリン酸である、請求項1に記載の化合物。
【請求項4】
Rがエチルであり、HXがリン酸である、請求項1に記載の化合物。
【請求項5】
式(3)の化合物を酸HXと反応させるステップを含む式(4)の化合物を製造するための方法
【化14】
(式中、Rはアルキル基であり、nは1〜3の整数であり、HXは、リン酸、硫酸、β,β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸または4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸である)。
【請求項6】
反応させるステップを有機溶媒中で実施する、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
反応させるステップを、MTBE、酢酸エチル、ジクロロメタン、酢酸イソプロピルまたはトルエンを含む溶媒中で実施する、請求項5に記載の方法。
【請求項8】
反応させるステップを、水溶性共溶媒と組み合わせてMTBE、酢酸エチル、ジクロロメタン、酢酸イソプロピル、またはトルエンを含む溶媒中で実施する、請求項5に記載の方法。
【請求項9】
前記式(4)の化合物を濾過により単離する、請求項5に記載の方法。
【請求項10】
式(5)のイミノエステル中間体を酸HXで加水分解するステップを含む式(4)の化合物を製造する方法
【化15】
(式中、Rはアルキル基であり、nは1〜3の整数であり、HXは、リン酸、硫酸、β,β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸または4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸である)。
【請求項11】
前記式(5)のイミノエステル中間体を、式(7)のトランス−1,4−ジハロブタ−2−エンを用いた(E)−N−フェニルメチレングリシンアルキルエステル(6)のジアルキル化によって得る、請求項10に記載の方法。
【化16】
【請求項12】
ジアルキル化に続いて、前記式(5)のイミノエステル中間体を単離せずに加水分解する、請求項11に記載の方法。
【請求項13】
HXがリン酸である、請求項10に記載の方法。
【請求項14】
前記式(4)の化合物を濾過により単離する、請求項10に記載のプロセス。
【請求項15】
さらなる緩衝剤を用いずに生物学的分割プロセスにおいて式(4)の化合物を使用するステップを含む、ヒドロラーゼ触媒による生物学的分割のための方法。
【請求項16】
ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる酵素を特定する方法であって:
a)ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと;
b)細胞構成要素を前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に暴露するステップと;
c)前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を、鏡像異性体比の変化について試験するステップと;
d)前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に対して分割活性を有する酵素を単離するステップと;
e)前記酵素を特定するステップと
を含む方法。
【請求項17】
前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物が塩の形態である、請求項16に記載の方法。
【請求項18】
前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物がリン酸塩、ナトリウム塩、硝酸塩またはカルシウム塩である、請求項16に記載の方法。
【請求項19】
暴露が流体接触である、請求項16に記載の方法。
【請求項20】
細胞構成要素を、動物、植物、細菌、古細菌、菌類、海洋生物、海藻、Formosa sp.、Psychroserpens sp.、Shewanella sp.、Winogradskyella sp.、Leeuwenhoekiella blandensis、Croceibacter atlanticusおよびLeeuwenhoekiella aequorea、Aquamarina,sp.、AQP317およびAQP383から得る、請求項16に記載の方法。
【請求項21】
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割する方法であって:
a)1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと;
b)1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルの前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を細胞構成要素に暴露するステップと
を含む方法。
【請求項22】
細胞構成要素を、動物、植物、細菌、古細菌、菌類、海洋生物、海藻、Formosa sp.、Psychroserpens sp.、Shewanella sp.、Winogradskyella sp.、Leeuwenhoekiella blandensis、Croceibacter atlanticus、Leeuwenhoekiella aequorea、Aquamarina sp.、AQP317およびAQP383から得る、請求項21に記載の方法。
【請求項23】
細胞構成要素が、図2の配列を有するタンパク質を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項24】
細胞構成要素が、図3の配列を有するタンパク質を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項1】
式(4)の化合物
【化13】
(式中、Rはアルキル基であり、nは1〜3の整数であり、HXは、リン酸、硫酸、β,β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸または4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸である)。
【請求項2】
Rがメチルまたはエチルである、請求項1に記載の化合物。
【請求項3】
Rがメチルであり、HXがリン酸である、請求項1に記載の化合物。
【請求項4】
Rがエチルであり、HXがリン酸である、請求項1に記載の化合物。
【請求項5】
式(3)の化合物を酸HXと反応させるステップを含む式(4)の化合物を製造するための方法
【化14】
(式中、Rはアルキル基であり、nは1〜3の整数であり、HXは、リン酸、硫酸、β,β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸または4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸である)。
【請求項6】
反応させるステップを有機溶媒中で実施する、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
反応させるステップを、MTBE、酢酸エチル、ジクロロメタン、酢酸イソプロピルまたはトルエンを含む溶媒中で実施する、請求項5に記載の方法。
【請求項8】
反応させるステップを、水溶性共溶媒と組み合わせてMTBE、酢酸エチル、ジクロロメタン、酢酸イソプロピル、またはトルエンを含む溶媒中で実施する、請求項5に記載の方法。
【請求項9】
前記式(4)の化合物を濾過により単離する、請求項5に記載の方法。
【請求項10】
式(5)のイミノエステル中間体を酸HXで加水分解するステップを含む式(4)の化合物を製造する方法
【化15】
(式中、Rはアルキル基であり、nは1〜3の整数であり、HXは、リン酸、硫酸、β,β−ジメチルグルタル酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸または4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸である)。
【請求項11】
前記式(5)のイミノエステル中間体を、式(7)のトランス−1,4−ジハロブタ−2−エンを用いた(E)−N−フェニルメチレングリシンアルキルエステル(6)のジアルキル化によって得る、請求項10に記載の方法。
【化16】
【請求項12】
ジアルキル化に続いて、前記式(5)のイミノエステル中間体を単離せずに加水分解する、請求項11に記載の方法。
【請求項13】
HXがリン酸である、請求項10に記載の方法。
【請求項14】
前記式(4)の化合物を濾過により単離する、請求項10に記載のプロセス。
【請求項15】
さらなる緩衝剤を用いずに生物学的分割プロセスにおいて式(4)の化合物を使用するステップを含む、ヒドロラーゼ触媒による生物学的分割のための方法。
【請求項16】
ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割することができる酵素を特定する方法であって:
a)ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと;
b)細胞構成要素を前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に暴露するステップと;
c)前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を、鏡像異性体比の変化について試験するステップと;
d)前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物に対して分割活性を有する酵素を単離するステップと;
e)前記酵素を特定するステップと
を含む方法。
【請求項17】
前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物が塩の形態である、請求項16に記載の方法。
【請求項18】
前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物がリン酸塩、ナトリウム塩、硝酸塩またはカルシウム塩である、請求項16に記載の方法。
【請求項19】
暴露が流体接触である、請求項16に記載の方法。
【請求項20】
細胞構成要素を、動物、植物、細菌、古細菌、菌類、海洋生物、海藻、Formosa sp.、Psychroserpens sp.、Shewanella sp.、Winogradskyella sp.、Leeuwenhoekiella blandensis、Croceibacter atlanticusおよびLeeuwenhoekiella aequorea、Aquamarina,sp.、AQP317およびAQP383から得る、請求項16に記載の方法。
【請求項21】
1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を分割する方法であって:
a)1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルのラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を提供するステップと;
b)1−アミノ−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸のエステルの前記ラセミ混合物または一部鏡像異性体的に富化された混合物を細胞構成要素に暴露するステップと
を含む方法。
【請求項22】
細胞構成要素を、動物、植物、細菌、古細菌、菌類、海洋生物、海藻、Formosa sp.、Psychroserpens sp.、Shewanella sp.、Winogradskyella sp.、Leeuwenhoekiella blandensis、Croceibacter atlanticus、Leeuwenhoekiella aequorea、Aquamarina sp.、AQP317およびAQP383から得る、請求項21に記載の方法。
【請求項23】
細胞構成要素が、図2の配列を有するタンパク質を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項24】
細胞構成要素が、図3の配列を有するタンパク質を含む、請求項20に記載の方法。
【図1】
【公表番号】特表2012−532146(P2012−532146A)
【公表日】平成24年12月13日(2012.12.13)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−518620(P2012−518620)
【出願日】平成22年7月2日(2010.7.2)
【国際出願番号】PCT/US2010/040900
【国際公開番号】WO2011/003063
【国際公開日】平成23年1月6日(2011.1.6)
【出願人】(399131150)ドクター・レディーズ・ラボラトリーズ・リミテッド (19)
【出願人】(506017137)ドクター レディズ ラボラトリーズ, インコーポレイテッド (24)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成24年12月13日(2012.12.13)
【国際特許分類】
【出願日】平成22年7月2日(2010.7.2)
【国際出願番号】PCT/US2010/040900
【国際公開番号】WO2011/003063
【国際公開日】平成23年1月6日(2011.1.6)
【出願人】(399131150)ドクター・レディーズ・ラボラトリーズ・リミテッド (19)
【出願人】(506017137)ドクター レディズ ラボラトリーズ, インコーポレイテッド (24)
【Fターム(参考)】
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