アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途
【課題】アミノ酸資化能の高い醸造酵母、アミノ酸含有量が低く、アミノ酸組成に特徴のある酒類の製造法などを提供する。
【解決手段】醸造酵母のアミノ酸トランスポーターであるGap1p、Agp2p、Mup1pまたはMup3pをコードする遺伝子GAP1、AGP2、MUP1またはMUP3、特にビール酵母に特徴的なnonScGAP1、nonScAGP2、nonScMUP1またはnonScMUP3遺伝子の発現量を高めることによって、アミノ酸資化能を向上させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法。
【解決手段】醸造酵母のアミノ酸トランスポーターであるGap1p、Agp2p、Mup1pまたはMup3pをコードする遺伝子GAP1、AGP2、MUP1またはMUP3、特にビール酵母に特徴的なnonScGAP1、nonScAGP2、nonScMUP1またはnonScMUP3遺伝子の発現量を高めることによって、アミノ酸資化能を向上させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途に関し、特に、アミノ酸資化性に優れた醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のアミノ酸トランスポーターであるGap1p、Agp2p、Mup1pまたはMup3pをコードする遺伝子GAP1、AGP2、MUP1またはMUP3、特にビール酵母に特徴的なnonScGAP1、nonScAGP2、nonScMUP1またはnonScMUP3遺伝子の発現量を高めることによって、アミノ酸資化能を向上させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般にアミノ酸は酒類の呈味成分として重要であり、品質を左右する重要な要素であることが知られている。そのため、目的の酒質にあわせてアミノ酸の量をコントロールする事は、新しいタイプの種類の開発において重要である。
しかしながら、アミノ酸は発酵中に酵母によって窒素源として資化されるため、発酵終了時のアミノ酸の含有量をコントロールする事はきわめて困難である。
酵母が細胞外のアミノ酸を窒素源として利用するためには、アミノ酸を菌体内に取り込むことが必須である。このようなアミノ酸の取り込みには酵母の細胞膜に存在するアミノ酸トランスポーターが関与していることが明らかとなっている。
酵母のアミノ酸トランスポーターとしては基質特異性の低いGap1や基質特異性の異なる多くのアミノ酸トランスポーター(アミノ酸トランスポーターTAT2、アルギニントランスポーターCan1、プロリントランスポーターPut4等（非特許文献１；Mol Cell Biol. 14:6597-6606,1994、非特許文献2；Curr Genet 36:317-328, 1999）が知られている。
これまでに、酒類中のアミノ酸含量をコントロールするためにアミノ酸の取り込みに関与する遺伝子(gap1,shr3,can1, put4, uga4)の変異を有する酵母を用いた例(特許文献１；特開2001-321159号公報)や分枝アミノ酸トランスポーターBAP2を高発現させた例（特許文献２；特開2000-316559号公報）が報告されている。
【特許文献１】特開2001-321159号公報
【特許文献２】特開2000-316559号公報
【非特許文献１】Mol Cell Biol. 14:6597-6606,1994
【非特許文献２】Curr Genet 36:317-328, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
酒中のアミノ酸組成を改変し、特徴ある品質を有する酒類を製造するために、アミノ酸の資化がコントロールされた酵母が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から既知のタンパク質より有利な効果を奏するアミノ酸トランスポーターをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、アミノ酸の資化が促進されることを確認して、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち本発明は、ビール酵母に特徴的に存在する新規なアミノ酸トランスポーター遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる酒類の製造方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【０００６】
（１）以下の(a)〜(ｆ)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(ｆ)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【０００７】
（２）以下の(g)〜(i)のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列、又は配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（３）配列番号：１または配列番号：３または配列番号：５または配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【０００８】
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（７a）以下の(a)〜(c)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（８）上記（７）に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
（９）上記（７）に記載のベクターを導入することによって、アミノ酸の資化能が増強された上記(８)に記載の醸造用酵母。
（１０）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってアミノ酸の資化能が向上した上記（９）に記載の醸造用酵母。
（１１）上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１２）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１１）に記載の酒類の製造方法。
（１３）醸造する酒類がワインである上記（１１）に記載の酒類の製造方法。
（１４）上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
（１５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のアミノ酸資化能について評価する方法。
（１５a）上記（１５）に記載の方法によって、アミノ酸資化能が高い酵母を選別する方法。
（１５b）上記（１５a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１６）被検酵母を培養し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のアミノ酸資化能を評価する方法。
（１６a）上記（１６）に記載の方法で、被検酵母を評価し、アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量が高い酵母を選別する、アミノ酸資化能の高い酵母を選別する方法。
（１６b）上記（１６a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１７）被検酵母を培養し、請求項６に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とするアミノ酸資化能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（１８）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、上記（１７）記載の酵母の選択方法。
（１９）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（１７）に記載の酵母の選択方法。
（２０）上記（８）〜（１０）に記載の酵母および上記（１７）〜（１９）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、アミノ酸含有量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、アミノ酸の資化が促進されるため、酒中のアミノ酸組成を改変することができ、特徴ある品質を有する酒類の製造が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明者らは、酵母のアミノ酸トランスポーターの活性を増大させることによって、さらに効率よくアミノ酸を資化させることが可能であると考えた。このような着想に基づいて研究を重ね、特開2004-283169に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のアミノ酸トランスポーターをコードするnonScGAP1、nonScAGP2、nonScMUP1及びnonScMUP3遺伝子を単離・同定した。これらの遺伝子の塩基配列を配、それぞれ、列番号：１、配列番号：３、配列番号：５及び配列番号：７に示す。またこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６及び配列番号：８に示す。
【００１１】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１、３、５または７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（具体的には、DNA、以下、これらを単に「DNA」とも称する）；及び(b)配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするDNAは、上記のビール酵母由来のアミノ酸トランスポーターをコードするDNAに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のDNAを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列において、例えば、１〜100個、１〜90個、１〜80個、１〜70個、１〜60個、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、アミノ酸トランスポーター活性は、例えば（J. Bacteriology 121:562-570,1975）に記載の方法によって測定することができる。
【００１２】
また、本発明は、(e)配列番号：１、３、５または７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００１３】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA）」とは、配列番号：１、３、５または７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列をコードするDNAの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるDNAをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００１４】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１５】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
【００１６】
これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列をコードするDNAと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（proc. Natl． Acad． Sci． USA 872264-2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J Mol Biol 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００１７】
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(e)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００１８】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００１９】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２０】
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
【００２１】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の糖やアミノ酸などの成分の濃度に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
【００２２】
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００２３】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリイオン金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。 その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genitics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００２４】
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによってアミノ酸の組成に特徴のある酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、発酵期間の短縮された酒類を製造するためのコストの増加はない。つまり、本発明によれば、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
【００２５】
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１、３、５または７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のアミノ酸資化能について評価する方法に関する。プライマーまたはプローブを用いる評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
【００２６】
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のアミノ酸資化能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
【００２７】
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１、３、５または７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のアミノ酸資化能を評価することもできる。なお、アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、アミノ酸トランスポーター遺伝子の転写産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的RT-PCRによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
【００２８】
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１、３、５または７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とするアミノ酸資化能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１、３、５または７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である株を選択することによって酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
【００２９】
あるいは、被検酵母を培養して、アミノ酸資化能の高い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母又は基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、EMS（エチルメタンスルホネート）、N-メチル-N-ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センターなど参照）。
【００３０】
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母などが挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母群から任意の組合せで選択してもよい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１：新規アミノ酸トランスポーター（nonScGAP1, nonScAGP2, nonScMUP1, nonScMUP3）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の新規アミノ酸トランスポーター遺伝子nonScGAP1, nonScAGP2, nonScMUP1, nonScMUP3を見出した（配列番号：１、３，５，７）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScGAP1_F（配列番号：9）／nonScGAP1_R（配列番号：10）、nonSc AGP2_F（配列番号：11）／nonSc AGP2_R（配列番号：12）、nonScMUP1_F（配列番号：13）／nonScMUP1_R（配列番号：14）、nonSc MUP3_F（配列番号：15）／nonSc MUP3_R（配列番号：16）、を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScGAP1, nonScAGP2, nonScMuP1及び nonScMUP3の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
【００３３】
上記のようにして得られたnonScGAP1, nonScAGP2, nonScMUP1及び nonScMUP3遺伝子断片を、それぞれ、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。nonScGAP1, nonScAGP2, nonScMUP1及び nonScMUP3遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００３４】
実施例２：ビール試醸中のnonScGAP1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図1）、外観エキス濃度（図2）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、特開2004-283169に記載のビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScGAP1, nonScAGP2, nonScMuP1, nonScMUP3遺伝子の発現パターンを図3、図4、図5、図6に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScGAP1、nonScAGP2、nonScMUP1及びnonScMUP3遺伝子がそれぞれ発現していることを確認した。
【００３５】
実施例３：nonScGAP1、nonScAGP2、nonScMUP1、nonScMUP3遺伝子の構成的発現
実施例１に記載のnonScGAP1/pCR2.1-TOPO、nonScAGP2/pCR2.1-TOPO、 nonScMUP1/pCR2.1-TOPO、nonScMUP3/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製する。この断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、構成的発現ベクターnonScGAP1/pYCGPYNot、nonScAGP2/pYCGPYNot、nonScMUP1/pYCGPYNot、nonScMUP3/pYCGPYNot、を構築した。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって構成的に発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
【００３６】
上述の方法で作製した構成的発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株を形質転換した。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択する。
【００３７】
実施例４：ビール試験醸造におけるアミノ酸資化量の測定
親株ならびに実施例3で得られたnonScGAP1、nonScAGP2、nonScMUP1及びnonScMUP3高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度 12%
麦汁容量 1L
麦汁溶存酸素濃度 約 8ppm
発酵温度 12℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）、エキス消費量の経時変化を調べる。さらに発酵終了後のビールのアミノ酸組成をL-8800高速アミノ酸分析計（日立社製）及び標準アミノ酸分析カラム P/N855-3506（日立製作所社製）を用いて測定する。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の酒類製造法によれば、酵母のアミノ酸資化能が増大するため、アミノ酸含有量が低く、アミノ酸組成に特徴のある酒類を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScGAP1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図４】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScAGP2遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図５】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScMUP1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図６】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScMUP3遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
［配列番号：９］ プライマー
［配列番号：１０］ プライマー
［配列番号：１１］ プライマー
［配列番号：１２］ プライマー
［配列番号：１３］ プライマー
［配列番号：１４］ プライマー
［配列番号：１５］ プライマー
［配列番号：１６］ プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途に関し、特に、アミノ酸資化性に優れた醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のアミノ酸トランスポーターであるGap1p、Agp2p、Mup1pまたはMup3pをコードする遺伝子GAP1、AGP2、MUP1またはMUP3、特にビール酵母に特徴的なnonScGAP1、nonScAGP2、nonScMUP1またはnonScMUP3遺伝子の発現量を高めることによって、アミノ酸資化能を向上させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般にアミノ酸は酒類の呈味成分として重要であり、品質を左右する重要な要素であることが知られている。そのため、目的の酒質にあわせてアミノ酸の量をコントロールする事は、新しいタイプの種類の開発において重要である。
しかしながら、アミノ酸は発酵中に酵母によって窒素源として資化されるため、発酵終了時のアミノ酸の含有量をコントロールする事はきわめて困難である。
酵母が細胞外のアミノ酸を窒素源として利用するためには、アミノ酸を菌体内に取り込むことが必須である。このようなアミノ酸の取り込みには酵母の細胞膜に存在するアミノ酸トランスポーターが関与していることが明らかとなっている。
酵母のアミノ酸トランスポーターとしては基質特異性の低いGap1や基質特異性の異なる多くのアミノ酸トランスポーター(アミノ酸トランスポーターTAT2、アルギニントランスポーターCan1、プロリントランスポーターPut4等（非特許文献１；Mol Cell Biol. 14:6597-6606,1994、非特許文献2；Curr Genet 36:317-328, 1999）が知られている。
これまでに、酒類中のアミノ酸含量をコントロールするためにアミノ酸の取り込みに関与する遺伝子(gap1,shr3,can1, put4, uga4)の変異を有する酵母を用いた例(特許文献１；特開2001-321159号公報)や分枝アミノ酸トランスポーターBAP2を高発現させた例（特許文献２；特開2000-316559号公報）が報告されている。
【特許文献１】特開2001-321159号公報
【特許文献２】特開2000-316559号公報
【非特許文献１】Mol Cell Biol. 14:6597-6606,1994
【非特許文献２】Curr Genet 36:317-328, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
酒中のアミノ酸組成を改変し、特徴ある品質を有する酒類を製造するために、アミノ酸の資化がコントロールされた酵母が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から既知のタンパク質より有利な効果を奏するアミノ酸トランスポーターをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、アミノ酸の資化が促進されることを確認して、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち本発明は、ビール酵母に特徴的に存在する新規なアミノ酸トランスポーター遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる酒類の製造方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【０００６】
（１）以下の(a)〜(ｆ)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(ｆ)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【０００７】
（２）以下の(g)〜(i)のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列、又は配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（３）配列番号：１または配列番号：３または配列番号：５または配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【０００８】
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（７a）以下の(a)〜(c)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（８）上記（７）に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
（９）上記（７）に記載のベクターを導入することによって、アミノ酸の資化能が増強された上記(８)に記載の醸造用酵母。
（１０）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってアミノ酸の資化能が向上した上記（９）に記載の醸造用酵母。
（１１）上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１２）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１１）に記載の酒類の製造方法。
（１３）醸造する酒類がワインである上記（１１）に記載の酒類の製造方法。
（１４）上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
（１５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のアミノ酸資化能について評価する方法。
（１５a）上記（１５）に記載の方法によって、アミノ酸資化能が高い酵母を選別する方法。
（１５b）上記（１５a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１６）被検酵母を培養し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のアミノ酸資化能を評価する方法。
（１６a）上記（１６）に記載の方法で、被検酵母を評価し、アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量が高い酵母を選別する、アミノ酸資化能の高い酵母を選別する方法。
（１６b）上記（１６a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１７）被検酵母を培養し、請求項６に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とするアミノ酸資化能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（１８）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、上記（１７）記載の酵母の選択方法。
（１９）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（１７）に記載の酵母の選択方法。
（２０）上記（８）〜（１０）に記載の酵母および上記（１７）〜（１９）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、アミノ酸含有量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、アミノ酸の資化が促進されるため、酒中のアミノ酸組成を改変することができ、特徴ある品質を有する酒類の製造が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明者らは、酵母のアミノ酸トランスポーターの活性を増大させることによって、さらに効率よくアミノ酸を資化させることが可能であると考えた。このような着想に基づいて研究を重ね、特開2004-283169に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のアミノ酸トランスポーターをコードするnonScGAP1、nonScAGP2、nonScMUP1及びnonScMUP3遺伝子を単離・同定した。これらの遺伝子の塩基配列を配、それぞれ、列番号：１、配列番号：３、配列番号：５及び配列番号：７に示す。またこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６及び配列番号：８に示す。
【００１１】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１、３、５または７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（具体的には、DNA、以下、これらを単に「DNA」とも称する）；及び(b)配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするDNAは、上記のビール酵母由来のアミノ酸トランスポーターをコードするDNAに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のDNAを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列において、例えば、１〜100個、１〜90個、１〜80個、１〜70個、１〜60個、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、アミノ酸トランスポーター活性は、例えば（J. Bacteriology 121:562-570,1975）に記載の方法によって測定することができる。
【００１２】
また、本発明は、(e)配列番号：１、３、５または７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００１３】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA）」とは、配列番号：１、３、５または７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列をコードするDNAの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるDNAをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００１４】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１５】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
【００１６】
これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列をコードするDNAと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（proc. Natl． Acad． Sci． USA 872264-2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J Mol Biol 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００１７】
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(e)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００１８】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００１９】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２０】
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
【００２１】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の糖やアミノ酸などの成分の濃度に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
【００２２】
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００２３】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリイオン金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。 その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genitics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００２４】
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによってアミノ酸の組成に特徴のある酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、発酵期間の短縮された酒類を製造するためのコストの増加はない。つまり、本発明によれば、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
【００２５】
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１、３、５または７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のアミノ酸資化能について評価する方法に関する。プライマーまたはプローブを用いる評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
【００２６】
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のアミノ酸資化能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
【００２７】
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１、３、５または７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のアミノ酸資化能を評価することもできる。なお、アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、アミノ酸トランスポーター遺伝子の転写産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的RT-PCRによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
【００２８】
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１、３、５または７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とするアミノ酸資化能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１、３、５または７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である株を選択することによって酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
【００２９】
あるいは、被検酵母を培養して、アミノ酸資化能の高い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母又は基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、EMS（エチルメタンスルホネート）、N-メチル-N-ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センターなど参照）。
【００３０】
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母などが挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母群から任意の組合せで選択してもよい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１：新規アミノ酸トランスポーター（nonScGAP1, nonScAGP2, nonScMUP1, nonScMUP3）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の新規アミノ酸トランスポーター遺伝子nonScGAP1, nonScAGP2, nonScMUP1, nonScMUP3を見出した（配列番号：１、３，５，７）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScGAP1_F（配列番号：9）／nonScGAP1_R（配列番号：10）、nonSc AGP2_F（配列番号：11）／nonSc AGP2_R（配列番号：12）、nonScMUP1_F（配列番号：13）／nonScMUP1_R（配列番号：14）、nonSc MUP3_F（配列番号：15）／nonSc MUP3_R（配列番号：16）、を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScGAP1, nonScAGP2, nonScMuP1及び nonScMUP3の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
【００３３】
上記のようにして得られたnonScGAP1, nonScAGP2, nonScMUP1及び nonScMUP3遺伝子断片を、それぞれ、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。nonScGAP1, nonScAGP2, nonScMUP1及び nonScMUP3遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００３４】
実施例２：ビール試醸中のnonScGAP1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図1）、外観エキス濃度（図2）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、特開2004-283169に記載のビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScGAP1, nonScAGP2, nonScMuP1, nonScMUP3遺伝子の発現パターンを図3、図4、図5、図6に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScGAP1、nonScAGP2、nonScMUP1及びnonScMUP3遺伝子がそれぞれ発現していることを確認した。
【００３５】
実施例３：nonScGAP1、nonScAGP2、nonScMUP1、nonScMUP3遺伝子の構成的発現
実施例１に記載のnonScGAP1/pCR2.1-TOPO、nonScAGP2/pCR2.1-TOPO、 nonScMUP1/pCR2.1-TOPO、nonScMUP3/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製する。この断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、構成的発現ベクターnonScGAP1/pYCGPYNot、nonScAGP2/pYCGPYNot、nonScMUP1/pYCGPYNot、nonScMUP3/pYCGPYNot、を構築した。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって構成的に発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
【００３６】
上述の方法で作製した構成的発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株を形質転換した。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択する。
【００３７】
実施例４：ビール試験醸造におけるアミノ酸資化量の測定
親株ならびに実施例3で得られたnonScGAP1、nonScAGP2、nonScMUP1及びnonScMUP3高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度 12%
麦汁容量 1L
麦汁溶存酸素濃度 約 8ppm
発酵温度 12℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）、エキス消費量の経時変化を調べる。さらに発酵終了後のビールのアミノ酸組成をL-8800高速アミノ酸分析計（日立社製）及び標準アミノ酸分析カラム P/N855-3506（日立製作所社製）を用いて測定する。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の酒類製造法によれば、酵母のアミノ酸資化能が増大するため、アミノ酸含有量が低く、アミノ酸組成に特徴のある酒類を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScGAP1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図４】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScAGP2遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図５】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScMUP1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図６】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScMUP3遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
［配列番号：９］ プライマー
［配列番号：１０］ プライマー
［配列番号：１１］ プライマー
［配列番号：１２］ プライマー
［配列番号：１３］ プライマー
［配列番号：１４］ プライマー
［配列番号：１５］ プライマー
［配列番号：１６］ プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(f)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i)のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列、又は配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
【請求項９】
請求項７に記載のベクターを導入することによって、アミノ酸資化能が向上した請求項８に記載の醸造用酵母。
【請求項１０】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってアミノ酸資化能が向上した請求項９に記載の醸造用酵母。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１２】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１１に記載の酒類の製造方法。
【請求項１３】
醸造する酒類がワインである請求項１１に記載の酒類の製造方法。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１５】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のアミノ酸資化能について評価する方法。
【請求項１６】
被検酵母を培養し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のアミノ酸資化能を評価する方法。
【請求項１７】
被検酵母を培養し、請求項６に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とするアミノ酸資化能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項１８】
基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、請求項１７記載の酵母の選択方法。
【請求項１９】
基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、請求項１７に記載の酵母の選択方法。
【請求項２０】
請求項８〜１０に記載の酵母および請求項１７〜１９に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、アミノ酸含有量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【請求項１】
以下の(a)〜(f)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i)のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列、又は配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
【請求項９】
請求項７に記載のベクターを導入することによって、アミノ酸資化能が向上した請求項８に記載の醸造用酵母。
【請求項１０】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってアミノ酸資化能が向上した請求項９に記載の醸造用酵母。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１２】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１１に記載の酒類の製造方法。
【請求項１３】
醸造する酒類がワインである請求項１１に記載の酒類の製造方法。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１５】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のアミノ酸資化能について評価する方法。
【請求項１６】
被検酵母を培養し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のアミノ酸資化能を評価する方法。
【請求項１７】
被検酵母を培養し、請求項６に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とするアミノ酸資化能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項１８】
基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1の塩基配列を有するアミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、請求項１７記載の酵母の選択方法。
【請求項１９】
基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、請求項１７に記載の酵母の選択方法。
【請求項２０】
請求項８〜１０に記載の酵母および請求項１７〜１９に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、アミノ酸含有量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１６５３５３（Ｐ２００９−１６５３５３Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５５４８（Ｐ２００６−５５５４８）
【出願日】平成１８年３月１日（２００６．３．１）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー酒類株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１日（２００６．３．１）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー酒類株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
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