アミロイド線維伸長ペプチド
【課題】アミロイド線維を形成しうる危険性やその「種」となるアミロイド線維核、あるいはその元になるタンパク質分子種の量を見積もる診断薬を開発し、早期にアミロイド病に罹病していること、あるいは罹病する可能性があることを判断、アミロイド病の予防薬や治療薬の開発。
【解決手段】ヒトのαシヌクレイン蛋白のアミロイド線維コアー部位ペプチドである７６番目から９４番目〜９６番目に相当するペプチド、それらの９４番目のＰｈｅが他のアミノ酸に置換されたペプチド、ならびにそれらのアミロイド病の検査、予防または治療における使用。
【解決手段】ヒトのαシヌクレイン蛋白のアミロイド線維コアー部位ペプチドである７６番目から９４番目〜９６番目に相当するペプチド、それらの９４番目のＰｈｅが他のアミノ酸に置換されたペプチド、ならびにそれらのアミロイド病の検査、予防または治療における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイド線維伸長ペプチド、アミロイド病の検査におけるその使用、ならびにアミロイド病の予防または治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学の進歩によって人の寿命が延び、世界的に高齢化社会に向かっている。ここで、新たな病気として、人の尊厳や生活の質に深く関わっている認知症をはじめとする脳神経変性病が生じ、社会的な問題となっている。アルツハイマー病やパーキンソン病、プリオン病（狂牛病）をはじめとする脳神経変性病は、特殊なタンパク質（それぞれ、Ａβ１−４２、αシヌクレイン、プリオン）の構造が変化して、β構造に富んだアミロイド線維という不溶性の物質を細胞内外で長い年月をかけて蓄積することによって発症するとされている。
【０００３】
また、脳神経変性病に限らず、体の様々な臓器や血液中においても、ある種のタンパク質が高濃度で長期間存在するとアミロイド線維を形成し、臓器や組織に沈着することで病気が発症する。これらの病気はアミロイド病（アミロイドーシス）と呼ばれており、２０種類以上の病気が知られている（非特許文献１）。例えば、β２ミクログロブリンが血中に高濃度で存在すると関節などにアミロイド線維が蓄積して痛みを生じる。β２ミクログロブリンは人工透析を行っている患者の血液中に高濃度に蓄積されることが知られており、日本でも数十万人がそのアミロイド病の発症予備軍となりうる。さらに、膵臓や肝臓などに蓄積して全身性アミロイドーシスを引き起こすインスリンやアミリン、リゾチームなどもアミロイド線維を形成することが知られている。
【０００４】
アミロイド線維の形成は、タンパク質の安定性とも大きく関係しており、コンフォーメーション変化が起こり、アミロイド線維の種（シード）に相当するものが先ず形成され、その後、その「種」に次々と構造変化したタンパク質が結合して伸長してアミロイド線維が形成される、いわゆる「核形成−核依存的伸長」の機構で起こることが分かっている。
【０００５】
高齢化社会の中で多くの人が質の高い生活を享受するためには、神経変性病をはじめとするアミロイド病の克服が大きなポイントとなる。このためには、アミロイド病を早期に診断する技術を開発する必要がある。さらに、アミロイド病の予防薬や治療薬の開発も必要となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】G.T.Westermark and P.Westermark, Amyloid, Vol.7, 19 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アミロイド線維を形成しうる危険性やその「種」となるアミロイド線維核、あるいはその元になるタンパク質分子種の量を見積もる診断薬を開発し、早期にアミロイド病に罹病していること、あるいは罹病する可能性があることを判断することが必要である。そして、アミロイド病の予防薬や治療薬の開発も必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、αシヌクレインの特定の部分ペプチドが、αシヌクレイン以外の様々なアミロイド性タンパク質の「種」に対して伸長する能力を有することを見出した。さらに本発明者らは、これらのペプチドの特定の変異体が、自らはアミロイド核形成を起こさないが、アミロイド核が存在する場合にはアミロイド線維伸長反応を起こすことを見出した。本発明者らは、これらの知見から本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、以下のものに関する。
（１）下記（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ（配列番号：１）、
（ｂ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ（配列番号：２）、
（ｃ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：３）、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド
［（ａ）〜（ｃ）においてＸａａはＰｈｅ以外のいずれかのアミノ酸を意味し、（ｄ）に記載のペプチドにおいてＸａａは保持されている］
からなる群より選択されるペプチド。
（２）ＸａａがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＡｒｇである、（１）記載のペプチド。
（３）ＸａａがＧｌｙである（２）記載のペプチド。
（４）下記（ｅ）〜（ｇ）：
（ｅ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：４）、
（ｆ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号：５）、および
（ｇ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：６）
からなる群より選択される（３）記載のペプチド。
（５）標識されている（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドを含む、アミロイド病の検査用組成物。
（７）（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドを構成成分として含む、アミロイド病の検査用キット。
（８）対象から得た試料に（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドを接触させ、次いで、アミロイド線維の生成の有無を調べることを特徴とする、アミロイド病の検査方法であって、アミロイド線維が生成した場合に、対象がアミロイド病に罹患しているか、罹患するおそれがあると判定する方法。
（９）下記（ｈ）〜（ｍ）：
（ｈ）（１）請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、
（ｉ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号：７）、
（ｊ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：８）、
（ｋ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：９）、
（ｌ）Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：１０）、および
（ｍ）（ｉ）〜（ｋ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む、アミロイド病の予防または治療用医薬組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、広範囲のアミロイド病の早期診断が可能な検査方法、予防および治療が可能となる。該検査方法は大がかりな設備を必要とせず、しかも比較的短時間で済むという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はαシヌクレインの全アミノ酸配列を示す。アミロイド線維核領域（コアー）領域を黒くしている。
【図２】図２は合成核部位ペプチドによるアミロイド線維形成を示す。（ａ）はＴｈｉｏＴ結合測定によるアミロイド線維形成の経時変化を示す。０．５ｍＭペプチド、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、３７℃でインキュベートした。黒丸はＳＰ６１−８９、白丸はＳＰ７６−８９、黒四角はＳＰ８１−９６、白四角はＳＰ７６−９６を用いた場合である。（ｂ）はＳＰ８１−９６のアミロイド線維形成後のＴＥＭによるイメージ、（ｃ）はＳＰ７６−９６のアミロイド線維形成後のＴＥＭによるイメージである。
【図３】核部位ペプチドのアミロイド線維形成能における９４番目のフェニルアラニン残基の役割を示す。（ａ）はＴｈｉｏＴ結合測定によるアミロイド線維形成の経時変化を示す。黒丸はＳＰ７６−９４、黒四角はＳＰ７６−９３、白丸はＳＰ７６−９１、白四角はＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇを用いた場合である。（ｂ）はＳＰ７６−９４の線維形成後のＡＦＭによる観測イメージである。スケールバーは２００ｎｍである。（ｃ）はＳＰ７６−９４の線維形成実験前後のＣＤスペクトル測定結果である。白丸は０時間、黒丸は３５０時間後である。
【図４】図４はＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇの線維伸長反応を示す。（ａ）はＴｈｉｏＴ結合測定によるアミロイド線維形成の経時変化を示す。ＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇのみの場合をグレーの棒で、１０％（ｖ／ｖ）のＳＰ７６−９４アミロイド線維をシードとして添加した場合を黒の棒で示す。（ｂ）はシードを添加したサンプルの３３６時間後のＴＥＭ観測イメージである。スケールバーは２００ｎｍである。
【図５】図５はＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇの各種アミロイド線維核（シード）に対する伸長反応の様子をＴｈｊｏＴ結合測定による経時変化にて示す。１ｍｇ／ｍｌ ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ、１％（ｖ／ｖ）シード添加、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＴｈｉｏＴ、１２０ｍｉｎ−１振盪、３７℃。
【図６】図６は蛍光顕微鏡を用いたＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇの線維伸長反応の直接観察結果を示す。（ａ）はαシヌクレイン線維シードのみを添加したコントロール、（ｂ）はαシヌクレイン線維シードを用いて４８時間後、（ｃ）はＧｒｏＥＳシードを用いて４８時間後、（ｄ）はインシュリン線維シードを用いての２０時間後（ｅ）はリゾチーム線維シードを用いての２０時間後のＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ線維伸長の様子である。図中の白いバーはいずれも１０μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、パーキンソン病の原因タンパク質の１つであるαシヌクレインのアミロイド線維のアミロイド核部分を同定した。さらに本発明者らは、同定したアミロイド核部分の部分ペプチドおよび変異ペプチドについても検討を重ねた結果、自身ではアミロイド線維形成は起こさないが、アミロイド核が「種」として存在する場合に限り、それを足がかりにして伸長してアミロイド線維を形成するという、従来になかったユニークな性質を有するペプチドを見出した（実施例参照）。すでに本発明者らは、αシヌクレイン全長のタンパク質が異種タンパク質のアミロイド線維核に対しても伸長することを見出しているが（H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J.Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005）、上記のようなユニークな性質を持ったペプチドが見出されたのは今回が初めてである。
【００１３】
上記のユニークな性質を有する本発明の新規ペプチドの具体例は下記のものである：
（ａ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９４番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンを他のアミノ酸に置換したペプチド、配列番号：１）、
（ｂ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９５番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンを他のアミノ酸に置換したペプチド、配列番号：２）、
（ｃ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９６番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンを他のアミノ酸に置換したペプチド、配列番号：３）、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド。
【００１４】
上記（ｄ）のような変異ペプチドも本発明に包含される。ただし、いずれのペプチドにおいても、上記性質を有するためには９４番目のフェニルアラニンがフェニルアラニン以外のアミノ酸（Ｘａａ）により置換されていることが必要である。ペプチドが上記性質を有するために好ましいＸａａとしてはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、ＬｅｕあるいはＡｒｇなどが挙げられ、より好ましいＸａａとしてはグリシンが挙げられる。
【００１５】
したがって、上記のユニークな性質が特に顕著なペプチドとしては：
（ｅ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９４番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンをグリシンに置換したペプチド、ＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇ、配列番号：４）、
（ｆ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９５番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンをグリシンに置換したペプチド、ＳＰ７６−９５Ｆ９４Ｇ、配列番号：５）、および
（ｇ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９６番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンをグリシンに置換したペプチド、ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ、配列番号：６）
が挙げられる。
【００１６】
上で説明したペプチドは修飾されていてもかまわない。修飾の例としては、ペプチドの側鎖官能基を誘導体化すること等が挙げられる。かかる誘導体化は当業者によく知られている。例えば、アラニンの水酸基を修飾してもよく、グルタミン酸のγ−カルボキシル基を修飾してもよい。また、上記ペプチドにおいて１またはそれ以上のアミノ酸残基を非天然または人工アミノ酸に変更してもよい。ペプチド中の変異、修飾あるいは誘導体化の部位は、上記性質を損なわないかぎり、ペプチドのいずれの部位にあってもよい。例えば、ペプチドの内部残基が変異（例えば、他のアミノ酸で置換、欠失、付加等）、修飾あるいは誘導体化されていてもよく、ペプチドのＣ末端またはＮ末端において変異、修飾あるいは誘導体化されていてもよい。ただし、９４番目のフェニルアラニンがフェニルアラニン以外のアミノ酸により置換されていることが必要である。
【００１７】
ここで、本明細書におけるペプチドの標記方法について説明する。本発明のペプチドのアミノ酸残基番号は図１に示αシヌクレインのアミン酸配列の番号と一致する。本明細書において、アミノ酸はカナ標記のほか、当業者によく知られた３文字表記または１文字表記で示される。本明細書において、αシヌクレインのＸ番目のアミノ酸からＹ番目のアミノ酸からなる部分ペプチドを、「ＳＰＸ−Ｙ」と標記することがある。例えば、図１のαシヌクレインのアミノ酸７６からアミノ酸９６までからなる本発明のペプチドをＳＰ７６−９６と標記することがある。本明細書において、本発明のペプチド中のアミノ酸残基を特定するに際し、αシヌクレインのＺ番目のアミノ酸に相当するものである場合には、「Ｚ番目のアミノ酸」あるいは「アミノ酸Ｚ」と標記することがある。例えば、「９４番目のＰｈｅ」あるいは「Ｐｈｅ９４」という場合には、図１の９４番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基をいう。さらに、本発明のペプチドがαシヌクレインのアミノ酸とは異なるアミノ酸を含む場合には、その位置を示す数字の前に本来のアミノ酸、後に異なるアミノ酸を表示する。例えば、本発明のペプチドＳＰ７６−９６の９４番目のＰｈｅがＧｌｙに置き換わっているペプチドを、「ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ」と標記することがある。
【００１８】
上で説明した本発明のペプチドは、自身ではアミロイド線維形成は起こさないが、アミロイド核が「種」として存在する場合に限り、それを足がかりにして伸長してアミロイド線維を形成するという極めてユニークな性質を有する。これらのペプチドは、同種タンパク質であるαシヌクレインだけでなく、他のアミロイド性タンパク質の「種」に対しても伸長する能力を有する。したがって、これらのペプチドを用いて、アミロイド病の発症前のアミロイド線維核や前駆体分子種の存在を確認することができる。すなわち、すなわち、上で説明したペプチドは、検体中にアミロイド線維形成の「種」があるかどうかを判断する試薬として利用価値がある。そして、これらのペプチドを用いることによって、検体中の「種」の存在を調べ、アミロイド病の発症を早期に診断することができる。アミロイド病（アミロイドーシス）は、アミロイド線維が臓器や組織に沈着することで発症する病気であり、パーキンソン病やアルツハイマー病などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、本明細書において、「アミロイド核」、「アミロイド線維核」、「種」、「シード」は同義である。また、特に断らないかぎり、本明細書で用いられる他の用語の意味は当該分野で一般的に認識されている意味に解される。
【００１９】
したがって、本発明は、上で説明したペプチドを含む、アミロイド病の検査用組成物および検査用キットを提供する。さらに本発明は、対象から得た試料に上で説明したペプチドを接触させ、次いで、アミロイド線維の生成の有無を調べることを特徴とする、アミロイド病の検査方法を提供する。該方法において、アミロイド線維が生成した場合に、対象がアミロイド病に罹患しているか、罹患するおそれがあると判定する。上記検査方法、検査キットおよび検査方法においてアミロイド線維の生成を確認する手段・方法としては、以下のようなものが挙げられるが、限定するものではない。
【００２０】
先ず、対象から試料を得る。試料採取は、アミロイド線維が存在あるいは生成する可能性のある身体部位から得ることができる。対象から得た試料に上で説明したペプチドを接触させた後、一定時間後（例えば、数時間〜数百時間後）に、アミロイド線維に特異的に結合する色素（例えば、チオフラビンＴなど）と混合し、色素の結合を調べることによりアミロイド線維の生成を確認する。色素は、試料とペプチドとの接触時に添加しておいてもよく、色素添加のタイミングは特に限定されない。アミロイド線維の生成は、蛍光を測定すること、光学顕微鏡にて観察すること、あるいは透過型電子顕微鏡または原子間力顕微鏡などを用いること、円偏光二色性を調べることなどにより行うことができるが、このような手段・方法に限定されず、当業者は、他の手段・方法を適用してアミロイド線維の生成を確認することができる。
【００２１】
具体的には、上記ペプチド約０．１ｍＭ以上，例えば約０．５ｍＭ（約１ｍｇ／ｍｌ）、好ましくは約１．５ｍＭ（約３ｍｇ／ｍｌ）、より好ましくは約３ｍＭ（約６ｍｇ／ｍｌ）を、アミロイド線維伸長反応を調べたい試料に添加することが望ましい。伸長反応時間は約２５〜３７℃で約２４時間、好ましくは４８時間、より好ましくは２００時間またはそれ以上行うことが望ましい。好ましくは、伸長反応は中性付近の緩衝液中で振盪しながら行う。反応系にＮａＣｌなどの塩類を適当濃度、例えば数十ｍＭ〜約１Ｍ程度添加してアミロイド線維伸長反応を行ってもよい。色素が光感受性である場合など、必要に応じてアミロイド線維伸長反応中は適宜遮光してもよい。
【００２２】
上記検査方法、検査キットおよび検査方法において、上で説明したペプチドが検出可能な標識にて標識されていてもよい。標識は、発色基、蛍光基、吸光基、例えば、Ｃｙ５、ダンシル基、フルオレセイン基、ナフタレンスルホン酸基、ナフチル基、ピレン基など、あるいは放射性基などであってもよいが、これらに限定されない。
【００２３】
アミロイド病はアミロイド線維そのものに毒性があるのではなく、アミロイド線維形成を起こす過程の凝集体やアミロイド核、オリゴマー分子種などが毒性の原因であるとも考えられている（Ｉ.Ｃ. Ｍａｒｔｉｎｓ, Ｉ. Ｋｕｐｅｒｓｔｅｉｎ, Ｈ. Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ, Ｅ. Ｍａｅｓ, Ｍ. Ｖａｎｂｒａｂａｎｔ, Ｗ. Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ, Ｐ.Ｖ. Ｇｅｌｄｅｒ, Ｄ. Ｈａｒｔｍａｎｎ, Ｒ. Ｄ'Ｈｏｏｇｅ, Ｂ. Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ, Ｊ. Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚ, Ｆ. Ｒｏｕｓｓｅａｕ, ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ, ２７, ２２４-２３３, ２００８）。したがって、むしろ、できるだけ素早いアミロイド線維を形成させて無毒化してしまうことがアミロイド病の予防や治療につながると考えられる。したがって、「種」が存在しさえすればそれを足場としてアミロイド線維を形成するペプチドを、アミロイド病の予防または治療に用いることができる。
【００２４】
したがって、本発明は、下記のペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む、アミロイド病の予防または治療用医薬組成物を提供する：
上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載のペプチド、
（ｉ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ＳＰ７６−９４、配列番号：７）、
（ｊ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（ＳＰ７６−９５、配列番号：８）、
（ｋ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＳＰ７６−９６、配列番号：９）、
（ｌ）Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＳＰ８１−９６、配列番号：１０）、および
（ｍ）（ｉ）〜（ｋ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド（ただし、９４番目のＰｈｅは保持されている）。
【００２５】
（ｉ）〜（ｍ）のペプチドは修飾されていてもかまわない。修飾の例としては、ペプチドの側鎖官能基を誘導体化することが挙げられる。かかる誘導体化は当業者によく知られている。例えば、アラニンの水酸基を修飾してもよく、グルタミン酸のγ−カルボキシル基を修飾してもよい。また、上記ペプチドにおいて１またはそれ以上のアミノ酸残基を非天然または人工アミノ酸としてもよい。ペプチド中の変異、修飾あるいは誘導体化の部位は、上記性質を損なわないかぎり、ペプチドのいずれの部位にあってもよい。例えば、ペプチドの内部残基が変異（例えば、他のアミノ酸で置換、欠失、付加等）、修飾あるいは誘導体化されていてもよく、ペプチドのＣ末端またはＮ末端において変異、修飾あるいは誘導体化されていてもよい。
【００２６】
本発明のアミロイド病の予防または治療用医薬組成物は、公知の方法にて製造されうる。また、本発明のアミロイド病の予防または治療用医薬組成物の剤形は特に限定されず、例えば、溶液状、乾燥固体状などであってもよく、好ましい剤形は溶液状である。これらの有効成分たるペプチドの投与量は、１〜１０ｍｇ/ｋｇなどであってもよく、好ましい投与量は１０ｍｇ/ｋｇである。これらの条件は例示であり、医師により適宜選択、変更されうる。
【００２７】
本発明のペプチドおよびそれらの変異ペプチドは一般的な固相法（Ｆｍｏｃ法やＢｏｃ法など）によって化学合成することができ、遺伝子組み換え法によっても得ることができ、あるいはそれらを組み合わせた方法によっても得ることができる。これらの方法は当業者によく知られている。
【００２８】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であり、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００２９】
実施例１：本発明のペプチドの同定
（１）αシヌクレインアミロイド線維核部位の同定
H. Yagi, A. Sato, A. Yoshida, Y. Hattori, M. Hara, J. Shimamura, I. Sakane, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Mol. Biol. 377, 1593-1606, 2008に記載の方法に準じて行った。すなわち、H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J.Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005に示す方法でαシヌクレインのアミロイド線維を作成し、その後、Ｌｙｓを特異的に認識してペプチド鎖を切断するAchromobactr Lyticus protease I （ＡＰＩと略称）と、疎水性アミノ酸を認識してペプチド鎖を切断するproteinase K （ＰＫと略称）で別々に消化した。残存する不溶性部分を７．５Ｍグアニジンに可溶化させた後、逆相ＨＰＬＣで単離生成し、アミノ酸シークエンサーと質量分析計にて分析した。参考のため、αシヌクレインの全アミノ酸配列を図１に示した。得られた消化ペプチドは、それぞれ、
ＡＲＩ消化ペプチド：Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＳＰ８１−９６、配列番号：１０）、および
ＰＫ消化ペプチド：Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（ＳＰ７６−８９、配列番号：１１）
であった。
【００３０】
（２）同定した核部位ペプチドの性質検討
上で同定した２つの核部位ペプチドのほか、これら２つのペプチドの重なり部分であるＴｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（ＳＰ８１−８９、配列番号：１２）や、これら２つの同定ペプチドの領域すべてに渡ったペプチドＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＳＰ７６−９６、配列番号：９）など、様々な種類のペプチドを化学合成し、それらのアミロイド線維形成の特徴を調べた（表１）。アミロイド線維形成は、それぞれ終濃度０．５ｍＭのペプチドを１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させ、３７℃で毎分１７０回転（１７０ｍｉｎ−１）の振盪速度で振盪することで行った。適宜サンプルを取り出し、ＰＢＳ−ｓａｌｉｎｅ緩衝液中２５μＭ チオフラビンＴ（ＴｈｉｏＴ）と混合し、励起波長４４０ｎｍ、蛍光観測波長４８０ｎｍで測定した。さらに、アミロイド線維は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）または原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、円偏光二色性（ＣＤ）によっても確認した。その結果、Ｃ末端領域を含むＳＰ８１−９６とＳＰ７６−９６が自発的にアミロイド線維を形成することが分かった（図２）。
【００３１】
次に、これらのペプチドのＣ末端領域のそのアミノ酸がアミロイド線維形成に重要であるかを調べるために、Ｃ末端を少しずつ削ったペプチドを作成してアミロイド線維形成を調べた。その結果、９４番目のＰｈｅ（Ｐｈｅ９４）を持っているＳＰ７６−９４はアミロイド線維を形成するが、Ｐｈｅ９４がないＳＰ７６−９３やＳＰ７６−９１はアミロイド線維を成形しないことが分かった。これらの結果から、Ｐｈｅ９４がアミロイド線維形成に重要な役割を果たしていることが示された（図３、表１）。
【００３２】
そこで、ＳＰ７６−９４あるいはＳＰ７６−９６のＰｈｅ９４をＧｌｙに置換したＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧとＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇを合成して、これらのペプチドのアミロイド線維形成について調べた。これらのペプチドはアミロイド核が「種」として存在しなければ、アミロイド線維を形成することはできないが、「種」が存在するとそれを足がかりにして伸長し、結果的にアミロイド線維を形成することが判明した（図４、表１）。すなわち、これらのペプチドは、それ自身はアミロイド核を形成する脳力はないが、アミロイド核が存在していればアミロイド線維伸長を起こすことができるという、極めてユニークな性質を有している。
【００３３】
これらのペプチドのユニークな性質を利用すれば、検体中にアミロイド線維形成の「種」があるかどうかを判断することができる。すなわち、アミロイド線維を作る「種」があれば、最終的に時間が経てばアミロイドが形成され、様々なアミロイド病が発症する可能性があるので、この「種」の存在を調べることで、アミロイド病の発症を予期することができる。したがって、かかるユニークな性質を有するペプチドは、アミロイド病の早期診断のための検査に非常に有用である。
【００３４】
【表１】
表１の核（種）なし、有りは実施例２の（２）で述べる方法で作成したαシヌクレインのアミロイド線維核（種）のなし、有りを示す。＋は線維が形成されたこと、−は線維が形成されなかったことを示す。ｎ．ｄ．は未測定であることを示す。
【実施例２】
【００３５】
実施例２：本発明のペプチドのアミロイド線維伸長
（１）アミロイド線維伸長およびその条件
アミロイド伸長ペプチドとして、ＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧとＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇをペプチド研究所（大阪）に依頼して化学合成したものを使用した。０．５ｍＭに相当するペプチドを秤量し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌの緩衝液に溶解し、シリコナイズドした試験管中に調製した。調製したサンプルは、３７℃、１７０ｍｉｎ−１で振盪し、アミロイド線維形成を行った。
【００３６】
（２）αシヌクレインおよび異種タンパク質ＧｒｏＥＳ、インシュリン、リゾチームのアミロイド線維核（種、あるいはシード）の調製
これらのアミロイド線維は以下のようにして形成させた。αシヌクレインおよびＧｒｏＥＳは、それぞれH. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J.Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005およびT. Higurashi, Y. Hiragi, K. Ichimura, Y. Seki, K. Soda, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Mol. Biol. 333, 605-620, 2003に従って精製した。ウシのインシュリンとニワトリのリゾチームはシグマとナカライテスクからそれぞれ購入した。αシヌクレイン、インシュリン、リゾチームのアミロイド線維核の形成方法は上記H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J.Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005に記載された方法で行った。ＧｒｏＥＳは７量体のコシャペロニンであり、病気とは関係のないオリゴマータンパク質であるが、変性状態で長時間放置すると典型的なアミロイド線維を形成することがすでに確かめられており（T. Higurashi, H. Yagi, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Mol. Biol. 351, 1057-1069, 2005）、その方法に従ってアミロイド線維核を調製した。
【００３７】
上記の方法で調製したアミロイド線維核の溶液を超遠心分離（１１０，０００ｘｇ，４℃,１時間）にかけ、沈殿画分を回収し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５に再懸濁し、溶液中の沈殿が均等になるように超音波破砕（Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ２０，ＰＵＬＳＥＲ １，３０秒）を行った後、ＴｈｉｏＴによる蛍光が一定になるように希釈してシード（種）サンプル（タンパク質量は３０μｇ程度）を調製した。
【００３８】
（３）各種シード存在下でのＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧとＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇを用いた線維伸長
本発明のペプチドの由来と同種であるαシヌクレインアミロイド線維シードや異種タンパク質で病気とは無関係のＧｒｏＥＳタンパク質のアミロイド線維シード、異種タンパク質であるが病気に関連しているインシュリンとリゾチームのアミロイド線維シードをそれぞれ存在させて、ＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧとＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇによるアミロイド線維伸長実験を行った。
【００３９】
１Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液に終濃度５μＭのＴｈｉｏＴ、１〜６ｍｇ／ｍｌのアミロイド線維を伸長させるべきペプチドを、様々なシード存在下でよく混合した後、１５０μｌずつ、９６穴のプラスチックマルチプレートのウェルに分注し、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｅａｌ ＲＴでシールし、アルミホイルで遮光しながらＴＡＩＴＥＣ ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ−５１を用いて、１２０ｍｉｎ−１で振盪させながら、３７℃でインキュベートした。適当な時間に、アミロイド線維形成の指標となるＴｈｉｏＴの蛍光測定をＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダーを用いて行った。ＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇを用いた結果を図５に示した。同種のαシヌクレインのシードからは４８時間後にはアミロイド線維伸長がすでに起こっていた。一方、異種タンパク質のインシュリンのシードでも９６時間後には、ＧｒｏＥＳのシードとリゾチームのシードは１９２時間後にアミロイド線維伸長が起こっていることが明らかになった。
【００４０】
さらに、この反応が線維核由来であることを裏付けるとともに、線維の詳細な形態観察を、さらに感度の良い蛍光顕微鏡を用いて行った。１Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液に終濃度５〜２０μＭのＴｈｉｏＴ、１〜６ｍｇ／ｍｌのアミロイド線維を伸長させるべきペプチドをそれぞれ、シード存在下でよく混合した後、１０μｌをスライドガラス上に載せ、気泡が入らないように丁寧にカバーガラスで覆った後、余分な溶液をクリーンワイプで吸い取り、周囲をマニキュアで固め、アルミホイルで遮光した状態で３７℃、２０〜４８時間インキュベートした。使用ペプチドはＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇであった。核シードの量は３０μｇ、ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇの量はαシヌクレインとＧｒｏＥＳシードの場合３ｍｇ／ｍｌ、インシュリンシードおよびリゾチームシードの場合６ｍｇ／ｍｌであった。アミロイド線維伸長は、ＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００蛍光顕微鏡を用い、ＴｈｉｏＴの蛍光によって調べた。結果を図６に示す。同種であるαシヌクレインのシードだけでは見られなかったアミロイド線維（図６ａ）がＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ添加後４８時間（図６ｂ）で、さらに異種シードであるＧｒｏＥＳシード添加後４８時間（図６ｃ）、インシュリンシード（図６ｄ）、リゾチームシード（図６ｅ）の２０時間後に伸長したアミロイド線維の蛍光顕微鏡写真を示した。このように、ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇは、異種シードであるインシュリンシードおよびリゾチームシードからもアミロイド線維を伸長できることが確認された。
【００４１】
これらの結果から、ＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧやＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇには、同種のαシヌクレインのシードからは最も早く、そして、異種タンパク質由来の線維核からでも線維を伸長させる能力を有することが判明した。このように、このペプチドは脳神経変性病に関わるαシヌクレインのアミロイド線維形成をはじめ、他のアミロイド病（インシュリンやリゾチームが関与）、更には、病気とは関係していないＧｒｏＥＳタンパク質のアミロイド線維でさえ、それらの「種」が存在していればそれを基に伸長する性質を有することが証明された。このユニークな性質は、これらの本発明のペプチドを広範なアミロイド病の早期診断や検査に使用可能ならしめるものである。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、アミロイド病の診断薬および予防・治療薬の分野において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
SEQ ID NO:1 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-94 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with other amino acid (Xaa) than phenylalanine.
SEQ ID NO:2 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-95 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with other amino acid (Xaa) than phenylalanine.
SEQ ID NO:3 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-96 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with other amino acid (Xaa) than phenylalanine.
SEQ ID NO:4 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-94 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with glycine (SP76-94F94G).
SEQ ID NO:5 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-95 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with glycine (SP76-95F94G).
SEQ ID NO:6 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-96 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with glycine (SP76-96F94G).
SEQ ID NO:7 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-94 of alpha-synuclein (SP76-94).
SEQ ID NO:8 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-95 of alpha-synuclein (SP76-95).
SEQ ID NO:9 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-96 of alpha-synuclein (SP76-96).
SEQ ID NO:10 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 81-96 of alpha-synuclein (SP81-96).
SEQ ID NO:11 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-89 of alpha-synuclein (SP76-89).
SEQ ID NO:12 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 81-89 of alpha-synuclein (SP81-89).
SEQ ID NO:13 is an amino acid sequence of the amyloid fiber core region of human alpha-synuclein.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイド線維伸長ペプチド、アミロイド病の検査におけるその使用、ならびにアミロイド病の予防または治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学の進歩によって人の寿命が延び、世界的に高齢化社会に向かっている。ここで、新たな病気として、人の尊厳や生活の質に深く関わっている認知症をはじめとする脳神経変性病が生じ、社会的な問題となっている。アルツハイマー病やパーキンソン病、プリオン病（狂牛病）をはじめとする脳神経変性病は、特殊なタンパク質（それぞれ、Ａβ１−４２、αシヌクレイン、プリオン）の構造が変化して、β構造に富んだアミロイド線維という不溶性の物質を細胞内外で長い年月をかけて蓄積することによって発症するとされている。
【０００３】
また、脳神経変性病に限らず、体の様々な臓器や血液中においても、ある種のタンパク質が高濃度で長期間存在するとアミロイド線維を形成し、臓器や組織に沈着することで病気が発症する。これらの病気はアミロイド病（アミロイドーシス）と呼ばれており、２０種類以上の病気が知られている（非特許文献１）。例えば、β２ミクログロブリンが血中に高濃度で存在すると関節などにアミロイド線維が蓄積して痛みを生じる。β２ミクログロブリンは人工透析を行っている患者の血液中に高濃度に蓄積されることが知られており、日本でも数十万人がそのアミロイド病の発症予備軍となりうる。さらに、膵臓や肝臓などに蓄積して全身性アミロイドーシスを引き起こすインスリンやアミリン、リゾチームなどもアミロイド線維を形成することが知られている。
【０００４】
アミロイド線維の形成は、タンパク質の安定性とも大きく関係しており、コンフォーメーション変化が起こり、アミロイド線維の種（シード）に相当するものが先ず形成され、その後、その「種」に次々と構造変化したタンパク質が結合して伸長してアミロイド線維が形成される、いわゆる「核形成−核依存的伸長」の機構で起こることが分かっている。
【０００５】
高齢化社会の中で多くの人が質の高い生活を享受するためには、神経変性病をはじめとするアミロイド病の克服が大きなポイントとなる。このためには、アミロイド病を早期に診断する技術を開発する必要がある。さらに、アミロイド病の予防薬や治療薬の開発も必要となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】G.T.Westermark and P.Westermark, Amyloid, Vol.7, 19 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アミロイド線維を形成しうる危険性やその「種」となるアミロイド線維核、あるいはその元になるタンパク質分子種の量を見積もる診断薬を開発し、早期にアミロイド病に罹病していること、あるいは罹病する可能性があることを判断することが必要である。そして、アミロイド病の予防薬や治療薬の開発も必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、αシヌクレインの特定の部分ペプチドが、αシヌクレイン以外の様々なアミロイド性タンパク質の「種」に対して伸長する能力を有することを見出した。さらに本発明者らは、これらのペプチドの特定の変異体が、自らはアミロイド核形成を起こさないが、アミロイド核が存在する場合にはアミロイド線維伸長反応を起こすことを見出した。本発明者らは、これらの知見から本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、以下のものに関する。
（１）下記（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ（配列番号：１）、
（ｂ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ（配列番号：２）、
（ｃ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：３）、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド
［（ａ）〜（ｃ）においてＸａａはＰｈｅ以外のいずれかのアミノ酸を意味し、（ｄ）に記載のペプチドにおいてＸａａは保持されている］
からなる群より選択されるペプチド。
（２）ＸａａがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＡｒｇである、（１）記載のペプチド。
（３）ＸａａがＧｌｙである（２）記載のペプチド。
（４）下記（ｅ）〜（ｇ）：
（ｅ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：４）、
（ｆ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号：５）、および
（ｇ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：６）
からなる群より選択される（３）記載のペプチド。
（５）標識されている（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドを含む、アミロイド病の検査用組成物。
（７）（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドを構成成分として含む、アミロイド病の検査用キット。
（８）対象から得た試料に（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドを接触させ、次いで、アミロイド線維の生成の有無を調べることを特徴とする、アミロイド病の検査方法であって、アミロイド線維が生成した場合に、対象がアミロイド病に罹患しているか、罹患するおそれがあると判定する方法。
（９）下記（ｈ）〜（ｍ）：
（ｈ）（１）請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、
（ｉ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号：７）、
（ｊ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：８）、
（ｋ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：９）、
（ｌ）Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：１０）、および
（ｍ）（ｉ）〜（ｋ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む、アミロイド病の予防または治療用医薬組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、広範囲のアミロイド病の早期診断が可能な検査方法、予防および治療が可能となる。該検査方法は大がかりな設備を必要とせず、しかも比較的短時間で済むという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はαシヌクレインの全アミノ酸配列を示す。アミロイド線維核領域（コアー）領域を黒くしている。
【図２】図２は合成核部位ペプチドによるアミロイド線維形成を示す。（ａ）はＴｈｉｏＴ結合測定によるアミロイド線維形成の経時変化を示す。０．５ｍＭペプチド、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、３７℃でインキュベートした。黒丸はＳＰ６１−８９、白丸はＳＰ７６−８９、黒四角はＳＰ８１−９６、白四角はＳＰ７６−９６を用いた場合である。（ｂ）はＳＰ８１−９６のアミロイド線維形成後のＴＥＭによるイメージ、（ｃ）はＳＰ７６−９６のアミロイド線維形成後のＴＥＭによるイメージである。
【図３】核部位ペプチドのアミロイド線維形成能における９４番目のフェニルアラニン残基の役割を示す。（ａ）はＴｈｉｏＴ結合測定によるアミロイド線維形成の経時変化を示す。黒丸はＳＰ７６−９４、黒四角はＳＰ７６−９３、白丸はＳＰ７６−９１、白四角はＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇを用いた場合である。（ｂ）はＳＰ７６−９４の線維形成後のＡＦＭによる観測イメージである。スケールバーは２００ｎｍである。（ｃ）はＳＰ７６−９４の線維形成実験前後のＣＤスペクトル測定結果である。白丸は０時間、黒丸は３５０時間後である。
【図４】図４はＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇの線維伸長反応を示す。（ａ）はＴｈｉｏＴ結合測定によるアミロイド線維形成の経時変化を示す。ＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇのみの場合をグレーの棒で、１０％（ｖ／ｖ）のＳＰ７６−９４アミロイド線維をシードとして添加した場合を黒の棒で示す。（ｂ）はシードを添加したサンプルの３３６時間後のＴＥＭ観測イメージである。スケールバーは２００ｎｍである。
【図５】図５はＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇの各種アミロイド線維核（シード）に対する伸長反応の様子をＴｈｊｏＴ結合測定による経時変化にて示す。１ｍｇ／ｍｌ ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ、１％（ｖ／ｖ）シード添加、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＴｈｉｏＴ、１２０ｍｉｎ−１振盪、３７℃。
【図６】図６は蛍光顕微鏡を用いたＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇの線維伸長反応の直接観察結果を示す。（ａ）はαシヌクレイン線維シードのみを添加したコントロール、（ｂ）はαシヌクレイン線維シードを用いて４８時間後、（ｃ）はＧｒｏＥＳシードを用いて４８時間後、（ｄ）はインシュリン線維シードを用いての２０時間後（ｅ）はリゾチーム線維シードを用いての２０時間後のＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ線維伸長の様子である。図中の白いバーはいずれも１０μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、パーキンソン病の原因タンパク質の１つであるαシヌクレインのアミロイド線維のアミロイド核部分を同定した。さらに本発明者らは、同定したアミロイド核部分の部分ペプチドおよび変異ペプチドについても検討を重ねた結果、自身ではアミロイド線維形成は起こさないが、アミロイド核が「種」として存在する場合に限り、それを足がかりにして伸長してアミロイド線維を形成するという、従来になかったユニークな性質を有するペプチドを見出した（実施例参照）。すでに本発明者らは、αシヌクレイン全長のタンパク質が異種タンパク質のアミロイド線維核に対しても伸長することを見出しているが（H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J.Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005）、上記のようなユニークな性質を持ったペプチドが見出されたのは今回が初めてである。
【００１３】
上記のユニークな性質を有する本発明の新規ペプチドの具体例は下記のものである：
（ａ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９４番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンを他のアミノ酸に置換したペプチド、配列番号：１）、
（ｂ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９５番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンを他のアミノ酸に置換したペプチド、配列番号：２）、
（ｃ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９６番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンを他のアミノ酸に置換したペプチド、配列番号：３）、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド。
【００１４】
上記（ｄ）のような変異ペプチドも本発明に包含される。ただし、いずれのペプチドにおいても、上記性質を有するためには９４番目のフェニルアラニンがフェニルアラニン以外のアミノ酸（Ｘａａ）により置換されていることが必要である。ペプチドが上記性質を有するために好ましいＸａａとしてはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、ＬｅｕあるいはＡｒｇなどが挙げられ、より好ましいＸａａとしてはグリシンが挙げられる。
【００１５】
したがって、上記のユニークな性質が特に顕著なペプチドとしては：
（ｅ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９４番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンをグリシンに置換したペプチド、ＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇ、配列番号：４）、
（ｆ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９５番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンをグリシンに置換したペプチド、ＳＰ７６−９５Ｆ９４Ｇ、配列番号：５）、および
（ｇ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９６番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンをグリシンに置換したペプチド、ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ、配列番号：６）
が挙げられる。
【００１６】
上で説明したペプチドは修飾されていてもかまわない。修飾の例としては、ペプチドの側鎖官能基を誘導体化すること等が挙げられる。かかる誘導体化は当業者によく知られている。例えば、アラニンの水酸基を修飾してもよく、グルタミン酸のγ−カルボキシル基を修飾してもよい。また、上記ペプチドにおいて１またはそれ以上のアミノ酸残基を非天然または人工アミノ酸に変更してもよい。ペプチド中の変異、修飾あるいは誘導体化の部位は、上記性質を損なわないかぎり、ペプチドのいずれの部位にあってもよい。例えば、ペプチドの内部残基が変異（例えば、他のアミノ酸で置換、欠失、付加等）、修飾あるいは誘導体化されていてもよく、ペプチドのＣ末端またはＮ末端において変異、修飾あるいは誘導体化されていてもよい。ただし、９４番目のフェニルアラニンがフェニルアラニン以外のアミノ酸により置換されていることが必要である。
【００１７】
ここで、本明細書におけるペプチドの標記方法について説明する。本発明のペプチドのアミノ酸残基番号は図１に示αシヌクレインのアミン酸配列の番号と一致する。本明細書において、アミノ酸はカナ標記のほか、当業者によく知られた３文字表記または１文字表記で示される。本明細書において、αシヌクレインのＸ番目のアミノ酸からＹ番目のアミノ酸からなる部分ペプチドを、「ＳＰＸ−Ｙ」と標記することがある。例えば、図１のαシヌクレインのアミノ酸７６からアミノ酸９６までからなる本発明のペプチドをＳＰ７６−９６と標記することがある。本明細書において、本発明のペプチド中のアミノ酸残基を特定するに際し、αシヌクレインのＺ番目のアミノ酸に相当するものである場合には、「Ｚ番目のアミノ酸」あるいは「アミノ酸Ｚ」と標記することがある。例えば、「９４番目のＰｈｅ」あるいは「Ｐｈｅ９４」という場合には、図１の９４番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基をいう。さらに、本発明のペプチドがαシヌクレインのアミノ酸とは異なるアミノ酸を含む場合には、その位置を示す数字の前に本来のアミノ酸、後に異なるアミノ酸を表示する。例えば、本発明のペプチドＳＰ７６−９６の９４番目のＰｈｅがＧｌｙに置き換わっているペプチドを、「ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ」と標記することがある。
【００１８】
上で説明した本発明のペプチドは、自身ではアミロイド線維形成は起こさないが、アミロイド核が「種」として存在する場合に限り、それを足がかりにして伸長してアミロイド線維を形成するという極めてユニークな性質を有する。これらのペプチドは、同種タンパク質であるαシヌクレインだけでなく、他のアミロイド性タンパク質の「種」に対しても伸長する能力を有する。したがって、これらのペプチドを用いて、アミロイド病の発症前のアミロイド線維核や前駆体分子種の存在を確認することができる。すなわち、すなわち、上で説明したペプチドは、検体中にアミロイド線維形成の「種」があるかどうかを判断する試薬として利用価値がある。そして、これらのペプチドを用いることによって、検体中の「種」の存在を調べ、アミロイド病の発症を早期に診断することができる。アミロイド病（アミロイドーシス）は、アミロイド線維が臓器や組織に沈着することで発症する病気であり、パーキンソン病やアルツハイマー病などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、本明細書において、「アミロイド核」、「アミロイド線維核」、「種」、「シード」は同義である。また、特に断らないかぎり、本明細書で用いられる他の用語の意味は当該分野で一般的に認識されている意味に解される。
【００１９】
したがって、本発明は、上で説明したペプチドを含む、アミロイド病の検査用組成物および検査用キットを提供する。さらに本発明は、対象から得た試料に上で説明したペプチドを接触させ、次いで、アミロイド線維の生成の有無を調べることを特徴とする、アミロイド病の検査方法を提供する。該方法において、アミロイド線維が生成した場合に、対象がアミロイド病に罹患しているか、罹患するおそれがあると判定する。上記検査方法、検査キットおよび検査方法においてアミロイド線維の生成を確認する手段・方法としては、以下のようなものが挙げられるが、限定するものではない。
【００２０】
先ず、対象から試料を得る。試料採取は、アミロイド線維が存在あるいは生成する可能性のある身体部位から得ることができる。対象から得た試料に上で説明したペプチドを接触させた後、一定時間後（例えば、数時間〜数百時間後）に、アミロイド線維に特異的に結合する色素（例えば、チオフラビンＴなど）と混合し、色素の結合を調べることによりアミロイド線維の生成を確認する。色素は、試料とペプチドとの接触時に添加しておいてもよく、色素添加のタイミングは特に限定されない。アミロイド線維の生成は、蛍光を測定すること、光学顕微鏡にて観察すること、あるいは透過型電子顕微鏡または原子間力顕微鏡などを用いること、円偏光二色性を調べることなどにより行うことができるが、このような手段・方法に限定されず、当業者は、他の手段・方法を適用してアミロイド線維の生成を確認することができる。
【００２１】
具体的には、上記ペプチド約０．１ｍＭ以上，例えば約０．５ｍＭ（約１ｍｇ／ｍｌ）、好ましくは約１．５ｍＭ（約３ｍｇ／ｍｌ）、より好ましくは約３ｍＭ（約６ｍｇ／ｍｌ）を、アミロイド線維伸長反応を調べたい試料に添加することが望ましい。伸長反応時間は約２５〜３７℃で約２４時間、好ましくは４８時間、より好ましくは２００時間またはそれ以上行うことが望ましい。好ましくは、伸長反応は中性付近の緩衝液中で振盪しながら行う。反応系にＮａＣｌなどの塩類を適当濃度、例えば数十ｍＭ〜約１Ｍ程度添加してアミロイド線維伸長反応を行ってもよい。色素が光感受性である場合など、必要に応じてアミロイド線維伸長反応中は適宜遮光してもよい。
【００２２】
上記検査方法、検査キットおよび検査方法において、上で説明したペプチドが検出可能な標識にて標識されていてもよい。標識は、発色基、蛍光基、吸光基、例えば、Ｃｙ５、ダンシル基、フルオレセイン基、ナフタレンスルホン酸基、ナフチル基、ピレン基など、あるいは放射性基などであってもよいが、これらに限定されない。
【００２３】
アミロイド病はアミロイド線維そのものに毒性があるのではなく、アミロイド線維形成を起こす過程の凝集体やアミロイド核、オリゴマー分子種などが毒性の原因であるとも考えられている（Ｉ.Ｃ. Ｍａｒｔｉｎｓ, Ｉ. Ｋｕｐｅｒｓｔｅｉｎ, Ｈ. Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ, Ｅ. Ｍａｅｓ, Ｍ. Ｖａｎｂｒａｂａｎｔ, Ｗ. Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ, Ｐ.Ｖ. Ｇｅｌｄｅｒ, Ｄ. Ｈａｒｔｍａｎｎ, Ｒ. Ｄ'Ｈｏｏｇｅ, Ｂ. Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ, Ｊ. Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚ, Ｆ. Ｒｏｕｓｓｅａｕ, ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ, ２７, ２２４-２３３, ２００８）。したがって、むしろ、できるだけ素早いアミロイド線維を形成させて無毒化してしまうことがアミロイド病の予防や治療につながると考えられる。したがって、「種」が存在しさえすればそれを足場としてアミロイド線維を形成するペプチドを、アミロイド病の予防または治療に用いることができる。
【００２４】
したがって、本発明は、下記のペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む、アミロイド病の予防または治療用医薬組成物を提供する：
上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載のペプチド、
（ｉ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ＳＰ７６−９４、配列番号：７）、
（ｊ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（ＳＰ７６−９５、配列番号：８）、
（ｋ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＳＰ７６−９６、配列番号：９）、
（ｌ）Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＳＰ８１−９６、配列番号：１０）、および
（ｍ）（ｉ）〜（ｋ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド（ただし、９４番目のＰｈｅは保持されている）。
【００２５】
（ｉ）〜（ｍ）のペプチドは修飾されていてもかまわない。修飾の例としては、ペプチドの側鎖官能基を誘導体化することが挙げられる。かかる誘導体化は当業者によく知られている。例えば、アラニンの水酸基を修飾してもよく、グルタミン酸のγ−カルボキシル基を修飾してもよい。また、上記ペプチドにおいて１またはそれ以上のアミノ酸残基を非天然または人工アミノ酸としてもよい。ペプチド中の変異、修飾あるいは誘導体化の部位は、上記性質を損なわないかぎり、ペプチドのいずれの部位にあってもよい。例えば、ペプチドの内部残基が変異（例えば、他のアミノ酸で置換、欠失、付加等）、修飾あるいは誘導体化されていてもよく、ペプチドのＣ末端またはＮ末端において変異、修飾あるいは誘導体化されていてもよい。
【００２６】
本発明のアミロイド病の予防または治療用医薬組成物は、公知の方法にて製造されうる。また、本発明のアミロイド病の予防または治療用医薬組成物の剤形は特に限定されず、例えば、溶液状、乾燥固体状などであってもよく、好ましい剤形は溶液状である。これらの有効成分たるペプチドの投与量は、１〜１０ｍｇ/ｋｇなどであってもよく、好ましい投与量は１０ｍｇ/ｋｇである。これらの条件は例示であり、医師により適宜選択、変更されうる。
【００２７】
本発明のペプチドおよびそれらの変異ペプチドは一般的な固相法（Ｆｍｏｃ法やＢｏｃ法など）によって化学合成することができ、遺伝子組み換え法によっても得ることができ、あるいはそれらを組み合わせた方法によっても得ることができる。これらの方法は当業者によく知られている。
【００２８】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であり、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００２９】
実施例１：本発明のペプチドの同定
（１）αシヌクレインアミロイド線維核部位の同定
H. Yagi, A. Sato, A. Yoshida, Y. Hattori, M. Hara, J. Shimamura, I. Sakane, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Mol. Biol. 377, 1593-1606, 2008に記載の方法に準じて行った。すなわち、H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J.Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005に示す方法でαシヌクレインのアミロイド線維を作成し、その後、Ｌｙｓを特異的に認識してペプチド鎖を切断するAchromobactr Lyticus protease I （ＡＰＩと略称）と、疎水性アミノ酸を認識してペプチド鎖を切断するproteinase K （ＰＫと略称）で別々に消化した。残存する不溶性部分を７．５Ｍグアニジンに可溶化させた後、逆相ＨＰＬＣで単離生成し、アミノ酸シークエンサーと質量分析計にて分析した。参考のため、αシヌクレインの全アミノ酸配列を図１に示した。得られた消化ペプチドは、それぞれ、
ＡＲＩ消化ペプチド：Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＳＰ８１−９６、配列番号：１０）、および
ＰＫ消化ペプチド：Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（ＳＰ７６−８９、配列番号：１１）
であった。
【００３０】
（２）同定した核部位ペプチドの性質検討
上で同定した２つの核部位ペプチドのほか、これら２つのペプチドの重なり部分であるＴｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（ＳＰ８１−８９、配列番号：１２）や、これら２つの同定ペプチドの領域すべてに渡ったペプチドＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＳＰ７６−９６、配列番号：９）など、様々な種類のペプチドを化学合成し、それらのアミロイド線維形成の特徴を調べた（表１）。アミロイド線維形成は、それぞれ終濃度０．５ｍＭのペプチドを１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させ、３７℃で毎分１７０回転（１７０ｍｉｎ−１）の振盪速度で振盪することで行った。適宜サンプルを取り出し、ＰＢＳ−ｓａｌｉｎｅ緩衝液中２５μＭ チオフラビンＴ（ＴｈｉｏＴ）と混合し、励起波長４４０ｎｍ、蛍光観測波長４８０ｎｍで測定した。さらに、アミロイド線維は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）または原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、円偏光二色性（ＣＤ）によっても確認した。その結果、Ｃ末端領域を含むＳＰ８１−９６とＳＰ７６−９６が自発的にアミロイド線維を形成することが分かった（図２）。
【００３１】
次に、これらのペプチドのＣ末端領域のそのアミノ酸がアミロイド線維形成に重要であるかを調べるために、Ｃ末端を少しずつ削ったペプチドを作成してアミロイド線維形成を調べた。その結果、９４番目のＰｈｅ（Ｐｈｅ９４）を持っているＳＰ７６−９４はアミロイド線維を形成するが、Ｐｈｅ９４がないＳＰ７６−９３やＳＰ７６−９１はアミロイド線維を成形しないことが分かった。これらの結果から、Ｐｈｅ９４がアミロイド線維形成に重要な役割を果たしていることが示された（図３、表１）。
【００３２】
そこで、ＳＰ７６−９４あるいはＳＰ７６−９６のＰｈｅ９４をＧｌｙに置換したＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧとＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇを合成して、これらのペプチドのアミロイド線維形成について調べた。これらのペプチドはアミロイド核が「種」として存在しなければ、アミロイド線維を形成することはできないが、「種」が存在するとそれを足がかりにして伸長し、結果的にアミロイド線維を形成することが判明した（図４、表１）。すなわち、これらのペプチドは、それ自身はアミロイド核を形成する脳力はないが、アミロイド核が存在していればアミロイド線維伸長を起こすことができるという、極めてユニークな性質を有している。
【００３３】
これらのペプチドのユニークな性質を利用すれば、検体中にアミロイド線維形成の「種」があるかどうかを判断することができる。すなわち、アミロイド線維を作る「種」があれば、最終的に時間が経てばアミロイドが形成され、様々なアミロイド病が発症する可能性があるので、この「種」の存在を調べることで、アミロイド病の発症を予期することができる。したがって、かかるユニークな性質を有するペプチドは、アミロイド病の早期診断のための検査に非常に有用である。
【００３４】
【表１】
表１の核（種）なし、有りは実施例２の（２）で述べる方法で作成したαシヌクレインのアミロイド線維核（種）のなし、有りを示す。＋は線維が形成されたこと、−は線維が形成されなかったことを示す。ｎ．ｄ．は未測定であることを示す。
【実施例２】
【００３５】
実施例２：本発明のペプチドのアミロイド線維伸長
（１）アミロイド線維伸長およびその条件
アミロイド伸長ペプチドとして、ＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧとＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇをペプチド研究所（大阪）に依頼して化学合成したものを使用した。０．５ｍＭに相当するペプチドを秤量し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌの緩衝液に溶解し、シリコナイズドした試験管中に調製した。調製したサンプルは、３７℃、１７０ｍｉｎ−１で振盪し、アミロイド線維形成を行った。
【００３６】
（２）αシヌクレインおよび異種タンパク質ＧｒｏＥＳ、インシュリン、リゾチームのアミロイド線維核（種、あるいはシード）の調製
これらのアミロイド線維は以下のようにして形成させた。αシヌクレインおよびＧｒｏＥＳは、それぞれH. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J.Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005およびT. Higurashi, Y. Hiragi, K. Ichimura, Y. Seki, K. Soda, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Mol. Biol. 333, 605-620, 2003に従って精製した。ウシのインシュリンとニワトリのリゾチームはシグマとナカライテスクからそれぞれ購入した。αシヌクレイン、インシュリン、リゾチームのアミロイド線維核の形成方法は上記H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J.Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005に記載された方法で行った。ＧｒｏＥＳは７量体のコシャペロニンであり、病気とは関係のないオリゴマータンパク質であるが、変性状態で長時間放置すると典型的なアミロイド線維を形成することがすでに確かめられており（T. Higurashi, H. Yagi, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Mol. Biol. 351, 1057-1069, 2005）、その方法に従ってアミロイド線維核を調製した。
【００３７】
上記の方法で調製したアミロイド線維核の溶液を超遠心分離（１１０，０００ｘｇ，４℃,１時間）にかけ、沈殿画分を回収し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５に再懸濁し、溶液中の沈殿が均等になるように超音波破砕（Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ２０，ＰＵＬＳＥＲ １，３０秒）を行った後、ＴｈｉｏＴによる蛍光が一定になるように希釈してシード（種）サンプル（タンパク質量は３０μｇ程度）を調製した。
【００３８】
（３）各種シード存在下でのＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧとＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇを用いた線維伸長
本発明のペプチドの由来と同種であるαシヌクレインアミロイド線維シードや異種タンパク質で病気とは無関係のＧｒｏＥＳタンパク質のアミロイド線維シード、異種タンパク質であるが病気に関連しているインシュリンとリゾチームのアミロイド線維シードをそれぞれ存在させて、ＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧとＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇによるアミロイド線維伸長実験を行った。
【００３９】
１Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液に終濃度５μＭのＴｈｉｏＴ、１〜６ｍｇ／ｍｌのアミロイド線維を伸長させるべきペプチドを、様々なシード存在下でよく混合した後、１５０μｌずつ、９６穴のプラスチックマルチプレートのウェルに分注し、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｅａｌ ＲＴでシールし、アルミホイルで遮光しながらＴＡＩＴＥＣ ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ−５１を用いて、１２０ｍｉｎ−１で振盪させながら、３７℃でインキュベートした。適当な時間に、アミロイド線維形成の指標となるＴｈｉｏＴの蛍光測定をＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダーを用いて行った。ＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇを用いた結果を図５に示した。同種のαシヌクレインのシードからは４８時間後にはアミロイド線維伸長がすでに起こっていた。一方、異種タンパク質のインシュリンのシードでも９６時間後には、ＧｒｏＥＳのシードとリゾチームのシードは１９２時間後にアミロイド線維伸長が起こっていることが明らかになった。
【００４０】
さらに、この反応が線維核由来であることを裏付けるとともに、線維の詳細な形態観察を、さらに感度の良い蛍光顕微鏡を用いて行った。１Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液に終濃度５〜２０μＭのＴｈｉｏＴ、１〜６ｍｇ／ｍｌのアミロイド線維を伸長させるべきペプチドをそれぞれ、シード存在下でよく混合した後、１０μｌをスライドガラス上に載せ、気泡が入らないように丁寧にカバーガラスで覆った後、余分な溶液をクリーンワイプで吸い取り、周囲をマニキュアで固め、アルミホイルで遮光した状態で３７℃、２０〜４８時間インキュベートした。使用ペプチドはＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇであった。核シードの量は３０μｇ、ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇの量はαシヌクレインとＧｒｏＥＳシードの場合３ｍｇ／ｍｌ、インシュリンシードおよびリゾチームシードの場合６ｍｇ／ｍｌであった。アミロイド線維伸長は、ＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００蛍光顕微鏡を用い、ＴｈｉｏＴの蛍光によって調べた。結果を図６に示す。同種であるαシヌクレインのシードだけでは見られなかったアミロイド線維（図６ａ）がＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ添加後４８時間（図６ｂ）で、さらに異種シードであるＧｒｏＥＳシード添加後４８時間（図６ｃ）、インシュリンシード（図６ｄ）、リゾチームシード（図６ｅ）の２０時間後に伸長したアミロイド線維の蛍光顕微鏡写真を示した。このように、ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇは、異種シードであるインシュリンシードおよびリゾチームシードからもアミロイド線維を伸長できることが確認された。
【００４１】
これらの結果から、ＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧやＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇには、同種のαシヌクレインのシードからは最も早く、そして、異種タンパク質由来の線維核からでも線維を伸長させる能力を有することが判明した。このように、このペプチドは脳神経変性病に関わるαシヌクレインのアミロイド線維形成をはじめ、他のアミロイド病（インシュリンやリゾチームが関与）、更には、病気とは関係していないＧｒｏＥＳタンパク質のアミロイド線維でさえ、それらの「種」が存在していればそれを基に伸長する性質を有することが証明された。このユニークな性質は、これらの本発明のペプチドを広範なアミロイド病の早期診断や検査に使用可能ならしめるものである。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、アミロイド病の診断薬および予防・治療薬の分野において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
SEQ ID NO:1 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-94 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with other amino acid (Xaa) than phenylalanine.
SEQ ID NO:2 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-95 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with other amino acid (Xaa) than phenylalanine.
SEQ ID NO:3 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-96 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with other amino acid (Xaa) than phenylalanine.
SEQ ID NO:4 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-94 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with glycine (SP76-94F94G).
SEQ ID NO:5 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-95 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with glycine (SP76-95F94G).
SEQ ID NO:6 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-96 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with glycine (SP76-96F94G).
SEQ ID NO:7 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-94 of alpha-synuclein (SP76-94).
SEQ ID NO:8 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-95 of alpha-synuclein (SP76-95).
SEQ ID NO:9 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-96 of alpha-synuclein (SP76-96).
SEQ ID NO:10 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 81-96 of alpha-synuclein (SP81-96).
SEQ ID NO:11 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-89 of alpha-synuclein (SP76-89).
SEQ ID NO:12 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 81-89 of alpha-synuclein (SP81-89).
SEQ ID NO:13 is an amino acid sequence of the amyloid fiber core region of human alpha-synuclein.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ（配列番号：１）、
（ｂ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ（配列番号：２）、
（ｃ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：３）、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド
［（ａ）〜（ｃ）においてＸａａはＰｈｅ以外のいずれかのアミノ酸を意味し、（ｄ）に記載のペプチドにおいてＸａａは保持されている］
からなる群より選択されるペプチド。
【請求項２】
ＸａａがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＡｒｇである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ＸａａがＧｌｙである請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
下記（ｅ）〜（ｇ）：
（ｅ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：４）、
（ｆ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号：５）、および
（ｇ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：６）
からなる群より選択される請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
標識されている請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドを含む、アミロイド病の検査用組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドを構成成分として含む、アミロイド病の検査用キット。
【請求項８】
対象から得た試料に請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドを接触させ、次いで、アミロイド線維の生成の有無を調べることを特徴とする、アミロイド病の検査方法であって、アミロイド線維が生成した場合に、対象がアミロイド病に罹患しているか、罹患するおそれがあると判定する方法。
【請求項９】
下記（ｈ）〜（ｍ）：
（ｈ）請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、
（ｉ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号：７）、
（ｊ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：８）、
（ｋ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：９）、
（ｌ）Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：１０）、および
（ｍ）（ｉ）〜（ｋ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド（ただし、９４番目のＰｈｅは保持されている）
からなる群より選択されるペプチドを含む、アミロイド病の予防または治療用医薬組成物。
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ（配列番号：１）、
（ｂ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ（配列番号：２）、
（ｃ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：３）、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド
［（ａ）〜（ｃ）においてＸａａはＰｈｅ以外のいずれかのアミノ酸を意味し、（ｄ）に記載のペプチドにおいてＸａａは保持されている］
からなる群より選択されるペプチド。
【請求項２】
ＸａａがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＡｒｇである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ＸａａがＧｌｙである請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
下記（ｅ）〜（ｇ）：
（ｅ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：４）、
（ｆ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号：５）、および
（ｇ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：６）
からなる群より選択される請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
標識されている請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドを含む、アミロイド病の検査用組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドを構成成分として含む、アミロイド病の検査用キット。
【請求項８】
対象から得た試料に請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドを接触させ、次いで、アミロイド線維の生成の有無を調べることを特徴とする、アミロイド病の検査方法であって、アミロイド線維が生成した場合に、対象がアミロイド病に罹患しているか、罹患するおそれがあると判定する方法。
【請求項９】
下記（ｈ）〜（ｍ）：
（ｈ）請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、
（ｉ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号：７）、
（ｊ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：８）、
（ｋ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：９）、
（ｌ）Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：１０）、および
（ｍ）（ｉ）〜（ｋ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド（ただし、９４番目のＰｈｅは保持されている）
からなる群より選択されるペプチドを含む、アミロイド病の予防または治療用医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１１６７２４（Ｐ２０１１−１１６７２４Ａ）
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７７６８１（Ｐ２００９−２７７６８１）
【出願日】平成２１年１２月７日（２００９．１２．７）
【出願人】（５０４１５０４６１）国立大学法人鳥取大学 (271)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月７日（２００９．１２．７）
【出願人】（５０４１５０４６１）国立大学法人鳥取大学 (271)
【Ｆターム（参考）】
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