アラメ由来のβ−グルカン素材
【課題】免疫賦活化作用、糖尿病改善作用を有するアラメ由来の水溶性β-グルカン素材を得る。
【解決手段】海藻の一種であるアラメを熱水抽出し、得られる水溶液に各種酵素を添加して侠雑物を排除することにより、βグルカン素材を得る。これらは水溶解性に優れた新規構造のβグルカンであり、免疫賦活作用及び抗糖尿病効果を発現するので、健康機能食品用の素材として利用可能である。
【解決手段】海藻の一種であるアラメを熱水抽出し、得られる水溶液に各種酵素を添加して侠雑物を排除することにより、βグルカン素材を得る。これらは水溶解性に優れた新規構造のβグルカンであり、免疫賦活作用及び抗糖尿病効果を発現するので、健康機能食品用の素材として利用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、アラメに含まれているβ-グルカン成分を抽出して得られるアラメ由来の素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本人の死亡原因として生活習慣病が台頭する中、医薬品に頼らない代替医療に対する期待は大きく、その中でも生理活性を有する素材を用いた機能性食品の果たす役割は大きい。
【０００３】
β-グルカンは、抗癌作用、抗アレルギー作用、また血糖調整作用など、多くの機能性を有した素材である。
【０００４】
また、β-グルカンの分子量は、一般的には数百万と言われているが、生物種別の具体的な分子量の報告としては、一例としては、黒酵母Aureobasidium pullulansの分子量が1,000,000Ｄａと報告されている（非特許文献１参照）。
【０００５】
【非特許文献１】黒酵母Aureobasidium pullulansによる高純度β-グルカンの生産とその生理機能；機能性糖質素材の開発と食品への応用、2005年、シーエムシー出版
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
β-グルカンは、βグルコースの重合した多糖類である。β-グルカンは、大麦や酵母やキノコに含有されている。
【０００７】
酵母やキノコのβ-グルカンの分子構造は、β1,3グルコピラノース結合の主鎖にβ1,6グルコピラノース結合で分岐を有する。大麦由来のβ-グルカンの分子構造は、β1,4グルコピラノース結合から成る。これらのβ-グルカンは、水への溶解性が低いという問題を有している。
【０００８】
β-グルカンは機能性食品素材として優れているが、水への溶解性が低いために、多くの食品への応用が困難であった。すなわち、水に懸濁させようとしてもダマを生じるため飲料への添加が実用上不可能であったり、また分散能が低いため食品製造工程においてハンドリングの困難を伴う等の問題点があった。
【０００９】
本発明は、水溶解性に優れたβ-グルカンを提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は上記課題を解決するために、海藻の一種であるアラメに含有されているアラメのβ-グルカンを抽出して得られることを特徴とするアラメ由来のβ-グルカン素材を提供する。
【００１１】
上記β-グルカンは、次の式１に示される構造を有するβ-グルカンであることを特徴とする。
【化１】
【００１２】
上記β-グルカンは、水に対して高い溶解性を有するβ-グルカンであることを特徴とする。
【００１３】
上記アラメ由来のβ-グルカン素材は、そのβ-グルカンは、免疫賦活作用及び抗糖尿病効果を有し、健康機能食品用の素材として利用されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材は、免疫賦活化作用を有し、糖尿病改善作用を有する。また、本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材は、水溶解性に優れるため、各種食品に応用出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材を実施するための最良の形態を実施例に基づいて説明する。
【００１６】
本発明者らは、上記のとおり、水溶解性に優れたβ-グルカンを得ることを目的として、開発を進め、褐藻類アラメのβ-グルカンが本目的を達成することを確認して本発明を完成させた。また、アラメは日本近海で水揚げされる食用海藻であり、多くの多糖類を含有している。このアラメより抽出したラミラナンとも呼ばれるアラメのβ-グルカンの分子構造はβ1,3グルコピラノース結合とβ1,6グルコピラノース結合から成り、かつ水溶解性に優れていることを見出して本発明を完成させた。
【００１７】
アラメの名称で呼ばれる海藻には、分類学的な見地から地域差がある。三重、徳島等の静岡県御前崎以西の関西方面でアラメと呼ばれる海藻は、褐藻綱コンブ目コンブ科アラメ属のサガラメであり、千葉県の房総半島等の関東方面でアラメと呼ばれる海藻は、褐藻綱コンブ目コンブ科アラメ属のアラメである。
【００１８】
ここで、本発明で言うアラメとは、褐藻綱コンブ目コンブ科カジメ属のカジメ、もしくは、褐藻綱コンブ目コンブ科アラメ属のアラメ及びサガラメ、好ましくは、褐藻綱コンブ目コンブ科アラメ属のアラメ及びサガラメ、より好ましくは、褐藻綱コンブ目コンブ科アラメ属のサガラメを指す。
【００１９】
アラメは、異型世代交代を行う生活環を有し、海藻の形を有しているものは巨視的な胞子体であり、配偶体は数mmの微視的な糸状体である。夏から秋にかけて成熟し多数の遊走子を放出、遊走子は発芽して雌雄の微視的な糸状体（配偶体）となり、それらの卵・精子が受精して元の藻体（胞子体）となる。その群落はアラメ場や海中林などと呼ばれており、魚介類の産卵・発育の場となる。
【００２０】
アラメは、本州中部、近畿地方、九州西部および山陰地方の一部地域では食用習慣があるものの、他のコンブ類に比べると漁獲量は少なく、認知度も低い。
【００２１】
アラメは日本海近縁に繁茂している日本人に馴染みやすい藻類である上、２ｍにも成長する大型藻類のため、天然の生産量も大きい。また、多年生であり、同一の収穫場所でも毎年収穫することが出来るため、一年生の藻類に比べて収穫が容易であるという利点を有する。
【００２２】
そして、本発明者らは、アラメより抽出したβ-グルカンの構造解析を行った。各シグナルの面積比が各分子の存在比となるため、4.75ppmおよび4.50ppm付近の面積比より、β1,3グルコピラノース結合とβ1,6グルコピラノース結合が3.62：2.00の割合で存在する直鎖構造であることを明らかとした。
【００２３】
さらに、4.5349ppmおよび4.5160ppmの二つのピークの合計面積比が、4.4977ppmおよび4.4781ppmの二つのピークの2倍以上であることから、β1,6グルコピラノース結合同士の連鎖は少なく、β1,3グルコピラノース結合とβ1,6グルコピラノース結合との結合の半分程度であるとの特徴を有することを見出した。
【００２４】
さらに、アラメ由来のβ-グルカン素材中のβ-グルカンの分子量は21,000Ｄａであった。
【００２５】
そして、アラメβグルカンの溶解性を検討したところ、大麦や酵母由来のβ-グルカンが水に難溶性であったのに対し、アラメβ-グルカンは極めて高い溶解性を有していた。これにより、高機能な直鎖構造を有するβ-グルカンを提供できることとなった。なお、ここで、β-グルカン素材とは、アラメより産生されたβ-グルカン調製物を意味し、β-グルカンとは、β-グルカン以外の物質を含有しない純品を意味する。
【００２６】
そして、アラメ由来のβ-グルカン素材は、好ましい香りを有することから、機能性を有した調味素材として活用出来る素材であることを見出した。
【００２７】
さらに、アラメ由来のβ-グルカン素材は、その機能性を試験した結果、免疫賦活化作用を有し、また、糖尿病改善により優れた効果等を有することを見出した。
【００２８】
具体的には、LPSおよびIFN-γで刺激したRAW267.4細胞に本発明のβ-グルカン素材を添加したところ、TNF-αおよびIL-6といったサイトカイン（cytokine：リンパ球や単球などの細胞から産生されて、細胞の増殖、分化、成熟、機能発現を作用する蛋白（糖蛋白）を総称する。）の発現量が、コントロール区に比べて有意に増加していた。また、ウィスターラットにおいて糖負荷試験を行ったところ、本発明のβ-グルカン素材給仕群（投与群）はコントロール群に比べて血糖値が有意に低下していた。
【００２９】
以上のとおり、本発明は、アラメよりβ-グルカンを抽出したアラメ由来のβ-グルカン素材であり、免疫賦活化を促し、糖尿病改善、更には、他のβ-グルカン同様、抗癌作用、抗アレルギー作用、また血糖調整作用等々の種々の生活習慣病予防を目的とした大量、安価な機能性素材として提供するものである。
【実施例】
【００３０】
（製造法）
本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材の実施例を以下説明する。本発明のβ-グルカン素材は、次のようにして製造した。
【００３１】
乾燥アラメ（10Ｋｇ）を粉砕し、重量の21倍(湿重量の３倍)の水を加えた後、１時間加熱することにより熱水抽出を行い、フィルタープレスでろ過した。次いで、得られたろ液に、5M NaOHを添加しpHを6.3に調整した。これにアルギン酸リアーゼを添加し、40℃にて1時間加熱した。含有するアルギン酸を低分子化させた後、90℃で10分加熱し酵素反応を停止させた。
【００３２】
再びpHを4.0に調整した後、ヘミセルラーゼを添加し、40℃にて２時間加熱した。含有するヘミセルロースを低分子化させた後、90℃で10分加熱し酵素反応を停止させた。限外ろ過し、分子量3000Da以下を除去した後、濃縮された高分子画分をスプレードライに供して本発明のβ-グルカン素材を得た。
【００３３】
得られたβ-グルカンの定量をmegazyme社のβ-グルカン測定キットを用いて行った。すなわち、β-グルカン粉末100mgに濃塩酸1.5mlを加え、30℃にて45分間加温した後、さらに10mlの水を添加し100℃にて2時間加熱することで、βグルカンを部分的に分解して可溶化し、またα-グルカンをグルコースにまで分解した。2M 水酸化カリウム10mlを加えて中和した後、0.2M酢酸バッファーを用いて液量を100mlにメスアップし、1500gで10分間の遠心分離を行い、上清を100μl採取した。なお、アラメは褐藻類にはα-グルカンは含有されていないが、キットのプロトコールに従って測定した。
【００３４】
得られた上清100μlに対し、上記測定キットに付属のexo-1,3-βglucanase/βglucosidase混合液を100μl添加し、40℃にて60分間反応させ、β-グルカンをグルコースにまで分解した。さらに、キットに付属のGlucose Determination Reagentを3ml添加し、40℃にて20分間呈色反応させ、510nmの吸光度を測定した。
【００３５】
α-グルカン量の測定は以下の通りに行った。β-グルカン粉末100mgに2M 水酸化カリウム2mlを加えて4℃にて20分間振盪させることで溶解させた。1.2M酢酸バッファー8mlを加えて中和した後、キットに付属のAmyloglucosidase/Invertase混合液を200μl添加し、40℃にて30分間反応させ、α-グルカンをグルコースに分解した。1500gで10分間の遠心分離を行い、上清を100μl採取した。
【００３６】
得られた上清100μlに対し、キットに付属のGlucose Determination Reagentを3ml添加し、40℃にて20分間呈色反応させ、510nmの吸光度を測定した。なお、ブランクとして0.2M酢酸バッファー、スタンダードとして1mg/mlのD-グルコース溶液を用いて同様の測定を行った。得られた吸光度を、以下の計算式に代入して、β-グルカン量を定量した。各グルカンの量は次のとおりである。
【００３７】
全グルカン量＝（各サンプル吸光度−ブランク吸光度）×100/スタンダード吸光度/検体量（mg）×90
α-グルカン量＝（各サンプル吸光度−ブランク吸光度）×100/スタンダード吸光度/検体量（mg）×9.27
β-グルカン量＝全グルカン−α-グルカン
【００３８】
上記本発明のβ-グルカン素材の成分分析を定法に従って行った。つまり、蛋白質はケルダール法、脂質はエーテル抽出法、灰分は直接灰化法、ナトリウムはICP発光分析法により測定し、炭水化物は計算式：100−(蛋白質＋脂質＋灰分)により算出した。
【００３９】
その成分分析値は、次の表１に示す通りであった。
【００４０】
【表１】
【００４１】
さらに、抽出したβグルカンを、精製し、分子量分析およびＮＭＲ（核磁気共鳴法：nuclear magnetic resonance)を用いた構造解析を行った。すなわち、抽出液に2倍量のエタノールを加え、多糖を沈殿回収した。これを乾燥させ、水に再融解させたものに対し終濃度4Mになるよう塩化カルシウムを加え、アルギン酸を析出させた。これをフィルターろ過で除いた後、透析し塩を除去した。これを凍結乾燥させたものを分析用サンプルとした。
【００４２】
分子量分析にはTSKgel PWXL(Tosoh)カラムを接続した高速液体クロマトグラフLC-6A（島津製作所）を用い、示唆屈折計(RID6-A、島津製作所)により検出した。標準多糖として分子量６０，０００〜４００，０００Ｄａのプルランを使用した。その結果、分子量分布曲線には均一のピークが認められ、標品とそれらを比較して分子量を計算したところ、約２１，０００Ｄａであった。
【００４３】
一方、ＮＭＲはＡＬ４００（日本電子社）を用い、重水に融解させて４％とし、1H-NMRを９０℃で、13C-NMRを２５℃で測定した。その結果、1H-NMRの分析値において、4.75ppmおよび4.5ppm付近のシグナル結果より、β1,3グルコピラノース結合とβ1,6グルコピラノース結合が3.62：2.00の割合で混合していることが判明した。
【００４４】
また4.5ppm付近に詳しく注目すると、β1,6グルコピラノース結合同士の連鎖は少なく、β1,3グルコピラノース結合とβ1,6グルコピラノース結合の結合の半分程度であることを見出した。以上の1H-NMR（図１参照）、13C-NMR（図２参照）の結果等より、本β-グルカンの構造が決定された。
【００４５】
構造模式図を次の式１に示す。これは、β1,3グルコピラノース結合とβ1,6グルコピラノース結合が3.62：2.00の割合で混合していた。
【００４６】
【化１】
【００４７】
さらに、本発明のβ-グルカン素材の水に対する溶解性についての確認を、次のように実施した。すなわち、Ａ社酵母β-グルカン（比較例）、Ｂ社大麦β-グルカン（比較例）および本発明のアラメβ-グルカンについて、それぞれ１％（w/v）となるよう２５℃の水溶液を調整した。振盪器を用いてこれを１０分間撹拌した後、測定温度（１５℃および５℃）に液温を合わせ、1500gにて10分間遠心分離し、水溶性分画を採取した。固形分含量を測定した後、凍結乾燥に供して水溶性分画のβグルカン粉末を得た。
【００４８】
また、この各粉末を用いて、それぞれ適した測定法にて可溶化したβ-グルカン量を測定した。すなわち、Ａ社酵母β-グルカンは多糖を酸加水分解して単糖にした後にフェノール硫酸法、Ｂ社大麦β-グルカンはmegazyme社のβ-グルカン測定キット（McCleary法）および本発明のβ-グルカン素材は前述の測定方法を用いて測定した。この測定結果により、次の表２に示すように、本発明のアラメβ-グルカンは、いずれの比較例に比べて有意に水溶性に優れており、得られる水溶性β-グルカン濃度が高いことが判明した。なお、表２中、水溶性の程度について、◎は良く溶ける、△は溶けにくい、×はほとんど溶けない、を示している。
【００４９】
【表２】
【００５０】
さらに、本発明のβ-グルカン素材の免疫賦活化作用、糖尿病改善効果の機能性の確認を、次のように実施した。
【００５１】
（機能性データの評価）
in vitro 免疫賦活化作用：
細胞培養系を使用して免疫賦活化作用を評価した。方法としては、マウスのマクロファージ細胞であるRAW267.4細胞（細胞数3×105cells/ml、培養液DMEM+10%FBS、培養条件:
温度37℃、CO2濃度5％）に、あらかじめ細胞を活性化させて、反応を起きやすくするために、ＬＰＳ（CalBiochem社：最終濃度1μg/ml）およびIFN-γ（wako社：最終濃度10IU/ml）を添加し、刺激を与え、37℃にて48時間培養した。
【００５２】
通常、この場合、サイトカインであるTNF-αおよびIL-6がマクロファージより分泌され、培養液中のTNF-αおよびIL-6の濃度が上昇するが、このとき、本発明のβ-グルカン素材（最終濃度1.25mg/mlおよび0.25mg/ml）を同時に添加することで、TNF-αおよびIL-6の濃度がどのように変化するかを確認した（表３、表４参照）。なお、表３及び表４中の数値は、TNF-αおよびIL-6の濃度の増加量を示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】
【表４】
【００５５】
その結果、マクロファージ細胞に前もって、LPSおよびIFN-γの刺激を与えた場合（LPS+IFN-γ（+））のみならず、LPSおよびIFN-γの刺激を与えなかった場合（LPS+IFN-γ（-））でも、本発明のアラメβ-グルカン添加により、コントロールよりもTNF-αにおいて発現量が有意に増加し（ｐ＜0.001）、またIL-6においても、増加の傾向がみられた。
【００５６】
これらのサイトカイン、特にTNF-αは標的細胞のレセプターに結合することで、標的細胞のアポトーシスを誘導することが知られている。つまり、本試験結果より、本β-グルカン素材はサイトカインの発現量上昇を通した免疫賦活化の効果を有することが示された。
【００５７】
in vivo 血糖降下作用：
糖負荷試験を行うため、ウィスターラット（雄、6週齢、18匹）を1２時間絶食後、体重1kg当たりグルコース2g、グルコース2g＋本発明のβ-グルカン素材1g、グルコース2g＋本発明のβ-グルカン素材２gをそれぞれ水溶液として経口投与し、開始前、30、60、120および120分後に尾静脈より採血し、血糖値を測定した（表５参照）。
【００５８】
【表５】
【００５９】
この測定の結果、本β-グルカン素材給仕群はコントロール群に比べて30分後の血糖値を有意に低下した（p＜0.01）。これより、本β-グルカン素材は、血糖降下作用を有することが示された。
【００６０】
以上のことから、本発明のβ-グルカン素材は、免疫賦活化作用、糖尿病改善効果を発現する優れた機能性素材であることを確認した。
【００６１】
本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材の最良の形態を実施例に基づいて説明したが、本発明は特にこのような実施例に限定されることなく、特許請求の範囲記載の技術的事項の範囲内でいろいろな実施例があることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材は、免疫賦活化作用、糖尿病改善作用を有する。また、本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材は水溶解性に優れているため、飲料、菓子等の各種食品に応用して、健康機能食品として適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明のアラメβ-グルカンの1H-NMR解析データ(横軸単位ppm)を示す図である。
【図２】本発明のアラメβ-グルカンの13C-NMR解析データ(横軸単位ppm)を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、アラメに含まれているβ-グルカン成分を抽出して得られるアラメ由来の素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本人の死亡原因として生活習慣病が台頭する中、医薬品に頼らない代替医療に対する期待は大きく、その中でも生理活性を有する素材を用いた機能性食品の果たす役割は大きい。
【０００３】
β-グルカンは、抗癌作用、抗アレルギー作用、また血糖調整作用など、多くの機能性を有した素材である。
【０００４】
また、β-グルカンの分子量は、一般的には数百万と言われているが、生物種別の具体的な分子量の報告としては、一例としては、黒酵母Aureobasidium pullulansの分子量が1,000,000Ｄａと報告されている（非特許文献１参照）。
【０００５】
【非特許文献１】黒酵母Aureobasidium pullulansによる高純度β-グルカンの生産とその生理機能；機能性糖質素材の開発と食品への応用、2005年、シーエムシー出版
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
β-グルカンは、βグルコースの重合した多糖類である。β-グルカンは、大麦や酵母やキノコに含有されている。
【０００７】
酵母やキノコのβ-グルカンの分子構造は、β1,3グルコピラノース結合の主鎖にβ1,6グルコピラノース結合で分岐を有する。大麦由来のβ-グルカンの分子構造は、β1,4グルコピラノース結合から成る。これらのβ-グルカンは、水への溶解性が低いという問題を有している。
【０００８】
β-グルカンは機能性食品素材として優れているが、水への溶解性が低いために、多くの食品への応用が困難であった。すなわち、水に懸濁させようとしてもダマを生じるため飲料への添加が実用上不可能であったり、また分散能が低いため食品製造工程においてハンドリングの困難を伴う等の問題点があった。
【０００９】
本発明は、水溶解性に優れたβ-グルカンを提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は上記課題を解決するために、海藻の一種であるアラメに含有されているアラメのβ-グルカンを抽出して得られることを特徴とするアラメ由来のβ-グルカン素材を提供する。
【００１１】
上記β-グルカンは、次の式１に示される構造を有するβ-グルカンであることを特徴とする。
【化１】
【００１２】
上記β-グルカンは、水に対して高い溶解性を有するβ-グルカンであることを特徴とする。
【００１３】
上記アラメ由来のβ-グルカン素材は、そのβ-グルカンは、免疫賦活作用及び抗糖尿病効果を有し、健康機能食品用の素材として利用されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材は、免疫賦活化作用を有し、糖尿病改善作用を有する。また、本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材は、水溶解性に優れるため、各種食品に応用出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材を実施するための最良の形態を実施例に基づいて説明する。
【００１６】
本発明者らは、上記のとおり、水溶解性に優れたβ-グルカンを得ることを目的として、開発を進め、褐藻類アラメのβ-グルカンが本目的を達成することを確認して本発明を完成させた。また、アラメは日本近海で水揚げされる食用海藻であり、多くの多糖類を含有している。このアラメより抽出したラミラナンとも呼ばれるアラメのβ-グルカンの分子構造はβ1,3グルコピラノース結合とβ1,6グルコピラノース結合から成り、かつ水溶解性に優れていることを見出して本発明を完成させた。
【００１７】
アラメの名称で呼ばれる海藻には、分類学的な見地から地域差がある。三重、徳島等の静岡県御前崎以西の関西方面でアラメと呼ばれる海藻は、褐藻綱コンブ目コンブ科アラメ属のサガラメであり、千葉県の房総半島等の関東方面でアラメと呼ばれる海藻は、褐藻綱コンブ目コンブ科アラメ属のアラメである。
【００１８】
ここで、本発明で言うアラメとは、褐藻綱コンブ目コンブ科カジメ属のカジメ、もしくは、褐藻綱コンブ目コンブ科アラメ属のアラメ及びサガラメ、好ましくは、褐藻綱コンブ目コンブ科アラメ属のアラメ及びサガラメ、より好ましくは、褐藻綱コンブ目コンブ科アラメ属のサガラメを指す。
【００１９】
アラメは、異型世代交代を行う生活環を有し、海藻の形を有しているものは巨視的な胞子体であり、配偶体は数mmの微視的な糸状体である。夏から秋にかけて成熟し多数の遊走子を放出、遊走子は発芽して雌雄の微視的な糸状体（配偶体）となり、それらの卵・精子が受精して元の藻体（胞子体）となる。その群落はアラメ場や海中林などと呼ばれており、魚介類の産卵・発育の場となる。
【００２０】
アラメは、本州中部、近畿地方、九州西部および山陰地方の一部地域では食用習慣があるものの、他のコンブ類に比べると漁獲量は少なく、認知度も低い。
【００２１】
アラメは日本海近縁に繁茂している日本人に馴染みやすい藻類である上、２ｍにも成長する大型藻類のため、天然の生産量も大きい。また、多年生であり、同一の収穫場所でも毎年収穫することが出来るため、一年生の藻類に比べて収穫が容易であるという利点を有する。
【００２２】
そして、本発明者らは、アラメより抽出したβ-グルカンの構造解析を行った。各シグナルの面積比が各分子の存在比となるため、4.75ppmおよび4.50ppm付近の面積比より、β1,3グルコピラノース結合とβ1,6グルコピラノース結合が3.62：2.00の割合で存在する直鎖構造であることを明らかとした。
【００２３】
さらに、4.5349ppmおよび4.5160ppmの二つのピークの合計面積比が、4.4977ppmおよび4.4781ppmの二つのピークの2倍以上であることから、β1,6グルコピラノース結合同士の連鎖は少なく、β1,3グルコピラノース結合とβ1,6グルコピラノース結合との結合の半分程度であるとの特徴を有することを見出した。
【００２４】
さらに、アラメ由来のβ-グルカン素材中のβ-グルカンの分子量は21,000Ｄａであった。
【００２５】
そして、アラメβグルカンの溶解性を検討したところ、大麦や酵母由来のβ-グルカンが水に難溶性であったのに対し、アラメβ-グルカンは極めて高い溶解性を有していた。これにより、高機能な直鎖構造を有するβ-グルカンを提供できることとなった。なお、ここで、β-グルカン素材とは、アラメより産生されたβ-グルカン調製物を意味し、β-グルカンとは、β-グルカン以外の物質を含有しない純品を意味する。
【００２６】
そして、アラメ由来のβ-グルカン素材は、好ましい香りを有することから、機能性を有した調味素材として活用出来る素材であることを見出した。
【００２７】
さらに、アラメ由来のβ-グルカン素材は、その機能性を試験した結果、免疫賦活化作用を有し、また、糖尿病改善により優れた効果等を有することを見出した。
【００２８】
具体的には、LPSおよびIFN-γで刺激したRAW267.4細胞に本発明のβ-グルカン素材を添加したところ、TNF-αおよびIL-6といったサイトカイン（cytokine：リンパ球や単球などの細胞から産生されて、細胞の増殖、分化、成熟、機能発現を作用する蛋白（糖蛋白）を総称する。）の発現量が、コントロール区に比べて有意に増加していた。また、ウィスターラットにおいて糖負荷試験を行ったところ、本発明のβ-グルカン素材給仕群（投与群）はコントロール群に比べて血糖値が有意に低下していた。
【００２９】
以上のとおり、本発明は、アラメよりβ-グルカンを抽出したアラメ由来のβ-グルカン素材であり、免疫賦活化を促し、糖尿病改善、更には、他のβ-グルカン同様、抗癌作用、抗アレルギー作用、また血糖調整作用等々の種々の生活習慣病予防を目的とした大量、安価な機能性素材として提供するものである。
【実施例】
【００３０】
（製造法）
本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材の実施例を以下説明する。本発明のβ-グルカン素材は、次のようにして製造した。
【００３１】
乾燥アラメ（10Ｋｇ）を粉砕し、重量の21倍(湿重量の３倍)の水を加えた後、１時間加熱することにより熱水抽出を行い、フィルタープレスでろ過した。次いで、得られたろ液に、5M NaOHを添加しpHを6.3に調整した。これにアルギン酸リアーゼを添加し、40℃にて1時間加熱した。含有するアルギン酸を低分子化させた後、90℃で10分加熱し酵素反応を停止させた。
【００３２】
再びpHを4.0に調整した後、ヘミセルラーゼを添加し、40℃にて２時間加熱した。含有するヘミセルロースを低分子化させた後、90℃で10分加熱し酵素反応を停止させた。限外ろ過し、分子量3000Da以下を除去した後、濃縮された高分子画分をスプレードライに供して本発明のβ-グルカン素材を得た。
【００３３】
得られたβ-グルカンの定量をmegazyme社のβ-グルカン測定キットを用いて行った。すなわち、β-グルカン粉末100mgに濃塩酸1.5mlを加え、30℃にて45分間加温した後、さらに10mlの水を添加し100℃にて2時間加熱することで、βグルカンを部分的に分解して可溶化し、またα-グルカンをグルコースにまで分解した。2M 水酸化カリウム10mlを加えて中和した後、0.2M酢酸バッファーを用いて液量を100mlにメスアップし、1500gで10分間の遠心分離を行い、上清を100μl採取した。なお、アラメは褐藻類にはα-グルカンは含有されていないが、キットのプロトコールに従って測定した。
【００３４】
得られた上清100μlに対し、上記測定キットに付属のexo-1,3-βglucanase/βglucosidase混合液を100μl添加し、40℃にて60分間反応させ、β-グルカンをグルコースにまで分解した。さらに、キットに付属のGlucose Determination Reagentを3ml添加し、40℃にて20分間呈色反応させ、510nmの吸光度を測定した。
【００３５】
α-グルカン量の測定は以下の通りに行った。β-グルカン粉末100mgに2M 水酸化カリウム2mlを加えて4℃にて20分間振盪させることで溶解させた。1.2M酢酸バッファー8mlを加えて中和した後、キットに付属のAmyloglucosidase/Invertase混合液を200μl添加し、40℃にて30分間反応させ、α-グルカンをグルコースに分解した。1500gで10分間の遠心分離を行い、上清を100μl採取した。
【００３６】
得られた上清100μlに対し、キットに付属のGlucose Determination Reagentを3ml添加し、40℃にて20分間呈色反応させ、510nmの吸光度を測定した。なお、ブランクとして0.2M酢酸バッファー、スタンダードとして1mg/mlのD-グルコース溶液を用いて同様の測定を行った。得られた吸光度を、以下の計算式に代入して、β-グルカン量を定量した。各グルカンの量は次のとおりである。
【００３７】
全グルカン量＝（各サンプル吸光度−ブランク吸光度）×100/スタンダード吸光度/検体量（mg）×90
α-グルカン量＝（各サンプル吸光度−ブランク吸光度）×100/スタンダード吸光度/検体量（mg）×9.27
β-グルカン量＝全グルカン−α-グルカン
【００３８】
上記本発明のβ-グルカン素材の成分分析を定法に従って行った。つまり、蛋白質はケルダール法、脂質はエーテル抽出法、灰分は直接灰化法、ナトリウムはICP発光分析法により測定し、炭水化物は計算式：100−(蛋白質＋脂質＋灰分)により算出した。
【００３９】
その成分分析値は、次の表１に示す通りであった。
【００４０】
【表１】
【００４１】
さらに、抽出したβグルカンを、精製し、分子量分析およびＮＭＲ（核磁気共鳴法：nuclear magnetic resonance)を用いた構造解析を行った。すなわち、抽出液に2倍量のエタノールを加え、多糖を沈殿回収した。これを乾燥させ、水に再融解させたものに対し終濃度4Mになるよう塩化カルシウムを加え、アルギン酸を析出させた。これをフィルターろ過で除いた後、透析し塩を除去した。これを凍結乾燥させたものを分析用サンプルとした。
【００４２】
分子量分析にはTSKgel PWXL(Tosoh)カラムを接続した高速液体クロマトグラフLC-6A（島津製作所）を用い、示唆屈折計(RID6-A、島津製作所)により検出した。標準多糖として分子量６０，０００〜４００，０００Ｄａのプルランを使用した。その結果、分子量分布曲線には均一のピークが認められ、標品とそれらを比較して分子量を計算したところ、約２１，０００Ｄａであった。
【００４３】
一方、ＮＭＲはＡＬ４００（日本電子社）を用い、重水に融解させて４％とし、1H-NMRを９０℃で、13C-NMRを２５℃で測定した。その結果、1H-NMRの分析値において、4.75ppmおよび4.5ppm付近のシグナル結果より、β1,3グルコピラノース結合とβ1,6グルコピラノース結合が3.62：2.00の割合で混合していることが判明した。
【００４４】
また4.5ppm付近に詳しく注目すると、β1,6グルコピラノース結合同士の連鎖は少なく、β1,3グルコピラノース結合とβ1,6グルコピラノース結合の結合の半分程度であることを見出した。以上の1H-NMR（図１参照）、13C-NMR（図２参照）の結果等より、本β-グルカンの構造が決定された。
【００４５】
構造模式図を次の式１に示す。これは、β1,3グルコピラノース結合とβ1,6グルコピラノース結合が3.62：2.00の割合で混合していた。
【００４６】
【化１】
【００４７】
さらに、本発明のβ-グルカン素材の水に対する溶解性についての確認を、次のように実施した。すなわち、Ａ社酵母β-グルカン（比較例）、Ｂ社大麦β-グルカン（比較例）および本発明のアラメβ-グルカンについて、それぞれ１％（w/v）となるよう２５℃の水溶液を調整した。振盪器を用いてこれを１０分間撹拌した後、測定温度（１５℃および５℃）に液温を合わせ、1500gにて10分間遠心分離し、水溶性分画を採取した。固形分含量を測定した後、凍結乾燥に供して水溶性分画のβグルカン粉末を得た。
【００４８】
また、この各粉末を用いて、それぞれ適した測定法にて可溶化したβ-グルカン量を測定した。すなわち、Ａ社酵母β-グルカンは多糖を酸加水分解して単糖にした後にフェノール硫酸法、Ｂ社大麦β-グルカンはmegazyme社のβ-グルカン測定キット（McCleary法）および本発明のβ-グルカン素材は前述の測定方法を用いて測定した。この測定結果により、次の表２に示すように、本発明のアラメβ-グルカンは、いずれの比較例に比べて有意に水溶性に優れており、得られる水溶性β-グルカン濃度が高いことが判明した。なお、表２中、水溶性の程度について、◎は良く溶ける、△は溶けにくい、×はほとんど溶けない、を示している。
【００４９】
【表２】
【００５０】
さらに、本発明のβ-グルカン素材の免疫賦活化作用、糖尿病改善効果の機能性の確認を、次のように実施した。
【００５１】
（機能性データの評価）
in vitro 免疫賦活化作用：
細胞培養系を使用して免疫賦活化作用を評価した。方法としては、マウスのマクロファージ細胞であるRAW267.4細胞（細胞数3×105cells/ml、培養液DMEM+10%FBS、培養条件:
温度37℃、CO2濃度5％）に、あらかじめ細胞を活性化させて、反応を起きやすくするために、ＬＰＳ（CalBiochem社：最終濃度1μg/ml）およびIFN-γ（wako社：最終濃度10IU/ml）を添加し、刺激を与え、37℃にて48時間培養した。
【００５２】
通常、この場合、サイトカインであるTNF-αおよびIL-6がマクロファージより分泌され、培養液中のTNF-αおよびIL-6の濃度が上昇するが、このとき、本発明のβ-グルカン素材（最終濃度1.25mg/mlおよび0.25mg/ml）を同時に添加することで、TNF-αおよびIL-6の濃度がどのように変化するかを確認した（表３、表４参照）。なお、表３及び表４中の数値は、TNF-αおよびIL-6の濃度の増加量を示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】
【表４】
【００５５】
その結果、マクロファージ細胞に前もって、LPSおよびIFN-γの刺激を与えた場合（LPS+IFN-γ（+））のみならず、LPSおよびIFN-γの刺激を与えなかった場合（LPS+IFN-γ（-））でも、本発明のアラメβ-グルカン添加により、コントロールよりもTNF-αにおいて発現量が有意に増加し（ｐ＜0.001）、またIL-6においても、増加の傾向がみられた。
【００５６】
これらのサイトカイン、特にTNF-αは標的細胞のレセプターに結合することで、標的細胞のアポトーシスを誘導することが知られている。つまり、本試験結果より、本β-グルカン素材はサイトカインの発現量上昇を通した免疫賦活化の効果を有することが示された。
【００５７】
in vivo 血糖降下作用：
糖負荷試験を行うため、ウィスターラット（雄、6週齢、18匹）を1２時間絶食後、体重1kg当たりグルコース2g、グルコース2g＋本発明のβ-グルカン素材1g、グルコース2g＋本発明のβ-グルカン素材２gをそれぞれ水溶液として経口投与し、開始前、30、60、120および120分後に尾静脈より採血し、血糖値を測定した（表５参照）。
【００５８】
【表５】
【００５９】
この測定の結果、本β-グルカン素材給仕群はコントロール群に比べて30分後の血糖値を有意に低下した（p＜0.01）。これより、本β-グルカン素材は、血糖降下作用を有することが示された。
【００６０】
以上のことから、本発明のβ-グルカン素材は、免疫賦活化作用、糖尿病改善効果を発現する優れた機能性素材であることを確認した。
【００６１】
本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材の最良の形態を実施例に基づいて説明したが、本発明は特にこのような実施例に限定されることなく、特許請求の範囲記載の技術的事項の範囲内でいろいろな実施例があることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材は、免疫賦活化作用、糖尿病改善作用を有する。また、本発明に係るアラメ由来のβ-グルカン素材は水溶解性に優れているため、飲料、菓子等の各種食品に応用して、健康機能食品として適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明のアラメβ-グルカンの1H-NMR解析データ(横軸単位ppm)を示す図である。
【図２】本発明のアラメβ-グルカンの13C-NMR解析データ(横軸単位ppm)を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラメに含有されているβ-グルカンを抽出して得られることを特徴とするアラメ由来のβ-グルカン素材。
【請求項２】
上記β-グルカンは、次の式１に示される構造を有するβ-グルカンであることを特徴とする請求項１記載のアラメ由来のβ-グルカン素材。
【化１】
【請求項３】
上記β-グルカンは、水に対して高い溶解性を有するβ-グルカンであることを特徴とする請求項１又は２記載のアラメ由来のβ-グルカン素材。
【請求項４】
上記β-グルカンは、免疫賦活作用及び抗糖尿病効果を有し、健康機能食品用の素材として利用されることを特徴とする請求項１、２又は３記載のアラメ由来のβ-グルカン素材。
【請求項１】
アラメに含有されているβ-グルカンを抽出して得られることを特徴とするアラメ由来のβ-グルカン素材。
【請求項２】
上記β-グルカンは、次の式１に示される構造を有するβ-グルカンであることを特徴とする請求項１記載のアラメ由来のβ-グルカン素材。
【化１】
【請求項３】
上記β-グルカンは、水に対して高い溶解性を有するβ-グルカンであることを特徴とする請求項１又は２記載のアラメ由来のβ-グルカン素材。
【請求項４】
上記β-グルカンは、免疫賦活作用及び抗糖尿病効果を有し、健康機能食品用の素材として利用されることを特徴とする請求項１、２又は３記載のアラメ由来のβ-グルカン素材。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２４８１３３（Ｐ２００８−２４８１３３Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９２４９３（Ｐ２００７−９２４９３）
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（０００２２９５１９）日本ハム株式会社 (57)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（０００２２９５１９）日本ハム株式会社 (57)
【Ｆターム（参考）】
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