説明

アルコールの製造方法

本発明は微生物発酵、特にCOを含む基質の微生物発酵、によるアルコールおよび酸のような産物の産生に関する。より具体的には微生物発酵による産物の効率を改善するための方法とシステムに関する。具体的な態様では、本発明はCOのCOへの変換の割合を解明する工程を含む、所望の産物の最適な産生の方法を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は一般にガス基質に関する微生物発酵による微生物成長および産物の産生の効率を高める方法に関する。より具体的には、本発明は一酸化炭素含有ガスの微生物発酵によりアルコール、特にエタノールを産生する方法に関する。具体的な態様では、本発明は微生物発酵の間にCOの産物への全体的な正味変換率を定量する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
エタノールは世界中で水素が豊富な液状交通燃料として主要なものに急速になりつつある。2005年のエタノールの世界消費量は概算で122億ガロンであった。燃料エタノール産業の世界市場も、ヨーロッパ、日本、米国、およびいくつもの発展途上国での関心の高まりから、将来急速に成長し続けることが予想されている。
【0003】
例えば米国では、ガソリンに10%のエタノールを入れた混合物であるE10を生産するのにエタノールが使用される。E10混合物では、エタノール成分は酸素化剤として働き、燃焼効率を高め、大気汚染物質の産生を減らす。ブラジルでは、エタノールはガソリンに混入させる酸素化剤としてまたそれ自体純燃料として交通燃料需要の約30%を充足する。またヨーロッパでは、温室効果ガス(GHG)放出の重大性を中心とする環境への関心が刺激となって、欧州連合(EU)はエタノール由来のバイオマスのような持続可能な交通燃料消費についての強制的な目標を加盟国に課した。
【0004】
燃料エタノールの大部分は、主要な炭素源として、サトウキビから抽出されるショ糖または穀類から抽出されるデンプンのような作物由来の炭水化物を使用する、伝統的な酵母に基づく発酵過程を経て生産される。しかしながら、これらの炭水化物供給原料の費用は人間の食物または動物の飼料としてのそれらの価格によって影響を受け、また、エタノール生産用のデンプンまたはショ糖産生作物の栽培は地理学上あらゆる場所で経済的に持続可能なわけではない。したがって、より低原価および/またはより豊富な炭素源を燃料エタノールに変換する技術開発に関心が持たれる。
【0005】
COは石炭または石油および石油派生製品のような有機物の不完全燃焼における主要な、遊離した、エネルギーに富む副産物である。例えば、オーストラリアの鉄鋼産業は年間500,000トンを超えるCOを産生し大気中に放出すると報告されている。
【0006】
主としてCOおよび/またはCOと水素(H)からなるガスを種々の燃料および化学物質に変換するには触媒過程を使用することができる。微生物もこれらのガスを燃料および化学物質に変換するのに使用することができる。これらの生物学的過程は、一般に化学反応よりも遅いが、より高い選択性、より高い収率、より低いエネルギー費用、およびより大きな耐毒性など触媒過程より有利な点がいくつもある。
【0007】
COを唯一の炭素源として成長する微生物の能力は1903年に最初に発見された。これは後に独立栄養成長のアセチル補酵素A(アセチルCoA)生化学的経路(Woods-Ljungdahl経路および一酸化炭素脱水素酵素/アセチルCoAシンターゼ(CODH/ACS)経路としても知られている)を使用する生物の特性であることが究明された。カルボキシド栄養性生物、光合成生物、メタン産生生物、および酢酸産生生物を含む多数の嫌気性生物は、COを種々の最終産物、すなわちCO、H、メタン、n−ブタノール、アセタート、およびエタノールに代謝することが示された。COを唯一の炭素源として使用しながら、すべてのそのような生物は少なくとも2種のこれらの最終産物を産生する。
【0008】
例えばクロストリジウム属のような嫌気性細菌は、アセチルCoA生化学的経路を経てCO、CO、およびHからエタノールを産生することが示された。例えば、ガスからエタノールを産生する種々のクロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii)株がWO00/68407、EP117309、米国特許第5,173,429号、第5,593,886号、および第6,368,819号、WO98/00558、およびWO02/08438に記載されている。細菌のクロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)種もガスからエタノールを産生することが知られている(Abriniら、Archives of Microbiology 161,pp345-351(1994))。
【0009】
しかしながら、ガスの発酵による微生物によるエタノール産生は、通常はアセタートおよび/または酢酸の同時産生を伴う。利用可能な炭素の一部はエタノールではなくアセタート/酢酸に変換されるので、そのような発酵過程を使用するエタノールの生産効率は望ましいものとはいえない。また、副産物であるアセタート/酢酸が何か他の目的に使用できない限り、廃棄物処理の問題をもたらす。アセタート/酢酸は微生物によってメタンに変換されるので、地球温暖化ガス放出に寄与する可能性がある。
【0010】
一酸化炭素を唯一の炭素源およびエネルギー源として用いる微生物の能力に関して知られているいくつかの酵素はその活性に金属補因子を必要とすることが知られている。活性のための金属補因子を必要とする鍵酵素の例としては一酸化炭素脱水素酵素(CODH)およびアセチルCoAシンターゼ(ACS)が挙げられる。
【0011】
WO2007/117157、WO2008/115080、WO2009/022925、WO2009/058028、WO2009/064200、WO2009/064201、およびWO2009/113878は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれるが、一酸化炭素を含むガスの嫌気性発酵によりアルコール、特にエタノールを産生する過程を記載する。WO2007/117157に記載される発酵過程の副産物として産生されるアセタートは水素ガスおよび二酸化炭素ガスに変換され、その一方または両方が嫌気性発酵過程で使用することができる。WO2009/022925はCOを含む基質の発酵による酸およびアルコールのような産物への変換におけるpHおよびORPの効果を開示する。WO2009/058028には産業排気ガスを使用してアルコールのような産物を発酵により産生することが開示されている。WO2009/064201にはCO担体および発酵におけるCOの使用について開示されている。WO2009/113878にはCOを含む基質の発酵の間に1種以上の酸を1種以上のアルコールに変換することが開示されている。
【0012】
COを含むガスによって成長することができる微生物は糖類によって成長する微生物に関する従来からの速度よりも遅く成長することが知られている。商業的観点からは、発酵過程において、採算の合うレベルの産物が合成されることを可能にする、十分に高い細胞密度まで微生物個体群が成長するのに必要な時間が、前記過程の収益性に影響する重要な操業費用である。培養物の成長速度および/または生産性を高める技術は、したがって、所望の細胞密度および/または所望の産物水準に到達するのに必要な時間を減じ全体の過程の商業的実行可能性を改善することができる。
【0013】
ガス原料からアルコールを産生するための発酵過程では、微生物成長および/またはアルコール産生のための適切な条件確保が最適な微生物成長および/またはアルコール生産性を維持するのに重要である。例えば、発酵の初期操業の間、主要な目標は微生物の成長であってよい。しかしながら、所望の微生物密度に到達したら、主要な目標はアルコール産生量であってよい。変化が起きると、特に操作条件の変化に応じて、産物のプロファイルが発酵の進行とともにいかに変化するかを理解することでオペレータは生産性を最適化することができる。
【0014】
COおよび任意成分のHを、急速成長および/またはアルコール産生のような特定の要求についての最適濃度または最適範囲で含む基質を提供することもまた困難だがやりがいのあることである。例えば、過剰なCOは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第7,285,402号に記載されるようにCO阻止作用をもたらす可能性がある。さらに、過少なCOでは、微生物成長およびアルコール産生を含む代謝速度が落ちる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
本発明の目的は上記の欠点を少なくともある程度克服するための過程を提供すること、または公衆に少なくとも有用な選択を与えることである。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明は、COを含む基質の微生物発酵による酸および/またはアルコールを含む産物を産生する方法に関し、少なくとも一部の微生物培養物は、
COを含む基質の少なくとも一部を微生物バイオマスに変換し;および/または
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸に変換し;および/または
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換し;および/または
1種以上の酸、およびCOを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換する。
【0017】
一態様では、前記微生物培養物は、
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸に変換し;かつ
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換する。
【0018】
別の一態様では、前記微生物培養物は、
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸に変換し;かつ
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換し;かつ
1種以上の酸、およびCOを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換する。
【0019】
本発明の具体的態様では、前記基質はCOおよびHを含む。しかしながら、本発明によれば、前記変換は全部の炭素を細胞物質および/または産物に固定するには不十分なHで進行する。具体的態様では、Hの供給は2:1未満のH:COが培養物により変換されるようになされ、例えば約1:1、または約1:2、または約1:3、または約1:4、または約1:5、または約1:10である。具体的態様では、Hは供給されない。
【0020】
本発明の第一の側面では、COおよび任意成分のHを含む基質の微生物発酵の効率を高める方法が提供され、その方法はCOの第一の部分が1種以上の酸および/または1種以上のアルコールを含む1種以上の所望の産物として固定され、COの第二の部分がCOに変換されるように前記基質を微生物培養物に提供することを含む。具体的態様では、COに変換されるCOの割合を定量して1種以上の所望の産物の産生のための基質供給速度を決定する。
【0021】
具体的態様では、基質供給速度は、
i)COに変換されるCOの割合が最適値または最適範囲未満であると定量される場合には増加させ;または
ii)COに変換されるCOの割合が最適値または最適範囲を超えていると定量される場合には減少させ;または
iii)COに変換されるCOの割合が実質的に最適値または最適範囲にあると定量されると維持される。
【0022】
具体的態様では、基質供給速度はCOに変換されるCOの割合が実質的に最適値または最適範囲に維持されるように自動的に調節される。
具体的態様では、前記最適な値または範囲は所望の発酵産物に基づき実験的に究明することができる。具体的態様では、アルコールが所望の産物である場合、前記基質は固定炭素の少なくとも50%、または少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%がアルコールとして固定されるように提供することができる。それに加えてまたはそれに代えて、アセタートが所望の産物である場合、前記基質は固定炭素の少なくとも50%、または少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%がアセタートとして固定されるように提供することができる。
【0023】
具体的態様では、所望の産物として固定される炭素の割合は実質的に一定に維持することができる。具体的態様では、所望の産物として固定される炭素の割合が所定の範囲から外れる場合に、基質の供給は前記割合が所定の範囲に戻るように制御される。具体的態様では、前記所定の範囲は約±1%、または約±2%、または約±3%、または約±4%、または約±5%である。
【0024】
具体的態様では、基質の供給は前記所定の範囲からの逸脱に応じて自動的に調節される。
本発明の第二の側面では、COおよび任意成分のHを含む基質の微生物発酵による1種以上の酸および/またはアルコールの生産効率を高める方法が提供され、
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸に変換すること;または
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換すること;または
1種以上の酸、およびCOを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換すること;
から、
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸に変換すること;または
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換すること;または
1種以上の酸、およびCOを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換すること;
へ微生物培養物の少なくとも一部が遷移される。
【0025】
本発明の具体的態様では、微生物培養物の少なくとも一部をその微生物培養物および/または前記基質流を調節して遷移することができる。特定の態様では、嫌気性発酵はバイオリアクタ内で実行され、前記微生物培養物は培養液を含む発酵液に少なくともある程度に懸濁される。具体的態様では、前記微生物培養物の少なくとも一部を前記発酵液および/または培養液を調節して遷移することができる。
【0026】
特定の態様では、前記調節は、前記発酵液のpHの変更、前記発酵液の酸化還元電位の変更、前記発酵液のCO濃度の変更、前記基質流の組成の変更、前記基質流の圧力の変更、発酵液の攪拌速度の変更、産物の除去、前記発酵液の酸および/またはアルコール濃度の変更、前記培養液中の1種以上の栄養素の変更、1種以上の栄養素の供給速度の変更のうち1種以上を含む。
【0027】
本発明の具体的態様では、COを含む前記基質はまたHを含む。ある態様では、前記調節は前記発酵液のH濃度の変更および/または前記発酵液中のCO:H比の変更を含む。特定の態様では、COおよび任意成分のHを含む前記基質はガス状である。ある態様では、前記調節には前記バイオリアクタ内のCOおよび/またはHの分圧の変更を含む。
【0028】
本発明の具体的態様では、前記方法は前記微生物培養物による正味の変換が定量できるように、COに酸化されたCOの割合を定量することを含む。具体的態様では、前記微生物発酵の全体的な正味の変換は、
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸に変換すること;または
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換すること;または
1種以上の酸、およびCOを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換することである。
【0029】
第三の側面では、所定の操作パラメータに基づくCOを含む基質の微生物発酵による1種以上の酸および/またはアルコールの産生効率を高める方法が提供され、前記方法は1種以上の産物に向けられる炭素の割合を定量し、定量結果により、
i)所望の産物として固定される炭素の割合が増加するように1種以上の操作パラメータを調節すること;または
ii)所望の産物として固定される炭素の割合が実質的に一定に維持されるように操作パラメータを維持すること
のいずれかを含む。
【0030】
特定の態様では、前記調節は下記の操作パラメータの1種以上を変更することを含む。すなわち、前記発酵液のpHの変更、前記発酵液の酸化還元電位の変更、前記発酵液のCO濃度の変更、基質の供給速度の変更、前記基質流の組成の変更、前記基質流の圧力の変更、発酵液の攪拌速度の変更、産物の除去、前記発酵液の酸および/またはアルコール濃度の変更、前記培養液中の1種以上の栄養素の変更、1種以上の栄養素の供給速度の変更である。
【0031】
本発明の具体的態様では、COを含む前記基質はHをも含む。ある態様では、前記調節は前記発酵液のH濃度の変更および/または前記発酵液中のCO:H比の変更を含んでよい。特定の態様では、COおよび任意成分のHを含む前記基質はガス状である。ある態様では、前記調節には前記バイオリアクタ内のCOおよび/またはHの分圧の変更を含む。
【0032】
前記第一、第二、第三の側面の具体的態様では、効率を高める前記方法にはアルコール、特にエタノールのような産物が1種以上産生される速度を高めることを含む。
本発明の第四の側面では、COを含む基質の微生物発酵における全体的な正味の変換の定量方法が提供され、前記方法は微生物培養物によって特定の産物として固定される炭素の割合の定量を含む。
【0033】
具体的態様では、特定の産物として固定される炭素の割合はCOへ酸化されるCOの割合を定量して定めることができる。
具体的態様では、前記微生物発酵における全体的な正味の変換は、
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸に変換すること;または
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換すること、または
1種以上の酸、およびCOを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換することである。
【0034】
具体的態様では、COに変換されたCOの割合は前記微生物培養物によって消費されたCOおよび任意成分のH並びに微生物培養物によって産生されたCOを測定して決められる。
【0035】
前記第一、第二、第三、または第四の側面の特定の態様では、バイオリアクタに出入りするCO、H、および/またはCOは実質的に連続的に、または調節がなされる前後のような不連続な時点で監視することができる。ある態様では、バイオリアクタに出入りするCO、CO、および/またはHの量はガスクロマトグラフィーを用いて定量することができる。具体的態様では、ガスクロマトグラフィーはCOに変換されたCOの割合を定量するのに使用される。一態様では、前記ガスクロマトグラフィーはマイクロGCを使用して実施される。
【0036】
前記微生物培養物の一部は別の変換を伴う可能性が認められるが、全体の培養物による全体的な正味の変換を定量することはできる。本発明の具体的態様では、基質流が5%未満のH、または4%未満のH、または3%未満のH、または2%未満のH、または1%未満のHを含むような態様で、実質的にHが制限されている場合には、CO(産生)/CO(消費)比が0.5であるとCOを含む基質の1種以上の酸および必要なら微生物細胞への正味の変換を示す。CO(産生)/CO(消費)比が0.667であるとCOを含む基質の1種以上のアルコールへの正味の変換を示す。CO(産生)/CO(消費)比が0.5〜0.667であるとCOを含む基質の1種以上の酸および1種以上のアルコール並びに必要なら微生物細胞への正味の変換を示す。CO(産生)/CO(消費)比が0.667を超えるとCOおよび1種以上の酸を含む基質の1種以上のアルコールへの正味の変換を示す。
【0037】
上記の側面の種々の態様において、少なくとも一部の微生物培養物は1種以上のアルコールを1種以上の酸および一酸化炭素に変換するかもしれない。しかしながら、具体的な態様では、前記嫌気性発酵はCOを含む基質の産物への正味の全体的変換をもたらす。他の態様では、CO(産生)/CO(消費)比が0.5未満の場合、前記正味の変換は1種以上のアルコールから1種以上の酸への変換であり、そしてCOおよび/またはHOの還元であり、望ましくない。
【0038】
本発明の第五の側面では、COを含む基質流の1種以上の酸および/または1種以上のアルコールのような産物への前記微生物発酵のためのシステムが提供され、前記システムは微生物培養物を含有するバイオリアクタ、特定の産物として固定される炭素の割合を定量するように構成された測定手段、および前記微生物培養物および/または前記基質流に対して1種以上の調節をするように構成された少なくとも1種の調節手段を含む。
【0039】
具体的態様では、前記測定手段はバイオリアクタから出る排出流の組成および必要ならバイオリアクタに入る基質流を定量するように構成された少なくとも1種の手段を含む。前記測定手段は所望の産物として固定される炭素の割合が定量できるように処理手段に必要に応じて連結されてよい。一態様では、前記測定手段はガスクロマトグラフである。
【0040】
特定の態様では、前記調節手段は前記定量手段が所望の産物として固定される炭素の割合が所定の値または範囲から外れていると判断した場合には1種以上の調節を行うように構成される。具体的態様では前記調節は、前記発酵液のpHの変更、前記発酵液の酸化還元電位の変更、前記発酵液のCO濃度の変更、前記発酵液のH濃度の変更、前記基質流の組成の変更、前記基質流の圧力の変更、発酵液の攪拌速度、産物の除去、前記発酵液の酸および/またはアルコール濃度の変更、前記培養液中の1種以上の栄養素の変更、1種以上の栄養素の供給速度の変更による調節を行うように構成される。
【0041】
具体的な態様では、前記システムは所望の産物として固定される炭素の割合が所定の値または範囲から外れていると判断した場合には、前記微生物培養物および/または基質流に対して1種以上の調節を行うように1種以上の調節手段を制御するように構成される処理手段を含む。 他の態様では、前記システムはオペレータ向けの視覚的および/または聴覚的フィードバックを含んでよく、その結果前記オペレータは調節手段を手動で制御することができる。
【0042】
前記種々の側面の具体的態様では、前記基質は工業的過程の副産物として得られるガスを含む。特定の態様では、前記工業的過程は鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製過程、バイオマスのガス化、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産、およびコークス生産からなる群から選択される。具体的な態様では前記ガス基質は製鋼所から得られるガスを含む。
【0043】
特定の態様では、前記基質は容量で20%のCOから100%のCO、例えば容量で40%から95%のCO、容量で60%から90%のCO、または容量で70%から90%のCOを含む。具体的な態様では、前記基質は容量で25%、または30%、または35%、または40%、または45%、または50%のCOを含む。
【0044】
前記基質は水素を含む必要はないが、水素の存在が本発明の方法に従えば産物の形成に弊害をもたらすことはない。具体的な態様では、水素の存在がアルコール産生の全体的効率を高める結果になる。前記ガス基質はまたある程度のCO例えば容量で約1%から約80%のCO、または容量で1%から約30%のCOを含有してもよい。
【0045】
前記種々の側面の具体的な態様では、COを含む前記基質はガス状である。
具体的な態様では、前記発酵過程により産生されるアルコールはエタノールである。前記発酵反応はまたアセタートを産生してもよい。
【0046】
具体的な態様では、前記発酵反応は多くのカルボキシド栄養性細菌の一種以上の株によってなされる。好ましくは、前記カルボキシド栄養性細菌はクロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)、クロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii)、クロストリジウム・ラグスダレイ(Clostridium ragsdalei)、クロストリジウム・カルボキシジボランス(Clostridium carboxydivorans)、およびムーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica)などのクロストリジウム、ムーレラ、およびカルボキシドサーマスから選択される。一態様では、前記カルボキシド栄養性細菌はクロストリジウム・オートエタノゲナムである。
【0047】
本発明は上記に広く定義されるが、それに限定されることはなく、下記に提供する実施例の態様を含む。
本発明は以下の添付図面を参照して詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】図1はアルコールを含む産物を産生するためのCOを含む基質のバッチ発酵におけるアセタートとアルコールの産生量およびCO(産生)/CO(消費)の変化を示すグラフである。
【図2】図2はアルコールを含む産物を産生するためのCOを含む基質のバッチ発酵におけるアセタートとアルコールの産生量およびCO(産生)/CO(消費)の変化を示すグラフである。
【図3】図3は本発明の特定の態様に従って、CO(産生)/CO(消費)比を定量するための手段を含むシステムの略図である。
【図4】図4は実施例3における微生物培養物によって消費されたCOおよびHの量を示すグラフである。
【図5】図5は実施例3における微生物培養物の代謝産物産生量と成長を示すグラフである。
【図6】図6は実施例4におけるCOの量と微生物培養物によって消費された量を示すグラフである。
【図7】図7は実施例4における微生物培養物の代謝産物産生量と成長を示すグラフである。
【図8】図8は実施例5における連続発酵での代謝産物産生量を示すグラフである。
【発明の詳細な説明】
【0049】
クロストリジウム・オートエタノゲナムのようなカルボキシド栄養性細菌は、同時に進行する多くの異なる作用によって、COおよび任意成分のHを含む基質の嫌気性発酵により1種以上の酸および1種以上のアルコール等の産物を予想外に産生する。カルボキシド栄養性微生物による1種以上の酸および1種以上のアルコールの産生が水の産生を付随しないで起きることが意外にも認められた。従前報告されたCOおよびHを含む基質の発酵では、アルコールおよび/または酸のような産物は水と一緒に産生されると考えられる。しかしながら、細胞物質並びにアルコールおよび/または酸のような産物に完全な炭素固定をするのに使用可能なHが不十分であると、前記発酵は水の産生を付随せずに進行することが意外にも認められた。具体的な態様では、微生物培養物によって2:1未満のH:CO比、例えば約1:1、または約1:2、または約1:3、または約1:4、または約1:5、または約1:10、でHおよびCOが消費される場合には、完全な炭素固定をするのに使用可能なHが不十分である。具体的な態様では、Hは前記微生物培養物には実質的に利用されない。
【0050】
理論に制約されることは望まないが、アセタートおよびエタノールは下記の同時進行する作用の少なくとも一つ、または少なくとも二つ、または少なくとも三つ、またはすべてによって産生される。
【0051】
1.一酸化炭素の酢酸への固定
2CO+2H→CHCOOH
2.一酸化炭素のエタノールへの固定
3CO+3H→CHCHOH+CO
3.酢酸のエタノールへの還元
CHCOOH+H→CHCHOH+CO
4.エタノールの酢酸への酸化
CHCHOH+HO→CHCOOH+2H
同化作用または微生物細胞の大量蓄積は通常は少なくとも作用1に付随して起きる。しかしながら、他の代謝産物に比較して少ない割合の炭素だけが同化作用に向けられると考えられる。
【0052】
さらに、前記微生物は水性ガスシフト反応(CO+HO→CO+H)を経てそれら自身のHを産生する。したがって、アセタートおよびエタノールを含む代謝産物もまたA〜Cに従って産生される。
【0053】
A)4CO+2HO→CHCOOH+2CO
B)6CO+3HO→CHCHOH+4CO
C)CHCOOH+2CO+HO→CHCHOH+2CO
前記微生物培養物は動的であり、理論に制約されることは望まないが、前記微生物培養物はCOおよび任意成分のHを含む基質の少なくとも一部を1〜3およびA〜Cの一つ以上にしたがって同時に産物に変換すると考えられる。したがって、動的微生物培養物では、いくつかの異なる作用がシステム内で進行して全部のCOのアルコールおよび/または酸への全体的な正味の変換がされる。COがいかに代謝されるかを定量するには、Hの影響と式1〜3の式A〜Cに対する重みづけ決めなければならない。これが決まれば、式1〜3および式A〜Cの相対的な個々の影響は、産生されたCO、並びに消費されたHおよびCOを定量して定められる。
【0054】
本発明の一側面によれば、COを含む基質の微生物発酵による酸および/またはアルコールを含む産物を産生するための方法が提供され、微生物培養物の少なくとも一部は、
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸および微生物細胞に変換し;および/または
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸に変換し;および/または
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換し、および/または
1種以上の酸、およびCOを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換する。
【0055】
COへ変換されるCOの割合を定量することで、COを代謝する細菌について、アルコールおよび/または酸のような産物の産生プロファイルを予見するモデルシステムが開発できることが意外にも見出された。産物中の酸化の程度は前記細菌が有機酸またはアルコールを合成しているかどうかにより異なるから、細菌が溶媒産生(アルコール産生など)に供している炭素の割合は基礎をなす化学過程の化学量論に基づいて予測できる。
【0056】
システムの産物プロファイルがいかに変化するかを理解することで、アルコール産生量の増大のような望ましい成果を増長するためにすべきシステムの操作条件の調節または変更を可能にする。さらに、具体的な態様では、本発明はCOを含む基質の1種以上のアルコールおよび/または1種以上の酸を含む産物を産生するための発酵効率を上げる方法を提供し、前記方法は基質を最適な濃度または最適な範囲内で供給することを含む。
【0057】
具体的な態様では、Hが存在しないか限定的な量のHとともにCOが供給される場合、1〜3の前記影響はわずかである。限定的な量のHが利用できる場合は基質流中のHの割合が、例えば4%未満、例えば3%未満、例えば2%未満、例えば1%未満のように、5%未満である。そのような場合、式A〜Cの相対的影響はCO(産生)/CO(消費)比をy=2/3x+0.5により計算して定めることができる。そのような態様では、式Aは0.5の比を与え、式Bは0.667の比を与え、式Cは0.667よりも大きな値を与え、式4は0.5よりも小さな値を与える。この計算値から、各式の相対的影響が判断される。
【0058】
本発明はまたCOを含む基質の微生物発酵による1種以上の酸および/またはアルコールを産生する効率を高める方法が提供され、
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸および微生物細胞に変換すること;または
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸に変換すること;または
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換すること;または
1種以上の酸、およびCOを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換すること;
から、
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸および微生物細胞に変換すること;または
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上の酸に変換すること;または
COを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換すること;または
1種以上の酸、およびCOを含む基質の少なくとも一部を1種以上のアルコールに変換すること;
へ微生物培養物の少なくとも一部は遷移される。
定義
別に定義されない限り、明細書を通して使用される下記の用語は次のように定義される。
【0059】
「効率を高める」、「高い効率」などの用語は発酵過程に関連して使用される場合、以下の1種以上を高めることを含むが、これらに限定はされない。すなわち、発酵に触媒作用を及ぼす微生物の成長速度、消費される基質(例えば一酸化炭素)の容積あたり産生される所望の産物(例えばアルコール)の容積、所望の産物の産生速度または産生濃度、および発酵の他の副産物と比較した産生した所望の産物の相対的割合である。
【0060】
「一酸化炭素を含む基質」などの用語は、一酸化炭素が例えば成長および/または発酵のために細菌の1種以上の株に利用可能な任意の基質を含むと理解される。
「一酸化炭素を含むガス基質」は一酸化炭素を含有する任意のガスを含む。そのガス基質は通常はかなりの割合のCOを含有し、好ましくは容積で少なくとも約5%から約100%のCOを含有する。
【0061】
発酵産物の文脈では、明細書中の「酸」という用語は、明細書に記載されるように発酵液中に存在する遊離酢酸およびアセタートの混合物のような、カルボン酸およびその関連カルボン酸陰イオンの両方を含む。発酵液中の分子状の酸のカルボキシラートに対する比はその系のpHに依存する。「アセタート」という用語は、例えば本明細書で記載されるように発酵液中に存在する酢酸塩と遊離酢酸の混合物のような、酢酸塩単体並びに分子状または遊離酢酸および酢酸塩の混合物の両方を含む。発酵液中の分子状の酢酸のアセタートに対する比はその系のpHに依存する。
【0062】
「バイオリアクタ」という用語は一つ以上の容器および/または塔または配管からなる発酵装置を含み、連続撹拌槽型反応器(CSTR)、固定化細胞反応器(ICR)、トリクルベッド反応器(TBR)、気泡塔、ガスリフト発酵槽、中空繊維膜反応器(HFMBR)のような膜反応器、静的ミキサー、または気液接触に適切な他の容器または装置を含む。
【0063】
文脈が他を要求しない限り、「発酵する」、「発酵過程」、または「発酵反応」などの語句は、本明細書では過程中の成長段階と産物の生合成段階の両方を包含することを意図している。本明細書でさらに記載されるように、ある態様では、前記バイオリアクタは第一の成長反応器と第二の発酵反応器を含む。そのような場合に金属または組成物の発酵反応への添加はこれらの反応器の一方または両方への添加を含むと理解される。
【0064】
「全体的な正味の変換」などの用語は、本明細書ではCOのような基質の特定の時点における微生物培養物による1種以上の酸および/または1種以上のアルコールを含む産物への変換を記載することを意図する。微生物培養物の一部は特定の時点において異なる作用に供され、多くの産物が産生されることが認められる。さらに、発酵液中に存在する1種以上の産物が他の産物に変換される。したがって全体的な正味の変換は任意の特定の時点における微生物培養物によって産生されるすべての産物を含む。
【0065】
下記の記載は本発明の具体的な態様、すなわち主要な基質としてCOを用いたエタノールおよび/またはアセタートの産生に焦点を合わせるが、本発明は別のアルコールおよび/または酸の産生に応用できることは当然であり、別の基質を使用することも本発明に関連する当業者によって知られている。例えば、二酸化炭素および水素を含有するガス基質を使用できる。さらに、本発明は酪酸塩、プロピオン酸塩、カプリル酸塩、エタノール、プロパノール、およびブタノールを産生する発酵に応用できる。前記方法はまた水素の産生に使用してもよい。一例として、これらの産物はムーレラ、クロストリジア(Clostridia)、ルミノコッカス(Ruminococcus)、アセトバクテリウム(Acetobacterium)、ユウバクテリウム(Eubacterium)、ブチリバクテリウム(Butyribacterium)、オキシオバクター(Oxobacter)、メタノサルシナ(Methanosarcina)、およびデスルフォトマクルム(Desulfotomaculum)属からの微生物を使用した発酵により産生することができる。
【0066】
本発明の特定の態様では、1種以上の工業的過程により産生されるガス流を使用するように構成される。そのような過程は製鋼工程、特に高いCO含量、すなわち所定の濃度(すなわち5%)を超えるCO含量を有するガス流を産生する過程を含む。そのような態様では、酢酸産生菌が酸および/またはアルコール、特にエタノールまたはブタノール、を一つ以上のバイオリアクタ内で産生するのに好ましく使用される。当業者は本開示を検討して本発明は種々の産業または排ガス流(内燃機関を有する車両の排ガス流を含む)に応用できると気付くであろう。また、当業者は本開示を検討して本発明は同じまたは異なる微生物を用いた場合を含む他の発酵反応に応用できることに気付くであろう。したがって、本発明の範囲は前記の具体的な態様および/または応用に限定されず、広義に解釈され、例えば前記ガス流源は少なくともその一成分が発酵反応に供することに使用できる限り、限定されない。本発明は自動車排ガスおよび高容量CO含有の産業排煙ガスのようなガス基質からの全体的な炭素捕捉を改善し、並びに/またはエタノールおよび他のアルコールの産生への適用性が特に高い。
【0067】
発酵
ガス基質からエタノールおよび他のアルコールを産生する過程は知られている。典型的な過程は例えばWO2007/117157、WO2008/115080、米国特許第6,340,581号、米国特許第6,136,577号、米国特許第5,593,886号、米国特許第5,807,722号、米国特許第5,821,111号に記載され、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【0068】
多くの嫌気性細菌がn−ブタノールおよびエタノールを含むアルコール並びに酢酸へのCOの発酵を行うことができることが知られ、本発明の過程に使用に適する。本発明の使用に適するそのような細菌としては、WO00/68407、EP117309、米国特許第5,173,429号、第5,593,886号、および第6,368,819号、WO98/00558およびWO02/08438に記載されるものを含むクロストリジウム・リュングダリイ株のようなクロストリジウム属、クロストリジウム・カルボキシジボランス(Liou et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp 2085-2091)、クロストリジウム・ラグスダレイ(WO/2008/028055)およびクロストリジウム・オートエタノゲナム(Abrini et al, Archives of Microbiology 161: pp 345-351)が挙げられる。その他の適合する細菌にはムーレラ種HUC22−1(Sakai et al, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612)を含むムーレラ属のもの、およびカルボキシドサーマス種(Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. et al (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260)のものが挙げられる。さらには、ムーレラ・サーモアセチカ、ムーレラ・サーモオートトロフィカ(Moorella thermoautotrophica)、ルミノコッカス・プロダクタス(Ruminococcus productus)、アセトバクテリウム・ウッディー(Acetobacterium woodii)、ユウバクテリウム・リモーサム(Eubacterium limosum)、ブチリバクテリウム・メチロトロフィクム(Butyribacterium methylotrophicum)、オキシオバクター・フェニギー(Oxobacter pfennigii)、メタノサルシナ・バーケリ(Methanosarcina barkeri)、メタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans)、およびDesulfotomaculum kuznetsovii (Simpa et. al. Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. pp41-65) が挙げられる。なお、その他の酢酸を産生する嫌気性細菌も本発明に適用されてもよいことは当業者により理解される。また本発明は2種以上の細菌の混合培養物に当然に適用される。
【0069】
本発明の使用に適する典型的な微生物の1種はクロストリジウム・オートエタノゲナムである。一態様では、前記クロストリジウム・オートエタノゲナムはドイツ生物材料資源センター(DSMZ)において寄託第19630号として同定される寄託株の同定特性を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムである。別の一態様では、前記クロストリジウム・オートエタノゲナムはDSMZ寄託番号DSMZ10061号として同定される特性を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムである。
【0070】
本発明の方法に使用される細菌の培養は当業者に知られている多くの培養過程と嫌気性細菌を用いた発酵基質を用いて行われる。典型的な手法は下記の「実施例」の項に提供される。さらなる例としては発酵のためのガス基質を使用する下記の論文に一般的に記載されている過程が利用できる。(i) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources(合成ガス発酵源のためのバイオリアクタ). Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations(合成ガス発酵のためのバイオリアクタ設計). Fuel. 70. 605-614; (iii) K. T. Klasson, et al. (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels(合成ガスの液体または気体燃料への生物変換). Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L. Vega, et al. (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation(ガス基質発酵の研究): Carbon Monoxide Conversion to Acetate(一酸化炭素のアセタートへの変換). 2. Continuous Culture(連続培養). Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (v) J. L Vega, et al. (1989). Study of gaseous substrate fermentations(ガス基質発酵の研究): Carbon monoxide conversion to acetate(一酸化炭素のアセタートへの変換). 1. Batch culture(バッチ培養). Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; (vi) J. L Vega, et al. (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations(石炭合成ガス発酵のためのバイオリアクタ設計). Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160。これらのすべては参照により本明細書に組み込まれる。
【0071】
前記発酵は連続撹拌槽型反応器(CSTR)、固定化細胞反応器、ガスリフト発酵槽、気泡塔反応器(BCR)、中空繊維膜反応器(HFMBR)のような膜反応器、またはトリクルベッド反応器(TBR)のような適切なバイオリアクタ内で行われる。また、本発明のある態様では、前記バイオリアクタには微生物が培養される第一の成長反応器と成長反応器から発酵液が供給されほとんどの発酵産物(例えばエタノールおよびアセタート)が産生される第二の発酵反応器を含むことができる。
【0072】
本発明の種々の態様では、発酵反応のための炭素源はCOを含むガス基質である。前記基質は、工業過程の副産物として得られる、または自動車排ガスのようなその他の源から得られるCO含有排ガスであってよい。特定の態様では、前記工業的過程は製鋼所のような鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製過程、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産、およびコークス生産からなる群から選択される。これらの態様では、前記CO含有基質は任意の使いやすい方法を用いて、大気へ放出される前に工業的過程から捕捉される。CO含有基質の組成により、基質を発酵に導入する前に処理して塵埃粒子のような望ましくない不純物を除去することも望ましい。例えば、前記ガス基質は既知の方法を用いてろ過または洗浄される。
【0073】
あるいは、前記CO含有基質はバイオマスのガス化により調達されてもよい。前記ガス化過程は空気または酸素の供給を制限したバイオマスの部分燃焼を伴う。得られたガスは通常は主にCOおよびHを含み、わずかにCO、メタン、エチレンおよびエタンを含む。例えば、サトウキビから砂糖のような食材を抽出または加工する間に得られるバイオマス副産物、またはトウモロコシもしくは穀物からのデンプン、または林業で発生する非食物バイオマス廃棄物をガス化して本発明の使用に適するCO含有ガスを産生することができる。
【0074】
前記CO含有基質は通常は主要な割合のCOを含み、例えば少なくとも容量で約20%から約100%のCO、容量で40%から95%のCO、容量で60%から90%のCO、および容量で70%から90%のCOを含む。具体的な態様では、前記基質は容量で25%、または30%、または35%、または40%、または45%、または50%のCOを含む。例えば6%のようなより低い濃度のCOを有する基質も、特にHおよびCOの共存下では適切である。
【0075】
前記基質は水素を含む必要はないが、本発明の方法に従えばHの存在が産物の形成に弊害をもたらすことはない。具体的な態様では、水素の存在がアルコール産生の全体的効率を高める結果になる。例えば、具体的な態様では、前記基質はH:CO比として2:1、または1:1、または1:2まで含むことができる。他の態様では、前記基質流は例えば5%未満、または4%未満、または3%未満、または2%未満、または1%未満、のような低濃度のHを含むか、または実質的に水素を含まない。前記基質はまたある程度のCO例えば容量で約1%から約80%のCO、または容量で1%から約30%のCOを含有してもよい。
【0076】
通常は、前記一酸化炭素は気体状態で発酵反応に添加される。しかしながら、本発明の方法はこの状態での基質の添加に限定されない。例えば、前記一酸化炭素は液状で供給することができる。例えば、液体が一酸化炭素含有ガスで飽和され、その液体がバイオリアクタに添加されてもよい。これは標準的なやり方を用いて達成される。一例としては、微小気泡分散発生機(Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation(好気性発酵のための微小気泡分散発生機のスケールアップ); Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October, 2002)はこの目的のために使用できる。
【0077】
細菌の成長とCOのアルコールへの発酵が起きるためには、CO含有の基質ガスに加えて、適切な培養液がバイオリアクタに供給される必要がある。栄養媒体は使用される微生物が成長できるに十分なビタミンとミネラルを含む。COを単独の炭素源として用いるエタノールの発酵に適した嫌気性媒体は当業者に知られている。例えば、適合する媒体は上記に参照した米国特許第5,173,429号および第5,593,886号、並びにWO02/08438、WO2007/115157、およびWO2008/115080に記載されている。本発明は微生物の成長、および/または発酵過程におけるアルコール産生を支える効能が高い新規の媒体を提供する。この媒体については以下により詳しく記載される。
【0078】
前記発酵は所望の発酵が生じる(例えばCOからエタノールへ)ように適切な条件下で望ましく行われなければならない。考慮すべき反応条件は、圧力、温度、ガス流速、液体流速、媒体pH、媒体酸化還元電位、撹拌速度(連続撹拌槽型反応器を使用の場合)、接種材料濃度、液相中のCOが限定されないための最大ガス基質濃度、産物阻害を避けるための最大産物濃度が挙げられる。適合条件はWO02/08438、WO07/117157およびWO08/115080に記載されている。
【0079】
最適反応条件は部分的には具体的な使用微生物に依存する。しかしながら、一般に、前記発酵は環境圧力よりも高い圧力で行われることが好ましい。高い圧力での操作はCOがガス相からエタノール産生のための炭素源として微生物によって吸収されて液相へ移動する速度を顕著に高める。これは換言すると、バイオリアクタを環境圧力よりも高圧に維持すると保持時間(バイオリアクタ中の液体容量を投入ガス流速で割ったものと定義される)を減らすことができることを意味する。
【0080】
また、所定のCOからアルコールへの転換速度は部分的に基質保持時間の関数であり、換言すると所望の保持時間を達成することは必要とされるバイオリアクタの容積を決定するから、加圧システムの使用は必要とされるバイオリアクタの容量、その結果として発酵装置の投資コストを大幅に減らすことができる。米国特許第5,593,886号に記載の実施例によれば、反応器の容量は反応器の操作圧力の増加に線形に比例して小さくすることができ、具体的には10気圧の操作圧力のバイオリアクタは1気圧の操作圧力のバイオリアクタの容量の1/10を必要とするだけである。
【0081】
ガスからエタノールへの発酵を高圧で行うことの利点は他にも記載されている。例えば、WO02/08438は30psigおよび75psigの圧力で行うガスからエタノールへの発酵が、それぞれエタノールの生産性として150g/l/日および369g/l/日を得たことを記載している。しかしながら、同様の媒体と投入ガス組成を用いて大気圧で行う発酵実施例では1日あたり1リットルあたりのエタノールは10倍から20倍少ない生産量であることが分かった。
【0082】
COを含むガス基質の導入速度は液相中のCO濃度が制限されないようなものであることも望ましい。これはCOが制限された条件の結果としてエタノール産物が培養物によって消費されるからである。
【0083】
産物の回収
発酵反応の産物は既知の方法を用いて回収することができる。典型的な方法としてはWO07/117157、WO08/115080、米国特許第6,340,581号、 米国特許第6,136,577号、米国特許第5,593,886号、米国特許第5,807,722号、および米国特許第5,821,111号に記載のものが挙げられる。しかしながら、簡単にいうと一例では分留または蒸発、および抽出発酵のような方法により発酵液からエタノールだけが回収される。
【0084】
発酵液からのエタノールの蒸留でエタノールと水の共沸性混合物(すなわち95%エタノールと5%水)が得られる。無水エタノールはその後に、これも当業者に知られている分子篩エタノール脱水技術を用いて得られる。
【0085】
抽出発酵処理は発酵微生物に対する毒性リスクが低い水混和性溶媒の使用を伴い、低濃度の発酵液からエタノールを回収する。例えばオレイルアルコールはこのタイプの抽出過程に使用できる溶媒の1種である。オレイルアルコールは発酵槽に連続的に導入され、すぐにこの溶媒は上昇して連続的に抽出され遠心分離機に供給される層を発酵槽の上端に形成する。水と細胞はその後にオレイルアルコールから容易に分離され発酵槽へ戻される一方、前記エタノールを含む溶媒はフラッシュ蒸発装置へ供給される。前記エタノールのほとんどは蒸発、凝縮されるが、オレイルアルコールは不揮発性で発酵に再使用のため回収される。
【0086】
アセタートは前記発酵反応の副産物として産生され、やはり当業者に知られている方法を使用して発酵液から回収することができる。
例えば、活性炭フィルタを伴う吸着システムを使用することができる。この場合には、微生物細胞は適切な分離装置を用いて発酵液から最初に除去されることが好ましい。産物回収のために細胞が存在しない発酵液を作り出すための、ろ過に基づく多数の方法が当業者に知られている。前記の細胞を含まないエタノール(およびアセタート)含有透過物はその後アセタートを吸着するための活性炭を含むカラムを通過させられる。酸の形態のアセタート(酢酸)は塩の形態(酢酸塩)よりも容易に活性炭に吸着する。したがって、発酵液のpHは活性炭カラムを通過する前に約3未満に減じて、大部分のアセタートを酢酸の形態に変換することが好ましい。
【0087】
活性炭に吸着した酢酸は当業者に知られている方法を用いて溶離により回収することができる。例えば、エタノールは前記固定したアセタートを溶離するのに使用することができる。特定の態様では、発酵過程それ自体で産生されるエタノールを、アセタートを溶離するのに使用することができる。エタノールの沸点は78.8°Cで酢酸は107°Cであるから、蒸留のような揮発度に基づく方法を用いてエタノールとアセタートは容易に相互に分離させることができる。
【0088】
発酵液からアセタートを回収するためのその他の方法も当業者に知られていて、本発明の過程に使用することができる。例えば米国特許第6,368,819号および第6,753,170号は発酵液からの酢酸の抽出に使用することができる溶媒および共溶媒システムを記載している。エタノールの抽出発酵について記載したオレイルアルコールに基づくシステムの例と同様に、米国特許第6,368,819号および第6,753,170号に記載のシステムは酢酸産物を抽出するために発酵生物が存在してもしなくても発酵液に混ぜることができる水不混和溶媒/共溶媒を記載している。前記酢酸産物を含む溶媒/共溶媒はその後蒸留によって発酵液から分離される。第二の蒸留段階は溶媒/共溶媒からの酢酸を精製するのにその後使用することができる。
【0089】
発酵反応の産物(例えばエタノールおよびアセタート)は、発酵バイオリアクタからの発酵液の一部を連続的に除去し、発酵液からの微生物細胞を分離し(簡便にはろ過により)、かつ発酵液から1種以上の産物を同時にまたは逐次に回収することにより、発酵液から回収することができる。エタノールの場合には蒸留により簡便に回収することができ、アセタートは上記の方法を用いて活性炭に吸着して回収することができる。前記分離した微生物細胞は好ましくは発酵バイオリアクタに戻される。エタノールとアセタートが除去された後に残る細胞を含まない透過物もまた好ましくは発酵バイオリアクタに戻される。追加の栄養素(ビタミンBなど)は細胞を含まない透過物がバイオリアクタに戻される前に添加して栄養媒体へ補給してもよい。また、前記発酵液のpHが上記のように調節されて活性炭への酢酸の吸着を促進させる場合には、前記pHはバイオリアクタに戻す前に発酵バイオリアクタ中の発酵液と同様なpHに再調節されなければならない。
【0090】
発酵における炭素固定の定量
COへ変換されるCOの割合を定量することで、COを代謝する細菌について、産物の産生プロファイルを予見するモデルシステムが開発された。前記産物中の酸化の程度は前記細菌が有機酸またはアルコールを合成しているかどうかにより異なるから、細菌が溶媒産生に供している炭素の割合は基礎をなす化学過程の化学量論に基づいて予測することができる。酸化された副産物(CO)の程度の分析および/または定量化は微生物培養物による全体の産物変換のリアルタイムの指標を効果的に提供する。
【0091】
本システムは前記反応器の状態を、基礎をなす化学量論から計算した一つ以上の「理想状態」の合成としてモデル化する。前記モデルシステムは具体的なガス標本を、二つの第一の状態と、利用できる水素に依存して二つの第二の混成反応を作り出す修正条件との間の「最適」折衷、および二つの第三の状態に割り当てる。
【0092】
前記第一の状態は下記である。
一酸化炭素の酢酸への固定
2CO+2H→CHCOOH(CO/CO比は0)
一酸化炭素のエタノールへの固定
3CO+3H→CHCHOH+CO(CO/CO比は0.3333)
遊離の水素ガスが存在しないと、これらの第一の反応の両方とも水性ガスシフト反応によって補完される。
【0093】
CO+HO→H+CO
この水性ガスシフトは遊離水素が存在しないで炭素固定が行われる場合には、炭素固定と同時に起きると想定することができる。
【0094】
前記水性ガスシフトを前記二つの第一の反応と合わせると遊離水素ガスが存在しないで起きる一対の第二の混成反応を与える。
遊離水素が存在しない場合の一酸化炭素の酢酸への固定
4CO+2HO→CHCOOH+2CO(CO/CO比は0.5)
遊離水素が存在しない場合の一酸化炭素のエタノールへの固定
6CO+3HO→CHCHOH+4CO(CO/CO比は0.6667)
さらに二つの潜在的な第三の状態がある。
酢酸のエタノールへの還元
CHCOOH+2CO+HO→CHCHOH+2CO(CO/CO比は1)
エタノールの酢酸への酸化
CHCHOH+HO→CHCOOH+2H(CO/CO比は0)
CO(産生)/CO(消費)比を観察することにより、培養物の状態を推測することができ、その産物産生量を計算することができる。100%水素消費の特性を有する培養物では、前記比は0と1/3の間で変化する。これは方程式y=l/3xによる線形関数としてグラフに表すことができる。100%水性ガスシフトの特性を有する培養物では、前記比は1/2と2/3の間で変化し、これは同様に方程式y=2/3x+0.5による線形関数としてグラフに表すことができる。
【0095】
水素消費が無視できる場合、モデル化の目的では第一の線形関数は事実上無視することができ、観察したCO/CO値を用いて第二の方程式だけを解くことにより、計算されたxの値はエタノール産生に向けられた炭素の割合になる。全部の炭素摂取量から遊離した全CO量を差し引くと固定化に利用できる炭素が得られ、これに前記のあらかじめ計算した比を乗じるとエタノールとして固定される予測炭素量が得られる。二つの炭素原子が一つのエタノール分子に固定されるから、投入炭素モルを産生エタノールモルに変換するにはこの値を半分にしなければならない。
【0096】
水素消費が。無視できないが産物および/または細胞物質として完全に炭素固定されるには不十分である場合には、培養物の状態を直接的に推測するにはCO/CO比も水素の量も使用することができない。水素からのエタノールの産生は下記の二つの間の範囲にある。
【0097】
3CO+3H→CHCHOH+CO(CO/CO比は0.3333)および
2CO+2H→CHCOOH(CO/CO比は0)
両方ともCOとHを1:1の比で利用する。微生物培養物の水素消費部分によって占められるこの範囲の状況を知らなければ、水素を消費する微生物によるCOの相対的産生量は分からない。正確な全体的なCO/CO比は基礎をなす水性ガスシフトを利用する個体群によって産生されたCOを知らなければ計算できず、その数量は水素を消費するもののCO/CO比とそれらが産生するCOの相対的量を第一に正確に知ることなしには計算できない。
【0098】
しかしながら、これは水素消費状態ではH消費はCO消費に等しく、前記第二の状態方程式もまたCO/H比が、x値よりもz値として表されることを考慮することにより回避することができ、
y=2/3x+0.5
および
y= l/3z
である。
【0099】
しかしながら、xとzを関連づける第三の方程式がなければ、連立方程式を解くことはできない。培養物の状態は変化するから、この第三の方程式、y=ax+bzは、実際は変数であり、発酵が進行する間培養物がアセタートまたはエタノールを産生する程度は当然に条件により変わる。
【0100】
培養物が水素を全部消費する環境では、CO消費は水素消費と1:1であるから、CO/CO比とCO/H比の両方が等しくなる。このことから、CO/CO比から計算される点とCO/H比から計算される点の間に引かれる直線は、微生物個体群の水素消費特性が増大すると水平に近づき、z軸切片は、前記直線が完全に水平な場合は水素を食べる状態においてCOはエタノールと1:1基準で産生されるから、エタノールへ固定される炭素の割合に直接的に比例することが推測される。
【0101】
この情報から、一つの概算を付加することができ、前記第三の「混成」方程式を計算することができる。
CO/COとCO/H比の間の直線の勾配がこの混成直線のz切片の重みづけを割り当てるのに使用される。この直線が水平な場合には前記勾配([CO/CO]/[CO/H])は1であり、純粋な水素消費培養物を示し、すべてのエタノール産物は水素を消費するものに由来し、考慮すべき唯一の方程式は前記水素方程式である。
【0102】
この直線が水平から離れるにつれて、その勾配([CO/CO]/[CO/H])はゼロに近づく。これをz切片を掛け合わせる乗法の重み値として使用すると、水素を消費するものによって産生されるCO(およびエタノール)の推測量は、CO/COとCO/H比の間の前記直線が水平からさらに一層離れるにつれてゼロに近づく。
【0103】
前記z切片に前記勾配から導いた重みづけ係数を乗じて、水素を消費する微生物による全体的な産生されたCOの概算が得られ、前記水素を消費するものによって消費されたCOは水素消費と1:1であり、この値はその後代入され、方程式y=l/3xを解く。水素を消費する微生物による前記CO消費とCO産生は全体の消費と産生から差し引かれ、前記水性ガスシフト個体群が関与する残余のCOとCOが得られ、この残余物の比を代入して方程式y=2/3x+0.5を解くことができる。こうして、1種以上の酸および/または1種以上のアルコールのような具体的な産物に固定される炭素の割合が定量される。
【0104】
当業者は消費されるCOと任意成分のHの量および産生されるCOの量を所望により連続的にまたは不連続な時点で監視することができる。当業者に知られている方法を用いてCO、CO、およびHを定量することができるが、本発明の一態様では、ガスクロマトグラフィー(GC)を用いてバイオリアクタから出る排出流中に存在するCO、CO、およびHの量の測定をする。アルコールおよび/または酸として固定される炭素の割合は、バイオリアクタに入る基質流の組成が分かれば計算することができる。基質流の組成が不明な場合にはさらなるガスクロマトグラフを用いて組成の定量を行うことができる。産生されたCOと消費された基質を定量するための他の方法には質量分析(MS)、GCMS、およびインラインセンサーが挙げられる。
【0105】
このように、本発明によれば、アセタートおよび/またはエタノールのような具体的な産物として固定される炭素の割合は産生されたCO、消費されたCO、および消費された任意成分のHを測定して定量することができる。基質(例えばCOおよび任意成分のH)が微生物培養物に利用される速度はそれらが産生される速度と同じように産物の相対比に影響することが認められる。例えば、アセタートを産生する培養物への基質供給速度を増すとアルコール産生に向けられる炭素の割合を増すことができる。
【0106】
COと任意成分のHを含む基質は通常は気体状態で提供され、微生物培養物に対するCOとHの利用性は発酵システムの物質移動に依存することになる。例えば発酵液中に懸濁する微生物培養物に対するCOおよび/またはHの利用性は温度、培養液組成、ガス供給速度、ガス組成、CO蒸気圧、H蒸気圧、混合を含む当業者に知られている因子に依存する。したがって、微生物発酵に対するCOおよび/またはHの利用性を増大させるには前記システムの物質移動特性を改善することが必要で、例えば基質の供給速度を高め、および/または機械的に撹拌されるバイオリアクタの撹拌を強めることである。
【0107】
本発明の方法によれば、発酵効率はCOと任意成分のHを含む基質を最適濃度または範囲で、または最適濃度または範囲に向けて提供することにより改善することができる。最適濃度は前記発酵の所望の産物に基づき解明することができる。例えば、アルコールと微生物成長が望まれる場合は、COと任意成分のHを含む基質は炭素が主にアルコールとして固定されるが、一部は微生物成長に利用されるように供給することができる。例えば、COを含む基質は微生物成長とアルコール産生が起きるように微生物に供給することができる。
【0108】
前記条件、特に前記基質供給速度および/またはCOおよびHの相対濃度は微生物成長とアルコール産物が最適化されオペレータが満足するまで変化させることができる。炭素を産物に固定する各経路の影響は定量化することができるから、前記基質の供給を調節して発酵の間所望の条件に到達および/または維持することができる。例えば、基質流は変動するCOおよび/またはH成分を含むことがあることが認められる。しかしながら、本発明の方法を用いれば、産物の正味の産生は基質の供給を調節することにより実質的に一定の比に維持することができる。
【0109】
これに加えてあるいはこれに代えて、微生物培養物が成長するかその微生物密度が変動するにつれて、前記基質の供給は産生されたCO並びに消費されたCOおよびHの定量に基づき前記微生物培養物の要件に従って変化させることができる。
【0110】
その際、具体的な産物に向けられる炭素の割合は基質の供給および/または微生物密度についての変化に関わらず実質的に一定に維持することができる。本発明の具体的な態様では、前記具体的な産物に向けられる炭素の割合はオペレータが選択して前記条件を実質的に一定に維持するため調節することができる。例えば、オペレータが固定化炭素の90%をエタノールへの産生に向ける必要がある場合、基質を前記割合が所定の範囲である±1%、または±2%、または±3%、または±4%、または±5%から外れないように供給することができる。具体的な態様では、前記基質の供給は具体的な産物に向けられる炭素の割合の定量に応じて制御することができる。具体的な態様では、前記基質の供給は具体的産物に向けられた炭素の割合の変化に応じて自動的に調節される。
【0111】
具体的な態様では、相当量のHが存在しないでCOが供給される場合には、CO(産生)/CO(消費)比を定量することができる。本発明の具体的な態様では、微生物成長とアルコール産生はアセタートが同時に産生される場合に最適化することができる。そのような場合は、CO(産生)/CO(消費)比が0.667未満、例えば約0.66、または約0.65、または約0.64、または約0.63、または約0.62、または約0.61、または約0.60、またはさらに小さいような場合が想定される。あるいは、アセタートが消費される場合に微生物成長とアルコール産生を最適化することができる。そのような場合はCO(産生)/CO(消費)比が0.667より大きい、例えば約0.67、または約0.68、または約0.69、または約0.70、またはさらに大きいような場合が想定される。
【0112】
最適濃度または最適範囲が定量されると、前記発酵または今後の発酵は同じような条件で操作することができ、実験的に定量された固定化炭素および/またはCO(産生)/CO(消費)比を実質的に維持するように、前記基質が供給される。COおよびHを含む基質の発酵の最適比は同様に定量され適用される。
【0113】
追加のまたは別の一態様では、前記方法は微生物培養物がいつおよび/またはどのように一つの正味の全体的変換から別の変換へ遷移させられることができるか、またはすべきかを示すのに用いられる。例えば、前述したように、成長が第一の目的の場合には前記微生物培養物は好ましくは大部分の炭素がアセタートの産生に向けられるように維持することができる。例えば、COを含みHはごく僅かしか含まないか全く含まない基質流では、前記CO(産生)/CO(消費)比は約0.5に維持される。前記CO(産生)/CO(消費)比が所定の範囲または閾値、例えば約0.45〜0.55、または約0.48〜0.52、を超えて外れた場合には、前記培養物および/または前記基質流を調節して、全体の培養物による全体の正味の変換が所望のものであるように、微生物培養物の少なくとも一部を遷移させる。例えば前記CO(産生)/CO(消費)比が約0.5であるように前記培養物を遷移させる。Hが存在する場合、炭素固定が実質的に一定に留まるよう、同等な調節を同様に行うことができる。
【0114】
本発明の具体的な態様では、前記微生物培養物の少なくとも一部は微生物培養物および/または前記基質流を調節して遷移させることができる。特定の態様では、バイオリアクタ中で嫌気性発酵が実施され、前記微生物培養物は少なくとも一部が培養液を含む発酵液中に懸濁する。具体的な態様では、前記微生物培養物の少なくとも一部は前記発酵液および/または培養液を調節することで遷移させることができる。
【0115】
特定の態様では、前記調節としては、前記発酵液のpHの変更、前記発酵液の酸化還元電位の変更、前記発酵液のCO濃度の変更、前記発酵液のH濃度の変更、前記基質流の組成の変更、前記基質流の圧力の変更、発酵液撹拌速度の変更、産物の除去、前記発酵液の酸および/またはアルコール濃度の変更、培養液中の1種以上の栄養素の変更、1種以上の栄養素の供給速度の変更の1種以上を含む。
【0116】
これに加えてあるいはこれに代えて、アルコール産生が第一の目的であるならば、基質は実質的にすべての炭素がエタノールとして固定されるように提供することができる。具体的な態様では、Hが利用できない場合には前記CO(産生)/CO(消費)比は好ましくは約0.667に維持することができる。前記CO(産生)/CO(消費)比が所定の範囲または閾値、例えば0.58〜0.73または0.63〜0.7、を超えて外れた場合には、前記培養物および/または前記基質流を調節して微生物培養物の少なくとも一部を遷移させ、全体の培養物による全体の正味の変換が所望のものであるように、例えばCO(産生)/CO(消費)比が約0.667に戻るようにする。
【0117】
追加のまたは別の態様では、約0.667のCO(産生)/CO(消費)比に維持されたアルコールを産生する培養物は大量の不要なアセタート、例えば初期の成長段階からの残留アセタートを有するかもしれない。アセタートのアルコールへの還元(方程式3)の少なくとも一部を遷移させることにより、このアセタートはアルコールに変換することができる。そのような場合、前記培養物を調節して所望の変換が達成されるまで、CO(産生)/CO(消費)比を0.667よりも大きくすることができる。
【0118】
COに酸化されたCOの割合を用いて微生物培養物の全体的な正味の変換を定量することができる。前記培養物によって消費されたCOの量はまた培養物の生存能力(特異的取り込み:CO摂取速度/細胞密度)の指標を提供する。したがって、本発明の方法は特異的取り込みの監視と組み合わせて用いることができる。例えば、具体的な産物として固定される炭素の割合および/または特異的取り込みが所定の閾値または範囲から外れる場合には、培養物に対して1種以上の調節をして生存能力および所望の変換を維持することができる。具体的な態様では、Hが制限され、または実質的に利用できない場合には、COの特異的取り込みは少なくとも0.5mmol/グラム乾燥重量微生物細胞/分(mmol/g/分)であると推定され、例えば約0.6mmol/g/分、例えば約0.7mmol/g/分、例えば約0.8mmol/g/分、例えば約0.9mmol/g/分、例えば約1.0mmol/g/分である。
【0119】
その際、具体的な産物として固定される炭素の割合はCOの特異的取り込みと組み合わせて使用して具体的な所望の代謝産物、例えば酸および/またはアルコールが産生される速度の定量をすることができる。具体的な態様では、前記方法を使用して1種以上の産物(アルコールなど)が産生される速度を最適化(すなわち改善)することにより微生物発酵の効率を改善することができる。例えば、エタノール産生は約0.667のCO(産生)/CO(消費)比を維持しながら、COの特異的取り込みを高める微生物培養物に対して1種以上の調節をすることにより高めることができる。これに加えてあるいはこれに代えて、1種以上の調節をして、COの摂取とCO(産生)/CO(消費)比を(例えば)0.5から(例えば)0.667に高めてアルコール産生の速度を改善することができる。
【0120】
本発明の具体的な態様では、COと任意成分のHを含む基質の連続的発酵は少なくとも2日間、例えば少なくとも3日間、または例えば少なくとも5日間、または例えば少なくとも1週間、または例えば少なくとも1カ月間の長期間にわたり達成することができる。連続的発酵は新鮮な媒体を発酵液に供することと産物と微生物細胞を含む発酵液を除去して実質的に一定容量の発酵液を維持することを含む。具体的態様では、産物の濃度は1種以上のアルコール並びに1種以上の任意成分の酸および微生物細胞を含んで、連続的過程において実質的に一定に維持される。本発明の具体的な態様では、長期間連続的発酵を維持するには、前記微生物培養物は炭素の少なくとも一部をアセタートのような酸として固定する。前記アセタートは5g/L未満の濃度で産生することができる。ただし、本発明の方法によれば、固定化炭素の大部分はエタノールのようなアルコールとして10g/L、または15g/Lより多く固定される。したがって、連続操業を維持するためには、前記基質は炭素がアセタート、エタノール、およびバイオマスとして固定されるように提供される必要がある。
【0121】
具体的な態様では、エタノールと少量のアセタートを長期間にわたり連続的に産生する発酵はCO(産生)/CO(消費)比を約0.61〜0.65の範囲内、例えば0.62〜0.64の間、に維持する。そのようなCO(産生)/CO(消費)比により、大部分の固定化炭素がアルコール産生に向けられ、少量がアセタートと微生物成長を維持するための細胞物質に向けられ、その結果連続的培養物を維持する。具体的な態様では、前記基質はCOの特異的取り込みが少なくとも0.8mmol/g/分、例えば1.0mmol/グラム乾燥細胞質量/分、に維持されるように提供される。
【0122】
別の一態様によれば、非連続(バッチ)発酵は酸の産生を付随しないでアルコールが産生するように実施することができる。そのような態様では、アルコールおよび任意成分の細胞物質(バイオマス)が産生するように基質を提供する。本発明によれば、約0.667のCO/CO比が維持されるように基質を提供する。微生物培養物が成長すると、必要なCO(および任意成分のH)の量が高まることが認められる。しかしながら、本発明によれば、COの最適量は、基質供給速度が高まるときにCO/CO比を維持することによりもたらされる。
【0123】
図1は本発明の一態様によるシステム100の概略図である。基質流1は適切な導管3を経てバイオリアクタ2に入る。基質流1はCOおよび任意成分のCOおよび/またはHを含み、特定の態様では、前記基質は鋼の脱炭のような工業過程からの廃ガス流である。基質流1は絶えず供給されるという意味では一定流であるが、その流れの内容物は時間とともに変動してもよい。前記基質流の組成、特にCOおよびCOの濃度は既知であるか、またはその代わりに任意の定量手段(図示せず)により定量することができる。
【0124】
バイオリアクタ2は所望の発酵反応が産物を産生するように構成される。特定の態様によれば、バイオリアクタ2はCOを1種以上の酸および/またはアルコールを含む産物に変換するように構成される。バイオリアクタ2は一つ以上の槽を含むことができ、各槽は同じ反応および/または一つの具体的な発酵過程における異なる段階、および/または1種以上の共通段階を含んでもよい異なる発酵のための異なる反応を含む異なる反応を実施するように構成される。
【0125】
バイオリアクタ2内で産生された酸および/またはアルコールのような産物は当業者に知られている回収過程により回収することができる。
前記発酵反応で消費されない基質流の成分およびCOのような発酵反応の副産物は排出口4を経てバイオリアクタ2を出る。本発明の具体的な態様では、測定手段5は排出口4を経てバイオリアクタ2を出る排出流中のCO、CO、および任意成分のH濃度を定量するように構成される。具体的な態様では、1種以上の酸および/または1種以上のアルコールに向けられる炭素の割合はバイオリアクタ2に供給されるCO、CO、およびHの量および出る量から定量することができる。したがって、オペレータは調節手段6を用いてバイオリアクタ2および/または前記培養物の基質流1中の微生物培養物を任意に調節して微生物培養物を所望の産生状態に維持し、またはその培養物をその状態に遷移させることができる。前記培養物を維持または遷移させる調節としては、前記発酵液のpHの変更、前記発酵液の酸化還元電位の変更、前記発酵液のCO濃度の変更、前記発酵液のH濃度の変更、前記基質流の組成の変更、前記基質流の圧力の変更、発酵液撹拌速度の変更、産物の除去、前記発酵液の酸および/またはアルコール濃度の変更、培養液の1種以上の栄養素の変更、1種以上の栄養素の供給速度の変更の1種以上を含む。
【0126】
これに加えてあるいはこれに代えて、システム100は具体的な産物に向けられる炭素の割合を定量し調節手段6を制御するように構成された任意の処理手段7を含み、その結果前記培養物を所望の状態に維持し、または遷移することができる。
【0127】
具体的な態様では、バイオリアクタ2に出入りする前記CO、HおよびCOは連続的にまたは不連続な時点で監視することができ、前記炭素固定を定量することができる。さらに、調節手段6は必要ならば連続的な調節または不連続な時点での調節がされるように構成することができる。
【0128】
CO(産生)/CO(消費)比を定量するための手段は任意だが、具体的な態様では、バイオリアクタ2から出る流れおよび任意の基質流1のCOおよびCOの濃度を定量するのに一つ以上のガスクロマトグラフが使用される。一態様では、バイオリアクタ2から出る流れのCOおよびCOの濃度を定量するための手段はバリアンCP−4900マイクロGCである。
【実施例】
【0129】
材料と方法(実施例1および2)
【0130】
【表1】

【0131】
媒体の調製(実施例1および2)
媒体は次のように調製した。85%HPO(20mmol)を1Lの溶液Aに加えた。媒体のpHはNaOHの5M溶液を添加して5.3に調節した。金属塩をその後1種以上の溶液Bに従い任意に加えた。媒体溶液は30分間121°Cの高圧蒸気殺菌法または使用前ろ過殺菌により滅菌した。レザズリンを酸化還元指標として加え、10mlのビタミンB溶液(溶液C)を加えた。
【0132】
Naの調製
500mlのフラスコにNaS(93.7g、0.39モル)および200mlのHOを入れた。溶液を撹拌して塩を溶解した後、硫黄(25g、0.1モル)を一定N流の下で加えた。室温で2時間撹拌した後、その「Na」溶液([Na]については約4M、[S]については約5M)は透明なえび茶色の液体となり、これをNパージした血清瓶へ移しアルミ箔で包んだ。
【0133】
材料と方法(実施例3、4、および5)
【0134】
【表2】

【0135】
Cr(II)溶液の調製
1Lの三口フラスコに気密性の注入口と排出口を取り付けて不活性ガスの下での作業ができるようにし、その後前記の所望の産物を適切な貯蔵フラスコに移した。このフラスコにCrCl・6H0(40g、0.15モル)、亜鉛顆粒[20メッシュ] (18.3g、0.28モル)、水銀(13.55g、1mL、0.0676モル)、および500mLの蒸留水を入れた。Nを1時間流した後、前記混合物を約80°Cに温めて反応を開始させた。一定のN流の下で2時間の撹拌の後、前記混合物を室温に冷却し、さらに48時間連続撹拌すると、反応混合物は藍色の溶液に変わった。その溶液をNでパージした血清瓶に移し、後に使用するために冷蔵庫で保管した。
【0136】
細菌:使用したクロストリジウム・オートエタノゲナムはドイツ生物材料資源センター(DSMZ)に寄託され、受入番号DSMZ19630号を割り当てられたものである。
標本採取と分析手順
媒体標本はCSTR反応器から20日間までの期間にわたり、周期的に採取された。媒体を標本採取する各時点で、反応器にガスが出入りしないように注意した。
【0137】
HPLC:
HPLCシステムはアジレント1100シリーズ。移動相:0.0025N硫酸。流量および圧力:0.800mL/分。カラム:オルテックIOA、カタログ番号9648、150´6.5mm、粒径5μm。カラム温度:60°C。検出器:屈折率計。検出器温度:45°C。
【0138】
標本調製の方法
400μLの標本と、50μLの0.15M ZnSOと、50μLの0.15M Ba(OH)と、をエッペンドルフ管に入れた。前記管を10分間、12,000rpm、4°Cで遠心分離機にかけた。200μLの上清をHPLCの小瓶に移し、5μLをHPLC機器に注入した。
【0139】
ヘッドスペース分析
測定はバリアンCP−4900マイクロGCに2つのチャンネルを取り付けて実施した。チャンネル1には10mの分子篩カラムで70°C、200kPaのアルゴンを4.2秒の逆流時間で流したのに対し、チャンンネル2には10mのPPQカラムで90°C、150kPaのヘリウムを逆流させずに流した。注入器温度は両方のチャンネルともに70°Cであった。測定時間は120秒に設定されたが、関心のあるピークはすべて100秒前に常に溶離した。
【0140】
実施例1:CSTR中のバッチ発酵
1種以上の溶液Bを含む1.5リットルの媒体溶液を無菌状態で嫌気的に2LのCSTR容器に移し、Nを連続散布した。前記発酵容器に移した後、移された媒体の還元状態およびpHは探針により直接測定することができた。前記媒体を37°Cに加熱し300rpmで撹拌した。前記媒体をその後0.3M Cr(II)塩化物溶液を加えて−130mVまでさらに還元した。
【0141】
多硫化物溶液(0.1%v/v、1.5mL)を前記溶液に加えた結果、黒色の沈殿物が媒体中に観察された。電位もまた初期に−300mVまでの低下が観察されたが、数時間後には−150mVまでに安定化した。多硫化物溶液の添加後は前記溶液にNを連続散布した。
【0142】
植菌に先立ち、ガスをあらかじめ混合した70%CO、1%H、15%CO、および14%Nの混合物に切り替え、これを実験の間発酵液に連続散布した。活発に成長するクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を前記CSTRに約7.5%(v/v)の濃度で植菌した。この実験の間、pHは約5.5に維持した。
【0143】
結果
図1に代謝体産生とCO(産生)/CO(消費)比の比較を示す。前記培養物が顕著な量のガスを消費しない遅延期の後、ガスの消費と代謝体の産生が約5日後に始まった。
【0144】
最初の3日間はCO(産生)/CO(消費)比は0.55と0.62の間に留まり、この値は前記モデルがエタノールはアセタートとともに産生することを示し、エタノールとアセタートの両方の増加がHPLCによる分析で同時に観察される。
【0145】
9日目に、CO(産生)/CO(消費)比は0.66に急上昇し、この値はほとんどすべての摂取炭素がアセタートをほとんどあるいは全く産生することなくエタノールの産生に向けられていることを示すことが前記モデルにより推測される。同日のHPLC分析は培養物による継続的エタノールの産生を示すが、アセタート濃度は横ばいである。比がわずかだがより高くなるときはアセタート消費を示すことになり、この事象はガスヘッドスペース分析を行わなかった11日目と12日目の間の夜に生じたことがHPLC分析からわかる。
【0146】
12日目と13日目に、前記比は0.6に近づき、幾分かのアセタート産生を伴う継続的エタノールの産生を示し、これもHPLC測定と一致する見解になる。14日目から16日目には、前記比は0.667より高くなり、エタノールの産生がアセタートの消費から生じていることを示す。これらの日のHPLCデータは継続的エタノールの蓄積を示すが、アセタート濃度は少量の増加と減少を伴って変動する。19日目には前記比は急激に0.5未満に下がり、エタノールの消費を示唆し、その期間のHPLC分析はエタノール濃度の低下を示す。19日目の後は反応器によるガスの消費はゼロに近く、前記培養物は不活性であると推測された。
【0147】
実施例2:CSTR中のバッチ発酵
1種以上の溶液Bを含まないで1.5リットルの媒体溶液を無菌状態で嫌気的に2LのCSTR容器に移し、Nを連続散布した。前記発酵容器に移した後、移された媒体の還元状態およびpHは探針により直接測定することができた。前記媒体を37°Cに加熱し300rpmで撹拌した。前記媒体はその後0.3M Cr(II)塩化物溶液を加えて−130mVまでさらに還元した。
【0148】
多硫化物溶液(3M溶液、1.0mL)を前記溶液に加えた。初期に−220mVまでの電位低下もまた観察されたが、数時間後には−100mVまでに安定化した。Nを12時間連続散布した後、前記溶液に1種以上の溶液Dを加え、Cr(II)を加えて前記ORPを約−200mVに調節した。
【0149】
植菌に先立ち、前記ガスをあらかじめ混合した70%CO、1%H、15%CO、および14%Nの混合物に切り替え、これを実験の間は発酵液に連続散布した。活発に成長するクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を前記CSTRに約7.5%(v/v)の濃度で植菌した。この実験の間、pHは外部からは制御しなかった。
【0150】
結果:
図2に代謝体産生とCO(産生)/CO(消費)比の比較を示す。前記培養物が顕著な量のガスを消費しない遅延期の後、ガスの消費と代謝体の産生が約3日目に始まった。最初はCO(産生)/CO(消費)比は非常に高いことが観察され、実際に1:1を超える。1:1を超える計算値は前記モデルでは1:1に等しいとして処理される。この高い比からアセタートの消費とエタノールの産生が示唆される。この期間のHPLC分析は対応するアセタートの減少とエタノールの増加を示した。5日目と9日目の間は、前記比は0.6と0.5の間に下がり、エタノールの産生は同時にアセタートの産生を伴うことを示し、HPLC分析と一致する。8日目と11日目の間は、CO(産生)/CO(消費)比は0.5未満に下がり、エタノールの消費を示す。9日目と10日目には、HPLC分析はエタノール濃度が下がることを示す。11日目の後は、前記比は0.667より高くなり、エタノールの産生がアセタートの消費から生じていることを示し、HPLC分析において観察されたアセタートの減少と一致する。この消費は13日目と14日目にはより顕著になり、前記比は対応して1:1を超えて急上昇する。
【0151】
15日目から18日目の期間は、ガスヘッドスペース分析は行わなかったが、HPLC分析ではエタノール濃度が徐々に減少しアセタート濃度がわずかに増加した。
19日目には、ヘッドスペース分析を再開し、前記比は0.667より高く、エタノールの産生とアセタートの消費を示すものであった。HPLC分析で、標本採取を行わなかった期間にエタノール濃度は顕著に上昇したがアセタート濃度はほぼ変わらなかった。20日目後は培養物についてさらなるデータ収集は行わなかった。
【0152】
実施例3:CSTR中のバッチ発酵
媒体を次のように調製した。85% HPO(45mmol)を1.5Lの溶液Aの溶液に加えた。媒体のpHはNaOHの5M溶液を加えて5.3に調節した。媒体溶液を30分間121°Cの高圧蒸気殺菌法または使用前ろ過殺菌により滅菌した。レザズリンを酸化還元指標として加えた。前記媒体溶液を無菌状態で嫌気的に1.5LのCSTR容器に移し、Nを連続散布した。前記発酵容器に移した後、移された媒体の還元状態およびpHは探針により直接測定することができた。前記媒体を37°Cに加熱し300rpmで撹拌した。
【0153】
硫化ナトリウム溶液(3.75mLの0.2M溶液)を加えた後、ニトリロ酢酸(1.5mLの0.1M溶液)、微量金属溶液B(1.5mL)NaWO(1.5mLの0.01M溶液)、およびビタミンB溶液C(15mL)を加えた。前記溶液のORPはCr(II)溶液を用いて約−200mVに調節した。
【0154】
植菌に先立ち、前記ガスを33%H、23%N、31%CO、13%COの混合物に切り替えた。
活発に成長するクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を前記CSTRに約10%(v/v)の濃度で植菌した。この実験の間pHを約5.3に維持し、NaS溶液を約0.16mMol/日の速度で加えた。
【0155】
前記ガスの供給と撹拌はバイオリアクタを出るガス流中の変化に応じて発酵の経時変化とともに増加させた。本発明の方法によれば、アルコールに向けられる炭素の割合は70%より大きいが100%未満の区切り点を維持することにより高い水準に維持される。図4にCO、Hの摂取および区切り点を示し、図5に微生物成長と代謝体産生を示す。基質供給を一定濃度に維持してアルコール産生を促進することにより、アセタートを産生せず、エタノールとバイオマスが急速に蓄積する。
【0156】
実施例4:CSTR中のバッチ発酵
媒体を次のように調製した。85% HPO(45mmol)を溶液Aの1.5Lの溶液に加えた。媒体にNaOHの5M溶液を加えてpHを5.3に調節した。媒体溶液は30分間121°Cの高圧蒸気殺菌法または使用前ろ過殺菌により滅菌した。レザズリンを酸化還元指標として加えた。前記媒体溶液を無菌状態で嫌気的に1.5LのCSTR容器に移し、Nを連続散布した。前記発酵容器に移した後、移された媒体の還元状態およびpHは探針により直接測定することができた。前記媒体を37°Cに加熱し300rpmで撹拌した。
【0157】
硫化ナトリウム溶液(3.75mLの0.2M溶液)を加えた後、ニトリロ酢酸(1.5mLの0.1M溶液)、微量金属溶液B(1.5mL)NaWO(1.5mLの0.01M溶液)、およびビタミンB溶液C(15mL)を加えた。前記溶液のORPはCr(II)溶液を用いて約−200mVに調節した。
【0158】
植菌に先立ち、前記ガスを50%COおよび50%Nの混合物に切り替え、これを実験の間発酵液に連続散布した。活発に成長するクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を前記CSTRに約10%(v/v)の濃度で植菌した。前記発酵の間、pHは約5.3に維持し、NaS溶液を約0.16mMol/日の速度で加えた。
【0159】
前記ガスの供給と撹拌はバイオリアクタを出るガス流中の変化に応じて発酵の経時変化とともに増加させた。本発明の方法によれば、CO(産生)/CO(消費)比は実質的にすべての炭素がアルコール産生に向けられるように約0.667に維持される。図6にCOの摂取とCO(産生)/CO(消費)比を示し、図7に微生物成長と代謝体産生を示す。基質供給を一定水準に維持してアルコール産生を促進することにより、アセタートを産生せず、エタノールとバイオマスが急速に蓄積される。
【0160】
実施例5:CSTR中の連続発酵
2LのCSTRを次の条件下で用意した。媒体は次のように調製した。85% HPO(30mM)を1.5Lの溶液Aに加えた。媒体にNHOHを加えてpHを5.3に調節した。媒体溶液を30分間121°Cの高圧蒸気殺菌法または使用前ろ過殺菌により滅菌した。レザズリンを酸化還元指標として加えた。前記媒体溶液を無菌状態で嫌気的に1.5LのCSTR容器に移し、Nを連続散布した。前記発酵容器に移した後、移された媒体の還元状態およびpHは探針により直接測定することができた。前記媒体を37°Cに加熱し300rpmで撹拌した後、0.3モル/Lのニトリロ酢酸(1.5mL)を含む微量金属溶液B(1.5mL)、NaWO(1.5mLの0.01M溶液)、および溶液C(15mL)を加えた。植菌に先立ち、前記ガスを2%H、28%N、48%COおよび22%COに切り替えた。活発に成長するクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を前記CSTRに約10%(v/v)の濃度で植菌した。この実験の間、NaS溶液(0.2M)を約0.3ml/時の速度で加えた。
【0161】
前記微生物培養物を約1日中バッチ形態で成長させた。1日目に前記発酵を連続操作に切り替え、新鮮な媒体を提供して約1から1.8の希釈割合を実現した。基質供給は前記微生物培養物の要求に応じて増加させた。
【0162】
図8に前記発酵の結果を示す。前記基質供給速度と撹拌速度はCOに変換されるCOの割合の変化に応じて発酵の経時変化とともに増減させた。本発明によれば、持続可能な連続操業は約0.62〜0.64のCO/CO比を維持して達成された。持続可能な連続操業は約3g/Lの安定したバイオマス、約5g/Lの実質的に安定したアセタート濃度、および少なくとも10g/Lの実質的に安定したエタノール濃度が得られた。微生物培養物によるCOの特異的取り込みは約1.0mmol/g/分に維持された。
【0163】
実施例6:予測
培養液中のカルボキシド栄養性微生物培養物によるCOを含む基質の発酵であって、前記条件(当業者に知られているものなど)がアセタートの同時産生を伴って培養物の急成長を促進する発酵。そのような条件下では、CO(産生)/CO(消費)比は好ましくは約0.5に維持されることになる。しかしながら、オペレータが培養物をアセタート産生からアルコール産生へ切り替えたい段階では、1種以上の調節を行うことができる。具体的な態様では、前記培養液のpHは前記微生物培養物の少なくとも一部をアルコールが産生する状態に遷移するように低減させることができる。所望の遷移がなされたら、CO(産生)/CO(消費)比は約0.667に向けて増加することになる。別の一態様では、前記pHを手動で変更するのではなく、前記微生物培養物がpHを自主調整できるようにpHの制御を止めて調節を実現させることができる。
【0164】
実施例7:予測
培養液中のカルボキシド栄養性微生物培養物によるCOを含む基質の発酵であって、前記条件(当業者に知られているものなど)がアルコールの産生を促進する発酵。そのような条件下では、CO(産生)/CO(消費)比は好ましくは約0.667に維持されることになる。しかしながら、CO(産生)/CO(消費)比がこの値から外れる場合、例えば約0.5に下がれば、1種以上の調節をして前記比を前記最適値に戻すように高めることができる。例えば、前記ガス流の水素成分をアルコールの産生が促進するように増加させることができる。
【0165】
本明細書では読者が不適切な実験をすることなく本発明を実施することができるように特定の好ましい態様を参照して本発明を記載した。本発明が具体的に記載されていない変動や修正を許容することは当業者には当然である。本発明はすべてのそのような変動や修正を含むと理解される。さらに題名、見出しなどは本文書が読者に理解が高まるよう提供されていて、本発明の範囲を限定するように読み取るべきではない。上述およびもしあるとすれば下記の、すべての引用出願、特許および刊行物の開示の全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0166】
本明細書における先行技術の参照は先行技術が世界のどこかの国において開発分野の共通一般常識の部分を形成することを承認したり示したりするものではなく、そのように解釈されるべきではない。
【0167】
本明細書および下記のいずれかの請求項を通じて、文脈が他を要求しない限り、「含む」の語は排他的意味に対立した包含的な意味で解釈され、すなわち「限定的ではなく包含する」の意味である。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
COおよび任意成分のHを含む基質の微生物発酵の効率を高める方法であって、COの第一の部分が1種以上の酸および/または1種以上のアルコールを含む1種以上の所望の産物として固定され、COの第二の部分がCOに変換されるように前記基質を微生物培養物に提供することを含み、COに変換されるCOの割合を定量して1種以上の所望の産物の産生のための基質供給速度を決定する、前記方法。
【請求項2】
前記基質供給速度を、
i)COに変換されるCOの割合が最適値または最適範囲未満であると定量される場合には増加させ、または
ii)COに変換されるCOの割合が最適値または最適範囲を超えていると定量される場合には減少させ、または
iii)COに変換されるCOの割合が実質的に最適値または最適範囲にあると定量される場合には維持する、
請求項1に記載される方法。
【請求項3】
前記基質供給速度はCOに変換されるCOの割合が実質的に最適値または最適範囲に維持されるように自動的に調節される、請求項2に記載される方法。
【請求項4】
が実質的に制限(5%未満)される、請求項1〜3のいずれか1項に記載される方法。
【請求項5】
所望の産物がエタノールである、請求項1〜4のいずれか1項に記載される方法。
【請求項6】
所定の操作パラメータに基づくCOを含む基質の微生物発酵による1種以上の酸および/またはアルコールの産生効率を高める方法であって、1種以上の産物に向けられる炭素の割合を定量し、定量結果により、
i)所望の産物として固定される炭素の割合が増加するように1種以上の操作パラメータを調節すること、または
ii)所望の産物として固定される炭素の割合が実質的に一定に維持されるように前記操作パラメータを維持すること、
のいずれかを含む、前記方法。
【請求項7】
1種以上の前記操作パラメータは、前記発酵液のpH、前記発酵液の酸化還元電位、前記発酵液のCO濃度、基質供給速度、前記基質流の組成、前記基質流の圧力、発酵液の攪拌速度、産物の除去速度、前記発酵液の酸および/またはアルコール濃度、前記培養液中の1種以上の栄養素、1種以上の栄養素の供給速度から選択される、請求項6に記載される方法。
【請求項8】
前記操作パラメータは基質供給の速度である、請求項6または7に記載される方法。
【請求項9】
1種以上の産物として固定される炭素の割合はCOへ酸化されるCOの割合を定量して定める、請求項6〜8のいずれか1項に記載される方法。
【請求項10】
エタノールとして固定される前記炭素の割合が最適化される、請求項6〜9に記載される方法。
【請求項11】
エタノールが連続産生される、請求項10に記載される方法。
【請求項12】
アセタートの同時産生を伴わないでエタノールが産生される、請求項10または11に記載される方法。
【請求項13】
COを含む前記基質はガス状である、請求項1〜12のいずれか1項に記載される方法。
【請求項14】
前記基質は鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製過程、バイオマスのガス化、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産、およびコークス生産からなる群から選択される工業的過程の副産物として得られるガスを含む、請求項13に記載される方法。
【請求項15】
COを含む前記基質は容量で少なくとも約15%から約100%のCOを含む、請求項13または14に記載される方法。
【請求項16】
COを含む前記基質は容量で少なくとも約40%から約70%のCOを含む、請求項13〜15のいずれか1項に記載される方法。
【請求項17】
前記微生物はクロストリジウム、ムーレラ、ピロコッカス(Pyrococcus)、ユウバクテリウム、デスルフォバクテリウム(Desulfobacterium)、カルボキシドサーマス、アセトゲニウム(Acetogenium)、アセトバクテリウム、アセトアナエロビウム(Acetoanaerobium)、ブチリバクテリウムおよびペプトストレプトコッカス(Peptostreptococcus)からなる群から選択される、請求項1〜16のいずれか1項に記載される方法。
【請求項18】
前記微生物はクロストリジウム・オートエタノゲナムである、請求項17に記載される方法。
【請求項19】
COを含む基質流の1種以上の酸および/または1種以上のアルコールのような産物への微生物発酵のためのシステムであって、微生物培養物を使用時に含有するバイオリアクタ、特定の産物として固定される炭素の割合を定量するように構成された測定手段、および前記微生物培養物および/または基質流に対して1種以上の調節をするように構成された少なくとも1種の調節手段を含む、前記システム。
【請求項20】
前記測定手段はバイオリアクタから出る排出流の組成および任意にバイオリアクタに入る基質流を定量するように構成された少なくとも1種の手段を含む、請求項19に記載されるシステム。
【請求項21】
前記調節手段は、前記定量手段が所望の産物として固定される炭素の割合が所定の値または範囲から外れていると判断した場合には、1種以上の調節を行うように構成される、請求項19または20に記載されるシステム。
【請求項22】
前記調節手段は、前記発酵液のpHの変更;または前記発酵液の酸化還元電位の変更;または前記発酵液のCO濃度の変更;または前記発酵液のH濃度の変更;または前記基質流の組成の変更;または前記基質流の圧力の変更;または発酵液の攪拌速度;または産物の除去;または前記発酵液の酸および/もしくはアルコール濃度の変更;または前記培養液中の1種以上の栄養素の変更;または1種以上の栄養素の供給速度の変更による調節を行うように構成される、請求項21に記載されるシステム。
【請求項23】
前記システムは、所望の産物として固定される炭素の割合が所定の値または範囲から外れていると判断される場合には、前記微生物培養物および/または基質流に対して1種以上の調節を行うように、1種以上の調節手段を制御するように構成される処理手段を含む、請求項19〜23のいずれか1項に記載されるシステム。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【公表番号】特表2012−516152(P2012−516152A)
【公表日】平成24年7月19日(2012.7.19)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−547846(P2011−547846)
【出願日】平成22年1月29日(2010.1.29)
【国際出願番号】PCT/NZ2010/000009
【国際公開番号】WO2010/093262
【国際公開日】平成22年8月19日(2010.8.19)
【出願人】(510119555)ランザテク・ニュージーランド・リミテッド (6)
【Fターム(参考)】