アルコール刺激抑制物質の評価方法
【課題】アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価することができるアルコール刺激抑制物質の評価方法を提供すること。
【解決手段】被験物質とエタノールまたは多価アルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞と接触させ、該エタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびエタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とするアルコール刺激抑制物質の評価方法。
【解決手段】被験物質とエタノールまたは多価アルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞と接触させ、該エタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびエタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とするアルコール刺激抑制物質の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール刺激抑制物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトの皮膚に用いられる化粧料などの皮膚外用剤の開発などに有用なアルコール刺激抑制物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚に用いられる化粧料などの皮膚外用剤には、必要により、爽快感や清涼感を付与するための清涼化剤や、皮膚の保湿のための保湿剤が配合されている。前記清涼化剤として、例えば、エタノールなどが用いられている。また、前記保湿剤として、ジプロピレングリコールなどの多価アルコールが用いられている。
【０００３】
しかしながら、前記エタノールや多価アルコールなどのアルコールを配合した皮膚外用剤を用いた場合、使用者によっては皮膚に痛みや灼熱感などの不快な刺激を感じることがあるため、アルコールによる不快な刺激を抑制することが求められている。
【０００４】
ところで、一過性受容体電位チャネル（以下、「ＴＲＰチャネル」という）は、痛みを惹起する因子を受容する受容体として機能することが知られている。例えば、ＴＲＰチャネルの１つであるＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化が、パラベン類やアルカリ剤が配合された皮膚外用剤を用いたときに引き起こされる不快な刺激と関連していることが、本発明者らによって見出されている。また、前記パラベン類やアルカリ剤による刺激と前記ＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化との関連性を利用して、パラベン類やアルカリ剤による刺激を抑制する物質を評価することが提案されている（例えば、特許文献１および２参照）。
【０００５】
しかしながら、本発明者らは、現時点では、アルコールによる刺激とＴＲＰＡ１との関連性や当該関連性を利用して、アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価する方法を具体的に記載した文献を発見していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−７９５２８号公報
【特許文献２】特開２００９−８２０５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価することができるアルコール刺激抑制物質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）被験物質とアルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞と接触させ、アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびアルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とするアルコール刺激抑制物質の評価方法、
（２）前記生理学的事象が、アルコールとの接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である前記（１）に記載の評価方法、
（３）前記ＴＲＰＡ１発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である前記（１）または（２）に記載の評価方法、
（４）前記ＴＲＰＶ１発現細胞が、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の評価方法、
（５）前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である前記（１）または（２）に記載の評価方法、ならびに
（６）前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞である前記（３）〜（５）のいずれかに記載の評価方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法は、アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図２】実施例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図３】比較例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図４】比較例２において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図５】実施例２において、各試料と抑制率との関係を示すグラフである。
【図６】実施例２において、各試料と抑制率との関係を示すグラフである。
【図７】試験例１において、各試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図８】試験例１において、各試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法は、被験物質とアルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞に接触させ、アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびアルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする。
【００１２】
本発明者らは、アルコールを、ＴＲＰチャネルを発現する種々の細胞と接触させたとき、ＴＲＰチャネルのうち、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１両方が活性化するが、ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＶ２のいずれもが活性化しないことを見出した。さらに、本発明者らは、被験物質の存在下において、アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびアルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、前記被験物質がアルコールによる皮膚などへの刺激を抑制する物質であるか否かを評価することができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００１３】
以下、アルコールによる皮膚などへの刺激をアルコール刺激という。また、本明細書において、アルコール刺激抑制物質とは、前記アルコール刺激を抑制する物質をいう。
【００１４】
本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法は、被験物質とアルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞と接触させる点に１つの大きな特徴がある。本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法によれば、アルコールによってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象に対する被験物質の影響およびアルコールによってＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象に対する被験物質の影響を簡便な操作で測定することができるので、被験物質がアルコール刺激を抑制するか否かを簡便な操作で評価することができる。
【００１５】
また、本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法には、被験物質を評価する際に、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いているか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いている点にも１つの大きな特徴がある。このように、本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法によれば、実験動物などと比べて、低コストで、かつ取扱いが簡便な細胞を用いるので、前記アルコール刺激抑制物質を低コストで評価することができる。
【００１６】
前記被験物質としては、特に限定されないが、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物などが挙げられる。前記被験物質は、そのまま用いてもよく、必要に応じて、溶媒に溶解させて用いてもよい。前記溶媒は、前記生理学的事象の測定に影響を与えない溶媒であることが好ましい。前記溶媒としては、例えば、生理的食塩水、水などが挙げられる。
【００１７】
本明細書において、前記アルコールとは、一価アルコールおよび多価アルコールをいう。
【００１８】
前記一価アルコールとしては、例えば、脂肪族一価アルコールなどが挙げられる。前記一価アルコールは、当該一価アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で的確に評価する観点から、好ましくは炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコール、より好ましくは炭素数２〜８の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコールである。前記炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコールとしては、例えば、エタノール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、ペンチルアルコール、ヘキシルアルコール、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、ノニルアルコール、デシルアルコールなどが挙げられる。
【００１９】
前記多価アルコールとしては、例えば、皮膚外用剤に配合される多価アルコールなどが挙げられる。前記皮膚外用剤に配合される多価アルコールとしては、例えば、脂肪族多価アルコールなどが挙げられる。前記多価アルコールは、当該多価アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で的確に評価する観点から、好ましくは炭素数２〜６の脂肪族二価アルコール、より好ましくは炭素数３〜６の脂肪族二価アルコールである。前記炭素数２〜６の脂肪族二価アルコールとしては、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ペンチレングリコール、ヘキシレングリコールなどが挙げられる。
【００２０】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、マスタード、シナモアルデヒド、アリルイソチオシアネート、カルバクロール、アリシンなどによる化学刺激、冷覚刺激（例えば、１７℃前後での刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。
【００２１】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＡ１発現細胞」ともいう）が好ましい。
【００２２】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞は、ＴＲＰＶ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＶ１の生理学的機能としては、例えば、カプサイシン、カンフル、プロトンなどによる化学刺激、熱覚刺激（例えば、４３℃前後の刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。
【００２３】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＶ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＶ１発現細胞」ともいう）が好ましい。
【００２４】
前記内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、内耳の細胞などが挙げられる。また、前記内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、脳の細胞、膀胱上皮の細胞などが挙げられる。
【００２５】
前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸がいずれも発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞においては、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記アルコールによってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象をそれぞれ測定する観点から、それぞれ別々の発現プロモーターの制御下にあることが好ましい。発現プロモーターは、宿主細胞内でＴＲＰＡ１を発現させるのに適したプロモーターであればよい。発現プロモーターは、用いられる宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、染色体外要素として前記核酸が存在している細胞であってもよく、前記核酸が染色体に組み込まれている細胞であってもよい。
【００２７】
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。また、前記外因性ＴＲＰＶ１発現細胞は、ＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。
【００２８】
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。また、前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよい。
【００２９】
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトに適用することができるアルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、好ましくはヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸である。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。
【００３０】
また、前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトに適用することができるアルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、好ましくはヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸である。前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：３に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿０８０７０４．３としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＶ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。また、ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸とオルタナティブスプライシングを介して異なるスプライシングバリアントであってもよい。前記スプライシングバリアントとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８７２７．５、ＮＭ＿０８０７０５．３、ＮＭ＿０８０７０６．３などの塩基配列で示される核酸が挙げられる。
【００３１】
ＴＲＰＡ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
【００３２】
また、ＴＲＰＶ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（ａ）配列番号：３に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｂ）配列番号：４において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｃ）配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
【００３３】
なお、本明細書において、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸または配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸と、前記核酸に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられる。
【００３４】
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：３に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：３に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。
【００３５】
前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸および／またはＴＲＰＶ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。これらのなかでは、ヒトにおけるＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１の生理学的機能を十分に再現する観点から、好ましくは動物細胞である。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞などが挙げられる。サル細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。マウス細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。ヒト細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。前記宿主細胞のなかでは、取扱いが容易であり、アルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。これらのなかでは、ＴＲＰチャネルがほとんど発現しておらず、外因性のＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１の活性化を容易にかつ選択的に測定することができる観点およびヒトへの適用に適したアルコール刺激抑制剤を的確に評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞が好ましい。
【００３６】
前記組換えベクターは、ＴＲＰＡ１をコードする核酸および／またはＴＲＰＶ１をコードする核酸と慣用のベクターとを連結させることによって得られるベクターである。前記ベクターは、調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。前記ベクターは、形質転換後に、組換えベクターを保持する細胞を容易に選択する観点から、好ましくは選択マーカー遺伝子を有するベクターである。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。これらのベクターは、用いられる宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞および外因性ＴＲＰＶ１発現細胞を作製するための組換えベクターに用いられるベクターは、発現プロモーターを有していてもよい。
【００３７】
前記組換えベクターを用いた形質転換は、用いられる宿主細胞の種類に応じて、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などの形質転換方法によって行なうことができる。これらの形質転換方法は、例えば、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕などの記載に準じて行なうことができる。形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどによって行なうことができる。
【００３８】
得られた細胞が、ＴＲＰＡ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＡ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。また、得られた細胞が、ＴＲＰＶ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１００ｎＭ〜１０μＭカプサイシンと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＶ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、カプサイシンと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。
【００３９】
被験物質と、アルコールと、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞との接触は、例えば、各細胞の培養に適した培地中で、被験物質と、アルコールと、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞とをインキュベーションすること、被験物質と、アルコールと、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞との混合物をインキュベーションすることなどによって行なわれる。なお、ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いる場合、アルコールによってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象をそれぞれ測定するタイミングに合わせて、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１をそれぞれ別々に発現させるようにする。
【００４０】
前記培地としては、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞が生育するのに適した成分〔例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質など）、血清（例えば、ウシ胎仔血清など）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど〕を含む培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に前記成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。基本培地としては、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地などが挙げられる。かかる培地は、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、用いられる細胞がＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞である場合、培地として、１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。
【００４１】
ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞の各使用量は、試験データの信頼性の観点から、１視野（データ解析範囲）あたり、それぞれ１×１０1細胞以上が好ましく、１×１０2細胞以上がより好ましく、細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎないようにする観点から、３×１０２細胞以下が好ましく、２×１０２細胞以下がより好ましい。
【００４２】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させる被験物質の量は、被験物質の種類に応じて適宜設定することができる。
【００４３】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させるアルコールの量は、例えば、当該アルコールが炭素数２〜６の脂肪族一価アルコールまたは炭素数２〜６の多価アルコールである場合、通常、皮膚外用剤に配合される量のアルコールによる刺激を再現し、アルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、細胞１×１０2個あたり、１００ｍＭ以上であることが好ましく、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１以外の因子による応答を抑制する観点から、５Ｍ以下であることが好ましく、２Ｍ以下であることがより好ましく、１Ｍ以下であることがさらに好ましい。
【００４４】
また、前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させるアルコールの量は、例えば、当該アルコールが炭素数７〜８の脂肪族一価アルコールである場合、アルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、細胞１×１０2個あたり、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、０．５ｍＭ以上であることがより好ましく、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１以外の因子による応答を抑制する観点から、５ｍＭ以下であることが好ましく、２ｍＭ以下であることがより好ましい。
【００４５】
さらに、前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させるアルコールの量は、例えば、当該アルコールが炭素数９〜１０の脂肪族一価アルコールである場合、細胞とアルコールとの接触時に用いられる培地への炭素数９〜１０の脂肪族一価アルコールの溶解度などにより異なるので一概には決定することができない。
【００４６】
なお、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、それぞれ、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持するために、必要に応じて、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を、各細胞に適した条件下で、予めインキュベーションしておいてもよい。
【００４７】
前記インキュベーションは、用いられる細胞の種類に応じた方法によって行なうことができる。かかる方法としては、例えば、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法などが挙げられる。また、インキュベーション温度、インキュベーション時間、二酸化炭素濃度などの条件は、用いられる細胞に応じて適宜設定される。例えば、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞として、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞を用いる場合、かかる細胞は、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持する観点から、通常、５体積％二酸化炭素を含む雰囲気中で、３６〜３８℃、好ましくは３６．５〜３７．５℃でインキュベーションすればよい。
【００４８】
前記生理学的事象としては、アルコールとの接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化、アルコールとの接触前後の一定電位下での電流の変化、これらの組み合わせなどが挙げられる。本発明においては、簡便な操作で、かつ高感度で測定することができる観点から、前記生理学的事象は、好ましくはアルコールとの接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である。
【００４９】
前記一定の電位での電流の測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。
【００５０】
ここで、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いた場合、被験物質がアルコール刺激抑制物質であることの判断基準としては、例えば、アルコールと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における一定の電位下での電流と比べて、被験物質とアルコールとを接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が小さくなっており、かつアルコールと接触させたＴＲＰＶ１発現細胞における一定の電位下での電流と比べて、被験物質とアルコールとを接触させたＴＲＰＶ１発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が小さくなっていること、すなわち、被験物質によって、アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる一定の電位下での電流の増加およびアルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる一定の電位下での電流の増加が抑制されていることなどが挙げられる。
【００５１】
また、ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合、被験物質がアルコール刺激抑制物質であることの判断基準としては、ＴＲＰＡ１を発現させるとともにアルコールと接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における一定の電位下での電流と比べて、ＴＲＰＡ１を発現させるとともに被験物質とアルコールとを接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が小さくなっており、かつＴＲＰＶ１を発現させるとともにアルコールと接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における一定の電位下での電流と比べて、ＴＲＰＶ１を発現させるとともに被験物質とアルコールとを接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が小さくなっていることなどが挙げられる。
【００５２】
細胞内カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を調べる方法などを用いて算出することができる。前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンと結合した当該蛍光カルシウム指示薬の量によってその蛍光特性が変化する試薬であればよく、特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ ２、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられる。
【００５３】
なお、蛍光カルシウム指示薬が２種類の励起波長を有する場合、より精度を高める観点から、各励起波長における蛍光強度から蛍光強度比を算出することが好ましい。例えば、蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭの励起波長は、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍである。この場合、ＴＲＰＡ１またはＴＲＰＶ１のアゴニストと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度に対する被験物質およびアルコールと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、式（Ｉ）：
【００５４】
【数１】
【００５５】
に基づいて、変化率（％）を算出することにより調べることができる。なお、前記Δ蛍光強度比Aは、式（ＩＩ）：
【００５６】
【数２】
【００５７】
に基づいて算出することができる。また、前記Δ蛍光強度比Bは、式（ＩＩＩ）：
【００５８】
【数３】
【００５９】
に基づいて算出することができる。なお、本明細書において、「蛍光強度340nm」は励起波長３４０ｎｍにおける蛍光強度を示し、「蛍光強度380nm」は励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度を示す。
【００６０】
ここで、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いた場合、被験物質がアルコール刺激抑制物質であることの判断基準としては、例えば、アルコールに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と比べて、被験物質とアルコールとに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度が低くなっており、かつアルコールに接触させたＴＲＰＶ１発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と比べて、被験物質とアルコールとに接触させたＴＲＰＶ１発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度が低くなっていること、すなわち、被験物質によって、アルコールによってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウム濃度の増加およびアルコールによってＴＲＰＶ１を介して引き起こされる細胞内カルシウム濃度の増加が抑制されていることなどが挙げられる。
【００６１】
また、ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合、被験物質がアルコール刺激抑制物質であることの判断基準としては、
（ａ）ＴＲＰＡ１を発現させるとともに、アルコールに接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と比べて、ＴＲＰＡ１を発現させるとともに、被験物質とアルコールとに接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度が低くなっていること、
（ｂ）ＴＲＰＶ１を発現させるとともに、アルコールに接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と比べて、ＴＲＰＶ１を発現させるとともに、被験物質とアルコールとに接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度が低くなっていること
などが挙げられる。
【００６２】
本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法により、アルコール刺激抑制物質であることが判明した被験物質は、例えば、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールを配合した化粧品、皮膚外用剤などにより皮膚などで引き起こされる感覚刺激を抑制する成分として用いることができる。したがって、本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法によれば、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールによって皮膚トラブルを生じやすい人に適した化粧品、皮膚外用剤などの成分の評価およびスクリーニングが可能になる。
【実施例】
【００６３】
以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００６４】
（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μｌとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μｌと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μｌとを混合し、混合物ＩＩを得た。
【００６５】
また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。
【００６６】
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
【００６７】
（製造例２）
製造例１において、ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＶ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ＿０８０７０４．３）に示される塩基配列の２７６位〜２７９５位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＶ１発現細胞を得た。
【００６８】
（製造例３）
製造例１において、ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＭ８をコードするｃＤＮＡ〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２４０８０．４に示される塩基配列の４１位〜３３５５位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＭ８発現細胞を得た。
【００６９】
（製造例４）
製造例１において、ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＶ２をコードするｃＤＮＡ〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１６１１３．３に示される塩基配列の３６８位〜２６６２位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＶ２発現細胞を得た。
【００７０】
（実施例１）
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
前記製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
【００７１】
得られたＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。
【００７２】
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、試料として、アルコール水溶液を還流し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞とアルコール水溶液とを混合した。なお、前記アルコール水溶液として、２００ｍＭエタノール水溶液、５００ｍＭエタノール水溶液、１Ｍエタノール水溶液、５Ｍエタノール水溶液、２００ｍＭジプロピレングリコール水溶液、５００ｍＭジプロピレングリコール水溶液、１Ｍジプロピレングリコール水溶液、２００ｍＭプロピレングリコール水溶液、５００ｍＭプロピレングリコール水溶液、１Ｍプロピレングリコール水溶液、２００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液、５００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液または１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた。
【００７３】
その後、チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を測定した。
【００７４】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比アルコールを算出した。前記Δ蛍光強度比アルコールは、下記式（ＩＶ）：
【００７５】
【数４】
【００７６】
に基づいて算出した。
【００７７】
また、アルコール水溶液の代わりにＴＲＰＡ１に対する既知のアゴニストであるアリルイソチオシアナート（２０μＭアリルイソチオシアナート水溶液）を用いたことを除き、前記アルコール水溶液を用いた場合と同様にしてΔ蛍光強度比アゴニストを算出した。前記Δ蛍光強度比アゴニストは、下記式（Ｖ）：
【００７８】
【数５】
【００７９】
に基づいて算出した。
【００８０】
算出されたΔ蛍光強度比アルコールとΔ蛍光強度比アゴニストとから、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００８１】
実施例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図１に示す。
【００８２】
図１において、試料番号１は２００ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は５００ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は５Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は２００ｍＭジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は５００ｍＭジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１Ｍジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は２００ｍＭプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号９は５００ｍＭプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１０は１Ｍプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１１は２００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１２は５００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号１３は１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【００８３】
図１に示された結果から、エタノール水溶液（試料番号１〜４）、ジプロピレングリコール水溶液（試料番号５〜７）、プロピレングリコール水溶液（試料番号８〜１０）および１，３−ブチレングリコール水溶液（試料番号１１〜１３）のいずれのアルコール水溶液を用いた場合であっても、アルコール水溶液におけるアルコールの濃度に依存して、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが大きくなっていることがわかる。これらの結果から、ＴＲＰＡ１を活性化させて細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることが知られているアリルイソチオシアナートと同様に、エタノール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコールおよび１，３−ブチレングリコールは、ＴＲＰＡ１を濃度依存的に活性化させ、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることがわかる。
【００８４】
（２）ＴＲＰＶ１発現細胞による評価
前記（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに製造例２で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＶ１に対する既知のアゴニストであるカプサイシン（１μＭカプサイシン水溶液）を用いたことを除き、前記（１）と同様にして、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００８５】
実施例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図２に示す。
【００８６】
図２において、試料番号１は２００ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は５００ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は５Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は２００ｍＭジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は５００ｍＭジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１Ｍジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は２００ｍＭプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号９は５００ｍＭプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１０は１Ｍプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１１は２００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１２は５００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号１３は１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【００８７】
図２に示された結果から、エタノール水溶液（試料番号１〜４）、ジプロピレングリコール水溶液（試料番号５〜７）、プロピレングリコール水溶液（試料番号８〜１０）および１，３−ブチレングリコール水溶液（試料番号１１〜１３）のいずれのアルコール水溶液を用いた場合であっても、濃度に依存して、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが大きくなっていることがわかる。これらの結果から、ＴＲＰＶ１を活性化させて細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることが知られているカプサイシンと同様に、エタノール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコールおよび１，３−ブチレングリコールは、ＴＲＰＶ１を濃度依存的に活性化させ、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることがわかる。
【００８８】
（比較例１）
実施例１の（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに、製造例３で得られたＴＲＰＭ８発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＭ８に対する既知のアゴニストであるメントール（１ｍＭメントール水溶液）を用いたことを除き、前記（１）と同様にしてΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００８９】
比較例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図３に示す。
【００９０】
図３において、試料番号１は１Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１Ｍジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１Ｍプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【００９１】
図３に示された結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれにおけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト（図１および２）と比べて、ＴＲＰＭ８発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストは、エタノール水溶液、ジプロピレングリコール水溶液、プロピレングリコール水溶液および１，３−ブチレングリコール水溶液のいずれのアルコール水溶液を用いた場合であっても、著しく小さいことがわかる。これらの結果から、エタノール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコールおよび１，３−ブチレングリコールは、ＴＲＰＭ８をほとんど活性化させず、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させないことがわかる。
【００９２】
（比較例２）
実施例１の（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに、製造例４で得られたＴＲＰＶ２発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＶ２に対する既知のアゴニストであるリソフォスファチジルコリン（３０μＭリソフォスファチジルコリン水溶液）を用いたことを除き、前記実施例１の（１）と同様にして、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００９３】
比較例２において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図４に示す。
【００９４】
図４において、試料番号１は１Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１Ｍジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１Ｍプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【００９５】
図４に示された結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれにおけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト（図１および２）と比べて、ＴＲＰＶ２発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストは、エタノール水溶液、ジプロピレングリコール水溶液、プロピレングリコール水溶液および１，３−ブチレングリコール水溶液のいずれのアルコール水溶液を用いた場合であっても、著しく小さいことがわかる。これらの結果から、エタノール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコールおよび１，３−ブチレングリコールは、ＴＲＰＶ２をほとんど活性化させず、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させないことがわかる。
【００９６】
以上説明したように、エタノールおよび炭素数２〜６の多価アルコールは、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１の両方を活性化させるが、ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＶ２を活性化させないことがわかる。したがって、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞の両方を用いて、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象と、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象とを測定することにより、エタノールおよび炭素数２〜６の多価アルコールによる刺激を抑制する物質を評価することができることが示唆される。
【００９７】
（実施例２）
実施例１の（１）において、前記溶媒Ａで洗浄した後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、アルコール水溶液の代わりに、被験物質と１Ｍジプロピレングリコール水溶液との混合物を還流したことを除き、実施例１の（１）と同様にして蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。なお、前記被験物質として、ＴＲＰチャネルに対する既知のアンタゴニストであるルテニウムレッド〔シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製〕、ＴＲＰＡ１に対してブロッカーとして作用し、かつＴＲＰＶ１を活性化させる物質であるカンファー〔シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製〕、ＴＲＰＶ１に対するアンタゴニストであるカプサゼピン〔シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製〕およびマルチトール〔（株）林原生物化学研究所製〕を用いた。各混合物中における被験物質の濃度は、それぞれ、ルテニウムレッドが１０μＭ、カンファーが５ｍＭ、カプサゼピンが１０μＭ、マンニトールが５ｍＭとした。測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比ａを算出した。前記Δ蛍光強度比ａは、下記式（ＶＩ）：
【００９８】
【数６】
【００９９】
に基づいて算出した。
【０１００】
また、実施例１の（１）において、前記溶媒Ａで洗浄した後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、アルコール水溶液の代わりに、１Ｍジプロピレングリコール水溶液を還流したことを除き、実施例１の（１）と同様にして、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比ｂを算出した。前記Δ蛍光強度比ｂは、下記式（ＶＩＩ）：
【０１０１】
【数７】
【０１０２】
に基づいて算出した。
【０１０３】
算出されたΔ蛍光強度比ａおよびΔ蛍光強度比ｂを用い、ジプロピレングリコールによるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する被験物質による抑制率を、式（ＶＩＩＩ）：
【０１０４】
【数８】
【０１０５】
に基づき算出した。実施例２において、各試料と抑制率との関係を示すグラフを図５に示す。
【０１０６】
図５において、試料番号１はルテニウムレッドを用いた場合の抑制率、試料番号２はカンファーを用いた場合の抑制率、試料番号３はカプサゼピンを用いた場合の抑制率、試料番号４はマンニトールを用いた場合の抑制率を示す。
【０１０７】
一方、前記ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を用いたことを除き、前記と同様にして、Δ蛍光強度比ａおよびΔ蛍光強度比ｂそれぞれを算出した。算出されたΔ蛍光強度比ａおよびΔ蛍光強度比ｂを用い、ジプロピレングリコールによるＴＲＰＶ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する被験物質による抑制率を、前記式（ＶＩＩＩ）に基づき算出した。実施例２において、各試料と抑制率との関係を示すグラフを図６に示す。
【０１０８】
図６において、試料番号１はルテニウムレッドを用いた場合の抑制率、試料番号２はカンファーを用いた場合の抑制率、試料番号３はカプサゼピンを用いた場合の抑制率、試料番号４はマンニトールを用いた場合の抑制率を示す。
【０１０９】
図５および図６に示された結果から、ルテニウムレッドを用いた場合、ジプロピレングリコールによるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する抑制率およびジプロピレングリコールによるＴＲＰＶ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する抑制率がいずれも４０％以上となっていることがわかる。これに対して、カンファー、カプサゼピンまたはマンニトールを用いた場合には、ジプロピレングリコールによるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する抑制率およびジプロピレングリコールによるＴＲＰＶ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する抑制率のいずれかまたは両者が２０％以下となっていることがわかる。
【０１１０】
したがって、これらの結果から、被験物質のうち、ルテニウムレッドは、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールによる刺激に対して最も高い抑制効果を示すことが示唆される。
【０１１１】
以上の結果から、被験物質と、エタノールまたは多価アルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させ、該エタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、簡便な操作で、当該被験物質がアルコール刺激抑制物質であるか否かを評価することができることがわかる。また、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いることの代わりに、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１を共発現するＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合であっても、エタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象を測定することができるため、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いる場合と同様に、簡便な操作で、当該被験物質がアルコール刺激抑制物質であるか否かを評価することができることがわかる。
【０１１２】
（試験例１）
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
実施例１の（１）において、前記溶媒Ａで洗浄した後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、アルコール水溶液として、１ｍＭメタノール水溶液、１ｍＭエタノール水溶液、１ｍＭプロパノール水溶液、１ｍＭブタノール水溶液、１ｍＭペンチルアルコール水溶液、１ｍＭヘキシルアルコール水溶液、１ｍＭヘプチルアルコール水溶液または１ｍＭオクチルアルコール水溶液を還流したことを除き、実施例１の（１）と同様にしてΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。なお、１ｍＭヘプチルアルコール水溶液は、前記溶媒Ａによって、１Ｍヘプチルアルコールエタノール水溶液を１／１０００倍のヘプチルアルコール濃度となるように希釈した溶液である。また、１ｍＭオクチルアルコール水溶液は、前記溶媒Ａによって、１Ｍオクチルアルコール水溶液を１／１０００倍のオクチルアルコール濃度となるように希釈した溶液である。
【０１１３】
試験例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を示すグラフを図７に示す。
【０１１４】
図７において、試料番号１は１ｍＭメタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１ｍＭプロピルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１ｍＭブチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は１ｍＭペンチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は１ｍＭヘキシルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１ｍＭヘプチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は１ｍＭオクチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【０１１５】
図７に示された結果から、炭素数７〜８のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合（試料番号７〜８）、炭素数の増加に伴って、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが大きくなっており、しかも、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが０を大きく超えていることがわかる。
【０１１６】
したがって、これらの結果から、炭素数７〜８のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合、ＴＲＰＡ１発現細胞に接触させるアルコールの量が１ｍＭであっても、当該アルコールによるＴＲＰＡ１の活性化を良好に検出することができることがわかる。
【０１１７】
（２）ＴＲＰＶ１発現細胞による評価
前記（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに製造例２で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＶ１に対する既知のアゴニストであるカプサイシン（１μＭカプサイシン水溶液）を用いたことを除き、前記（１）と同様にして、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【０１１８】
試験例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を示すグラフを図８に示す。
【０１１９】
図８において、試料番号１は１ｍＭメタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１ｍＭプロピルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１ｍＭブチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は１ｍＭペンチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は１ｍＭヘキシルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１ｍＭヘプチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は１ｍＭオクチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【０１２０】
図８に示された結果から、炭素数１〜６のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合（試料番号１〜６）、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストがほぼ０であり、当該アルコールによるＴＲＰＡ１の活性化を検出することが困難であることがわかる。これに対して、炭素数７〜８のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合（試料番号７〜８）、炭素数の増加に伴って、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが大きくなっており、しかも、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが０を大きく超えていることがわかる。
【０１２１】
したがって、これらの結果から、炭素数７〜８のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合、ＴＲＰＶ１発現細胞に接触させるアルコールの量が１ｍＭであっても、当該アルコールによるＴＲＰＶ１の活性化を良好に検出することができることがわかる。
【０１２２】
以上説明したように、炭素数７〜８のアルコールは、低濃度で用いた場合であっても、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１の両方を活性化させることがわかる。なお、炭素数９〜１０のアルコールも、炭素数７〜８のアルコールの場合と同様の傾向を示した。したがって、炭素数７以上のアルコールによる刺激を抑制する物質の評価は、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させる当該アルコールの量が少なくても、高感度で行なうことができることが示唆される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール刺激抑制物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトの皮膚に用いられる化粧料などの皮膚外用剤の開発などに有用なアルコール刺激抑制物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚に用いられる化粧料などの皮膚外用剤には、必要により、爽快感や清涼感を付与するための清涼化剤や、皮膚の保湿のための保湿剤が配合されている。前記清涼化剤として、例えば、エタノールなどが用いられている。また、前記保湿剤として、ジプロピレングリコールなどの多価アルコールが用いられている。
【０００３】
しかしながら、前記エタノールや多価アルコールなどのアルコールを配合した皮膚外用剤を用いた場合、使用者によっては皮膚に痛みや灼熱感などの不快な刺激を感じることがあるため、アルコールによる不快な刺激を抑制することが求められている。
【０００４】
ところで、一過性受容体電位チャネル（以下、「ＴＲＰチャネル」という）は、痛みを惹起する因子を受容する受容体として機能することが知られている。例えば、ＴＲＰチャネルの１つであるＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化が、パラベン類やアルカリ剤が配合された皮膚外用剤を用いたときに引き起こされる不快な刺激と関連していることが、本発明者らによって見出されている。また、前記パラベン類やアルカリ剤による刺激と前記ＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化との関連性を利用して、パラベン類やアルカリ剤による刺激を抑制する物質を評価することが提案されている（例えば、特許文献１および２参照）。
【０００５】
しかしながら、本発明者らは、現時点では、アルコールによる刺激とＴＲＰＡ１との関連性や当該関連性を利用して、アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価する方法を具体的に記載した文献を発見していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−７９５２８号公報
【特許文献２】特開２００９−８２０５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価することができるアルコール刺激抑制物質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）被験物質とアルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞と接触させ、アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびアルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とするアルコール刺激抑制物質の評価方法、
（２）前記生理学的事象が、アルコールとの接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である前記（１）に記載の評価方法、
（３）前記ＴＲＰＡ１発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である前記（１）または（２）に記載の評価方法、
（４）前記ＴＲＰＶ１発現細胞が、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の評価方法、
（５）前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である前記（１）または（２）に記載の評価方法、ならびに
（６）前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞である前記（３）〜（５）のいずれかに記載の評価方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法は、アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図２】実施例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図３】比較例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図４】比較例２において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図５】実施例２において、各試料と抑制率との関係を示すグラフである。
【図６】実施例２において、各試料と抑制率との関係を示すグラフである。
【図７】試験例１において、各試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図８】試験例１において、各試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法は、被験物質とアルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞に接触させ、アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびアルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする。
【００１２】
本発明者らは、アルコールを、ＴＲＰチャネルを発現する種々の細胞と接触させたとき、ＴＲＰチャネルのうち、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１両方が活性化するが、ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＶ２のいずれもが活性化しないことを見出した。さらに、本発明者らは、被験物質の存在下において、アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびアルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、前記被験物質がアルコールによる皮膚などへの刺激を抑制する物質であるか否かを評価することができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００１３】
以下、アルコールによる皮膚などへの刺激をアルコール刺激という。また、本明細書において、アルコール刺激抑制物質とは、前記アルコール刺激を抑制する物質をいう。
【００１４】
本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法は、被験物質とアルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞と接触させる点に１つの大きな特徴がある。本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法によれば、アルコールによってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象に対する被験物質の影響およびアルコールによってＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象に対する被験物質の影響を簡便な操作で測定することができるので、被験物質がアルコール刺激を抑制するか否かを簡便な操作で評価することができる。
【００１５】
また、本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法には、被験物質を評価する際に、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いているか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いている点にも１つの大きな特徴がある。このように、本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法によれば、実験動物などと比べて、低コストで、かつ取扱いが簡便な細胞を用いるので、前記アルコール刺激抑制物質を低コストで評価することができる。
【００１６】
前記被験物質としては、特に限定されないが、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物などが挙げられる。前記被験物質は、そのまま用いてもよく、必要に応じて、溶媒に溶解させて用いてもよい。前記溶媒は、前記生理学的事象の測定に影響を与えない溶媒であることが好ましい。前記溶媒としては、例えば、生理的食塩水、水などが挙げられる。
【００１７】
本明細書において、前記アルコールとは、一価アルコールおよび多価アルコールをいう。
【００１８】
前記一価アルコールとしては、例えば、脂肪族一価アルコールなどが挙げられる。前記一価アルコールは、当該一価アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で的確に評価する観点から、好ましくは炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコール、より好ましくは炭素数２〜８の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコールである。前記炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコールとしては、例えば、エタノール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、ペンチルアルコール、ヘキシルアルコール、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、ノニルアルコール、デシルアルコールなどが挙げられる。
【００１９】
前記多価アルコールとしては、例えば、皮膚外用剤に配合される多価アルコールなどが挙げられる。前記皮膚外用剤に配合される多価アルコールとしては、例えば、脂肪族多価アルコールなどが挙げられる。前記多価アルコールは、当該多価アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で的確に評価する観点から、好ましくは炭素数２〜６の脂肪族二価アルコール、より好ましくは炭素数３〜６の脂肪族二価アルコールである。前記炭素数２〜６の脂肪族二価アルコールとしては、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ペンチレングリコール、ヘキシレングリコールなどが挙げられる。
【００２０】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、マスタード、シナモアルデヒド、アリルイソチオシアネート、カルバクロール、アリシンなどによる化学刺激、冷覚刺激（例えば、１７℃前後での刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。
【００２１】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＡ１発現細胞」ともいう）が好ましい。
【００２２】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞は、ＴＲＰＶ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＶ１の生理学的機能としては、例えば、カプサイシン、カンフル、プロトンなどによる化学刺激、熱覚刺激（例えば、４３℃前後の刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。
【００２３】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＶ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＶ１発現細胞」ともいう）が好ましい。
【００２４】
前記内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、内耳の細胞などが挙げられる。また、前記内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、脳の細胞、膀胱上皮の細胞などが挙げられる。
【００２５】
前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸がいずれも発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞においては、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記アルコールによってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象をそれぞれ測定する観点から、それぞれ別々の発現プロモーターの制御下にあることが好ましい。発現プロモーターは、宿主細胞内でＴＲＰＡ１を発現させるのに適したプロモーターであればよい。発現プロモーターは、用いられる宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、染色体外要素として前記核酸が存在している細胞であってもよく、前記核酸が染色体に組み込まれている細胞であってもよい。
【００２７】
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。また、前記外因性ＴＲＰＶ１発現細胞は、ＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。
【００２８】
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。また、前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよい。
【００２９】
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトに適用することができるアルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、好ましくはヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸である。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。
【００３０】
また、前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトに適用することができるアルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、好ましくはヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸である。前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：３に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿０８０７０４．３としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＶ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。また、ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸とオルタナティブスプライシングを介して異なるスプライシングバリアントであってもよい。前記スプライシングバリアントとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８７２７．５、ＮＭ＿０８０７０５．３、ＮＭ＿０８０７０６．３などの塩基配列で示される核酸が挙げられる。
【００３１】
ＴＲＰＡ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
【００３２】
また、ＴＲＰＶ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（ａ）配列番号：３に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｂ）配列番号：４において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｃ）配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
【００３３】
なお、本明細書において、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸または配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸と、前記核酸に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられる。
【００３４】
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：３に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：３に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。
【００３５】
前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸および／またはＴＲＰＶ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。これらのなかでは、ヒトにおけるＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１の生理学的機能を十分に再現する観点から、好ましくは動物細胞である。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞などが挙げられる。サル細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。マウス細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。ヒト細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。前記宿主細胞のなかでは、取扱いが容易であり、アルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。これらのなかでは、ＴＲＰチャネルがほとんど発現しておらず、外因性のＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１の活性化を容易にかつ選択的に測定することができる観点およびヒトへの適用に適したアルコール刺激抑制剤を的確に評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞が好ましい。
【００３６】
前記組換えベクターは、ＴＲＰＡ１をコードする核酸および／またはＴＲＰＶ１をコードする核酸と慣用のベクターとを連結させることによって得られるベクターである。前記ベクターは、調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。前記ベクターは、形質転換後に、組換えベクターを保持する細胞を容易に選択する観点から、好ましくは選択マーカー遺伝子を有するベクターである。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。これらのベクターは、用いられる宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞および外因性ＴＲＰＶ１発現細胞を作製するための組換えベクターに用いられるベクターは、発現プロモーターを有していてもよい。
【００３７】
前記組換えベクターを用いた形質転換は、用いられる宿主細胞の種類に応じて、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などの形質転換方法によって行なうことができる。これらの形質転換方法は、例えば、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕などの記載に準じて行なうことができる。形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどによって行なうことができる。
【００３８】
得られた細胞が、ＴＲＰＡ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＡ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。また、得られた細胞が、ＴＲＰＶ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１００ｎＭ〜１０μＭカプサイシンと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＶ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、カプサイシンと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。
【００３９】
被験物質と、アルコールと、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞との接触は、例えば、各細胞の培養に適した培地中で、被験物質と、アルコールと、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞とをインキュベーションすること、被験物質と、アルコールと、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞との混合物をインキュベーションすることなどによって行なわれる。なお、ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いる場合、アルコールによってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象をそれぞれ測定するタイミングに合わせて、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１をそれぞれ別々に発現させるようにする。
【００４０】
前記培地としては、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞が生育するのに適した成分〔例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質など）、血清（例えば、ウシ胎仔血清など）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど〕を含む培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に前記成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。基本培地としては、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地などが挙げられる。かかる培地は、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、用いられる細胞がＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞である場合、培地として、１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。
【００４１】
ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞の各使用量は、試験データの信頼性の観点から、１視野（データ解析範囲）あたり、それぞれ１×１０1細胞以上が好ましく、１×１０2細胞以上がより好ましく、細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎないようにする観点から、３×１０２細胞以下が好ましく、２×１０２細胞以下がより好ましい。
【００４２】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させる被験物質の量は、被験物質の種類に応じて適宜設定することができる。
【００４３】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させるアルコールの量は、例えば、当該アルコールが炭素数２〜６の脂肪族一価アルコールまたは炭素数２〜６の多価アルコールである場合、通常、皮膚外用剤に配合される量のアルコールによる刺激を再現し、アルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、細胞１×１０2個あたり、１００ｍＭ以上であることが好ましく、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１以外の因子による応答を抑制する観点から、５Ｍ以下であることが好ましく、２Ｍ以下であることがより好ましく、１Ｍ以下であることがさらに好ましい。
【００４４】
また、前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させるアルコールの量は、例えば、当該アルコールが炭素数７〜８の脂肪族一価アルコールである場合、アルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、細胞１×１０2個あたり、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、０．５ｍＭ以上であることがより好ましく、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１以外の因子による応答を抑制する観点から、５ｍＭ以下であることが好ましく、２ｍＭ以下であることがより好ましい。
【００４５】
さらに、前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させるアルコールの量は、例えば、当該アルコールが炭素数９〜１０の脂肪族一価アルコールである場合、細胞とアルコールとの接触時に用いられる培地への炭素数９〜１０の脂肪族一価アルコールの溶解度などにより異なるので一概には決定することができない。
【００４６】
なお、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、それぞれ、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持するために、必要に応じて、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を、各細胞に適した条件下で、予めインキュベーションしておいてもよい。
【００４７】
前記インキュベーションは、用いられる細胞の種類に応じた方法によって行なうことができる。かかる方法としては、例えば、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法などが挙げられる。また、インキュベーション温度、インキュベーション時間、二酸化炭素濃度などの条件は、用いられる細胞に応じて適宜設定される。例えば、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞として、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞を用いる場合、かかる細胞は、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持する観点から、通常、５体積％二酸化炭素を含む雰囲気中で、３６〜３８℃、好ましくは３６．５〜３７．５℃でインキュベーションすればよい。
【００４８】
前記生理学的事象としては、アルコールとの接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化、アルコールとの接触前後の一定電位下での電流の変化、これらの組み合わせなどが挙げられる。本発明においては、簡便な操作で、かつ高感度で測定することができる観点から、前記生理学的事象は、好ましくはアルコールとの接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である。
【００４９】
前記一定の電位での電流の測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。
【００５０】
ここで、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いた場合、被験物質がアルコール刺激抑制物質であることの判断基準としては、例えば、アルコールと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における一定の電位下での電流と比べて、被験物質とアルコールとを接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が小さくなっており、かつアルコールと接触させたＴＲＰＶ１発現細胞における一定の電位下での電流と比べて、被験物質とアルコールとを接触させたＴＲＰＶ１発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が小さくなっていること、すなわち、被験物質によって、アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる一定の電位下での電流の増加およびアルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる一定の電位下での電流の増加が抑制されていることなどが挙げられる。
【００５１】
また、ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合、被験物質がアルコール刺激抑制物質であることの判断基準としては、ＴＲＰＡ１を発現させるとともにアルコールと接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における一定の電位下での電流と比べて、ＴＲＰＡ１を発現させるとともに被験物質とアルコールとを接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が小さくなっており、かつＴＲＰＶ１を発現させるとともにアルコールと接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における一定の電位下での電流と比べて、ＴＲＰＶ１を発現させるとともに被験物質とアルコールとを接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が小さくなっていることなどが挙げられる。
【００５２】
細胞内カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を調べる方法などを用いて算出することができる。前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンと結合した当該蛍光カルシウム指示薬の量によってその蛍光特性が変化する試薬であればよく、特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ ２、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられる。
【００５３】
なお、蛍光カルシウム指示薬が２種類の励起波長を有する場合、より精度を高める観点から、各励起波長における蛍光強度から蛍光強度比を算出することが好ましい。例えば、蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭの励起波長は、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍである。この場合、ＴＲＰＡ１またはＴＲＰＶ１のアゴニストと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度に対する被験物質およびアルコールと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、式（Ｉ）：
【００５４】
【数１】
【００５５】
に基づいて、変化率（％）を算出することにより調べることができる。なお、前記Δ蛍光強度比Aは、式（ＩＩ）：
【００５６】
【数２】
【００５７】
に基づいて算出することができる。また、前記Δ蛍光強度比Bは、式（ＩＩＩ）：
【００５８】
【数３】
【００５９】
に基づいて算出することができる。なお、本明細書において、「蛍光強度340nm」は励起波長３４０ｎｍにおける蛍光強度を示し、「蛍光強度380nm」は励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度を示す。
【００６０】
ここで、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いた場合、被験物質がアルコール刺激抑制物質であることの判断基準としては、例えば、アルコールに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と比べて、被験物質とアルコールとに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度が低くなっており、かつアルコールに接触させたＴＲＰＶ１発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と比べて、被験物質とアルコールとに接触させたＴＲＰＶ１発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度が低くなっていること、すなわち、被験物質によって、アルコールによってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウム濃度の増加およびアルコールによってＴＲＰＶ１を介して引き起こされる細胞内カルシウム濃度の増加が抑制されていることなどが挙げられる。
【００６１】
また、ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合、被験物質がアルコール刺激抑制物質であることの判断基準としては、
（ａ）ＴＲＰＡ１を発現させるとともに、アルコールに接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と比べて、ＴＲＰＡ１を発現させるとともに、被験物質とアルコールとに接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度が低くなっていること、
（ｂ）ＴＲＰＶ１を発現させるとともに、アルコールに接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と比べて、ＴＲＰＶ１を発現させるとともに、被験物質とアルコールとに接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度が低くなっていること
などが挙げられる。
【００６２】
本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法により、アルコール刺激抑制物質であることが判明した被験物質は、例えば、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールを配合した化粧品、皮膚外用剤などにより皮膚などで引き起こされる感覚刺激を抑制する成分として用いることができる。したがって、本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法によれば、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールによって皮膚トラブルを生じやすい人に適した化粧品、皮膚外用剤などの成分の評価およびスクリーニングが可能になる。
【実施例】
【００６３】
以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００６４】
（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μｌとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μｌと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μｌとを混合し、混合物ＩＩを得た。
【００６５】
また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。
【００６６】
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
【００６７】
（製造例２）
製造例１において、ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＶ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ＿０８０７０４．３）に示される塩基配列の２７６位〜２７９５位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＶ１発現細胞を得た。
【００６８】
（製造例３）
製造例１において、ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＭ８をコードするｃＤＮＡ〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２４０８０．４に示される塩基配列の４１位〜３３５５位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＭ８発現細胞を得た。
【００６９】
（製造例４）
製造例１において、ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＶ２をコードするｃＤＮＡ〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１６１１３．３に示される塩基配列の３６８位〜２６６２位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＶ２発現細胞を得た。
【００７０】
（実施例１）
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
前記製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
【００７１】
得られたＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。
【００７２】
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、試料として、アルコール水溶液を還流し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞とアルコール水溶液とを混合した。なお、前記アルコール水溶液として、２００ｍＭエタノール水溶液、５００ｍＭエタノール水溶液、１Ｍエタノール水溶液、５Ｍエタノール水溶液、２００ｍＭジプロピレングリコール水溶液、５００ｍＭジプロピレングリコール水溶液、１Ｍジプロピレングリコール水溶液、２００ｍＭプロピレングリコール水溶液、５００ｍＭプロピレングリコール水溶液、１Ｍプロピレングリコール水溶液、２００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液、５００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液または１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた。
【００７３】
その後、チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を測定した。
【００７４】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比アルコールを算出した。前記Δ蛍光強度比アルコールは、下記式（ＩＶ）：
【００７５】
【数４】
【００７６】
に基づいて算出した。
【００７７】
また、アルコール水溶液の代わりにＴＲＰＡ１に対する既知のアゴニストであるアリルイソチオシアナート（２０μＭアリルイソチオシアナート水溶液）を用いたことを除き、前記アルコール水溶液を用いた場合と同様にしてΔ蛍光強度比アゴニストを算出した。前記Δ蛍光強度比アゴニストは、下記式（Ｖ）：
【００７８】
【数５】
【００７９】
に基づいて算出した。
【００８０】
算出されたΔ蛍光強度比アルコールとΔ蛍光強度比アゴニストとから、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００８１】
実施例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図１に示す。
【００８２】
図１において、試料番号１は２００ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は５００ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は５Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は２００ｍＭジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は５００ｍＭジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１Ｍジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は２００ｍＭプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号９は５００ｍＭプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１０は１Ｍプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１１は２００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１２は５００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号１３は１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【００８３】
図１に示された結果から、エタノール水溶液（試料番号１〜４）、ジプロピレングリコール水溶液（試料番号５〜７）、プロピレングリコール水溶液（試料番号８〜１０）および１，３−ブチレングリコール水溶液（試料番号１１〜１３）のいずれのアルコール水溶液を用いた場合であっても、アルコール水溶液におけるアルコールの濃度に依存して、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが大きくなっていることがわかる。これらの結果から、ＴＲＰＡ１を活性化させて細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることが知られているアリルイソチオシアナートと同様に、エタノール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコールおよび１，３−ブチレングリコールは、ＴＲＰＡ１を濃度依存的に活性化させ、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることがわかる。
【００８４】
（２）ＴＲＰＶ１発現細胞による評価
前記（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに製造例２で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＶ１に対する既知のアゴニストであるカプサイシン（１μＭカプサイシン水溶液）を用いたことを除き、前記（１）と同様にして、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００８５】
実施例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図２に示す。
【００８６】
図２において、試料番号１は２００ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は５００ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は５Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は２００ｍＭジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は５００ｍＭジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１Ｍジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は２００ｍＭプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号９は５００ｍＭプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１０は１Ｍプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１１は２００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１２は５００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号１３は１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【００８７】
図２に示された結果から、エタノール水溶液（試料番号１〜４）、ジプロピレングリコール水溶液（試料番号５〜７）、プロピレングリコール水溶液（試料番号８〜１０）および１，３−ブチレングリコール水溶液（試料番号１１〜１３）のいずれのアルコール水溶液を用いた場合であっても、濃度に依存して、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが大きくなっていることがわかる。これらの結果から、ＴＲＰＶ１を活性化させて細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることが知られているカプサイシンと同様に、エタノール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコールおよび１，３−ブチレングリコールは、ＴＲＰＶ１を濃度依存的に活性化させ、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることがわかる。
【００８８】
（比較例１）
実施例１の（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに、製造例３で得られたＴＲＰＭ８発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＭ８に対する既知のアゴニストであるメントール（１ｍＭメントール水溶液）を用いたことを除き、前記（１）と同様にしてΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００８９】
比較例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図３に示す。
【００９０】
図３において、試料番号１は１Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１Ｍジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１Ｍプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【００９１】
図３に示された結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれにおけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト（図１および２）と比べて、ＴＲＰＭ８発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストは、エタノール水溶液、ジプロピレングリコール水溶液、プロピレングリコール水溶液および１，３−ブチレングリコール水溶液のいずれのアルコール水溶液を用いた場合であっても、著しく小さいことがわかる。これらの結果から、エタノール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコールおよび１，３−ブチレングリコールは、ＴＲＰＭ８をほとんど活性化させず、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させないことがわかる。
【００９２】
（比較例２）
実施例１の（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに、製造例４で得られたＴＲＰＶ２発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＶ２に対する既知のアゴニストであるリソフォスファチジルコリン（３０μＭリソフォスファチジルコリン水溶液）を用いたことを除き、前記実施例１の（１）と同様にして、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００９３】
比較例２において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図４に示す。
【００９４】
図４において、試料番号１は１Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１Ｍジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１Ｍプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【００９５】
図４に示された結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれにおけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト（図１および２）と比べて、ＴＲＰＶ２発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストは、エタノール水溶液、ジプロピレングリコール水溶液、プロピレングリコール水溶液および１，３−ブチレングリコール水溶液のいずれのアルコール水溶液を用いた場合であっても、著しく小さいことがわかる。これらの結果から、エタノール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコールおよび１，３−ブチレングリコールは、ＴＲＰＶ２をほとんど活性化させず、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させないことがわかる。
【００９６】
以上説明したように、エタノールおよび炭素数２〜６の多価アルコールは、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１の両方を活性化させるが、ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＶ２を活性化させないことがわかる。したがって、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞の両方を用いて、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象と、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象とを測定することにより、エタノールおよび炭素数２〜６の多価アルコールによる刺激を抑制する物質を評価することができることが示唆される。
【００９７】
（実施例２）
実施例１の（１）において、前記溶媒Ａで洗浄した後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、アルコール水溶液の代わりに、被験物質と１Ｍジプロピレングリコール水溶液との混合物を還流したことを除き、実施例１の（１）と同様にして蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。なお、前記被験物質として、ＴＲＰチャネルに対する既知のアンタゴニストであるルテニウムレッド〔シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製〕、ＴＲＰＡ１に対してブロッカーとして作用し、かつＴＲＰＶ１を活性化させる物質であるカンファー〔シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製〕、ＴＲＰＶ１に対するアンタゴニストであるカプサゼピン〔シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製〕およびマルチトール〔（株）林原生物化学研究所製〕を用いた。各混合物中における被験物質の濃度は、それぞれ、ルテニウムレッドが１０μＭ、カンファーが５ｍＭ、カプサゼピンが１０μＭ、マンニトールが５ｍＭとした。測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比ａを算出した。前記Δ蛍光強度比ａは、下記式（ＶＩ）：
【００９８】
【数６】
【００９９】
に基づいて算出した。
【０１００】
また、実施例１の（１）において、前記溶媒Ａで洗浄した後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、アルコール水溶液の代わりに、１Ｍジプロピレングリコール水溶液を還流したことを除き、実施例１の（１）と同様にして、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比ｂを算出した。前記Δ蛍光強度比ｂは、下記式（ＶＩＩ）：
【０１０１】
【数７】
【０１０２】
に基づいて算出した。
【０１０３】
算出されたΔ蛍光強度比ａおよびΔ蛍光強度比ｂを用い、ジプロピレングリコールによるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する被験物質による抑制率を、式（ＶＩＩＩ）：
【０１０４】
【数８】
【０１０５】
に基づき算出した。実施例２において、各試料と抑制率との関係を示すグラフを図５に示す。
【０１０６】
図５において、試料番号１はルテニウムレッドを用いた場合の抑制率、試料番号２はカンファーを用いた場合の抑制率、試料番号３はカプサゼピンを用いた場合の抑制率、試料番号４はマンニトールを用いた場合の抑制率を示す。
【０１０７】
一方、前記ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を用いたことを除き、前記と同様にして、Δ蛍光強度比ａおよびΔ蛍光強度比ｂそれぞれを算出した。算出されたΔ蛍光強度比ａおよびΔ蛍光強度比ｂを用い、ジプロピレングリコールによるＴＲＰＶ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する被験物質による抑制率を、前記式（ＶＩＩＩ）に基づき算出した。実施例２において、各試料と抑制率との関係を示すグラフを図６に示す。
【０１０８】
図６において、試料番号１はルテニウムレッドを用いた場合の抑制率、試料番号２はカンファーを用いた場合の抑制率、試料番号３はカプサゼピンを用いた場合の抑制率、試料番号４はマンニトールを用いた場合の抑制率を示す。
【０１０９】
図５および図６に示された結果から、ルテニウムレッドを用いた場合、ジプロピレングリコールによるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する抑制率およびジプロピレングリコールによるＴＲＰＶ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する抑制率がいずれも４０％以上となっていることがわかる。これに対して、カンファー、カプサゼピンまたはマンニトールを用いた場合には、ジプロピレングリコールによるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する抑制率およびジプロピレングリコールによるＴＲＰＶ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する抑制率のいずれかまたは両者が２０％以下となっていることがわかる。
【０１１０】
したがって、これらの結果から、被験物質のうち、ルテニウムレッドは、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールによる刺激に対して最も高い抑制効果を示すことが示唆される。
【０１１１】
以上の結果から、被験物質と、エタノールまたは多価アルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させ、該エタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、簡便な操作で、当該被験物質がアルコール刺激抑制物質であるか否かを評価することができることがわかる。また、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いることの代わりに、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１を共発現するＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合であっても、エタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象を測定することができるため、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いる場合と同様に、簡便な操作で、当該被験物質がアルコール刺激抑制物質であるか否かを評価することができることがわかる。
【０１１２】
（試験例１）
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
実施例１の（１）において、前記溶媒Ａで洗浄した後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、アルコール水溶液として、１ｍＭメタノール水溶液、１ｍＭエタノール水溶液、１ｍＭプロパノール水溶液、１ｍＭブタノール水溶液、１ｍＭペンチルアルコール水溶液、１ｍＭヘキシルアルコール水溶液、１ｍＭヘプチルアルコール水溶液または１ｍＭオクチルアルコール水溶液を還流したことを除き、実施例１の（１）と同様にしてΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。なお、１ｍＭヘプチルアルコール水溶液は、前記溶媒Ａによって、１Ｍヘプチルアルコールエタノール水溶液を１／１０００倍のヘプチルアルコール濃度となるように希釈した溶液である。また、１ｍＭオクチルアルコール水溶液は、前記溶媒Ａによって、１Ｍオクチルアルコール水溶液を１／１０００倍のオクチルアルコール濃度となるように希釈した溶液である。
【０１１３】
試験例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を示すグラフを図７に示す。
【０１１４】
図７において、試料番号１は１ｍＭメタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１ｍＭプロピルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１ｍＭブチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は１ｍＭペンチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は１ｍＭヘキシルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１ｍＭヘプチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は１ｍＭオクチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【０１１５】
図７に示された結果から、炭素数７〜８のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合（試料番号７〜８）、炭素数の増加に伴って、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが大きくなっており、しかも、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが０を大きく超えていることがわかる。
【０１１６】
したがって、これらの結果から、炭素数７〜８のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合、ＴＲＰＡ１発現細胞に接触させるアルコールの量が１ｍＭであっても、当該アルコールによるＴＲＰＡ１の活性化を良好に検出することができることがわかる。
【０１１７】
（２）ＴＲＰＶ１発現細胞による評価
前記（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに製造例２で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＶ１に対する既知のアゴニストであるカプサイシン（１μＭカプサイシン水溶液）を用いたことを除き、前記（１）と同様にして、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【０１１８】
試験例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を示すグラフを図８に示す。
【０１１９】
図８において、試料番号１は１ｍＭメタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１ｍＭプロピルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１ｍＭブチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は１ｍＭペンチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は１ｍＭヘキシルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１ｍＭヘプチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は１ｍＭオクチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【０１２０】
図８に示された結果から、炭素数１〜６のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合（試料番号１〜６）、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストがほぼ０であり、当該アルコールによるＴＲＰＡ１の活性化を検出することが困難であることがわかる。これに対して、炭素数７〜８のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合（試料番号７〜８）、炭素数の増加に伴って、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが大きくなっており、しかも、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが０を大きく超えていることがわかる。
【０１２１】
したがって、これらの結果から、炭素数７〜８のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合、ＴＲＰＶ１発現細胞に接触させるアルコールの量が１ｍＭであっても、当該アルコールによるＴＲＰＶ１の活性化を良好に検出することができることがわかる。
【０１２２】
以上説明したように、炭素数７〜８のアルコールは、低濃度で用いた場合であっても、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１の両方を活性化させることがわかる。なお、炭素数９〜１０のアルコールも、炭素数７〜８のアルコールの場合と同様の傾向を示した。したがって、炭素数７以上のアルコールによる刺激を抑制する物質の評価は、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させる当該アルコールの量が少なくても、高感度で行なうことができることが示唆される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質とエタノールまたは多価アルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞と接触させ、エタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびエタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とするアルコール刺激抑制物質の評価方法。
【請求項２】
前記生理学的事象が、エタノールまたは多価アルコールとの接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞が、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である請求項１〜３のいずれかに記載の評価方法。
【請求項５】
前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項６】
前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞である請求項３〜５のいずれかに記載の評価方法。
【請求項１】
被験物質とエタノールまたは多価アルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞と接触させ、エタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびエタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とするアルコール刺激抑制物質の評価方法。
【請求項２】
前記生理学的事象が、エタノールまたは多価アルコールとの接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞が、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である請求項１〜３のいずれかに記載の評価方法。
【請求項５】
前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項６】
前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞である請求項３〜５のいずれかに記載の評価方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−２０５９７５（Ｐ２０１１−２０５９７５Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７７２８６（Ｐ２０１０−７７２８６）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【出願人】（５０４２６１０７７）大学共同利用機関法人自然科学研究機構 (156)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【出願人】（５０４２６１０７７）大学共同利用機関法人自然科学研究機構 (156)
【Ｆターム（参考）】
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