アルツハイマー病の予防及び治療薬並びにアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法
【課題】脳内のＡβの分解効率を飛躍的に向上させアルツハイマー病の発症及び進行を顕著に抑制し得るアルツハイマー病の予防及び治療薬を提供する。
【解決手段】リポプロテインリパーゼを有効成分とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬である。本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬は、脳内に投与されることにより、ＬＰＬが脳内のミクログリアやアストロサイト等の細胞内へのＡβの取り込みを促進し、取り込まれたＡβは細胞内で速やかに分解されるので、脳内のＡβの分解効率を飛躍的に向上させ、脳内でのＡβの蓄積を顕著に抑制する。
【解決手段】リポプロテインリパーゼを有効成分とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬である。本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬は、脳内に投与されることにより、ＬＰＬが脳内のミクログリアやアストロサイト等の細胞内へのＡβの取り込みを促進し、取り込まれたＡβは細胞内で速やかに分解されるので、脳内のＡβの分解効率を飛躍的に向上させ、脳内でのＡβの蓄積を顕著に抑制する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の予防及び治療薬並びにアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、認知機能低下、人格の変化を主な症状とする認知症をきたす神経変性疾患である。アルツハイマー病の主要な病理変化には老人斑と神経原線維変化があるが、老人斑は発症の早期から認められ、その主要構成成分はアミロイドβ蛋白質（Ａβ：Ａｍｙｌｏｉｄ β）である。Ａβはアミノ酸が連なったペプチドであり、比較的疾患特異性は高いが、正常脳でも認められる。Ａβは細胞外に蓄積し老人斑を形成するとともに、神経細胞内においても蓄積が認められる場合がある。従来は蓄積したＡβに神経毒性があると考えられてきたが、近年の研究からＡβの重合体がシナプスや神経細胞に対して毒性を発揮し、神経細胞を変性させて最終的には神経細胞の脱落を惹起するものと考えられている。
【０００３】
現在、アルツハイマー病の治療法としては、Ａβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ：Ａｍｙｌｏｉｄ β Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）が切断されてＡβが産生される際にＡＰＰの切断を行うプロテアーゼであるβ−セクレターゼやγ−セクレターゼを阻害する薬剤を投与することにより脳内のＡβ産生を抑制する方法や、Ａβに対する抗体を投与もしくはＡβで免疫することによりＡβに対する抗体の産生を促し脳内Ａβの除去を促進する方法等が知られている。
【０００４】
一方、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ：Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅ）は、リポタンパク質に含まれるトリグリセリドを脂肪酸とモノグリセリドに加水分解する酵素であり、脂肪組織等で合成及び分泌され、毛細血管の血管内皮細胞表面（脂肪細胞外）に存在することが知られている。また、ＬＰＬは、細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンやコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと相互作用し、これらとリポタンパク質とを橋渡しすることにより、リポタンパク質の細胞内への取り込みを促進する作用を有することも知られている。近年、このＬＰＬが、アルツハイマー病の脳において老人斑に共局在していることが確認されている（例えば、非特許文献１又は２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｕｍ、ｅｔ ａｌ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、８８、１３６−１３９（１９９９）
【非特許文献２】Ｂａｕｍ、ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｎｉｑｕｅ、５０、２９１−２９６（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、脳内の主なリポタンパク質画分は高比重リポタンパク（ＨＤＬ：Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）でありトリグリセリドを含まないので、脳内にはＬＰＬの基質が存在せず、また、活性化因子であるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩも脳内には存在しない。従って、脳内ではＬＰＬが酵素活性を発揮する場はないと考えられ、現在のところ、脳内におけるＬＰＬの働きについては殆ど解明されていない。
【０００７】
本発明は、上記従来技術の有する問題点に鑑みなされたものであり、その目的とするところは、脳内のＡβの脳内細胞への取り込みを活性化し、Ａβの分解効率を飛躍的に向上させ、脳内でのＡβの蓄積を抑えてアルツハイマー病の発症及び進行を顕著に抑制し得るアルツハイマー病の予防及び治療薬を提供することにある。
【０００８】
また、本発明の他の目的は、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を簡便かつ高精度に評価することのできるアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の上記目的は、下記の手段によって達成される。
【００１０】
（１）すなわち、本発明は、リポプロテインリパーゼを有効成分とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬である。
【００１１】
（２）本発明はまた、脳内投与用である、（１）に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬である。
【００１２】
（３）また、本発明は、脳内のリポプロテインリパーゼ量を指標とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【００１３】
（４）本発明はまた、動物に被験物質を投与するステップと、前記動物の脳内のリポプロテインリパーゼ量を測定するステップと、を有することを特徴とする、（３）に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【００１４】
（５）本発明はまた、前記動物は、哺乳類である、（４）に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【００１５】
（６）本発明はまた、リポプロテインリパーゼ発現量を指標とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【００１６】
（７）本発明はまた、リポプロテインリパーゼ発現細胞に被験物質を添加するステップと、前記リポプロテインリパーゼ発現細胞のリポプロテインリパーゼ発現量を測定するステップと、を有することを特徴とする、（６）に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【００１７】
（８）本発明はまた、前記リポプロテインリパーゼ発現細胞は、線維芽細胞由来のもの、胎盤由来細胞由来のもの、脂肪細胞由来のもの、骨格筋由来のもの、アストロサイト由来のもの、グリア細胞由来のもの、神経細胞由来のもの、神経系細胞、心筋細胞、血液系細胞若しくは脂肪細胞に分化するもの、乳腺ガン細胞に由来するもの、マクロファージ細胞由来のもの、ミクログリア細胞由来のもの、卵巣由来のもの又は肝細胞由来のものである、（７）に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬は、ＬＰＬを有効成分とするので、脳内に投与されることにより、ＬＰＬが脳内のミクログリアやアストロサイト等の細胞内へのＡβの取り込みを顕著に促進し、取り込まれたＡβは細胞内で速やかに分解されるので、脳内のＡβの分解効率を飛躍的に向上させることができ、脳内でのＡβの蓄積を抑えてアルツハイマー病の発症及び進行を顕著に抑制することができる。
【００１９】
また、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法は、脳内のＬＰＬ量を指標とするので、動物に被験物質を投与して当該動物の脳内ＬＰＬ量を測定することにより、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を簡便かつ高精度に評価することができる。
【００２０】
また、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法によれば、ＬＰＬ発現量を指標とするので、ＬＰＬ発現細胞に被験物質を添加して当該ＬＰＬ発現細胞のＬＰＬ発現量を測定することにより、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を簡便かつ高精度に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ウェスタンブロット法を用いたマウス初代培養アストロサイトによるＡβの取り込み状態を示す図である。
【図２】ウェスタンブロット法によるマウス初代培養アストロサイトとＡβとの結合状態を示す図である。
【図３】免疫沈降法によるＬＰＬとＡβとの結合状態を示す図である。
【図４】ウェスタンブロット法を用いたマウス初代培養アストロサイトによって取り込まれたＡβの分解状態を示す図である。
【図５】ＬＰＬとｐ−ニトロフェニル酢酸塩を反応させ、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した結果を示す図である。
【図６】培養した３Ｔ３−Ｌ１細胞をリン酸緩衝生理食塩水中又はヘパリン含有リン酸緩衝生理食塩水中でインキュベートし、その上清にｐ−ニトロフェニル酢酸塩を加え、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２３】
本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬は、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）を有効成分とするものである。
【００２４】
本発明で利用可能なＬＰＬとしては、ウシ、ヒト、マウス、モルモット等の哺乳類の組織や分泌物から精製されたものや、これらの哺乳類のＬＰＬをコードする遺伝子から既知の遺伝子組み換え技術により製造したもの等が挙げられる。なお、上記哺乳類においては、アルツハイマー病患者やアルツハイマー病病態モデル動物等も含まれる。
【００２５】
本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬は、ＬＰＬに、必要に応じて蒸留水、ｐＨ調整剤、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、抗酸化剤、保存剤等を添加することにより、液状製剤として製造することができる。ｐＨ調整剤としては、塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられ、懸濁化剤としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等が挙げられ、溶解補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等が挙げられ、安定化剤としては、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、エーテル等が挙げられ、等張剤としては、塩化ナトリウム、ぶどう糖等が挙げられ、保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等が挙げられる。
【００２６】
本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬は、患者の脳内に局所投与して利用される。本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬の投与量は、患者、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性差、薬剤に対する感受性差等により著しく異なり、正確な投与量は医師の診断により決定されるものであるが、通常、成人に対し１日あたり、ＬＰＬの投与量換算で、０．００１〜１０００ｍｇを、１日１回又は数回に分けて投与する。
【００２７】
本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬の作用機序は必ずしも明らかではないが、有効成分であるＬＰＬが脳内に投与されると、ＬＰＬとヘパラン硫酸プロテオグリカンやコンドロイチン硫酸プロテオグリカン等のプロテオグリカンとの相互作用により、脳内に存在するＡβが、脳内のミクログリアやアストロサイト等の細胞内に積極的に取り込まれるものと考えられる。一度ミクログリアやアストロサイト等の細胞内にＡβが取り込まれるとＡβは速やかに分解されるので、結果としてＬＰＬの投与により脳内Ａβの分解効率が飛躍的に向上し、脳内でのＡβの蓄積を抑制することにより、アルツハイマー病の発症及び進行を顕著に抑制することができるものである。
【００２８】
また、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法は、脳内のＬＰＬ量を指標とするものである。即ち、本発明のスクリーニング方法は、動物に被験物質を投与し、当該動物の脳内ＬＰＬ量を測定することにより、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を評価するものである。上述のとおり、脳内ＬＰＬ量が増加するとＡβの脳内細胞への取り込みが活性化され脳内Ａβの分解効率が向上するので、被験物質の投与による脳内ＬＰＬ量の変化を観測することにより、被験物質によるアルツハイマー病の予防及び治療効果を簡便かつ高精度に予測することができる。本発明のスクリーニング方法で利用することのできる動物としては、トガリネズミ科、モグラ科、ソレノドン科、ニシインドトガリネズミ科等のトガリネズミ目、ハリネズミ科等のハリネズミ目、オオコウモリ科、オナガコウモリ科、サシオコウモリ科、ブタバナコウモリ科、ミゾコウモリ科、アラコウモリ科、キクガシラコウモリ科、カグラコウモリ科、ウオクイコウモリ科、クチビルコウモリ科、チスイコウモリ科、ヘラコウモリ科、アシナガコウモリ科、ツメナシコウモリ科、スイツキコウモリ科、サラモチコウモリ科、ヒナコウモリ科、ツギホコウモリ科、オヒキコウモリ科等のコウモリ目（翼手目）、コビトキツネザル科、イタチキツネザル科、キツネザル科、インドリ科、アイアイ科、ロリス科、ガラゴ科、メガネザル科、オマキザル科、マーモセット科、オナガザル科、テナガザル科、オランウータン科、ヒト科等のサル目（霊長目）、ウサギ科、ナキウサギ科等のウサギ目（兎目、重歯目）、リス科、グンディ科、ヤマネ科、メクラネズミ科、ヨルマウス科、アシナガマウス科、キヌゲネズミ科、ネズミ科、トビネズミ科、ビーバー科、ウロコオリス科、トビウサギ科、ヤマアラシ科、アメリカヤマアラシ科（キノボリヤマアラシ科）、ヨシネズミ科、デバネズミ上科、デバネズミ科、デグー科、アメリカトビネズミ科、カプロミス科、ヌートリア科、アグーチ科（パカ科）、パカラナ科、テンジクネズミ科、カピバラ科、チンチラ科、チンチラネズミ科等のネズミ目（齧歯目）、ネコ科、マングース科、ジャコウネコ科、ハイエナ科、キノボリジャコウネコ科、イヌ科、レッサーパンダ科、アライグマ科、イタチ科、スカンク科、クマ科、アザラシ科、アシカ科等のネコ目（食肉目）、サイ科、ウマ科、バク科等のウマ目（奇蹄目）、ラクダ科、イノシシ科、ペッカリー科、マメジカ科、ジャコウジカ科、シカ科、キリン科、プロングホーン科、ウシ科、カバ科、マッコウクジラ科、コマッコウ科、アカボウクジラ科、インドカワイルカ科、ヨウスコウカワイルカ科、アマゾンカワイルカ科、ラプラタカワイルカ科、マイルカ科、ネズミイルカ科、イッカク科、セミクジラ科、コセミクジラ科、コククジラ科、ナガスクジラ科等のクジラ偶蹄目（鯨偶蹄目）、ジュゴン科、マナティー科等のジュゴン目（海牛目）等の哺乳類等が挙げられる。
【００２９】
また、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法は、ＬＰＬ発現量を指標とするものである。即ち、本発明のスクリーニング方法は、ＬＰＬ発現細胞に被験物質を添加し、当該細胞のＬＰＬ発現量を測定することにより、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を評価するものである。被験物質がＬＰＬ発現細胞を活性化しＬＰＬ発現を促進すれば、結果として脳内ＬＰＬ量が増加することが予測されるので、被験物質の投与によるＬＰＬ発現細胞のＬＰＬ発現量の変化を観測することにより、被験物質によるアルツハイマー病の予防及び治療効果を簡便かつ高精度に予測することができる。本発明のスクリーニング方法で利用することのできるＬＰＬ発現細胞としては、３Ｔ３−Ｌ１細胞等の線維芽細胞由来のもの、ＨｕＧ１−ＰＩ、ＢｅＷｏ、ＰＬ５０２細胞等の胎盤由来細胞由来のもの、ＲＧＢ３Ｔ３−１、ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞等の脂肪細胞由来のもの、ＴＩＧ−２Ｍ−３０、Ｌ６細胞等の骨格筋由来のもの、Ｕ−２５１ ＭＧ、ＡＰ−１６、ＫＴ−５、ＲＮＢ、Ｃ６細胞等のアストロサイト由来のもの、Ａ−１７２細胞等のグリア細胞由来のもの、Ｎｅｕｒｏ２Ａ、ＧＯＴＯ、ＰＣ１２細胞等の神経細胞由来のもの、Ｈｕ５／Ｅ１８、Ｈ−１、Ｐ１９．ＣＬ６細胞等の神経系細胞、心筋細胞、血液系細胞、脂肪細胞等に分化するもの、ＢＡＬＢ−ＭＣ、ＭＣＦ７、ＦＭ３Ａ細胞等の乳腺ガン細胞に由来するもの、Ｊ７７４．１細胞等のマクロファージ細胞由来のもの、ＭＧ５、ＭＧ６細胞等のミクログリア細胞由来のもの、ＣＨＯ、ＯＶＭＩＵ細胞等の卵巣由来のもの、Ｈｅｐ Ｇ２、ＪＨＨ−１細胞等の肝細胞由来のもの等が挙げられる。
【実施例】
【００３０】
次に、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬並びにアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法を、実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
［参考例１］
【００３２】
クリーンベンチ内で、生後１、２日齢のｃ５７ＢＬ／６ Ｃｒ Ｓｌｃマウス（ＳＬＣ）から脳を取り出し、氷冷したハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ（登録商標））の中に入れ、小脳、間脳、脳幹、硬膜等を取り除いて大脳皮質を得た。次に、得られた大脳皮質をハンクス平衡塩５ｍｌ／ＤＮＡ分解酵素（ロシュ）５００μl及びトリプシン（ＧＩＢＣＯ（登録商標））１５０μlの中に移してピペッティングを行い、３７℃で５分静置後に上清を除去して沈殿物を得た。次に、得られた沈殿物にダルベッコ変法イーグル培地５ｍｌ／１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ（登録商標））及びＤＮＡ分解酵素５０μｌを加えてピペッティングを行い、室温で５分静置後に得られた上澄みを他のチューブへ移した。次に、得られた上清を４℃、８００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけて沈殿物を得た。次に、得られた沈殿物にダルベッコ変法イーグル培地／１０％ウシ胎児血清を加え、４℃、８００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけて沈殿物（細胞）を得た。次に、得られた細胞をダルベッコ変法イーグル培地／１０％ウシ胎児血清、ペニシリンＧ及びストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ（登録商標））で懸濁し、フラスコ（７５ｃｍ２、コーニング）に播種して７〜１０日間培養した後、フラスコを３７℃、２００ｒｐｍで一晩振盪し、ミクログリアを浮遊させて取り除いた。次に、取り除いたミクログリアを１×トリプシン（ＧＩＢＣＯ（登録商標））を用いて継代し、アストロサイトを得た。
【００３３】
［実施例１］
【００３４】
参考例１で得られた野生型マウス初代培養アストロサイト２×１０４個／ｃｍ２を１２ウェルプレート（コーニング）に播種して２日間培養した後、Ａβ４２（ペプチド研究所）５００ｎＭ及びＬＰＬ（シグマ）１〜５μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１〜５時間培養して細胞を得た。次に、得られた細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、更にリン酸緩衝生理食塩水１ｍｌを加えてセルスクレイパーを用いて細胞を回収した。次に、回収された細胞にＲＩＰＡ（１％［ｗ／ｗ］Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％［ｗ／ｖ］デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ））２５μｌを加えて超音波で破砕し、更に２×ドデシル硫酸ナトリウムサンプルバッファー（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１０％グリセロール、２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ブロモフェノールブルー、２％メルカプトエタノールｐＨ６．８）２５μｌを加えて５分間煮沸して細胞溶解液を得た。次に、得られた細胞溶解液を５〜２０％ゲル（和光純薬）にアプライし、８５Ｖで９０分間電気泳動してタンパク質を分離した。次に、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア）に、セミドライブロッティング装置（日本エイドー）及びブロッティングバッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、１０％メタノール）を用いて転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜をブロッキングバッファー（２０ｍＭトリス、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ウシ血清アルブミン、３％スキムミルク、０．１％アジ化ナトリウム）中で室温で１時間ブロッキングし、更に、抗Ａβ抗体（６Ｅ１０、シグネット）と反応させ、引き続きＨＲＰ標識抗体（セルシグナリング）と反応させ、ウェスタンブロッティング検出試薬（ＥＣＬ ｐｌｕｓ、ＧＥヘルスケア）を用いて発色を行った結果を図１に示した。
【００３５】
図１の結果から明らかな通り、ＬＰＬはマウス初代培養アストロサイトによるＡβの取り込みを促進することがわかった。
【００３６】
なお、図１に示したアクチンは、タンパク量補正のために示してあり、抗アクチン抗体（シグマ）を用いて、上記と同様に検出を行った。また、図１には、固形物を除いた液である細胞溶解液（ｌｙｓａｔｅ）及び媒地（ｍｅｄｉｕｍ）も示した。
【００３７】
［実施例２］
【００３８】
参考例１で得られた野生型マウス初代培養アストロサイトを実施例１と同様にして播種及び培養した後、５００ｎＭのＡβ４２及びＬＰＬを２μｇ／ｍｌになるように添加し、４℃で３時間培養して細胞を得た。次に、得られた細胞を実施例１と同様にして洗浄、回収、破砕及び煮沸を行い細胞溶解液を得た。次に、得られた細胞溶解液を実施例１と同様にしてタンパク質を分離し、分離したタンパク質を実施例１と同様にして転写した。次に、ＰＶＤＦ膜を、実施例１と同様にしてブロッキングし、抗Ａβ抗体と反応させ、ウェスタンブロッキング試薬を用いて発色を行った結果を図２に示した。
【００３９】
図２の結果から明らかな通り、ＬＰＬはマウス初代培養アストロサイトへのＡβの結合を促進することがわかった。
【００４０】
［実施例３］
【００４１】
ダルベッコ変法イーグル培地２００μｌ中で、５００ｎＭのＡβ及びＬＰＬを５μｇ／ｍｌ、３７℃で３時間培養した。次に、磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ、ダイナル）を、Ｗ／Ｂバッファー（０．２Ｍ ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）５０μｌで２度洗浄し、マウスモノクローナル抗ＬＰＬ抗体（アブカム）３μｇをＷ／Ｂバッファー２００μｌで希釈したものと室温で１０分間反応させ、更にリン酸緩衝生理食塩水で３度洗浄し、上の反応液を加え、室温で１０分間反応させた。次いで、マグネット（ダイナル）で磁性ビーズを回収し、リン酸緩衝生理食塩水で３度洗浄した。その後、マグネット（ダイナル）で磁性ビーズを回収し、ドデシル硫酸ナトリウム−サンプルバッファーを加え、７０℃で１０分間加熱した。次いで、マグネットで磁性ビーズと上清に分離し、上清を実施例１と同様にしてタンパク質を分離し、分離したタンパク質を実施例１と同様にして転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜を、実施例１と同様にしてブロッキングし、抗Ａβ抗体と反応させ、ウェスタンブロッキング試薬を用いて発色を行った結果を図３に示した。
【００４２】
図３の結果から明らかな通り、ＡβはＬＰＬと共沈降されたことから、ＬＰＬとＡβとは結合することがわかった。なお、ＬＰＬに対する抗体（α−ＬＰＬ）のコントロールとして、マウスＩｇＧ（ケミコン）を用いた。
【００４３】
［実施例４］
【００４４】
参考例１で得られた野生型マウス初代培養アストロサイトを実施例１と同様にして播種及び培養した。次に、Ａβ４２及びＬＰＬを実施例２と同様にして添加して３７℃で５時間培養した後、ダルベッコ変法イーグル培地で２回洗浄し、ダルベッコ変法イーグル培地を加えて３７℃で１２〜２４時間培養した。次に、培養した細胞を実施例１と同様にして破砕及び煮沸し、細胞溶解液を得た。次いで、得られた細胞溶解液を実施例１と同様にしてタンパク質を分離し、分離したタンパク質を実施例１と同様にして転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜を、実施例１と同様にしてブロッキングし、抗Ａβ抗体と反応させ、ウェスタンブロッキング試薬を用いて発色を行った結果を図４に示した。
【００４５】
図４の結果から明らかな通り、１２時間培養後では、Ａβのバンドがほぼ消失していることから、取り込まれたＡβが分解されていることがわかった。
【００４６】
［参考例２］
【００４７】
９６ウェルプレートに、リン酸緩衝生理食塩水で希釈したＬＰＬを１００μｌと、１００μＭのｐ−ニトロフェニル酢酸塩１００μｌとを入れ、３７℃で３０分間インキュベートした後、ＬＰＬによってｐ−ニトロフェニル酢酸塩が加水分解されて生じたｐ−ニトロフェノールに由来する吸光度（４５０ｎｍ）を測定した結果を図５に示した。
【００４８】
図５の結果から明らかな通り、吸光度（４５０ｎｍ）とＬＰＬ濃度がよく相関する事が分かり、この方法によりＬＰＬ量を定量することができることがわかった。
【００４９】
［実施例５］
【００５０】
９６ウェルプレートに３Ｔ３−Ｌ１細胞を播種し、コンフルーエントに達するまで培養した。次に、それらをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水又は１０ｍｇ／ｍｌヘパリン（シグマ）１５０μｌ加え、３７℃で１０分間培養した。次に、得られた溶液から１００μｌ採取して別の９６ウェルプレートに移し、１００μＭのｐ−ニトロフェニル酢酸塩１００μｌを入れて、３７℃で３０分間インキュベートした後、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。次に、ヘパリン中でインキュベートしたものの値から参考例１の結果（リン酸緩衝生理食塩水中でインキュベートしたものの値）を引いた差をＬＰＬの活性に由来したものとして算出した結果を図６に示した。
【００５１】
図６の結果から明らかな通り、この系を利用すれば、被験物質のＬＰＬ発現促進能を評価できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
上述したように、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬は、脳内に投与されることにより、有効成分であるＬＰＬがアルツハイマー病の発病の原因物質と考えられているＡβの細胞内への取り込みを促進させて、Ａβの分解効率を飛躍的に向上させ、脳内でのＡβの蓄積を顕著に抑制することができるので、家族性アルツハイマー病やアルツハイマー型老年認知症等のアルツハイマー病の予防及び治療に用いた場合極めて有用である。
【００５３】
また、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法は、脳内のＬＰＬ量を指標とするので、動物に被験物質を投与して当該動物の脳内ＬＰＬ量を測定することにより、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を評価することができる。また、本発明のスクリーニング方法は、ＬＰＬ発現量を指標とするので、ＬＰＬ発現細胞に被験物質を添加して当該ＬＰＬ発現細胞のＬＰＬ発現量を測定することにより、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を評価することができる。従って、本発明のスクリーニング方法は、アルツハイマー病の予防及び治療薬の有効成分の探索に利用した場合極めて有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の予防及び治療薬並びにアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、認知機能低下、人格の変化を主な症状とする認知症をきたす神経変性疾患である。アルツハイマー病の主要な病理変化には老人斑と神経原線維変化があるが、老人斑は発症の早期から認められ、その主要構成成分はアミロイドβ蛋白質（Ａβ：Ａｍｙｌｏｉｄ β）である。Ａβはアミノ酸が連なったペプチドであり、比較的疾患特異性は高いが、正常脳でも認められる。Ａβは細胞外に蓄積し老人斑を形成するとともに、神経細胞内においても蓄積が認められる場合がある。従来は蓄積したＡβに神経毒性があると考えられてきたが、近年の研究からＡβの重合体がシナプスや神経細胞に対して毒性を発揮し、神経細胞を変性させて最終的には神経細胞の脱落を惹起するものと考えられている。
【０００３】
現在、アルツハイマー病の治療法としては、Ａβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ：Ａｍｙｌｏｉｄ β Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）が切断されてＡβが産生される際にＡＰＰの切断を行うプロテアーゼであるβ−セクレターゼやγ−セクレターゼを阻害する薬剤を投与することにより脳内のＡβ産生を抑制する方法や、Ａβに対する抗体を投与もしくはＡβで免疫することによりＡβに対する抗体の産生を促し脳内Ａβの除去を促進する方法等が知られている。
【０００４】
一方、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ：Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅ）は、リポタンパク質に含まれるトリグリセリドを脂肪酸とモノグリセリドに加水分解する酵素であり、脂肪組織等で合成及び分泌され、毛細血管の血管内皮細胞表面（脂肪細胞外）に存在することが知られている。また、ＬＰＬは、細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンやコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと相互作用し、これらとリポタンパク質とを橋渡しすることにより、リポタンパク質の細胞内への取り込みを促進する作用を有することも知られている。近年、このＬＰＬが、アルツハイマー病の脳において老人斑に共局在していることが確認されている（例えば、非特許文献１又は２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｕｍ、ｅｔ ａｌ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、８８、１３６−１３９（１９９９）
【非特許文献２】Ｂａｕｍ、ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｎｉｑｕｅ、５０、２９１−２９６（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、脳内の主なリポタンパク質画分は高比重リポタンパク（ＨＤＬ：Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）でありトリグリセリドを含まないので、脳内にはＬＰＬの基質が存在せず、また、活性化因子であるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩも脳内には存在しない。従って、脳内ではＬＰＬが酵素活性を発揮する場はないと考えられ、現在のところ、脳内におけるＬＰＬの働きについては殆ど解明されていない。
【０００７】
本発明は、上記従来技術の有する問題点に鑑みなされたものであり、その目的とするところは、脳内のＡβの脳内細胞への取り込みを活性化し、Ａβの分解効率を飛躍的に向上させ、脳内でのＡβの蓄積を抑えてアルツハイマー病の発症及び進行を顕著に抑制し得るアルツハイマー病の予防及び治療薬を提供することにある。
【０００８】
また、本発明の他の目的は、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を簡便かつ高精度に評価することのできるアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の上記目的は、下記の手段によって達成される。
【００１０】
（１）すなわち、本発明は、リポプロテインリパーゼを有効成分とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬である。
【００１１】
（２）本発明はまた、脳内投与用である、（１）に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬である。
【００１２】
（３）また、本発明は、脳内のリポプロテインリパーゼ量を指標とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【００１３】
（４）本発明はまた、動物に被験物質を投与するステップと、前記動物の脳内のリポプロテインリパーゼ量を測定するステップと、を有することを特徴とする、（３）に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【００１４】
（５）本発明はまた、前記動物は、哺乳類である、（４）に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【００１５】
（６）本発明はまた、リポプロテインリパーゼ発現量を指標とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【００１６】
（７）本発明はまた、リポプロテインリパーゼ発現細胞に被験物質を添加するステップと、前記リポプロテインリパーゼ発現細胞のリポプロテインリパーゼ発現量を測定するステップと、を有することを特徴とする、（６）に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【００１７】
（８）本発明はまた、前記リポプロテインリパーゼ発現細胞は、線維芽細胞由来のもの、胎盤由来細胞由来のもの、脂肪細胞由来のもの、骨格筋由来のもの、アストロサイト由来のもの、グリア細胞由来のもの、神経細胞由来のもの、神経系細胞、心筋細胞、血液系細胞若しくは脂肪細胞に分化するもの、乳腺ガン細胞に由来するもの、マクロファージ細胞由来のもの、ミクログリア細胞由来のもの、卵巣由来のもの又は肝細胞由来のものである、（７）に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬は、ＬＰＬを有効成分とするので、脳内に投与されることにより、ＬＰＬが脳内のミクログリアやアストロサイト等の細胞内へのＡβの取り込みを顕著に促進し、取り込まれたＡβは細胞内で速やかに分解されるので、脳内のＡβの分解効率を飛躍的に向上させることができ、脳内でのＡβの蓄積を抑えてアルツハイマー病の発症及び進行を顕著に抑制することができる。
【００１９】
また、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法は、脳内のＬＰＬ量を指標とするので、動物に被験物質を投与して当該動物の脳内ＬＰＬ量を測定することにより、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を簡便かつ高精度に評価することができる。
【００２０】
また、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法によれば、ＬＰＬ発現量を指標とするので、ＬＰＬ発現細胞に被験物質を添加して当該ＬＰＬ発現細胞のＬＰＬ発現量を測定することにより、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を簡便かつ高精度に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ウェスタンブロット法を用いたマウス初代培養アストロサイトによるＡβの取り込み状態を示す図である。
【図２】ウェスタンブロット法によるマウス初代培養アストロサイトとＡβとの結合状態を示す図である。
【図３】免疫沈降法によるＬＰＬとＡβとの結合状態を示す図である。
【図４】ウェスタンブロット法を用いたマウス初代培養アストロサイトによって取り込まれたＡβの分解状態を示す図である。
【図５】ＬＰＬとｐ−ニトロフェニル酢酸塩を反応させ、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した結果を示す図である。
【図６】培養した３Ｔ３−Ｌ１細胞をリン酸緩衝生理食塩水中又はヘパリン含有リン酸緩衝生理食塩水中でインキュベートし、その上清にｐ−ニトロフェニル酢酸塩を加え、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２３】
本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬は、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）を有効成分とするものである。
【００２４】
本発明で利用可能なＬＰＬとしては、ウシ、ヒト、マウス、モルモット等の哺乳類の組織や分泌物から精製されたものや、これらの哺乳類のＬＰＬをコードする遺伝子から既知の遺伝子組み換え技術により製造したもの等が挙げられる。なお、上記哺乳類においては、アルツハイマー病患者やアルツハイマー病病態モデル動物等も含まれる。
【００２５】
本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬は、ＬＰＬに、必要に応じて蒸留水、ｐＨ調整剤、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、抗酸化剤、保存剤等を添加することにより、液状製剤として製造することができる。ｐＨ調整剤としては、塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられ、懸濁化剤としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等が挙げられ、溶解補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等が挙げられ、安定化剤としては、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、エーテル等が挙げられ、等張剤としては、塩化ナトリウム、ぶどう糖等が挙げられ、保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等が挙げられる。
【００２６】
本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬は、患者の脳内に局所投与して利用される。本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬の投与量は、患者、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性差、薬剤に対する感受性差等により著しく異なり、正確な投与量は医師の診断により決定されるものであるが、通常、成人に対し１日あたり、ＬＰＬの投与量換算で、０．００１〜１０００ｍｇを、１日１回又は数回に分けて投与する。
【００２７】
本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬の作用機序は必ずしも明らかではないが、有効成分であるＬＰＬが脳内に投与されると、ＬＰＬとヘパラン硫酸プロテオグリカンやコンドロイチン硫酸プロテオグリカン等のプロテオグリカンとの相互作用により、脳内に存在するＡβが、脳内のミクログリアやアストロサイト等の細胞内に積極的に取り込まれるものと考えられる。一度ミクログリアやアストロサイト等の細胞内にＡβが取り込まれるとＡβは速やかに分解されるので、結果としてＬＰＬの投与により脳内Ａβの分解効率が飛躍的に向上し、脳内でのＡβの蓄積を抑制することにより、アルツハイマー病の発症及び進行を顕著に抑制することができるものである。
【００２８】
また、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法は、脳内のＬＰＬ量を指標とするものである。即ち、本発明のスクリーニング方法は、動物に被験物質を投与し、当該動物の脳内ＬＰＬ量を測定することにより、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を評価するものである。上述のとおり、脳内ＬＰＬ量が増加するとＡβの脳内細胞への取り込みが活性化され脳内Ａβの分解効率が向上するので、被験物質の投与による脳内ＬＰＬ量の変化を観測することにより、被験物質によるアルツハイマー病の予防及び治療効果を簡便かつ高精度に予測することができる。本発明のスクリーニング方法で利用することのできる動物としては、トガリネズミ科、モグラ科、ソレノドン科、ニシインドトガリネズミ科等のトガリネズミ目、ハリネズミ科等のハリネズミ目、オオコウモリ科、オナガコウモリ科、サシオコウモリ科、ブタバナコウモリ科、ミゾコウモリ科、アラコウモリ科、キクガシラコウモリ科、カグラコウモリ科、ウオクイコウモリ科、クチビルコウモリ科、チスイコウモリ科、ヘラコウモリ科、アシナガコウモリ科、ツメナシコウモリ科、スイツキコウモリ科、サラモチコウモリ科、ヒナコウモリ科、ツギホコウモリ科、オヒキコウモリ科等のコウモリ目（翼手目）、コビトキツネザル科、イタチキツネザル科、キツネザル科、インドリ科、アイアイ科、ロリス科、ガラゴ科、メガネザル科、オマキザル科、マーモセット科、オナガザル科、テナガザル科、オランウータン科、ヒト科等のサル目（霊長目）、ウサギ科、ナキウサギ科等のウサギ目（兎目、重歯目）、リス科、グンディ科、ヤマネ科、メクラネズミ科、ヨルマウス科、アシナガマウス科、キヌゲネズミ科、ネズミ科、トビネズミ科、ビーバー科、ウロコオリス科、トビウサギ科、ヤマアラシ科、アメリカヤマアラシ科（キノボリヤマアラシ科）、ヨシネズミ科、デバネズミ上科、デバネズミ科、デグー科、アメリカトビネズミ科、カプロミス科、ヌートリア科、アグーチ科（パカ科）、パカラナ科、テンジクネズミ科、カピバラ科、チンチラ科、チンチラネズミ科等のネズミ目（齧歯目）、ネコ科、マングース科、ジャコウネコ科、ハイエナ科、キノボリジャコウネコ科、イヌ科、レッサーパンダ科、アライグマ科、イタチ科、スカンク科、クマ科、アザラシ科、アシカ科等のネコ目（食肉目）、サイ科、ウマ科、バク科等のウマ目（奇蹄目）、ラクダ科、イノシシ科、ペッカリー科、マメジカ科、ジャコウジカ科、シカ科、キリン科、プロングホーン科、ウシ科、カバ科、マッコウクジラ科、コマッコウ科、アカボウクジラ科、インドカワイルカ科、ヨウスコウカワイルカ科、アマゾンカワイルカ科、ラプラタカワイルカ科、マイルカ科、ネズミイルカ科、イッカク科、セミクジラ科、コセミクジラ科、コククジラ科、ナガスクジラ科等のクジラ偶蹄目（鯨偶蹄目）、ジュゴン科、マナティー科等のジュゴン目（海牛目）等の哺乳類等が挙げられる。
【００２９】
また、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法は、ＬＰＬ発現量を指標とするものである。即ち、本発明のスクリーニング方法は、ＬＰＬ発現細胞に被験物質を添加し、当該細胞のＬＰＬ発現量を測定することにより、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を評価するものである。被験物質がＬＰＬ発現細胞を活性化しＬＰＬ発現を促進すれば、結果として脳内ＬＰＬ量が増加することが予測されるので、被験物質の投与によるＬＰＬ発現細胞のＬＰＬ発現量の変化を観測することにより、被験物質によるアルツハイマー病の予防及び治療効果を簡便かつ高精度に予測することができる。本発明のスクリーニング方法で利用することのできるＬＰＬ発現細胞としては、３Ｔ３−Ｌ１細胞等の線維芽細胞由来のもの、ＨｕＧ１−ＰＩ、ＢｅＷｏ、ＰＬ５０２細胞等の胎盤由来細胞由来のもの、ＲＧＢ３Ｔ３−１、ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞等の脂肪細胞由来のもの、ＴＩＧ−２Ｍ−３０、Ｌ６細胞等の骨格筋由来のもの、Ｕ−２５１ ＭＧ、ＡＰ−１６、ＫＴ−５、ＲＮＢ、Ｃ６細胞等のアストロサイト由来のもの、Ａ−１７２細胞等のグリア細胞由来のもの、Ｎｅｕｒｏ２Ａ、ＧＯＴＯ、ＰＣ１２細胞等の神経細胞由来のもの、Ｈｕ５／Ｅ１８、Ｈ−１、Ｐ１９．ＣＬ６細胞等の神経系細胞、心筋細胞、血液系細胞、脂肪細胞等に分化するもの、ＢＡＬＢ−ＭＣ、ＭＣＦ７、ＦＭ３Ａ細胞等の乳腺ガン細胞に由来するもの、Ｊ７７４．１細胞等のマクロファージ細胞由来のもの、ＭＧ５、ＭＧ６細胞等のミクログリア細胞由来のもの、ＣＨＯ、ＯＶＭＩＵ細胞等の卵巣由来のもの、Ｈｅｐ Ｇ２、ＪＨＨ−１細胞等の肝細胞由来のもの等が挙げられる。
【実施例】
【００３０】
次に、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬並びにアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法を、実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
［参考例１］
【００３２】
クリーンベンチ内で、生後１、２日齢のｃ５７ＢＬ／６ Ｃｒ Ｓｌｃマウス（ＳＬＣ）から脳を取り出し、氷冷したハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ（登録商標））の中に入れ、小脳、間脳、脳幹、硬膜等を取り除いて大脳皮質を得た。次に、得られた大脳皮質をハンクス平衡塩５ｍｌ／ＤＮＡ分解酵素（ロシュ）５００μl及びトリプシン（ＧＩＢＣＯ（登録商標））１５０μlの中に移してピペッティングを行い、３７℃で５分静置後に上清を除去して沈殿物を得た。次に、得られた沈殿物にダルベッコ変法イーグル培地５ｍｌ／１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ（登録商標））及びＤＮＡ分解酵素５０μｌを加えてピペッティングを行い、室温で５分静置後に得られた上澄みを他のチューブへ移した。次に、得られた上清を４℃、８００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけて沈殿物を得た。次に、得られた沈殿物にダルベッコ変法イーグル培地／１０％ウシ胎児血清を加え、４℃、８００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけて沈殿物（細胞）を得た。次に、得られた細胞をダルベッコ変法イーグル培地／１０％ウシ胎児血清、ペニシリンＧ及びストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ（登録商標））で懸濁し、フラスコ（７５ｃｍ２、コーニング）に播種して７〜１０日間培養した後、フラスコを３７℃、２００ｒｐｍで一晩振盪し、ミクログリアを浮遊させて取り除いた。次に、取り除いたミクログリアを１×トリプシン（ＧＩＢＣＯ（登録商標））を用いて継代し、アストロサイトを得た。
【００３３】
［実施例１］
【００３４】
参考例１で得られた野生型マウス初代培養アストロサイト２×１０４個／ｃｍ２を１２ウェルプレート（コーニング）に播種して２日間培養した後、Ａβ４２（ペプチド研究所）５００ｎＭ及びＬＰＬ（シグマ）１〜５μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１〜５時間培養して細胞を得た。次に、得られた細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、更にリン酸緩衝生理食塩水１ｍｌを加えてセルスクレイパーを用いて細胞を回収した。次に、回収された細胞にＲＩＰＡ（１％［ｗ／ｗ］Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％［ｗ／ｖ］デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ））２５μｌを加えて超音波で破砕し、更に２×ドデシル硫酸ナトリウムサンプルバッファー（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１０％グリセロール、２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ブロモフェノールブルー、２％メルカプトエタノールｐＨ６．８）２５μｌを加えて５分間煮沸して細胞溶解液を得た。次に、得られた細胞溶解液を５〜２０％ゲル（和光純薬）にアプライし、８５Ｖで９０分間電気泳動してタンパク質を分離した。次に、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア）に、セミドライブロッティング装置（日本エイドー）及びブロッティングバッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、１０％メタノール）を用いて転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜をブロッキングバッファー（２０ｍＭトリス、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ウシ血清アルブミン、３％スキムミルク、０．１％アジ化ナトリウム）中で室温で１時間ブロッキングし、更に、抗Ａβ抗体（６Ｅ１０、シグネット）と反応させ、引き続きＨＲＰ標識抗体（セルシグナリング）と反応させ、ウェスタンブロッティング検出試薬（ＥＣＬ ｐｌｕｓ、ＧＥヘルスケア）を用いて発色を行った結果を図１に示した。
【００３５】
図１の結果から明らかな通り、ＬＰＬはマウス初代培養アストロサイトによるＡβの取り込みを促進することがわかった。
【００３６】
なお、図１に示したアクチンは、タンパク量補正のために示してあり、抗アクチン抗体（シグマ）を用いて、上記と同様に検出を行った。また、図１には、固形物を除いた液である細胞溶解液（ｌｙｓａｔｅ）及び媒地（ｍｅｄｉｕｍ）も示した。
【００３７】
［実施例２］
【００３８】
参考例１で得られた野生型マウス初代培養アストロサイトを実施例１と同様にして播種及び培養した後、５００ｎＭのＡβ４２及びＬＰＬを２μｇ／ｍｌになるように添加し、４℃で３時間培養して細胞を得た。次に、得られた細胞を実施例１と同様にして洗浄、回収、破砕及び煮沸を行い細胞溶解液を得た。次に、得られた細胞溶解液を実施例１と同様にしてタンパク質を分離し、分離したタンパク質を実施例１と同様にして転写した。次に、ＰＶＤＦ膜を、実施例１と同様にしてブロッキングし、抗Ａβ抗体と反応させ、ウェスタンブロッキング試薬を用いて発色を行った結果を図２に示した。
【００３９】
図２の結果から明らかな通り、ＬＰＬはマウス初代培養アストロサイトへのＡβの結合を促進することがわかった。
【００４０】
［実施例３］
【００４１】
ダルベッコ変法イーグル培地２００μｌ中で、５００ｎＭのＡβ及びＬＰＬを５μｇ／ｍｌ、３７℃で３時間培養した。次に、磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ、ダイナル）を、Ｗ／Ｂバッファー（０．２Ｍ ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）５０μｌで２度洗浄し、マウスモノクローナル抗ＬＰＬ抗体（アブカム）３μｇをＷ／Ｂバッファー２００μｌで希釈したものと室温で１０分間反応させ、更にリン酸緩衝生理食塩水で３度洗浄し、上の反応液を加え、室温で１０分間反応させた。次いで、マグネット（ダイナル）で磁性ビーズを回収し、リン酸緩衝生理食塩水で３度洗浄した。その後、マグネット（ダイナル）で磁性ビーズを回収し、ドデシル硫酸ナトリウム−サンプルバッファーを加え、７０℃で１０分間加熱した。次いで、マグネットで磁性ビーズと上清に分離し、上清を実施例１と同様にしてタンパク質を分離し、分離したタンパク質を実施例１と同様にして転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜を、実施例１と同様にしてブロッキングし、抗Ａβ抗体と反応させ、ウェスタンブロッキング試薬を用いて発色を行った結果を図３に示した。
【００４２】
図３の結果から明らかな通り、ＡβはＬＰＬと共沈降されたことから、ＬＰＬとＡβとは結合することがわかった。なお、ＬＰＬに対する抗体（α−ＬＰＬ）のコントロールとして、マウスＩｇＧ（ケミコン）を用いた。
【００４３】
［実施例４］
【００４４】
参考例１で得られた野生型マウス初代培養アストロサイトを実施例１と同様にして播種及び培養した。次に、Ａβ４２及びＬＰＬを実施例２と同様にして添加して３７℃で５時間培養した後、ダルベッコ変法イーグル培地で２回洗浄し、ダルベッコ変法イーグル培地を加えて３７℃で１２〜２４時間培養した。次に、培養した細胞を実施例１と同様にして破砕及び煮沸し、細胞溶解液を得た。次いで、得られた細胞溶解液を実施例１と同様にしてタンパク質を分離し、分離したタンパク質を実施例１と同様にして転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜を、実施例１と同様にしてブロッキングし、抗Ａβ抗体と反応させ、ウェスタンブロッキング試薬を用いて発色を行った結果を図４に示した。
【００４５】
図４の結果から明らかな通り、１２時間培養後では、Ａβのバンドがほぼ消失していることから、取り込まれたＡβが分解されていることがわかった。
【００４６】
［参考例２］
【００４７】
９６ウェルプレートに、リン酸緩衝生理食塩水で希釈したＬＰＬを１００μｌと、１００μＭのｐ−ニトロフェニル酢酸塩１００μｌとを入れ、３７℃で３０分間インキュベートした後、ＬＰＬによってｐ−ニトロフェニル酢酸塩が加水分解されて生じたｐ−ニトロフェノールに由来する吸光度（４５０ｎｍ）を測定した結果を図５に示した。
【００４８】
図５の結果から明らかな通り、吸光度（４５０ｎｍ）とＬＰＬ濃度がよく相関する事が分かり、この方法によりＬＰＬ量を定量することができることがわかった。
【００４９】
［実施例５］
【００５０】
９６ウェルプレートに３Ｔ３−Ｌ１細胞を播種し、コンフルーエントに達するまで培養した。次に、それらをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水又は１０ｍｇ／ｍｌヘパリン（シグマ）１５０μｌ加え、３７℃で１０分間培養した。次に、得られた溶液から１００μｌ採取して別の９６ウェルプレートに移し、１００μＭのｐ−ニトロフェニル酢酸塩１００μｌを入れて、３７℃で３０分間インキュベートした後、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。次に、ヘパリン中でインキュベートしたものの値から参考例１の結果（リン酸緩衝生理食塩水中でインキュベートしたものの値）を引いた差をＬＰＬの活性に由来したものとして算出した結果を図６に示した。
【００５１】
図６の結果から明らかな通り、この系を利用すれば、被験物質のＬＰＬ発現促進能を評価できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
上述したように、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬は、脳内に投与されることにより、有効成分であるＬＰＬがアルツハイマー病の発病の原因物質と考えられているＡβの細胞内への取り込みを促進させて、Ａβの分解効率を飛躍的に向上させ、脳内でのＡβの蓄積を顕著に抑制することができるので、家族性アルツハイマー病やアルツハイマー型老年認知症等のアルツハイマー病の予防及び治療に用いた場合極めて有用である。
【００５３】
また、本発明のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法は、脳内のＬＰＬ量を指標とするので、動物に被験物質を投与して当該動物の脳内ＬＰＬ量を測定することにより、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を評価することができる。また、本発明のスクリーニング方法は、ＬＰＬ発現量を指標とするので、ＬＰＬ発現細胞に被験物質を添加して当該ＬＰＬ発現細胞のＬＰＬ発現量を測定することにより、被験物質のアルツハイマー病の予防及び治療に対する有効性を評価することができる。従って、本発明のスクリーニング方法は、アルツハイマー病の予防及び治療薬の有効成分の探索に利用した場合極めて有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポプロテインリパーゼを有効成分とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬。
【請求項２】
脳内投与用である、請求項１に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬。
【請求項３】
脳内のリポプロテインリパーゼ量を指標とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
動物に被験物質を投与するステップと、
前記動物の脳内のリポプロテインリパーゼ量を測定するステップと、
を有することを特徴とする、請求項３に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記動物は、哺乳類である、請求項４に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
リポプロテインリパーゼ発現量を指標とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【請求項７】
リポプロテインリパーゼ発現細胞に被験物質を添加するステップと、
前記リポプロテインリパーゼ発現細胞のリポプロテインリパーゼ発現量を測定するステップと、
を有することを特徴とする、請求項６に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記リポプロテインリパーゼ発現細胞は、線維芽細胞由来のもの、胎盤由来細胞由来のもの、脂肪細胞由来のもの、骨格筋由来のもの、アストロサイト由来のもの、グリア細胞由来のもの、神経細胞由来のもの、神経系細胞、心筋細胞、血液系細胞若しくは脂肪細胞に分化するもの、乳腺ガン細胞に由来するもの、マクロファージ細胞由来のもの、ミクログリア細胞由来のもの、卵巣由来のもの又は肝細胞由来のものである、請求項７に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１】
リポプロテインリパーゼを有効成分とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬。
【請求項２】
脳内投与用である、請求項１に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬。
【請求項３】
脳内のリポプロテインリパーゼ量を指標とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
動物に被験物質を投与するステップと、
前記動物の脳内のリポプロテインリパーゼ量を測定するステップと、
を有することを特徴とする、請求項３に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記動物は、哺乳類である、請求項４に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
リポプロテインリパーゼ発現量を指標とする、アルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法である。
【請求項７】
リポプロテインリパーゼ発現細胞に被験物質を添加するステップと、
前記リポプロテインリパーゼ発現細胞のリポプロテインリパーゼ発現量を測定するステップと、
を有することを特徴とする、請求項６に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記リポプロテインリパーゼ発現細胞は、線維芽細胞由来のもの、胎盤由来細胞由来のもの、脂肪細胞由来のもの、骨格筋由来のもの、アストロサイト由来のもの、グリア細胞由来のもの、神経細胞由来のもの、神経系細胞、心筋細胞、血液系細胞若しくは脂肪細胞に分化するもの、乳腺ガン細胞に由来するもの、マクロファージ細胞由来のもの、ミクログリア細胞由来のもの、卵巣由来のもの又は肝細胞由来のものである、請求項７に記載のアルツハイマー病の予防及び治療薬のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１２６８４７（Ｐ２０１１−１２６８４７Ａ）
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８９４８７（Ｐ２００９−２８９４８７）
【出願日】平成２１年１２月２１日（２００９．１２．２１）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２１日（２００９．１２．２１）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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