アルツハイマー病モデルトランスジェニック動物
【構成】 １) ベータアクチンプロモーターのＤＮＡ配列、２) サイトメガロウイルスエンハンサーのＤＮＡ配列、３) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および４) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白の９９ないし１０３個のアミノ酸残基長のＣ末端ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする組み換え遺伝子が、体細胞および生殖細胞に組み込まれた、ヒト以外の哺乳動物であるアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【効果】 本発明のトランスジェニック動物は、動物脳内に形成される抗ベータ蛋白抗体反応性物質等のアルツハイマー病特有のパラメーターを減少させる能力に関する薬剤の効果検定に利用できる。
【効果】 本発明のトランスジェニック動物は、動物脳内に形成される抗ベータ蛋白抗体反応性物質等のアルツハイマー病特有のパラメーターを減少させる能力に関する薬剤の効果検定に利用できる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、一般的に疾患の治療に関連した薬の開発に有効な動物モデルに関するものである。更に詳しくは、ベータアミロイド前駆体蛋白（β−amyloid precursor protein, APP：以後、これをＡＰＰと呼ぶ）の一部をコードする外来性遺伝子構築体を自らのゲノムに取り込んだトランスジェニック（transgenic）動物の作製に関するもので、その中で、外来性遺伝子構築体をどの細胞タイプでも広く過剰発現させるよう仕組まれている。
【０００２】
【従来の技術】最近の発生工学の発展により、外来性遺伝物質（ＤＮＡ）を胚の核内へ注入するか感染させることにより、胚の染色体にその物質を組み込んだ胚（いわゆる形質転換胚）を作ることができるようになった(Gordon J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.77, p.7380-7384, 1980；Jaenisch R. et al., Cell, vol.32, p.209-216, 1983）。この胚は、仮親（里親）に移植することにより、成長させることができ、得られた成体動物は外来性DNAを自らの染色体に取り込んでおり、且つそれを発現することができる。形質転換された個体は、一般的にトランスジェニック動物と呼ばれる（Gordon J. and Ruddle F., Science, vol.214,p.1244-1246, 1981）。取り込まれた外来性DNAは、トランスジーン（transgene）と呼ばれ、一般的にプロモーターとｃＤＮＡ等の目的遺伝子とから成る。外来性ＤＮＡの発現は、成体にならずとも発現させることができ、例えば、胚の細胞分裂過程でも発現する場合がある。従って、その発現の結果、外来性DNAによりコードされる蛋白が生産され、特にその蛋白が生体にとって重要な機能を果たしているなら、その個体の発生のある時点では、個体の表現型に何らかの変化を引き起こすこともあり得る。表現型の変化を与える様式としては、個体で発現させるべき目的蛋白の過剰発現か、内在性の目的蛋白の発現の抑制があり、それを制御するのは、目的蛋白をコードする遺伝子の上流側に置かれているプロモーターかエンハンサーである。尚、発現抑制の仕方としては、アンチセンス法 (Katsuki M. et al., Science, vol.241, p.593-595, 1988）等が挙げられる。
【０００３】個体が外来性DNAで形質転換された、あるいはその結果、本来の表現型が変わったという報告は、これまでに多くされており、特にPalmiter R.D. and Brinster R.L.（Annu. Rev. Genet., vol.20, p.465-499, 1986）や Gordon J.W.（Int. Rev. of Cytobiol., vol.115, p.171-229, 1989）等の総説に詳しく述べられている。このトランスジェニック動物は、1）発生過程での遺伝子発現のin vivoでの解析、2）遺伝病の克服または軽減に向けた研究等の分野で利用されうる。外来性ＤＮＡによる胚の形質転換は、外来性ＤＮＡを外から与えることにより、最終的に胚核内の染色体内のDNA配列の一部に組み込まれることにより達成される。これを達成するにはいくつかの方法があるが、例えば、外来性DNAを微小ピペットに吸入し、これを１細胞期の前核内へ注入する方法、所謂、顕微注入法(Gordon et al., 1980）が一般的である。
【０００４】ＤＮＡを注入された胚はついで、偽妊娠雌の生殖道（輸卵管または子宮）に移植することにより、１個の生命体へと発生させることができる。この生命体は後日、外来性ＤＮＡを自らの染色体に取り込んでいるかどうか、ＰＣＲ法やサザンブロット法等で解析されることとなる。もしこの取り込みが確認されたら、この動物はin vivoにおける遺伝子発現解析（例えば、ノーザンブロット法や免疫抗体法等による解析）に利用される。この発現により、ヒトのある遺伝病に似た形質を引き起こすことも可能である。
【０００５】アルツハイマー病には、一説では後に述べるように、APPの過剰発現が関連すると考えられている（Terry R.D. and Katsman R, Ann. Neurol. vol.14, p.496-506, 1983）。アルツハイマー病患者脳には、アルツハイマー病特有の神経原線維変化 [neurofibrillay tangles (NFT)、paired helical filaments (PHF) :以後これをＰＨＦと呼ぶ］、老人斑（neuritic plaque または senile plaque）及び脳アミロイド（amyloid）の沈着があり、脳アミロイドはＡＰＰから生じるからである。しかも、最近では、後で述べる家族性アルツハイマー病や遺伝性脳血管アミロイドアンギオパチー（amyloid angiopathy）でＡＰＰの遺伝子異常が発見されたことや、脳内に沈着したアミロイドの主成分であるアミロイドプラークコア蛋白（amyloid plaque core protein；APCP）あるいは、アミロイドコア蛋白（β−amyloid core protein）（後日、このポリペプチドは ベータ蛋白またはβ／Ａ４蛋白と命名される。以後、これをβ／Ａ４蛋白と呼ぶ）自体が神経毒性を有するという報告（Yankner B.A. et al., Science, vol.245, p.417-420, 1989）等から、ＡＰＰからβ／Ａ４蛋白が代謝され、沈着する機序の解明がアルツハイマー病の病因解明の最も本質的なアプローチと考えらている。しかし、残念ながら、これまでアルツハイマー病のモデルとなる動物が知られていないか、あるいは、確立されていないため、このような仮説を立証する手立てがなかった。そこで、人為的にＡＰＰ遺伝子を組み込ませたトランスジェニック動物を作り、このＡＰＰをトランスジェニック動物脳内で過剰発現させ、アミロイド沈着を引き起こした結果、最終的にアルツハイマー病に似た動物、所謂ヒトアルツハイマー病モデルができる可能性がある。
【０００６】最近、ヒトのＡＰＰｃＤＮＡの全長あるいはー部分を過剰発現させることにより、脳内のアミロイド沈着を引き起こしたトランスジェニックマウスがいくつかの研究室から相次いで報告された（Kawabata S. et al., Nature, vol.345, p.476-478, 1991；Quon D. et al., Nature, vol.352, p.239-241, 1991；Wirak D.O. et al., Science, vol.253, p.323-325, 1991）。しかし、Kawabata らの報告は、その後、追試に成功せず、論文は撤回された（Nature, vol.356, p.265,1992）。更に、Ｗｉｒａｋらの報告も、その形質変化はトランスジーンによるものではないということである（Science, 28, Feb., 1992）。特許出願でもいくつかのアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物を確立したという報告が、例えばＷＯ９３／１４２００、ＷＯ９３／０２１８９、ＷＯ９２／１３０６９、ＷＯ９２／０６１８７、ＷＯ９１／１９８１０、ＥＰ４５１７００及びＷＯ８９／０６６８９として公開されているが、いずれも遺伝子の構築だけであったり、得られたトランスジェニック動物で単にＡＰＰの沈着がみられたといった間接的な証拠しかない。従って、現在のところ、はっきりとしたアルツハイマー病モデル動物は確立されていないと思われる。これに対し、本発明で作出されたトランスジェニック動物は、アルツハイマー病に伴う様々な症状と類似した形質を示しており、この意味では本発明で作出されたトランスジェニック動物は、アルツハイマー病の発症原因の解明のための実験系を提供し、また、アルツハイマー病発症の阻止、あるいは、アルツハイマー病発症に伴う神経細胞死等を阻止するようなアルツハイマー病治療薬をスクリーニングするための系を提供し得るものと言える。
【０００７】前にも述べたように、アルツハイマー病と関連した形態学的、病理学的変化としては、ＰＨＦの形成及び脳アミロイドの沈着の２点がある。ＰＨＦはアルツハイマー病以外の神経性疾患にも出現するが、神経と神経の間に見られるアミロイド沈着、所謂、老人斑及び脳血管周囲にも沈着するアミロイド沈着は、アルツハイマー病特異的と考えられている。特に、老人斑は高齢者のダウン症候群患者脳（アルツハイマー病も発症させている）でも見られる。老人斑アミロイドを構成する主要蛋白は、部分的に精製され、約４.２ｋＤの３９〜４２個のアミノ酸から成るβ／Ａ４蛋白から成ることが判明した（Glenner G. and Wong C.W., BBRC, vol.120, p.1131-1135, 1984）。このアミノ酸配列は決定され（Glenner G. and Wong C.W., 1984；Masters C.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.82, p.4245-4249, 1985）、そのアミノ酸配列はこれまで報告されている蛋白のものと全く異なるものであった。
【０００８】近年、ヒト胎児脳組織ｃＤＮＡライブラリーよりβ／Ａ４蛋白を含む比較的大きなサイズの蛋白（前駆体）をコードするｃＤＮＡが単離され、そのＤＮＡ配列解析から、６９５個のアミノ酸より成る（この蛋白をＡ６９５という）こと、β／Ａ４蛋白は、アミノ酸配列５９７−６９５の位置に相当することがわかった（Kang J. et al., Nature, vol.325, p.733-736, 1987）。更に、Ａ６９５以外にも、もっと大きいサイズのＡＰＰｃＤＮＡ（A751、A770） が報告された（Kitaguchi et al., Nature, vol.331, p.530-532, 1988)。このＡ７５１蛋白はＡ６９５に５６個分のアミノ酸が付与されたもので、この特殊なインサートは、クニツファミリー（Kunitz family）のセリンプロテアーゼインヒビター（serine protease inhibitor）（以下ＫＰＩと呼ぶ）に非常に高い相同性を示す（Kitaguchi et al., 1988）。一方、Ａ７７０蛋白は、Ａ７５１の５７個のインサートのすぐ後にＭＲＣ ＯＸ−２抗原に相同性の高い１９個分のアミノ酸が挿入されたタイプである。これらＡ７５１、Ａ７７０は、全身臓器に多く発現している。尚、この３者は、同一の遺伝子（ＡＰＰ）からアルターナティブスプライシング（alternative splicing）によって生じることが示されており（Kitaguchi et al.,1988；Ponte P. et al., Nature, vol.331, p.525-527, 1988; Tanz R. et al.,Nature, vol.331, p.528-530, 1988）、いずれもＣ末端から９９番目の間にβ／Ａ４蛋白部分を有すること（２８アミノ酸は細胞膜外に、１１〜１４アミノ酸は細胞膜内に存在）から、脳内のアミロイド沈着に関係する蛋白をコードするものと考えられる。
【０００９】アルツハイマー病患者脳におけるＡＰＰの脳内局在を、ＡＰＰのいくつかの部位に対する数種の抗体を作製し、免疫組織化学的に検討すると、老人斑等が染められることが解かった（Wong C.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.82, p.8729-8732, 1985；Allsop D. et al., Neurosci. Letter, vol.68, p.252-256, 1986; Shoji M. et al., Brain Res., vol.512, p.164-168, 1990a; Shoji M. et al., Am. J. Pathol., vol.137, p.1027-1032, 1990b；Shoji M. etal., Brain Res., vol.530, p.113-116, 1990c）。従って、アルツハイマー病患者脳で見つかった老人斑を構成するアミロイド蛋白はこれら抗体により認識されると言える。これらの抗体を用いて、例えば、ＡＰＰをある動物の脳内で強制発現させた場合、ＡＰＰとその代謝分画蛋白の神経における局在性を追跡することができる。
【００１０】ＡＰＰは全身臓器に広範に発現する蛋白であり、また、蛋白進化の過程でもよく保存された蛋白である（マウスとヒトでは、アミノ酸レベルで97%の一致が見られる）ことから、細胞間接着（cell-cell adhesion）や細胞分化等に重要な役割を果たしているものと想定されたが（Shivers B.D. et al., EMBO. J., vol.7, p.1365-1370, 1988）、正確な役割は未だに不明である。最近、β／Ａ４蛋白が未分化な海馬神経細胞に対し、低濃度では神経栄養因子として働く一方、成熟した神経細胞に対しては、高農度では神経毒性として働くことが示され、注目されている（Yankner B.A. et al., 1989）。この実験系では、栄養因子と神経毒性として働く部分は、β／Ａ４蛋白の２５〜３５番目のアミノ酸に相当し、この部分はタヒキニン系のペプチドと相同性があることが示された（Yankner B.A etal., 1989）。これに関連して興味深いのは、β／Ａ４蛋白を大脳皮質または海馬内へ注入すると、この現象がin vivo においても起こること、及びＰＨＦの構成成分である異常燐酸化タウ（tau）蛋白の生成が誘導された点である（KowallN.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.88, p.7247-7251, 1991）。従って、β／Ａ４蛋白蓄積とＰＨＦ生成の深い関連が示唆された。更に、もっと最近では、ＡＰＰのC末端側の細胞内部位は、プロテイキナーゼＣやＣａ2+／カルモジュリン依存性プロテイキナーゼIIにより燐酸化され (Gandy S. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.85, p.6218-6221, 1988）、また、細胞膜直下に存在する主要ＧＴＰ結合蛋白であるG0とAPPが相互作用するという報告（Nishimoto I et al., Nature, vol.362, p.75-78, 1993）もあり、ＡＰＰがシグナル伝達にも関与する可能性が指摘されている。
【００１１】ＡＰＰ遺伝子はヒトの場合、第２１染色体の長腕に存在することが知られている（Goldgaber D. et al., Science, vol.235, p.877-880, 1987）。近年、家族性アルツハイマー病 (familial Alzheimer's disease)のうち、早期発症型（発症年齢が６５歳以下のもの）家系において、ＡＰＰのアミノ酸番号６４２(KangJ. et al., 1987の配列に基づく；以下、ＡＰＰの塩基配列、アミノ酸配列はKang J. et al., 1987に基づいて表記してある）にＶａｌからＩｌｅへの突然変異が発見された（Goate A. et al. , Nature, vol.349, p.704-706, 1991；NaruseS. et al., Lancet, vol.337, p.978-979, 1991; Yoshioka K. et al., BBRC,vol.178, p.1141- 1146, 1991；Hardy J. et al., Lancet, vol.337, p.1342-1343, 1991）。更に、同じアミノ酸部位にＰｈｅ、Ｇｌyという他の アミノ酸への突然変異が発見され（Murrell J. et al., Science, vol.254, p.97-99, 1991；Chartier-Harlin M-C et al., Nature, vol.353, p.844-846, 1991）、家族性アルツハイマー病の発症にこのValの変異が重要な役割を果たしていると考えられている。また、オランダ型（Dutch-type）の遺伝性脳出血に伴うアミロイド沈着の場合、β／Ａ４蛋白の内部、即ちＡＰＰのアミノ酸番号６１８にＧｌｕからＧｌｎへの突然変異がみられる（Levy E. et al., Science, vol.248, p.1124-1126, 1990）。更には、β／Ａ４蛋白のＮ末端側の２個のアミノ酸の変異（アミノ酸番号５９５のＬｙｓがＡｓｎへ、及びアミノ酸番号５９６のＭｅｔがＬｅｕへ変換）がスウェーデンの家族性アルツハイマー病と関連することが提唱され(Mullan M. et al., Nature Genet, vol.1, p.345-347, 1992)、このタイプはスウェーデン型突然変異と呼ばれる。このようにAPPに関する分子生物学的解析は進んだが、アルツハイマー病患者脳で何故アミロイドが蓄積され、沈着するか、そして、β／Ａ４蛋白の蓄積によりどのように神経細胞が変性していくのかというメカニズムについては何ら有効な情報は未だない。
【００１２】現在、最も問題となっているのは、脳内にアミロイド沈着が生じるためには、ＡＰＰのどのような代謝経路に問題があるのかで、詳細に検討され始めている。例えば、ＡＰＰｃＤＮＡを導入したヒト胎児性腎臓（embryonic kidney）細胞２９３株から、膜結合型C末端分画９ｋＤを抽出し、そのN末端のアミノ酸配列を決定した結果、β／Ａ４蛋白部分のＮ末端から１６番目のＬｙｓでＡＰＰが切断されていることが解かった（Esch F.S. et al., Science, vol.248, p.1122-1124,1990）。しかし、脳アミロイドとして沈着するには、ＡＰＰはβ／Ａ４蛋白部分のＮ末端とＣ末端で切断され凝集することが必要であり、Ｅｓｃｈらの明らかにした代謝系では不溶性のβ／Ａ４蛋白は生成されて来ない。この点から更に、様々な代謝系の関与やその異常等が推定されているが、未だ明らかな結果は得られていない。現在のところ、ＡＰＰのプロセッシングには、1) ＡＰＰをβ／Ａ４蛋白部分の１５番目のアミノ酸で終わる分子量１００ｋＤ以上の分泌性派生体（secretedderivative）とＣ末端側の低分子産物とに分解される、いわゆる分泌経路（secretary pathway）と、2) β／Ａ４蛋白の部分を全長の形で含むC末端側の様々な大きさのペプチドを生成する、いわゆるエンドゾーマル／リソゾーマル経路（endosomal/lysosomal pathway）の２つがあると考えられている（Golde T.E. et al, Science, vol.235, p.728-730, 1992）。
【００１３】従って、上記家族性アルツハイマー病型、オランダ型、及びスウェーデン型のＡＰＰ遺伝子上の３箇所の突然変異が生じた際に、これらの２つの代謝経路はどのように影響されるのかという点はまだ解決されていないが、これらＡＰＰアナログはＡＰＰのプロセッシングの経路をエンドゾーマル／リソゾーマル経路に積極的に変える構造を持つものと想定される。この意味では、これらＡＰＰアナログを過剰発現するトランスジェニック動物システムは、ＡＰＰのプロセッシング機構を明らかにするための有用な材料を提供するものである。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＡＰＰの合成に関する分子機構、詳しくは、ＡＰＰ合成後のＡＰＰのプロセッシングに関する分子機構解明する方法を提供するものである。更に重要なことは、β／Ａ４蛋白の合成と沈着を阻止するための薬剤のin vivoスクリーニング系を提供するものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】アルツハイマー病に関連したＡＰＰをコードするＤＮＡ断片を哺乳動物好ましくはマウスの１細胞期胚の前核に顕微注入し、次いでこの注入された胚は、偽妊娠メスに移植され、トランスジェニック動物出産へと至る。このトランスジェニック動物は、アルツハイマー病に関連するＡＰＰ蛋白を過剰発現すると考えられる。注入されたＤＮＡには、トランスジェニック動物の非特異的で様々なタイプの細胞で目的の蛋白を発現せしめるようなプロモーターが含まれている。β／Ａ４蛋白はＡＰＰのＣ末端側領域から生成されるので、ＡＰＰのＣ末端側領域のみの大量発現は、β／Ａ４蛋白の形成を促進し、その結果として、特有の神経の退化及び老人斑の形成等が始まると考えられる。
【００１６】本発明の重要な点は、β／Ａ４蛋白を含むＡＰＰのＣ末端側領域を強力なプロモーターの制御の下、神経やそれ以外のどのタイプの細胞でも過剰発現させることができる点である。そして、その結果、アルツハイマー病特有の海馬におけるアミロイドの沈着、燐酸化タウ蛋白の出現、グリア細胞の増加、海馬付近における神経細胞死、更には、動物の活発的な行動の低下が引き起こされる点である。また、内在性のＡＰＰｍＲＮＡのアルターナティブスプライシングのパターンの変化もこの発現によって引き起こされる点である。更に、本発明の重要な点は、β／Ａ４蛋白の中で最底1箇所アミノ酸の置換を持つアナログをコードするＤＮＡ配列を有するトランスジェニック動物を作出した点である。これにより、ＡＰＰのエンドゾーマル／リソゾーマル経路におけるプロセッシングに変化をきたし、プロテアーゼの活性特異性が変わるような蛋白が生じる可能性があり、その結果、脳内での大量のアミロイドの蓄積が望まれる。従って、本発明で紹介されたトランスジェニック動物は、ＡＰＰ蛋白とプロテアーゼとの相互作用、あるいは、内在性ＡＰＰと導入された外来性蛋白同志の相互作用等をin vivoで研究するための有用な系を提供するものであり、また、アルツハイマー病治療薬の探索にも利用できるものである。
【００１７】本発明の目的は、β／Ａ４蛋白に相当するＡＰＰのＣ末端側領域、及びそのアナログを神経細胞や他の細胞に強力に発現せしめるために必要なＤＮＡ配列、所謂、組み換えＤＮＡを有するトランスジェニック動物を提供することであり、本発明の有用性としては、このトランスジェニック動物がアルツハイマー病の病因解析及びアルツハイマー病治療薬のin vivo スクリーニングのために用いることができることである。本発明の特徴としては、このトランスジェニック動物がＡＰＰの大量合成、燐酸化タウ蛋白の出現、グリア細胞の増加、神経細胞死等の一連のアルツハイマー病特有の症状を示すため、これまで知られているＡＰＰ遺伝子導入トランスジェニックマウスに比べ、よりアルツハイマー病に近い動物モデルであると言える。本発明をより具体的に説明するため、以下に実施例を示す。
【００１８】
【実施例】次に掲載する実施例は、ＤＮＡ配列、融合（fusion）構築体、トランスジェニックマウス等をどのように作るか等を完全に開示し、記載することを目的としたものだが、これによって本発明が実施例に限定されるものではない。
【００１９】実施例１トランスジェニックマウスで発現されるべきプラスミドｐβＡ／ＮＯＲβ、ｐβＡ／ＦＡＤβ、ｐβＡ／Ｄβ、ｐβＡ／ΔＮＯＲβ及びｐβＡ／ＮＬβの構築マウスで発現させるべき目的遺伝子は以下のように作成した。正常なヒトＡＰＰｃＤＮＡのシグナルペプチド（アミノ酸番号１番目から１７番目）とβ／Ａ４蛋白に相当するＡＰＰのＣ末端側（アミノ酸番号５９７番目から６９５番目）との融合遺伝子（これをＮＯＲβと呼ぶ）をHorton R.M. et al (Gene, vol.77, p.61-68, 1989）の方法に習い合成した。先ず、ヒト脳 ｐｏｌｙ（A）ＲＮＡ（＃6516-1；Clontech社）を材料とし、ＲＴ−ＰＣＲ法によりヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを合成した。用いたプライマー（primer）は、リバースプライマーＢＡＰＰ−６（配列番号７）、センスプライマーＢＡＰＰ−７（配列番号８）、センスプライマーＢＡＰＰ−１０（配列番号９）、 リバースプライマーＢＡＰＰ−１２（配列番号１０）で、これらを適当に組み合わせて用いることにより、ＮＯＲβを合成した。合成されたＮＯＲβは、２％アガロースゲルによる電気泳動で分画し、単離した。このＮＯＲβは、ＸｂａＩ消化後、ｐＧＥＭ３Ｚ(−)（Promega社）のＸｂａＩ部位へ導入し、この組み替えプラスミド（pGEM3Z／NORb）を大腸菌内にて増幅させ、ジデオキシ鎖終止法（dideoxy chain-termination）（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.74, p.5463-5468, 1977）によるシークエンシングを行い、ＮＯＲβ配列が目的通り、正しいことを確認した。
【００２０】Ｄβ（配列番号１と配列番号３の結合したもの）及びＦＡＤβ（配列番号１と配列番号４の結合したもの）は、基本的にＮＯＲβと同じ構造であるが、ＤβはＡＰＰアミノ酸番号６１８にＧｌｕからＧｌｎへの変異を持つオランダ型の遺伝性脳出血アミロイドアンギオパチーで、ＦＡＤβはＡＰＰアミノ酸番号６４２においてＶａｌからＩｌｅへの変異を持つ家族性アルツハイマー病に各々対応する。また、Ｄβ及びＦＡＤβは、そのＡＰＰｃＤＮＡ（Kang J. et al., 1987）３′側の非コード領域約３０ｂｐを含んでいる。これらは、前記ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを基にＨｏｒｔｏｎらの方法に従い、ＰＣＲ法で目的の配列を増幅した。Ｄβの場合、ＢＡＰＰ−１０、 ＢＡＰＰ−６、ＢＡＰＰ−７の他、リバースプライマーＢＡＰＰ−８（配列番号１１）、 センスプライマーＢＡＰＰ−２（配列番号１２）、およびリバースプライマーＢＡＰＰ−１５（配列番号１３）を用いた。ＦＡＤβの場合、ＢＡＰＰ−１０、 ＢＡＰＰ−６、ＢＡＰＰ−７の他、リバースプライマーＢＡＰＰ−３（配列番号１４）、センスプライマーＢＡＰＰ−９（配列番号１５）およびＢＡＰＰ−１５を用いた。
【００２１】ΔＮＯＲβ（配列番号５のペプチドのＮ端にＭｅｔが付加したもの）は、１７個のアミノ酸から成るシグナルペプチドがない点を除けば、基本的にＮＯＲβと同じ構造である。ΔＮＯＲβはセンスプライマーＢＡＰＰ−１３（配列番号１６）およびＢＡＰＰ−１２を用い、ｐＧＥＭ３Ｚ／ＮＯＲβに対しＰＣＲを行い、インサートを増幅させた。増幅された断片はｐＧＥＭ３Ｚにクローニングされ、次いで、シークエンシングを行い、その配列の正しさを確認した。ＮＬβ（配列番号６のペプチドのＮ端にＭｅｔが付加したもの）はΔＮＯＲβと同様、センスプライマーＢＡＰＰ−１４（配列番号１７）およびＢＡＰＰ−１２を用い、ｐＧＥＭ３Ｚ／ＮＯＲβに対しＰＣＲを行い、インサートを増幅させた。増幅された断片はｐＧＥＭ３Ｚにクローニングされ、シークエンシングを行い、その配列の正しさを確認した。ＮＬβはスウェーデン型の遺伝性アルツハイマー病に対応するもので、ＡＰＰのアミノ酸番号５９５のＬｙｓがＡｓｎへ、及びアミノ酸番号５９６のＭｅｔがＬｅｕへ変異している。
【００２２】一方、上記標的遺伝子を発現させるためのべクターを以下のように作成した。ニワトリベータアクチンプロモーターとその上流にサイトメガロウイルスエンハンサーを有する哺乳動物発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Niwa H. et al., Gene, vol.108, p.193-200, 1991）より２.３ｋｂ断片をＳａｌＩ／ＰｓｔＩ消化により切り出し、これをクローニングベクター pBluescript（Stratagene社)の ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位へ挿入し、ｐＢｓＣＡＧ−２ベクターを構築した（図１）。この２.３ｋｂ断片の中には、上記エンハンサー／プロモターの他に、ウサギベータグロビン遺伝子の一部（第２イントロン、第３エクソン、３′側非コード領域から成る）が含まれている。通常、ｃＤＮＡ等の発現させたい目的遺伝子は、第３エクソンのＥｃｏＲＩ部位に挿入される。このｐＢｓＣＡＧ−２のＥｃｏＲＩ部位に上記目的遺伝子ＮＯＲβ、ＦＡＤβ、Ｄβ、ΔＮＯＲβ、及びＮＬβの各種ＤＮＡ断片を挿入し、トランスジェニックマウス発現用プラスミドｐβＡ／ＮＯＲβ、ｐβＡ／ＦＡＤβ、ｐβＡ／Ｄβ、ｐβＡ／ΔＮＯＲβ、及びｐβＡ／ＮＬβを構築した（図２）。マウス１細胞期胚へのＤＮＡ導入には、これら融合構築体よりＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化によりトランスジーンを単離し、これを用いた。
【００２３】尚、この構築には、ＤＮＡを消化したり、つなげたり、ＤＮＡ断片を単離する等の操作が行なわれたが、このためには Maniatis T. et al (Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, 1982）の標準的ＤＮＡ組み換え技術が用いられた。また、インサートの結合部周辺のＤＮＡ配列は、シークエンシングにより確認された。
【００２４】実施例２ １細胞期胚の回収及びそれへのＤＮＡ導入１細胞期胚は、既に雄と交配してあったＢ６Ｃ３Ｆ１雌マウスの輸卵管より回収した。回収した胚は前核期の初期ステージにあり、この時点では雄核と雌核とがまだ分離されており、容易に識別されうる。回収された胚からは周囲に存在する卵胞細胞 (cumulus cell)等を除去し、適当に洗浄後、ＤＮＡ注入まで一時、３７℃、５％ＣＯ2空気条件下で保存される。好ましくは、３０ｍｍ径バクテリオロジカルディッシュ（bacteriological dish ）(No.333656, Nunc社) 上、Ｍ１６培養液（Whittingham D.G., J. Reprod. Fert., vol.4, p.7-21, 1971）５０μｌ ｄｒｏｐ（パラフィン油で覆われる）で保存される。トランスジーンを含む融合構築体は、上述の方法で調製した。上述のいかなる融合構築体も、クローニングされ得、ここで述べる方法に習い、１細胞期胚に導入することができる。
【００２５】次に、主にＮＯＲβ発現ベクター（ｐβＡ／ＮＯＲβ）から得られるＤＮＡの導入について詳細に解説するが、ｐβＡ／ＮＯＲβ以外の他の融合構築体にも通用できる方法である。まず最初に、ｐβＡ／ＮＯＲβは宿主大腸菌にクローニングされ、大量増幅の後、抽出された。更に精製するため、塩化セシウムによる超遠心、続く 臭化エチジュウム（ethidium bromide）の除去後、透析処理に付された。こうして精製されたプラスミドは、適当な制限酵素による消化（この場合、ＳａｌＩとＢａｍＨＩが用いられた）、続く０.８％アガロースゲル電気泳動により、目的のトランスジーンを単離することができる。こうして得られたトランスジーンは、外径が約1mmの注入ピペットを使い、１細胞期胚前核へ顕微注入される（Hogan B. etal., Manipulating the Mouse Embryo, 1986)。トランスジーンを含む約１０μｌのＤＮＡ溶液（約２０００コピーのトランスジーンが含まれる）を吸引し、雄性前核へこのDNAを注入する。注入を受けた胚は、数時間か1日間培養に付され、次いで偽妊娠Ｄａｙ１（プラグ確認日をＤａｙ１と判定する）のＩＣＲ仮親マウス輸卵管内へ移植される。移植を受けた仮親マウスは胎仔を出産するまで飼育される。出産後、新生児は離乳までの１月間、仮親マウスより保育を受け、次いで、尾DNAのサザンブロット解析に付される。トランスジェニック動物と判定されたＦ０マウス（founder）は、他の非トランスジェニックマウスと交配させ、そのＦ１子孫を得た後（それらは卵や精子の形で凍結保存される）、生後１０〜３０週目にてすべて殺処分し、ノーザンブロット解析、病理学的解析に付した。
【００２６】表１には、一つの例として、βＡ−ＮＯＲβトランスジーンを マウス１細胞期胚に注入して得られた結果が示されている。この中にはＤＮＡ注入後、移植されたマウス胚の数、注入された胚の移植後の生存胎仔の数、実際トランスジェニック動物と判定されたＦ０マウス胎仔の数、等が表示されている。
【００２７】
【表１】
【００２８】表１に示されるように、生まれた１２０匹のマウスうち、３５匹は、トランスジェニック動物であった。これらのマウスを飼育した結果、１匹（０３０４）は、生後約１０週目でその活発な動きが低下し、もう１匹（１１０２）は水頭症を発していた。他のトランスジェニック動物は、生後１０〜３０週目までは、正常様であった。これらは、すべて採材されるまでには、その配偶子が取られ、凍結保存に付された。そして、ノーザンブロット、ウエスタンブロットによりスクリーニングを行ない、発現の強い５系統（０２０２、０３０４、１００２、１１０２、１３０１）を選択した、。以下の解析は、主にこの５系統に関するものである。
【００２９】実施例３ トランスジーン由来のｍＲＮＡ発現トランスジーン由来のｍＲＮＡ発現は、０３０４、１１０２等を含むβＡ−ＮＯＲβトランスジェニックマウスの系統においてノーザンブロット解析を行なった。トランスジェニック動物及び非トランスジェニックマウスの脳を含む各種臓器より、全ＲＮＡを単離し、２０μｇの全ＲＮＡを１.１％アガロース／１.１Ｍホルムアルデヒドゲル電気泳動に付し、次いで、ナイロン膜フイルターに移した。プレハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション液 ［５ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮａＣｌ、１５mＭ Na-citrate, ｐＨ７.４）、５０％ホルムアミド、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍｇ／ｍｌの変性サケＤＮＡ、 ５Ｘ Denhardt試薬等を含む］の中で、４２℃にて２時間行った。次いで、ランダムにプライミングしたｃＤＮＡプローブ（ＮＯＲβ断片）を熱変性させた後、これをハイブリダイゼーション液に加え、ハイブリダイゼーションを行った。反応は４２℃にて１８時間行った。洗浄は、０.１ＸＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中、５６℃、２０分間行った。フィルターは−８０℃にて、２４〜７２時間暴した（増感スクリーン＋コダックＸＡＲ−５フイルム使用）。ノーザンブロット解析の一例を図３R>３に示す。図３には、選択されたトランスジェニック動物系統のうち、比較的発現の強い０３０４、１１０２、及び、非トランスジェニック動物のサンプルが示されている。調べた臓器は、脳、肝、腎臓、小腸、精巣である。脳では、０３０４では、内在性のＡ６９５ｍＲＮＡ（〜３.４ｋｂ)の量に比べ、〜１０倍程高いトランスジーン由来mRNAの発現（〜１ｋｂ）があるが、１１０２はそれと比べると、やや低い。非トランスジェニック動物は、トランスジーン由来ｍＲＮＡの発現は全く見られない。同じ傾向は、他の臓器にも見られる。また、興味深いことに、トランスジェニックマウスでは、Ａ６９５ｍＲＮＡが増加している（例えば、１１０２及び０３０４の肝サンプルを参照）とか、Ａ６９５ｍＲＮＡの他にＡ７５１（〜３.８ｋｂ)、及びＡ７７０（〜３.８５ｋｂ)ｍＲＮＡも出現しているのが判かる（例えば、１１０２及び０３０４の脳サンプルを参照）。おそらく、外来性のＮＯＲβの過剰発現の結果、内在性のＡＰＰｍＲＮＡのアルターナティブスプライシングのパターンが何らかの理由で変化を起こした結果と思われる。
【００３０】実施例４ ウェスタンブロット解析βＡ−ＮＯＲβトランスジェニック動物及び非トランスジェニック動物（コントロール）のマウス脳内のＡＰＰ蛋白発現様式をウェスタンブロット解析により決定した。蛋白ホモジネイトを、Shivers B.D.ら（1988）の方法に基づき、脳全てあるいは３／４から調製した。５０μｇ量のサンプルを１０／１６％Tris-Tricine SDSゲルにて電気泳動に付し、イモビルム−Ｐメンブレン（Immobilm-P membrane）へエレクトロブロッティング（electroblotting ）により転写させた。ブロットを抗ＡＰＰ抗体Ｗ６１Ｃ [ＡＰＰのＣ末端側ペプチド（６６０番目から６９５番目）に対するウサギ抗体；Shoji M. et al., 1990c］（1／500希釈）と反応させ、ＥＣＬ（Amersham社）システムによる非RI法による検出システムを用い、ＡＰＰ蛋白の検出を試みた。
【００３１】ウェスタンブロット解析の一例を図４に示す。図４には、１１系統のトランスジェニックマウスと非トランスジェニック動物の結果が示されている。即ち、これまで報告されている哺乳動物ＡＰＰ isoformの平均的サイズに相当する約１２０−ｋｂ近傍のいくつかのバンドがコントロール及びトランスジェニックマウスの脳及び各種臓器の蛋白ホモジネイト中に検出される。更に、今回発現させたトランスジーン由来の蛋白（１１.４ｋＤ）がコントロールサンプルと比べ顕著に増加している。特に、高い発現（５〜６倍）は、０２０２、１００２、１３０１トランスジェニック動物サンプルに見られる。しかしながら、この方法では、β／Ａ４蛋白に相当する〜４.２ｋＤのバンドは検出されず、この蛋白は調べたトランスジェニック動物脳では作られていないか、あっても少ないだろうと考えられる。
【００３２】実施例５ 抗体を用いたマウス脳の免疫組織化学的解析トランスジーンの発現を組織、細胞レベルで詳細に解析するため、トランスジェニック動物及び非トランスジェニック動物から得た脳を含む各種臓器に対し、抗ＡＰＰ抗体を用いた免疫組織化学的染色を行なった。調べたマウスは、βＡ−ＮＯＲβを有する3系統のトランスジェニックマウス、及び非トランスジェニックマウスである。マウスをペントバルビタールで麻酔後、脳を含む各種臓器を摘出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳが溶媒）にて１日間固定後、パラフィンへ包埋し、５μｍ厚の切片を作製した。切片は脱パラフィン後、脱水させ、０.５％過ヨーソ酸にて３０分処理後、正常山羊血清でブロッキングを行い、適当に希釈された抗体（１／500）と反応させた。反応は、室温、３時間行ない、次いでビオチン化された抗ウサギＩｇＧと反応させ（室温、２時間）、更にアビジンービオチンパーオキシダーゼ複合体（avidin-biotin peroxidase complex : ABC) と反応させた。これらの反応は、製造者（ＡＢＣキット; ベクター社, Burlingame, USA)の推薦する方法で行なった。パーオキシダーゼは、3,3′-diamino benzidine (DAB)／NiCl2にて発色、可視化される。切片の核染色は、メチルグリーンにて行なった。時に、切片を抗体で反応させる前に、切片はニッスル（Nissul）染色に付された。
【００３３】βＡ−ＮＯＲβ−０３０４系統のトランスジェニック動物脳切片と非トランスジェニック動物脳切片とをニッスル染色で観察すると、このトランスジェニック動物系統においては、神経細胞死が見られた。特に海馬付近のＣＡ３領域を中心とした海馬錐体細胞での神経の変性、脱落が著しい。図５にその写真を示す。βＡ−ＮＯＲβ−０３０４系統のトランスジェニック動物脳切片と非トランスジェニック動物脳切片とを抗ＡＰＰ抗体の一つＷ６１Ｃで染色すると非トランスジェニック動物脳切片に比べ、トランスジェニック動物脳では、免疫反応は、大脳皮質、海馬等の神経細胞に特に強く見られた。更に陽性反応は、多数の神経突起に見られた。しかし、中脳、脳幹、小脳等には、ほとんど見られなかった。同じような所見は、他の抗体 [Ｗ６３Ｎ；ＡＰＰのＮ末端側のペプチド（１８番目から３８番目）に反応する抗体：Shoji M. et al., 1990c］を用いても見られた。図６にその写真を示す。
【００３４】βＡ−ＮＯＲβ−０３０４系統のトランスジェニック動物脳切片と非トランスジェニック動物脳切片とをグリア細胞（astrocyte）を特異的に染色する抗ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein）抗体と反応させると、トランスジェニック動物脳では非トランスジェニック動物に比べ、大脳皮質、海馬、前脳基底部に著明なグリア細胞の増加を認めた。図７にその写真を示す。グリア細胞の増加は、アルツハイマー病に相関するとされ（Beach T．G. et al., Glia, vol.2,p.420-436, 1989)、おそらく図５から推測されうるに、神経細胞の死滅後、グリア細胞がその後を埋める形で増殖したと考えられる。βＡ−ＮＯＲβ−０３０４系統のトランスジェニック動物脳切片と非トランスジェニック動物脳切片とを異常燐酸化タウ蛋白と特異的に反応する抗体β１−２８（Ihara Y. et al., Nature, vol.304, p.727-730, 1983) で切片を反応させると、トランスジェニック動物脳では、この抗体と反応する構造物が海馬付近に認められた［図８(Ａ)］。このような陽性反応は非トランスジェニック動物脳では認められない［図８(Ｂ)］。
【００３５】トランスジェニックマウスの全身写真を図９R>９に示す。図９の(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニックマウス（写真中央）及び非トランスジェニックマウス（写真上方）の全身写真であり、(Ｂ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニックマウスの全身写真である。
【００３６】
【発明の効果】本発明のトランスジェニックマウスは、マウス脳内に形成される抗ベータ蛋白抗体反応性物質、抗異常燐酸化タウ蛋白抗体反応性物質等のアルツハイマー病特有のパラメーターを減少させる能力に関する薬剤の効果検定に利用できる。例えば、検定されるべき薬剤は対照動物、即ち本発明のトランスジェニック動物でない動物群及び本発明のトランスジェニック動物に同時に投与される。この薬剤は、動物の脳内に上記パラメーターに影響を及ぼすのに充分な期間、あるいは神経細胞死を抑えるのに充分な期間を越えて連続的に投与され得るだろう。この充分な期間を経て薬剤を投与された後、トランスジェニック動物及び対照の非トランスジェニック動物は、供試され、脳内の解析が行われる。そして、上記パラメーターを比較することにより、薬剤の効能についてひとつの決定を下すことができる。
【００３７】
【配列表】
配列番号：１配列の長さ：５１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA起源生物名：ヒト（homo sapiense）
配列の特徴：他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のシグナルペプチド配列ATG CTG CCC GGT TTG GCA CTG CTC CTG CTG GCC GCC TGG ACG GCT CGG 48Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15GCG 51Ala
【００３８】配列番号：２配列の長さ：２９７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA起源生物名：ヒト（homo sapiense）
配列の特徴：他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチド配列GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA AAA 48Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA GGT GCA ATC ATT 96Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG ATC GTC ATC ACC 144Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr 35 40 45 TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT CAT CAT GGT GTG 192Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val 50 55 60 GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC CAC CTG TCC AAG 240Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys 65 70 75 80ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG TTC TTT GAG CAG 288Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln 85 90 95ATG CAG AAC 297Met Gln Asn 99
【００３９】配列番号：３配列の長さ：２９７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA起源生物名：ヒト（homo sapiense）
配列の特徴：他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチド配列GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA AAA 48Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15TTG GTG TTC TTT GCA CAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA GGT GCA ATC ATT 96Leu Val Phe Phe Ala Gln Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG ATC GTC ATC ACC 144Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr 35 40 45 TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT CAT CAT GGT GTG 192Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val 50 55 60 GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC CAC CTG TCC AAG 240Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys 65 70 75 80ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG TTC TTT GAG CAG 288Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln 85 90 95ATG CAG AAC 297Met Gln Asn 99
【００４０】配列番号：４配列の長さ：２９７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA起源生物名：ヒト（homo sapiense）
配列の特徴：他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチド配列GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA AAA 48Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA GGT GCA ATC ATT 96Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG ATC ATC ATC ACC 144Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Ile Ile Thr 35 40 45 TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT CAT CAT GGT GTG 192Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val 50 55 60 GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC CAC CTG TCC AAG 240Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys 65 70 75 80ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG TTC TTT GAG CAG 288Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln 85 90 95ATG CAG AAC 297Met Gln Asn 99
【００４１】配列番号：５配列の長さ：３０９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA起源生物名：ヒト（homo sapiense）
配列の特徴：他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチド配列GAA GTG AAG ATG GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT 48Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 15CAT CAT CAA AAA TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA 96His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 30 GGT GCA ATC ATT GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG 144Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val 35 40 45 ATC GTC ATC ACC TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT 192Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile 50 55 60 CAT CAT GGT GTG GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC 240His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg 65 70 75 80 CAC CTG TCC AAG ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG 288His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 85 90 95 TTC TTT GAG CAG ATG CAG AAC 309Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn 100 103
【００４２】配列番号：６配列の長さ：３０９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA起源生物名：ヒト（homo sapiense）
配列の特徴：他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチド配列GAA GTG AAT CTG GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT 48Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 15 CAT CAT CAA AAA TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA 96His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 30 GGT GCA ATC ATT GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG 144Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val 35 40 45 ATC GTC ATC ACC TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT 192Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile 50 55 60 CAT CAT GGT GTG GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC 240His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg 65 70 75 80 CAC CTG TCC AAG ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG 288His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 85 90 95 TTC TTT GAG CAG ATG CAG AAC 309Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn 100 103
【００４３】配列番号：７配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―6と名付けた。
配列TTCTGCATCC GCCCGAGCCG TCCAGG 26
【００４４】配列番号：８配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―7と名付けた。
配列GCTCGGGCGG ATGCAGAATT CCGACATGA 29
【００４５】配列番号：９配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―10と名付けた。
配列CTCTAGAGAT GCTGCCCGGT TTGGC 25
【００４６】配列番号：１０配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―12と名付けた。
配列GGCTCTAGAG CATGTTCTGC ATCTGCTCAA 30
【００４７】配列番号：１１配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―8と名付けた。
配列GTCTTGTGCA AAGAACACCA A 21
【００４８】配列番号：１２配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―2と名付けた。
配列TTGGTGTTCT TTGCACAAGA T 21
【００４９】配列番号：１３配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―15と名付けた。
配列GGATCCAACT TCAGAGGCTG CTGT 24
【００５０】配列番号：１４配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―3と名付けた。
配列GGTGATGATG ATCACTGTCG C 21
【００５１】配列番号：１５配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―9と名付けた。
配列GCGACAGTGA TCATCATCAC C 21
【００５２】配列番号：１６配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―13と名付けた。
配列GGCTCTAGAG ATGGAAGTGA AGATGGATGC AGAATTCC 38
【００５３】配列番号：１７配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―14と名付けた。
配列GGCTCTAGAG ATGGAAGTGA ATCTGGATGC AGAATTCC 38
【図面の簡単な説明】
【図１】サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーターを有するプラスミドｐＢｓＣＡＧ−２のプラスミドマップを表した図である。
【図２】サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーターとＮＯＲβ、Ｄβ、ＦＡＤβ、ΔＮＯＲβ及びＮＬβとを結合した各種トランスジーンを表わした図である。
【図３】βＡ−ＮＯＲβトランスジェニックマウス（１１０２，０３０４）及び非トランスジェニックマウスから採取した各種組織の全ＲＮＡのノーザンブロット解析結果を示した図である。分子量のサイズはＫで示され、分子量マーカーは図の右側に記されている。
【図４】βＡ−ＮＯＲβトランスジェニックマウス及び非トランスジェニックマウスから採取した脳抽出物のウェスタンブロット解析を示した図である。用いた抗体は抗ＡＰＰ抗体Ｗ６１Ｃである。
【図５】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニック動物脳、そして(Ｂ)は非トランスジェニックマウス脳の海馬領域におけるニッスル染色を表わした写真である。
【図６】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニック動物脳、そして(Ｂ)は非トランスジェニックマウス脳における抗ＡＰＰ抗体Ｗ６１Ｃによる免疫反応産物の顕微鏡写真である。
【図７】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニック動物脳、そして(Ｂ)は非トランスジェニックマウス脳における抗ＧＦＡＰ抗体による免疫反応産物の顕微鏡写真である。
【図８】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニック動物脳、(Ｂ)は非トランスジェニックマウス脳における抗タウ抗体β１−２８による免疫反応産物の顕微鏡写真である。
【図９】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニックマウス及び非トランスジェニックマウスの全身写真であり、(Ｂ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニックマウスの全身写真である。
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、一般的に疾患の治療に関連した薬の開発に有効な動物モデルに関するものである。更に詳しくは、ベータアミロイド前駆体蛋白（β−amyloid precursor protein, APP：以後、これをＡＰＰと呼ぶ）の一部をコードする外来性遺伝子構築体を自らのゲノムに取り込んだトランスジェニック（transgenic）動物の作製に関するもので、その中で、外来性遺伝子構築体をどの細胞タイプでも広く過剰発現させるよう仕組まれている。
【０００２】
【従来の技術】最近の発生工学の発展により、外来性遺伝物質（ＤＮＡ）を胚の核内へ注入するか感染させることにより、胚の染色体にその物質を組み込んだ胚（いわゆる形質転換胚）を作ることができるようになった(Gordon J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.77, p.7380-7384, 1980；Jaenisch R. et al., Cell, vol.32, p.209-216, 1983）。この胚は、仮親（里親）に移植することにより、成長させることができ、得られた成体動物は外来性DNAを自らの染色体に取り込んでおり、且つそれを発現することができる。形質転換された個体は、一般的にトランスジェニック動物と呼ばれる（Gordon J. and Ruddle F., Science, vol.214,p.1244-1246, 1981）。取り込まれた外来性DNAは、トランスジーン（transgene）と呼ばれ、一般的にプロモーターとｃＤＮＡ等の目的遺伝子とから成る。外来性ＤＮＡの発現は、成体にならずとも発現させることができ、例えば、胚の細胞分裂過程でも発現する場合がある。従って、その発現の結果、外来性DNAによりコードされる蛋白が生産され、特にその蛋白が生体にとって重要な機能を果たしているなら、その個体の発生のある時点では、個体の表現型に何らかの変化を引き起こすこともあり得る。表現型の変化を与える様式としては、個体で発現させるべき目的蛋白の過剰発現か、内在性の目的蛋白の発現の抑制があり、それを制御するのは、目的蛋白をコードする遺伝子の上流側に置かれているプロモーターかエンハンサーである。尚、発現抑制の仕方としては、アンチセンス法 (Katsuki M. et al., Science, vol.241, p.593-595, 1988）等が挙げられる。
【０００３】個体が外来性DNAで形質転換された、あるいはその結果、本来の表現型が変わったという報告は、これまでに多くされており、特にPalmiter R.D. and Brinster R.L.（Annu. Rev. Genet., vol.20, p.465-499, 1986）や Gordon J.W.（Int. Rev. of Cytobiol., vol.115, p.171-229, 1989）等の総説に詳しく述べられている。このトランスジェニック動物は、1）発生過程での遺伝子発現のin vivoでの解析、2）遺伝病の克服または軽減に向けた研究等の分野で利用されうる。外来性ＤＮＡによる胚の形質転換は、外来性ＤＮＡを外から与えることにより、最終的に胚核内の染色体内のDNA配列の一部に組み込まれることにより達成される。これを達成するにはいくつかの方法があるが、例えば、外来性DNAを微小ピペットに吸入し、これを１細胞期の前核内へ注入する方法、所謂、顕微注入法(Gordon et al., 1980）が一般的である。
【０００４】ＤＮＡを注入された胚はついで、偽妊娠雌の生殖道（輸卵管または子宮）に移植することにより、１個の生命体へと発生させることができる。この生命体は後日、外来性ＤＮＡを自らの染色体に取り込んでいるかどうか、ＰＣＲ法やサザンブロット法等で解析されることとなる。もしこの取り込みが確認されたら、この動物はin vivoにおける遺伝子発現解析（例えば、ノーザンブロット法や免疫抗体法等による解析）に利用される。この発現により、ヒトのある遺伝病に似た形質を引き起こすことも可能である。
【０００５】アルツハイマー病には、一説では後に述べるように、APPの過剰発現が関連すると考えられている（Terry R.D. and Katsman R, Ann. Neurol. vol.14, p.496-506, 1983）。アルツハイマー病患者脳には、アルツハイマー病特有の神経原線維変化 [neurofibrillay tangles (NFT)、paired helical filaments (PHF) :以後これをＰＨＦと呼ぶ］、老人斑（neuritic plaque または senile plaque）及び脳アミロイド（amyloid）の沈着があり、脳アミロイドはＡＰＰから生じるからである。しかも、最近では、後で述べる家族性アルツハイマー病や遺伝性脳血管アミロイドアンギオパチー（amyloid angiopathy）でＡＰＰの遺伝子異常が発見されたことや、脳内に沈着したアミロイドの主成分であるアミロイドプラークコア蛋白（amyloid plaque core protein；APCP）あるいは、アミロイドコア蛋白（β−amyloid core protein）（後日、このポリペプチドは ベータ蛋白またはβ／Ａ４蛋白と命名される。以後、これをβ／Ａ４蛋白と呼ぶ）自体が神経毒性を有するという報告（Yankner B.A. et al., Science, vol.245, p.417-420, 1989）等から、ＡＰＰからβ／Ａ４蛋白が代謝され、沈着する機序の解明がアルツハイマー病の病因解明の最も本質的なアプローチと考えらている。しかし、残念ながら、これまでアルツハイマー病のモデルとなる動物が知られていないか、あるいは、確立されていないため、このような仮説を立証する手立てがなかった。そこで、人為的にＡＰＰ遺伝子を組み込ませたトランスジェニック動物を作り、このＡＰＰをトランスジェニック動物脳内で過剰発現させ、アミロイド沈着を引き起こした結果、最終的にアルツハイマー病に似た動物、所謂ヒトアルツハイマー病モデルができる可能性がある。
【０００６】最近、ヒトのＡＰＰｃＤＮＡの全長あるいはー部分を過剰発現させることにより、脳内のアミロイド沈着を引き起こしたトランスジェニックマウスがいくつかの研究室から相次いで報告された（Kawabata S. et al., Nature, vol.345, p.476-478, 1991；Quon D. et al., Nature, vol.352, p.239-241, 1991；Wirak D.O. et al., Science, vol.253, p.323-325, 1991）。しかし、Kawabata らの報告は、その後、追試に成功せず、論文は撤回された（Nature, vol.356, p.265,1992）。更に、Ｗｉｒａｋらの報告も、その形質変化はトランスジーンによるものではないということである（Science, 28, Feb., 1992）。特許出願でもいくつかのアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物を確立したという報告が、例えばＷＯ９３／１４２００、ＷＯ９３／０２１８９、ＷＯ９２／１３０６９、ＷＯ９２／０６１８７、ＷＯ９１／１９８１０、ＥＰ４５１７００及びＷＯ８９／０６６８９として公開されているが、いずれも遺伝子の構築だけであったり、得られたトランスジェニック動物で単にＡＰＰの沈着がみられたといった間接的な証拠しかない。従って、現在のところ、はっきりとしたアルツハイマー病モデル動物は確立されていないと思われる。これに対し、本発明で作出されたトランスジェニック動物は、アルツハイマー病に伴う様々な症状と類似した形質を示しており、この意味では本発明で作出されたトランスジェニック動物は、アルツハイマー病の発症原因の解明のための実験系を提供し、また、アルツハイマー病発症の阻止、あるいは、アルツハイマー病発症に伴う神経細胞死等を阻止するようなアルツハイマー病治療薬をスクリーニングするための系を提供し得るものと言える。
【０００７】前にも述べたように、アルツハイマー病と関連した形態学的、病理学的変化としては、ＰＨＦの形成及び脳アミロイドの沈着の２点がある。ＰＨＦはアルツハイマー病以外の神経性疾患にも出現するが、神経と神経の間に見られるアミロイド沈着、所謂、老人斑及び脳血管周囲にも沈着するアミロイド沈着は、アルツハイマー病特異的と考えられている。特に、老人斑は高齢者のダウン症候群患者脳（アルツハイマー病も発症させている）でも見られる。老人斑アミロイドを構成する主要蛋白は、部分的に精製され、約４.２ｋＤの３９〜４２個のアミノ酸から成るβ／Ａ４蛋白から成ることが判明した（Glenner G. and Wong C.W., BBRC, vol.120, p.1131-1135, 1984）。このアミノ酸配列は決定され（Glenner G. and Wong C.W., 1984；Masters C.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.82, p.4245-4249, 1985）、そのアミノ酸配列はこれまで報告されている蛋白のものと全く異なるものであった。
【０００８】近年、ヒト胎児脳組織ｃＤＮＡライブラリーよりβ／Ａ４蛋白を含む比較的大きなサイズの蛋白（前駆体）をコードするｃＤＮＡが単離され、そのＤＮＡ配列解析から、６９５個のアミノ酸より成る（この蛋白をＡ６９５という）こと、β／Ａ４蛋白は、アミノ酸配列５９７−６９５の位置に相当することがわかった（Kang J. et al., Nature, vol.325, p.733-736, 1987）。更に、Ａ６９５以外にも、もっと大きいサイズのＡＰＰｃＤＮＡ（A751、A770） が報告された（Kitaguchi et al., Nature, vol.331, p.530-532, 1988)。このＡ７５１蛋白はＡ６９５に５６個分のアミノ酸が付与されたもので、この特殊なインサートは、クニツファミリー（Kunitz family）のセリンプロテアーゼインヒビター（serine protease inhibitor）（以下ＫＰＩと呼ぶ）に非常に高い相同性を示す（Kitaguchi et al., 1988）。一方、Ａ７７０蛋白は、Ａ７５１の５７個のインサートのすぐ後にＭＲＣ ＯＸ−２抗原に相同性の高い１９個分のアミノ酸が挿入されたタイプである。これらＡ７５１、Ａ７７０は、全身臓器に多く発現している。尚、この３者は、同一の遺伝子（ＡＰＰ）からアルターナティブスプライシング（alternative splicing）によって生じることが示されており（Kitaguchi et al.,1988；Ponte P. et al., Nature, vol.331, p.525-527, 1988; Tanz R. et al.,Nature, vol.331, p.528-530, 1988）、いずれもＣ末端から９９番目の間にβ／Ａ４蛋白部分を有すること（２８アミノ酸は細胞膜外に、１１〜１４アミノ酸は細胞膜内に存在）から、脳内のアミロイド沈着に関係する蛋白をコードするものと考えられる。
【０００９】アルツハイマー病患者脳におけるＡＰＰの脳内局在を、ＡＰＰのいくつかの部位に対する数種の抗体を作製し、免疫組織化学的に検討すると、老人斑等が染められることが解かった（Wong C.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.82, p.8729-8732, 1985；Allsop D. et al., Neurosci. Letter, vol.68, p.252-256, 1986; Shoji M. et al., Brain Res., vol.512, p.164-168, 1990a; Shoji M. et al., Am. J. Pathol., vol.137, p.1027-1032, 1990b；Shoji M. etal., Brain Res., vol.530, p.113-116, 1990c）。従って、アルツハイマー病患者脳で見つかった老人斑を構成するアミロイド蛋白はこれら抗体により認識されると言える。これらの抗体を用いて、例えば、ＡＰＰをある動物の脳内で強制発現させた場合、ＡＰＰとその代謝分画蛋白の神経における局在性を追跡することができる。
【００１０】ＡＰＰは全身臓器に広範に発現する蛋白であり、また、蛋白進化の過程でもよく保存された蛋白である（マウスとヒトでは、アミノ酸レベルで97%の一致が見られる）ことから、細胞間接着（cell-cell adhesion）や細胞分化等に重要な役割を果たしているものと想定されたが（Shivers B.D. et al., EMBO. J., vol.7, p.1365-1370, 1988）、正確な役割は未だに不明である。最近、β／Ａ４蛋白が未分化な海馬神経細胞に対し、低濃度では神経栄養因子として働く一方、成熟した神経細胞に対しては、高農度では神経毒性として働くことが示され、注目されている（Yankner B.A. et al., 1989）。この実験系では、栄養因子と神経毒性として働く部分は、β／Ａ４蛋白の２５〜３５番目のアミノ酸に相当し、この部分はタヒキニン系のペプチドと相同性があることが示された（Yankner B.A etal., 1989）。これに関連して興味深いのは、β／Ａ４蛋白を大脳皮質または海馬内へ注入すると、この現象がin vivo においても起こること、及びＰＨＦの構成成分である異常燐酸化タウ（tau）蛋白の生成が誘導された点である（KowallN.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.88, p.7247-7251, 1991）。従って、β／Ａ４蛋白蓄積とＰＨＦ生成の深い関連が示唆された。更に、もっと最近では、ＡＰＰのC末端側の細胞内部位は、プロテイキナーゼＣやＣａ2+／カルモジュリン依存性プロテイキナーゼIIにより燐酸化され (Gandy S. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.85, p.6218-6221, 1988）、また、細胞膜直下に存在する主要ＧＴＰ結合蛋白であるG0とAPPが相互作用するという報告（Nishimoto I et al., Nature, vol.362, p.75-78, 1993）もあり、ＡＰＰがシグナル伝達にも関与する可能性が指摘されている。
【００１１】ＡＰＰ遺伝子はヒトの場合、第２１染色体の長腕に存在することが知られている（Goldgaber D. et al., Science, vol.235, p.877-880, 1987）。近年、家族性アルツハイマー病 (familial Alzheimer's disease)のうち、早期発症型（発症年齢が６５歳以下のもの）家系において、ＡＰＰのアミノ酸番号６４２(KangJ. et al., 1987の配列に基づく；以下、ＡＰＰの塩基配列、アミノ酸配列はKang J. et al., 1987に基づいて表記してある）にＶａｌからＩｌｅへの突然変異が発見された（Goate A. et al. , Nature, vol.349, p.704-706, 1991；NaruseS. et al., Lancet, vol.337, p.978-979, 1991; Yoshioka K. et al., BBRC,vol.178, p.1141- 1146, 1991；Hardy J. et al., Lancet, vol.337, p.1342-1343, 1991）。更に、同じアミノ酸部位にＰｈｅ、Ｇｌyという他の アミノ酸への突然変異が発見され（Murrell J. et al., Science, vol.254, p.97-99, 1991；Chartier-Harlin M-C et al., Nature, vol.353, p.844-846, 1991）、家族性アルツハイマー病の発症にこのValの変異が重要な役割を果たしていると考えられている。また、オランダ型（Dutch-type）の遺伝性脳出血に伴うアミロイド沈着の場合、β／Ａ４蛋白の内部、即ちＡＰＰのアミノ酸番号６１８にＧｌｕからＧｌｎへの突然変異がみられる（Levy E. et al., Science, vol.248, p.1124-1126, 1990）。更には、β／Ａ４蛋白のＮ末端側の２個のアミノ酸の変異（アミノ酸番号５９５のＬｙｓがＡｓｎへ、及びアミノ酸番号５９６のＭｅｔがＬｅｕへ変換）がスウェーデンの家族性アルツハイマー病と関連することが提唱され(Mullan M. et al., Nature Genet, vol.1, p.345-347, 1992)、このタイプはスウェーデン型突然変異と呼ばれる。このようにAPPに関する分子生物学的解析は進んだが、アルツハイマー病患者脳で何故アミロイドが蓄積され、沈着するか、そして、β／Ａ４蛋白の蓄積によりどのように神経細胞が変性していくのかというメカニズムについては何ら有効な情報は未だない。
【００１２】現在、最も問題となっているのは、脳内にアミロイド沈着が生じるためには、ＡＰＰのどのような代謝経路に問題があるのかで、詳細に検討され始めている。例えば、ＡＰＰｃＤＮＡを導入したヒト胎児性腎臓（embryonic kidney）細胞２９３株から、膜結合型C末端分画９ｋＤを抽出し、そのN末端のアミノ酸配列を決定した結果、β／Ａ４蛋白部分のＮ末端から１６番目のＬｙｓでＡＰＰが切断されていることが解かった（Esch F.S. et al., Science, vol.248, p.1122-1124,1990）。しかし、脳アミロイドとして沈着するには、ＡＰＰはβ／Ａ４蛋白部分のＮ末端とＣ末端で切断され凝集することが必要であり、Ｅｓｃｈらの明らかにした代謝系では不溶性のβ／Ａ４蛋白は生成されて来ない。この点から更に、様々な代謝系の関与やその異常等が推定されているが、未だ明らかな結果は得られていない。現在のところ、ＡＰＰのプロセッシングには、1) ＡＰＰをβ／Ａ４蛋白部分の１５番目のアミノ酸で終わる分子量１００ｋＤ以上の分泌性派生体（secretedderivative）とＣ末端側の低分子産物とに分解される、いわゆる分泌経路（secretary pathway）と、2) β／Ａ４蛋白の部分を全長の形で含むC末端側の様々な大きさのペプチドを生成する、いわゆるエンドゾーマル／リソゾーマル経路（endosomal/lysosomal pathway）の２つがあると考えられている（Golde T.E. et al, Science, vol.235, p.728-730, 1992）。
【００１３】従って、上記家族性アルツハイマー病型、オランダ型、及びスウェーデン型のＡＰＰ遺伝子上の３箇所の突然変異が生じた際に、これらの２つの代謝経路はどのように影響されるのかという点はまだ解決されていないが、これらＡＰＰアナログはＡＰＰのプロセッシングの経路をエンドゾーマル／リソゾーマル経路に積極的に変える構造を持つものと想定される。この意味では、これらＡＰＰアナログを過剰発現するトランスジェニック動物システムは、ＡＰＰのプロセッシング機構を明らかにするための有用な材料を提供するものである。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＡＰＰの合成に関する分子機構、詳しくは、ＡＰＰ合成後のＡＰＰのプロセッシングに関する分子機構解明する方法を提供するものである。更に重要なことは、β／Ａ４蛋白の合成と沈着を阻止するための薬剤のin vivoスクリーニング系を提供するものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】アルツハイマー病に関連したＡＰＰをコードするＤＮＡ断片を哺乳動物好ましくはマウスの１細胞期胚の前核に顕微注入し、次いでこの注入された胚は、偽妊娠メスに移植され、トランスジェニック動物出産へと至る。このトランスジェニック動物は、アルツハイマー病に関連するＡＰＰ蛋白を過剰発現すると考えられる。注入されたＤＮＡには、トランスジェニック動物の非特異的で様々なタイプの細胞で目的の蛋白を発現せしめるようなプロモーターが含まれている。β／Ａ４蛋白はＡＰＰのＣ末端側領域から生成されるので、ＡＰＰのＣ末端側領域のみの大量発現は、β／Ａ４蛋白の形成を促進し、その結果として、特有の神経の退化及び老人斑の形成等が始まると考えられる。
【００１６】本発明の重要な点は、β／Ａ４蛋白を含むＡＰＰのＣ末端側領域を強力なプロモーターの制御の下、神経やそれ以外のどのタイプの細胞でも過剰発現させることができる点である。そして、その結果、アルツハイマー病特有の海馬におけるアミロイドの沈着、燐酸化タウ蛋白の出現、グリア細胞の増加、海馬付近における神経細胞死、更には、動物の活発的な行動の低下が引き起こされる点である。また、内在性のＡＰＰｍＲＮＡのアルターナティブスプライシングのパターンの変化もこの発現によって引き起こされる点である。更に、本発明の重要な点は、β／Ａ４蛋白の中で最底1箇所アミノ酸の置換を持つアナログをコードするＤＮＡ配列を有するトランスジェニック動物を作出した点である。これにより、ＡＰＰのエンドゾーマル／リソゾーマル経路におけるプロセッシングに変化をきたし、プロテアーゼの活性特異性が変わるような蛋白が生じる可能性があり、その結果、脳内での大量のアミロイドの蓄積が望まれる。従って、本発明で紹介されたトランスジェニック動物は、ＡＰＰ蛋白とプロテアーゼとの相互作用、あるいは、内在性ＡＰＰと導入された外来性蛋白同志の相互作用等をin vivoで研究するための有用な系を提供するものであり、また、アルツハイマー病治療薬の探索にも利用できるものである。
【００１７】本発明の目的は、β／Ａ４蛋白に相当するＡＰＰのＣ末端側領域、及びそのアナログを神経細胞や他の細胞に強力に発現せしめるために必要なＤＮＡ配列、所謂、組み換えＤＮＡを有するトランスジェニック動物を提供することであり、本発明の有用性としては、このトランスジェニック動物がアルツハイマー病の病因解析及びアルツハイマー病治療薬のin vivo スクリーニングのために用いることができることである。本発明の特徴としては、このトランスジェニック動物がＡＰＰの大量合成、燐酸化タウ蛋白の出現、グリア細胞の増加、神経細胞死等の一連のアルツハイマー病特有の症状を示すため、これまで知られているＡＰＰ遺伝子導入トランスジェニックマウスに比べ、よりアルツハイマー病に近い動物モデルであると言える。本発明をより具体的に説明するため、以下に実施例を示す。
【００１８】
【実施例】次に掲載する実施例は、ＤＮＡ配列、融合（fusion）構築体、トランスジェニックマウス等をどのように作るか等を完全に開示し、記載することを目的としたものだが、これによって本発明が実施例に限定されるものではない。
【００１９】実施例１トランスジェニックマウスで発現されるべきプラスミドｐβＡ／ＮＯＲβ、ｐβＡ／ＦＡＤβ、ｐβＡ／Ｄβ、ｐβＡ／ΔＮＯＲβ及びｐβＡ／ＮＬβの構築マウスで発現させるべき目的遺伝子は以下のように作成した。正常なヒトＡＰＰｃＤＮＡのシグナルペプチド（アミノ酸番号１番目から１７番目）とβ／Ａ４蛋白に相当するＡＰＰのＣ末端側（アミノ酸番号５９７番目から６９５番目）との融合遺伝子（これをＮＯＲβと呼ぶ）をHorton R.M. et al (Gene, vol.77, p.61-68, 1989）の方法に習い合成した。先ず、ヒト脳 ｐｏｌｙ（A）ＲＮＡ（＃6516-1；Clontech社）を材料とし、ＲＴ−ＰＣＲ法によりヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを合成した。用いたプライマー（primer）は、リバースプライマーＢＡＰＰ−６（配列番号７）、センスプライマーＢＡＰＰ−７（配列番号８）、センスプライマーＢＡＰＰ−１０（配列番号９）、 リバースプライマーＢＡＰＰ−１２（配列番号１０）で、これらを適当に組み合わせて用いることにより、ＮＯＲβを合成した。合成されたＮＯＲβは、２％アガロースゲルによる電気泳動で分画し、単離した。このＮＯＲβは、ＸｂａＩ消化後、ｐＧＥＭ３Ｚ(−)（Promega社）のＸｂａＩ部位へ導入し、この組み替えプラスミド（pGEM3Z／NORb）を大腸菌内にて増幅させ、ジデオキシ鎖終止法（dideoxy chain-termination）（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.74, p.5463-5468, 1977）によるシークエンシングを行い、ＮＯＲβ配列が目的通り、正しいことを確認した。
【００２０】Ｄβ（配列番号１と配列番号３の結合したもの）及びＦＡＤβ（配列番号１と配列番号４の結合したもの）は、基本的にＮＯＲβと同じ構造であるが、ＤβはＡＰＰアミノ酸番号６１８にＧｌｕからＧｌｎへの変異を持つオランダ型の遺伝性脳出血アミロイドアンギオパチーで、ＦＡＤβはＡＰＰアミノ酸番号６４２においてＶａｌからＩｌｅへの変異を持つ家族性アルツハイマー病に各々対応する。また、Ｄβ及びＦＡＤβは、そのＡＰＰｃＤＮＡ（Kang J. et al., 1987）３′側の非コード領域約３０ｂｐを含んでいる。これらは、前記ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを基にＨｏｒｔｏｎらの方法に従い、ＰＣＲ法で目的の配列を増幅した。Ｄβの場合、ＢＡＰＰ−１０、 ＢＡＰＰ−６、ＢＡＰＰ−７の他、リバースプライマーＢＡＰＰ−８（配列番号１１）、 センスプライマーＢＡＰＰ−２（配列番号１２）、およびリバースプライマーＢＡＰＰ−１５（配列番号１３）を用いた。ＦＡＤβの場合、ＢＡＰＰ−１０、 ＢＡＰＰ−６、ＢＡＰＰ−７の他、リバースプライマーＢＡＰＰ−３（配列番号１４）、センスプライマーＢＡＰＰ−９（配列番号１５）およびＢＡＰＰ−１５を用いた。
【００２１】ΔＮＯＲβ（配列番号５のペプチドのＮ端にＭｅｔが付加したもの）は、１７個のアミノ酸から成るシグナルペプチドがない点を除けば、基本的にＮＯＲβと同じ構造である。ΔＮＯＲβはセンスプライマーＢＡＰＰ−１３（配列番号１６）およびＢＡＰＰ−１２を用い、ｐＧＥＭ３Ｚ／ＮＯＲβに対しＰＣＲを行い、インサートを増幅させた。増幅された断片はｐＧＥＭ３Ｚにクローニングされ、次いで、シークエンシングを行い、その配列の正しさを確認した。ＮＬβ（配列番号６のペプチドのＮ端にＭｅｔが付加したもの）はΔＮＯＲβと同様、センスプライマーＢＡＰＰ−１４（配列番号１７）およびＢＡＰＰ−１２を用い、ｐＧＥＭ３Ｚ／ＮＯＲβに対しＰＣＲを行い、インサートを増幅させた。増幅された断片はｐＧＥＭ３Ｚにクローニングされ、シークエンシングを行い、その配列の正しさを確認した。ＮＬβはスウェーデン型の遺伝性アルツハイマー病に対応するもので、ＡＰＰのアミノ酸番号５９５のＬｙｓがＡｓｎへ、及びアミノ酸番号５９６のＭｅｔがＬｅｕへ変異している。
【００２２】一方、上記標的遺伝子を発現させるためのべクターを以下のように作成した。ニワトリベータアクチンプロモーターとその上流にサイトメガロウイルスエンハンサーを有する哺乳動物発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Niwa H. et al., Gene, vol.108, p.193-200, 1991）より２.３ｋｂ断片をＳａｌＩ／ＰｓｔＩ消化により切り出し、これをクローニングベクター pBluescript（Stratagene社)の ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位へ挿入し、ｐＢｓＣＡＧ−２ベクターを構築した（図１）。この２.３ｋｂ断片の中には、上記エンハンサー／プロモターの他に、ウサギベータグロビン遺伝子の一部（第２イントロン、第３エクソン、３′側非コード領域から成る）が含まれている。通常、ｃＤＮＡ等の発現させたい目的遺伝子は、第３エクソンのＥｃｏＲＩ部位に挿入される。このｐＢｓＣＡＧ−２のＥｃｏＲＩ部位に上記目的遺伝子ＮＯＲβ、ＦＡＤβ、Ｄβ、ΔＮＯＲβ、及びＮＬβの各種ＤＮＡ断片を挿入し、トランスジェニックマウス発現用プラスミドｐβＡ／ＮＯＲβ、ｐβＡ／ＦＡＤβ、ｐβＡ／Ｄβ、ｐβＡ／ΔＮＯＲβ、及びｐβＡ／ＮＬβを構築した（図２）。マウス１細胞期胚へのＤＮＡ導入には、これら融合構築体よりＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化によりトランスジーンを単離し、これを用いた。
【００２３】尚、この構築には、ＤＮＡを消化したり、つなげたり、ＤＮＡ断片を単離する等の操作が行なわれたが、このためには Maniatis T. et al (Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, 1982）の標準的ＤＮＡ組み換え技術が用いられた。また、インサートの結合部周辺のＤＮＡ配列は、シークエンシングにより確認された。
【００２４】実施例２ １細胞期胚の回収及びそれへのＤＮＡ導入１細胞期胚は、既に雄と交配してあったＢ６Ｃ３Ｆ１雌マウスの輸卵管より回収した。回収した胚は前核期の初期ステージにあり、この時点では雄核と雌核とがまだ分離されており、容易に識別されうる。回収された胚からは周囲に存在する卵胞細胞 (cumulus cell)等を除去し、適当に洗浄後、ＤＮＡ注入まで一時、３７℃、５％ＣＯ2空気条件下で保存される。好ましくは、３０ｍｍ径バクテリオロジカルディッシュ（bacteriological dish ）(No.333656, Nunc社) 上、Ｍ１６培養液（Whittingham D.G., J. Reprod. Fert., vol.4, p.7-21, 1971）５０μｌ ｄｒｏｐ（パラフィン油で覆われる）で保存される。トランスジーンを含む融合構築体は、上述の方法で調製した。上述のいかなる融合構築体も、クローニングされ得、ここで述べる方法に習い、１細胞期胚に導入することができる。
【００２５】次に、主にＮＯＲβ発現ベクター（ｐβＡ／ＮＯＲβ）から得られるＤＮＡの導入について詳細に解説するが、ｐβＡ／ＮＯＲβ以外の他の融合構築体にも通用できる方法である。まず最初に、ｐβＡ／ＮＯＲβは宿主大腸菌にクローニングされ、大量増幅の後、抽出された。更に精製するため、塩化セシウムによる超遠心、続く 臭化エチジュウム（ethidium bromide）の除去後、透析処理に付された。こうして精製されたプラスミドは、適当な制限酵素による消化（この場合、ＳａｌＩとＢａｍＨＩが用いられた）、続く０.８％アガロースゲル電気泳動により、目的のトランスジーンを単離することができる。こうして得られたトランスジーンは、外径が約1mmの注入ピペットを使い、１細胞期胚前核へ顕微注入される（Hogan B. etal., Manipulating the Mouse Embryo, 1986)。トランスジーンを含む約１０μｌのＤＮＡ溶液（約２０００コピーのトランスジーンが含まれる）を吸引し、雄性前核へこのDNAを注入する。注入を受けた胚は、数時間か1日間培養に付され、次いで偽妊娠Ｄａｙ１（プラグ確認日をＤａｙ１と判定する）のＩＣＲ仮親マウス輸卵管内へ移植される。移植を受けた仮親マウスは胎仔を出産するまで飼育される。出産後、新生児は離乳までの１月間、仮親マウスより保育を受け、次いで、尾DNAのサザンブロット解析に付される。トランスジェニック動物と判定されたＦ０マウス（founder）は、他の非トランスジェニックマウスと交配させ、そのＦ１子孫を得た後（それらは卵や精子の形で凍結保存される）、生後１０〜３０週目にてすべて殺処分し、ノーザンブロット解析、病理学的解析に付した。
【００２６】表１には、一つの例として、βＡ−ＮＯＲβトランスジーンを マウス１細胞期胚に注入して得られた結果が示されている。この中にはＤＮＡ注入後、移植されたマウス胚の数、注入された胚の移植後の生存胎仔の数、実際トランスジェニック動物と判定されたＦ０マウス胎仔の数、等が表示されている。
【００２７】
【表１】
【００２８】表１に示されるように、生まれた１２０匹のマウスうち、３５匹は、トランスジェニック動物であった。これらのマウスを飼育した結果、１匹（０３０４）は、生後約１０週目でその活発な動きが低下し、もう１匹（１１０２）は水頭症を発していた。他のトランスジェニック動物は、生後１０〜３０週目までは、正常様であった。これらは、すべて採材されるまでには、その配偶子が取られ、凍結保存に付された。そして、ノーザンブロット、ウエスタンブロットによりスクリーニングを行ない、発現の強い５系統（０２０２、０３０４、１００２、１１０２、１３０１）を選択した、。以下の解析は、主にこの５系統に関するものである。
【００２９】実施例３ トランスジーン由来のｍＲＮＡ発現トランスジーン由来のｍＲＮＡ発現は、０３０４、１１０２等を含むβＡ−ＮＯＲβトランスジェニックマウスの系統においてノーザンブロット解析を行なった。トランスジェニック動物及び非トランスジェニックマウスの脳を含む各種臓器より、全ＲＮＡを単離し、２０μｇの全ＲＮＡを１.１％アガロース／１.１Ｍホルムアルデヒドゲル電気泳動に付し、次いで、ナイロン膜フイルターに移した。プレハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション液 ［５ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮａＣｌ、１５mＭ Na-citrate, ｐＨ７.４）、５０％ホルムアミド、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍｇ／ｍｌの変性サケＤＮＡ、 ５Ｘ Denhardt試薬等を含む］の中で、４２℃にて２時間行った。次いで、ランダムにプライミングしたｃＤＮＡプローブ（ＮＯＲβ断片）を熱変性させた後、これをハイブリダイゼーション液に加え、ハイブリダイゼーションを行った。反応は４２℃にて１８時間行った。洗浄は、０.１ＸＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中、５６℃、２０分間行った。フィルターは−８０℃にて、２４〜７２時間暴した（増感スクリーン＋コダックＸＡＲ−５フイルム使用）。ノーザンブロット解析の一例を図３R>３に示す。図３には、選択されたトランスジェニック動物系統のうち、比較的発現の強い０３０４、１１０２、及び、非トランスジェニック動物のサンプルが示されている。調べた臓器は、脳、肝、腎臓、小腸、精巣である。脳では、０３０４では、内在性のＡ６９５ｍＲＮＡ（〜３.４ｋｂ)の量に比べ、〜１０倍程高いトランスジーン由来mRNAの発現（〜１ｋｂ）があるが、１１０２はそれと比べると、やや低い。非トランスジェニック動物は、トランスジーン由来ｍＲＮＡの発現は全く見られない。同じ傾向は、他の臓器にも見られる。また、興味深いことに、トランスジェニックマウスでは、Ａ６９５ｍＲＮＡが増加している（例えば、１１０２及び０３０４の肝サンプルを参照）とか、Ａ６９５ｍＲＮＡの他にＡ７５１（〜３.８ｋｂ)、及びＡ７７０（〜３.８５ｋｂ)ｍＲＮＡも出現しているのが判かる（例えば、１１０２及び０３０４の脳サンプルを参照）。おそらく、外来性のＮＯＲβの過剰発現の結果、内在性のＡＰＰｍＲＮＡのアルターナティブスプライシングのパターンが何らかの理由で変化を起こした結果と思われる。
【００３０】実施例４ ウェスタンブロット解析βＡ−ＮＯＲβトランスジェニック動物及び非トランスジェニック動物（コントロール）のマウス脳内のＡＰＰ蛋白発現様式をウェスタンブロット解析により決定した。蛋白ホモジネイトを、Shivers B.D.ら（1988）の方法に基づき、脳全てあるいは３／４から調製した。５０μｇ量のサンプルを１０／１６％Tris-Tricine SDSゲルにて電気泳動に付し、イモビルム−Ｐメンブレン（Immobilm-P membrane）へエレクトロブロッティング（electroblotting ）により転写させた。ブロットを抗ＡＰＰ抗体Ｗ６１Ｃ [ＡＰＰのＣ末端側ペプチド（６６０番目から６９５番目）に対するウサギ抗体；Shoji M. et al., 1990c］（1／500希釈）と反応させ、ＥＣＬ（Amersham社）システムによる非RI法による検出システムを用い、ＡＰＰ蛋白の検出を試みた。
【００３１】ウェスタンブロット解析の一例を図４に示す。図４には、１１系統のトランスジェニックマウスと非トランスジェニック動物の結果が示されている。即ち、これまで報告されている哺乳動物ＡＰＰ isoformの平均的サイズに相当する約１２０−ｋｂ近傍のいくつかのバンドがコントロール及びトランスジェニックマウスの脳及び各種臓器の蛋白ホモジネイト中に検出される。更に、今回発現させたトランスジーン由来の蛋白（１１.４ｋＤ）がコントロールサンプルと比べ顕著に増加している。特に、高い発現（５〜６倍）は、０２０２、１００２、１３０１トランスジェニック動物サンプルに見られる。しかしながら、この方法では、β／Ａ４蛋白に相当する〜４.２ｋＤのバンドは検出されず、この蛋白は調べたトランスジェニック動物脳では作られていないか、あっても少ないだろうと考えられる。
【００３２】実施例５ 抗体を用いたマウス脳の免疫組織化学的解析トランスジーンの発現を組織、細胞レベルで詳細に解析するため、トランスジェニック動物及び非トランスジェニック動物から得た脳を含む各種臓器に対し、抗ＡＰＰ抗体を用いた免疫組織化学的染色を行なった。調べたマウスは、βＡ−ＮＯＲβを有する3系統のトランスジェニックマウス、及び非トランスジェニックマウスである。マウスをペントバルビタールで麻酔後、脳を含む各種臓器を摘出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳが溶媒）にて１日間固定後、パラフィンへ包埋し、５μｍ厚の切片を作製した。切片は脱パラフィン後、脱水させ、０.５％過ヨーソ酸にて３０分処理後、正常山羊血清でブロッキングを行い、適当に希釈された抗体（１／500）と反応させた。反応は、室温、３時間行ない、次いでビオチン化された抗ウサギＩｇＧと反応させ（室温、２時間）、更にアビジンービオチンパーオキシダーゼ複合体（avidin-biotin peroxidase complex : ABC) と反応させた。これらの反応は、製造者（ＡＢＣキット; ベクター社, Burlingame, USA)の推薦する方法で行なった。パーオキシダーゼは、3,3′-diamino benzidine (DAB)／NiCl2にて発色、可視化される。切片の核染色は、メチルグリーンにて行なった。時に、切片を抗体で反応させる前に、切片はニッスル（Nissul）染色に付された。
【００３３】βＡ−ＮＯＲβ−０３０４系統のトランスジェニック動物脳切片と非トランスジェニック動物脳切片とをニッスル染色で観察すると、このトランスジェニック動物系統においては、神経細胞死が見られた。特に海馬付近のＣＡ３領域を中心とした海馬錐体細胞での神経の変性、脱落が著しい。図５にその写真を示す。βＡ−ＮＯＲβ−０３０４系統のトランスジェニック動物脳切片と非トランスジェニック動物脳切片とを抗ＡＰＰ抗体の一つＷ６１Ｃで染色すると非トランスジェニック動物脳切片に比べ、トランスジェニック動物脳では、免疫反応は、大脳皮質、海馬等の神経細胞に特に強く見られた。更に陽性反応は、多数の神経突起に見られた。しかし、中脳、脳幹、小脳等には、ほとんど見られなかった。同じような所見は、他の抗体 [Ｗ６３Ｎ；ＡＰＰのＮ末端側のペプチド（１８番目から３８番目）に反応する抗体：Shoji M. et al., 1990c］を用いても見られた。図６にその写真を示す。
【００３４】βＡ−ＮＯＲβ−０３０４系統のトランスジェニック動物脳切片と非トランスジェニック動物脳切片とをグリア細胞（astrocyte）を特異的に染色する抗ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein）抗体と反応させると、トランスジェニック動物脳では非トランスジェニック動物に比べ、大脳皮質、海馬、前脳基底部に著明なグリア細胞の増加を認めた。図７にその写真を示す。グリア細胞の増加は、アルツハイマー病に相関するとされ（Beach T．G. et al., Glia, vol.2,p.420-436, 1989)、おそらく図５から推測されうるに、神経細胞の死滅後、グリア細胞がその後を埋める形で増殖したと考えられる。βＡ−ＮＯＲβ−０３０４系統のトランスジェニック動物脳切片と非トランスジェニック動物脳切片とを異常燐酸化タウ蛋白と特異的に反応する抗体β１−２８（Ihara Y. et al., Nature, vol.304, p.727-730, 1983) で切片を反応させると、トランスジェニック動物脳では、この抗体と反応する構造物が海馬付近に認められた［図８(Ａ)］。このような陽性反応は非トランスジェニック動物脳では認められない［図８(Ｂ)］。
【００３５】トランスジェニックマウスの全身写真を図９R>９に示す。図９の(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニックマウス（写真中央）及び非トランスジェニックマウス（写真上方）の全身写真であり、(Ｂ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニックマウスの全身写真である。
【００３６】
【発明の効果】本発明のトランスジェニックマウスは、マウス脳内に形成される抗ベータ蛋白抗体反応性物質、抗異常燐酸化タウ蛋白抗体反応性物質等のアルツハイマー病特有のパラメーターを減少させる能力に関する薬剤の効果検定に利用できる。例えば、検定されるべき薬剤は対照動物、即ち本発明のトランスジェニック動物でない動物群及び本発明のトランスジェニック動物に同時に投与される。この薬剤は、動物の脳内に上記パラメーターに影響を及ぼすのに充分な期間、あるいは神経細胞死を抑えるのに充分な期間を越えて連続的に投与され得るだろう。この充分な期間を経て薬剤を投与された後、トランスジェニック動物及び対照の非トランスジェニック動物は、供試され、脳内の解析が行われる。そして、上記パラメーターを比較することにより、薬剤の効能についてひとつの決定を下すことができる。
【００３７】
【配列表】
配列番号：１配列の長さ：５１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA起源生物名：ヒト（homo sapiense）
配列の特徴：他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のシグナルペプチド配列ATG CTG CCC GGT TTG GCA CTG CTC CTG CTG GCC GCC TGG ACG GCT CGG 48Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15GCG 51Ala
【００３８】配列番号：２配列の長さ：２９７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA起源生物名：ヒト（homo sapiense）
配列の特徴：他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチド配列GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA AAA 48Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA GGT GCA ATC ATT 96Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG ATC GTC ATC ACC 144Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr 35 40 45 TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT CAT CAT GGT GTG 192Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val 50 55 60 GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC CAC CTG TCC AAG 240Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys 65 70 75 80ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG TTC TTT GAG CAG 288Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln 85 90 95ATG CAG AAC 297Met Gln Asn 99
【００３９】配列番号：３配列の長さ：２９７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA起源生物名：ヒト（homo sapiense）
配列の特徴：他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチド配列GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA AAA 48Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15TTG GTG TTC TTT GCA CAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA GGT GCA ATC ATT 96Leu Val Phe Phe Ala Gln Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG ATC GTC ATC ACC 144Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr 35 40 45 TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT CAT CAT GGT GTG 192Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val 50 55 60 GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC CAC CTG TCC AAG 240Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys 65 70 75 80ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG TTC TTT GAG CAG 288Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln 85 90 95ATG CAG AAC 297Met Gln Asn 99
【００４０】配列番号：４配列の長さ：２９７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA起源生物名：ヒト（homo sapiense）
配列の特徴：他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチド配列GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA AAA 48Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA GGT GCA ATC ATT 96Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG ATC ATC ATC ACC 144Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Ile Ile Thr 35 40 45 TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT CAT CAT GGT GTG 192Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val 50 55 60 GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC CAC CTG TCC AAG 240Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys 65 70 75 80ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG TTC TTT GAG CAG 288Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln 85 90 95ATG CAG AAC 297Met Gln Asn 99
【００４１】配列番号：５配列の長さ：３０９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA起源生物名：ヒト（homo sapiense）
配列の特徴：他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチド配列GAA GTG AAG ATG GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT 48Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 15CAT CAT CAA AAA TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA 96His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 30 GGT GCA ATC ATT GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG 144Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val 35 40 45 ATC GTC ATC ACC TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT 192Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile 50 55 60 CAT CAT GGT GTG GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC 240His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg 65 70 75 80 CAC CTG TCC AAG ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG 288His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 85 90 95 TTC TTT GAG CAG ATG CAG AAC 309Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn 100 103
【００４２】配列番号：６配列の長さ：３０９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA起源生物名：ヒト（homo sapiense）
配列の特徴：他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチド配列GAA GTG AAT CTG GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT 48Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 15 CAT CAT CAA AAA TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA 96His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 30 GGT GCA ATC ATT GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG 144Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val 35 40 45 ATC GTC ATC ACC TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT 192Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile 50 55 60 CAT CAT GGT GTG GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC 240His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg 65 70 75 80 CAC CTG TCC AAG ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG 288His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 85 90 95 TTC TTT GAG CAG ATG CAG AAC 309Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn 100 103
【００４３】配列番号：７配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―6と名付けた。
配列TTCTGCATCC GCCCGAGCCG TCCAGG 26
【００４４】配列番号：８配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―7と名付けた。
配列GCTCGGGCGG ATGCAGAATT CCGACATGA 29
【００４５】配列番号：９配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―10と名付けた。
配列CTCTAGAGAT GCTGCCCGGT TTGGC 25
【００４６】配列番号：１０配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―12と名付けた。
配列GGCTCTAGAG CATGTTCTGC ATCTGCTCAA 30
【００４７】配列番号：１１配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―8と名付けた。
配列GTCTTGTGCA AAGAACACCA A 21
【００４８】配列番号：１２配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―2と名付けた。
配列TTGGTGTTCT TTGCACAAGA T 21
【００４９】配列番号：１３配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―15と名付けた。
配列GGATCCAACT TCAGAGGCTG CTGT 24
【００５０】配列番号：１４配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―3と名付けた。
配列GGTGATGATG ATCACTGTCG C 21
【００５１】配列番号：１５配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―9と名付けた。
配列GCGACAGTGA TCATCATCAC C 21
【００５２】配列番号：１６配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―13と名付けた。
配列GGCTCTAGAG ATGGAAGTGA AGATGGATGC AGAATTCC 38
【００５３】配列番号：１７配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸起源：なし生物名：なし株名：なし配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―14と名付けた。
配列GGCTCTAGAG ATGGAAGTGA ATCTGGATGC AGAATTCC 38
【図面の簡単な説明】
【図１】サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーターを有するプラスミドｐＢｓＣＡＧ−２のプラスミドマップを表した図である。
【図２】サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーターとＮＯＲβ、Ｄβ、ＦＡＤβ、ΔＮＯＲβ及びＮＬβとを結合した各種トランスジーンを表わした図である。
【図３】βＡ−ＮＯＲβトランスジェニックマウス（１１０２，０３０４）及び非トランスジェニックマウスから採取した各種組織の全ＲＮＡのノーザンブロット解析結果を示した図である。分子量のサイズはＫで示され、分子量マーカーは図の右側に記されている。
【図４】βＡ−ＮＯＲβトランスジェニックマウス及び非トランスジェニックマウスから採取した脳抽出物のウェスタンブロット解析を示した図である。用いた抗体は抗ＡＰＰ抗体Ｗ６１Ｃである。
【図５】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニック動物脳、そして(Ｂ)は非トランスジェニックマウス脳の海馬領域におけるニッスル染色を表わした写真である。
【図６】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニック動物脳、そして(Ｂ)は非トランスジェニックマウス脳における抗ＡＰＰ抗体Ｗ６１Ｃによる免疫反応産物の顕微鏡写真である。
【図７】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニック動物脳、そして(Ｂ)は非トランスジェニックマウス脳における抗ＧＦＡＰ抗体による免疫反応産物の顕微鏡写真である。
【図８】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニック動物脳、(Ｂ)は非トランスジェニックマウス脳における抗タウ抗体β１−２８による免疫反応産物の顕微鏡写真である。
【図９】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニックマウス及び非トランスジェニックマウスの全身写真であり、(Ｂ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニックマウスの全身写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 １) ベータアクチンプロモーターのＤＮＡ配列、２) サイトメガロウイルスエンハンサーのＤＮＡ配列、３) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および４) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白の９９ないし１０３個のアミノ酸残基長のＣ末端ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする組み換え遺伝子が、体細胞および生殖細胞に組み込まれた、ヒト以外の哺乳動物であるアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【請求項２】 ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のシグナルペプチドが、配列表の配列番号１のペプチドである請求項１のアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【請求項３】 １) ベータアクチンプロモーターのＤＮＡ配列、２) サイトメガロウイルスエンハンサーのＤＮＡ配列、および３) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白の９９ないし１０３個のアミノ酸残基長のＣ末端ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする組み換え遺伝子が、体細胞および生殖細胞に組み込まれた、ヒト以外の哺乳動物であるアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【請求項４】 ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のＣ末端ペプチドが、１) 配列番号２のアミノ酸配列を有する、正常ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のペプチド、２) 配列番号３のアミノ酸配列を有する、２２番目のグルタミン酸がグルタミンに変換した変異体ペプチド、３) 配列番号４のアミノ酸配列を有する、４６番目のバリンがイソロイシンに変換した変異体ペプチド、４) 配列番号５のアミノ酸配列を有する正常ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のペプチド、または５) 配列番号６のアミノ酸配列を有する、３番目のリジンがアスパラギンに、４番目のメチオニンがロイシンに変換した変異体ペプチドから選ばれる請求項１〜３のアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【請求項５】 海馬領域において以下の組織病理学的特徴、１) ベータアミロイド前駆体蛋白質Ｃ末端ペプチドの大量合成、２) ＣＡ領域の海馬錐体細胞での神経細胞死、３) グリア細胞の増加、および４）異常リン酸化タウ蛋白質の沈着を有する、請求項１〜４のアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【請求項６】 マウスである請求項１〜５のアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【請求項１】 １) ベータアクチンプロモーターのＤＮＡ配列、２) サイトメガロウイルスエンハンサーのＤＮＡ配列、３) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および４) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白の９９ないし１０３個のアミノ酸残基長のＣ末端ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする組み換え遺伝子が、体細胞および生殖細胞に組み込まれた、ヒト以外の哺乳動物であるアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【請求項２】 ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のシグナルペプチドが、配列表の配列番号１のペプチドである請求項１のアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【請求項３】 １) ベータアクチンプロモーターのＤＮＡ配列、２) サイトメガロウイルスエンハンサーのＤＮＡ配列、および３) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白の９９ないし１０３個のアミノ酸残基長のＣ末端ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする組み換え遺伝子が、体細胞および生殖細胞に組み込まれた、ヒト以外の哺乳動物であるアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【請求項４】 ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のＣ末端ペプチドが、１) 配列番号２のアミノ酸配列を有する、正常ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のペプチド、２) 配列番号３のアミノ酸配列を有する、２２番目のグルタミン酸がグルタミンに変換した変異体ペプチド、３) 配列番号４のアミノ酸配列を有する、４６番目のバリンがイソロイシンに変換した変異体ペプチド、４) 配列番号５のアミノ酸配列を有する正常ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のペプチド、または５) 配列番号６のアミノ酸配列を有する、３番目のリジンがアスパラギンに、４番目のメチオニンがロイシンに変換した変異体ペプチドから選ばれる請求項１〜３のアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【請求項５】 海馬領域において以下の組織病理学的特徴、１) ベータアミロイド前駆体蛋白質Ｃ末端ペプチドの大量合成、２) ＣＡ領域の海馬錐体細胞での神経細胞死、３) グリア細胞の増加、および４）異常リン酸化タウ蛋白質の沈着を有する、請求項１〜４のアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【請求項６】 マウスである請求項１〜５のアルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
【図１】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開平７−１３２０３３
【公開日】平成７年（１９９５）５月２３日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平５−３０６０２６
【出願日】平成５年（１９９３）１１月１２日
【出願人】（０００１１３１３７）ヘキストジャパン株式会社 (2)
【公開日】平成７年（１９９５）５月２３日
【国際特許分類】
【出願日】平成５年（１９９３）１１月１２日
【出願人】（０００１１３１３７）ヘキストジャパン株式会社 (2)
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