アルツハイマー病予防薬
【課題】本発明は、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／または予防に有用な物質、当該物質を含む、γセクレターゼの阻害またはアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料および食品／飲料添加剤を提供する。
【解決手段】ヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウの少なくとも１種以上、とりわけヒシュカ、カンジュウまたはライコウトウ、特にヒシュカのエキスを含む、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤を提供する。
【解決手段】ヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウの少なくとも１種以上、とりわけヒシュカ、カンジュウまたはライコウトウ、特にヒシュカのエキスを含む、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／または予防に有用な物質、当該物質を含む、γセクレターゼの阻害またはアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料および食品／飲料添加剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
超高齢化社会に突入しつつある我が国では、アルツハイマー病に代表される認知症を患う患者の急激な増加が予想される。しかしながら、現在、有効な治療法が無いため、患者のみならず患者の家族を救う手段が無い。今十分な対応策を講じなければ、来るべき医療費と人的負担の膨大な増加は、我が国の存亡をも左右しかねない事態になる。一方、この状況は多くの先進国にも当てはまり、アルツハイマー病に対する有効な治療法の開発は、先進国に共通する重要課題である。特に世界でもっとも顕著な高齢化社会を迎えつつある我が国にとって、この分野の研究の推進ほど、緊急かつ重要な科学政策は無いとさえいえる。
【０００３】
アルツハイマー病の病因の最も上流に位置すると考えられているのが老人斑の主要構成成分であるＡβの産生である。Ａβは、その前駆体蛋白質であるＡＰＰ(ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ)の膜貫通近傍部分からβセクレターゼとγセクレターゼの２つの蛋白質プロセシング酵素の働きで切り出される。遺伝性アルツハイマー病では、ほとんどの症例でＡβ（特にＡβ４２）の産生亢進が観察され、アルツハイマー病の発症には、γセクレターゼによるＡβのＡＰＰからの切り出しが重要な役割を有すると考えられている。したがって、アルツハイマー病の処置および／または予防用の薬物を得るために、γセクレターゼ阻害活性についてスクリーニングすることが行われており、そのようなスクリーニングによって、いくつかの化合物が、実際にγセクレターゼ阻害剤として同定されている。しかし、多くのγセクレターゼ阻害剤は、同時にＮｏｔｃｈシグナリングを抑制し、したがって副作用を惹起することも知られている。
【０００４】
現在、アルツハイマー病の処置および／または予防に有用な物質として、ドネペジル塩酸塩（商品名：アリセプト、エーザイ）、リバスチグミン（商品名：イクセロン、ノバルティス）、メマンチン塩酸塩（商品名：メマリー、第一三共）およびガランタミン臭化水素酸塩（商品名：レミニール、ヤンセンファーマ）が存在するが、効果が高く、少ない副作用で長期投与が可能なアルツハイマー病の処置および／または予防薬は今もなお必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、γセクレターゼ阻害剤、特に少ない副作用で長期投与が可能なアルツハイマー病の処置および／または予防に有用な物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、まず、アルツハイマー病発症の最初のイベントであるＡβの産生を担うγセクレターゼの活性を簡単に評価するアッセイ系を構築した。次に、このアッセイ系を用いて漢方薬の原料等として使用されている約１６００種類の植物のエキスをスクリーングし、γセクレターゼの阻害活性をもつ数種類のエキスを同定した。その内の１つ、ヒシュカに含まれるγセクレターゼの阻害成分を精製し、その分子量と構造を決定した。
【０００７】
同定されたγセクレターゼ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化１】
の構造を有するｇａｒｃｉｎｉｅｌｌｉｐｔｏｎｅ ＨＣであった。
【０００８】
したがって本発明は、第一の態様において、ヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウの各植物エキスのうち、少なくとも１種以上、とりわけヒシュカ、カンジュウまたはライコウトウのエキス、特にヒシュカのエキスを含む、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【化２】
の化合物を含む、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤を提供する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、対象におけるγセクレターゼの阻害またはアルツハイマー病の処置および／もしくは予防方法であって、当該対象に治療上有効量のヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウの各植物エキスのうち、少なくとも１種以上、とりわけヒシュカ、カンジュウまたはライコウトウ、特にヒシュカのエキス、あるいは式（Ｉ）：
【化３】
の化合物を投与することを含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
アルツハイマー病に対する薬物治療・予防においては、かなりの長期間に渡って薬物投与を行う必要が想定される。したがって、いかに副作用の少ない治療薬を提供できるかが極めて重要となる。このような少ない副作用という点で、漢方薬に代表される植物エキスは、数百年から千年を超えてヒトに使われており、大幅に摂取量を間違わない限り安全であることが実証されており、有益である。アルツハイマー病は、食生活の欧米化と長寿によって顕在化してきた病気であり、実際、古来の中国での経験則からは、アルツハイマー病の治療・予防効果がある漢方薬という記載は無い。しかしながら、本発明者らは、漢方薬に代表される植物エキスにアルツハイマー病に対する有効な成分を含むものが存在することを見出した。とりわけ本発明の漢方薬のエキスは、γセクレターゼの活性を阻害することによって、アルツハイマー病の病因の最も上流に位置するＡβ（Ａβ４０および／またはＡβ４２）の産生を減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】レポーターアッセイの概略を示す。
【図２】８つの生薬エキスのγセクレターゼ阻害活性を示す。コントロールにはＤＭＳＯを用いた。
【図３】ＥＬＩＳＡ法によるＡβ４０の産生量の測定結果を示す。ポジティブコントロールにはＤＡＰＴ（０，３０，１００ｎＭ）を用いた。
【図４】ＥＬＩＳＡ法によるＡβ４２の産生量の測定結果を示す。ポジティブコントロールにはＤＡＰＴ（０，３０，１００ｎＭ）を用いた。
【図５】モリスの水迷路試験-Iの結果を示す。
【図６】モリスの水迷路試験-IIの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、第一の態様において、ヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウの各植物エキスのうち、少なくとも１種以上、とりわけヒシュカ、カンジュウまたはライコウトウ、特にヒシュカのエキスを含む、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤を提供する。
【００１４】
ヒシュカは植物名ホップであり、特にその雌花序をエキスの原料として用いる。ヒシュカのエキス、特にヒシュカの雌花序エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ｇ６０）。
カンジュウは植物名オシダ（ゼンマイ）であり、特にその根茎をエキスの原料として用いる。オシダのエキス、特にオシダの根茎エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ａ５０）。
ライコウトウは植物名クロヅルであり、特にその根、葉および花をエキスの原料として用いる。ライコウトウのエキス、特にライコウトウの根、葉または花エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ｈ３４）。
フンボウイは植物名シマハスノハカズラであり、特にその蔓性の根茎および茎をエキスの原料として用いる。フンボウイのエキス、特にフンボウイの根茎または茎エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ａ２７）。
【００１５】
クジンは植物名クララであり、特にその根をエキスの原料として用いる。クジンのエキス、特にクジンの根エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ａ２）。
クレンピは植物名センダンであり、特にその樹皮および根皮をエキスの原料として用いる。クレンピのエキス、特にクレンピの樹皮または根皮エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ｃ１５）。
カダンリュウは植物名オキナワクジャクシダであり、特にその全草または根茎をエキスの原料として用いる。カダンリュウのエキス、特にカダンリュウの全草または根茎エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ｈ２２）。
ハクシュウは植物名ダイコンゴヒショウであり、特にその根をエキスの原料として用いる。ハクシュウのエキス、特にハクシュウの根エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ａ３）。
【００１６】
本発明において、「エキス」は、原料植物を水、アルコール等の溶媒で抽出した抽出液、抽出液を濃縮したもの、抽出液を完全に乾燥させて固体もしくは半固体としたもの、抽出液、濃縮液もしくは乾燥物を水、アルコール、糖等の希釈媒で希釈したもののいずれかまたはいずれをも意味する。抽出は、製剤学または食品工学の分野において通常用いられる方法によって行うことができる。上記エキスは、原料植物を溶媒で抽出した粗抽出物であってもよいし、粗抽出物を常法により精製することで得られる抽出物画分であってもよい。また、抽出に使用する溶媒としては、例えば、水、エタノール（例えば濃度７０容積％以上）、メタノール（例えば濃度７０容積％以上）、ヘキサン（例えば濃度９０容積％以上）、クロロホルム（例えば濃度９０容積％以上）またはそれらの混合物などを挙げることができ、特にエタノールまたはメタノールが好ましい。
【００１７】
エキスを製造するにあたり、原料植物は、生の状態であってもよいし、乾燥品や粗乾燥品であってもよいが、γセクレターゼの阻害活性を有する成分を効率的に抽出するという観点から、原料植物を常法により粉砕してから抽出することが好ましい。なお、乾燥品または粗乾燥品を原料植物として使用する場合には、乾燥品または粗乾燥品を水に戻してから粉砕し、その後凍結乾燥して再度粉砕した素材を抽出に使用することが好ましい。
【００１８】
第一の態様における本発明の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤は、前記した植物の各エキスのうち、１種のみ含むものであってもよいし、２種以上、例えば２種、３種またはそれ以上含むものであってもよい。また、本発明の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤は、γセクレターゼの阻害活性を有する他の材料（前記した植物以外の材料）を併せて含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤は、各植物エキスを、それぞれの全体質量に対して０．０１〜９９質量％、好ましくは０．１〜８０質量％、さらに好ましくは０．２〜５０質量％の範囲内で含んでいてよい。本発明の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤において、各植物エキスの１日の摂取量が体重１ｋｇ当たり１〜３２０ｍｇ（エキス質量（例えば製造元栄進商事の各植物エキスの質量を意味する。以下同じ。））となるように設定することが好ましく、４〜１６０ｍｇ（エキス質量）となるように設定することがより好ましく、８〜８０ｍｇ（エキス質量）となるように添加量を設定することがさらに好ましい。
【００２０】
別の態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【化４】
の化合物を有効成分として含む、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤を提供する。この態様において、有効成分の含有量は、γセクレターゼの阻害活性を失わない範囲であればよく、具体的には０．０１〜９９質量％であり、好ましくは０．１〜８０質量％、さらに好ましくは０．２〜５０質量％である。
【００２１】
本発明において、「式（Ｉ）：
【化５】
の化合物」についての一般的な情報は、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６９，２００８，２２５−２３３に記載されている。この文献を参照により本明細書に引用する。本発明の式（Ｉ）の化合物は、全合成、半合成または生物資源からの単離精製によって得ることができる。例えば当該化合物は、ヒシュカのエキスから、例えば実施例に記載のとおりに、単離精製して得ることができる。
【００２２】
本発明において、「組成物」は、目的に応じて様々な態様で使用することができる。例えば、飲食用、医薬用などとして安全かつ有効に使用することができる。また、組成物は飲食用、医薬用のほか、例えば、いわゆる医薬部外品としても使用することができる。具体的には、例えば、軟膏、リニメント剤、エアゾール剤、クリーム、石鹸、洗顔料、全身洗浄料、化粧水、ローション、入浴剤などに添加して、局所的に使用することができる。
【００２３】
なお、組成物には、必要に応じて、添加物を添加することができる。添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、滑沢剤、結合剤、コーティング 剤、着色剤、基剤、酸化防止剤、溶解剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、粘着剤などを挙げることができる。また、組成物には、有機物または無機物の担体を使用することができる。担体としては、例えば、乳糖、澱粉、油脂などを挙げることができる。
【００２４】
本発明において、「剤」は、典型的には薬剤を意味する。薬剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、経口液剤、シロップ剤、経口ゼリー剤、注射剤、エキス剤、丸剤、チンキ剤等であってよいが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明において、「薬剤」は、製剤学分野において通常用いられる賦形剤または担体を含んでいてよい。また「薬剤」は、薬学的に許容される添加剤、例えば着色剤、安定化剤、抗酸化剤、防腐剤、pH調節剤、等張化剤、溶解補助剤、風味剤、滑沢剤、コーティング剤等を含んでいてもよい。このような薬剤の製造方法は、意図する剤形に応じて、製剤学分野における当業者が適宜選択し、容易に実施できる。
【００２６】
本発明において、「食品」は、動物、特にヒトが食するものであれば特にその範囲が限定されず、例えばゼリー、ガム、飴等を含む。
本発明において、「飲料」は、動物、特にヒトが飲用するものであれば特にその範囲が限定されず、例えば水、茶、栄養補助飲料、アルコール飲料等を含む。
本発明において、「食品／飲料添加剤」は、それのみを喫食することを意図しないが、食品または飲料と共に喫食されるものを意味し、例えば調味料等を含む。
本発明の「食品」、「飲料」および「食品／飲料添加剤」は、食品工学の分野において通常用いられる成分を含んでいてよく、またその分野における当業者が通常実施するとおりに製造することができる。
【００２７】
前記した植物のエキスまたは式（Ｉ）の化合物を食品または飲料中に含ませることによって、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、機能性食品、栄養補助食品とすることができる。具体的には、例えば、澱粉質食品、練り製品、菓子類、冷菓類、飲料、調味料、サプリメント、その他の加工食品などに植物のエキスまたは式（Ｉ）の化合物を添加することができる。
【００２８】
本発明において、「γセクレターゼの阻害」は、γセクレターゼ活性を測定したとき、例えば下記実施例に記載のγセクレターゼ阻害アッセイ系を用いて活性を測定したとき、ポジティブコントロール、例えばＤＭＳＯ水溶液と比して有意に、例えば約５％以上、好ましくは約１０％以上、より好ましくは約２０％以上、さらに好ましくは約３０％以上、最も好ましくは約４０％以上γセクレターゼ活性を低下させることを意味する。
【００２９】
本発明において、「アルツハイマー病の処置」は、病理学的または臨床症状的観点における、アルツハイマー病またはアルツハイマー型認知症の治療、進行の停止もしくは遅延または症状の軽減を意味する。
本発明において、「アルツハイマー病の予防」は、アルツハイマー病またはアルツハイマー型認知症の発症の予防を意味する。
【００３０】
本発明において、「対象」は、アルツハイマー病を患っているかまたは患い得る動物、例えばヒトを含む哺乳類を意味する。
本発明において、「治療上有効量」は、アルツハイマー病の処置および／または予防に有効な量を意味し、具体的な量は、様々な要因、例えば、用いる具体的なエキス、患者の性別、体重、年齢、さらに、患者の一般的な健康状態、疾患の程度、剤形、投与経路、投与回数などの種々の条件に応じて適宜設定することができる。例えば、γセクレターゼ阻害剤剤の１日の投与量は、体重１ｋｇ当たり１０〜６４０ｍｇ（エキス質量）となるように設定することが好ましく、２０〜４８０ｍｇ（エキス質量）となるように設定することがより好ましく、４０〜３２０ｍｇ（エキス質量）となるように設定することがさらに好ましい。なお、投与は１日数回に分けてすることができ、１回の投与で使用される薬剤中に含まれる組成物の含有量は、投与回数にあわせて適宜調整することができる。
【実施例】
【００３１】
γセクレターゼ活性測定アッセイ
Ａβの前駆体であるＡＰＰのＣ−末部位に酵母の転写因子であるＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域と単純ヘルペスウイルスの転写活性化領域を融合したＧＡＬ４−ＶＰ１６（Ｇ４Ｖ１６）を付加した蛋白質（ＡＰＰ−Ｇ４Ｖ１６）を発現させるベクターを構築した。このＧＡＬ４−ＶＰ１６は、転写研究領域で汎用されている強力な転写因子で、その活性は、プロモーター領域にＧＡＬ４認識配列（ＵＡＳ）を４個挿入したルシフェラーゼのレポーター（ＴＫ ４ｘ（ＵＡＳ）ＬＵＣ）で測定することができる。このＡＰＰ−Ｇ４Ｖ１６とＴＫ ４ｘ（ＵＡＳ）ＬＵＣを培養細胞にトランスフェクションし、２４時間後に細胞を回収し、その抽出液のルシフェラーゼ活性を測定した。このルシフェラーゼ活性は、既存のγセクレターゼの阻害剤であるＤＡＰＴを添加することで減少したので、γセクレターゼによって膜に存在するＡＰＰ−Ｇ４Ｖ１６が切断された結果、Ｇ４Ｖ１６が核に移行してレポーターの転写を活性化していることが確認できた。従って、このアッセイ（以下レポーターアッセイ）を用いることで、γセクレターゼに対する阻害活性をルシフェラーゼの活性を指標に評価することが可能となった。レポーターアッセイの概略を図１に示す。
【００３２】
γセクレターゼ阻害活性を持つ漢方薬エキスのスクリーニング
上記レポーターアッセイを用いて、現在ヒトに対して使用されている漢方薬の原材料となっている約１６００種類の植物エキスに対して、それらのエキスがγセクレターゼの阻害活性を含んでいるかどうかを検証した。このアッセイでは、非特異的な転写抑制作用が擬陽性になるため、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターでβガラクトシダーゼ（βｇａｌ）を発現させるプラスミッド（ｐＣＭＶ−βｇａｌ）を同時にトランスフェクションし、βｇａｌ 活性に変化を与えずルシフェラーゼ活性を低下させるものをポジティブと判定した。このスクリーニングによって、ヒシュカと他に幾つかの漢方薬エキスがルシフェラーゼ活性の特異的な低下を示した。結果を図２に示す。有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで行った。
【００３３】
ＥＬＩＳＡ法によるＡβ４０およびＡβ４２の産生量の測定
スクリーニングした漢方薬エキスが実際にγセクレターゼの阻害活性があることを下記ＥＬＩＳＡ法によって確認した。
方法：家族性アルツハイマー病で同定されたＬｏｎｄｏｎ変異（Ｖ７１７Ｆ）をもつ変異ＡＰＰを発現させるベクターとβｇａｌを発現させるベクターをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、２４時間後に、エキスを培地に投与した。さらに２４時間後、βｇａｌの活性の定量とＡβ４０およびＡβ４２の産生量の定量を、ＷＡＫＯ ｈｕｍａｎβ ａｍｉｌｏｉｄ ＥＬＩＳＡキットを用いて行った。トランスフェクション効率を補正するため、Ａβ４０およびＡβ４２の産生量は、βｇａｌの活性で補正した。γセクレターゼ阻害のポジティブコントロールには、既知のβセクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴを用いた。また、βｇａｌを発現させるベクターのみをトランスフェクションし変異ＡＰＰを発現させていない時（mock）のＡβ４０およびＡβ４２の産生量も測定し、βｇａｌの活性で補正した。結果を図３および４に示す。有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで行った。
【００３４】
ヒシュカ由来γセクレターゼ阻害物質の精製と構造決定
ヒシュカエキスをＢｌｉｇｈ Ｄｙｅｒ法により水溶性、脂溶性の２層に分離した後、レポーターアッセイによりエキス中のγセクレターゼ阻害活性が脂溶性分画に移行していることを確認した。続いて、この脂溶性分画をＳｉｌｉｃａ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓを使用した固相抽出により３分画に分離した。用いた溶媒は（１）ヘキサン：クロロホルム＝５０：５０、（２）クロロホルム：メタノール＝９９：１、（３）１００％メタノールで、レポーターアッセイによりγセクレターゼ阻害活性が、（２）クロロホルム：メタノール＝９９：１分画に移行していることを確認した。
次に、（２）の分画を５ＣＮ−ＭＳ順相カラムにより、ヘキサン：クロロホルム＝５０：５０の溶媒からスタートし、毎分１％ずつメタノール濃度を上昇させるプロトコールでＨＰＬＣを実施した。結果、５分〜７分の分画に活性成分が溶出していることを確認した。さらに、この順相ＨＰＬＣで得た分画を５Ｃ１８−ＡＲ−IIカラム、及びπ−ＮＡＰカラムにより逆相ＨＰＬＣを行うことでさらに分離した。アセトニトリル：水＝８０：２０からスタートし、毎分アセトニトリル濃度を１％ずつ上昇させるプロトコールで行い、これら２種類のカラムで合計３回（５Ｃ１８−ＡＲ−IIカラムで１回とπ−ＮＡＰカラムで２回）の逆相ＨＰＬＣを行うことで、活性成分をシングルピークになるまで精製することに成功した。
一連の実験を８ｍｇのエキスからスタートすることで、約２０μｇの精製物を得ることができた。このサイクルを約１００回繰り返し、最終的に２ｍｇの極めて純度の高い化合物を得た。質量分析によりこの化合物の分子量は４１６であり、下記核磁気共鳴（ＮＭＲ）により、構造を式：
【化６】
と決定した。
【００３５】
ＮＭＲ方法
1H NMRはJEOL社JNM-LA 500 (500 MHz)により重クロロホルムを溶媒に用いて測定した。残存CHCl3 (δ = 7.27 ppm)を内部標準物質として化学シフトを報告した。
13C NMRはJEOL社JNM-LA 500 (125 MHz)により重クロロホルムを溶媒に用いて測定した。重クロロホルム(δ = 77.0 ppm)を内部標準物質として化学シフトを報告した。
各種二次元NMR (COSY, HMQC, HMBC, NOESY)は重クロロホルムを溶媒にしてJNM-LA 500 (500 MHz)により測定した。
ＮＭＲ測定値
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.81-4.76 (m, 3H), 3.64 (m, 1H), 2.93 (dd, J = 14.4, 10.9 Hz, 1H), 2.82 (dd, J = 14.4, 8.0 Hz, 1H), 2.70-2.59 (m, 4H), 1.57 (s, 6H), 1.52 (s, 6H), 1.30 (s, 3H), 1.24 (s, 3H), 1.23 (d, J = 6.3Hz, 3H), 1.21 (d, J = 6.9Hz, 3H); 13C NMR (125MHz, CDCl3) δ 204.8, 202.3, 199.3, 158.1, 135.2, 135.0, 118.1, 117.7, 108.9, 102.3, 92.5, 72.0, 61.8, 39.2, 37.4, 34.9, 26.5, 25.8, 25.7, 25.1, 24.3, 20.1, 18.8, 17.9, 17.7; HRMS (FAB) C25H37O5 [(M+H)+]の計算値 417.2641、実測値417.2632.
【００３６】
家族性アルツハイマー病の原因遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの作製
神経特異的エノラーゼ(ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ：ＮＳＥ)遺伝子のプロモーターの支配下に家族性アルツハイマー病で同定されたＬｏｎｄｏｎ変異(Ｖ７１７Ｆ)をもつ変異ＡＰＰを発現させるトランスジーンをマウスの受精卵にインジェクションをおこない、トランスジェニックマウスを得た。
【００３７】
モリスの水迷路試験-I
それぞれ２ヶ月齢および６ヶ月齢のトランスジェニック（ＴＧ）マウスおよび野生型（ＷＴ）マウスを用いて、モリスの水迷路試験を行った。試験１日目〜５日目まで１日３回ずつ、白濁させたプールでマウスを泳がせ、プラットホームへたどり着くまでの時間を測定した。このモリスの水迷路試験の結果は平均値と標準誤差(ＳＥＭ)で示した（図５）。たどりつくまでの時間の測定は、６０秒を最大として、それ以上の測定は行っていない。それぞれのマウスには、６週齢より水またはヒシュカエキス０．２％を含む水を自由に飲ませた。群間で飲水量に有意差はなく、一日あたり約５ｍｌであった。また、群間で体重の変化にも有意な差はなかった。ＷＴマウスでは、２ヶ月齢および６ヶ月齢のいずれであっても、ヒシュカエキスの摂取の有無に拘わらず、プラットホームにたどりつくまでに要した時間は５日間の間で短縮され、また２ヶ月齢のＴＧマウスでも短縮されたが、６ヶ月齢のＴＧマウスでは、ヒシュカエキスを摂取しなかった群では、プラットホームにたどりつくまでに要した時間は５日間の間で短縮されず、ヒシュカエキスを摂取した群では、時間が短縮され、５日目にｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで差が見られた（Ｐ＜０．１）。
【００３８】
モリスの水迷路試験-II
上記と同様、６週齢より水またはヒシュカエキス０．２％を含む水を自由に飲ませたトランスジェニック（ＴＧ）マウスに対して、９ヶ月齢で、初めてモリスの水迷路試験を行った。上記と同様、試験１日目〜５日目まで１日３回ずつ、白濁させたプールでマウスを泳がせ、プラットホームへたどり着くまでの時間を測定した。このモリスの水迷路試験の結果は平均値と標準誤差(ＳＥＭ)で示した（図６）。この試験では、マウスは初めてモリスの水迷路試験を経験するため、過去の経験・記憶の影響を一切受けない状態での現在の記憶・学習能力を反映している。また、この実験では、水槽の回りの模様に異なる色を付け、マウスが水槽内での自分の位置をより確認し易くした。９ヶ月齢のＴＧマウスでは、ヒシュカエキスを摂取しなかった群では、プラットホームにたどりつくまでに要した時間は５日間の全てで６０秒以上を要し、全く短縮されなかった。一方、ヒシュカエキスを摂取した群では、日を追うごとに時間が短縮され、３〜５日にわたりｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで有意な差が見られた（Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／または予防に有用な物質、当該物質を含む、γセクレターゼの阻害またはアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料および食品／飲料添加剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
超高齢化社会に突入しつつある我が国では、アルツハイマー病に代表される認知症を患う患者の急激な増加が予想される。しかしながら、現在、有効な治療法が無いため、患者のみならず患者の家族を救う手段が無い。今十分な対応策を講じなければ、来るべき医療費と人的負担の膨大な増加は、我が国の存亡をも左右しかねない事態になる。一方、この状況は多くの先進国にも当てはまり、アルツハイマー病に対する有効な治療法の開発は、先進国に共通する重要課題である。特に世界でもっとも顕著な高齢化社会を迎えつつある我が国にとって、この分野の研究の推進ほど、緊急かつ重要な科学政策は無いとさえいえる。
【０００３】
アルツハイマー病の病因の最も上流に位置すると考えられているのが老人斑の主要構成成分であるＡβの産生である。Ａβは、その前駆体蛋白質であるＡＰＰ(ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ)の膜貫通近傍部分からβセクレターゼとγセクレターゼの２つの蛋白質プロセシング酵素の働きで切り出される。遺伝性アルツハイマー病では、ほとんどの症例でＡβ（特にＡβ４２）の産生亢進が観察され、アルツハイマー病の発症には、γセクレターゼによるＡβのＡＰＰからの切り出しが重要な役割を有すると考えられている。したがって、アルツハイマー病の処置および／または予防用の薬物を得るために、γセクレターゼ阻害活性についてスクリーニングすることが行われており、そのようなスクリーニングによって、いくつかの化合物が、実際にγセクレターゼ阻害剤として同定されている。しかし、多くのγセクレターゼ阻害剤は、同時にＮｏｔｃｈシグナリングを抑制し、したがって副作用を惹起することも知られている。
【０００４】
現在、アルツハイマー病の処置および／または予防に有用な物質として、ドネペジル塩酸塩（商品名：アリセプト、エーザイ）、リバスチグミン（商品名：イクセロン、ノバルティス）、メマンチン塩酸塩（商品名：メマリー、第一三共）およびガランタミン臭化水素酸塩（商品名：レミニール、ヤンセンファーマ）が存在するが、効果が高く、少ない副作用で長期投与が可能なアルツハイマー病の処置および／または予防薬は今もなお必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、γセクレターゼ阻害剤、特に少ない副作用で長期投与が可能なアルツハイマー病の処置および／または予防に有用な物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、まず、アルツハイマー病発症の最初のイベントであるＡβの産生を担うγセクレターゼの活性を簡単に評価するアッセイ系を構築した。次に、このアッセイ系を用いて漢方薬の原料等として使用されている約１６００種類の植物のエキスをスクリーングし、γセクレターゼの阻害活性をもつ数種類のエキスを同定した。その内の１つ、ヒシュカに含まれるγセクレターゼの阻害成分を精製し、その分子量と構造を決定した。
【０００７】
同定されたγセクレターゼ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化１】
の構造を有するｇａｒｃｉｎｉｅｌｌｉｐｔｏｎｅ ＨＣであった。
【０００８】
したがって本発明は、第一の態様において、ヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウの各植物エキスのうち、少なくとも１種以上、とりわけヒシュカ、カンジュウまたはライコウトウのエキス、特にヒシュカのエキスを含む、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【化２】
の化合物を含む、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤を提供する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、対象におけるγセクレターゼの阻害またはアルツハイマー病の処置および／もしくは予防方法であって、当該対象に治療上有効量のヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウの各植物エキスのうち、少なくとも１種以上、とりわけヒシュカ、カンジュウまたはライコウトウ、特にヒシュカのエキス、あるいは式（Ｉ）：
【化３】
の化合物を投与することを含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
アルツハイマー病に対する薬物治療・予防においては、かなりの長期間に渡って薬物投与を行う必要が想定される。したがって、いかに副作用の少ない治療薬を提供できるかが極めて重要となる。このような少ない副作用という点で、漢方薬に代表される植物エキスは、数百年から千年を超えてヒトに使われており、大幅に摂取量を間違わない限り安全であることが実証されており、有益である。アルツハイマー病は、食生活の欧米化と長寿によって顕在化してきた病気であり、実際、古来の中国での経験則からは、アルツハイマー病の治療・予防効果がある漢方薬という記載は無い。しかしながら、本発明者らは、漢方薬に代表される植物エキスにアルツハイマー病に対する有効な成分を含むものが存在することを見出した。とりわけ本発明の漢方薬のエキスは、γセクレターゼの活性を阻害することによって、アルツハイマー病の病因の最も上流に位置するＡβ（Ａβ４０および／またはＡβ４２）の産生を減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】レポーターアッセイの概略を示す。
【図２】８つの生薬エキスのγセクレターゼ阻害活性を示す。コントロールにはＤＭＳＯを用いた。
【図３】ＥＬＩＳＡ法によるＡβ４０の産生量の測定結果を示す。ポジティブコントロールにはＤＡＰＴ（０，３０，１００ｎＭ）を用いた。
【図４】ＥＬＩＳＡ法によるＡβ４２の産生量の測定結果を示す。ポジティブコントロールにはＤＡＰＴ（０，３０，１００ｎＭ）を用いた。
【図５】モリスの水迷路試験-Iの結果を示す。
【図６】モリスの水迷路試験-IIの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、第一の態様において、ヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウの各植物エキスのうち、少なくとも１種以上、とりわけヒシュカ、カンジュウまたはライコウトウ、特にヒシュカのエキスを含む、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤を提供する。
【００１４】
ヒシュカは植物名ホップであり、特にその雌花序をエキスの原料として用いる。ヒシュカのエキス、特にヒシュカの雌花序エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ｇ６０）。
カンジュウは植物名オシダ（ゼンマイ）であり、特にその根茎をエキスの原料として用いる。オシダのエキス、特にオシダの根茎エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ａ５０）。
ライコウトウは植物名クロヅルであり、特にその根、葉および花をエキスの原料として用いる。ライコウトウのエキス、特にライコウトウの根、葉または花エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ｈ３４）。
フンボウイは植物名シマハスノハカズラであり、特にその蔓性の根茎および茎をエキスの原料として用いる。フンボウイのエキス、特にフンボウイの根茎または茎エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ａ２７）。
【００１５】
クジンは植物名クララであり、特にその根をエキスの原料として用いる。クジンのエキス、特にクジンの根エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ａ２）。
クレンピは植物名センダンであり、特にその樹皮および根皮をエキスの原料として用いる。クレンピのエキス、特にクレンピの樹皮または根皮エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ｃ１５）。
カダンリュウは植物名オキナワクジャクシダであり、特にその全草または根茎をエキスの原料として用いる。カダンリュウのエキス、特にカダンリュウの全草または根茎エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ｈ２２）。
ハクシュウは植物名ダイコンゴヒショウであり、特にその根をエキスの原料として用いる。ハクシュウのエキス、特にハクシュウの根エキスは、市販されているものであってもよい（例えば製造元：栄進商事、品番：Ａ３）。
【００１６】
本発明において、「エキス」は、原料植物を水、アルコール等の溶媒で抽出した抽出液、抽出液を濃縮したもの、抽出液を完全に乾燥させて固体もしくは半固体としたもの、抽出液、濃縮液もしくは乾燥物を水、アルコール、糖等の希釈媒で希釈したもののいずれかまたはいずれをも意味する。抽出は、製剤学または食品工学の分野において通常用いられる方法によって行うことができる。上記エキスは、原料植物を溶媒で抽出した粗抽出物であってもよいし、粗抽出物を常法により精製することで得られる抽出物画分であってもよい。また、抽出に使用する溶媒としては、例えば、水、エタノール（例えば濃度７０容積％以上）、メタノール（例えば濃度７０容積％以上）、ヘキサン（例えば濃度９０容積％以上）、クロロホルム（例えば濃度９０容積％以上）またはそれらの混合物などを挙げることができ、特にエタノールまたはメタノールが好ましい。
【００１７】
エキスを製造するにあたり、原料植物は、生の状態であってもよいし、乾燥品や粗乾燥品であってもよいが、γセクレターゼの阻害活性を有する成分を効率的に抽出するという観点から、原料植物を常法により粉砕してから抽出することが好ましい。なお、乾燥品または粗乾燥品を原料植物として使用する場合には、乾燥品または粗乾燥品を水に戻してから粉砕し、その後凍結乾燥して再度粉砕した素材を抽出に使用することが好ましい。
【００１８】
第一の態様における本発明の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤は、前記した植物の各エキスのうち、１種のみ含むものであってもよいし、２種以上、例えば２種、３種またはそれ以上含むものであってもよい。また、本発明の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤は、γセクレターゼの阻害活性を有する他の材料（前記した植物以外の材料）を併せて含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤は、各植物エキスを、それぞれの全体質量に対して０．０１〜９９質量％、好ましくは０．１〜８０質量％、さらに好ましくは０．２〜５０質量％の範囲内で含んでいてよい。本発明の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤において、各植物エキスの１日の摂取量が体重１ｋｇ当たり１〜３２０ｍｇ（エキス質量（例えば製造元栄進商事の各植物エキスの質量を意味する。以下同じ。））となるように設定することが好ましく、４〜１６０ｍｇ（エキス質量）となるように設定することがより好ましく、８〜８０ｍｇ（エキス質量）となるように添加量を設定することがさらに好ましい。
【００２０】
別の態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【化４】
の化合物を有効成分として含む、γセクレターゼ阻害、特にアルツハイマー病の処置および／もしくは予防用の組成物、剤、食品、飲料または食品／飲料添加剤を提供する。この態様において、有効成分の含有量は、γセクレターゼの阻害活性を失わない範囲であればよく、具体的には０．０１〜９９質量％であり、好ましくは０．１〜８０質量％、さらに好ましくは０．２〜５０質量％である。
【００２１】
本発明において、「式（Ｉ）：
【化５】
の化合物」についての一般的な情報は、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６９，２００８，２２５−２３３に記載されている。この文献を参照により本明細書に引用する。本発明の式（Ｉ）の化合物は、全合成、半合成または生物資源からの単離精製によって得ることができる。例えば当該化合物は、ヒシュカのエキスから、例えば実施例に記載のとおりに、単離精製して得ることができる。
【００２２】
本発明において、「組成物」は、目的に応じて様々な態様で使用することができる。例えば、飲食用、医薬用などとして安全かつ有効に使用することができる。また、組成物は飲食用、医薬用のほか、例えば、いわゆる医薬部外品としても使用することができる。具体的には、例えば、軟膏、リニメント剤、エアゾール剤、クリーム、石鹸、洗顔料、全身洗浄料、化粧水、ローション、入浴剤などに添加して、局所的に使用することができる。
【００２３】
なお、組成物には、必要に応じて、添加物を添加することができる。添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、滑沢剤、結合剤、コーティング 剤、着色剤、基剤、酸化防止剤、溶解剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、粘着剤などを挙げることができる。また、組成物には、有機物または無機物の担体を使用することができる。担体としては、例えば、乳糖、澱粉、油脂などを挙げることができる。
【００２４】
本発明において、「剤」は、典型的には薬剤を意味する。薬剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、経口液剤、シロップ剤、経口ゼリー剤、注射剤、エキス剤、丸剤、チンキ剤等であってよいが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明において、「薬剤」は、製剤学分野において通常用いられる賦形剤または担体を含んでいてよい。また「薬剤」は、薬学的に許容される添加剤、例えば着色剤、安定化剤、抗酸化剤、防腐剤、pH調節剤、等張化剤、溶解補助剤、風味剤、滑沢剤、コーティング剤等を含んでいてもよい。このような薬剤の製造方法は、意図する剤形に応じて、製剤学分野における当業者が適宜選択し、容易に実施できる。
【００２６】
本発明において、「食品」は、動物、特にヒトが食するものであれば特にその範囲が限定されず、例えばゼリー、ガム、飴等を含む。
本発明において、「飲料」は、動物、特にヒトが飲用するものであれば特にその範囲が限定されず、例えば水、茶、栄養補助飲料、アルコール飲料等を含む。
本発明において、「食品／飲料添加剤」は、それのみを喫食することを意図しないが、食品または飲料と共に喫食されるものを意味し、例えば調味料等を含む。
本発明の「食品」、「飲料」および「食品／飲料添加剤」は、食品工学の分野において通常用いられる成分を含んでいてよく、またその分野における当業者が通常実施するとおりに製造することができる。
【００２７】
前記した植物のエキスまたは式（Ｉ）の化合物を食品または飲料中に含ませることによって、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、機能性食品、栄養補助食品とすることができる。具体的には、例えば、澱粉質食品、練り製品、菓子類、冷菓類、飲料、調味料、サプリメント、その他の加工食品などに植物のエキスまたは式（Ｉ）の化合物を添加することができる。
【００２８】
本発明において、「γセクレターゼの阻害」は、γセクレターゼ活性を測定したとき、例えば下記実施例に記載のγセクレターゼ阻害アッセイ系を用いて活性を測定したとき、ポジティブコントロール、例えばＤＭＳＯ水溶液と比して有意に、例えば約５％以上、好ましくは約１０％以上、より好ましくは約２０％以上、さらに好ましくは約３０％以上、最も好ましくは約４０％以上γセクレターゼ活性を低下させることを意味する。
【００２９】
本発明において、「アルツハイマー病の処置」は、病理学的または臨床症状的観点における、アルツハイマー病またはアルツハイマー型認知症の治療、進行の停止もしくは遅延または症状の軽減を意味する。
本発明において、「アルツハイマー病の予防」は、アルツハイマー病またはアルツハイマー型認知症の発症の予防を意味する。
【００３０】
本発明において、「対象」は、アルツハイマー病を患っているかまたは患い得る動物、例えばヒトを含む哺乳類を意味する。
本発明において、「治療上有効量」は、アルツハイマー病の処置および／または予防に有効な量を意味し、具体的な量は、様々な要因、例えば、用いる具体的なエキス、患者の性別、体重、年齢、さらに、患者の一般的な健康状態、疾患の程度、剤形、投与経路、投与回数などの種々の条件に応じて適宜設定することができる。例えば、γセクレターゼ阻害剤剤の１日の投与量は、体重１ｋｇ当たり１０〜６４０ｍｇ（エキス質量）となるように設定することが好ましく、２０〜４８０ｍｇ（エキス質量）となるように設定することがより好ましく、４０〜３２０ｍｇ（エキス質量）となるように設定することがさらに好ましい。なお、投与は１日数回に分けてすることができ、１回の投与で使用される薬剤中に含まれる組成物の含有量は、投与回数にあわせて適宜調整することができる。
【実施例】
【００３１】
γセクレターゼ活性測定アッセイ
Ａβの前駆体であるＡＰＰのＣ−末部位に酵母の転写因子であるＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域と単純ヘルペスウイルスの転写活性化領域を融合したＧＡＬ４−ＶＰ１６（Ｇ４Ｖ１６）を付加した蛋白質（ＡＰＰ−Ｇ４Ｖ１６）を発現させるベクターを構築した。このＧＡＬ４−ＶＰ１６は、転写研究領域で汎用されている強力な転写因子で、その活性は、プロモーター領域にＧＡＬ４認識配列（ＵＡＳ）を４個挿入したルシフェラーゼのレポーター（ＴＫ ４ｘ（ＵＡＳ）ＬＵＣ）で測定することができる。このＡＰＰ−Ｇ４Ｖ１６とＴＫ ４ｘ（ＵＡＳ）ＬＵＣを培養細胞にトランスフェクションし、２４時間後に細胞を回収し、その抽出液のルシフェラーゼ活性を測定した。このルシフェラーゼ活性は、既存のγセクレターゼの阻害剤であるＤＡＰＴを添加することで減少したので、γセクレターゼによって膜に存在するＡＰＰ−Ｇ４Ｖ１６が切断された結果、Ｇ４Ｖ１６が核に移行してレポーターの転写を活性化していることが確認できた。従って、このアッセイ（以下レポーターアッセイ）を用いることで、γセクレターゼに対する阻害活性をルシフェラーゼの活性を指標に評価することが可能となった。レポーターアッセイの概略を図１に示す。
【００３２】
γセクレターゼ阻害活性を持つ漢方薬エキスのスクリーニング
上記レポーターアッセイを用いて、現在ヒトに対して使用されている漢方薬の原材料となっている約１６００種類の植物エキスに対して、それらのエキスがγセクレターゼの阻害活性を含んでいるかどうかを検証した。このアッセイでは、非特異的な転写抑制作用が擬陽性になるため、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターでβガラクトシダーゼ（βｇａｌ）を発現させるプラスミッド（ｐＣＭＶ−βｇａｌ）を同時にトランスフェクションし、βｇａｌ 活性に変化を与えずルシフェラーゼ活性を低下させるものをポジティブと判定した。このスクリーニングによって、ヒシュカと他に幾つかの漢方薬エキスがルシフェラーゼ活性の特異的な低下を示した。結果を図２に示す。有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで行った。
【００３３】
ＥＬＩＳＡ法によるＡβ４０およびＡβ４２の産生量の測定
スクリーニングした漢方薬エキスが実際にγセクレターゼの阻害活性があることを下記ＥＬＩＳＡ法によって確認した。
方法：家族性アルツハイマー病で同定されたＬｏｎｄｏｎ変異（Ｖ７１７Ｆ）をもつ変異ＡＰＰを発現させるベクターとβｇａｌを発現させるベクターをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションし、２４時間後に、エキスを培地に投与した。さらに２４時間後、βｇａｌの活性の定量とＡβ４０およびＡβ４２の産生量の定量を、ＷＡＫＯ ｈｕｍａｎβ ａｍｉｌｏｉｄ ＥＬＩＳＡキットを用いて行った。トランスフェクション効率を補正するため、Ａβ４０およびＡβ４２の産生量は、βｇａｌの活性で補正した。γセクレターゼ阻害のポジティブコントロールには、既知のβセクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴを用いた。また、βｇａｌを発現させるベクターのみをトランスフェクションし変異ＡＰＰを発現させていない時（mock）のＡβ４０およびＡβ４２の産生量も測定し、βｇａｌの活性で補正した。結果を図３および４に示す。有意差検定は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで行った。
【００３４】
ヒシュカ由来γセクレターゼ阻害物質の精製と構造決定
ヒシュカエキスをＢｌｉｇｈ Ｄｙｅｒ法により水溶性、脂溶性の２層に分離した後、レポーターアッセイによりエキス中のγセクレターゼ阻害活性が脂溶性分画に移行していることを確認した。続いて、この脂溶性分画をＳｉｌｉｃａ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓを使用した固相抽出により３分画に分離した。用いた溶媒は（１）ヘキサン：クロロホルム＝５０：５０、（２）クロロホルム：メタノール＝９９：１、（３）１００％メタノールで、レポーターアッセイによりγセクレターゼ阻害活性が、（２）クロロホルム：メタノール＝９９：１分画に移行していることを確認した。
次に、（２）の分画を５ＣＮ−ＭＳ順相カラムにより、ヘキサン：クロロホルム＝５０：５０の溶媒からスタートし、毎分１％ずつメタノール濃度を上昇させるプロトコールでＨＰＬＣを実施した。結果、５分〜７分の分画に活性成分が溶出していることを確認した。さらに、この順相ＨＰＬＣで得た分画を５Ｃ１８−ＡＲ−IIカラム、及びπ−ＮＡＰカラムにより逆相ＨＰＬＣを行うことでさらに分離した。アセトニトリル：水＝８０：２０からスタートし、毎分アセトニトリル濃度を１％ずつ上昇させるプロトコールで行い、これら２種類のカラムで合計３回（５Ｃ１８−ＡＲ−IIカラムで１回とπ−ＮＡＰカラムで２回）の逆相ＨＰＬＣを行うことで、活性成分をシングルピークになるまで精製することに成功した。
一連の実験を８ｍｇのエキスからスタートすることで、約２０μｇの精製物を得ることができた。このサイクルを約１００回繰り返し、最終的に２ｍｇの極めて純度の高い化合物を得た。質量分析によりこの化合物の分子量は４１６であり、下記核磁気共鳴（ＮＭＲ）により、構造を式：
【化６】
と決定した。
【００３５】
ＮＭＲ方法
1H NMRはJEOL社JNM-LA 500 (500 MHz)により重クロロホルムを溶媒に用いて測定した。残存CHCl3 (δ = 7.27 ppm)を内部標準物質として化学シフトを報告した。
13C NMRはJEOL社JNM-LA 500 (125 MHz)により重クロロホルムを溶媒に用いて測定した。重クロロホルム(δ = 77.0 ppm)を内部標準物質として化学シフトを報告した。
各種二次元NMR (COSY, HMQC, HMBC, NOESY)は重クロロホルムを溶媒にしてJNM-LA 500 (500 MHz)により測定した。
ＮＭＲ測定値
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.81-4.76 (m, 3H), 3.64 (m, 1H), 2.93 (dd, J = 14.4, 10.9 Hz, 1H), 2.82 (dd, J = 14.4, 8.0 Hz, 1H), 2.70-2.59 (m, 4H), 1.57 (s, 6H), 1.52 (s, 6H), 1.30 (s, 3H), 1.24 (s, 3H), 1.23 (d, J = 6.3Hz, 3H), 1.21 (d, J = 6.9Hz, 3H); 13C NMR (125MHz, CDCl3) δ 204.8, 202.3, 199.3, 158.1, 135.2, 135.0, 118.1, 117.7, 108.9, 102.3, 92.5, 72.0, 61.8, 39.2, 37.4, 34.9, 26.5, 25.8, 25.7, 25.1, 24.3, 20.1, 18.8, 17.9, 17.7; HRMS (FAB) C25H37O5 [(M+H)+]の計算値 417.2641、実測値417.2632.
【００３６】
家族性アルツハイマー病の原因遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの作製
神経特異的エノラーゼ(ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ：ＮＳＥ)遺伝子のプロモーターの支配下に家族性アルツハイマー病で同定されたＬｏｎｄｏｎ変異(Ｖ７１７Ｆ)をもつ変異ＡＰＰを発現させるトランスジーンをマウスの受精卵にインジェクションをおこない、トランスジェニックマウスを得た。
【００３７】
モリスの水迷路試験-I
それぞれ２ヶ月齢および６ヶ月齢のトランスジェニック（ＴＧ）マウスおよび野生型（ＷＴ）マウスを用いて、モリスの水迷路試験を行った。試験１日目〜５日目まで１日３回ずつ、白濁させたプールでマウスを泳がせ、プラットホームへたどり着くまでの時間を測定した。このモリスの水迷路試験の結果は平均値と標準誤差(ＳＥＭ)で示した（図５）。たどりつくまでの時間の測定は、６０秒を最大として、それ以上の測定は行っていない。それぞれのマウスには、６週齢より水またはヒシュカエキス０．２％を含む水を自由に飲ませた。群間で飲水量に有意差はなく、一日あたり約５ｍｌであった。また、群間で体重の変化にも有意な差はなかった。ＷＴマウスでは、２ヶ月齢および６ヶ月齢のいずれであっても、ヒシュカエキスの摂取の有無に拘わらず、プラットホームにたどりつくまでに要した時間は５日間の間で短縮され、また２ヶ月齢のＴＧマウスでも短縮されたが、６ヶ月齢のＴＧマウスでは、ヒシュカエキスを摂取しなかった群では、プラットホームにたどりつくまでに要した時間は５日間の間で短縮されず、ヒシュカエキスを摂取した群では、時間が短縮され、５日目にｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで差が見られた（Ｐ＜０．１）。
【００３８】
モリスの水迷路試験-II
上記と同様、６週齢より水またはヒシュカエキス０．２％を含む水を自由に飲ませたトランスジェニック（ＴＧ）マウスに対して、９ヶ月齢で、初めてモリスの水迷路試験を行った。上記と同様、試験１日目〜５日目まで１日３回ずつ、白濁させたプールでマウスを泳がせ、プラットホームへたどり着くまでの時間を測定した。このモリスの水迷路試験の結果は平均値と標準誤差(ＳＥＭ)で示した（図６）。この試験では、マウスは初めてモリスの水迷路試験を経験するため、過去の経験・記憶の影響を一切受けない状態での現在の記憶・学習能力を反映している。また、この実験では、水槽の回りの模様に異なる色を付け、マウスが水槽内での自分の位置をより確認し易くした。９ヶ月齢のＴＧマウスでは、ヒシュカエキスを摂取しなかった群では、プラットホームにたどりつくまでに要した時間は５日間の全てで６０秒以上を要し、全く短縮されなかった。一方、ヒシュカエキスを摂取した群では、日を追うごとに時間が短縮され、３〜５日にわたりｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで有意な差が見られた（Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウの各植物エキスのうち、少なくとも１種以上を含むことを特徴とするγセクレターゼ阻害組成物。
【請求項２】
植物エキスの由来がヒシュカ、カンジュウまたはライコウトウである、請求項１の組成物。
【請求項３】
植物エキスの由来がヒシュカである、請求項２の組成物。
【請求項４】
アルツハイマー病の処置および／もしくは予防用である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
ヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウのうち、少なくとも１種以上から選択される植物のエキスを含む、γセクレターゼ阻害剤。
【請求項６】
植物がヒシュカ、カンジュウまたはライコウトウである、請求項５のγセクレターゼ阻害剤。
【請求項７】
植物がヒシュカである、請求項５のγセクレターゼ阻害剤。
【請求項８】
アルツハイマー病の処置および／もしくは予防用薬剤である、請求項５〜７のいずれかに記載のγセクレターゼ阻害剤。
【請求項９】
ヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウのうち、少なくとも１種以上から選択される植物のエキスを含む、食品、飲料または食品／飲料添加剤。
【請求項１０】
式：
【化１】
の化合物を含む、γセクレターゼ阻害組成物。
【請求項１１】
アルツハイマー病の処置および／もしくは予防用である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１】
ヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウの各植物エキスのうち、少なくとも１種以上を含むことを特徴とするγセクレターゼ阻害組成物。
【請求項２】
植物エキスの由来がヒシュカ、カンジュウまたはライコウトウである、請求項１の組成物。
【請求項３】
植物エキスの由来がヒシュカである、請求項２の組成物。
【請求項４】
アルツハイマー病の処置および／もしくは予防用である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
ヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウのうち、少なくとも１種以上から選択される植物のエキスを含む、γセクレターゼ阻害剤。
【請求項６】
植物がヒシュカ、カンジュウまたはライコウトウである、請求項５のγセクレターゼ阻害剤。
【請求項７】
植物がヒシュカである、請求項５のγセクレターゼ阻害剤。
【請求項８】
アルツハイマー病の処置および／もしくは予防用薬剤である、請求項５〜７のいずれかに記載のγセクレターゼ阻害剤。
【請求項９】
ヒシュカ、カンジュウ、ライコウトウ、フンボウイ、クジン、クレンピ、カダンリュウおよびハクシュウのうち、少なくとも１種以上から選択される植物のエキスを含む、食品、飲料または食品／飲料添加剤。
【請求項１０】
式：
【化１】
の化合物を含む、γセクレターゼ阻害組成物。
【請求項１１】
アルツハイマー病の処置および／もしくは予防用である、請求項１０に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−５３０７６（Ｐ２０１３−５３０７６Ａ）
【公開日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９０４３３（Ｐ２０１１−１９０４３３）
【出願日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]