アルツハイマー病動物モデル、それを得るための方法およびその使用
本発明は、トランスジェニック非ヒト動物に関し、このトランスジェニック非ヒト動物は、アルツハイマー病（ＡＤ）を研究するための非ヒト動物モデルとして使用することができ、このトランスジェニック非ヒト動物は、そのゲノムに挿入され、完全ヒトＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列をその調節配列とともに含む、異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）を含有すること；そしてヒトにおけるｈＡＰＰ遺伝子と同様の内因性発現パターンを有すること：を特徴とする。本発明のモデルは、ＡＤを研究するために、そしてＡＤの予防および／または治療のために潜在的に有用な化合物のスクリーニングにおいて使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、バイオテクノロジー分野および薬学分野に含まれる：本発明は、特に非ヒトアルツハイマー病動物モデルとして使用するためのトランスジェニック非ヒト動物の開発およびその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
１９０７年に、Alois Alzheimerが初めて認知症と認識能力の進行性低下を特徴とする神経病理学的症候群を報告した。彼はまた、認知記憶の低下と、剖検で観察された神経病理学的病変と、患者の病歴との関連性も最初に証明した。アルツハイマー病（ＡＤ）の臨床的特徴は、幻覚、鬱病、失見当および攻撃行動を伴う、記憶、言語（失語）、運動機能（失行）および知覚（失認）の進行性消失である。
【０００３】
Alzheimerによって行われた２つの神経学的所見は、ＡＤを説明するために現在使用されている：（ｉ）神経原繊維変化（無定形のニューロン内で見られる緻密な繊維のもつれであり、その主要なサブユニットは微小管関連タンパク質Ｔａｕである）および（ii）老人斑（細胞外斑であり、その主要成分はβ−アミロイドペプチド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる前駆体タンパク質由来のβ−アミロイド（Ａβ）と呼ばれるペプチドである）。
【０００４】
ヒトＡＰＰ遺伝子は２１ｑ２１．３領域の第２１染色体に位置し、３００キロベース（ｋｂ）にわたって分布する１８のエキソンによって形成される。その発現は特定組織に限定されず、内皮、脳のグリアおよびニューロンを含む多くの細胞種および組織で発現される。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は成熟し、３つの主要なアイソフォームを産生するための代替法を受ける可能性がある。これらの３つの主要なアイソフォームにはそれらを形成しているアミノ酸の数により名前が付けられている（ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ６９５）。最長のアイソフォームは完全遺伝子配列を含むＡＰＰ７７０であり；アイソフォームＡＰＰ７５１は最も多量にかつ普遍的に発現されるアイソフォームであり；そしてアイソフォームＡＰＰ６９５は脳において主要なアイソフォームであり、皮質での３つのｍＲＮＡ間の比率はＡＰＰ７７０：ＡＰＰ７５１：ＡＰＰ６９５、１：１０：２０であり、そのため、アイソフォームＡＰＰ６９５がＡＤに関連して最も研究されたアイソフォームであった。
【０００５】
ＡＤの発症に関与する、ＡＰＰ遺伝子の異なる突然変異が１９９０〜１９９２年の間に発見され、その伝達は、浸透度がほぼ１００％の常染色体優性であることを確認することができた。１９９５年には、ＡＤに関連する２つの他の遺伝子が発見され、それらの遺伝子はプレセニリン１（ＰＳ１）およびプレセニリン２（ＰＳ２）と呼ばれている。
【０００６】
ＡＤは、その原因に基づいて２つのタイプに分けることができる：
（ｉ）家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）（ＡＰＰ、ＰＳ１およびＰＳ２遺伝子の突然変異に関連し、発症年齢が早期であり、アルツハイマー病患者のおよそ１％を占める）；および
（ii）孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）（晩期発症型（通常６０歳以後）であり、原因不明である（この疾患に対する罹患素因は一連の感受性遺伝子および環境因子によって決まるようであり、その罹患素因により複雑な多因子疾患となり、主な危険因子は老齢であることと家族歴があることである）；ＳＡＤはアルツハイマー病患者のおよそ９９％を占める）。
【０００７】
両疾患（ＦＡＤおよびＳＡＤ）は臨床症状によっても神経病理学によっても区別することができない。
【０００８】
知られているとおり、実験神経系疾患モデルの開発は生物医学研究に極めて重要である。ヒトにおける神経変性疾患の特徴によく似たモデルの開発には、大きな方法論的進歩が必要であった。ＡＤの場合、主な進歩はＦＡＤに関与するタンパク質を同定することに関係していた。
【０００９】
９０年代の初めに、ＡＰＰ遺伝子におけるいくつかのＦＡＤ関連突然変異が発見され、それらの突然変異は、遺伝子導入技術によって得られる進歩とともに、ＡＤを研究するためのモデルを開発する可能性をもたらした。遺伝子導入を用いて、病原型ＡＰＰ遺伝子を再現可能な、より適した方法で、脳の異なる領域において発現させることが可能であり、それにより、野生型ＡＰＰ、ＡＰＰ断片、突然変異ＡＰＰタンパク質および他のＡＤ関連遺伝子を発現するトランスジェニックマウスに大きな真実性が与えられた。
【００１０】
ＡＤのためにマウスにおいて開発されたモデルとしては、以下が挙げられる：
【００１１】
ＮＳＥＡＰＰ：このマウスを作製するために、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターおよびＡＰＰ遺伝子アイソフォーム７５１ｃＤＮＡを有する構築物を調製した。この構築物の過剰発現は、月齢２２ヶ月のときにびまん性Ａβ斑を発生させた。これらの斑は、マウスの５％でのみ、アルツハイマー病患者に見られる斑によく似たより成熟した外観を呈し、Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙおよびチオフラビン−Ｓ染色液で陽性に染色された。
【００１２】
ＡＰＰ ＹＡＣ：多量のＤＮＡを挿入することができる、トランスジェニックマウスを作製するための担体として酵母人工染色体（ＹＡＣ）を使用することにより、３つのグループによってほぼ同時に、全ＡＰＰ遺伝子コード領域と該遺伝子の３’および５’の両方にある広範な領域を含む６５０ｋｂ ＹＡＣ(B142F9 Washington University YAC library)を有するトランスジェニックマウスの作製が公開された。これらのマウスでは、ヒト遺伝子の発現は、マウスにおける内因性発現と同様に、斑の形成または神経原繊維変化を観察することなく行われた。ヒトゲノム配列決定では、これらのマウスを作製するのに用いられるＹＡＣは、ＡＰＰ遺伝子に加えて、望ましくない表現型を生じる可能性があるＧＡＢＰＡ転写因子をコードする遺伝子も含むことが分かった。
【００１３】
ＰＤＡＰＰ：このトランスジェニックマウスは、１９９５年に報告されており、多様なＡＤ神経病理を発現する初めてのマウスであり、「Ｉｎｄｉａｎａ」Ｖ７１７Ｆ突然変異を含むＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡを過剰発現させる構築物を用いて得られた；それらのマウスの脳では異栄養性神経突起(dystrophic neurites)に囲まれた神経炎性斑、星状細胞増加症、小膠細胞症およびシナプスの喪失を観察することができたが、神経原繊維変化は観察されなかった。皮質領域では斑の存在は５０％占有に達した。この割合は、６％〜１２％間である傾向があるアルツハイマー病患者のものと比較するならば、極めて高い割合である。脳においてこのように多量の斑が存在するにもかかわらず、これらのマウスにおいて神経変性は示されなかった。
【００１４】
Ｔｇ２５７６：このマウスは、１９９６年に報告されており、おそらく、ＡＤを研究するために最もよく用いられているモデルである；トランスジーンは、脳における高発現を確実にするプリオンタンパク質プロモーターによって形成され、遺伝的Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ／／ＳＪＬバックグラウンドにおいて「Ｓｗｅｄｉｓｈ」Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ突然変異を含むアイソフォームＡＰＰ６９５ ｃＤＮＡを有する。Ｔｇ２５７６マウスは、脳におけるマウスの内因性発現レベルの５．６倍であるヒトＡＰＰ（ｈＡＰＰ）発現レベルを有する。それらのマウスは、月齢９〜１２ヶ月のときには、すでに内側嗅領に神経炎性斑があり、後にその斑は海馬および皮質にまで広がった。
【００１５】
ＡＰＰ２３：ＡＤを研究するためのこの新しいネズミモデルは、１９９７年に、Ｔｈｙ１プロモーターと、内因性発現の７倍を上回る発現が行われる、「Ｓｗｅｄｉｓｈ」Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ突然変異を有するｈＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡの過剰発現を用いて作製され、月齢６ヶ月のときに斑の発生を起こした。これらのマウスの最も重要な特徴は、月齢１４〜１８ヶ月のときに海馬のＣＡ１領域における神経細胞死がようやく報告されたということである。このモデルのもう１つの重要な特徴は、ＡＤを研究するための優れたモデルにする脳アミロイド血管症の発生である。これらのマウスの行動解析では、結果において大きな差があり、月齢１８ヶ月からの学習において有意差があることが示された。
【００１６】
今日までの作製された動物モデルでは、総てのＡＤ病理を作製することができなかった。これらのモデルの作製は、野生型またはＦＡＤ関連突然変異を有するＡＰＰタンパク質の過剰発現に基づいたものであり、そのようなモデルは、ＳＡＤ患者では起こらない状況から出発するため、ＦＡＤの研究に限定される。これらのモデルでは、マウス脳において脳領域の２０〜５０％を占めるアミロイド生成性斑(amyloidogenic plaques)の発生が報告されているが、一方、ヒト患者では斑の存在は１２％を超えない。
【００１７】
本明細書に記載のモデル、ヒトＡＰＰ ＹＡＣマウス「ｈＡＰＰｙ」では、ＡＰＰ遺伝子発現は、ＡＰＰ ＹＡＣを用いて行われた先行研究に記載されているとおり、マウスの内因性発現とほぼ同じように行われた(Buxbaum, J. D., et al. (1993). "Expression of APP in brains of transgenic mice containing the entire human APP gene." Biochem Biophys Res Commun 197(2): 639-45; Lamb, B. T., et al. (1993). " Introduction and expression of the 400 kilobase amyloid precursor protein gene in transgenic mice ［補正済み］. "Nat Genet 5(1): 22-30; Pearson, B. E. and T. K. Choi (1993). "Expression of the human beta-amyloid precursor protein gene from a yeast artificial chromosome in transgenic mice." Proc Nati Acad Sci USA 90(22): 10578-82)が、「ｈＡＰＰｙ」マウスでは、これまでＹＡＣ中に存在していたＧＡＢＰＡ遺伝子の存在が消失したという違いがあった(Lamb, B. T., et al. (1997). "Altered metabolism of familial Alzheimer's disease-linked amyloid precursor protein variants in yeast artificial chromosome transgenic mice." Hum Mol Genet 6(9): 1535-41.)。ＡＤモデルの作製には、好適なＡＰＰ遺伝子発現と外部刺激によるその発現における考えられる応答が極めて重要である。
【００１８】
これまで行われた、多くのＡＤ関連神経病理を作成し、さらにＦＡＤをよりよく理解するという努力にもかかわらず、得られたモデルは、ＳＡＤの原因やその発症を理解するためにそれらを使用することが難しいほど現実から離れている。このため、既存のモデルの欠点を克服するＡＤ動物モデルを提供する必要性がまだある。
【００１９】
ヒトＡＰＰタンパク質発現、ひいてはヒトＡβペプチド発現は、ネズミタンパク質はその配列が異なることによりアミロイド斑を形成することができないという事実によって、このモデルにおいてアミロイド斑の形成を可能にする。よって、異なる環境因子または病原因子を「ｈＡＰＰｙ」に適用することで、ＡＰＰ遺伝子の正確な応答を可能にし、アミロイド斑の形成を可能にする。その疾患に大きく関与すると考えられるこれらの環境因子をそのモデルに適用する可能性により、そのモデルはＳＡＤを研究するための極めて重要なツールとなる。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、一般に、アルツハイマー病（ＡＤ）を研究するための非ヒト動物モデルとして使用することができるトランスジェニック非ヒト動物に関する。前記トランスジェニック動物は、そのゲノムに挿入されており、完全ヒトＡＰＰ遺伝子（ｈＡＰＰ）のヌクレオチド配列をその調節配列とともに含む、異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）を含む（該トランスジーンはｈＡＰＰ遺伝子の自然環境に存在する他の遺伝子、例えばＧＡＢＰＡ、ＡＴＰＪおよびＣＹＹＲ１遺伝子を欠いている）こと、そして該トランスジーンの発現がトランスジェニック動物において、ヒトにおけるこの同じｈＡＰＰ遺伝子の内因性発現パターンと同様の内因性発現パターンを有することを特徴とする。本明細書において、表現「ヒトにおけるｈＡＰＰ遺伝子の内因性発現パターンと同様のトランスジェニック動物におけるｈＡＰＰトランスジーンの内因性発現パターン」などは、該ｈＡＰＰトランスジーンを含むトランスジェニック動物がｈＡＰＰ遺伝子を、そのｈＡＰＰ遺伝子がヒトにおいて発現される同じ組織において実質的に同じ割合で発現するという事実による。
【００２１】
本発明によって提供されるトランスジェニック非ヒト動物は完全ｈＡＰＰ遺伝子だけをその調節配列とともに含むトランスジーンを含み、ｈＡＰＰ遺伝子の自然環境に存在する、その発現を妨げる可能性のある他の遺伝子（例えば、ＧＡＢＰＡ、ＡＴＰＪおよびＣＹＹＲ１遺伝子）の干渉を受けないという事実により、ヒトにおけるｈＡＰＰ遺伝子の内因性発現パターンと同様の内因性発現パターンでの該トランスジェニック動物における該トランスジーンの発現を可能にする（すなわち該トランスジェニック動物はヒトにおける状況をかなりの信頼性で再現する）ため、該トランスジェニック動物は、ＡＤ、その進行および発症を研究するためだけでなく、それを引き起こしている要因および刺激を研究するためや該疾患の予防および／または治療のために潜在的に有用な化合物を同定するための非ヒト動物モデルとして使用することができる。
【００２２】
よって、一態様では、本発明は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６６４２６６５：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，６４２，６６５との間に含まれるヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチドまたは完全ｈＡＰＰ遺伝子をその調節配列とともに含む該ポリヌクレオチドの断片（以下本発明のポリヌクレオチド）に関する。前記ポリヌクレオチドは完全ｈＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列をその調節配列とともに含み、ｈＡＰＰ遺伝子の該ヌクレオチド配列の末端に隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）それぞれの近接（ａｄｊａｃｅｎｔ）領域は固有の組換え配列を含み、完全ｈＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列をその調節配列とともに単離するのにその固有の組換え配列を使用することができる。
【００２３】
特定の一実施形態では、前記完全ｈＡＰＰ遺伝子は、その調節配列とともに、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６１７４７３３：２６４６４８０９：１）のヌクレオチド２６，１７４，７３３とヌクレオチド２６，４６４，８０９との間に含まれる。
【００２４】
もう１つの特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６５７３３４４：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，５７３，３４４との間に含まれるヌクレオチド配列からなる。前記ポリヌクレオチドは、完全ｈＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列をその調節配列とともに含み、それらに少なくとも１つの固有の組換え配列を含む領域に隣接される。
【００２５】
よって、もう１つの特定の実施形態では、図１に示されるように、前記ｈＡＰＰ遺伝子は、その５’末端において（ＡＰＰ遺伝子転写の始点および方向に関連）第１のヌクレオチド配列に隣接され（ｆｌａｎｋｅｄ）、その３’末端において（ＡＰＰ遺伝子転写の終点および方向に関連）第２のヌクレオチド配列に隣接され、ここで：
該第１のヌクレオチド配列は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６４６４８１０：２６６４２６６５：ｌ）のヌクレオチド２６，４６４，８１０とヌクレオチド２６，６４２，６６５との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片からなり、かつ
該第２のヌクレオチド配列は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６１７４７３２：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，１７４，７３２との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片からなる。
【００２６】
具体的な一実施形態では、前記第１のヌクレオチド配列は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６４６４８１０：２６５７３３４４：ｌ）のヌクレオチド２６，４６４，８１０とヌクレオチド２６，５７３，３４４との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片を含み、かつ前記第２のヌクレオチド配列は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６１７４７３２：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，１７４，７３２との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片を含む。
【００２７】
上述の第１および第２のヌクレオチド配列に含まれる（非反復）固有の配列は、本明細書に含まれる実施例に記載のとおり、相同組換えを利用して、その環境から完全ｈＡＰＰ遺伝子をその調節配列とともに単離するのに利用することができる。前記固有の配列は、当技術分野の水準において記載された当業者に公知のプロセスに従って同定することができる。例として、前記プロセスには一般にＲｅｐｅａｔＭａｓｔｅｒプログラムなどの公的バイオコンピューター資源が含まれる[http://woody.embl-heidelberg.of/repeatmask/;Chenna Ramu et al., (2000) cgi-model: CGI Programming Made Easy with Python. LINUX Journal, July, 142-149; Smit, AFA and Green, P. RepeatMasker at http://repeatmasker.genome.washington.edu/cgi-bin/RM2_req.pl]; Jurka, J. 2000 Repbase Update: a database and an electronic journal of repetitive elements. Trend in Genetics 16(9): 418-420)]。
【００２８】
特定の一実施形態では、前記第１のヌクレオチド配列は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６５７１８７６：２６５７３３４４：１）のヌクレオチド２６，５７１，８７６とヌクレオチド２６，５７３，３４４との間に含まれる固有の配列（本発明ではＳｅｑ２と呼ぶ）を含む。
【００２９】
もう１つの特定の実施形態では、前記第２のヌクレオチド配列は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６０６７２２１：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，０６７，２２１との間に含まれる固有の配列（本発明ではＳｅｑＢと呼ぶ）を含む。
【００３０】
当業者ならば、完全ｈＡＰＰ遺伝子とその調節配列との末端に隣接する前記第１および第２のヌクレオチド配列内に含まれるいずれの固有の配列も同じ目的（完全ｈＡＰＰ遺伝子とその調節配列のそれらの環境からの単離）に利用することができることは分かる。よって、本発明は、本明細書に記載の固有の配列（本発明の特定の一実施形態を構成する）に限定されるのみならず、前記第１および第２のヌクレオチド配列内に含まれる、当技術分野の水準の一部をなす当業者に公知のバイオコンピューターツールを利用して位置づけることができる総ての固有の配列を含む。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは好適なベクター内に含めることができる。よって、もう１つの態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター（以下本発明のベクター）に関する。前記ベクターは、それゆえ、完全ｈＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列をその調節配列とともに含み、それらに本発明に記載の固有の配列に隣接される。ベクターの選択は、そのベクターをその後に導入する宿主細胞によって決まる。一例として、前記ポリヌクレオチドを導入するベクターは酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）であってよい。よって、特定の一実施形態では、本発明のベクターは、形質転換されるゲスト細胞に応じて、ＹＡＣ、ＢＡＣまたはＰＡＣからなる群から選択される。
【００３２】
特定の一実施形態では、本発明のベクターが導入される細胞が酵母である場合、好ましいベクターは、それぞれのアームにその機能を果たすための総ての好適な構造要素、例えばテロメア、セントロメア、自己複製配列および栄養要求性選択マーカーを含むＹＡＣである。本明細書に含まれる実施例では、酵母細胞を形質転換するのに用いられる上述の構造要素を有するＹＡＣの獲得について記載する。
【００３３】
もう１つの特定の実施形態では、本発明のベクターが導入される細胞が細菌である場合には、好ましいベクターは、必要最小限の要素が複製起点とコピー数およびＢＡＣ分裂を制御する遺伝子であるＢＡＣである。
【００３４】
ＹＡＣ、ＢＡＣおよびＰＡＣの特徴は当業者には公知である。前記種類のベクターについての詳細な情報は、例えば、Giraldo および Montoliuによって提供されている[Giraldo, P. & Montoliu L., 2001 Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals, Transgenic Research 10(2): 83-110]。
【００３５】
よって、特定の一実施形態では、本発明は、その一方の末端において第３のヌクレオチド配列に隣接され、もう一方の末端（反対端）において第４のヌクレオチド配列に隣接される本発明のポリヌクレオチドを含む酵母を形質転換するのに有用なベクターに関し、この場合：
−前記第３のヌクレオチド配列は、（ｉ）酵母細胞において機能的なテロメアおよび少なくとも（ii）１つの栄養要求性選択マーカーを含み、かつ
−前記第４のヌクレオチド配列は、（ｉ）酵母細胞において機能的なセントロメア、酵母細胞において機能的なテロメアおよび少なくとも１つの栄養要求性選択マーカーを含む。
【００３６】
酵母において機能的な、事実上いかなるテロメアおよびセントロメアも本発明において用いることができる。酵母において機能的な前記テロメアおよびセントロメアの限定されない例示的な例には、本明細書に含まれる実施例に記載されているものが含まれる。
【００３７】
同様に、事実上いかなる栄養要求性選択マーカーも本発明において用いることができる。前記栄養要求性選択マーカーの限定されない例示的な例には、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＨＩＳ３、ＨＩＳ５、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が含まれる。
【００３８】
本発明のベクターは、当業者に公知の従来の方法によって得ることができる[Sambrok et al., 1989 "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Vol 1-3]。
【００３９】
本発明のベクターは、例えば、酵母細胞、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などの真核細胞、または例えば、細菌、大腸菌(Escherichia coli)などの原核細胞を形質転換するのに用いることができる。
【００４０】
よって、もう１つの態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のベクターを含む細胞（以下本発明の細胞）に関する。このような細胞は、当業者に公知の従来の方法によって得ることができる[Sambrok et al., 1989 "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Vol 1-3]。
【００４１】
記載する本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞は、そのゲノムに、完全ｈＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列がその調節配列とともに挿入されたトランスジェニック非ヒト動物を得るのに用いることができる。
【００４２】
よって、もう１つの態様では、本発明は、そのゲノムに挿入された本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非ヒト動物（以下本発明のトランスジェニック非ヒト動物）に関する。結果として、本発明のトランスジェニック非ヒト動物のｈＡＰＰ遺伝子の内因性発現パターンは、この同じｈＡＰＰ遺伝子がヒトにおいて示す発現パターンと同様である。いずれかの理論に拘束される訳ではないが、これは、主に、その遺伝子がそれ自体の調節配列により調節されるという事実によるものと思われる。このことは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物におけるｈＡＰＰ遺伝子発現を、ヒトにおいてその発現を誘導する同じ因子によって誘導することを可能にし、そのトランスジェニック非ヒト動物をヒトにおいて起こるＡＤの現象および特徴を確実に再現する動物モデルにする。
【００４３】
本発明の特定の一実施形態では、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、哺乳類、好ましくは齧歯類、より好ましくはマウスまたはラットである。
【００４４】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、当業者による技術水準において公知のものの任意の遺伝的背景を有していてよい、すなわち該トランスジェニック非ヒト動物は、野生型（ｗｔ）動物由来のものであってよく、またはＡＤと直接または間接的に関係している任意の分子マーカーを組み込んでいる遺伝的背景を有する非ヒト動物由来のものであってよい。よって、特定の一実施形態では、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、ｈＡＰＰ遺伝子の他に、ＡＤの発症と直接または間接的に関係している１つ以上の遺伝子を発現することができる。ＡＤの発症と直接または間接的に関係している事実上いかなる分子マーカーも用いることができる。ＡＤの分子マーカーとして認識されている前記遺伝子の限定されない例示的な例には、プレセニリン１（ＰＳ１）遺伝子、プレセニリン２（ＰＳ２）遺伝子およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子のε４対立遺伝子が含まれる。
【００４５】
よって、特定の一実施形態では、本発明のトランスジェニック非ヒト動物のゲノムは、本発明のポリヌクレオチドの他に、１つ以上のＡＤ分子マーカーを含む。限定されない例として、前記ＡＤ分子マーカーは、ＰＳ１、ＰＳ２遺伝子、およびＡＰＯＥ遺伝子のイプシロン４（ε４）対立遺伝子からなる群から選択される。
【００４６】
ＡＤを発症しやすい素因に関連する他の遺伝因子には、α２−マクログロブリン遺伝子、超低密度リポタンパク質受容体遺伝子、リポタンパク質受容体関連タンパク質ＬＲＰの遺伝子、Ｔａｕタンパク質の遺伝子、ブチルコリンエステラーゼＫの遺伝子、カテプシンＤの遺伝子、インターロイキンの遺伝子およびコリンアセチルトランスフェラーゼの遺伝子が含まれる。
【００４７】
本発明の非ヒトマウスの遺伝的背景は、前記ＡＤ分子マーカーの対立遺伝子変異体、突然変異体および多型をさらに含み得る。
【００４８】
完全ヒトＡＰＰ（ｈＡＰＰ）遺伝子のヌクレオチド配列がその調節配列とともに本発明のトランスジェニック非ヒト動物のゲノム中に存在することにより、該遺伝子を、この同じ遺伝子がヒトにおいて示す発現パターンと同様の内因性発現パターンで発現させることを可能にするため、該トランスジェニック動物を、ＡＤを研究するためのトランスジェニック非ヒト動物モデルとして使用することができる。前述のとおり、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、必要に応じて、さらなるＡＤ分子マーカーも有していてよい。この総てにより、一般にはＡＤだけでなく、異なる異型アルツハイマー病、例えばＦＡＤおよびＳＡＤを研究することも可能にする。
【００４９】
よって、もう１つの態様では、本発明は、ＡＤの研究における本発明のトランスジェニック非ヒト動物の使用に関する。特定の一実施形態では、ＡＤはＦＡＤおよびＳＡＤから選択される。
【００５０】
もう１つの態様では、本発明は、該疾患の病因、原因、誘発因子、その疾患の確立につながる環境的および／または生理病理学的攻撃または傷害を研究するためのＡＤモデルとしての本発明のトランスジェニック非ヒト動物の使用に関する。
【００５１】
その限定されない例示的な例には、年齢、頭蓋外傷、女性、ヘルペス型（ＨＳＶ１）ウイルスおよび細菌、細菌、例えば、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)などのような病原体の作用、脳内でのアルミニウム、亜鉛型金属の蓄積などが含まれる。
【００５２】
もう１つの態様では、本発明は、ＡＤの治療および／または予防のために潜在的に有用な化合物をスクリーニングし、発見し、同定し、評価し、および妥当性を立証するための本発明のトランスジェニック非ヒト動物の使用に向けられる。前記化合物は、いかなる性質の化合物であってもよく、例えば、単離されたまたは１種以上の異なる化合物と混合された化学的、生物学的、微生物学的化合物などであってよく、既知または未知組成および構造を有する化合物、任意の既知治療用途を有する医薬製剤、生物学的製剤、微生物学的製剤など、例えば、有機または無機化学化合物、ペプチド、タンパク質、核酸、抽出物などが含まれる。
【００５３】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物、例えば、マウスは、それらの先祖の遺伝子型および表現型特徴を有する非ヒト動物を得るために、同じ種の他の非ヒト動物との交配を用いてさらに使用することができる。本発明の非ヒト動物と交配させることができる非ヒト動物の例には：
−ＡＰＰ遺伝子、あるいはＡＤと直接または間接的に関係している他の遺伝子についてのノックアウト非ヒト動物；
−ＡＤに関与する遺伝子の対立遺伝子変異体、多型または突然変異体を発現する非ヒト動物、あるいは
−ＡＤモデルとして使用することができる他の非ヒト動物
が含まれる。
【００５４】
特定の一実施形態では、ＡＤと直接または間接的に関係している遺伝子は、ＰＳ１、ＰＳ２遺伝子、およびＡＰＯＥ遺伝子のイプシロン４（ε４）対立遺伝子、またはその疾患に関連する他の遺伝的素因因子、例えばα２−マクログロブリン遺伝子、超低密度リポタンパク質受容体遺伝子、リポタンパク質受容体関連タンパク質ＬＲＰの遺伝子、Ｔａｕタンパク質の遺伝子、ブチルコリンエステラーゼＫの遺伝子、カテプシンＤの遺伝子、インターロイキンの遺伝子およびコリンアセチルトランスフェラーゼの遺伝子からなる群から選択される。
【００５５】
もう１つの特定の実施形態では、本発明のトランスジェニック非ヒトマウスは、数回の交配後に、ｈＡＰＰトランスジーンだけを発現するマウスが得られるように、ネズミＡＰＰ（ｍＡＰＰ）遺伝子についてのノックアウトマウスと交配させることができる。
【００５６】
よって、もう１つの態様では、本発明は、ｈＡＰＰトランスジーンだけを発現し、ｍＡＰＰ遺伝子を発現しないトランスジェニック非ヒト動物を得るための本発明によるトランスジェニック非ヒト動物の使用に関する。
【００５７】
もう１つの態様では、本発明は、ＡＤの治療および／または予防のために潜在的に有用な化合物を同定するための方法であって、
ａ）本発明のトランスジェニック非ヒト動物に候補化合物を投与すること；
ｂ）工程（ａ）の該トランスジェニック非ヒト動物における、ｈＡＰＰ遺伝子の発現パターンおよび／またはｈＡＰＰタンパク質産生および／またはβ−アミロイド（Ａβ）ペプチド産生を決定すること、および
ｃ）該トランスジェニック非ヒト動物において（ｉ）神経組織におけるｈＡＰＰ遺伝子発現レベルの低下、（ii）ｈＡＰＰタンパク質産生および／もしくは蓄積の減少、ならびに／または（iii）Ａβペプチド産生および／もしくは蓄積の減少を引き起こす該候補化合物を選択すること
を含む方法に関する。
【００５８】
神経組織におけるｈＡＰＰ遺伝子発現レベル、ｈＡＰＰタンパク質産生および／もしくは蓄積レベル、ならびにＡβペプチド産生および／もしくは蓄積レベルは、定量ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウエスタンブロットなどのような当業者に公知の従来の技術によって測定することができる。ｈＡＰＰ遺伝子発現レベルまたはｈＡＰＰタンパク質蓄積レベルの好ましい範囲は、それぞれ、図２４および図２６で見ることができる。
【００５９】
特定の一実施形態では、対照レベルと比べて、ｈＡＰＰ遺伝子発現レベルの低下、またはｈＡＰＰタンパク質産生および／もしくは蓄積レベルの減少、またはＡβペプチド産生および／もしくは蓄積の減少、を引き起こす前記候補化合物が選択される。前記化合物は、上記化合物のいずれであってもよい。
【００６０】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、当業者に公知の任意の遺伝子導入法例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子衝撃、細胞形質転換とその後のクローニング（形質転換に成功した細胞の細胞核を除核卵に移し、受容体女性に移植する）、生殖体形質転換（卵母細胞または精母細胞に遺伝子を導入し、形質転換された生殖体を受精に使用し、完全動物を作り出すこと）および／または卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）によって得ることができる。
【００６１】
特定の一実施形態では、本明細書に含まれる実施例に記載のとおり、用いられる遺伝子導入法は卵細胞質内精子注入法に基づく。前記技術については国際特許出願ＷＯ ２００５／０９８０１０に詳細に記載されている。
【００６２】
これまでに記載された遺伝子導入法によって得られる動物は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の特徴的な遺伝子型および表現型を有し、それらは、それらのゲノムに挿入された、完全ｈＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列とその調節配列とを含み、該ｈＡＰＰ遺伝子は、この同じ遺伝子がヒトにおいて示す発現パターンと同様の内因性発現パターンを有する。
【００６３】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物のように、これまでに記載された遺伝子導入法によって得られるトランスジェニック非ヒト動物もまた、それらの先祖の遺伝子型および表現型特徴を有するトランスジェニック非ヒト動物を得るために、同じ種の他の非ヒト動物と交配させ、ＡＤを研究するためのモデルとして使用することができる異なる非ヒト動物を生み出すことができる。
【００６４】
加えて、本発明に記載の遺伝子導入法によって得られるトランスジェニック非ヒト動物の子孫も、ヒトにおけるｈＡＰＰ遺伝子タンパク質のパターンと同様のｈＡＰＰ遺伝子の内因性発現パターンを有し得る。
【００６５】
本発明のもう１つの態様は、それゆえ、本発明に記載の遺伝子導入法に従って得ることができる、ヒトにおける前記遺伝子の発現パターンと同様のまたは同等の発現パターンでヒトＡＰＰ遺伝子を内因的に発現するトランスジェニック非ヒト動物の子孫に関する。
【００６６】
次の実施例により本発明を説明するが、本発明を限定する意味に解してはならない。
【実施例】
【００６７】
完全ヒトＡＰＰ遺伝子を、ヒトにおける該遺伝子の発現パターンと同等の発現パターンで内因性発現するトランスジェニック非ヒト動物の獲得
【００６８】
材料および方法
１．プラスミドの作製
１．１ 一般的なクローニング
通常の分子生物学技術(Sambroock, J., 1989, 上記; Ausubel FM, B. R., Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and struhl, K. (1999). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.)と本発明者らの研究室で改良した技術(Montoliu, 1997 Lab protocols. Generation of a transgenic mouse)を用いて、この研究に必要なベクターを作製した。
【００６９】
１．２ ＤＮＡの電気泳動
アガロースゲルでの電気泳動を用いて、異なるＤＮＡ断片の分離、同定および定量を実施した。１００ｂｐ〜１２ｋｂの様々な分子を分離することができる、０．５〜２％間に含まれる濃度のＵｌｔｒａ Ｐｕｒｅ Ａｇａｒｏｓｅ(GIBCO-BRL)を用いた。
【００７０】
水平型Ｅｃｏｇｅｎセル（６．５ｘ８ｃｍおよび１１ｘ１５ｃｍ）を使用し、それらのセル内でＳｅｇａｉｎｖｅｘ電源を用いて電流量５Ｖ／ｃｍを適用した。ゲルは、ＴＡＥバッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ、２ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸） ｐＨ８(Merck)）中に入れ、臭化エチジウム(Roche)を０．５μｇ／ｍｌで加えて調製した。
【００７１】
１．３ ＤＮＡの定量
必要な精度および予測濃度に応じて、異なる方法を用いてＤＮＡの定量を実施した。予測濃度範囲が０．０５〜２μｇ／μｌ間に及ぶサンプルにおけるＤＮＡ濃度の推定を、波長２６０ｎｍでのＤＮＡ吸光度の分光光度測定に基づき、SHIMADZU社製ＵＶ−１６０１型分光光度計において行った。測定は会社の使用説明書に従って実施し、波長２６０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ２６０）の一単位は５０μｇ／ｍｌの二本鎖ＤＮＡに相当することを考慮して、ＤＮＡ濃度を次の方程式に従って算出した：
【数１】
【００７２】
Ｈｏｅｆｅｒ ＤｙＮＡ Ｑｕａｎｔ ２００ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、濃度が０．０１〜０．０５μｇ／μｌ間であると推定されるサンプルを評価した。この方法では、ビスベンズアミド（Ｈｏｅｓｃｈｓｔ ３３２５８）の蛍光を測定し、このビスベンズアミドの分子は二本鎖ＤＮＡと結合する能力を有し、３６５ｎｍの紫外線を用いてそれを励起すると蛍光光度計により検出することができる蛍光を発する。この方法では、遊離ヌクレオチドまたはＲＮＡによるバックグラウンドが抑制されることから、小濃度範囲で測定するのに非常に有用である。これら総ての測定をｎａｎｏｄｒｏｐ（NanoDrop、ＮＤ−１０００分光光度計）を用いて検証した。
【００７３】
１．４ ポリメラーゼ鎖増幅反応（ＰＣＲ）
組換えを解析するため、さらにトランスジェニックマウスへのその組込みを確認するための特異的ＹＡＣ領域のクローニングおよび増幅用のＤＮＡ断片を、ＰＣＲを用いて得た。
【００７４】
ＰＣＲでは各増幅断片に特異的な条件が必要である。混合物の反応濃度は、温度、増幅時間およびサイクルと同様に、それぞれの反応によって変化する。総ての反応についての標準的な出発条件は以下のとおりである：１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２(Biotools)、２００μＭデオキシヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ(Roche)］、１μＭの特異的オリゴヌクレオチド対(Isogen)、１ｘ反応バッファー(Biotools)および１単位のＴａｑポリメラーゼ(Biotools)、合計量２５μｌ。反応はMJ Researchys社製ＰＣＴ−１００モデルサーマルサイクラーにおいて０．２ｍｌチューブ(MJ Research)中で行った。使用するプログラムは増幅する断片に応じて変更した。それらのプログラムは、一般に、９５℃で５分間の最初のＤＮＡ変性、その後３温度のサイクル、９５℃で３０秒、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション温度に応じて５５〜６５℃間で３０秒および７２℃で１分の３５回の反復で構成された。断片を完全増幅するために、それらを最後に７２℃で１０分に供した。
【００７５】
１．４．１ 酵母コロニーのＰＣＲ
異なる相同組換えを研究するために、酵母コロニーを解析した。コロニーの直接ＰＣＲを行うために、コロニーの増殖を防ぎ、そこからＤＮＡを抽出して、コロニーをＰＣＲチューブ（０．２ｍｌ）に移し、そのＰＣＲチューブ中でそれを５０μｌのザイモリアーゼ（２０Ｕ／ｍｌ）中に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。それらのチューブをEppendorf社製５４１７ｃ卓上遠心機で５，０００ｒ．ｐ．ｍにて遠心分離し、上清を除去し、細胞を９５℃で５分間加熱した。その沈殿物を１５μｌの水中に再懸濁し、５μｌを用いて、ＰＣＲを行った。
【００７６】
１．５ アガロースゲルからのＤＮＡの精製および抽出
１０ｋｂ未満のＤＮＡ断片を、ＴＡＥバッファー中のアガロースゲルを用いて精製した。ゲル中で断片を分離した後、それらを紫外線灯(Upland)を用いて確認した。その後、滅菌ナイフでバンドを切り取り、Eppendorf社製チューブに入れた。QIAagen社製Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを、そのプロトコールに記載の使用説明書に従って用いてゲルからＤＮＡを抽出した。
【００７７】
１．６ 原核細胞
１．６．１ 細菌株および培養
組換えプラスミドを市販の大腸菌株中で増幅した。サイズが約５ｋｂであるプラスミドを増幅し、ＤＨ５α細胞(Gibco)に形質転換し、一方、１０ｋｂに近いサイズのプラスミドを増幅し、ＴＯＰ１０Ｆ’細胞(Stratagen)に形質転換した。
異なるプラスミドの増幅のための細菌増殖は、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）液体培地中、３７℃で少なくとも８時間、攪拌しながら（２５０ｒ．ｐ．ｍ．）、アンピシリン(Sigma)の存在下で、終濃度５０μｇ／ｍｌで行った。コロニーのスクリーニングは、形質転換体を寒天およびＬＢ培地を入れたペトリ皿で、アンピシリンの存在下で増殖させた後、カラースクリーニングを実施し得る場合にはＸ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを用いて、実施した。
【００７８】
１．６．２ コンピテント細菌の調製および形質転換
コンピテントＤＨ５α細胞を、塩化カルシウム法を用いて調製し、熱ショック法を用いて形質転換した。
【００７９】
大型プラスミドは市販のＴＯＰ１０Ｆ’株(Stratagen)を用いて形質転換した。エレクトロポレーションは、予め氷冷しておいた直径２ｍｍのエレクトロポレーション用セル(Bio Rad)中で、Bio-Rad社製Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを会社の指示に従って用いて、２５μＦ、２．５ＫＶおよび２０Ωの条件でパルスを与えて実施した。
【００８０】
１．６．３ プラスミドＤＮＡの精製
小規模プラスミドＤＮＡ精製を、抗生物質を含むＬＢ培地２ｍｌに問題のコロニーを植菌して行った。これらの培養物を３７℃で少なくとも８時間、攪拌しながら（２５０ｒ．ｐ．ｍ．）増殖させた。プラスミドＤＮＡはアルカリ溶菌法を用いて抽出した。より高い濃度および量でのプラスミドＤＮＡの調製は、大量細菌（１００〜５００ｍｌ）培養を利用して、市販のＱｉａｇｅｎ ｍａｘｉ ｋｉｔｓ(Qiagen)とＦｌｅｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔｓ(Amersham Pharmacia)を各キットの具体的なプロトコールに従って用いて行った。
【００８１】
２．オリゴヌクレオチド
ＹＡＣにおけるＡＰＰ遺伝子のフランキング５’および３’領域と、最近コード遺伝子領域までのそれらの距離の範囲を定めるのに用いられるオリゴヌクレオチドは：
APP3'-B-U 5'-atcctaagaggaagggatcttaagg-3' [配列番号：１]
APP3'-B-L 5'-gggagaacaaacatacctcactagc-3' [配列番号：２]
APP3'-A-U 5'-ccagcatgttttccaaagtatgag-3' [配列番号：３]
APP3'-A-L 5'-tgaaatgtccccacactgatcactg-3' [配列番号：４]
APP3'-1-U 5'-gtatagtatggatggttcaaacagagccta-3' [配列番号：５]
APP3'-1-L 5'-aaggtaaagctctagaatctatcagtgcct-3' [配列番号：６]
APP3'-2-U 5'-tttagaagagctcagtaagaatccacattt-3' [配列番号：７]
APP3'-2-L 5'-cattttgtcgttactagtaccattggtttc-3' [配列番号：８]
APP5'-1-U 5'-ctcaaaaacagcaacacagatgtgc-3' [配列番号：９]
APP5'-1-L 5'-gagcttaaacaccttcctctgc-3' [配列番号：１０]
APP5'-2-U 5'-tggggagaggaatggaatttggagc-3' [配列番号：１１]
APP5'-2-L 5'-gtcatttccagaaaaagcccactgc-3' [配列番号：１２]
APP5'-3-U 5'-tcaaggacatggagattgggcaggc-3' [配列番号：１３]
APP5'-3-L 5'-ggggtaacaggttgccggtcatatg-3' [配列番号：１４]
APP5'-4-U 5'-caccagaccatgatgtctcagtagc-3' [配列番号：１５]
APP5'-4-L 5'-ctgcaaaacagccctcatattctgc-3' [配列番号：１６]
APP5'-5-U 5'-tagcatcctttgctaagccagttgc-3' [配列番号：１７]
APP5'-5-L 5'-gcttgttattggaggttccagcacg-3' [配列番号：１８]
APP5'-6-U 5'-tccaacgggggagtgagtgaaaggc-3' [配列番号：１９]
APP5'-6-L 5'-gcctcactcctgcaaacgtgcccaa-3' [配列番号：２０]
APP5'-7-U 5'-tctttcttccaccttggtatcctgc-3' [配列番号：２１]
APP5'-7-L 5'-caggatgtctctggatttttactcg-3' [配列番号：２２]
である。
【００８２】
ＡＰＰ遺伝子のエキソン、ならびにＧＡＢＰＡ遺伝子の存在を確認するのに用いられるオリゴヌクレオチドは以下である：
APP-Ex1-U 5'-agtttcctcggcagcggtagg-3' [配列番号：２３]
APP-Ex1-L 5'-ccagcaggagcagtgccaaac-3' [配列番号：２４]
APP-Ex2-U 5'-aagaccgggctgattcctaa-3' [配列番号：２５]
APP-Ex2-L 5'-tccaacgtgaattgctagcc-3' [配列番号：２６]
APP-Ex3-U 5'-cccaagcattttggataagg-3' [配列番号：２７]
APP-Ex3-L 5'-cctctttttcttccctcaag-3' [配列番号：２８]
APP-Ex4-U 5'-ttgattgggttgcttaggca-3' [配列番号：２９]
APP-Ex4-L 5'-tgttgcctcaaaatacccct-3' [配列番号：３０]
APP-Ex5-U 5'-ctaccactcactgttttctc-3' [配列番号：３１]
APP-Ex5-L 5'-gcagagaccttttcagtgat-3' [配列番号：３２]
APP-Ex6-U 5'-tgccaaaattccatatggacg-3' [配列番号：３３]
APP-Ex6-L 5'-gggatttgccaagcagcatat-3' [配列番号：３４]
APP-Ex7-U 5'-ccactgggaggattaaaaga-3' [配列番号：３５]
APP-Ex7-L 5'-gagaagtggacagaaatgtg-3' [配列番号：３６]
APP-Ex8-U 5'-tgtcagtggactcgtgcatt-3' [配列番号：３７]
APP-Ex8-L 5'-catctcaagctgtctggcaa-3' [配列番号：３８]
APP-Ex9-U 5'-catgtcttcagcaccaactg-3' [配列番号：３９]
APP-Ex9-L 5'-caaactgtgcccacacagta-3' [配列番号：４０]
APP-Ex10-U 5'-cagataggaaggggtatgta-3' [配列番号：４１]
APP-Ex10-L 5'-ggagcaaatataaggcagga-3' [配列番号：４２]
APP-Ex11-U 5'-tgatgagggttggagagtgca-3' [配列番号：４３]
APP-Ex11-L 5'-caagatggaatggacaggggt-3' [配列番号：４４]
APP-Ex12-13-U 5'-cctcgtcacgtgttcaatat-3' [配列番号：４５]
APP-Ex12-13-L 5'-caacttcatcctgaatctcc-3' [配列番号：４６]
APP-Ex14-U 5'-cacgtgaaagcagttgaagt-3' [配列番号：４７]
APP-Ex14-L 5'-ttgccacctatacaatggag-3' [配列番号：４８]
APP-Ex15-U 5'-ctggcacatcaatagcgata-3' [配列番号：４９]
APP-Ex15-L 5'-actcggaacttgggaaatga-3' [配列番号：５０]
APP-Ex16-U 5'-taaaggcagcagaagcctta-3' [配列番号：５１]
APP-Ex16-L 5'-gctcagcctagcctatttat-3' [配列番号：５２]
APP-Ex17-U 5'-accagttgggcagagaatat-3' [配列番号：５３]
APP-Ex17-L 5'-cttgagcagaatattcacgg-3' [配列番号：５４]
APP-Ex18-U 5'-cttggtaattgaagaccagc-3' [配列番号：５５]
APP-Ex18-L 5'-cttttgacagctgtgctgta-3' [配列番号：５６]
GABPA-Ex-U 5'-tattattacgatggggacat-3' [配列番号：５７]
GABPA-Ex-L 5'-gtaaagcaacatctaaagca-3' [配列番号：５８]
組換えに用いた異なるクローニングベクターの配列決定に用いられるオリゴヌクレオチドは：
SV40A-2 5'-gtgaaggaaccttacttctgtggtg-3' [配列番号：５９]
Sp6プロモーター 5'-atttaggtgacactata-3' [配列番号：６０]
T7プロモーター 5'-taatacgactcactataggg-3' [配列番号：６１]
である。
【００８３】
酵母ＵＲＡ遺伝子のクローニングに用いられるオリゴヌクレオチドは：
URA3-U 5'-gcccagtattcttaacccaaactgca-3' [配列番号：６２]
URA3-L 5'-cttccacccatgtctctttgagcaa-3' [配列番号：６３]
である。
【００８４】
栄養要求性ＹＡＣ配列を検出するのに用いられるオリゴヌクレオチドは：
TRP1 5'-gcccaatagaaagagaacaattgacc-3' [配列番号：６４]
TRP2 5'-acacctccgcttacatcaacacc-3' [配列番号：６５]
LYS1 5'-accaagccagcatctgtatcacc-3' [配列番号：６６]
LYS2 5'-gccaaatccatccacttctcatc-3' [配列番号：６７]
である。
【００８５】
サザンブロット解析用のプローブを作製するのに用いられるオリゴヌクレオチドは：
プローブAPP-seq2-U 5'-tgaatcttggcatttgggcc-3' [配列番号：６８]
プローブAPP-seq2-L 5'-cctgtaacttgccctcatag-3' [配列番号：６９]
プローブAPP-seqA-U 5'-gaaacgagttgaaaggcacag-3' [配列番号：７０]
プローブAPP-seqA-L 5'-tttacccttccatgaagtccc-3' [配列番号：７１]
プローブAPP-seqB-U 5'-ggcttgtaaattaaactctgaagc-3' [配列番号：７２]
プローブAPP-seqB-L 5'-cctcagtggctgttttgagagcat-3' [配列番号：７３]
である。
【００８６】
３．酵母人工染色体の修飾
３．１ 真核細胞
酵母において実施した総ての試験はＳ．セレビシエ ＡＢ１３８０株において実施し、その代謝特性は：Ｍａｔａ、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１、ａｄｅ２−１、ｌｙｓ２−１、ｈｉｓ５およびｃａｎ１−１００であった。使用したオリジナルクローンは、Washington Universityで購入し(Human Yeast Artificial chromosome Clone)、そのクローンはＹＡＣ Ｂ１４２Ｆ９を含むものであった（完全ヒトＡＰＰ遺伝子を含む６５０ＫｂのＹＡＣ）。
【００８７】
ＹＡＣ担体酵母は、時々起こるＹＡＣ消失を防ぐために独立栄養セレクター(autotrophic selectors)を加えた液体および固体培地で増殖させた。液体培養物を３０℃で２〜３日間、攪拌しながら（２００ｒ．ｐ．ｍ．）増殖させ、一方、酵母を３０℃で４〜５日間増殖させて、プレートでコロニーを得た。
【００８８】
選択培地はＤ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ(Merck)、ＹＮＢ(Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids)(Difco)および対応アミノ酸(Serva)を加えて調製した。
【００８９】
３．２ 酵母における相同組換え
酵母細胞の形質転換を２つの方法により実施し、それらの方法ではそれぞれ非常に異なる結果を生じた：酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）法(Markie, D. (1995). YAC Protocols_[Please complete the reference]; Alison, A. G., D; Kaiser, C; Stearns, T (1997). Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press.)および酵母細胞エレクトロポレーション(Becker, D. M. and L. Guarente (1991). "High-efficiency transformation of yeast by electroporation." Methods Enzymol 194: 182-7)。
【００９０】
３．３ ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（サザンブロット）を利用した解析
サザンブロット技術を利用して陽性クローンの解析を実施した。２〜４μｇ間のゲノムＤＮＡを、４ｍＭスペルミジンを含む１ｘ消化バッファー中４０〜６０Ｕの対応酵素［Ｅｃｏ ＲＶ、Ｓｃａ Ｉ、Ｂｇｌ II、Ｂａｍ ＨＩ、Ｈｉｎｄ III、Ｓａｌ ＩおよびＥｃｏ ＲＩ］で消化した。その消化物を酵素切断温度で１２〜１４時間インキュベートした。それらの消化産物を水平型Ｈｏｒｉｚｏｎセル（２０ｘ２５ｃｍ）(Life Technologies)内で０．８％アガロースゲルにおいて電気泳動により分離した。
【００９１】
キャピラリーを用いてＤＮＡをHybond（商標）−Ｎナイロン膜(Amersham)に転写した。そのためには、ＳＳＣ ２０Ｘトランスファーバッファー［３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム］中で１４〜１６時間を要した。ゲルは、ＤＮＡの脱プリン化のための０．２５Ｎ ＨＣｌでの洗浄、そしてＤＮＡの中和および変性のための０．４Ｍでの１５分洗浄２回を行って予め処理した。
【００９２】
一度、ＤＮＡが膜に転写されたら、ＣＬ−１０００ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ(UVP-Stratagen)を用いて紫外線照射により、パルス７０，０００ｍＪ／ｃｍ２を２回与えてそれを固定した。
【００９３】
酵素制限によりまたはＰＣＲを用いて単一コピープローブを得、５０ｎｇのＤＮＡ、２５μＣｉのα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ(Amersham)およびＨｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ｋｉｔ(Roche)を会社の使用説明書に従って用いて放射能標識した。標識プローブから遊離ヌクレオチドを除去するために、かかるプローブをＰｒｏｂｅ Ｑｕａｎｔ Ｇ５０カラム(Amersham)に通して精製した。プローブの活性をＷ １４１４シンチレーションカウンター(Beckmann)で定量し、およそ１ｘ１０６ｃｐｍ／μｌの活性を得た。
【００９４】
ハイブリダイゼーションを行い、膜を対応するプローブ（配列番号６８、配列番号６９、配列番号７２および配列番号７３）とともに６５℃で１４〜１６時間インキュベートした。
【００９５】
ハイブリダイズされたフィルターを、増感スクリーン(Miersham)と写真用フィルム(X-Omat, Kodak)の入った露光カセット内で−８０℃で数日間露光した。あるいは、フィルターをＰｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒのカセット(Molecular Dynamics)内で室温で１〜２日間露光し、そのシグナルをＩＱＭａｃ ｖ １．２プログラム(Molecular Dynamics)を用いて解析した。
【００９６】
３．４ 酵母細胞を含むアガロースブロックの小規模調製
ＹＡＣの修飾を解析するために、全細胞を含むアガロースブロックを調製し、そうすることによって、染色体を無傷のまま保つこと、そして染色体によって受けるサイズ変化をパルスフィールド電気泳動を利用して確認できることを実現した。次のプロトコールに従った：
【００９７】
１０ｍｌの選択培地に、解析する酵母クローンを接種し、それを３０℃で攪拌しながら（２００ｒ．ｐ．ｍ．）飽和まで増殖させた。その培養物を３，０００ｒ．ｐ．ｍにて室温で５分間遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿物を１０ｍｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８中に再懸濁し、再度３，０００ｒ．ｐ．ｍにて室温で５分間遠心分離した。この際、その沈殿物を３００μｌの溶液Ｉ（１Ｍソルビトール、２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、１４ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび２ｍｇ／ｍｌのｚｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔ）中に再懸濁し、４０℃に温度調整した。一度、温度調整したら、１０ｍｇ／ｍｌのｚｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔ溶液５０μｌを加え、その後、４０℃に温度調整した５００μｌの溶液II（２％のアガロースを含有する溶液Ｉ、Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ）を加えた。それを、先端を切った青色チップをつけたピペットを用いて混合し、それを、先端を切った黄色チップをつけた２００μｌピペットを用いて型に分配した。各型には８０μｌを加えた。アガロースが固化し得るようにそれらを氷中で１０分間インキュベートし、一度固化したら、それらのキューブをまた、４ｍｌの溶液III（１Ｍソルビトール、２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１４ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび２ｍｇ／ｍｌのｚｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔ）を入れた１０ｍｌチューブに移し、３７℃で１〜３時間、ゆっくりと攪拌しながらインキュベートした。その後、溶液IIIを５ｍｌの溶液ＩＶ（１％ラウリル硫酸塩、１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８）と交換し、それを再度３７℃で１時間インキュベートした。続いて、溶液ＩＶを新しい溶液と置き換え、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、キューブを５ｍｌの２０％ＮＤＳ（０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ、３４ｍＭ Ｎ−ラウリルサルコシン、ｐＨ９）で室温で２時間洗浄し、それらを新しい溶液と交換した。それらは４℃で保存し得る。
【００９８】
３．５ パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）
総てのゲルを０．５ｘＴＢＥバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．３）中１％のアガロース ＬＭＰ Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅに調製した。パルスフィールド電気泳動システムは、Ｇｅｎｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ(Amersham)のものであった。酵母マーカー ＰＦＧＥマーカーII(Roche)を分子量マーカーとして使用し、それらのマーカーはＳ．セレビシエ ＹＰＨ ７５５のアガロースキューブに対応する（染色体 ９０ｋｂ、２２０ｋｂ、２８０ｋｂ、３６０ｋｂ、４５０ｋｂ、５６０ｋｂ、６１０ｋｂ、７００ｋｂ、７７０ｋｂ、８１０ｋｂ、８５０ｋｂ、９２０ｋｂ、９６０ｋｂ、１，０１０ｋｂ、１，１００ｋｂ、１，６００ｋｂおよび２，２００ｋｂ）。
【００９９】
最初のＹＡＣはもともとサイズがおよそ６５０ｋｂであったが、修飾後の最終的なサイズは５２０ｋｂであった。そのため、実施した総てのパルスフィールド電気泳動ではこのサイズの染色体を最適に分離するプログラムを使用した。このプログラムは２００Ｖで２６時間続き：最初の１２時間は５０秒のパルス、残る１４時間は１００秒のパルスであった。一度、ゲルが泳動し終えたら、それを臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）（０．５μｇ／ｍｌ）を含む電気泳動バッファー１〜２ｌ中で３０分間染色した。
【０１００】
得られたＹＡＣを解析するために、染色体をHybond（商標）−Ｎナイロン膜(Amersham)に転写して、解析した。転写は、いくつかのわずかな違いを除いて、サザンブロットに関してすでに記載した転写と同様に行った：大型ＤＮＡ分子を破壊するために、転写の前にゲルを紫外線（２５４ｎｍ）での５分の処置に供した。続いて、それらのそれぞれを０．２５Ｎ ＨＣＬとともに２０分間で２回、次いで、０．４Ｍ ＮａＯＨとともに３０分間で１回インキュベートした。キャピラリーによる転写状態を少なくとも４８時間保った。固定とハイブリダイゼーションの両方を、第（３．３）節ですでに記載したとおりに行った。
【０１０１】
４．マイクロインジェクションのためのＹＡＣの調製
４．１ 酵母細胞を含むアガロースブロックの大規模調製
十分な量のＤＮＡを単離し、本発明のトランスジェニックマウスを作製するために、高細胞密度のアガロースキューブを調製した。そのためには、次のプロセスに従った：
【０１０２】
２００ｍｌの選択培地に、ＹＡＣを有する酵母を接種して、飽和まで増殖させた。それを６００ｇにて５分間遠心分離し、残留培地を除去した。それを、オリジナル培養物１００ｍｌにつき４０ｍｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）中に再懸濁し、それを再度遠心分離し、上清を廃棄した。酵母沈殿物の重量を測定し、密度１と仮定すれば、酵母を体積５０％として溶液Ｉを加え、その混合物を３７℃に温度調整した。一度、温度調整したら（約３０秒）、同じ量の溶液IIを加え、それをゆっくりと攪拌し、４℃で冷却されていた型に８０μｌを分配した。それを１０分間ゲル化させた。それらのキューブを、１ｍｌのキューブにつき８ｍｌの溶液IIIを入れたチューブに入れかえ、それを３７℃で２時間、攪拌しながらインキュベートした。溶液IIIを同量の溶液ＩＶと置き換え、それを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、それを新しい溶液と置き換える必要があり、それを３７℃で一晩放置した。翌日、それらのキューブを、１ｍｌのキューブにつき８ｍｌの２０％ＮＤＳで室温で２時間洗浄した。洗浄を繰り返し、それらをロードする準備ができた。
【０１０３】
４．２ パルス磁場を利用したＹＡＣの精製
この場合の精製産物はトランスジェニックマウスを作製するのに直接使用されることから、ＹＡＣの精製のためのパルス磁場の調製では一連の検討が必要であった。常に滅菌済みの使い捨て材料を使用して、高度無菌操作条件を用いた；ＥｔＢｒは高い突然変異誘発能力を有するため、ＤＮＡが抽出されるゲルの領域がＥｔＢｒと接触しないようにし、ＹＡＣを含む任意の溶液を、滅菌チップをつけてピペットで取った。滅菌チップは先端で切り、ＤＮＡ分子の破損を防いだ。
【０１０４】
９つのキューブが入るように、パルス磁場の７つの通常のウェルを合わせることによって大型ウェルを調製した。マーカーIIおよび１／２、１／４、１／８および１／１６キューブ画分を連続したウェルにロードした。
【０１０５】
このサイズ範囲での分離のために選択したプログラム（２００ボルトにおいて２６時間；最初の１２時間は５０秒のパルス、残る時間は１００秒のパルス）を用いてゲルを泳動した。
一度、ゲルを泳動したら、そのゲルを、ゲルの泳動方向に滅菌メスで３つに切り、それによって大型ウェル全体を含む中央の部分と、画分およびマーカーを含む両側の部分とを作った。これらの２つの部分はＥｔＢｒ（０．５μｇ／ｍｌ）で染色し、一方、中央の部分は泳動バッファー中に保った。染色された部分を用いて、染色されなかった断片において修飾ＹＡＣを位置づけた。一度、そのＹＡＣが位置づけられたら、それを含むアガロースブロックを切り取り、５０ｍｌの平衡バッファー（１０ｎＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３ｍＭスペルミンおよび０．０７ｍＭスペルミジン）中で４℃で少なくとも１６時間平衡化した。次に、修飾ＹＡＣを含むアガロースブロックを４つに分け、それらを１．５ｍｌチューブに移し、７０℃で１０分間加熱し、続いて、４５℃に温度調整することにより液化して、アガラーゼ（GELase（商標） Epicentre）、１００ｍｇのアガロースにつき５単位を加え、それを４５℃で３時間インキュベートした。溶けたアガロースを、次に、Millipore社製超遠心分離用カラム（Ultra free-（登録商標）MC Millipore）に移し、連続した６，０００ｒ．ｐ．ｍにて２分間の遠心分離により総てのＤＮＡをカラム内に濃縮した。この操作を最終量１００μｌが得られるまで繰り返し、ＤＮＡが再懸濁するように、カラムを一晩４℃で放置した。続いて、４０ｍｌのマイクロインジェクションバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３ｍＭスペルミン、０．０７ｍＭスペルミジンおよび滅菌水）を入れたペトリ皿に透析フィルター(Millipore)を入れ、それを２または３時間透析させた。この後、修飾ＹＡＣを含む液を回収した。
【０１０６】
５．卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）（精子はＹＡＣ ＤＮＡとともにインキュベートされる）を利用したトランスジェニックマウスの作製
修飾ＹＡＣを含むトランスジェニックマウスの作製は、特許出願ＷＯ２００５／０９８０１０ならびにMoreira, 2003 (Moreira, P. N., et al., 2003, "Mouse ICSI with frozen-thawed sperm: the impact of sperm freezing procedure and sperm donor strain", Mol Reprod Dev. 66(1) : 98-103)およびMoreira, 2004 (Moreira, P. N., et al., 2004, "Efficient generation of transgenic mice with yeast artificial chromosomes by intracytoplasmic sperm injection", Biol Reprod. 71(6) : 1943-7)に詳細に記載されているプロトコールに従って行った。
【０１０７】
６．創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）マウスおよびそれらの子孫の解析
６．１ ＰＣＲを利用した創始マウスの解析
ＰＣＲ技術は、高度に特異的であり、トランスジーンの同定について最速のものであるという事実から、トランスジーンの解析を実施するためにこの技術を選択した。このマウスを研究するために、ＡＰＰ遺伝子の異なるエキソンについての１７のＰＣＲと、ＹＡＣアームについての２つのＰＣＲと、非遺伝子コード領域についてのさらに４つのＰＣＲとを設計した。上記（１．３）のプロトコールに従って、生まれた総てのマウスについての２３のＰＣＲを行い、総てのＰＣＲについて陽性であるものだけが全トランスジーンの担体マウス（ｃａｒｒｉｅｒ ｍｉｃｅ）と考えられた。
【０１０８】
６．２ 生殖細胞系への伝達
トランスジーンの担体と考えられるマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させ、それらの子孫を解析した。伝達の解析は、２つのＹＡＣアーム（ＬＹＳ２およびＴＲＰ１）についてのＰＣＲと、ＡＰＰ遺伝子の２つのエキソン（エキソン６および１１）についてのＰＣＲとを利用して実施した。
【０１０９】
７．タンパク質の特性評価
７．１ タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。
【０１１０】
７．２ ＳＤＳの存在下でのポリアクリルアミドゲル中でのタンパク質の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
３％濃縮ゲルと、解析するタンパク質の分子量に従って様々なパーセンテージ（７．５％、８％、１０％または１５％）の分離ポリアクリルアミドゲルとを使用した。サンプルバッファーとして２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．３、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノールおよび０．０１％ブロモフェノールブルーを使用した。
【０１１１】
分子量標準としてAmershamm Pharmacia社製の高分子量Rainbow（商標）カラー分子量標準（２２０ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、６６ｋＤａ、４６ｋＤａ、３０ｋＤａ、２１．５ｋＤａおよび１４．３ｋＤａ）を使用した。
【０１１２】
７．３ ウエスタンブロット
簡潔には、上記節に記載のように、ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルで決定されたタンパク質を、セミドライ式電気泳動転写法を用いて、孔径０．４５μｍのニトロセルロースフィルター(Bio-Rad)に電流量１．３ｍＡ／ｃｍ２で９０分間転写した。
【０１１３】
ポンソーＳレッドでの染色を利用して、転写されたタンパク質を観察した後、非特異的結合をブロックするために、その膜を３％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で４℃で一晩飽和させた。
【０１１４】
次いで、それらの膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）および１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した異なる特異的抗体とともに室温で２時間インキュベートした。それらの膜をＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：５０，０００希釈したペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに室温で２時間インキュベートした。最後に、発現させるために化学発光法（この方法ではペルオキシダーゼがＨ２Ｏ２の存在下でルミナル試薬(the luminal reagent)の酸化を触媒する）を用いた（Amersham社の「ＥＣＬ」）。
【０１１５】
それらのバンドを濃度測定（ＧＳ−７１０ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ、Bio-Rad）を用いて定量した。
【０１１６】
７．４ 抗体
６Ｅ１０．６Ｅ１０はヒトＡβ配列の残基１〜１７を認識する精製マウスモノクローナル抗体(Signet)である。６Ｅ１０は電気泳動後の終濃度５μｇ／ｍｌでの免疫標識に使用された。
【０１１７】
抗α−チュブリン：抗α−チュブリン（クローンＢ−５−１−２）はチュブリンのアイソフォームαのＣ末端エピトープを認識するマウスモノクローナル抗体(Sigma)である。抗α−チュブリンは電気泳動後の終濃度１：１０，０００での免疫標識に使用された。
【０１１８】
ビオチン結合抗マウス．ウマにおいて作製された精製抗体；ビオチン結合抗マウスはVector Laboratoriesから入手した。
【０１１９】
８．異なる組織におけるトランスジーン発現の解析
８．１ 全ＲＮＡの単離
異なるマウス組織サンプルを機械的破壊によりホモジナイズし、全ＲＮＡを、市販の「Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」 ｋｉｔ(Roche diagnostic １ ８２８ ６６５)を製造業者によって示されるプロトコールに従って用いて抽出した。得られたＲＮＡの量の評価はＮａｎｏｄｒｏｐ装置（NanoDrop. ＮＤ−１０００分光光度計）によって実施した。
【０１２０】
８．２ レトロ転写(retrotranscription)によるＲＮＡからＤＮＡへの移行
レトロ転写は「Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ」(Applied Biosystem)を用いて行い、ＲＮＡサンプル各１μｇに対して、４単位の逆転写酵素「ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、特異的バッファーを使用し、ランダムヘキサマーを製造業者によって示される条件の指標として最終量１００μｌで使用した。反応混合物を入れたチューブをＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ２４００または９６００サーマルサイクラー(Perkin-Elmer)により次の温度サイクルに供した：
−２５℃で１０分間のプレインキュベーション
−３７℃で１２０分間のインキュベーション。
【０１２１】
８．３ ３８４−ウェルプレートでの定量ＰＣＲ
調製した総ての組織サンプルについて定量ＰＣＲを行い、それらを三連でアッセイし、その場合、５０ｎｇのオリジナルＲＮＡに相当する５μｌのｃＤＮＡを、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ｎｏ． ＡｍｐＥｒａｓｅ Ｕｎｇ(Applied Biosystem)によって記載された一般的な条件を用いて使用した。用いたプローブは：ヒトＡＰＰ遺伝子、ｏｎＤｅｍａｎｄ ｈＡＰＰ Ｈｓ００１６９０９８＿ｍｌ ａｓｓａｙ；ネズミＡＰＰ遺伝子、ｏｎＤｅｍａｎｄ ｍＡＰＰ Ｍｎ００４３１８２７＿ｍｌ ａｓｓａｙ；および内部対照遺伝子（ハウスキーピング）ｇａｐｄｈ、ｏｎＤｅｍａｎｄ Ｍｎ９９９９９９１５＿ｇ１ ａｓｓａｙであった。
【０１２２】
サンプルと反応混合物とを入れたプレートを、リアルタイムでのサンプルの解析を可能にするＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ(Applied Biosystem)を用いて、製造業者によって指定される温度サイクルに供した。得られたデータはＳＤＳ ２．１ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭプログラム(Applied Biosystem)を用いて解析した。
【０１２３】
９．光学顕微鏡での観察：アミロイド斑の検出
組織学的研究のためのサンプルを得る前に、マウスを潅流に供し、続いて、その動物を解剖し、脳を摘出した。
【０１２４】
Ｃｏｎｄｏ ｒｅｄ染色を、Ａｃｃｕｓｔａｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｓｔａｉｎ ｋｉｔ（コンゴレッド．Sigma diagnostic）を製造業者によって推奨されるプロトコールを用いて使用して行った。アミロイドの染色は赤色またはピンクがかった赤色で観察することができ、細胞核は青色、弾性繊維は明るい赤色である。サンプルを複屈折検査すると、それらは緑黄色で観察することができる。
【０１２５】
結果
ヒトＡＰＰ遺伝子を内因的に発現するトランスジェニックマウスの作製については、次の工程を通じて開発された：第一に、ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９およびその近接領域のコンピューター研究を実施する工程、次に、未知の配列またはＹＡＣに存在する他の遺伝子に対応する配列を削除する工程、修飾ＹＡＣを得る工程、続いて、全修飾ＹＡＣ構築物の組込みを達成するために遺伝子導入を実施する工程、それが確実に次の世代に伝達されるようにする工程、最後に、マウス組織におけるトランスジーン発現およびそのレベルを確認する工程。
【０１２６】
１．ＡＰＰ遺伝子およびその環境についてのコンピューター解析
ヒトＡＰＰ遺伝子は２１ｑ２１．３領域の第２１染色体に位置し、５’ではＣＹＹＲ１遺伝子に隣接され、３’ではＧＡＢＰＡおよびＡＴＰ５Ｊ遺伝子に隣接される（図２）。この全領域の配列はＥＮＳＥＭＢＬデータベース(http://www.ensembl.org/)から入手した。このデータベースでは、ヒト配列の他に、ハツカネズミ配列などの異なる生物の配列も入手可能である。ＡＰＰ遺伝子のハツカネズミにおけるホルトロゴウス領域(the hortologous region)は染色体１６ｃ３．３に位置し、ヒトの場合と同じ遺伝子に隣接され（図２）、このことはその配列が完全に保存されるという推測につながる。
【０１２７】
ヒトＡＰＰ遺伝子配列およびその環境を、相同性マトリックスを用いてネズミ遺伝子のものと比較している（図３）。両種間の１ＭｂのＤＮＡ配列をＭａｃＶｅｃｔｏｒ ７．１プログラム(Accelrys, Burlington, MA, USA)を用いて比較すると、ＡＰＰ遺伝子のプロモーター領域のような、コード領域をコードする領域は高度の相同性を示すことが認められる。近接領域に関しては、ＡＰＰ遺伝子の５’領域ではコード領域より観察される保存は少ないが、ゲノム構造は維持され、一方、その遺伝子の３’領域では、その約６０ｋｂにおいて、ヒト領域に関連したネズミ領域で一連の再配列が起こっている。この特定のゲノム構造は、ＹＡＣを修飾するのに用いる領域を定義するのに理想的であり、その境界を５’ではＳｅｑ２配列に相当する領域まで、そして３’ではＧＡＢＰＡ遺伝子のコード領域の開始点までに定める［図１］。
【０１２８】
２．異なるベクターにおける組換えおよびクローニングのための相同配列の選択
２．１ 反復領域の研究
酵母の相同組換えに用いる配列を選択するときには２つの条件が重要であると考えられている：一方では、サイズ、そしてもう一方では、その特異な状況。選択する配列のサイズに関しては、１〜２ｋｂ間であることが好適であると通常考えられる。その特異な状況に関しては、その適合性は、組換えが所望の場所で起こるという事実による。反復配列を位置づけ、それらを避けるために、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラム(A. F. A. Smith & P. Green, 未公開; http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/repeatmasker/)を用いて、１メガベースのＡＰＰ遺伝子環境を解析した。反復配列を排除しておいたこの配列においてＡＰＰ遺伝子の３’および５’の両方における１〜２ｋｂの領域を選択し、ＰＣＲによってクローニングし、酵母における相同組換えに用いた（図４）。
【０１２９】
２．２ 組換え配列のクローニング
ＡＰＰ遺伝子を含むＹＡＣ（ｂ１４２ｆ９）の異なるＰＣＲを、第２節に記載のオリゴヌクレオチドを用いて行った（図４）。ＹＡＣの伸長はこれらのＰＣＲにより確認し、ＡＰＰ遺伝子の５’領域において配列２（ｓｅｑｕｅｎｃｅ２）と配列３（ｓｅｑｕｅｎｃｅ３）の間に位置しており、配列ＡおよびＢ（ｓｅｑｕｅｎｃｅＡおよびＢ）はＡＰＰ遺伝子の３’領域においてＧＡＢＰＡ遺伝子の前に位置していた。配列２は、ＹＡＣ中にある、遺伝子転写開始部位から１２８，３５４ｋｂのところに位置する、ＡＰＰ遺伝子から最も離れた５’における配列であることから、この配列を５’での相同組換えに使用した。３’における領域では、配列ＡおよびＢがＡＰＰ遺伝子の末端からそれぞれ１００ｋｂおよび８０ｋｂの距離のところに位置し、ＧＡＢＰＡ遺伝子の開始点の前にあることから、配列ＡおよびＢの両方をクローニングした。クローニングでは、配列２、ＡおよびＢのＰＣＲを行い（図５）、選択した配列に対応するバンドを精製し、ＰＣＲIIクローニングベクター(Invitrogen)にクローニングして、ＰＣＲII−Ｓｅｑ２、ＰＣＲII−ＳｅｑＡおよびＰＣＲII−ＳｅｑＢを得た。
【０１３０】
２．３ 組換えベクター ｐＢ１Ｒ−Ｓｅｑ２の作製
図６に図式に示すように、プラスミド ＰＣＲII−Ｓｅｑ２およびプラスミド ｐＢ１Ｒの変異体を用いて、プラスミド ｐＢ１Ｒ−Ｓｅｑ２を作製した(Lewis, B. C, N. P. Shah, B. S. Braun and C. T. Denny (1992). "Creation of a yeast artificial chromosome fragmentation vector based on lysine-2." Genet Anal Tech Appl 9(3): 86-90)。このＹＡＣが一度修飾を受けたら、必要に応じて他のタイプの培養に使用できるように、オリジナルプラスミド ｐＢ１Ｒにネオマイシン選択遺伝子を加えた。クローニングベクターの配列２、ＰＣＲII Ｓｅｑ２を、ＥｃｏＲＩ酵素での消化により抽出した。
【０１３１】
この断片の末端を、それらのその後のクローニングのためにクレノウ酵素を用いて平滑末端にした。ベクター ｐＢ１Ｒ−ＮｅｏをＳａｃＩ酵素での消化により線状化した。Ｔ４リガーゼを用いて、Ｓｅｑ２断片をベクター ｐＢ１Ｒ−Ｎｅｏと結合し、後に酵素消化によりベクターにおけるその配列の正確な方向性を確認した。前記ベクターを酵母における第１回目の相同組換えに使用することができるように、そのベクターをＳａｌＩおよびＳａｃＩ酵素での消化により線状化した（図６）。
【０１３２】
２．４．組換えベクター ｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＡおよびｐＹＡＣ４ ３’−ｓｅｑＢの作製
これら２つの組換えベクターの作製を図７に要約している（２配列についてクローニングを並行して実施した）。組換え配列をプラスミド ＰＣＲII−ＳｅｑＡおよびＰＣＲII−ｓｅｑＢから得た。抽出では、それらを最初にＸｈｏＩ酵素で消化し、末端をクレノウ酵素で平滑末端にし、続いて、それらの配列が平滑末端とさらに付着末端を有するようにそれらをＢａｍＨＩで消化した。プラスミド ｐＹＡＣ４ ３’はチロシナーゼ遺伝子の調節配列を研究するために研究室で作製されたｐＹＡＣ４の誘導体である(Burke, D. T., G. F. Carle and M. V. Olson (1992). "Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors. 1987." Biotechnology 24: 172-8、およびBurke, D. T. and M. V. Olson (1991). "Preparation of clone libraries in yeast artificial-chromosome vectors." Methods Enzymol 194: 251-70)。配列ＡおよびＢを、ベクター ｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＡおよびｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＢが生成する配向方法で結合し得るように、消化を利用して、最初にＥｃｏＲＩを用いて、それらの末端を再び平滑末端にし、後にＢａｍＨＩで消化して、目的のものではない領域を削除し、そのベクターを線状化した。
【０１３３】
しかしながら、これらのベクターを第２回目の相同組換えに使用するためには、新規栄養要求性マーカーの存在が必要であった。そのために、最初にＮｏｔＩでの消化によってベクター ｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＡおよびｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＢを線状化して（この場合もクレノウ酵素を用いて、それらの末端を平滑末端にした）、プラスミド ＹＤｐ−ＵのＵＲＡ３マーカーをクローニングし(Alani, E., L. Cao and N. Kleckner (1987). "A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains." Genetics 116(4): 541-5)、続いてＢａｍＨＩでの消化によってプラスミド ＹＤｐ−ＵのＵＲＡ３遺伝子を得た、正確なクローニングのためにその末端も平滑末端にした。Ｔ４リガーゼを用いて、その断片をベクターにクローニングした。ＹＡＣの第２回目の組換えにそれらを正しく使用するためのベクター ｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＡ ＵＲＡ３およびｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＢ ＵＲＡ３の線状化を、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩでの酵素消化によって行った（図７）。
【０１３４】
３．ＹＡＣの５’領域における相同組換え
本発明では染色体断片化プロセスを５’および３’領域を修飾するために用いた；このプロセスはオリジナルＹＡＣの末端にある２つの領域を削除することからなり、それらの領域うちの一方が３’におけるＧＡＢＰＡ遺伝子を含む領域である。
【０１３５】
３．１ ＡＰＰ遺伝子の５’領域のＹＡＣ ｂ１４２ｆ９における相同組換え
１００〜１，０００ｎｇ間で変化するＤＮＡ量を用いて、ＬｉＡｃ法による酵母の形質転換によって合計４０のコロニーを得た。これらの４０コロニーを、ＰＣＲを利用して解析し、陽性の可能性があるクローンとして３つのクローンを得た。
次に、酵母のエレクトロポレーションでは合計９６のコロニーが生じ、これらのコロニーを、ＰＣＲ技術を利用して解析した。これらの中で陽性の可能性があるクローンとしての正確なパターンを示したものはなかった。
【０１３６】
３．２ ＰＣＲを利用した、相同組換えによって生じるクローンの解析
相同組換えによって得られたクローンの解析を、用いる２つのオリゴヌクレオチドのうちの１つが組換えプラスミド中に位置し（ＹＡＣには存在しない領域内）、一方、もう１つのオリゴヌクレオチドがＹＡＣ組換え領域に近接する領域中に位置することを特徴とするハイブリッドＰＣＲを設計することによって実施した。よって、このＰＣＲでは、組換えが予測される部位で起こった場合にのみ断片を増幅することができる。陽性対照として両方の領域を含む別のベクターを作製した。このＰＣＲについて陽性であったのは、解析した１３６のコロニーのうちの３つのもののみ、１３、１４およびｂ７の番号のついたコロニーであった。
【０１３７】
これらのクローンを用いた解析を、別の３つのＰＣＲを用いることによって行い、これによってそれらについてのより多くの情報を提供することができた。最初の２つのＰＣＲは、ＡＰＰ遺伝子の部分を維持するクローンがそのエキソン６および１１のものであるかどうかを確認するために行った（図８）。用いた３つ目のＰＣＲは組換え領域の５’に位置する配列のものであり、相同組換えが正確であったとすれば陰性となる（図８）。解析した３つのクローンは、図８に示されるように、エキソン６および１１のＰＣＲについて陽性であり、５’領域について陰性であった。
【０１３８】
３．３ パルスフィールド電気泳動を用いることによるＹＡＣの断片化の判定
ＹＡＣにおける正確な相同組換えはそのサイズの減少を伴い、そのことはその電気泳動移動度を調べることにより見ることができる。酵母ゲノムはパルスフィールド電気泳動技術（ＰＦＧＥ）を用いてゲル中で分離することができる。この技術に従って、解析する３つのクローンを、オリジナルクローン、同じ酵母株のクローン（ＹＡＣを全く含まない）および分子量マーカーとともに泳動した。図９ではＥｔＢｒで染色した泳動後のゲルを示している。オリジナルＹＡＣクローンにおいて６８０ｋｂマーカーと５８０ｋｂマーカーとの間に、ＹＡＣを含まない酵母クローンには存在しないバンドが存在することを観察することができる。このバンドは、クローン１３およびＢ７では維持されているように見えるが、一方、クローン１４では消失しているように見える。
【０１３９】
続いて、このゲルをニトロセルロース膜に転写して、ＡＰＰ遺伝子 ｃＤＮＡプローブとのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを行い、これによれば電気泳動移動度の変化が極めて正確に確認される。図９では、クローン１４が、正確な組換え後に予測されるＹＡＣサイズの約５０ｋｂの変化をどのように受けたかを示している。
【０１４０】
３．４ サザンブロット技術を利用した組換え領域の解析
相同組換えによるＹＡＣの断片化は、組換え領域のＤＮＡ配列において一連の修飾をもたらす。組換えクローン配列とオリジナルクローン配列との間の違いについては、サザンブロット技術を利用して解析することができる。ＢａｍＨＩ、ＳｃａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIの消化パターンは２つのクローンで異なっていた。
【０１４１】
加えて、ＡＰＰ遺伝子のオリジナルクローンとクローン１４について実施したサザンブロットにおいてバンドサイズの変化が得られ（図１０）、このことにより組換えが正確な相同部位で起こったことが分かり、ＰＣＲ解析とパルスフィールド電気泳動の両方で得られた結果と合わせて、ＡＰＰ遺伝子の５’領域において組換えが成功したこと、そしてクローン１４を次の組換えのベースとして使用可能なことを示している。
【０１４２】
３．５ クローン１４のコード領域の解析
クローン１４がＡＰＰ遺伝子のコード領域の欠失を受けていないことを確認するために、サザンブロットの比較を実施した。このために、オリジナルＹＡＣと修飾ＹＡＣをＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、続いて、ＡＰＰ遺伝子 ｃＤＮＡとハイブリダイズした。このハイブリダイゼーションでは異なる遺伝子コード領域に対応するバンドのラダーが生じるが、これはオリジナルクローンとクローン１４の両方で同じであるにちがいない。ＭａｃＶｅｃｔｏｒプログラムを使用して、ＢａｍＨＩ酵素での３００ｋｂのＡＰＰ遺伝子の消化パターンを得た。次いで、遺伝子コード領域の任意のものを含む断片を確認した。図１１では、このサザンブロットの理論パターンと、それがオリジナルクローンｂ１４２ｆ９と組換えクローン１４で得られたバンドのラダーと一致していることを示している。オリジナルクローンｂ１４２ｆ９と組換えクローン１４で得られたバンドパターンの保存は、組換え後にコード領域は大きな修飾または再配列を受けなかったということを示している。
【０１４３】
４．ＹＡＣの３’領域における相同組換え
４．１ クローン１４のＹＡＣにおける相同組換え．ＧＡＢＰＡ遺伝子削減
第１回目の組換え後に修飾ＹＡＣにおいてＡＰＰ遺伝子の３’領域における相同組換えを行い、これには形質転換に用いるコンピテント酵母を調製するためにクローン１４を用いることを必要とした。この組換えには２つの異なるベクター、ｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＡ ＵＲＡ３およびｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＢ ＵＲＡ３（図７）を用い、これらのベクターは組換え配列が異なるだけのものである。前記配列は２０ｋｂ相互に離れており、遺伝子の末端から８０ｋｂより遠く離れている（図４）。これらの組換え配列を用いることによってＧＡＢＰＡ遺伝子を含む、ＹＡＣの４０〜６０ｋｂを削除した（図１２）。
【０１４４】
ＬｉＡｃ法とエレクトロポレーション法の形質転換効率の違いを考えると、明らかに前者が有利であり（前節の第３．１節参照）、第２回目の形質転換を行うために使用することを決めた。第１回目の組換えとは異なり、ｄｕａｌ ＰＣＲを利用したこの組換えでは２，３１７のコロニーを解析する必要があり、ＡＰＰ遺伝子のエキソン６で行われる第１回目のＰＣＲで陽性を示し、ＧＡＢＰＡ遺伝子で行われる第２回目のＰＣＲでは陰性を示すと、このことによりＧＡＢＰＡ遺伝子に対応する配列が削除されたことが示される。
【０１４５】
解析した２，３１７のコロニーのうちの１，７２０のものは配列Ａに対応し、５９７のものは配列Ｂに対応した。異なるコロニーのＰＣＲ解析後、１７２０のうちの９０のものと、５９７のうちの５のものだけをＰＦＧＥおよびサザンブロットによって解析した。ＰＦＧＥおよびサザンブロットを用いたこれらのクローンの研究により、配列Ａを用いて行われた相同組換えが高い確実性で異なる領域で起こり、その結果、見慣れない組換えパターンをもたらし、いくつかの場合では、組換えＹＡＣが予想をかなり上回る再配列プロセスおよび断片化を受けて、説明することが非常に難しいパターンが生じたことが明らかになった。
【０１４６】
配列Ｂを用いた相同組換えについて解析した５つのクローンは、トランスジェニックマウスの作製に使用するための必要要件を満たすクローンを与えた。このクローンにおいて実施した様々な検証を以下に記載する。
【０１４７】
４．２ ＰＣＲ技術を利用した、３’における組換えによって生じたクローンの解析
酵母形質転換によって得られた異なるクローンの解析を、ｄｕａｌ ＰＣＲを用いて実施した。図１３では、配列Ａを用いた組換えについてのいくつかのクローンと配列Ｂについての５つの陽性のものとにおいて実施したｄｕａｌ ＰＣＲを示している。観察できるように、クローンｂ１０６、ｂ１０８、ｂ１０９、ｂ１１１およびｂ１１３はそれらの後の研究用の候補として反応している。ＡＰＰ遺伝子のエキソン６のＰＣＲではそれらの総てが陽性であり（このことは、それらのクローンはＡＰＰ遺伝子とともにＹＡＣを維持していることを示す）、その一方で、ＧＡＢＰＡ遺伝子のＰＣＲでは陰性である（このことは、これらのクローンはＧＡＢＰＡ遺伝子配列を失った可能性があることを示唆する）。以下に示すように、これら５つのクローンのうちクローンｂ１０６だけが正確な相同組換えパターンを示した。
【０１４８】
ＰＣＲを用いてクローンｂ１０６の研究を行うために、配列ＢとＧＡＢＰＡ遺伝子との間：配列ＡおよびＡ’との間に位置する２つの領域についてのＰＣＲを行った。この研究では、ＧＡＢＰＡ遺伝子とエキソン６のＰＣＲを繰り返し、ＡＰＰ遺伝子のエキソン１１のＰＣＲも含めた。図１４から分かるように、組換え領域に関して３’位置でのＰＣＲで陽性であったものはなく、クローンｂ１０６にはこれらの配列が存在しないことが示された。２つのエキソンのＰＣＲは陽性対照の場合ほど明らかではなく、それらを何度か繰り返したが、常に同じ陽性結果が得られた。
【０１４９】
４．３ ＰＦＧＥを利用したＹＡＣの電気泳動移動度の変化の判定
ＹＡＣの電気泳動移動度は、第１回目の相同組換え後と同じように、この第２回目の組換え後にも変化し、得られるＹＡＣの最終的なサイズは５２０ｋｂである、すなわちＹＡＣを含むクローン１４よりも４０ｋｂ小さい。図１５では、異なるクローンを泳動した１％アガロースゲルを示している：分子量マーカー、オリジナルクローンｂ１４２ｆ９、クローン１４およびクローンｂ１０６。前記ゲルをニトロセルロース膜に転写し、ＡＰＰ遺伝子 ｃＤＮＡとハイブリダイズした。異なるレーンのＹＡＣの観察が得られ、クローンｂ１０６におけるＹＡＣのサイズの変化はオリジナルＹＡＣおよびクローン１４に関して容易に観察された。
【０１５０】
４．４ クローンｂ１０６のＹＡＣとＧＡＢＰＡ遺伝子 ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション
ＹＡＣ ｂ１０６とＧＡＢＰＡ遺伝子 ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを、該ＹＡＣにおいてＧＡＢＰＡ遺伝子のコード領域が削除されたことを確認するために用いた。
【０１５１】
図１５では、前節で用いたパルスフィールドアガロースゲルを示しており、このパルスフィールドアガロースゲルに他のレーンを加え、前記レーンの場合と同じサンプルをこれらのレーンにロードしている。この場合には、ゲルの半分をＡＰＰ遺伝子 ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズし、残りの半分をＧＡＢＰＡ遺伝子 ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。その図から分かるように、クローンｂ１０６のＡＰＰ遺伝子を含むＹＡＣはＧＡＢＰＡ遺伝子配列とはハイブリダイズしないが、一方、オリジナル酵母のＹＡＣ、およびクローン１４のものは同じＹＡＣにおいて両方の遺伝子を有している。
【０１５２】
４．５ サザンブロット技術を利用した３’における組換え領域の解析
組換えベクターがＹＡＣに正確に組み込まれていることを、サザンブロット技術を用いて確認した。図１６に示されるパターンは、オリジナルＹＡＣとクローン１４では共通しているが、一方、クローンｂ１０６は異なった、予測ダイアグラムに従うバンドパターンを有する。ゲルハイブリダイゼーションでは、ＹＡＣ ｂ１０６に対応するバンドは前者のクローンのものとは異なるサイズを有することが分かり、このことは、プローブがハイブリダイズする、組換え配列の周辺領域にあり、後者の５’に位置する領域において、異なるクローン間で配列の違いがあることを明確に示している（図１６）。
【０１５３】
４．６ クローンｂ１０６のコード領域の解析
クローンｂ１０６の妥当性を確認するために、サザンブロットの比較を実施した。クローンｂ１０６のＹＡＣが、コード領域ではなく、ＹＡＣの３’領域で修飾を受けただけならば、３つのＹＡＣ（オリジナルＹＡＣ、クローン１４のＹＡＣおよびクローンｂ１０６のＹＡＣ）は、図１１に示された同じラダーのバンドを有するはずである。実施したサザンブロットを示している図１７を観察すると、３つのクローンのバンドパターンは全く同じであり、そして、それが図１１に示されるものとは明らかに異なるということが分かる。しかしながら、これらの違いは、実際には、より清浄なＤＮＡを、より高い濃度で使用することによって最後のゲルにおいてより良好な分解能が得られたという事実によるものにすぎない。図１７のゲルのバンドパターンを観察すると、いくつかの二重および三重バンドはより明確に見える。
【０１５４】
いずれにせよ、ＡＰＰ遺伝子を含むＹＡＣはクローンｂ１０６において重要なものであった。クローンに用いた同じ命名法を用いて、このＹＡＣに名前を付け、それをＹＡＣ ｂ１０６と呼んだ。
【０１５５】
５．ＹＡＣ Ｂ１０６の精製
本プロセスにより３回の連続したＤＮＡ抽出を実施した。材料および方法の第４．２節に記載のプロトコールに従って実施した３回の精製のうちの１つを示している図１８から分かるように、ＥｔＢｒで染色したゲルのエッジを用いて、ＹＡＣ ｂ１０６の位置を決定し、染まらなかったゲルの部分からＹＡＣ ｂ１０６を抽出した。抽出後にゲルの他の部分を染色することによって、ＹＡＣ ｂ１０６の総てのバンドが採取されたことを確認することができた（図１８）。
【０１５６】
３つの異なる技術によって３回のＤＮＡ抽出を測定した。まず第一に、アガロースゲルでの評価と既知量の参照ＹＡＣとの比較を利用する。得られた結果を、蛍光光度計とｎａｎｏｄｒｏｐを使用することによって調べた。その結果、抽出Ｉ、IIおよびIIIで得られた濃度はそれぞれ４ｎｇ／μｌ、７．１ｎｇ／μｌおよび１０ｎｇ／μｌであった。
【０１５７】
６．卵細胞質内精子注入法を介した遺伝子導入（精子はＹＡＣ ｂ１０６とともにインキュベートされる）
遺伝子導入を実施するために、異なるマイクロインジェクションセッションを実施し、プロセスが終わった後に生まれた合計１０２匹の動物を得た。遺伝子導入に用いた卵母細胞のドナーマウス系はＣＤ１とＣ５７ＢＬ／６Ｊとの混合系であり、それによって純系を使用するよりも高い効率が得られる。創始マウスが生まれてくるときに、それらが７５％Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝的背景を有するように、用いた精子はＣ５７ＢＬ／６Ｊ系のものである。
【０１５８】
７．創始マウスの解析
ＰＣＲ技術を用いて、細胞質注入後に得られた１０２匹のマウスの解析を実施した。５２０Ｋｂのトランスジーンの挿入を正確に確認する手段として総てのＹＡＣ領域に対してスキャンを実施した。この目的のために次のＰＣＲを設計した：ＡＰＰ遺伝子のエキソンについての１７のＰＣＲ（それらのうちの１つはエキソン１２とエキソン１３の両方を含む）と、ＹＡＣの２つのアームについての２つのＰＣＲ（ＬＹＳ２遺伝子の選択遺伝子およびＴＲＰ１のものの両方に関する）と、コード領域とＹＡＣのアームとの間に位置する配列についてのさらに４つのＰＣＲ（図１９）。
【０１５９】
得られた１０２匹のマウスについての２３のＰＣＲを行った（図２０）。それらのうちの１７においてある程度の遺伝子導入が得られ、これはそれらがＹＡＣの外因性ＤＮＡを完全にまたは部分的に組み込んだことを意味する。このＤＮＡの組込みは、１５のケースで起こったように、部分的なものであり得るが、それらのうちの２つ、マウス３５および雌マウス６４においては完全なものであり、ＹＡＣ ｂ１０６に関するこの調査で得られる第１のトランスジェニックマウスが生成したため、その主要目的の１つに適合する。
【０１６０】
８．雑種第一代（Ｆ１）におけるトランスジーンの伝達
２つのトランスジェニック創始マウス、マウス「３５」およびマウス「６４」の作製を確認したので、それらをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させて、それらの子孫へのトランスジーンの伝達を調べ、それらにおけるそのようなトランスジーンの発現を解析した。ＹＡＣ ｂ１０６の伝達を研究するために、それらの子孫で４つのＰＣＲを行った：ＹＡＣのアーム、すなわちＬＹＳ２およびＴＲＰ１遺伝子についての２つのＰＣＲと、ＡＰＰ遺伝子のエキソン６および１１についてのＰＣＲ。この結果、完全ＹＡＣが伝達されたこと、そしてそのためＹＡＣの部分的組込みが起こらなかったことを確認することができた。本明細書の作成まで４１匹のＦ１マウスをマウス３５の子孫について解析し；１８匹のトランスジェニックマウスを確認し、子孫の４４％への伝達がなされていた。雌マウス６４の場合では、３２匹のＦ１子孫を解析して、その子孫中１８匹のトランスジェニックマウスを得、５６％伝達がなされていた。要するに、２つのケースでは、創始マウスの第一代子孫へのトランスジーン伝達指数は、Mendelianのパターンによって予測されるものに一致して約５０％である。図２１では、マウス３５のいくつかの子孫についての例示的なＰＣＲを示している。
【０１６１】
９．トランスジェニックマウスにおけるＹＡＣ ｂ１０６構造の保存
創始マウスを交配することによって得られたトランスジェニックマウスのゲノム研究を、ＹＡＣ ｂ１０６におけるＡＰＰ遺伝子コード領域の構造を確認することにより行い、そのために２つの創始マウスの子孫についてのサザンブロットの比較を実施した。
【０１６２】
図２２では、創始マウス３５および６４のＦ１、すなわち第一代子孫において得られたバンドパターンを示しており、そのバンドパターンは各創始マウスにつき２匹の同腹子（それらの一方のものはトランスジェニックであり、もう一方のものは非トランスジェニックである）に対応している。パターンは図１１で得られたものと同じであることを観察することができ、そのことによりマウスゲノムにおいてトランスジーン構造が保存されていることが示される。
【０１６３】
１０．トランスジェニックマウス系統におけるヒトＡＰＰ遺伝子発現の解析
トランスジェニック系統３５および６４におけるヒトＡＰＰ遺伝子の伝達を立証したら、異なるマウス組織におけるＲＮＡおよびタンパク質両方の発現レベルを特徴づける必要があった。
【０１６４】
この解析には系統３５の第一代に相当するマウスを使用し、合計４匹の２ヶ月齢雄マウスを用いて、それらをそれらの同腹子と比較した。この研究の主な焦点は、ＡＰＰタンパク質の高い発現が起こる組織であることから中枢および末梢神経系であった。異なるマウス体器官における発現もまた解析した、全体的に以下を解析した：脳（皮質、脳室、小脳および中脳と呼ばれる（それらの解剖学的内容と完全に一致する）４つの領域に細分される）；脊髄、肝臓；肺；膵臓；脾臓；小腸；筋肉；精巣；血液；心臓および腎臓。
【０１６５】
１０．１．ＡＰＰ遺伝子メッセンジャーＲＮＡの発現の解析
トランスジェニック系統３５における正確なヒトＡＰＰ遺伝子発現を確認するための第１の工程は、ＲＴ−ＰＣＲを利用して異なるマウス組織におけるヒトＡＰＰ遺伝子の転写を調べることであった。そのためには、異なるマウス組織からメッセンジャーＲＮＡを抽出し、そのＲＮＡの転写レベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを利用して、ヒトＡＰＰ遺伝子に向けられるＴａｑｍａｎプローブを用いて測定した。この試験の内部対照としてネズミＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。この研究を行うために、ネズミＡＰＰ遺伝子ＲＮＡレベルも測定し、それらをＧＡＰＤＨに対して標準化すれば、両方の遺伝子の発現レベルを異なる組織間で比較することができるようにした。
【０１６６】
図２３では、解析した異なる組織で得られたヒトＡＰＰ遺伝子メッセンジャーＲＮＡレベルを示している。発現レベルを相対対数単位で表し、データをＧＡＰＤＨ遺伝子に対して標準化している。この遺伝子は主として神経組織において発現され；その値は、若干低い小脳の場合を除いて、それらの総てにおいてよく似ていることが認められる。他の研究した組織に関しては、精巣、血液、心臓および腎臓で検出可能な発現レベルに達しただけであり、いずれの場合においても、神経系で検出されたものより一桁低い。
【０１６７】
図２４では、トランスジェニックマウスおよびそれらの同腹子に関するヒト遺伝子およびネズミ遺伝子の両方についてのＡＰＰ遺伝子メッセンジャーＲＮＡ発現を示している。前のグラフ同様に、データはネズミＧＡＰＤＨ遺伝子に対して標準化している。示した結果により、神経組織では遺伝子発現レベルが高いが、小脳では低下していることが分かる。他の解析した器官に関しては、肺、精巣、血液、心臓および腎臓などの組織において発現を示しているが、一方、肝臓、膵臓、腸、脾臓および筋肉などの組織ではそのレベルはかなり低くなっており、極めて重要な変化を示している。
【０１６８】
１０．２ タンパク質レベルの解析
マウスにおけるヒトＡＰＰタンパク質の発現によって、マウスにおける正確なＹＡＣ ｂ１０６の転写および翻訳を確認する。タンパク質レベルを、ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動後の免疫標識技術（ウエスタンブロット）を用いて研究した。この研究では、ＡＰＰタンパク質を認識したが、ヒト型とネズミ型とを区別することができない抗体を使用した[Lamb, B. T., et al. (1997). "Altered metabolism of familial Alzheimer's disease-linked amyloid precursor protein variants in yeast artificial chromosome transgenic mice. "Hum Mol Genet 6(9): 1535-41.; Lehman, E. J., et al. (2003). "Genetic background regulates beta-amyloid precursor protein processing and beta-amyloid deposition in the mouse." Hum Mol Genet 12(22): 2949-56]ため、発現レベルを比較することができるように、結果をアクチンに対して標準化する必要がある。
【０１６９】
神経系の異なる組織では免疫反応性が欠如しており、低いＡＰＰ遺伝子発現レベルを示す。図２５では、系統３５および野生マウスの両方に関する代表的なゲルを示し、発現の評価を、アクチンに対して標準化して、下のグラフに示している。そのグラフでは、系統３５が野生マウスの少なくとも２倍の量のタンパク質を有することがはっきりと分かる。この割合はこの研究において解析した異なる脳領域間でわずかに変化するが、その水準を維持している。
【０１７０】
１０．３ マウス脳の組織学的研究
本発明のマウスになければならない特徴の１つは、正確なＡＰＰタンパク質発現およびプロセッシングであるが、その一方で、不正確な発現または誤りのあるプロセッシングの形跡があると、脳においてこのタンパク質（Ａβペプチド）由来のペプチドの蓄積が起こる。この研究を行うために、月齢２ヶ月の２つのマウス系統の脳の切開を行った。これらの切片をコンゴレッドで染色して、アミロイドを検出した。２系統またはそれらの同腹子ではいずれのＡＰＰタンパク質誘導体も蓄積は検出されない（図２６および２７）が、１年齢の対照トランスジェニックマウス（Ｔｇ ２５７６）ではそれらを検出することができる。
【０１７１】
考察
１．酵母の相同組換えによるＹＡＣ ｂ１０６の構築
アルツハイマー病の調査を可能にする、この調査で開発されたトランスジェニックマウスを設計する際に利用できたのは、ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９（ＡＰＰ遺伝子を含むことは分かっているが、場合によってはその後の使用において摂動を導入し得る他の遺伝子も含むかどうかは不明である、６００ｋｂを超えるサイズの人工染色体）だけであった。ヒトゲノム配列が公開され、ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９で実施された他の具体的な研究が発表されたことで、該ＹＡＣ中にはＡＰＰ遺伝子が単独で存在するのではなく、ＧＡＢＰＡ遺伝子が同時に存在することの証明が可能になった。そのため、そのＧＡＢＰＡ遺伝子を削除し、これまでに報告された総てのＡＰＰ遺伝子コード領域および調節領域を尊重して、ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９をその５’および３’領域において修飾する必要が生じる。そのようにして修飾したＹＡＣを、アルツハイマー病に関する調査のためのモデルとして使用することができるトランスジェニックマウスの作製において使用し得るようにするために、このことがこの調査の最初の目標となった。
【０１７２】
５’で行われる相同組換えはＹＡＣの４０ｋｂの削除を伴った（図１２および図９）。それでもなお、この削除後、ＡＰＰ遺伝子の５’領域において１２０ｋｂがまだ保存されており、調査の現状に従ってその正確な発現を可能にするには十分なものであった。実際、ＡＰＰ遺伝子の調節エレメントはその遺伝子の近位プロモーターにおいて報告されているだけであったが、距離が離れている調節エレメントの存在については議論の余地がないと考えられている。そのため、正確な時空間的遺伝子発現を成し遂げるために、進化的に保存されるエレメントを存在させる組換えを実施した［マウス遺伝子のものとの比較ゲノミクスによる配列解析後（図３）］。従って、本調査ではそれを確実にするために端で十分なスペースが保存された。
【０１７３】
ＹＡＣにおける相同組換えによって５’領域の境界を定めた後、染色体断片化によってＧＡＢＰＡ遺伝子を直接削除する第２回目の組換えを実施した。ＧＡＢＰＡ遺伝子は転写因子をコードし、トランスジェニックマウスにおいてそれが発現することによって、トランスジェニック表現型の研究に干渉し得る未知の方法でマウスの正確な開発に影響を及ぼす可能性があり、どの遺伝子が該表現型に関与するのかを確認することができなくなるため、このＹＡＣを動物モデルの作製に用いようとする場合には、その削除は必須である。
【０１７４】
ＡＰＰ遺伝子の３’領域における相同組換えは、５’において実施されるものよりもずっと複雑であるが、これは３’領域に二次ＤＮＡ構造が存在することにより、この構造が組換え配列へのアクセスをより複雑にしている可能性がある。
【０１７５】
第１回目の組換えの場合と同じように、正確な相同組換えとＧＡＢＰＡ遺伝子の削除を正確に確認するために一連の試験を設計した。第１回目のコロニースクリーニングを、ｄｕａｌ ＰＣＲを用いて実施した。この方法は得られた数百ものコロニーを区別すること、そしてこの数を一桁低減することを可能にした。ＧＡＢＰＡ遺伝子を有していなかったがエキソン６は有していたコロニーは適していると考えられるようだが、ＰＦＧＥを利用した後の解析ではいつもそういうわけではないことが分かった。
【０１７６】
この意味で、ＰＦＧＥと、続いての、フィルターのＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡおよびＧＡＢＰＡ遺伝子ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを利用した解析は、中でも最も信頼性の高い最終的な解析であった。これは；実際には、ＹＡＣ ｂ１０６の電気泳動移動度の変化がクローン１４のＹＡＣの断片化によるもののみであり得るためである。ＧＡＢＰＡ遺伝子ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、総ての遺伝子コード領域の認識を可能にするが、一方、ＰＣＲはエキソンの１つを対象にするだけであった。ＹＡＣ ｂ１０６のＧＡＢＰＡ遺伝子をコードする配列の消失についてのハイブリダイゼーションによる確認では、予測される電気泳動移動度の変化とともに、このコロニーが計画された組換えを受けたという確認を必要とした。それでもなお、サザンブロットによる確認および異なるＰＣＲは、研究を行い、その結果、トランスジェニックマウスを作製するためのプロセスに移るために有用であった。
【０１７７】
２．ＩＣＳＩを利用したトランスジェニックマウスの作製
５２０ｋｂのＹＡＣ ｂ１０６を有するトランスジェニックマウスを、ＷＯ２００５／０９８０１０およびMoreira, 2003および2004（上記）に記載のプロセスに従って、ＩＣＳＩを利用して得た。生まれた１０２匹のマウスから、合計１７匹のトランスジェニックマウス、すなわちＹＡＣ ｂ１０６Ｏｆの任意のＤＮＡ断片の担体を得、解析した。
【０１７８】
５２０ｋｂ構築物が完全に組み込まれたことを確認するには、配列全体にわたる入念な解析が必要であり、そのために、各マウスにおいてＹＡＣ全体にわたって２３のＰＣＲを実施した。ＹＡＣの完全組込みを確認するために設計されたＰＣＲ群（図１９）では、マウス３５および６４の場合だけ陽性であり、このことからこれらのマウスを新規動物モデルの候補創始マウスであると特定した。
【０１７９】
しかしながら、創始マウスにおいてトランスジーンが存在するからといって、その後の使用に最も重要な条件である生殖細胞系においてそれが存在することが確実とはならないため、次の世代でその伝達を確認しなければならない。それを調べるために、クローンをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させ、２つのトランスジェニック系統（図２１）から生まれた総ての同腹子をＰＣＲによって解析し、第一代、すなわちＦ１においておよそ５０％の伝達が得られた（結果の第８節）。生殖細胞系におけるトランスジーンの伝達（図２１）ならびにかかるトランスジーンの発現（図２３）を確認することにより、ＹＡＣの組込みを確認するために設計されたＰＣＲ群が適切な手法であったことが証明された。
【０１８０】
３．マウスにおけるヒトＡＰＰ遺伝子の発現
マウスにおけるヒトＡＰＰ遺伝子の発現を特徴づけるための第１の工程を、遺伝子ＲＮＡ発現を解析することによって実施した。そのためには、定量プレートＰＣＲ技術を用いて、異なる組織間のそのレベルを比較した。既存の参照によれば、この遺伝子の発現はいくつかの組織において起こるが、これらレベルは脳において高い。実際には、図２３から分かるように、系統３５の発現レベルは、解析した異なる領域中で脳において最も高い値を示している。脊髄で表れた高い遺伝子発現指数を強調する必要があるが、脊髄はこのタンパク質を産生する細胞系統が存在する神経組織によって形成されていることから、このデータは当然のことである。よって、マウスにおけるヒトＡＰＰ遺伝子の発現に関するこの調査の結果は、脳においてＲＮＡが最高発現レベルにあるという、同様のマウスに関してこれまでに報告されているものと十分に一致している。
【０１８１】
異なる器官におけるヒトＡＰＰ遺伝子の発現はネズミＡＰＰ遺伝子の発現と非常に似ており（図２４）、神経組織だけでなく、心臓、血液、精巣および腎臓においても発現パターンが保存されている。しかしながら、ネズミＡＰＰ遺伝子発現は、肝臓、肺、膵臓、腸および筋肉で検出され、心臓、血液、精巣および腎臓のものと同様の発現が起こっている肺の場合を除いて、他の器官よりもずっと低い値である（一桁低い(one order or magnitude lower)）が、ヒトＡＰＰ遺伝子ではそのようなことは起こらず、すでに指摘したようにその発現はそれらの器官では検出されなかった。
【０１８２】
一度、異なるマウス組織において遺伝子発現が確認されたら、そのＲＮＡのタンパク質への翻訳を確認する必要があった。この研究のために、ＲＴ−ＰＣＲを用いて解析した異なる組織中に存在するタンパク質の量についてのウエスタンブロット解析を実施した。この研究には、最初はヒトタンパク質に特異的な６Ｅ１０抗体を用いることによって対応していたが、この調査の試験においてその特異性を再現することができなかったため、ヒトタンパク質とネズミタンパク質の両方を認識する２２Ｃ１１抗体を使用する決定をし、その結果、タンパク質の総量を評価することができた。
【０１８３】
神経組織ではタンパク質発現が高いことから、起こり得るかかるタンパク質の同定および評価を行ったが、一方、他の組織では、タンパク質レベルの表示はずっと低く、その同定は不可能であった（図２５）。神経組織におけるタンパク質レベルを評価し、それらをアクチン値に対して標準化した後、トランスジェニックマウスおよびそれらの非トランスジェニック同胞種のタンパク質レベルを比較し、前者の場合に、特定組織に応じて、値が内因性タンパク質のものに対して２〜２．５倍高いことを観察した。これを受けて、皮質、脳室および脊髄では、タンパク質レベルは内因性タンパク質に対して２倍を少し上回っており、一方、中脳および小脳では、比率が上昇し、２．５倍に達していた。トランスジェニックマウスではヒトタンパク質とネズミタンパク質の両方が検出されることを考えなければならないため、総ＡＰＰタンパク質発現が２倍というのは、同量のヒトタンパク質とネズミタンパク質が発現されているということを意味する。２つの遺伝子間でのこれらのような発現差はこれまでに記載されているもの（皮質領域でのみ測定され、内因性遺伝子のものの１．７〜２倍間の発現レベルを示す）より少し大きいが、その違いは使用したマウス系に起因する可能性があり、そのマウス系の遺伝的特徴はそのレベルとそのプロセッシングの両方に影響を及ぼす可能性がある。
【０１８４】
最後に、マウス脳において予備研究を実施し、本疾患の典型的な神経病理学のいくつかの検出を試みた。２ヶ月齢マウスでのこのような予備研究では、現在のところアミロイドペプチドの沈着の兆候は検出されず、これらの特徴を有するマウスでの過去の研究と一致している。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ ３５）におけるＡＰＰ遺伝子の位置を示す図である。ＳｅｑＢ領域は全ＧＡＢＰＡ遺伝子コード領域を排除するが、その３’ＵＴＲ領域内で始まる。
【図２】ＡＰＰ遺伝子の染色体上の位置を示す図である；Ａ．ＥＮＳＥＭＢＬにおいて下方に示した近接遺伝子に隣接する、第２１染色体におけるヒトＡＰＰ遺伝子の位置。Ｂ．ＥＮＳＥＭＢＬにおいて下方に示した隣接遺伝子に隣接する、第１６染色体におけるネズミＡＰＰ遺伝子の位置。
【図３】ヒトおよびネズミＡＰＰ遺伝子配列の相同性マトリックスを示す図である。ヒトＡＰＰ遺伝子を含むヒト第２１染色体配列メガベースを、ネズミＡＰＰ遺伝子も含まれる第１６染色体メガベースと比較する。
【図４】ＡＰＰ遺伝子環境のＰＣＲのダイアグラムを示す。ＰＣＲの位置を利用して、その遺伝子の５’および３’の両方において、その遺伝子コード領域までの最近距離を有するＹＡＣ ｂ１４２ｆ９のサイズの範囲を定める。
【図５】ＰＣＲによるＹＡＣ ｂ１４２ｆ９の伸長の境界を示すダイアグラムを示す。配列Ａ、Ｂ、１および２のＰＣＲに関する１％アガロースゲル。レーン１は分子量マーカーに相当する。各配列に対して、陰性対照、ＹＡＣ、および陽性対照それぞれを示す Ｂ．配列３、４、５および６のＰＣＲに関する１％ゲル。レーン１は分子量マーカーに相当する。各配列に対して、陽性対照、ＹＡＣ、および陰性対照それぞれを示す。
【図６】組換えプラスミド ｐＢ１Ｒ Ｓｅｑ２の作製および線状化において従う工程のダイアグラムを示す。
【図７】組換えプラスミドｐＹＡＣ４ ３’ＳｅｑＡおよびｐＹＡＣ４ ３’ＳｅｑＢの作製および線状化において従う工程のダイアグラムを示す。
【図８】エキソン６および１１ならびに配列２’のＰＣＲを示す図である。ＡＰＰ遺伝子のエキソン６、エキソン１１およびいくつかの解析した酵母クローンの配列２’のＰＣＲ。Ｍ、分子量マーカー；Ｇ、ゲノムＤＮＡ；ｃ＋、陽性対照およびｃ−、陰性対照。
【図９】ＰＦＧＥによる酵母染色体の分離およびＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを示す図である。Ａ．臭化エチジウムで染色したＰＦＧＥ。Ｂ．ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡとハイブリダイズした膜。レーン：Ｍ 分子量マーカー、ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９、ＡＢ１３８０（ＹＡＣフリー酵母）、クローン１３、クローン１４、クローンＢ７。
【図１０】ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９およびクローン１４の５’領域のサザンブロットを示す図である。オリジナルクローンｂ１４２ｆ９（ＡＰＰ）とクローン１４とのサザンブロットバンドパターンの違い。
【図１１】ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９およびクローン１４のサザンブロットの比較を示す図である。クローンＢ１４２Ｆ９とクローン１４の両方のＤＮＡをＢａｍ ＨＩ酵素で消化した。アガロースゲルで分離し、ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡとハイブリダイズした。Ｍ、分子量マーカー；ＡＰＰ、クローンＢ１４２Ｆ９；１４、クローン１４。右側、Ｂ．３００ｋｂのＡＰＰ遺伝子をＢａｍ ＨＩで消化した後に得られたバンドパターン、遺伝子コード領域を含む断片には網がけしている。
【図１２】２連続ラウンドの酵母における相同組換えを利用したＹＡＣ ｂ１４２ｆ９の断片化のために提供されるスキームを示す。
【図１３】クローンｂ１０６のｄｕａｌ ＰＣＲ解析を示す図である。ＳｅｑＡおよびＳｅｑＢの両方について、異なるクローンで行ったＰＣＲ。第１回目のＰＣＲはＡＰＰ遺伝子のエキソン６で行い、一方、第２回目のＰＣＲはＧＡＢＰＡ遺伝子で行った。第１回目のＰＣＲに関して陽性であり、第２回目のＰＣＲに関して陰性であるクローンにはアスタリスクをつけて示している。Ｃ＋、陽性対照；Ｃ−、陰性対照。
【図１４】組換え環境のＰＣＲ解析を示す図である。ＰＣＲダイアグラム、陰影マークはＳｅｑＢの場所を示している。Ｂ．ＧＡＢＰＡ遺伝子、ＡＰＰ遺伝子のエキソン１１、エキソン６、ＳｅｑＡ’およびＳｅｑＡのＰＣＲ。各ＰＣＲに対して、陽性対照、クローンｂ１０６および陰性対照に対応する３つのレーンが存在する。
【図１５】ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡとＧＡＢＰＡ遺伝子ｃＤＮＡとを比較したＰＦＧＥについてのハイブリダイゼーションを示す図である。Ａ．臭化エチジウムで染色したＰＦＧＥゲル。１．マーカー。２および５ ｂ１４２ｆ９。３および６ クローン１４。４および７ クローンｂ１０６。Ｂ．レーン１〜４のＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション。レーン５〜７のＧＡＢＰＡ遺伝子ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション。
【図１６】３’における組換えについてのサザンブロットダイアグラムおよびゲルを示す。Ａ．３’における組換えについてのサザンブロットダイアグラム、上部にはオリジナルＹＡＣ、下部には組み換えられたＹＡＣ。Ｒｅｃｏ Ｂの前の陰影四角は使用したプローブの位置を示している。Ｂ．３つのＹＡＣ、ｂ１４２ｆ９（ＡＰＰ）、クローン１４およびクローンｂ１０６のＥｃｏ ＲＩおよびＳｃａ Ｉでの消化についてのサザンブロット。
【図１７】クローンｂ１４２ｆ９、１４およびｂ１０６のサザンブロットの比較を示す図である。Ｂａｍ ＨＩで消化し、ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズしたＹＡＣ ｂ１４２ｆ９（ＡＰＰ）、クローン１４およびクローンｂ１０６のサザンブロットの比較。３つのＹＡＣ間ではバンドパターンは保存されている。Ｍ、マーカー。
【図１８】ＹＡＣ ｂ１０６の抽出についてのＰＦＧＥを示す図である。ＹＡＣ ｂ１０６に対応するバンドの抽出。ゲルにおけるＹＡＣの位置を決めるためにまずサイドを染色した。ＹＡＣ ｂ１０６に対応するアガロースの一部分が中央部でなくなっている。
【図１９】創始マウスを解析するために用いたＰＣＲのダイアグラムを示す。
【図２０】創始マウスについての代表的なＰＣＲを示す図である。トランスジェニックマウスで行った２３のＰＣＲについてのサンプル、マウス２、１２、３５、３７、４１および４６で行ったものを示している、ｃ− 陰性対照、ｃ＋ 陽性対照。
【図２１】マウス３５のいくつかの子孫についての例示的なＰＣＲおよびＡＰＰ遺伝子の生殖細胞系への伝達を示す図である。マウス３５の最初の７子孫で行った４つのＰＣＲについての画像。ＴＲＰ１、エキソン６、エキソン１１およびＬＹＳ２のＰＣＲを行った。子孫１、４、５および７がトランスジーンを受け継いでいることを観察することができる。
【図２２】創始マウスのＦ１のサザンブロットの比較を示す図である。非トランスジェニック同腹子と比較したマウス３５および６４のフィンガープリント。ＹＡＣ ｂ１０６で得られたものと同一のバンドパターンを観察することができる。
【図２３】ヒトＡＰＰ遺伝子発現を示す棒グラフを示す。系統３５にけるヒトＡＰＰ遺伝子発現についての相対単位での対数表現。９７％信頼区間。中枢および末梢神経組織において高い発現が検出される。精巣、血液、心臓および腎臓ではレベルがより低い。
【図２４】ネズミＡＰＰ遺伝子発現を示す棒グラフを示す。マウスにおけるネズミＡＰＰ遺伝子発現についての相対単位での表現。このグラフは、９５％信頼区間を用いて、脾臓における発現（最も低い発現）に対して標準化している。凡例では各棒が対応している組織を示している。
【図２５】ＡＰＰタンパク質発現および評価を示す図である。Ａ．ＡＰＰタンパク質およびアクチンについてのウエスタンブロット解析の代表的なゲル。組織：１ 皮質、２ 脳室、３ 小脳、４ 中脳、５ 脊髄、６ 肝臓、７ 肺、８ 膵臓、９ 脾臓、１０ 小腸、１１ 筋肉、１２ 精巣、１３ 心臓および１４ 腎臓。Ｂ．ＡＰＰレベルのグラフ表現。青色の棒、野生マウス、赤色の棒、トランスジェニックマウス。組織：１ 皮質、２ 脳室、３ 中脳、４ 小脳および５ 脊髄。
【図２６】系統３５のトランスジェニックマウスの組織学的解析を示す図である。マウス脳のコンゴレッド染色。Ａ 野生マウスの皮質。Ｂ 野生マウスの海馬。Ｃ 系統３５の皮質。Ｄ 系統３５の海馬。Ｅ １年齢Ｔｇ２５７６マウスの海馬、ここではアミロイド生成性斑が観察される。
【図２７】系統６４のトランスジェニックマウスの組織学的解析を示す図である。マウス脳のコンゴレッド染色。Ａ 野生マウスの皮質。Ｂ 野生マウスの海馬。Ｃ 系統６４の皮質。Ｄ 系統６４の海馬。Ｅ １年齢Ｔｇ２５７６マウスの海馬、ここではアミロイド生成性斑が観察される。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、バイオテクノロジー分野および薬学分野に含まれる：本発明は、特に非ヒトアルツハイマー病動物モデルとして使用するためのトランスジェニック非ヒト動物の開発およびその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
１９０７年に、Alois Alzheimerが初めて認知症と認識能力の進行性低下を特徴とする神経病理学的症候群を報告した。彼はまた、認知記憶の低下と、剖検で観察された神経病理学的病変と、患者の病歴との関連性も最初に証明した。アルツハイマー病（ＡＤ）の臨床的特徴は、幻覚、鬱病、失見当および攻撃行動を伴う、記憶、言語（失語）、運動機能（失行）および知覚（失認）の進行性消失である。
【０００３】
Alzheimerによって行われた２つの神経学的所見は、ＡＤを説明するために現在使用されている：（ｉ）神経原繊維変化（無定形のニューロン内で見られる緻密な繊維のもつれであり、その主要なサブユニットは微小管関連タンパク質Ｔａｕである）および（ii）老人斑（細胞外斑であり、その主要成分はβ−アミロイドペプチド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる前駆体タンパク質由来のβ−アミロイド（Ａβ）と呼ばれるペプチドである）。
【０００４】
ヒトＡＰＰ遺伝子は２１ｑ２１．３領域の第２１染色体に位置し、３００キロベース（ｋｂ）にわたって分布する１８のエキソンによって形成される。その発現は特定組織に限定されず、内皮、脳のグリアおよびニューロンを含む多くの細胞種および組織で発現される。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は成熟し、３つの主要なアイソフォームを産生するための代替法を受ける可能性がある。これらの３つの主要なアイソフォームにはそれらを形成しているアミノ酸の数により名前が付けられている（ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ６９５）。最長のアイソフォームは完全遺伝子配列を含むＡＰＰ７７０であり；アイソフォームＡＰＰ７５１は最も多量にかつ普遍的に発現されるアイソフォームであり；そしてアイソフォームＡＰＰ６９５は脳において主要なアイソフォームであり、皮質での３つのｍＲＮＡ間の比率はＡＰＰ７７０：ＡＰＰ７５１：ＡＰＰ６９５、１：１０：２０であり、そのため、アイソフォームＡＰＰ６９５がＡＤに関連して最も研究されたアイソフォームであった。
【０００５】
ＡＤの発症に関与する、ＡＰＰ遺伝子の異なる突然変異が１９９０〜１９９２年の間に発見され、その伝達は、浸透度がほぼ１００％の常染色体優性であることを確認することができた。１９９５年には、ＡＤに関連する２つの他の遺伝子が発見され、それらの遺伝子はプレセニリン１（ＰＳ１）およびプレセニリン２（ＰＳ２）と呼ばれている。
【０００６】
ＡＤは、その原因に基づいて２つのタイプに分けることができる：
（ｉ）家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）（ＡＰＰ、ＰＳ１およびＰＳ２遺伝子の突然変異に関連し、発症年齢が早期であり、アルツハイマー病患者のおよそ１％を占める）；および
（ii）孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）（晩期発症型（通常６０歳以後）であり、原因不明である（この疾患に対する罹患素因は一連の感受性遺伝子および環境因子によって決まるようであり、その罹患素因により複雑な多因子疾患となり、主な危険因子は老齢であることと家族歴があることである）；ＳＡＤはアルツハイマー病患者のおよそ９９％を占める）。
【０００７】
両疾患（ＦＡＤおよびＳＡＤ）は臨床症状によっても神経病理学によっても区別することができない。
【０００８】
知られているとおり、実験神経系疾患モデルの開発は生物医学研究に極めて重要である。ヒトにおける神経変性疾患の特徴によく似たモデルの開発には、大きな方法論的進歩が必要であった。ＡＤの場合、主な進歩はＦＡＤに関与するタンパク質を同定することに関係していた。
【０００９】
９０年代の初めに、ＡＰＰ遺伝子におけるいくつかのＦＡＤ関連突然変異が発見され、それらの突然変異は、遺伝子導入技術によって得られる進歩とともに、ＡＤを研究するためのモデルを開発する可能性をもたらした。遺伝子導入を用いて、病原型ＡＰＰ遺伝子を再現可能な、より適した方法で、脳の異なる領域において発現させることが可能であり、それにより、野生型ＡＰＰ、ＡＰＰ断片、突然変異ＡＰＰタンパク質および他のＡＤ関連遺伝子を発現するトランスジェニックマウスに大きな真実性が与えられた。
【００１０】
ＡＤのためにマウスにおいて開発されたモデルとしては、以下が挙げられる：
【００１１】
ＮＳＥＡＰＰ：このマウスを作製するために、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターおよびＡＰＰ遺伝子アイソフォーム７５１ｃＤＮＡを有する構築物を調製した。この構築物の過剰発現は、月齢２２ヶ月のときにびまん性Ａβ斑を発生させた。これらの斑は、マウスの５％でのみ、アルツハイマー病患者に見られる斑によく似たより成熟した外観を呈し、Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙおよびチオフラビン−Ｓ染色液で陽性に染色された。
【００１２】
ＡＰＰ ＹＡＣ：多量のＤＮＡを挿入することができる、トランスジェニックマウスを作製するための担体として酵母人工染色体（ＹＡＣ）を使用することにより、３つのグループによってほぼ同時に、全ＡＰＰ遺伝子コード領域と該遺伝子の３’および５’の両方にある広範な領域を含む６５０ｋｂ ＹＡＣ(B142F9 Washington University YAC library)を有するトランスジェニックマウスの作製が公開された。これらのマウスでは、ヒト遺伝子の発現は、マウスにおける内因性発現と同様に、斑の形成または神経原繊維変化を観察することなく行われた。ヒトゲノム配列決定では、これらのマウスを作製するのに用いられるＹＡＣは、ＡＰＰ遺伝子に加えて、望ましくない表現型を生じる可能性があるＧＡＢＰＡ転写因子をコードする遺伝子も含むことが分かった。
【００１３】
ＰＤＡＰＰ：このトランスジェニックマウスは、１９９５年に報告されており、多様なＡＤ神経病理を発現する初めてのマウスであり、「Ｉｎｄｉａｎａ」Ｖ７１７Ｆ突然変異を含むＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡを過剰発現させる構築物を用いて得られた；それらのマウスの脳では異栄養性神経突起(dystrophic neurites)に囲まれた神経炎性斑、星状細胞増加症、小膠細胞症およびシナプスの喪失を観察することができたが、神経原繊維変化は観察されなかった。皮質領域では斑の存在は５０％占有に達した。この割合は、６％〜１２％間である傾向があるアルツハイマー病患者のものと比較するならば、極めて高い割合である。脳においてこのように多量の斑が存在するにもかかわらず、これらのマウスにおいて神経変性は示されなかった。
【００１４】
Ｔｇ２５７６：このマウスは、１９９６年に報告されており、おそらく、ＡＤを研究するために最もよく用いられているモデルである；トランスジーンは、脳における高発現を確実にするプリオンタンパク質プロモーターによって形成され、遺伝的Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ／／ＳＪＬバックグラウンドにおいて「Ｓｗｅｄｉｓｈ」Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ突然変異を含むアイソフォームＡＰＰ６９５ ｃＤＮＡを有する。Ｔｇ２５７６マウスは、脳におけるマウスの内因性発現レベルの５．６倍であるヒトＡＰＰ（ｈＡＰＰ）発現レベルを有する。それらのマウスは、月齢９〜１２ヶ月のときには、すでに内側嗅領に神経炎性斑があり、後にその斑は海馬および皮質にまで広がった。
【００１５】
ＡＰＰ２３：ＡＤを研究するためのこの新しいネズミモデルは、１９９７年に、Ｔｈｙ１プロモーターと、内因性発現の７倍を上回る発現が行われる、「Ｓｗｅｄｉｓｈ」Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ突然変異を有するｈＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡの過剰発現を用いて作製され、月齢６ヶ月のときに斑の発生を起こした。これらのマウスの最も重要な特徴は、月齢１４〜１８ヶ月のときに海馬のＣＡ１領域における神経細胞死がようやく報告されたということである。このモデルのもう１つの重要な特徴は、ＡＤを研究するための優れたモデルにする脳アミロイド血管症の発生である。これらのマウスの行動解析では、結果において大きな差があり、月齢１８ヶ月からの学習において有意差があることが示された。
【００１６】
今日までの作製された動物モデルでは、総てのＡＤ病理を作製することができなかった。これらのモデルの作製は、野生型またはＦＡＤ関連突然変異を有するＡＰＰタンパク質の過剰発現に基づいたものであり、そのようなモデルは、ＳＡＤ患者では起こらない状況から出発するため、ＦＡＤの研究に限定される。これらのモデルでは、マウス脳において脳領域の２０〜５０％を占めるアミロイド生成性斑(amyloidogenic plaques)の発生が報告されているが、一方、ヒト患者では斑の存在は１２％を超えない。
【００１７】
本明細書に記載のモデル、ヒトＡＰＰ ＹＡＣマウス「ｈＡＰＰｙ」では、ＡＰＰ遺伝子発現は、ＡＰＰ ＹＡＣを用いて行われた先行研究に記載されているとおり、マウスの内因性発現とほぼ同じように行われた(Buxbaum, J. D., et al. (1993). "Expression of APP in brains of transgenic mice containing the entire human APP gene." Biochem Biophys Res Commun 197(2): 639-45; Lamb, B. T., et al. (1993). " Introduction and expression of the 400 kilobase amyloid precursor protein gene in transgenic mice ［補正済み］. "Nat Genet 5(1): 22-30; Pearson, B. E. and T. K. Choi (1993). "Expression of the human beta-amyloid precursor protein gene from a yeast artificial chromosome in transgenic mice." Proc Nati Acad Sci USA 90(22): 10578-82)が、「ｈＡＰＰｙ」マウスでは、これまでＹＡＣ中に存在していたＧＡＢＰＡ遺伝子の存在が消失したという違いがあった(Lamb, B. T., et al. (1997). "Altered metabolism of familial Alzheimer's disease-linked amyloid precursor protein variants in yeast artificial chromosome transgenic mice." Hum Mol Genet 6(9): 1535-41.)。ＡＤモデルの作製には、好適なＡＰＰ遺伝子発現と外部刺激によるその発現における考えられる応答が極めて重要である。
【００１８】
これまで行われた、多くのＡＤ関連神経病理を作成し、さらにＦＡＤをよりよく理解するという努力にもかかわらず、得られたモデルは、ＳＡＤの原因やその発症を理解するためにそれらを使用することが難しいほど現実から離れている。このため、既存のモデルの欠点を克服するＡＤ動物モデルを提供する必要性がまだある。
【００１９】
ヒトＡＰＰタンパク質発現、ひいてはヒトＡβペプチド発現は、ネズミタンパク質はその配列が異なることによりアミロイド斑を形成することができないという事実によって、このモデルにおいてアミロイド斑の形成を可能にする。よって、異なる環境因子または病原因子を「ｈＡＰＰｙ」に適用することで、ＡＰＰ遺伝子の正確な応答を可能にし、アミロイド斑の形成を可能にする。その疾患に大きく関与すると考えられるこれらの環境因子をそのモデルに適用する可能性により、そのモデルはＳＡＤを研究するための極めて重要なツールとなる。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、一般に、アルツハイマー病（ＡＤ）を研究するための非ヒト動物モデルとして使用することができるトランスジェニック非ヒト動物に関する。前記トランスジェニック動物は、そのゲノムに挿入されており、完全ヒトＡＰＰ遺伝子（ｈＡＰＰ）のヌクレオチド配列をその調節配列とともに含む、異種ポリヌクレオチド（トランスジーン）を含む（該トランスジーンはｈＡＰＰ遺伝子の自然環境に存在する他の遺伝子、例えばＧＡＢＰＡ、ＡＴＰＪおよびＣＹＹＲ１遺伝子を欠いている）こと、そして該トランスジーンの発現がトランスジェニック動物において、ヒトにおけるこの同じｈＡＰＰ遺伝子の内因性発現パターンと同様の内因性発現パターンを有することを特徴とする。本明細書において、表現「ヒトにおけるｈＡＰＰ遺伝子の内因性発現パターンと同様のトランスジェニック動物におけるｈＡＰＰトランスジーンの内因性発現パターン」などは、該ｈＡＰＰトランスジーンを含むトランスジェニック動物がｈＡＰＰ遺伝子を、そのｈＡＰＰ遺伝子がヒトにおいて発現される同じ組織において実質的に同じ割合で発現するという事実による。
【００２１】
本発明によって提供されるトランスジェニック非ヒト動物は完全ｈＡＰＰ遺伝子だけをその調節配列とともに含むトランスジーンを含み、ｈＡＰＰ遺伝子の自然環境に存在する、その発現を妨げる可能性のある他の遺伝子（例えば、ＧＡＢＰＡ、ＡＴＰＪおよびＣＹＹＲ１遺伝子）の干渉を受けないという事実により、ヒトにおけるｈＡＰＰ遺伝子の内因性発現パターンと同様の内因性発現パターンでの該トランスジェニック動物における該トランスジーンの発現を可能にする（すなわち該トランスジェニック動物はヒトにおける状況をかなりの信頼性で再現する）ため、該トランスジェニック動物は、ＡＤ、その進行および発症を研究するためだけでなく、それを引き起こしている要因および刺激を研究するためや該疾患の予防および／または治療のために潜在的に有用な化合物を同定するための非ヒト動物モデルとして使用することができる。
【００２２】
よって、一態様では、本発明は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６６４２６６５：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，６４２，６６５との間に含まれるヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチドまたは完全ｈＡＰＰ遺伝子をその調節配列とともに含む該ポリヌクレオチドの断片（以下本発明のポリヌクレオチド）に関する。前記ポリヌクレオチドは完全ｈＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列をその調節配列とともに含み、ｈＡＰＰ遺伝子の該ヌクレオチド配列の末端に隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）それぞれの近接（ａｄｊａｃｅｎｔ）領域は固有の組換え配列を含み、完全ｈＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列をその調節配列とともに単離するのにその固有の組換え配列を使用することができる。
【００２３】
特定の一実施形態では、前記完全ｈＡＰＰ遺伝子は、その調節配列とともに、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６１７４７３３：２６４６４８０９：１）のヌクレオチド２６，１７４，７３３とヌクレオチド２６，４６４，８０９との間に含まれる。
【００２４】
もう１つの特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６５７３３４４：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，５７３，３４４との間に含まれるヌクレオチド配列からなる。前記ポリヌクレオチドは、完全ｈＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列をその調節配列とともに含み、それらに少なくとも１つの固有の組換え配列を含む領域に隣接される。
【００２５】
よって、もう１つの特定の実施形態では、図１に示されるように、前記ｈＡＰＰ遺伝子は、その５’末端において（ＡＰＰ遺伝子転写の始点および方向に関連）第１のヌクレオチド配列に隣接され（ｆｌａｎｋｅｄ）、その３’末端において（ＡＰＰ遺伝子転写の終点および方向に関連）第２のヌクレオチド配列に隣接され、ここで：
該第１のヌクレオチド配列は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６４６４８１０：２６６４２６６５：ｌ）のヌクレオチド２６，４６４，８１０とヌクレオチド２６，６４２，６６５との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片からなり、かつ
該第２のヌクレオチド配列は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６１７４７３２：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，１７４，７３２との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片からなる。
【００２６】
具体的な一実施形態では、前記第１のヌクレオチド配列は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６４６４８１０：２６５７３３４４：ｌ）のヌクレオチド２６，４６４，８１０とヌクレオチド２６，５７３，３４４との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片を含み、かつ前記第２のヌクレオチド配列は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６１７４７３２：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，１７４，７３２との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片を含む。
【００２７】
上述の第１および第２のヌクレオチド配列に含まれる（非反復）固有の配列は、本明細書に含まれる実施例に記載のとおり、相同組換えを利用して、その環境から完全ｈＡＰＰ遺伝子をその調節配列とともに単離するのに利用することができる。前記固有の配列は、当技術分野の水準において記載された当業者に公知のプロセスに従って同定することができる。例として、前記プロセスには一般にＲｅｐｅａｔＭａｓｔｅｒプログラムなどの公的バイオコンピューター資源が含まれる[http://woody.embl-heidelberg.of/repeatmask/;Chenna Ramu et al., (2000) cgi-model: CGI Programming Made Easy with Python. LINUX Journal, July, 142-149; Smit, AFA and Green, P. RepeatMasker at http://repeatmasker.genome.washington.edu/cgi-bin/RM2_req.pl]; Jurka, J. 2000 Repbase Update: a database and an electronic journal of repetitive elements. Trend in Genetics 16(9): 418-420)]。
【００２８】
特定の一実施形態では、前記第１のヌクレオチド配列は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６５７１８７６：２６５７３３４４：１）のヌクレオチド２６，５７１，８７６とヌクレオチド２６，５７３，３４４との間に含まれる固有の配列（本発明ではＳｅｑ２と呼ぶ）を含む。
【００２９】
もう１つの特定の実施形態では、前記第２のヌクレオチド配列は、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６０６７２２１：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，０６７，２２１との間に含まれる固有の配列（本発明ではＳｅｑＢと呼ぶ）を含む。
【００３０】
当業者ならば、完全ｈＡＰＰ遺伝子とその調節配列との末端に隣接する前記第１および第２のヌクレオチド配列内に含まれるいずれの固有の配列も同じ目的（完全ｈＡＰＰ遺伝子とその調節配列のそれらの環境からの単離）に利用することができることは分かる。よって、本発明は、本明細書に記載の固有の配列（本発明の特定の一実施形態を構成する）に限定されるのみならず、前記第１および第２のヌクレオチド配列内に含まれる、当技術分野の水準の一部をなす当業者に公知のバイオコンピューターツールを利用して位置づけることができる総ての固有の配列を含む。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは好適なベクター内に含めることができる。よって、もう１つの態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター（以下本発明のベクター）に関する。前記ベクターは、それゆえ、完全ｈＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列をその調節配列とともに含み、それらに本発明に記載の固有の配列に隣接される。ベクターの選択は、そのベクターをその後に導入する宿主細胞によって決まる。一例として、前記ポリヌクレオチドを導入するベクターは酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）であってよい。よって、特定の一実施形態では、本発明のベクターは、形質転換されるゲスト細胞に応じて、ＹＡＣ、ＢＡＣまたはＰＡＣからなる群から選択される。
【００３２】
特定の一実施形態では、本発明のベクターが導入される細胞が酵母である場合、好ましいベクターは、それぞれのアームにその機能を果たすための総ての好適な構造要素、例えばテロメア、セントロメア、自己複製配列および栄養要求性選択マーカーを含むＹＡＣである。本明細書に含まれる実施例では、酵母細胞を形質転換するのに用いられる上述の構造要素を有するＹＡＣの獲得について記載する。
【００３３】
もう１つの特定の実施形態では、本発明のベクターが導入される細胞が細菌である場合には、好ましいベクターは、必要最小限の要素が複製起点とコピー数およびＢＡＣ分裂を制御する遺伝子であるＢＡＣである。
【００３４】
ＹＡＣ、ＢＡＣおよびＰＡＣの特徴は当業者には公知である。前記種類のベクターについての詳細な情報は、例えば、Giraldo および Montoliuによって提供されている[Giraldo, P. & Montoliu L., 2001 Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals, Transgenic Research 10(2): 83-110]。
【００３５】
よって、特定の一実施形態では、本発明は、その一方の末端において第３のヌクレオチド配列に隣接され、もう一方の末端（反対端）において第４のヌクレオチド配列に隣接される本発明のポリヌクレオチドを含む酵母を形質転換するのに有用なベクターに関し、この場合：
−前記第３のヌクレオチド配列は、（ｉ）酵母細胞において機能的なテロメアおよび少なくとも（ii）１つの栄養要求性選択マーカーを含み、かつ
−前記第４のヌクレオチド配列は、（ｉ）酵母細胞において機能的なセントロメア、酵母細胞において機能的なテロメアおよび少なくとも１つの栄養要求性選択マーカーを含む。
【００３６】
酵母において機能的な、事実上いかなるテロメアおよびセントロメアも本発明において用いることができる。酵母において機能的な前記テロメアおよびセントロメアの限定されない例示的な例には、本明細書に含まれる実施例に記載されているものが含まれる。
【００３７】
同様に、事実上いかなる栄養要求性選択マーカーも本発明において用いることができる。前記栄養要求性選択マーカーの限定されない例示的な例には、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＨＩＳ３、ＨＩＳ５、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が含まれる。
【００３８】
本発明のベクターは、当業者に公知の従来の方法によって得ることができる[Sambrok et al., 1989 "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Vol 1-3]。
【００３９】
本発明のベクターは、例えば、酵母細胞、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などの真核細胞、または例えば、細菌、大腸菌(Escherichia coli)などの原核細胞を形質転換するのに用いることができる。
【００４０】
よって、もう１つの態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のベクターを含む細胞（以下本発明の細胞）に関する。このような細胞は、当業者に公知の従来の方法によって得ることができる[Sambrok et al., 1989 "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Vol 1-3]。
【００４１】
記載する本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞は、そのゲノムに、完全ｈＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列がその調節配列とともに挿入されたトランスジェニック非ヒト動物を得るのに用いることができる。
【００４２】
よって、もう１つの態様では、本発明は、そのゲノムに挿入された本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非ヒト動物（以下本発明のトランスジェニック非ヒト動物）に関する。結果として、本発明のトランスジェニック非ヒト動物のｈＡＰＰ遺伝子の内因性発現パターンは、この同じｈＡＰＰ遺伝子がヒトにおいて示す発現パターンと同様である。いずれかの理論に拘束される訳ではないが、これは、主に、その遺伝子がそれ自体の調節配列により調節されるという事実によるものと思われる。このことは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物におけるｈＡＰＰ遺伝子発現を、ヒトにおいてその発現を誘導する同じ因子によって誘導することを可能にし、そのトランスジェニック非ヒト動物をヒトにおいて起こるＡＤの現象および特徴を確実に再現する動物モデルにする。
【００４３】
本発明の特定の一実施形態では、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、哺乳類、好ましくは齧歯類、より好ましくはマウスまたはラットである。
【００４４】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、当業者による技術水準において公知のものの任意の遺伝的背景を有していてよい、すなわち該トランスジェニック非ヒト動物は、野生型（ｗｔ）動物由来のものであってよく、またはＡＤと直接または間接的に関係している任意の分子マーカーを組み込んでいる遺伝的背景を有する非ヒト動物由来のものであってよい。よって、特定の一実施形態では、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、ｈＡＰＰ遺伝子の他に、ＡＤの発症と直接または間接的に関係している１つ以上の遺伝子を発現することができる。ＡＤの発症と直接または間接的に関係している事実上いかなる分子マーカーも用いることができる。ＡＤの分子マーカーとして認識されている前記遺伝子の限定されない例示的な例には、プレセニリン１（ＰＳ１）遺伝子、プレセニリン２（ＰＳ２）遺伝子およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子のε４対立遺伝子が含まれる。
【００４５】
よって、特定の一実施形態では、本発明のトランスジェニック非ヒト動物のゲノムは、本発明のポリヌクレオチドの他に、１つ以上のＡＤ分子マーカーを含む。限定されない例として、前記ＡＤ分子マーカーは、ＰＳ１、ＰＳ２遺伝子、およびＡＰＯＥ遺伝子のイプシロン４（ε４）対立遺伝子からなる群から選択される。
【００４６】
ＡＤを発症しやすい素因に関連する他の遺伝因子には、α２−マクログロブリン遺伝子、超低密度リポタンパク質受容体遺伝子、リポタンパク質受容体関連タンパク質ＬＲＰの遺伝子、Ｔａｕタンパク質の遺伝子、ブチルコリンエステラーゼＫの遺伝子、カテプシンＤの遺伝子、インターロイキンの遺伝子およびコリンアセチルトランスフェラーゼの遺伝子が含まれる。
【００４７】
本発明の非ヒトマウスの遺伝的背景は、前記ＡＤ分子マーカーの対立遺伝子変異体、突然変異体および多型をさらに含み得る。
【００４８】
完全ヒトＡＰＰ（ｈＡＰＰ）遺伝子のヌクレオチド配列がその調節配列とともに本発明のトランスジェニック非ヒト動物のゲノム中に存在することにより、該遺伝子を、この同じ遺伝子がヒトにおいて示す発現パターンと同様の内因性発現パターンで発現させることを可能にするため、該トランスジェニック動物を、ＡＤを研究するためのトランスジェニック非ヒト動物モデルとして使用することができる。前述のとおり、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、必要に応じて、さらなるＡＤ分子マーカーも有していてよい。この総てにより、一般にはＡＤだけでなく、異なる異型アルツハイマー病、例えばＦＡＤおよびＳＡＤを研究することも可能にする。
【００４９】
よって、もう１つの態様では、本発明は、ＡＤの研究における本発明のトランスジェニック非ヒト動物の使用に関する。特定の一実施形態では、ＡＤはＦＡＤおよびＳＡＤから選択される。
【００５０】
もう１つの態様では、本発明は、該疾患の病因、原因、誘発因子、その疾患の確立につながる環境的および／または生理病理学的攻撃または傷害を研究するためのＡＤモデルとしての本発明のトランスジェニック非ヒト動物の使用に関する。
【００５１】
その限定されない例示的な例には、年齢、頭蓋外傷、女性、ヘルペス型（ＨＳＶ１）ウイルスおよび細菌、細菌、例えば、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)などのような病原体の作用、脳内でのアルミニウム、亜鉛型金属の蓄積などが含まれる。
【００５２】
もう１つの態様では、本発明は、ＡＤの治療および／または予防のために潜在的に有用な化合物をスクリーニングし、発見し、同定し、評価し、および妥当性を立証するための本発明のトランスジェニック非ヒト動物の使用に向けられる。前記化合物は、いかなる性質の化合物であってもよく、例えば、単離されたまたは１種以上の異なる化合物と混合された化学的、生物学的、微生物学的化合物などであってよく、既知または未知組成および構造を有する化合物、任意の既知治療用途を有する医薬製剤、生物学的製剤、微生物学的製剤など、例えば、有機または無機化学化合物、ペプチド、タンパク質、核酸、抽出物などが含まれる。
【００５３】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物、例えば、マウスは、それらの先祖の遺伝子型および表現型特徴を有する非ヒト動物を得るために、同じ種の他の非ヒト動物との交配を用いてさらに使用することができる。本発明の非ヒト動物と交配させることができる非ヒト動物の例には：
−ＡＰＰ遺伝子、あるいはＡＤと直接または間接的に関係している他の遺伝子についてのノックアウト非ヒト動物；
−ＡＤに関与する遺伝子の対立遺伝子変異体、多型または突然変異体を発現する非ヒト動物、あるいは
−ＡＤモデルとして使用することができる他の非ヒト動物
が含まれる。
【００５４】
特定の一実施形態では、ＡＤと直接または間接的に関係している遺伝子は、ＰＳ１、ＰＳ２遺伝子、およびＡＰＯＥ遺伝子のイプシロン４（ε４）対立遺伝子、またはその疾患に関連する他の遺伝的素因因子、例えばα２−マクログロブリン遺伝子、超低密度リポタンパク質受容体遺伝子、リポタンパク質受容体関連タンパク質ＬＲＰの遺伝子、Ｔａｕタンパク質の遺伝子、ブチルコリンエステラーゼＫの遺伝子、カテプシンＤの遺伝子、インターロイキンの遺伝子およびコリンアセチルトランスフェラーゼの遺伝子からなる群から選択される。
【００５５】
もう１つの特定の実施形態では、本発明のトランスジェニック非ヒトマウスは、数回の交配後に、ｈＡＰＰトランスジーンだけを発現するマウスが得られるように、ネズミＡＰＰ（ｍＡＰＰ）遺伝子についてのノックアウトマウスと交配させることができる。
【００５６】
よって、もう１つの態様では、本発明は、ｈＡＰＰトランスジーンだけを発現し、ｍＡＰＰ遺伝子を発現しないトランスジェニック非ヒト動物を得るための本発明によるトランスジェニック非ヒト動物の使用に関する。
【００５７】
もう１つの態様では、本発明は、ＡＤの治療および／または予防のために潜在的に有用な化合物を同定するための方法であって、
ａ）本発明のトランスジェニック非ヒト動物に候補化合物を投与すること；
ｂ）工程（ａ）の該トランスジェニック非ヒト動物における、ｈＡＰＰ遺伝子の発現パターンおよび／またはｈＡＰＰタンパク質産生および／またはβ−アミロイド（Ａβ）ペプチド産生を決定すること、および
ｃ）該トランスジェニック非ヒト動物において（ｉ）神経組織におけるｈＡＰＰ遺伝子発現レベルの低下、（ii）ｈＡＰＰタンパク質産生および／もしくは蓄積の減少、ならびに／または（iii）Ａβペプチド産生および／もしくは蓄積の減少を引き起こす該候補化合物を選択すること
を含む方法に関する。
【００５８】
神経組織におけるｈＡＰＰ遺伝子発現レベル、ｈＡＰＰタンパク質産生および／もしくは蓄積レベル、ならびにＡβペプチド産生および／もしくは蓄積レベルは、定量ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウエスタンブロットなどのような当業者に公知の従来の技術によって測定することができる。ｈＡＰＰ遺伝子発現レベルまたはｈＡＰＰタンパク質蓄積レベルの好ましい範囲は、それぞれ、図２４および図２６で見ることができる。
【００５９】
特定の一実施形態では、対照レベルと比べて、ｈＡＰＰ遺伝子発現レベルの低下、またはｈＡＰＰタンパク質産生および／もしくは蓄積レベルの減少、またはＡβペプチド産生および／もしくは蓄積の減少、を引き起こす前記候補化合物が選択される。前記化合物は、上記化合物のいずれであってもよい。
【００６０】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、当業者に公知の任意の遺伝子導入法例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子衝撃、細胞形質転換とその後のクローニング（形質転換に成功した細胞の細胞核を除核卵に移し、受容体女性に移植する）、生殖体形質転換（卵母細胞または精母細胞に遺伝子を導入し、形質転換された生殖体を受精に使用し、完全動物を作り出すこと）および／または卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）によって得ることができる。
【００６１】
特定の一実施形態では、本明細書に含まれる実施例に記載のとおり、用いられる遺伝子導入法は卵細胞質内精子注入法に基づく。前記技術については国際特許出願ＷＯ ２００５／０９８０１０に詳細に記載されている。
【００６２】
これまでに記載された遺伝子導入法によって得られる動物は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の特徴的な遺伝子型および表現型を有し、それらは、それらのゲノムに挿入された、完全ｈＡＰＰ遺伝子のヌクレオチド配列とその調節配列とを含み、該ｈＡＰＰ遺伝子は、この同じ遺伝子がヒトにおいて示す発現パターンと同様の内因性発現パターンを有する。
【００６３】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物のように、これまでに記載された遺伝子導入法によって得られるトランスジェニック非ヒト動物もまた、それらの先祖の遺伝子型および表現型特徴を有するトランスジェニック非ヒト動物を得るために、同じ種の他の非ヒト動物と交配させ、ＡＤを研究するためのモデルとして使用することができる異なる非ヒト動物を生み出すことができる。
【００６４】
加えて、本発明に記載の遺伝子導入法によって得られるトランスジェニック非ヒト動物の子孫も、ヒトにおけるｈＡＰＰ遺伝子タンパク質のパターンと同様のｈＡＰＰ遺伝子の内因性発現パターンを有し得る。
【００６５】
本発明のもう１つの態様は、それゆえ、本発明に記載の遺伝子導入法に従って得ることができる、ヒトにおける前記遺伝子の発現パターンと同様のまたは同等の発現パターンでヒトＡＰＰ遺伝子を内因的に発現するトランスジェニック非ヒト動物の子孫に関する。
【００６６】
次の実施例により本発明を説明するが、本発明を限定する意味に解してはならない。
【実施例】
【００６７】
完全ヒトＡＰＰ遺伝子を、ヒトにおける該遺伝子の発現パターンと同等の発現パターンで内因性発現するトランスジェニック非ヒト動物の獲得
【００６８】
材料および方法
１．プラスミドの作製
１．１ 一般的なクローニング
通常の分子生物学技術(Sambroock, J., 1989, 上記; Ausubel FM, B. R., Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and struhl, K. (1999). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.)と本発明者らの研究室で改良した技術(Montoliu, 1997 Lab protocols. Generation of a transgenic mouse)を用いて、この研究に必要なベクターを作製した。
【００６９】
１．２ ＤＮＡの電気泳動
アガロースゲルでの電気泳動を用いて、異なるＤＮＡ断片の分離、同定および定量を実施した。１００ｂｐ〜１２ｋｂの様々な分子を分離することができる、０．５〜２％間に含まれる濃度のＵｌｔｒａ Ｐｕｒｅ Ａｇａｒｏｓｅ(GIBCO-BRL)を用いた。
【００７０】
水平型Ｅｃｏｇｅｎセル（６．５ｘ８ｃｍおよび１１ｘ１５ｃｍ）を使用し、それらのセル内でＳｅｇａｉｎｖｅｘ電源を用いて電流量５Ｖ／ｃｍを適用した。ゲルは、ＴＡＥバッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ、２ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸） ｐＨ８(Merck)）中に入れ、臭化エチジウム(Roche)を０．５μｇ／ｍｌで加えて調製した。
【００７１】
１．３ ＤＮＡの定量
必要な精度および予測濃度に応じて、異なる方法を用いてＤＮＡの定量を実施した。予測濃度範囲が０．０５〜２μｇ／μｌ間に及ぶサンプルにおけるＤＮＡ濃度の推定を、波長２６０ｎｍでのＤＮＡ吸光度の分光光度測定に基づき、SHIMADZU社製ＵＶ−１６０１型分光光度計において行った。測定は会社の使用説明書に従って実施し、波長２６０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ２６０）の一単位は５０μｇ／ｍｌの二本鎖ＤＮＡに相当することを考慮して、ＤＮＡ濃度を次の方程式に従って算出した：
【数１】
【００７２】
Ｈｏｅｆｅｒ ＤｙＮＡ Ｑｕａｎｔ ２００ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、濃度が０．０１〜０．０５μｇ／μｌ間であると推定されるサンプルを評価した。この方法では、ビスベンズアミド（Ｈｏｅｓｃｈｓｔ ３３２５８）の蛍光を測定し、このビスベンズアミドの分子は二本鎖ＤＮＡと結合する能力を有し、３６５ｎｍの紫外線を用いてそれを励起すると蛍光光度計により検出することができる蛍光を発する。この方法では、遊離ヌクレオチドまたはＲＮＡによるバックグラウンドが抑制されることから、小濃度範囲で測定するのに非常に有用である。これら総ての測定をｎａｎｏｄｒｏｐ（NanoDrop、ＮＤ−１０００分光光度計）を用いて検証した。
【００７３】
１．４ ポリメラーゼ鎖増幅反応（ＰＣＲ）
組換えを解析するため、さらにトランスジェニックマウスへのその組込みを確認するための特異的ＹＡＣ領域のクローニングおよび増幅用のＤＮＡ断片を、ＰＣＲを用いて得た。
【００７４】
ＰＣＲでは各増幅断片に特異的な条件が必要である。混合物の反応濃度は、温度、増幅時間およびサイクルと同様に、それぞれの反応によって変化する。総ての反応についての標準的な出発条件は以下のとおりである：１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２(Biotools)、２００μＭデオキシヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ(Roche)］、１μＭの特異的オリゴヌクレオチド対(Isogen)、１ｘ反応バッファー(Biotools)および１単位のＴａｑポリメラーゼ(Biotools)、合計量２５μｌ。反応はMJ Researchys社製ＰＣＴ−１００モデルサーマルサイクラーにおいて０．２ｍｌチューブ(MJ Research)中で行った。使用するプログラムは増幅する断片に応じて変更した。それらのプログラムは、一般に、９５℃で５分間の最初のＤＮＡ変性、その後３温度のサイクル、９５℃で３０秒、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション温度に応じて５５〜６５℃間で３０秒および７２℃で１分の３５回の反復で構成された。断片を完全増幅するために、それらを最後に７２℃で１０分に供した。
【００７５】
１．４．１ 酵母コロニーのＰＣＲ
異なる相同組換えを研究するために、酵母コロニーを解析した。コロニーの直接ＰＣＲを行うために、コロニーの増殖を防ぎ、そこからＤＮＡを抽出して、コロニーをＰＣＲチューブ（０．２ｍｌ）に移し、そのＰＣＲチューブ中でそれを５０μｌのザイモリアーゼ（２０Ｕ／ｍｌ）中に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。それらのチューブをEppendorf社製５４１７ｃ卓上遠心機で５，０００ｒ．ｐ．ｍにて遠心分離し、上清を除去し、細胞を９５℃で５分間加熱した。その沈殿物を１５μｌの水中に再懸濁し、５μｌを用いて、ＰＣＲを行った。
【００７６】
１．５ アガロースゲルからのＤＮＡの精製および抽出
１０ｋｂ未満のＤＮＡ断片を、ＴＡＥバッファー中のアガロースゲルを用いて精製した。ゲル中で断片を分離した後、それらを紫外線灯(Upland)を用いて確認した。その後、滅菌ナイフでバンドを切り取り、Eppendorf社製チューブに入れた。QIAagen社製Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを、そのプロトコールに記載の使用説明書に従って用いてゲルからＤＮＡを抽出した。
【００７７】
１．６ 原核細胞
１．６．１ 細菌株および培養
組換えプラスミドを市販の大腸菌株中で増幅した。サイズが約５ｋｂであるプラスミドを増幅し、ＤＨ５α細胞(Gibco)に形質転換し、一方、１０ｋｂに近いサイズのプラスミドを増幅し、ＴＯＰ１０Ｆ’細胞(Stratagen)に形質転換した。
異なるプラスミドの増幅のための細菌増殖は、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）液体培地中、３７℃で少なくとも８時間、攪拌しながら（２５０ｒ．ｐ．ｍ．）、アンピシリン(Sigma)の存在下で、終濃度５０μｇ／ｍｌで行った。コロニーのスクリーニングは、形質転換体を寒天およびＬＢ培地を入れたペトリ皿で、アンピシリンの存在下で増殖させた後、カラースクリーニングを実施し得る場合にはＸ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを用いて、実施した。
【００７８】
１．６．２ コンピテント細菌の調製および形質転換
コンピテントＤＨ５α細胞を、塩化カルシウム法を用いて調製し、熱ショック法を用いて形質転換した。
【００７９】
大型プラスミドは市販のＴＯＰ１０Ｆ’株(Stratagen)を用いて形質転換した。エレクトロポレーションは、予め氷冷しておいた直径２ｍｍのエレクトロポレーション用セル(Bio Rad)中で、Bio-Rad社製Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを会社の指示に従って用いて、２５μＦ、２．５ＫＶおよび２０Ωの条件でパルスを与えて実施した。
【００８０】
１．６．３ プラスミドＤＮＡの精製
小規模プラスミドＤＮＡ精製を、抗生物質を含むＬＢ培地２ｍｌに問題のコロニーを植菌して行った。これらの培養物を３７℃で少なくとも８時間、攪拌しながら（２５０ｒ．ｐ．ｍ．）増殖させた。プラスミドＤＮＡはアルカリ溶菌法を用いて抽出した。より高い濃度および量でのプラスミドＤＮＡの調製は、大量細菌（１００〜５００ｍｌ）培養を利用して、市販のＱｉａｇｅｎ ｍａｘｉ ｋｉｔｓ(Qiagen)とＦｌｅｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔｓ(Amersham Pharmacia)を各キットの具体的なプロトコールに従って用いて行った。
【００８１】
２．オリゴヌクレオチド
ＹＡＣにおけるＡＰＰ遺伝子のフランキング５’および３’領域と、最近コード遺伝子領域までのそれらの距離の範囲を定めるのに用いられるオリゴヌクレオチドは：
APP3'-B-U 5'-atcctaagaggaagggatcttaagg-3' [配列番号：１]
APP3'-B-L 5'-gggagaacaaacatacctcactagc-3' [配列番号：２]
APP3'-A-U 5'-ccagcatgttttccaaagtatgag-3' [配列番号：３]
APP3'-A-L 5'-tgaaatgtccccacactgatcactg-3' [配列番号：４]
APP3'-1-U 5'-gtatagtatggatggttcaaacagagccta-3' [配列番号：５]
APP3'-1-L 5'-aaggtaaagctctagaatctatcagtgcct-3' [配列番号：６]
APP3'-2-U 5'-tttagaagagctcagtaagaatccacattt-3' [配列番号：７]
APP3'-2-L 5'-cattttgtcgttactagtaccattggtttc-3' [配列番号：８]
APP5'-1-U 5'-ctcaaaaacagcaacacagatgtgc-3' [配列番号：９]
APP5'-1-L 5'-gagcttaaacaccttcctctgc-3' [配列番号：１０]
APP5'-2-U 5'-tggggagaggaatggaatttggagc-3' [配列番号：１１]
APP5'-2-L 5'-gtcatttccagaaaaagcccactgc-3' [配列番号：１２]
APP5'-3-U 5'-tcaaggacatggagattgggcaggc-3' [配列番号：１３]
APP5'-3-L 5'-ggggtaacaggttgccggtcatatg-3' [配列番号：１４]
APP5'-4-U 5'-caccagaccatgatgtctcagtagc-3' [配列番号：１５]
APP5'-4-L 5'-ctgcaaaacagccctcatattctgc-3' [配列番号：１６]
APP5'-5-U 5'-tagcatcctttgctaagccagttgc-3' [配列番号：１７]
APP5'-5-L 5'-gcttgttattggaggttccagcacg-3' [配列番号：１８]
APP5'-6-U 5'-tccaacgggggagtgagtgaaaggc-3' [配列番号：１９]
APP5'-6-L 5'-gcctcactcctgcaaacgtgcccaa-3' [配列番号：２０]
APP5'-7-U 5'-tctttcttccaccttggtatcctgc-3' [配列番号：２１]
APP5'-7-L 5'-caggatgtctctggatttttactcg-3' [配列番号：２２]
である。
【００８２】
ＡＰＰ遺伝子のエキソン、ならびにＧＡＢＰＡ遺伝子の存在を確認するのに用いられるオリゴヌクレオチドは以下である：
APP-Ex1-U 5'-agtttcctcggcagcggtagg-3' [配列番号：２３]
APP-Ex1-L 5'-ccagcaggagcagtgccaaac-3' [配列番号：２４]
APP-Ex2-U 5'-aagaccgggctgattcctaa-3' [配列番号：２５]
APP-Ex2-L 5'-tccaacgtgaattgctagcc-3' [配列番号：２６]
APP-Ex3-U 5'-cccaagcattttggataagg-3' [配列番号：２７]
APP-Ex3-L 5'-cctctttttcttccctcaag-3' [配列番号：２８]
APP-Ex4-U 5'-ttgattgggttgcttaggca-3' [配列番号：２９]
APP-Ex4-L 5'-tgttgcctcaaaatacccct-3' [配列番号：３０]
APP-Ex5-U 5'-ctaccactcactgttttctc-3' [配列番号：３１]
APP-Ex5-L 5'-gcagagaccttttcagtgat-3' [配列番号：３２]
APP-Ex6-U 5'-tgccaaaattccatatggacg-3' [配列番号：３３]
APP-Ex6-L 5'-gggatttgccaagcagcatat-3' [配列番号：３４]
APP-Ex7-U 5'-ccactgggaggattaaaaga-3' [配列番号：３５]
APP-Ex7-L 5'-gagaagtggacagaaatgtg-3' [配列番号：３６]
APP-Ex8-U 5'-tgtcagtggactcgtgcatt-3' [配列番号：３７]
APP-Ex8-L 5'-catctcaagctgtctggcaa-3' [配列番号：３８]
APP-Ex9-U 5'-catgtcttcagcaccaactg-3' [配列番号：３９]
APP-Ex9-L 5'-caaactgtgcccacacagta-3' [配列番号：４０]
APP-Ex10-U 5'-cagataggaaggggtatgta-3' [配列番号：４１]
APP-Ex10-L 5'-ggagcaaatataaggcagga-3' [配列番号：４２]
APP-Ex11-U 5'-tgatgagggttggagagtgca-3' [配列番号：４３]
APP-Ex11-L 5'-caagatggaatggacaggggt-3' [配列番号：４４]
APP-Ex12-13-U 5'-cctcgtcacgtgttcaatat-3' [配列番号：４５]
APP-Ex12-13-L 5'-caacttcatcctgaatctcc-3' [配列番号：４６]
APP-Ex14-U 5'-cacgtgaaagcagttgaagt-3' [配列番号：４７]
APP-Ex14-L 5'-ttgccacctatacaatggag-3' [配列番号：４８]
APP-Ex15-U 5'-ctggcacatcaatagcgata-3' [配列番号：４９]
APP-Ex15-L 5'-actcggaacttgggaaatga-3' [配列番号：５０]
APP-Ex16-U 5'-taaaggcagcagaagcctta-3' [配列番号：５１]
APP-Ex16-L 5'-gctcagcctagcctatttat-3' [配列番号：５２]
APP-Ex17-U 5'-accagttgggcagagaatat-3' [配列番号：５３]
APP-Ex17-L 5'-cttgagcagaatattcacgg-3' [配列番号：５４]
APP-Ex18-U 5'-cttggtaattgaagaccagc-3' [配列番号：５５]
APP-Ex18-L 5'-cttttgacagctgtgctgta-3' [配列番号：５６]
GABPA-Ex-U 5'-tattattacgatggggacat-3' [配列番号：５７]
GABPA-Ex-L 5'-gtaaagcaacatctaaagca-3' [配列番号：５８]
組換えに用いた異なるクローニングベクターの配列決定に用いられるオリゴヌクレオチドは：
SV40A-2 5'-gtgaaggaaccttacttctgtggtg-3' [配列番号：５９]
Sp6プロモーター 5'-atttaggtgacactata-3' [配列番号：６０]
T7プロモーター 5'-taatacgactcactataggg-3' [配列番号：６１]
である。
【００８３】
酵母ＵＲＡ遺伝子のクローニングに用いられるオリゴヌクレオチドは：
URA3-U 5'-gcccagtattcttaacccaaactgca-3' [配列番号：６２]
URA3-L 5'-cttccacccatgtctctttgagcaa-3' [配列番号：６３]
である。
【００８４】
栄養要求性ＹＡＣ配列を検出するのに用いられるオリゴヌクレオチドは：
TRP1 5'-gcccaatagaaagagaacaattgacc-3' [配列番号：６４]
TRP2 5'-acacctccgcttacatcaacacc-3' [配列番号：６５]
LYS1 5'-accaagccagcatctgtatcacc-3' [配列番号：６６]
LYS2 5'-gccaaatccatccacttctcatc-3' [配列番号：６７]
である。
【００８５】
サザンブロット解析用のプローブを作製するのに用いられるオリゴヌクレオチドは：
プローブAPP-seq2-U 5'-tgaatcttggcatttgggcc-3' [配列番号：６８]
プローブAPP-seq2-L 5'-cctgtaacttgccctcatag-3' [配列番号：６９]
プローブAPP-seqA-U 5'-gaaacgagttgaaaggcacag-3' [配列番号：７０]
プローブAPP-seqA-L 5'-tttacccttccatgaagtccc-3' [配列番号：７１]
プローブAPP-seqB-U 5'-ggcttgtaaattaaactctgaagc-3' [配列番号：７２]
プローブAPP-seqB-L 5'-cctcagtggctgttttgagagcat-3' [配列番号：７３]
である。
【００８６】
３．酵母人工染色体の修飾
３．１ 真核細胞
酵母において実施した総ての試験はＳ．セレビシエ ＡＢ１３８０株において実施し、その代謝特性は：Ｍａｔａ、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１、ａｄｅ２−１、ｌｙｓ２−１、ｈｉｓ５およびｃａｎ１−１００であった。使用したオリジナルクローンは、Washington Universityで購入し(Human Yeast Artificial chromosome Clone)、そのクローンはＹＡＣ Ｂ１４２Ｆ９を含むものであった（完全ヒトＡＰＰ遺伝子を含む６５０ＫｂのＹＡＣ）。
【００８７】
ＹＡＣ担体酵母は、時々起こるＹＡＣ消失を防ぐために独立栄養セレクター(autotrophic selectors)を加えた液体および固体培地で増殖させた。液体培養物を３０℃で２〜３日間、攪拌しながら（２００ｒ．ｐ．ｍ．）増殖させ、一方、酵母を３０℃で４〜５日間増殖させて、プレートでコロニーを得た。
【００８８】
選択培地はＤ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ(Merck)、ＹＮＢ(Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids)(Difco)および対応アミノ酸(Serva)を加えて調製した。
【００８９】
３．２ 酵母における相同組換え
酵母細胞の形質転換を２つの方法により実施し、それらの方法ではそれぞれ非常に異なる結果を生じた：酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）法(Markie, D. (1995). YAC Protocols_[Please complete the reference]; Alison, A. G., D; Kaiser, C; Stearns, T (1997). Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press.)および酵母細胞エレクトロポレーション(Becker, D. M. and L. Guarente (1991). "High-efficiency transformation of yeast by electroporation." Methods Enzymol 194: 182-7)。
【００９０】
３．３ ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（サザンブロット）を利用した解析
サザンブロット技術を利用して陽性クローンの解析を実施した。２〜４μｇ間のゲノムＤＮＡを、４ｍＭスペルミジンを含む１ｘ消化バッファー中４０〜６０Ｕの対応酵素［Ｅｃｏ ＲＶ、Ｓｃａ Ｉ、Ｂｇｌ II、Ｂａｍ ＨＩ、Ｈｉｎｄ III、Ｓａｌ ＩおよびＥｃｏ ＲＩ］で消化した。その消化物を酵素切断温度で１２〜１４時間インキュベートした。それらの消化産物を水平型Ｈｏｒｉｚｏｎセル（２０ｘ２５ｃｍ）(Life Technologies)内で０．８％アガロースゲルにおいて電気泳動により分離した。
【００９１】
キャピラリーを用いてＤＮＡをHybond（商標）−Ｎナイロン膜(Amersham)に転写した。そのためには、ＳＳＣ ２０Ｘトランスファーバッファー［３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム］中で１４〜１６時間を要した。ゲルは、ＤＮＡの脱プリン化のための０．２５Ｎ ＨＣｌでの洗浄、そしてＤＮＡの中和および変性のための０．４Ｍでの１５分洗浄２回を行って予め処理した。
【００９２】
一度、ＤＮＡが膜に転写されたら、ＣＬ−１０００ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ(UVP-Stratagen)を用いて紫外線照射により、パルス７０，０００ｍＪ／ｃｍ２を２回与えてそれを固定した。
【００９３】
酵素制限によりまたはＰＣＲを用いて単一コピープローブを得、５０ｎｇのＤＮＡ、２５μＣｉのα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ(Amersham)およびＨｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ｋｉｔ(Roche)を会社の使用説明書に従って用いて放射能標識した。標識プローブから遊離ヌクレオチドを除去するために、かかるプローブをＰｒｏｂｅ Ｑｕａｎｔ Ｇ５０カラム(Amersham)に通して精製した。プローブの活性をＷ １４１４シンチレーションカウンター(Beckmann)で定量し、およそ１ｘ１０６ｃｐｍ／μｌの活性を得た。
【００９４】
ハイブリダイゼーションを行い、膜を対応するプローブ（配列番号６８、配列番号６９、配列番号７２および配列番号７３）とともに６５℃で１４〜１６時間インキュベートした。
【００９５】
ハイブリダイズされたフィルターを、増感スクリーン(Miersham)と写真用フィルム(X-Omat, Kodak)の入った露光カセット内で−８０℃で数日間露光した。あるいは、フィルターをＰｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒのカセット(Molecular Dynamics)内で室温で１〜２日間露光し、そのシグナルをＩＱＭａｃ ｖ １．２プログラム(Molecular Dynamics)を用いて解析した。
【００９６】
３．４ 酵母細胞を含むアガロースブロックの小規模調製
ＹＡＣの修飾を解析するために、全細胞を含むアガロースブロックを調製し、そうすることによって、染色体を無傷のまま保つこと、そして染色体によって受けるサイズ変化をパルスフィールド電気泳動を利用して確認できることを実現した。次のプロトコールに従った：
【００９７】
１０ｍｌの選択培地に、解析する酵母クローンを接種し、それを３０℃で攪拌しながら（２００ｒ．ｐ．ｍ．）飽和まで増殖させた。その培養物を３，０００ｒ．ｐ．ｍにて室温で５分間遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿物を１０ｍｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８中に再懸濁し、再度３，０００ｒ．ｐ．ｍにて室温で５分間遠心分離した。この際、その沈殿物を３００μｌの溶液Ｉ（１Ｍソルビトール、２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、１４ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび２ｍｇ／ｍｌのｚｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔ）中に再懸濁し、４０℃に温度調整した。一度、温度調整したら、１０ｍｇ／ｍｌのｚｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔ溶液５０μｌを加え、その後、４０℃に温度調整した５００μｌの溶液II（２％のアガロースを含有する溶液Ｉ、Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ）を加えた。それを、先端を切った青色チップをつけたピペットを用いて混合し、それを、先端を切った黄色チップをつけた２００μｌピペットを用いて型に分配した。各型には８０μｌを加えた。アガロースが固化し得るようにそれらを氷中で１０分間インキュベートし、一度固化したら、それらのキューブをまた、４ｍｌの溶液III（１Ｍソルビトール、２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１４ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび２ｍｇ／ｍｌのｚｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔ）を入れた１０ｍｌチューブに移し、３７℃で１〜３時間、ゆっくりと攪拌しながらインキュベートした。その後、溶液IIIを５ｍｌの溶液ＩＶ（１％ラウリル硫酸塩、１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８）と交換し、それを再度３７℃で１時間インキュベートした。続いて、溶液ＩＶを新しい溶液と置き換え、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、キューブを５ｍｌの２０％ＮＤＳ（０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ、３４ｍＭ Ｎ−ラウリルサルコシン、ｐＨ９）で室温で２時間洗浄し、それらを新しい溶液と交換した。それらは４℃で保存し得る。
【００９８】
３．５ パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）
総てのゲルを０．５ｘＴＢＥバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．３）中１％のアガロース ＬＭＰ Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅに調製した。パルスフィールド電気泳動システムは、Ｇｅｎｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ(Amersham)のものであった。酵母マーカー ＰＦＧＥマーカーII(Roche)を分子量マーカーとして使用し、それらのマーカーはＳ．セレビシエ ＹＰＨ ７５５のアガロースキューブに対応する（染色体 ９０ｋｂ、２２０ｋｂ、２８０ｋｂ、３６０ｋｂ、４５０ｋｂ、５６０ｋｂ、６１０ｋｂ、７００ｋｂ、７７０ｋｂ、８１０ｋｂ、８５０ｋｂ、９２０ｋｂ、９６０ｋｂ、１，０１０ｋｂ、１，１００ｋｂ、１，６００ｋｂおよび２，２００ｋｂ）。
【００９９】
最初のＹＡＣはもともとサイズがおよそ６５０ｋｂであったが、修飾後の最終的なサイズは５２０ｋｂであった。そのため、実施した総てのパルスフィールド電気泳動ではこのサイズの染色体を最適に分離するプログラムを使用した。このプログラムは２００Ｖで２６時間続き：最初の１２時間は５０秒のパルス、残る１４時間は１００秒のパルスであった。一度、ゲルが泳動し終えたら、それを臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）（０．５μｇ／ｍｌ）を含む電気泳動バッファー１〜２ｌ中で３０分間染色した。
【０１００】
得られたＹＡＣを解析するために、染色体をHybond（商標）−Ｎナイロン膜(Amersham)に転写して、解析した。転写は、いくつかのわずかな違いを除いて、サザンブロットに関してすでに記載した転写と同様に行った：大型ＤＮＡ分子を破壊するために、転写の前にゲルを紫外線（２５４ｎｍ）での５分の処置に供した。続いて、それらのそれぞれを０．２５Ｎ ＨＣＬとともに２０分間で２回、次いで、０．４Ｍ ＮａＯＨとともに３０分間で１回インキュベートした。キャピラリーによる転写状態を少なくとも４８時間保った。固定とハイブリダイゼーションの両方を、第（３．３）節ですでに記載したとおりに行った。
【０１０１】
４．マイクロインジェクションのためのＹＡＣの調製
４．１ 酵母細胞を含むアガロースブロックの大規模調製
十分な量のＤＮＡを単離し、本発明のトランスジェニックマウスを作製するために、高細胞密度のアガロースキューブを調製した。そのためには、次のプロセスに従った：
【０１０２】
２００ｍｌの選択培地に、ＹＡＣを有する酵母を接種して、飽和まで増殖させた。それを６００ｇにて５分間遠心分離し、残留培地を除去した。それを、オリジナル培養物１００ｍｌにつき４０ｍｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）中に再懸濁し、それを再度遠心分離し、上清を廃棄した。酵母沈殿物の重量を測定し、密度１と仮定すれば、酵母を体積５０％として溶液Ｉを加え、その混合物を３７℃に温度調整した。一度、温度調整したら（約３０秒）、同じ量の溶液IIを加え、それをゆっくりと攪拌し、４℃で冷却されていた型に８０μｌを分配した。それを１０分間ゲル化させた。それらのキューブを、１ｍｌのキューブにつき８ｍｌの溶液IIIを入れたチューブに入れかえ、それを３７℃で２時間、攪拌しながらインキュベートした。溶液IIIを同量の溶液ＩＶと置き換え、それを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、それを新しい溶液と置き換える必要があり、それを３７℃で一晩放置した。翌日、それらのキューブを、１ｍｌのキューブにつき８ｍｌの２０％ＮＤＳで室温で２時間洗浄した。洗浄を繰り返し、それらをロードする準備ができた。
【０１０３】
４．２ パルス磁場を利用したＹＡＣの精製
この場合の精製産物はトランスジェニックマウスを作製するのに直接使用されることから、ＹＡＣの精製のためのパルス磁場の調製では一連の検討が必要であった。常に滅菌済みの使い捨て材料を使用して、高度無菌操作条件を用いた；ＥｔＢｒは高い突然変異誘発能力を有するため、ＤＮＡが抽出されるゲルの領域がＥｔＢｒと接触しないようにし、ＹＡＣを含む任意の溶液を、滅菌チップをつけてピペットで取った。滅菌チップは先端で切り、ＤＮＡ分子の破損を防いだ。
【０１０４】
９つのキューブが入るように、パルス磁場の７つの通常のウェルを合わせることによって大型ウェルを調製した。マーカーIIおよび１／２、１／４、１／８および１／１６キューブ画分を連続したウェルにロードした。
【０１０５】
このサイズ範囲での分離のために選択したプログラム（２００ボルトにおいて２６時間；最初の１２時間は５０秒のパルス、残る時間は１００秒のパルス）を用いてゲルを泳動した。
一度、ゲルを泳動したら、そのゲルを、ゲルの泳動方向に滅菌メスで３つに切り、それによって大型ウェル全体を含む中央の部分と、画分およびマーカーを含む両側の部分とを作った。これらの２つの部分はＥｔＢｒ（０．５μｇ／ｍｌ）で染色し、一方、中央の部分は泳動バッファー中に保った。染色された部分を用いて、染色されなかった断片において修飾ＹＡＣを位置づけた。一度、そのＹＡＣが位置づけられたら、それを含むアガロースブロックを切り取り、５０ｍｌの平衡バッファー（１０ｎＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３ｍＭスペルミンおよび０．０７ｍＭスペルミジン）中で４℃で少なくとも１６時間平衡化した。次に、修飾ＹＡＣを含むアガロースブロックを４つに分け、それらを１．５ｍｌチューブに移し、７０℃で１０分間加熱し、続いて、４５℃に温度調整することにより液化して、アガラーゼ（GELase（商標） Epicentre）、１００ｍｇのアガロースにつき５単位を加え、それを４５℃で３時間インキュベートした。溶けたアガロースを、次に、Millipore社製超遠心分離用カラム（Ultra free-（登録商標）MC Millipore）に移し、連続した６，０００ｒ．ｐ．ｍにて２分間の遠心分離により総てのＤＮＡをカラム内に濃縮した。この操作を最終量１００μｌが得られるまで繰り返し、ＤＮＡが再懸濁するように、カラムを一晩４℃で放置した。続いて、４０ｍｌのマイクロインジェクションバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３ｍＭスペルミン、０．０７ｍＭスペルミジンおよび滅菌水）を入れたペトリ皿に透析フィルター(Millipore)を入れ、それを２または３時間透析させた。この後、修飾ＹＡＣを含む液を回収した。
【０１０６】
５．卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）（精子はＹＡＣ ＤＮＡとともにインキュベートされる）を利用したトランスジェニックマウスの作製
修飾ＹＡＣを含むトランスジェニックマウスの作製は、特許出願ＷＯ２００５／０９８０１０ならびにMoreira, 2003 (Moreira, P. N., et al., 2003, "Mouse ICSI with frozen-thawed sperm: the impact of sperm freezing procedure and sperm donor strain", Mol Reprod Dev. 66(1) : 98-103)およびMoreira, 2004 (Moreira, P. N., et al., 2004, "Efficient generation of transgenic mice with yeast artificial chromosomes by intracytoplasmic sperm injection", Biol Reprod. 71(6) : 1943-7)に詳細に記載されているプロトコールに従って行った。
【０１０７】
６．創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）マウスおよびそれらの子孫の解析
６．１ ＰＣＲを利用した創始マウスの解析
ＰＣＲ技術は、高度に特異的であり、トランスジーンの同定について最速のものであるという事実から、トランスジーンの解析を実施するためにこの技術を選択した。このマウスを研究するために、ＡＰＰ遺伝子の異なるエキソンについての１７のＰＣＲと、ＹＡＣアームについての２つのＰＣＲと、非遺伝子コード領域についてのさらに４つのＰＣＲとを設計した。上記（１．３）のプロトコールに従って、生まれた総てのマウスについての２３のＰＣＲを行い、総てのＰＣＲについて陽性であるものだけが全トランスジーンの担体マウス（ｃａｒｒｉｅｒ ｍｉｃｅ）と考えられた。
【０１０８】
６．２ 生殖細胞系への伝達
トランスジーンの担体と考えられるマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させ、それらの子孫を解析した。伝達の解析は、２つのＹＡＣアーム（ＬＹＳ２およびＴＲＰ１）についてのＰＣＲと、ＡＰＰ遺伝子の２つのエキソン（エキソン６および１１）についてのＰＣＲとを利用して実施した。
【０１０９】
７．タンパク質の特性評価
７．１ タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。
【０１１０】
７．２ ＳＤＳの存在下でのポリアクリルアミドゲル中でのタンパク質の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
３％濃縮ゲルと、解析するタンパク質の分子量に従って様々なパーセンテージ（７．５％、８％、１０％または１５％）の分離ポリアクリルアミドゲルとを使用した。サンプルバッファーとして２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．３、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノールおよび０．０１％ブロモフェノールブルーを使用した。
【０１１１】
分子量標準としてAmershamm Pharmacia社製の高分子量Rainbow（商標）カラー分子量標準（２２０ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、６６ｋＤａ、４６ｋＤａ、３０ｋＤａ、２１．５ｋＤａおよび１４．３ｋＤａ）を使用した。
【０１１２】
７．３ ウエスタンブロット
簡潔には、上記節に記載のように、ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルで決定されたタンパク質を、セミドライ式電気泳動転写法を用いて、孔径０．４５μｍのニトロセルロースフィルター(Bio-Rad)に電流量１．３ｍＡ／ｃｍ２で９０分間転写した。
【０１１３】
ポンソーＳレッドでの染色を利用して、転写されたタンパク質を観察した後、非特異的結合をブロックするために、その膜を３％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で４℃で一晩飽和させた。
【０１１４】
次いで、それらの膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）および１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した異なる特異的抗体とともに室温で２時間インキュベートした。それらの膜をＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：５０，０００希釈したペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに室温で２時間インキュベートした。最後に、発現させるために化学発光法（この方法ではペルオキシダーゼがＨ２Ｏ２の存在下でルミナル試薬(the luminal reagent)の酸化を触媒する）を用いた（Amersham社の「ＥＣＬ」）。
【０１１５】
それらのバンドを濃度測定（ＧＳ−７１０ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ、Bio-Rad）を用いて定量した。
【０１１６】
７．４ 抗体
６Ｅ１０．６Ｅ１０はヒトＡβ配列の残基１〜１７を認識する精製マウスモノクローナル抗体(Signet)である。６Ｅ１０は電気泳動後の終濃度５μｇ／ｍｌでの免疫標識に使用された。
【０１１７】
抗α−チュブリン：抗α−チュブリン（クローンＢ−５−１−２）はチュブリンのアイソフォームαのＣ末端エピトープを認識するマウスモノクローナル抗体(Sigma)である。抗α−チュブリンは電気泳動後の終濃度１：１０，０００での免疫標識に使用された。
【０１１８】
ビオチン結合抗マウス．ウマにおいて作製された精製抗体；ビオチン結合抗マウスはVector Laboratoriesから入手した。
【０１１９】
８．異なる組織におけるトランスジーン発現の解析
８．１ 全ＲＮＡの単離
異なるマウス組織サンプルを機械的破壊によりホモジナイズし、全ＲＮＡを、市販の「Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」 ｋｉｔ(Roche diagnostic １ ８２８ ６６５)を製造業者によって示されるプロトコールに従って用いて抽出した。得られたＲＮＡの量の評価はＮａｎｏｄｒｏｐ装置（NanoDrop. ＮＤ−１０００分光光度計）によって実施した。
【０１２０】
８．２ レトロ転写(retrotranscription)によるＲＮＡからＤＮＡへの移行
レトロ転写は「Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ」(Applied Biosystem)を用いて行い、ＲＮＡサンプル各１μｇに対して、４単位の逆転写酵素「ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、特異的バッファーを使用し、ランダムヘキサマーを製造業者によって示される条件の指標として最終量１００μｌで使用した。反応混合物を入れたチューブをＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ２４００または９６００サーマルサイクラー(Perkin-Elmer)により次の温度サイクルに供した：
−２５℃で１０分間のプレインキュベーション
−３７℃で１２０分間のインキュベーション。
【０１２１】
８．３ ３８４−ウェルプレートでの定量ＰＣＲ
調製した総ての組織サンプルについて定量ＰＣＲを行い、それらを三連でアッセイし、その場合、５０ｎｇのオリジナルＲＮＡに相当する５μｌのｃＤＮＡを、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ｎｏ． ＡｍｐＥｒａｓｅ Ｕｎｇ(Applied Biosystem)によって記載された一般的な条件を用いて使用した。用いたプローブは：ヒトＡＰＰ遺伝子、ｏｎＤｅｍａｎｄ ｈＡＰＰ Ｈｓ００１６９０９８＿ｍｌ ａｓｓａｙ；ネズミＡＰＰ遺伝子、ｏｎＤｅｍａｎｄ ｍＡＰＰ Ｍｎ００４３１８２７＿ｍｌ ａｓｓａｙ；および内部対照遺伝子（ハウスキーピング）ｇａｐｄｈ、ｏｎＤｅｍａｎｄ Ｍｎ９９９９９９１５＿ｇ１ ａｓｓａｙであった。
【０１２２】
サンプルと反応混合物とを入れたプレートを、リアルタイムでのサンプルの解析を可能にするＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ(Applied Biosystem)を用いて、製造業者によって指定される温度サイクルに供した。得られたデータはＳＤＳ ２．１ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭプログラム(Applied Biosystem)を用いて解析した。
【０１２３】
９．光学顕微鏡での観察：アミロイド斑の検出
組織学的研究のためのサンプルを得る前に、マウスを潅流に供し、続いて、その動物を解剖し、脳を摘出した。
【０１２４】
Ｃｏｎｄｏ ｒｅｄ染色を、Ａｃｃｕｓｔａｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｓｔａｉｎ ｋｉｔ（コンゴレッド．Sigma diagnostic）を製造業者によって推奨されるプロトコールを用いて使用して行った。アミロイドの染色は赤色またはピンクがかった赤色で観察することができ、細胞核は青色、弾性繊維は明るい赤色である。サンプルを複屈折検査すると、それらは緑黄色で観察することができる。
【０１２５】
結果
ヒトＡＰＰ遺伝子を内因的に発現するトランスジェニックマウスの作製については、次の工程を通じて開発された：第一に、ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９およびその近接領域のコンピューター研究を実施する工程、次に、未知の配列またはＹＡＣに存在する他の遺伝子に対応する配列を削除する工程、修飾ＹＡＣを得る工程、続いて、全修飾ＹＡＣ構築物の組込みを達成するために遺伝子導入を実施する工程、それが確実に次の世代に伝達されるようにする工程、最後に、マウス組織におけるトランスジーン発現およびそのレベルを確認する工程。
【０１２６】
１．ＡＰＰ遺伝子およびその環境についてのコンピューター解析
ヒトＡＰＰ遺伝子は２１ｑ２１．３領域の第２１染色体に位置し、５’ではＣＹＹＲ１遺伝子に隣接され、３’ではＧＡＢＰＡおよびＡＴＰ５Ｊ遺伝子に隣接される（図２）。この全領域の配列はＥＮＳＥＭＢＬデータベース(http://www.ensembl.org/)から入手した。このデータベースでは、ヒト配列の他に、ハツカネズミ配列などの異なる生物の配列も入手可能である。ＡＰＰ遺伝子のハツカネズミにおけるホルトロゴウス領域(the hortologous region)は染色体１６ｃ３．３に位置し、ヒトの場合と同じ遺伝子に隣接され（図２）、このことはその配列が完全に保存されるという推測につながる。
【０１２７】
ヒトＡＰＰ遺伝子配列およびその環境を、相同性マトリックスを用いてネズミ遺伝子のものと比較している（図３）。両種間の１ＭｂのＤＮＡ配列をＭａｃＶｅｃｔｏｒ ７．１プログラム(Accelrys, Burlington, MA, USA)を用いて比較すると、ＡＰＰ遺伝子のプロモーター領域のような、コード領域をコードする領域は高度の相同性を示すことが認められる。近接領域に関しては、ＡＰＰ遺伝子の５’領域ではコード領域より観察される保存は少ないが、ゲノム構造は維持され、一方、その遺伝子の３’領域では、その約６０ｋｂにおいて、ヒト領域に関連したネズミ領域で一連の再配列が起こっている。この特定のゲノム構造は、ＹＡＣを修飾するのに用いる領域を定義するのに理想的であり、その境界を５’ではＳｅｑ２配列に相当する領域まで、そして３’ではＧＡＢＰＡ遺伝子のコード領域の開始点までに定める［図１］。
【０１２８】
２．異なるベクターにおける組換えおよびクローニングのための相同配列の選択
２．１ 反復領域の研究
酵母の相同組換えに用いる配列を選択するときには２つの条件が重要であると考えられている：一方では、サイズ、そしてもう一方では、その特異な状況。選択する配列のサイズに関しては、１〜２ｋｂ間であることが好適であると通常考えられる。その特異な状況に関しては、その適合性は、組換えが所望の場所で起こるという事実による。反復配列を位置づけ、それらを避けるために、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラム(A. F. A. Smith & P. Green, 未公開; http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/repeatmasker/)を用いて、１メガベースのＡＰＰ遺伝子環境を解析した。反復配列を排除しておいたこの配列においてＡＰＰ遺伝子の３’および５’の両方における１〜２ｋｂの領域を選択し、ＰＣＲによってクローニングし、酵母における相同組換えに用いた（図４）。
【０１２９】
２．２ 組換え配列のクローニング
ＡＰＰ遺伝子を含むＹＡＣ（ｂ１４２ｆ９）の異なるＰＣＲを、第２節に記載のオリゴヌクレオチドを用いて行った（図４）。ＹＡＣの伸長はこれらのＰＣＲにより確認し、ＡＰＰ遺伝子の５’領域において配列２（ｓｅｑｕｅｎｃｅ２）と配列３（ｓｅｑｕｅｎｃｅ３）の間に位置しており、配列ＡおよびＢ（ｓｅｑｕｅｎｃｅＡおよびＢ）はＡＰＰ遺伝子の３’領域においてＧＡＢＰＡ遺伝子の前に位置していた。配列２は、ＹＡＣ中にある、遺伝子転写開始部位から１２８，３５４ｋｂのところに位置する、ＡＰＰ遺伝子から最も離れた５’における配列であることから、この配列を５’での相同組換えに使用した。３’における領域では、配列ＡおよびＢがＡＰＰ遺伝子の末端からそれぞれ１００ｋｂおよび８０ｋｂの距離のところに位置し、ＧＡＢＰＡ遺伝子の開始点の前にあることから、配列ＡおよびＢの両方をクローニングした。クローニングでは、配列２、ＡおよびＢのＰＣＲを行い（図５）、選択した配列に対応するバンドを精製し、ＰＣＲIIクローニングベクター(Invitrogen)にクローニングして、ＰＣＲII−Ｓｅｑ２、ＰＣＲII−ＳｅｑＡおよびＰＣＲII−ＳｅｑＢを得た。
【０１３０】
２．３ 組換えベクター ｐＢ１Ｒ−Ｓｅｑ２の作製
図６に図式に示すように、プラスミド ＰＣＲII−Ｓｅｑ２およびプラスミド ｐＢ１Ｒの変異体を用いて、プラスミド ｐＢ１Ｒ−Ｓｅｑ２を作製した(Lewis, B. C, N. P. Shah, B. S. Braun and C. T. Denny (1992). "Creation of a yeast artificial chromosome fragmentation vector based on lysine-2." Genet Anal Tech Appl 9(3): 86-90)。このＹＡＣが一度修飾を受けたら、必要に応じて他のタイプの培養に使用できるように、オリジナルプラスミド ｐＢ１Ｒにネオマイシン選択遺伝子を加えた。クローニングベクターの配列２、ＰＣＲII Ｓｅｑ２を、ＥｃｏＲＩ酵素での消化により抽出した。
【０１３１】
この断片の末端を、それらのその後のクローニングのためにクレノウ酵素を用いて平滑末端にした。ベクター ｐＢ１Ｒ−ＮｅｏをＳａｃＩ酵素での消化により線状化した。Ｔ４リガーゼを用いて、Ｓｅｑ２断片をベクター ｐＢ１Ｒ−Ｎｅｏと結合し、後に酵素消化によりベクターにおけるその配列の正確な方向性を確認した。前記ベクターを酵母における第１回目の相同組換えに使用することができるように、そのベクターをＳａｌＩおよびＳａｃＩ酵素での消化により線状化した（図６）。
【０１３２】
２．４．組換えベクター ｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＡおよびｐＹＡＣ４ ３’−ｓｅｑＢの作製
これら２つの組換えベクターの作製を図７に要約している（２配列についてクローニングを並行して実施した）。組換え配列をプラスミド ＰＣＲII−ＳｅｑＡおよびＰＣＲII−ｓｅｑＢから得た。抽出では、それらを最初にＸｈｏＩ酵素で消化し、末端をクレノウ酵素で平滑末端にし、続いて、それらの配列が平滑末端とさらに付着末端を有するようにそれらをＢａｍＨＩで消化した。プラスミド ｐＹＡＣ４ ３’はチロシナーゼ遺伝子の調節配列を研究するために研究室で作製されたｐＹＡＣ４の誘導体である(Burke, D. T., G. F. Carle and M. V. Olson (1992). "Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors. 1987." Biotechnology 24: 172-8、およびBurke, D. T. and M. V. Olson (1991). "Preparation of clone libraries in yeast artificial-chromosome vectors." Methods Enzymol 194: 251-70)。配列ＡおよびＢを、ベクター ｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＡおよびｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＢが生成する配向方法で結合し得るように、消化を利用して、最初にＥｃｏＲＩを用いて、それらの末端を再び平滑末端にし、後にＢａｍＨＩで消化して、目的のものではない領域を削除し、そのベクターを線状化した。
【０１３３】
しかしながら、これらのベクターを第２回目の相同組換えに使用するためには、新規栄養要求性マーカーの存在が必要であった。そのために、最初にＮｏｔＩでの消化によってベクター ｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＡおよびｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＢを線状化して（この場合もクレノウ酵素を用いて、それらの末端を平滑末端にした）、プラスミド ＹＤｐ−ＵのＵＲＡ３マーカーをクローニングし(Alani, E., L. Cao and N. Kleckner (1987). "A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains." Genetics 116(4): 541-5)、続いてＢａｍＨＩでの消化によってプラスミド ＹＤｐ−ＵのＵＲＡ３遺伝子を得た、正確なクローニングのためにその末端も平滑末端にした。Ｔ４リガーゼを用いて、その断片をベクターにクローニングした。ＹＡＣの第２回目の組換えにそれらを正しく使用するためのベクター ｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＡ ＵＲＡ３およびｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＢ ＵＲＡ３の線状化を、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩでの酵素消化によって行った（図７）。
【０１３４】
３．ＹＡＣの５’領域における相同組換え
本発明では染色体断片化プロセスを５’および３’領域を修飾するために用いた；このプロセスはオリジナルＹＡＣの末端にある２つの領域を削除することからなり、それらの領域うちの一方が３’におけるＧＡＢＰＡ遺伝子を含む領域である。
【０１３５】
３．１ ＡＰＰ遺伝子の５’領域のＹＡＣ ｂ１４２ｆ９における相同組換え
１００〜１，０００ｎｇ間で変化するＤＮＡ量を用いて、ＬｉＡｃ法による酵母の形質転換によって合計４０のコロニーを得た。これらの４０コロニーを、ＰＣＲを利用して解析し、陽性の可能性があるクローンとして３つのクローンを得た。
次に、酵母のエレクトロポレーションでは合計９６のコロニーが生じ、これらのコロニーを、ＰＣＲ技術を利用して解析した。これらの中で陽性の可能性があるクローンとしての正確なパターンを示したものはなかった。
【０１３６】
３．２ ＰＣＲを利用した、相同組換えによって生じるクローンの解析
相同組換えによって得られたクローンの解析を、用いる２つのオリゴヌクレオチドのうちの１つが組換えプラスミド中に位置し（ＹＡＣには存在しない領域内）、一方、もう１つのオリゴヌクレオチドがＹＡＣ組換え領域に近接する領域中に位置することを特徴とするハイブリッドＰＣＲを設計することによって実施した。よって、このＰＣＲでは、組換えが予測される部位で起こった場合にのみ断片を増幅することができる。陽性対照として両方の領域を含む別のベクターを作製した。このＰＣＲについて陽性であったのは、解析した１３６のコロニーのうちの３つのもののみ、１３、１４およびｂ７の番号のついたコロニーであった。
【０１３７】
これらのクローンを用いた解析を、別の３つのＰＣＲを用いることによって行い、これによってそれらについてのより多くの情報を提供することができた。最初の２つのＰＣＲは、ＡＰＰ遺伝子の部分を維持するクローンがそのエキソン６および１１のものであるかどうかを確認するために行った（図８）。用いた３つ目のＰＣＲは組換え領域の５’に位置する配列のものであり、相同組換えが正確であったとすれば陰性となる（図８）。解析した３つのクローンは、図８に示されるように、エキソン６および１１のＰＣＲについて陽性であり、５’領域について陰性であった。
【０１３８】
３．３ パルスフィールド電気泳動を用いることによるＹＡＣの断片化の判定
ＹＡＣにおける正確な相同組換えはそのサイズの減少を伴い、そのことはその電気泳動移動度を調べることにより見ることができる。酵母ゲノムはパルスフィールド電気泳動技術（ＰＦＧＥ）を用いてゲル中で分離することができる。この技術に従って、解析する３つのクローンを、オリジナルクローン、同じ酵母株のクローン（ＹＡＣを全く含まない）および分子量マーカーとともに泳動した。図９ではＥｔＢｒで染色した泳動後のゲルを示している。オリジナルＹＡＣクローンにおいて６８０ｋｂマーカーと５８０ｋｂマーカーとの間に、ＹＡＣを含まない酵母クローンには存在しないバンドが存在することを観察することができる。このバンドは、クローン１３およびＢ７では維持されているように見えるが、一方、クローン１４では消失しているように見える。
【０１３９】
続いて、このゲルをニトロセルロース膜に転写して、ＡＰＰ遺伝子 ｃＤＮＡプローブとのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを行い、これによれば電気泳動移動度の変化が極めて正確に確認される。図９では、クローン１４が、正確な組換え後に予測されるＹＡＣサイズの約５０ｋｂの変化をどのように受けたかを示している。
【０１４０】
３．４ サザンブロット技術を利用した組換え領域の解析
相同組換えによるＹＡＣの断片化は、組換え領域のＤＮＡ配列において一連の修飾をもたらす。組換えクローン配列とオリジナルクローン配列との間の違いについては、サザンブロット技術を利用して解析することができる。ＢａｍＨＩ、ＳｃａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIの消化パターンは２つのクローンで異なっていた。
【０１４１】
加えて、ＡＰＰ遺伝子のオリジナルクローンとクローン１４について実施したサザンブロットにおいてバンドサイズの変化が得られ（図１０）、このことにより組換えが正確な相同部位で起こったことが分かり、ＰＣＲ解析とパルスフィールド電気泳動の両方で得られた結果と合わせて、ＡＰＰ遺伝子の５’領域において組換えが成功したこと、そしてクローン１４を次の組換えのベースとして使用可能なことを示している。
【０１４２】
３．５ クローン１４のコード領域の解析
クローン１４がＡＰＰ遺伝子のコード領域の欠失を受けていないことを確認するために、サザンブロットの比較を実施した。このために、オリジナルＹＡＣと修飾ＹＡＣをＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、続いて、ＡＰＰ遺伝子 ｃＤＮＡとハイブリダイズした。このハイブリダイゼーションでは異なる遺伝子コード領域に対応するバンドのラダーが生じるが、これはオリジナルクローンとクローン１４の両方で同じであるにちがいない。ＭａｃＶｅｃｔｏｒプログラムを使用して、ＢａｍＨＩ酵素での３００ｋｂのＡＰＰ遺伝子の消化パターンを得た。次いで、遺伝子コード領域の任意のものを含む断片を確認した。図１１では、このサザンブロットの理論パターンと、それがオリジナルクローンｂ１４２ｆ９と組換えクローン１４で得られたバンドのラダーと一致していることを示している。オリジナルクローンｂ１４２ｆ９と組換えクローン１４で得られたバンドパターンの保存は、組換え後にコード領域は大きな修飾または再配列を受けなかったということを示している。
【０１４３】
４．ＹＡＣの３’領域における相同組換え
４．１ クローン１４のＹＡＣにおける相同組換え．ＧＡＢＰＡ遺伝子削減
第１回目の組換え後に修飾ＹＡＣにおいてＡＰＰ遺伝子の３’領域における相同組換えを行い、これには形質転換に用いるコンピテント酵母を調製するためにクローン１４を用いることを必要とした。この組換えには２つの異なるベクター、ｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＡ ＵＲＡ３およびｐＹＡＣ４ ３’−ＳｅｑＢ ＵＲＡ３（図７）を用い、これらのベクターは組換え配列が異なるだけのものである。前記配列は２０ｋｂ相互に離れており、遺伝子の末端から８０ｋｂより遠く離れている（図４）。これらの組換え配列を用いることによってＧＡＢＰＡ遺伝子を含む、ＹＡＣの４０〜６０ｋｂを削除した（図１２）。
【０１４４】
ＬｉＡｃ法とエレクトロポレーション法の形質転換効率の違いを考えると、明らかに前者が有利であり（前節の第３．１節参照）、第２回目の形質転換を行うために使用することを決めた。第１回目の組換えとは異なり、ｄｕａｌ ＰＣＲを利用したこの組換えでは２，３１７のコロニーを解析する必要があり、ＡＰＰ遺伝子のエキソン６で行われる第１回目のＰＣＲで陽性を示し、ＧＡＢＰＡ遺伝子で行われる第２回目のＰＣＲでは陰性を示すと、このことによりＧＡＢＰＡ遺伝子に対応する配列が削除されたことが示される。
【０１４５】
解析した２，３１７のコロニーのうちの１，７２０のものは配列Ａに対応し、５９７のものは配列Ｂに対応した。異なるコロニーのＰＣＲ解析後、１７２０のうちの９０のものと、５９７のうちの５のものだけをＰＦＧＥおよびサザンブロットによって解析した。ＰＦＧＥおよびサザンブロットを用いたこれらのクローンの研究により、配列Ａを用いて行われた相同組換えが高い確実性で異なる領域で起こり、その結果、見慣れない組換えパターンをもたらし、いくつかの場合では、組換えＹＡＣが予想をかなり上回る再配列プロセスおよび断片化を受けて、説明することが非常に難しいパターンが生じたことが明らかになった。
【０１４６】
配列Ｂを用いた相同組換えについて解析した５つのクローンは、トランスジェニックマウスの作製に使用するための必要要件を満たすクローンを与えた。このクローンにおいて実施した様々な検証を以下に記載する。
【０１４７】
４．２ ＰＣＲ技術を利用した、３’における組換えによって生じたクローンの解析
酵母形質転換によって得られた異なるクローンの解析を、ｄｕａｌ ＰＣＲを用いて実施した。図１３では、配列Ａを用いた組換えについてのいくつかのクローンと配列Ｂについての５つの陽性のものとにおいて実施したｄｕａｌ ＰＣＲを示している。観察できるように、クローンｂ１０６、ｂ１０８、ｂ１０９、ｂ１１１およびｂ１１３はそれらの後の研究用の候補として反応している。ＡＰＰ遺伝子のエキソン６のＰＣＲではそれらの総てが陽性であり（このことは、それらのクローンはＡＰＰ遺伝子とともにＹＡＣを維持していることを示す）、その一方で、ＧＡＢＰＡ遺伝子のＰＣＲでは陰性である（このことは、これらのクローンはＧＡＢＰＡ遺伝子配列を失った可能性があることを示唆する）。以下に示すように、これら５つのクローンのうちクローンｂ１０６だけが正確な相同組換えパターンを示した。
【０１４８】
ＰＣＲを用いてクローンｂ１０６の研究を行うために、配列ＢとＧＡＢＰＡ遺伝子との間：配列ＡおよびＡ’との間に位置する２つの領域についてのＰＣＲを行った。この研究では、ＧＡＢＰＡ遺伝子とエキソン６のＰＣＲを繰り返し、ＡＰＰ遺伝子のエキソン１１のＰＣＲも含めた。図１４から分かるように、組換え領域に関して３’位置でのＰＣＲで陽性であったものはなく、クローンｂ１０６にはこれらの配列が存在しないことが示された。２つのエキソンのＰＣＲは陽性対照の場合ほど明らかではなく、それらを何度か繰り返したが、常に同じ陽性結果が得られた。
【０１４９】
４．３ ＰＦＧＥを利用したＹＡＣの電気泳動移動度の変化の判定
ＹＡＣの電気泳動移動度は、第１回目の相同組換え後と同じように、この第２回目の組換え後にも変化し、得られるＹＡＣの最終的なサイズは５２０ｋｂである、すなわちＹＡＣを含むクローン１４よりも４０ｋｂ小さい。図１５では、異なるクローンを泳動した１％アガロースゲルを示している：分子量マーカー、オリジナルクローンｂ１４２ｆ９、クローン１４およびクローンｂ１０６。前記ゲルをニトロセルロース膜に転写し、ＡＰＰ遺伝子 ｃＤＮＡとハイブリダイズした。異なるレーンのＹＡＣの観察が得られ、クローンｂ１０６におけるＹＡＣのサイズの変化はオリジナルＹＡＣおよびクローン１４に関して容易に観察された。
【０１５０】
４．４ クローンｂ１０６のＹＡＣとＧＡＢＰＡ遺伝子 ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション
ＹＡＣ ｂ１０６とＧＡＢＰＡ遺伝子 ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを、該ＹＡＣにおいてＧＡＢＰＡ遺伝子のコード領域が削除されたことを確認するために用いた。
【０１５１】
図１５では、前節で用いたパルスフィールドアガロースゲルを示しており、このパルスフィールドアガロースゲルに他のレーンを加え、前記レーンの場合と同じサンプルをこれらのレーンにロードしている。この場合には、ゲルの半分をＡＰＰ遺伝子 ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズし、残りの半分をＧＡＢＰＡ遺伝子 ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。その図から分かるように、クローンｂ１０６のＡＰＰ遺伝子を含むＹＡＣはＧＡＢＰＡ遺伝子配列とはハイブリダイズしないが、一方、オリジナル酵母のＹＡＣ、およびクローン１４のものは同じＹＡＣにおいて両方の遺伝子を有している。
【０１５２】
４．５ サザンブロット技術を利用した３’における組換え領域の解析
組換えベクターがＹＡＣに正確に組み込まれていることを、サザンブロット技術を用いて確認した。図１６に示されるパターンは、オリジナルＹＡＣとクローン１４では共通しているが、一方、クローンｂ１０６は異なった、予測ダイアグラムに従うバンドパターンを有する。ゲルハイブリダイゼーションでは、ＹＡＣ ｂ１０６に対応するバンドは前者のクローンのものとは異なるサイズを有することが分かり、このことは、プローブがハイブリダイズする、組換え配列の周辺領域にあり、後者の５’に位置する領域において、異なるクローン間で配列の違いがあることを明確に示している（図１６）。
【０１５３】
４．６ クローンｂ１０６のコード領域の解析
クローンｂ１０６の妥当性を確認するために、サザンブロットの比較を実施した。クローンｂ１０６のＹＡＣが、コード領域ではなく、ＹＡＣの３’領域で修飾を受けただけならば、３つのＹＡＣ（オリジナルＹＡＣ、クローン１４のＹＡＣおよびクローンｂ１０６のＹＡＣ）は、図１１に示された同じラダーのバンドを有するはずである。実施したサザンブロットを示している図１７を観察すると、３つのクローンのバンドパターンは全く同じであり、そして、それが図１１に示されるものとは明らかに異なるということが分かる。しかしながら、これらの違いは、実際には、より清浄なＤＮＡを、より高い濃度で使用することによって最後のゲルにおいてより良好な分解能が得られたという事実によるものにすぎない。図１７のゲルのバンドパターンを観察すると、いくつかの二重および三重バンドはより明確に見える。
【０１５４】
いずれにせよ、ＡＰＰ遺伝子を含むＹＡＣはクローンｂ１０６において重要なものであった。クローンに用いた同じ命名法を用いて、このＹＡＣに名前を付け、それをＹＡＣ ｂ１０６と呼んだ。
【０１５５】
５．ＹＡＣ Ｂ１０６の精製
本プロセスにより３回の連続したＤＮＡ抽出を実施した。材料および方法の第４．２節に記載のプロトコールに従って実施した３回の精製のうちの１つを示している図１８から分かるように、ＥｔＢｒで染色したゲルのエッジを用いて、ＹＡＣ ｂ１０６の位置を決定し、染まらなかったゲルの部分からＹＡＣ ｂ１０６を抽出した。抽出後にゲルの他の部分を染色することによって、ＹＡＣ ｂ１０６の総てのバンドが採取されたことを確認することができた（図１８）。
【０１５６】
３つの異なる技術によって３回のＤＮＡ抽出を測定した。まず第一に、アガロースゲルでの評価と既知量の参照ＹＡＣとの比較を利用する。得られた結果を、蛍光光度計とｎａｎｏｄｒｏｐを使用することによって調べた。その結果、抽出Ｉ、IIおよびIIIで得られた濃度はそれぞれ４ｎｇ／μｌ、７．１ｎｇ／μｌおよび１０ｎｇ／μｌであった。
【０１５７】
６．卵細胞質内精子注入法を介した遺伝子導入（精子はＹＡＣ ｂ１０６とともにインキュベートされる）
遺伝子導入を実施するために、異なるマイクロインジェクションセッションを実施し、プロセスが終わった後に生まれた合計１０２匹の動物を得た。遺伝子導入に用いた卵母細胞のドナーマウス系はＣＤ１とＣ５７ＢＬ／６Ｊとの混合系であり、それによって純系を使用するよりも高い効率が得られる。創始マウスが生まれてくるときに、それらが７５％Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝的背景を有するように、用いた精子はＣ５７ＢＬ／６Ｊ系のものである。
【０１５８】
７．創始マウスの解析
ＰＣＲ技術を用いて、細胞質注入後に得られた１０２匹のマウスの解析を実施した。５２０Ｋｂのトランスジーンの挿入を正確に確認する手段として総てのＹＡＣ領域に対してスキャンを実施した。この目的のために次のＰＣＲを設計した：ＡＰＰ遺伝子のエキソンについての１７のＰＣＲ（それらのうちの１つはエキソン１２とエキソン１３の両方を含む）と、ＹＡＣの２つのアームについての２つのＰＣＲ（ＬＹＳ２遺伝子の選択遺伝子およびＴＲＰ１のものの両方に関する）と、コード領域とＹＡＣのアームとの間に位置する配列についてのさらに４つのＰＣＲ（図１９）。
【０１５９】
得られた１０２匹のマウスについての２３のＰＣＲを行った（図２０）。それらのうちの１７においてある程度の遺伝子導入が得られ、これはそれらがＹＡＣの外因性ＤＮＡを完全にまたは部分的に組み込んだことを意味する。このＤＮＡの組込みは、１５のケースで起こったように、部分的なものであり得るが、それらのうちの２つ、マウス３５および雌マウス６４においては完全なものであり、ＹＡＣ ｂ１０６に関するこの調査で得られる第１のトランスジェニックマウスが生成したため、その主要目的の１つに適合する。
【０１６０】
８．雑種第一代（Ｆ１）におけるトランスジーンの伝達
２つのトランスジェニック創始マウス、マウス「３５」およびマウス「６４」の作製を確認したので、それらをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させて、それらの子孫へのトランスジーンの伝達を調べ、それらにおけるそのようなトランスジーンの発現を解析した。ＹＡＣ ｂ１０６の伝達を研究するために、それらの子孫で４つのＰＣＲを行った：ＹＡＣのアーム、すなわちＬＹＳ２およびＴＲＰ１遺伝子についての２つのＰＣＲと、ＡＰＰ遺伝子のエキソン６および１１についてのＰＣＲ。この結果、完全ＹＡＣが伝達されたこと、そしてそのためＹＡＣの部分的組込みが起こらなかったことを確認することができた。本明細書の作成まで４１匹のＦ１マウスをマウス３５の子孫について解析し；１８匹のトランスジェニックマウスを確認し、子孫の４４％への伝達がなされていた。雌マウス６４の場合では、３２匹のＦ１子孫を解析して、その子孫中１８匹のトランスジェニックマウスを得、５６％伝達がなされていた。要するに、２つのケースでは、創始マウスの第一代子孫へのトランスジーン伝達指数は、Mendelianのパターンによって予測されるものに一致して約５０％である。図２１では、マウス３５のいくつかの子孫についての例示的なＰＣＲを示している。
【０１６１】
９．トランスジェニックマウスにおけるＹＡＣ ｂ１０６構造の保存
創始マウスを交配することによって得られたトランスジェニックマウスのゲノム研究を、ＹＡＣ ｂ１０６におけるＡＰＰ遺伝子コード領域の構造を確認することにより行い、そのために２つの創始マウスの子孫についてのサザンブロットの比較を実施した。
【０１６２】
図２２では、創始マウス３５および６４のＦ１、すなわち第一代子孫において得られたバンドパターンを示しており、そのバンドパターンは各創始マウスにつき２匹の同腹子（それらの一方のものはトランスジェニックであり、もう一方のものは非トランスジェニックである）に対応している。パターンは図１１で得られたものと同じであることを観察することができ、そのことによりマウスゲノムにおいてトランスジーン構造が保存されていることが示される。
【０１６３】
１０．トランスジェニックマウス系統におけるヒトＡＰＰ遺伝子発現の解析
トランスジェニック系統３５および６４におけるヒトＡＰＰ遺伝子の伝達を立証したら、異なるマウス組織におけるＲＮＡおよびタンパク質両方の発現レベルを特徴づける必要があった。
【０１６４】
この解析には系統３５の第一代に相当するマウスを使用し、合計４匹の２ヶ月齢雄マウスを用いて、それらをそれらの同腹子と比較した。この研究の主な焦点は、ＡＰＰタンパク質の高い発現が起こる組織であることから中枢および末梢神経系であった。異なるマウス体器官における発現もまた解析した、全体的に以下を解析した：脳（皮質、脳室、小脳および中脳と呼ばれる（それらの解剖学的内容と完全に一致する）４つの領域に細分される）；脊髄、肝臓；肺；膵臓；脾臓；小腸；筋肉；精巣；血液；心臓および腎臓。
【０１６５】
１０．１．ＡＰＰ遺伝子メッセンジャーＲＮＡの発現の解析
トランスジェニック系統３５における正確なヒトＡＰＰ遺伝子発現を確認するための第１の工程は、ＲＴ−ＰＣＲを利用して異なるマウス組織におけるヒトＡＰＰ遺伝子の転写を調べることであった。そのためには、異なるマウス組織からメッセンジャーＲＮＡを抽出し、そのＲＮＡの転写レベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを利用して、ヒトＡＰＰ遺伝子に向けられるＴａｑｍａｎプローブを用いて測定した。この試験の内部対照としてネズミＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。この研究を行うために、ネズミＡＰＰ遺伝子ＲＮＡレベルも測定し、それらをＧＡＰＤＨに対して標準化すれば、両方の遺伝子の発現レベルを異なる組織間で比較することができるようにした。
【０１６６】
図２３では、解析した異なる組織で得られたヒトＡＰＰ遺伝子メッセンジャーＲＮＡレベルを示している。発現レベルを相対対数単位で表し、データをＧＡＰＤＨ遺伝子に対して標準化している。この遺伝子は主として神経組織において発現され；その値は、若干低い小脳の場合を除いて、それらの総てにおいてよく似ていることが認められる。他の研究した組織に関しては、精巣、血液、心臓および腎臓で検出可能な発現レベルに達しただけであり、いずれの場合においても、神経系で検出されたものより一桁低い。
【０１６７】
図２４では、トランスジェニックマウスおよびそれらの同腹子に関するヒト遺伝子およびネズミ遺伝子の両方についてのＡＰＰ遺伝子メッセンジャーＲＮＡ発現を示している。前のグラフ同様に、データはネズミＧＡＰＤＨ遺伝子に対して標準化している。示した結果により、神経組織では遺伝子発現レベルが高いが、小脳では低下していることが分かる。他の解析した器官に関しては、肺、精巣、血液、心臓および腎臓などの組織において発現を示しているが、一方、肝臓、膵臓、腸、脾臓および筋肉などの組織ではそのレベルはかなり低くなっており、極めて重要な変化を示している。
【０１６８】
１０．２ タンパク質レベルの解析
マウスにおけるヒトＡＰＰタンパク質の発現によって、マウスにおける正確なＹＡＣ ｂ１０６の転写および翻訳を確認する。タンパク質レベルを、ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動後の免疫標識技術（ウエスタンブロット）を用いて研究した。この研究では、ＡＰＰタンパク質を認識したが、ヒト型とネズミ型とを区別することができない抗体を使用した[Lamb, B. T., et al. (1997). "Altered metabolism of familial Alzheimer's disease-linked amyloid precursor protein variants in yeast artificial chromosome transgenic mice. "Hum Mol Genet 6(9): 1535-41.; Lehman, E. J., et al. (2003). "Genetic background regulates beta-amyloid precursor protein processing and beta-amyloid deposition in the mouse." Hum Mol Genet 12(22): 2949-56]ため、発現レベルを比較することができるように、結果をアクチンに対して標準化する必要がある。
【０１６９】
神経系の異なる組織では免疫反応性が欠如しており、低いＡＰＰ遺伝子発現レベルを示す。図２５では、系統３５および野生マウスの両方に関する代表的なゲルを示し、発現の評価を、アクチンに対して標準化して、下のグラフに示している。そのグラフでは、系統３５が野生マウスの少なくとも２倍の量のタンパク質を有することがはっきりと分かる。この割合はこの研究において解析した異なる脳領域間でわずかに変化するが、その水準を維持している。
【０１７０】
１０．３ マウス脳の組織学的研究
本発明のマウスになければならない特徴の１つは、正確なＡＰＰタンパク質発現およびプロセッシングであるが、その一方で、不正確な発現または誤りのあるプロセッシングの形跡があると、脳においてこのタンパク質（Ａβペプチド）由来のペプチドの蓄積が起こる。この研究を行うために、月齢２ヶ月の２つのマウス系統の脳の切開を行った。これらの切片をコンゴレッドで染色して、アミロイドを検出した。２系統またはそれらの同腹子ではいずれのＡＰＰタンパク質誘導体も蓄積は検出されない（図２６および２７）が、１年齢の対照トランスジェニックマウス（Ｔｇ ２５７６）ではそれらを検出することができる。
【０１７１】
考察
１．酵母の相同組換えによるＹＡＣ ｂ１０６の構築
アルツハイマー病の調査を可能にする、この調査で開発されたトランスジェニックマウスを設計する際に利用できたのは、ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９（ＡＰＰ遺伝子を含むことは分かっているが、場合によってはその後の使用において摂動を導入し得る他の遺伝子も含むかどうかは不明である、６００ｋｂを超えるサイズの人工染色体）だけであった。ヒトゲノム配列が公開され、ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９で実施された他の具体的な研究が発表されたことで、該ＹＡＣ中にはＡＰＰ遺伝子が単独で存在するのではなく、ＧＡＢＰＡ遺伝子が同時に存在することの証明が可能になった。そのため、そのＧＡＢＰＡ遺伝子を削除し、これまでに報告された総てのＡＰＰ遺伝子コード領域および調節領域を尊重して、ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９をその５’および３’領域において修飾する必要が生じる。そのようにして修飾したＹＡＣを、アルツハイマー病に関する調査のためのモデルとして使用することができるトランスジェニックマウスの作製において使用し得るようにするために、このことがこの調査の最初の目標となった。
【０１７２】
５’で行われる相同組換えはＹＡＣの４０ｋｂの削除を伴った（図１２および図９）。それでもなお、この削除後、ＡＰＰ遺伝子の５’領域において１２０ｋｂがまだ保存されており、調査の現状に従ってその正確な発現を可能にするには十分なものであった。実際、ＡＰＰ遺伝子の調節エレメントはその遺伝子の近位プロモーターにおいて報告されているだけであったが、距離が離れている調節エレメントの存在については議論の余地がないと考えられている。そのため、正確な時空間的遺伝子発現を成し遂げるために、進化的に保存されるエレメントを存在させる組換えを実施した［マウス遺伝子のものとの比較ゲノミクスによる配列解析後（図３）］。従って、本調査ではそれを確実にするために端で十分なスペースが保存された。
【０１７３】
ＹＡＣにおける相同組換えによって５’領域の境界を定めた後、染色体断片化によってＧＡＢＰＡ遺伝子を直接削除する第２回目の組換えを実施した。ＧＡＢＰＡ遺伝子は転写因子をコードし、トランスジェニックマウスにおいてそれが発現することによって、トランスジェニック表現型の研究に干渉し得る未知の方法でマウスの正確な開発に影響を及ぼす可能性があり、どの遺伝子が該表現型に関与するのかを確認することができなくなるため、このＹＡＣを動物モデルの作製に用いようとする場合には、その削除は必須である。
【０１７４】
ＡＰＰ遺伝子の３’領域における相同組換えは、５’において実施されるものよりもずっと複雑であるが、これは３’領域に二次ＤＮＡ構造が存在することにより、この構造が組換え配列へのアクセスをより複雑にしている可能性がある。
【０１７５】
第１回目の組換えの場合と同じように、正確な相同組換えとＧＡＢＰＡ遺伝子の削除を正確に確認するために一連の試験を設計した。第１回目のコロニースクリーニングを、ｄｕａｌ ＰＣＲを用いて実施した。この方法は得られた数百ものコロニーを区別すること、そしてこの数を一桁低減することを可能にした。ＧＡＢＰＡ遺伝子を有していなかったがエキソン６は有していたコロニーは適していると考えられるようだが、ＰＦＧＥを利用した後の解析ではいつもそういうわけではないことが分かった。
【０１７６】
この意味で、ＰＦＧＥと、続いての、フィルターのＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡおよびＧＡＢＰＡ遺伝子ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを利用した解析は、中でも最も信頼性の高い最終的な解析であった。これは；実際には、ＹＡＣ ｂ１０６の電気泳動移動度の変化がクローン１４のＹＡＣの断片化によるもののみであり得るためである。ＧＡＢＰＡ遺伝子ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、総ての遺伝子コード領域の認識を可能にするが、一方、ＰＣＲはエキソンの１つを対象にするだけであった。ＹＡＣ ｂ１０６のＧＡＢＰＡ遺伝子をコードする配列の消失についてのハイブリダイゼーションによる確認では、予測される電気泳動移動度の変化とともに、このコロニーが計画された組換えを受けたという確認を必要とした。それでもなお、サザンブロットによる確認および異なるＰＣＲは、研究を行い、その結果、トランスジェニックマウスを作製するためのプロセスに移るために有用であった。
【０１７７】
２．ＩＣＳＩを利用したトランスジェニックマウスの作製
５２０ｋｂのＹＡＣ ｂ１０６を有するトランスジェニックマウスを、ＷＯ２００５／０９８０１０およびMoreira, 2003および2004（上記）に記載のプロセスに従って、ＩＣＳＩを利用して得た。生まれた１０２匹のマウスから、合計１７匹のトランスジェニックマウス、すなわちＹＡＣ ｂ１０６Ｏｆの任意のＤＮＡ断片の担体を得、解析した。
【０１７８】
５２０ｋｂ構築物が完全に組み込まれたことを確認するには、配列全体にわたる入念な解析が必要であり、そのために、各マウスにおいてＹＡＣ全体にわたって２３のＰＣＲを実施した。ＹＡＣの完全組込みを確認するために設計されたＰＣＲ群（図１９）では、マウス３５および６４の場合だけ陽性であり、このことからこれらのマウスを新規動物モデルの候補創始マウスであると特定した。
【０１７９】
しかしながら、創始マウスにおいてトランスジーンが存在するからといって、その後の使用に最も重要な条件である生殖細胞系においてそれが存在することが確実とはならないため、次の世代でその伝達を確認しなければならない。それを調べるために、クローンをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させ、２つのトランスジェニック系統（図２１）から生まれた総ての同腹子をＰＣＲによって解析し、第一代、すなわちＦ１においておよそ５０％の伝達が得られた（結果の第８節）。生殖細胞系におけるトランスジーンの伝達（図２１）ならびにかかるトランスジーンの発現（図２３）を確認することにより、ＹＡＣの組込みを確認するために設計されたＰＣＲ群が適切な手法であったことが証明された。
【０１８０】
３．マウスにおけるヒトＡＰＰ遺伝子の発現
マウスにおけるヒトＡＰＰ遺伝子の発現を特徴づけるための第１の工程を、遺伝子ＲＮＡ発現を解析することによって実施した。そのためには、定量プレートＰＣＲ技術を用いて、異なる組織間のそのレベルを比較した。既存の参照によれば、この遺伝子の発現はいくつかの組織において起こるが、これらレベルは脳において高い。実際には、図２３から分かるように、系統３５の発現レベルは、解析した異なる領域中で脳において最も高い値を示している。脊髄で表れた高い遺伝子発現指数を強調する必要があるが、脊髄はこのタンパク質を産生する細胞系統が存在する神経組織によって形成されていることから、このデータは当然のことである。よって、マウスにおけるヒトＡＰＰ遺伝子の発現に関するこの調査の結果は、脳においてＲＮＡが最高発現レベルにあるという、同様のマウスに関してこれまでに報告されているものと十分に一致している。
【０１８１】
異なる器官におけるヒトＡＰＰ遺伝子の発現はネズミＡＰＰ遺伝子の発現と非常に似ており（図２４）、神経組織だけでなく、心臓、血液、精巣および腎臓においても発現パターンが保存されている。しかしながら、ネズミＡＰＰ遺伝子発現は、肝臓、肺、膵臓、腸および筋肉で検出され、心臓、血液、精巣および腎臓のものと同様の発現が起こっている肺の場合を除いて、他の器官よりもずっと低い値である（一桁低い(one order or magnitude lower)）が、ヒトＡＰＰ遺伝子ではそのようなことは起こらず、すでに指摘したようにその発現はそれらの器官では検出されなかった。
【０１８２】
一度、異なるマウス組織において遺伝子発現が確認されたら、そのＲＮＡのタンパク質への翻訳を確認する必要があった。この研究のために、ＲＴ−ＰＣＲを用いて解析した異なる組織中に存在するタンパク質の量についてのウエスタンブロット解析を実施した。この研究には、最初はヒトタンパク質に特異的な６Ｅ１０抗体を用いることによって対応していたが、この調査の試験においてその特異性を再現することができなかったため、ヒトタンパク質とネズミタンパク質の両方を認識する２２Ｃ１１抗体を使用する決定をし、その結果、タンパク質の総量を評価することができた。
【０１８３】
神経組織ではタンパク質発現が高いことから、起こり得るかかるタンパク質の同定および評価を行ったが、一方、他の組織では、タンパク質レベルの表示はずっと低く、その同定は不可能であった（図２５）。神経組織におけるタンパク質レベルを評価し、それらをアクチン値に対して標準化した後、トランスジェニックマウスおよびそれらの非トランスジェニック同胞種のタンパク質レベルを比較し、前者の場合に、特定組織に応じて、値が内因性タンパク質のものに対して２〜２．５倍高いことを観察した。これを受けて、皮質、脳室および脊髄では、タンパク質レベルは内因性タンパク質に対して２倍を少し上回っており、一方、中脳および小脳では、比率が上昇し、２．５倍に達していた。トランスジェニックマウスではヒトタンパク質とネズミタンパク質の両方が検出されることを考えなければならないため、総ＡＰＰタンパク質発現が２倍というのは、同量のヒトタンパク質とネズミタンパク質が発現されているということを意味する。２つの遺伝子間でのこれらのような発現差はこれまでに記載されているもの（皮質領域でのみ測定され、内因性遺伝子のものの１．７〜２倍間の発現レベルを示す）より少し大きいが、その違いは使用したマウス系に起因する可能性があり、そのマウス系の遺伝的特徴はそのレベルとそのプロセッシングの両方に影響を及ぼす可能性がある。
【０１８４】
最後に、マウス脳において予備研究を実施し、本疾患の典型的な神経病理学のいくつかの検出を試みた。２ヶ月齢マウスでのこのような予備研究では、現在のところアミロイドペプチドの沈着の兆候は検出されず、これらの特徴を有するマウスでの過去の研究と一致している。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ ３５）におけるＡＰＰ遺伝子の位置を示す図である。ＳｅｑＢ領域は全ＧＡＢＰＡ遺伝子コード領域を排除するが、その３’ＵＴＲ領域内で始まる。
【図２】ＡＰＰ遺伝子の染色体上の位置を示す図である；Ａ．ＥＮＳＥＭＢＬにおいて下方に示した近接遺伝子に隣接する、第２１染色体におけるヒトＡＰＰ遺伝子の位置。Ｂ．ＥＮＳＥＭＢＬにおいて下方に示した隣接遺伝子に隣接する、第１６染色体におけるネズミＡＰＰ遺伝子の位置。
【図３】ヒトおよびネズミＡＰＰ遺伝子配列の相同性マトリックスを示す図である。ヒトＡＰＰ遺伝子を含むヒト第２１染色体配列メガベースを、ネズミＡＰＰ遺伝子も含まれる第１６染色体メガベースと比較する。
【図４】ＡＰＰ遺伝子環境のＰＣＲのダイアグラムを示す。ＰＣＲの位置を利用して、その遺伝子の５’および３’の両方において、その遺伝子コード領域までの最近距離を有するＹＡＣ ｂ１４２ｆ９のサイズの範囲を定める。
【図５】ＰＣＲによるＹＡＣ ｂ１４２ｆ９の伸長の境界を示すダイアグラムを示す。配列Ａ、Ｂ、１および２のＰＣＲに関する１％アガロースゲル。レーン１は分子量マーカーに相当する。各配列に対して、陰性対照、ＹＡＣ、および陽性対照それぞれを示す Ｂ．配列３、４、５および６のＰＣＲに関する１％ゲル。レーン１は分子量マーカーに相当する。各配列に対して、陽性対照、ＹＡＣ、および陰性対照それぞれを示す。
【図６】組換えプラスミド ｐＢ１Ｒ Ｓｅｑ２の作製および線状化において従う工程のダイアグラムを示す。
【図７】組換えプラスミドｐＹＡＣ４ ３’ＳｅｑＡおよびｐＹＡＣ４ ３’ＳｅｑＢの作製および線状化において従う工程のダイアグラムを示す。
【図８】エキソン６および１１ならびに配列２’のＰＣＲを示す図である。ＡＰＰ遺伝子のエキソン６、エキソン１１およびいくつかの解析した酵母クローンの配列２’のＰＣＲ。Ｍ、分子量マーカー；Ｇ、ゲノムＤＮＡ；ｃ＋、陽性対照およびｃ−、陰性対照。
【図９】ＰＦＧＥによる酵母染色体の分離およびＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを示す図である。Ａ．臭化エチジウムで染色したＰＦＧＥ。Ｂ．ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡとハイブリダイズした膜。レーン：Ｍ 分子量マーカー、ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９、ＡＢ１３８０（ＹＡＣフリー酵母）、クローン１３、クローン１４、クローンＢ７。
【図１０】ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９およびクローン１４の５’領域のサザンブロットを示す図である。オリジナルクローンｂ１４２ｆ９（ＡＰＰ）とクローン１４とのサザンブロットバンドパターンの違い。
【図１１】ＹＡＣ ｂ１４２ｆ９およびクローン１４のサザンブロットの比較を示す図である。クローンＢ１４２Ｆ９とクローン１４の両方のＤＮＡをＢａｍ ＨＩ酵素で消化した。アガロースゲルで分離し、ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡとハイブリダイズした。Ｍ、分子量マーカー；ＡＰＰ、クローンＢ１４２Ｆ９；１４、クローン１４。右側、Ｂ．３００ｋｂのＡＰＰ遺伝子をＢａｍ ＨＩで消化した後に得られたバンドパターン、遺伝子コード領域を含む断片には網がけしている。
【図１２】２連続ラウンドの酵母における相同組換えを利用したＹＡＣ ｂ１４２ｆ９の断片化のために提供されるスキームを示す。
【図１３】クローンｂ１０６のｄｕａｌ ＰＣＲ解析を示す図である。ＳｅｑＡおよびＳｅｑＢの両方について、異なるクローンで行ったＰＣＲ。第１回目のＰＣＲはＡＰＰ遺伝子のエキソン６で行い、一方、第２回目のＰＣＲはＧＡＢＰＡ遺伝子で行った。第１回目のＰＣＲに関して陽性であり、第２回目のＰＣＲに関して陰性であるクローンにはアスタリスクをつけて示している。Ｃ＋、陽性対照；Ｃ−、陰性対照。
【図１４】組換え環境のＰＣＲ解析を示す図である。ＰＣＲダイアグラム、陰影マークはＳｅｑＢの場所を示している。Ｂ．ＧＡＢＰＡ遺伝子、ＡＰＰ遺伝子のエキソン１１、エキソン６、ＳｅｑＡ’およびＳｅｑＡのＰＣＲ。各ＰＣＲに対して、陽性対照、クローンｂ１０６および陰性対照に対応する３つのレーンが存在する。
【図１５】ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡとＧＡＢＰＡ遺伝子ｃＤＮＡとを比較したＰＦＧＥについてのハイブリダイゼーションを示す図である。Ａ．臭化エチジウムで染色したＰＦＧＥゲル。１．マーカー。２および５ ｂ１４２ｆ９。３および６ クローン１４。４および７ クローンｂ１０６。Ｂ．レーン１〜４のＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション。レーン５〜７のＧＡＢＰＡ遺伝子ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション。
【図１６】３’における組換えについてのサザンブロットダイアグラムおよびゲルを示す。Ａ．３’における組換えについてのサザンブロットダイアグラム、上部にはオリジナルＹＡＣ、下部には組み換えられたＹＡＣ。Ｒｅｃｏ Ｂの前の陰影四角は使用したプローブの位置を示している。Ｂ．３つのＹＡＣ、ｂ１４２ｆ９（ＡＰＰ）、クローン１４およびクローンｂ１０６のＥｃｏ ＲＩおよびＳｃａ Ｉでの消化についてのサザンブロット。
【図１７】クローンｂ１４２ｆ９、１４およびｂ１０６のサザンブロットの比較を示す図である。Ｂａｍ ＨＩで消化し、ＡＰＰ遺伝子ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズしたＹＡＣ ｂ１４２ｆ９（ＡＰＰ）、クローン１４およびクローンｂ１０６のサザンブロットの比較。３つのＹＡＣ間ではバンドパターンは保存されている。Ｍ、マーカー。
【図１８】ＹＡＣ ｂ１０６の抽出についてのＰＦＧＥを示す図である。ＹＡＣ ｂ１０６に対応するバンドの抽出。ゲルにおけるＹＡＣの位置を決めるためにまずサイドを染色した。ＹＡＣ ｂ１０６に対応するアガロースの一部分が中央部でなくなっている。
【図１９】創始マウスを解析するために用いたＰＣＲのダイアグラムを示す。
【図２０】創始マウスについての代表的なＰＣＲを示す図である。トランスジェニックマウスで行った２３のＰＣＲについてのサンプル、マウス２、１２、３５、３７、４１および４６で行ったものを示している、ｃ− 陰性対照、ｃ＋ 陽性対照。
【図２１】マウス３５のいくつかの子孫についての例示的なＰＣＲおよびＡＰＰ遺伝子の生殖細胞系への伝達を示す図である。マウス３５の最初の７子孫で行った４つのＰＣＲについての画像。ＴＲＰ１、エキソン６、エキソン１１およびＬＹＳ２のＰＣＲを行った。子孫１、４、５および７がトランスジーンを受け継いでいることを観察することができる。
【図２２】創始マウスのＦ１のサザンブロットの比較を示す図である。非トランスジェニック同腹子と比較したマウス３５および６４のフィンガープリント。ＹＡＣ ｂ１０６で得られたものと同一のバンドパターンを観察することができる。
【図２３】ヒトＡＰＰ遺伝子発現を示す棒グラフを示す。系統３５にけるヒトＡＰＰ遺伝子発現についての相対単位での対数表現。９７％信頼区間。中枢および末梢神経組織において高い発現が検出される。精巣、血液、心臓および腎臓ではレベルがより低い。
【図２４】ネズミＡＰＰ遺伝子発現を示す棒グラフを示す。マウスにおけるネズミＡＰＰ遺伝子発現についての相対単位での表現。このグラフは、９５％信頼区間を用いて、脾臓における発現（最も低い発現）に対して標準化している。凡例では各棒が対応している組織を示している。
【図２５】ＡＰＰタンパク質発現および評価を示す図である。Ａ．ＡＰＰタンパク質およびアクチンについてのウエスタンブロット解析の代表的なゲル。組織：１ 皮質、２ 脳室、３ 小脳、４ 中脳、５ 脊髄、６ 肝臓、７ 肺、８ 膵臓、９ 脾臓、１０ 小腸、１１ 筋肉、１２ 精巣、１３ 心臓および１４ 腎臓。Ｂ．ＡＰＰレベルのグラフ表現。青色の棒、野生マウス、赤色の棒、トランスジェニックマウス。組織：１ 皮質、２ 脳室、３ 中脳、４ 小脳および５ 脊髄。
【図２６】系統３５のトランスジェニックマウスの組織学的解析を示す図である。マウス脳のコンゴレッド染色。Ａ 野生マウスの皮質。Ｂ 野生マウスの海馬。Ｃ 系統３５の皮質。Ｄ 系統３５の海馬。Ｅ １年齢Ｔｇ２５７６マウスの海馬、ここではアミロイド生成性斑が観察される。
【図２７】系統６４のトランスジェニックマウスの組織学的解析を示す図である。マウス脳のコンゴレッド染色。Ａ 野生マウスの皮質。Ｂ 野生マウスの海馬。Ｃ 系統６４の皮質。Ｄ 系統６４の海馬。Ｅ １年齢Ｔｇ２５７６マウスの海馬、ここではアミロイド生成性斑が観察される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６６４２６６５：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，６４２，６６５との間に含まれるヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチド、または完全ヒトＡＰＰ遺伝子（ｈＡＰＰ）をその調節配列とともに含んでなる該ポリヌクレオチドの断片。
【請求項２】
前記完全ｈＡＰＰ遺伝子が、その調節配列とともに、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６１７４７３３：２６４６４８０９：１）のヌクレオチド２６，１７４，７３３とヌクレオチド２６，４６４，８０９との間に含まれる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６５７３３４４：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，５７３，３４４との間に含まれるヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ｈＡＰＰ遺伝子が、その５’末端において（ＡＰＰ遺伝子転写の始点および方向に関連）第１のヌクレオチド配列に隣接され、その３’末端において（ＡＰＰ遺伝子転写の終点および方向に関連）第２のヌクレオチド配列に隣接され、ここで：
前記第１のヌクレオチド配列が、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６４６４８１０：２６６４２６６５：ｌ）のヌクレオチド２６，４６４，８１０とヌクレオチド２６，６４２，６６５との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片からなり、かつ
前記第２のヌクレオチド配列が、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６１７４７３２：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，１７４，７３２との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記第１のヌクレオチド配列が、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６４６４８１０：２６５７３３４４：１）のヌクレオチド２６，４６４，８１０とヌクレオチド２６，５７３，３４４との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片を含んでなり、かつ
前記第２のヌクレオチド配列が、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６１７４７３２：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，１７４，７３２との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片を含んでなる、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記第１のヌクレオチド配列が、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６５７１８７６：２６５７３３４４：ｌ）のヌクレオチド２６，５７１，８７６とヌクレオチド２６，５７３，３４４との間に含まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項４または５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記第２のヌクレオチド配列が、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６０６７２２１：ｌ）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，０６７，２２１との間に含まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項４または５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
【請求項９】
ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）またはＰＡＣ（Ｐ１由来人工染色体）からなる群から選択される、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、その一方の末端において第３のヌクレオチド配列に隣接され、もう一方の反対の末端において第４のヌクレオチド配列に隣接され、ここで：
前記第３のヌクレオチド配列が、（ｉ）酵母細胞において機能的なテロメア、および少なくとも（ii）１つの栄養要求性選択マーカーを含んでなり、かつ
前記第４のヌクレオチド配列が、（ｉ）酵母細胞において機能的なセントロメア、酵母細胞において機能的なテロメア、および少なくとも１つの栄養要求性選択マーカーを含んでなる、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
前記栄養要求性選択マーカーが、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＨＩＳ３、ＨＩＳ５、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３からなる群から選択される、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項８〜１１のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、細胞。
【請求項１３】
トランスジェニック非ヒト動物であって、そのゲノムに挿入された請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１４】
前記動物が哺乳類、好ましくは齧歯類、より好ましくはマウスまたはラットである、請求項１３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
そのゲノムがアルツハイマー病の１つ以上の分子マーカーをさらに含有する、請求項１３または請求項１４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記アルツハイマー病の分子マーカーが、ＰＳ１、ＰＳ２遺伝子、およびＡＰＯＥ遺伝子のイプシロン４（ε４）対立遺伝子からなる群から選択される、請求項１５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）と家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の両方のアルツハイマー病を研究するための動物モデルとしての、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項１８】
アルツハイマー病の病因、原因、誘発因子、その疾患の確立につながる環境的および／または生理病理学的攻撃または傷害を研究するためのアルツハイマー病モデルとしての、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項１９】
アルツハイマー病の治療および／または予防に潜在的に有用な化合物をスクリーニング、発見、同定、評価、および妥当性を立証するための、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項２０】
前記ｈＡＰＰ遺伝子だけを発現するトランスジェニック非ヒト動物を得るための、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項２１】
アルツハイマー病の治療および／または予防に潜在的に有用な化合物を同定するための方法であって、
ａ）請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物に候補化合物を投与する工程；
ｂ）工程（ａ）の該トランスジェニック非ヒト動物における、ｈＡＰＰ遺伝子の発現パターン、および／またはｈＡＰＰタンパク質の産生、および／またはβ−アミロイド（Ａβ）ペプチド産生を判定する工程、および
ｃ）該トランスジェニック非ヒト動物において（ｉ）神経組織におけるｈＡＰＰ遺伝子発現レベルの低下、（ii）ｈＡＰＰタンパク質産生および／もしくは蓄積の減少、ならびに／または（iii）Ａβペプチド産生および／もしくは蓄積の減少、を引き起こす該候補化合物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２２】
ヒトにおける前記遺伝子の発現パターンと同様のまたは同等の発現パターンでヒトＡＰＰ遺伝子を内因的に発現するトランスジェニック非ヒト動物の子孫。
【請求項１】
ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６６４２６６５：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，６４２，６６５との間に含まれるヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチド、または完全ヒトＡＰＰ遺伝子（ｈＡＰＰ）をその調節配列とともに含んでなる該ポリヌクレオチドの断片。
【請求項２】
前記完全ｈＡＰＰ遺伝子が、その調節配列とともに、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６１７４７３３：２６４６４８０９：１）のヌクレオチド２６，１７４，７３３とヌクレオチド２６，４６４，８０９との間に含まれる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６５７３３４４：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，５７３，３４４との間に含まれるヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ｈＡＰＰ遺伝子が、その５’末端において（ＡＰＰ遺伝子転写の始点および方向に関連）第１のヌクレオチド配列に隣接され、その３’末端において（ＡＰＰ遺伝子転写の終点および方向に関連）第２のヌクレオチド配列に隣接され、ここで：
前記第１のヌクレオチド配列が、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６４６４８１０：２６６４２６６５：ｌ）のヌクレオチド２６，４６４，８１０とヌクレオチド２６，６４２，６６５との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片からなり、かつ
前記第２のヌクレオチド配列が、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６１７４７３２：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，１７４，７３２との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記第１のヌクレオチド配列が、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６４６４８１０：２６５７３３４４：１）のヌクレオチド２６，４６４，８１０とヌクレオチド２６，５７３，３４４との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片を含んでなり、かつ
前記第２のヌクレオチド配列が、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６１７４７３２：１）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，１７４，７３２との間に含まれるヌクレオチド配列、または少なくとも１つの固有の配列を含むその断片を含んでなる、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記第１のヌクレオチド配列が、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６５７１８７６：２６５７３３４４：ｌ）のヌクレオチド２６，５７１，８７６とヌクレオチド２６，５７３，３４４との間に含まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項４または５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記第２のヌクレオチド配列が、ヒト第２１染色体（ＮＣＢＩ３５：２１：２６０６４９３４：２６０６７２２１：ｌ）のヌクレオチド２６，０６４，９３４とヌクレオチド２６，０６７，２２１との間に含まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項４または５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
【請求項９】
ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）またはＰＡＣ（Ｐ１由来人工染色体）からなる群から選択される、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、その一方の末端において第３のヌクレオチド配列に隣接され、もう一方の反対の末端において第４のヌクレオチド配列に隣接され、ここで：
前記第３のヌクレオチド配列が、（ｉ）酵母細胞において機能的なテロメア、および少なくとも（ii）１つの栄養要求性選択マーカーを含んでなり、かつ
前記第４のヌクレオチド配列が、（ｉ）酵母細胞において機能的なセントロメア、酵母細胞において機能的なテロメア、および少なくとも１つの栄養要求性選択マーカーを含んでなる、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
前記栄養要求性選択マーカーが、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＨＩＳ３、ＨＩＳ５、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３からなる群から選択される、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項８〜１１のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、細胞。
【請求項１３】
トランスジェニック非ヒト動物であって、そのゲノムに挿入された請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１４】
前記動物が哺乳類、好ましくは齧歯類、より好ましくはマウスまたはラットである、請求項１３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
そのゲノムがアルツハイマー病の１つ以上の分子マーカーをさらに含有する、請求項１３または請求項１４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記アルツハイマー病の分子マーカーが、ＰＳ１、ＰＳ２遺伝子、およびＡＰＯＥ遺伝子のイプシロン４（ε４）対立遺伝子からなる群から選択される、請求項１５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）と家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の両方のアルツハイマー病を研究するための動物モデルとしての、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項１８】
アルツハイマー病の病因、原因、誘発因子、その疾患の確立につながる環境的および／または生理病理学的攻撃または傷害を研究するためのアルツハイマー病モデルとしての、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項１９】
アルツハイマー病の治療および／または予防に潜在的に有用な化合物をスクリーニング、発見、同定、評価、および妥当性を立証するための、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項２０】
前記ｈＡＰＰ遺伝子だけを発現するトランスジェニック非ヒト動物を得るための、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項２１】
アルツハイマー病の治療および／または予防に潜在的に有用な化合物を同定するための方法であって、
ａ）請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物に候補化合物を投与する工程；
ｂ）工程（ａ）の該トランスジェニック非ヒト動物における、ｈＡＰＰ遺伝子の発現パターン、および／またはｈＡＰＰタンパク質の産生、および／またはβ−アミロイド（Ａβ）ペプチド産生を判定する工程、および
ｃ）該トランスジェニック非ヒト動物において（ｉ）神経組織におけるｈＡＰＰ遺伝子発現レベルの低下、（ii）ｈＡＰＰタンパク質産生および／もしくは蓄積の減少、ならびに／または（iii）Ａβペプチド産生および／もしくは蓄積の減少、を引き起こす該候補化合物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２２】
ヒトにおける前記遺伝子の発現パターンと同様のまたは同等の発現パターンでヒトＡＰＰ遺伝子を内因的に発現するトランスジェニック非ヒト動物の子孫。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２３】
【図２４】
【図２６】
【図２７】
【図８】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１７】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２３】
【図２４】
【図２６】
【図２７】
【図８】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１７】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２５】
【公表番号】特表２００９−５１７０６６（Ｐ２００９−５１７０６６Ａ）
【公表日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４２７８３（Ｐ２００８−５４２７８３）
【出願日】平成１８年１２月１日（２００６．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００６／０００６７３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６３１６０
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（５０４４３４０５１）ウニベルシダッド・アウトノマ・デ・マドリッド (7)
【出願人】（５９３００５８９５）コンセホ・スペリオール・デ・インベスティガシオネス・シエンティフィカス (67)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＥＪＯ ＳＵＰＥＲＩＯＲ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮＥＳ ＣＩＥＮＴＩＦＩＣＡＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１日（２００６．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００６／０００６７３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６３１６０
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（５０４４３４０５１）ウニベルシダッド・アウトノマ・デ・マドリッド (7)
【出願人】（５９３００５８９５）コンセホ・スペリオール・デ・インベスティガシオネス・シエンティフィカス (67)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＥＪＯ ＳＵＰＥＲＩＯＲ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮＥＳ ＣＩＥＮＴＩＦＩＣＡＳ
【Ｆターム（参考）】
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