アルツハイマーＡβペプチドの中間コンフォメーションへのアポリポタンパク質Ｅのアイソフォーム特異的な相互作用
本発明は、アポリポタンパク質Ｅ４（ａｐｏＥ４）と、アルツハイマーＡβペプチドの活性型との相互作用の阻害剤を見出すのに有用な分析方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポリポタンパク質Ｅ４（ａｐｏＥ４）と、アルツハイマーＡβペプチドの活性型との相互作用の阻害剤を見出すのに有用な分析方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、細胞外のタンパク質様アミロイド−βペプチド（Ａβ）が老人斑の形態で沈着することに関連する進行性の神経変性で特徴付けられる（Ｓｅｌｋｏｅ，１９９１年）。斑の沈着は、アミロイド形成というプロセスにより単量体Ａβペプチドが自己凝集した結果である。アミロイド形成は、インビトロでは、マイクロモル単位の量の単量体Ａβで開始される（Ｈａｒｐｅｒ，１９９７年）。アミロイド形成において、単量体サブユニットの凝集は、上記ペプチドがまず、直鎖状の凝集体の形成を開始させる唯一の種であり唯一のＡβの神経毒性型であるコンフォーマーをゆっくりと形成する反応速度論モデルと一致する。
【０００３】
アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）は、脂質とコレステロールの輸送、およびＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）を介した脳内でのクリアランスを調節するリガンドであり（Ｂｏｙｌｅｓ １９８９年，Ｃｏｒｄｅｒ １９９３年，Ｆａｇａｎ １９９６年．Ｐｏｉｒｉｅｒ，１９９４年）、これは、ＡＤの脳における斑の沈着に関与することが明らかにされている。ＡｐｏＥには、ヒト集団でみられる３種の優勢なアイソフォーム、Ｅ２（Ｃｙｓ112、Ｃｙｓ158）、Ｅ３（Ｃｙｓ112、Ａｒｇ158）、およびＥ４（Ａｒｇ112、Ａｒｇ158）がある（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ，１９９４年）。ＡＤに罹った患者において、ａｐｏＥ４キャリアーは、ａｐｏＥ３キャリアーに比べてより多い数の老人斑を示す（Ｇｅａｒｉｎｇ，１９９６年）。ＡｐｏＥ４／４遺伝子型を有する被験者は、ＡｐｏＥ２／３またはＡｐｏＥ３／３遺伝子型を有する被験者よりも、アルツハイマー病に８倍程度罹りやすいようである。さらに、アルツハイマー病発症の平均年齢と、平均生存年齢は、１つのＡｐｏＥ４対立遺伝子を有するヒトがより低く、２つのＡｐｏＥ４対立遺伝子を有するヒトは最も低い（米国特許第５,５０８,１６７号）。まれなａｐｏＥ２対立遺伝子の遺伝形質は、ＡＤ発病の危険率の減少に関連する（Ｃｏｒｄｅｒ，１９９４年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＡｐｏＥは、直接的なタンパク質−タンパク質相互作用によるＡβペプチドの沈着またはクリアランスに関与すると仮定されている。ＬａＤｕ（１９９４年，１９９７年）は、野生型の脂質化ａｐｏＥ分子を用いて、Ａβとの相互作用におけるａｐｏＥアイソフォーム特異的な差を実証したが、アイソフォーム特異性は、精製ａｐｏＥアイソフォームでは失われた。ＬａＤｕによる研究では、明らかに凝集によるＡβの様々な形態に対するａｐｏＥの作用を調査しておらず、それゆえに、ａｐｏＥ４との優先的な結合が示されていない。Ｔｏｋｕｄａ等は、ａｐｏＥ３およびＡβとのアイソフォーム特異的な相互作用を報告している。しかしながら、我々は、様々なＡβコンフォメーションが、様々な度合いの神経毒性を付与すること、および、Ａβの有毒型を再現可能に製造可能であることを確立した。それゆえに、その相互作用の生理学的な重要性を確認するためだけでなく、その相互作用の調節物質を発見するための分析法を開発する手段としても、ａｐｏＥ４とＡβとの相互作用に関するアイソフォーム特異的で／有毒な種に特異的な分析手法を開発することは極めて興味深かった。このような調節物質は、ａｐｏＥ４対立遺伝子を有する患者におけるアミロイド関連病の治療および予防に有用となり得る。
【０００５】
引用された参考文献
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【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記で確認されたニーズを扱うものであり、すなわち本発明は、脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体形成阻害剤化合物を同定する方法を提供し、本方法は、試験化合物の存在下で、脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドと、活性化Ａβポリペプチドとを接触させる工程；および、ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の形成を減少させる試験化合物を同定する工程を含み、ここで、脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体の形成を減少させる試験化合物が、複合体形成阻害剤化合物である。
【０００７】
上記に加えて、本発明は、さらなる局面として、特に上述された変形よりも多少なりとも狭い範囲の全ての本発明の実施形態を含む。出願人は添付された請求項の全ての範囲を発明しているが、添付された請求項には、他者の従来技術の仕事の範囲を含まないように意図している。それゆえに、請求項の範囲内の法定の従来技術が、特許庁または他の団体または個人により出願人に注意が与えられるということにおいて、出願人は、適用できる特許法に基づき補正する権利を行使する権利を有し、このような請求項の保護対象を、特にこのような法定の従来技術、または、このような請求項の範囲から法定の従来技術の自明な改変を排除するように、再定義できる。本発明の変形は、このようにして補正された請求項によって定義され、またそれらを本発明の局面とする。
【０００８】
図面の詳述
図１−濁度検出による代表的なＡβ1-40振盪凝集実験：Ａβ1-40の５０μＭ溶液を、方法の章で示された詳細に従って振盪することによって凝集するように誘導した。縦座標は、Ａ405×１０3の単位であり、１３８単位は、５０μＭに等しい。実線は、方程式１〜４と表１に示す速度定数を用いて計算された理論曲線である。左の縦座標は、開始ペプチド、および、凝集した種に関し、一方、右の縦座標は、活性化単量体、成長部位、および、四量体に関する。黒丸は、個々の実験データ点を示す。
【０００９】
図２−濁度およびペプチド濃度の時間依存性：濁度検出とペプチド質量との関係を並行
実験で決定した。方法で説明された通りに、遠心分離後に溶液中に残存したペプチドの質量を定量した。データを方程式１〜４で分析し、実線は、実験データ点に対する理論上の適合を示す。
【００１０】
図３−ＣＤ検出による自発的凝集のカイネティクス：凝集カイネティクス実験は、方法で説明されるようにＡ405での振盪法または２００〜２０５ｎｍにおけるＣＤ楕円率を用いて行った。実線は、最も適合した理論曲線を示す。
【００１１】
図４−凝集時間の関数としてのＡβ1-40のＣＤスペクトルにおける変化：凝集プロセス中の様々な時間でＣＤスペクトルを記録し、このスペクトルを方法で説明されるように分析した。
【００１２】
図５−凝集に対するペプチド濃度の効果；濁度および蛍光偏光法による検出：方法で説明されたようにペプチド濃度の関数として、濁度および蛍光偏光検出によって凝集実験を行った。黒丸：２５μＭペプチド；白丸：５０μＭペプチド。実線は、実験データ点に対する理論上の適合である。
【００１３】
図６−抗ａｐｏＥのＮ末端キャプチャー抗体を用いたＥＬＩＳＡによって、様々な形態のＡβ１−４０への、脂質化した、および脂質化されていないａｐｏＥの結合の検出である。記載したように、自発的凝集中に振盪して０、６０、８０、および、１１０分に、Ａβ１−４０を得た。パネルＡおよびＢ＝キャプチャー抗体６Ｃ５、パネルＣおよびＤ＝キャプチャー抗体９Ｈ８．Ｇ５．Ｆ２、パネルＡおよびＣ＝脂質化したａｐｏＥ、パネルＢおよびＤ＝脂質化されていないａｐｏＥ、●＝ａｐｏＥ２、○＝ａｐｏＥ３、▲＝ａｐｏＥ４、＊＝ａｐｏＥ２に対してｐ＜０.０５、＋＝ａｐｏＥ３に対してｐ＜０.０５のａｐｏＥ４。ｎ＝５（６Ｃ５、および、９Ｈ８．Ｇ５．Ｆ２脂質化ａｐｏＥの実験について）、およびｎ＝４（６Ｃ５、および９Ｈ８．Ｇ５．Ｆ２脂質化されていない実験について）。
【００１４】
図７−抗ａｐｏＥのＣ末端キャプチャー抗体３Ｈ１を用いたＥＬＩＳＡによる、様々な形態のＡβ１−４０への、脂質化した、および脂質化されていないａｐｏＥの結合の検出である。記載したように、自発的凝集中に振盪して０、６０、８０、および１１０分に、Ａβ１−４０を得た。パネルＡ＝脂質化ａｐｏＥ、パネルＢ＝脂質化されていないａｐｏＥ、●＝ａｐｏＥ２、○＝ａｐｏＥ３，▲＝ａｐｏＥ４。ｎ＝４（脂質化ａｐｏＥ実験について）、および、ｎ＝３（脂質化されていないａｐｏＥ実験について）。
【００１５】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、全長ＡｐｏＥ４のアミノ酸配列である。
配列番号２は、Ａβ１−４３のアミノ酸配列である。
配列番号３〜１０は、実施例２のプライマー配列である。
【００１６】
発明の詳細な説明
一般的な定義
アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）は、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）を介した脳における脂質とコレステロールの輸送およびクリアランスを調節するタンパク質種であり（Ｂｏｙｌｅｓ １９８９年，Ｃｏｒｄｅｒ １９９３年，Ｆａｇａｎ １９９６年，Ｐｏｉｒｉｅｒ １９９４年）、ＡＤ脳における斑の沈着に役割を果すことが明らかにされている。
【００１７】
ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、およびＡｐｏＥ４という３種の主要なＡｐｏＥのアイソフ
ォームがあり、これらは、単一の遺伝子座における３種の対立遺伝子の生成物である。３
種のホモ接合型の表現型（Ａｐｏ−Ｅ２／２，Ｅ３／３、およびＥ４／４）、および３種のヘテロ接合型の表現型（ＡｐｏＥ３／２，Ｅ４／３、およびＥ４／２）は、３種の対立遺伝子のいずれか２種の発現によって生じる。最も一般的な表現型はＡｐｏＥ３／３であり、最も一般的な対立遺伝子はＥ３である。Ｍａｈｌｅｙ.Ｒ.Ｗ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０；６２２〜６３０（１９８８年）を参照。３種のタイプのアミノ酸配列は、わずかしか違わない。ＡｐｏＥ４は、ＡｐｏＥ４のアミノ酸残基１１２で通常みられるシステインがアルギニンに置換されている点でＡｐｏＥ３と異なる。ＡｐｏＥ２の最も一般的な形態は、残基１５８で通常みられるアルギニンがシステインに置換されている点でＡｐｏＥ３と異なる。上記のＭａｈｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅを参照。それゆえに、３種のアイソフォームは、以下のそれらの配列の差の情報の短縮表記によって示すことができる：Ｅ２（Ｃｙｓ112，Ｃｙｓ158），Ｅ３（Ｃｙｓ112，Ａｒｇ158）、およびＥ４（Ａｒｇ112，Ａｒｇ158）（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９４年）。
【００１８】
ヒトａｐｏＥは、２９９個のアミノ酸残基からなる３４ｋＤａのタンパク質であり、３種の別個の機能的ドメイン：（１）Ｎ末端受容体結合領域、（２）プロテアーゼ切断に感受性を有するランダムコイル領域、および（３）Ｃ末端脂質結合領域を有する（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９４年）（Ｆｉｇ１）。Ｎ末端領域中の残基１３６〜１５８は、ａｐｏＥ関連受容体と相互作用し、残基１６５〜２１０は、タンパク質分解に高い感受性を有し、残基２２５〜２９９は、Ｃ末端部分を構成し、脂質結合に関与する残基２６８〜２８９を含む。我々は、残基２４３〜２７２がＡβへの結合に関与することを発見した。
【００１９】
本発明に記載される「ａｐｏＥ４由来ポリペプチド」は、Ｍａｈｌｅｙにより説明され、以下に引用して記載された成熟ヒトａｐｏＥ４ポリペプチド（配列番号１）、
【化１】
および、ヒトａｐｏＥ４の種の相同体を含む。多くの種のａｐｏＥの相同体は、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒにより記載されており、この定義は、ヒヒ、カニクイザル、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、イヌ、アシカ、およびその他の種の相同体、ならびに上記配列のポリペプチドのフラグメントを含み得る。
【００２０】
本発明で用いられる用語「Ａβポリペプチド」は、分子量が約４.０ｋＤの３８〜４３個のアミノ酸ペプチドを意味し、このペプチドは、Ｇｌｅｎｎｅｒ等（２２）により記載されたタンパク質の形態と実質的に相同であり、正常なベータアミロイドペプチドの突然変異、および翻訳後修飾を含む。どのような形態においても、ベータアミロイドペプチドは、ベータアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）という大きい膜貫通型糖タンパク質の約３８〜４１個のアミノ酸フラグメントである（フラグメントのカルボキシ末端が異なる）。その４３個のアミノ酸配列は以下の通り（配列番号２）、
【化２】
または、それらに相同な配列である。一例として、対応するラットおよびマウス配列は、上記配列に約９５％相同であり、この定義に含まれるものであり、それぞれＧｅｎｂａｎｋ受入番号Ｐ０８５９２およびＡＡＢ４１５０２から推測することができる。その他の相同体は、公開されたデータベースおよび私的なデータベースから、または、適切な種から対応するＡＰＰをクローニングおよび配列解析することによって容易に推測される。
【００２１】
Ａβポリペプチドは、可溶性、不溶性、または中間体型のいずれかで存在し得る。インビトロでインキュベートする際の濃度依存性のラグ期間の後、合成βＡＰの可溶性調製物は、活性化ベータアミロイド種をゆっくり形成し、最終的には、繊維性の凝集体を生じ、これは、天然アミロイドに類似し、沈降により水性媒体から分離可能である。本明細書において便宜上、Ａβポリペプチドは、場合により、Ａβ１−３８、Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４１、Ａβ１−４２、Ａβ１−４３、または単に「Ａβ」ともいう。
【００２２】
用語「凝集したＡβペプチド」は、不溶性状態のＡβペプチドを意味する。
【００２３】
用語「活性化Ａβポリペプチド」は、ａｐｏＥ４ポリペプチドと複合体を形成するというアイソフォームに特異的な性質を示す、自発的凝集中に生じるポリペプチド種を意味する。本明細書において、活性化Ａβポリペプチドを製造する手法は、下記で詳細に説明する。
【００２４】
「脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチド」は、ａｐｏＥ４由来ポリペプチドに加えて、極性または中性脂肪成分を含み、極性または中性脂肪成分は、活性化ベータアミロイドペプチドと複合体を特異的に形成することができ、その相互作用は、それらの結合の測定が可能なほど十分に強いａｐｏＥ４由来ポリペプチドである。ポリペプチドが他のポリペプチドと結合する性質を測定する方法は当業界周知であり、実証的な例が考察されている。
【００２５】
脂質成分としては、エステル化または非エステル化（遊離）コレステロール、トリグリセリド、およびリン脂質が挙げられる。一実施形態において、凝集体中の脂質成分は、脂質二重層を形成することができる。いくつかの実施形態は、ジラウロイルＰＣ（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルＰＣ（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルＰＣ（ＤＰＰＣ）、およびパルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ＰＣを含むホスファチジルコリン（ＰＣ）、または、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、セラミド、および、スフィンゴミエリン、セレブロシド、コール酸ナトリウム、コレステロール、およびコレステロールエステルで複合化したａｐｏＥ４を含む。再構成したリポタンパク質粒子を製造する方法は当業界周知であり、Ｊｏｎａｓにより詳細に記載された方法で、様々な割合の脂質混合物とタンパク質濃度で作製することができる。アポリポタンパク質を様々な脂質と結合させるための多くの方法があり、例えば、脂質およびタンパク質成分の共超音波処理（ｃｏｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、タンパク質と脂質小胞との自発的な相互作用、および様々な界面活性剤が介在する再構成方法が挙げられる。
【００２６】
本発明で用いられる用語「〜を接触させること」は、直接的または間接的のいずれかによって、化合物と本発明のポリペプチドとを共に物理的に近接させることを意味する。加えて、「〜を接触させること」は、本発明のポリペプチドと、他のポリペプチドとを物理的に近接させることを意味する場合もある。
【００２７】
本発明で用いられる用語「複合体」は、共に結合した分子の組み合わせを意味するものとし、特定のいかなる結合様式を意味するものではない。
【００２８】
本発明で用いられる用語「相同」は、所定のポリペプチドと、他のアミノ酸配列とのアミノ酸配列間の同一性の程度を説明するために用いられる。所定のポリペプチドのアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列は、例えば上で定義されたハイブリダイゼーションによって得られたＤＮＡ配列から推測してもよいし、または、従来のアミノ酸配列解析法で得てもよい。相同性の程度は、好ましくは、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列で決定される。好ましくは、相同性の程度は、比較されたアミノ酸配列間のアミノ酸配列において、少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、または、さらに９８％である。
【００２９】
相同なアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を包含する。相同性（％）は、例えば、ギャッププログラム（Ｇａｐ ｐｒｏｇｒａｍ）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，マディソン，ウィスコンシン州）によって決定することができ、これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ.Ａｐｐｌ.Ｍａｔｈ.，１９８１年，２，４８２〜４８９）のアルゴリズムを標準設定で用いている。
【００３０】
本発明で用いられ、かつ当業界で理解されている「単離（されている）」とは、ポリペプチドが正常に発見される元来の細胞の環境から分離されたことを意味するものとする。従って、単なる例として、本発明で用いられるように、それらが天然に存在しない細胞型で組換え手段によって発現されたタンパク質は、「単離されている」。一例として、天然に存在する細胞、またはそうではない細胞のどちらで発現されたとしても、ある程度まで精製された場合、そのタンパク質種は「単離されている」。
【００３１】
本発明で用いられる「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわちペプチド等価体（ｉｓｏｓｔｅｒｅｓ）で、互いに連結した２またはそれ以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、短鎖（一般的にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという）と、より長い鎖（一般的にタンパク質という）との両方を意味する。ポリペプチドは、遺伝子をコードする２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、自然のプロセス、例えば翻訳後プロセシング、または、当業界周知の化学修飾技術のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列を含む。ポリペプチドのグリコシル化および非グリコシル化型もこの定義に包含される。
【００３２】
本発明で用いられ、かつ当業界で理解されている「合成された」は、酵素による方法に対して、純粋に化学によって製造されたポリヌクレオチドを意味する。それゆえに、「完全に」合成されたＤＮＡまたはポリペプチド配列は、完全に化学的手段によって製造され、「部分的に」合成されたＤＮＡまたはポリペプチドは、得られたＤＮＡまたはポリペプチドの一部だけが化学的手段によって製造されたものを包含する。
【００３３】
用語「試験化合物」は、あらゆる手段、同定可能な天然または合成の化学物質または分子を意味し、例えば、これらに限定されないが、活性化Ａβポリペプチドが脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドと結合する性質を調節するその能力が評価される、低分子物質、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または、核酸が挙げられる。特に、抗体（例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性／二特異的な抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および相補決定領域（ＣＤＲ）移植抗体がこの定義に含まれ、ａｐｏＥ４誘導ポリペプチドまたは活性化Ａβに特異的に結合するＣＤＲ配列を含む化合物も含まれる。この定義は、１９９３年６月２０日に公開されたＷＯ９３／１１２３６に記載の方法に従って製造および同定されたヒト抗体を含む。この定義は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、および、Ｆvなどの抗体フラグメントを含み、これらも
本発明によって提供される。上記定義は、動物から単離した抗血清も含み、典型的な組成物としは、水、または、その他の希釈液、添加剤もしくはキャリアーに再懸濁された抗血清の抗体分画を含む組成物のようなものがある。
【００３４】
本発明で用いられる用語「脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチド−Ａβ複合体」または複合体は、ａｐｏＥ４タンパク質由来ポリペプチドとベータアミロイドペプチドとの複合体
を意味するものとする。
【００３５】
序論
アルツハイマー病（ＡＤ）の病理学的な特徴は、脳内における細胞外の斑の形態のアミロイドペプチド（Ａβ）の存在である。斑形成の前に、単量体Ａβフラグメントは、単一ユニットから凝集産物へトランスフォーメーションし、それによりフィブリル形成が起こり、最終的には斑沈着が起こる。アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）は、Ａβ斑形成に関与すると考えられてる。ａｐｏＥ４アイソフォームを有するＡＤに罹った患者は、ａｐｏＥ３キャリアーに比べてかなり多数のＡβ斑を示した。最も明白には、ａｐｏＥ２およびａｐｏＥ３キャリアーに比べて、ａｐｏＥ４対立遺伝子の遺伝は、ＡＤの危険性を高める。これまで、ＡＤの病因へのＡｐｏＥの関与の性質は、よく理解されていなかった。我々は、自発的凝集中に生成される、ＡｐｏＥ４アイソフォームと優先的に結合するＡβ活性種を再現可能的に作成する方法を発見した。我々はまず、下記で、活性ベータアミロイド種をどのように作成し、回収できるかを説明する。続いて我々は、どのように脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドを作成できるかを説明する。最後に、我々は、どのようにこれら２種の相互作用を評価する分析法を実施することができるかを説明する。
【００３６】
ＡｐｏＥのアイソフォーム特異的な結合を示す活性化Ａβポリペプチドの作成
下記で説明した分析は、単離したＡβポリペプチドを、その分子形態のいずれか一つ（代表的には、３８、３９、４０、４１、４２または４３個のアミノ酸変異体）で利用する。このようなポリペプチドは購入することができる（例えばシグマ・バイオケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）製の、フラグメント１−３８（カタログ番号Ａ０１８９）、フラグメント１−４０（カタログ番号Ａ１０７５）、フラグメント１−４２（カタログ番号Ａ９８１０）、フラグメント１−４３（カタログ番号Ａ−７７１２））。このようなポリペプチドはまた、当業界周知の手段で合成で製造されてもよい。固相ペプチド合成は当業者周知であり、一般的に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３年，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５６，ＦｉｅｌｄｓおよびＮｏｂｌｅ，１９９０年，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：１６１〜２１４、およびＳｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”ｂｙ ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｐａｒｄ（ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）出版，オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），１９８９年）で記載されている。従って、ここで開示されたペプチドおよびタンパク質は、これら比較的慣例的な技術を本発明の開示を考慮して用いて製造してもよい。固相ペプチド合成は提供された参考文献で説明されているように当業者周知であり、手動で行うこともでき、または自動化ペプチドシンセサイザー（例えばＡＢＳが販売しているもの）で行うこともできる。
【００３７】
一つの合成方法は、自動化ペプチドシンセサイザーによるＦｍｏｃ方法を用いた固相ペプチド合成によって達成される。この方法は、−ＣＯＯＨ末端からアミノ酸鎖を構築し、これを不溶性ポリマー支持体に付着させることを含む。塩基不安定性のＦｍｏｃ基が、各残基の−アミノ基を保護するのに用いられる。反応性を有する可能性のある側鎖を有する残基が、ｔ−ブチルのような酸不安定性基で保護される。各サイクル中にピペリジンでＦｍｏｃ基を除去した後、カップリング試薬または予め活性化したアミノ酸誘導体のいずれかを用いて、次の保護されたアミノ酸が付加される。合成の最後に、ペプチドを固体支持体から切断し、用いられるリンキング剤に応じてペプチド酸またはアミドが得られ、ペプチド−樹脂をトリフルオロ酢酸と様々なイオンスカベンジャーとの混合物で処理することによって側鎖保護基を除去する。メチルｔ−ブチルエーテルを加えて、切断混合物からペプチドを沈殿させる。粗ペプチドを溶解させ、凍結乾燥し、その後、高性能液体クロマトグラフィーで精製する。精製したペプチドを凍結乾燥し、−８０℃で保存する。
【００３８】
このようなポリペプチドは、ベータアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の正常なプロセシングとそれに続く精製によって作成することもできる。
【００３９】
本発明は、ＡｐｏＥ４-活性化Ａβ相互作用の阻害剤を同定するための数種の分析システムを含む。このような分析法の重要性を理解するために、Ａβの活性型が、神経毒性にも、またａｐｏＥ４結合にも関与する生理学的に関連する種であることを理解することがまず必要である。
【００４０】
このような活性種の生成は、我々が説明する４次反応速度論モデルに従うことを認識する必要もある。このモデルの使用により、活性種が最大に到達する時間の予想が可能になり、それゆえに、細胞毒性またはａｐｏＥ４相互作用を評価する分析法で使用するための活性種をいつ回収するかを決定するために予想ツールを供給することができる。
【００４１】
Ａβの自発的凝集の反応速度論研究は複雑であるが、これは、凝集形成速度の、高いペプチド濃度に対する依存性や、市販サンプルにしばしば存在するわずかなフィブリル、あらゆる微粒子状の物質、種、および、沈降しなかったオリゴマーの量に対してシステムが極度に高感度であるためである。また、凍結乾燥したペプチド中にわずかな量の湿気が存在することによっても、しばしば制御不能な未成熟な凝集形成が起こる。出発原料の純度と均一性を達成する最良の方法の一つは、ヘキサフルオロイソプロパノールまたは酢酸のような酸または溶媒で予備処理することである（Ｆｉｎｄｅｉｓ，１９９９年）。厳密なサンプル精製に加えて、一定速度で凝集混合物を振盪することが、毎日一定した速度を得るのに必要であるとみられていた。
【００４２】
我々は、凝集データが、始めに非活性化単量体（ＵＭ）がゆっくり活性種（ＡＳ）に変換される３段階反応速度論モデルに最も一致することを見出した。第二の遅い工程において、数種の単量体は、フィブリルの成長部位（ＧＳ）として役立つオリゴマーの核を協同して形成する。フィブリルの成長は、不活性単量体分子の連続付加により成長部位を破壊することなく凝集体を伸長させる第三の工程で起こる。
【数１】
【００４３】
上記モデルは、以下の方程式システムで示される：
【数２】
【００４４】
式中、Ｐは、凝集した単量体の濃度である。これら速度方程式は、独立した形態では積分不可能であるため、非線形最小二乗法プログラムを上記方程式の５次のルンゲ・クッタ数値積分と組み合わせて用いて、Ｐ対時間のデータを分析した。この分析により、ｘ＝４±１であることがわかり、速度定数を計算した。この分析を、初期推定値に関して選択された値に関わらず、ほぼ同様の最も適合するパラメーターに収束させた。速度定数が計算されれば、あらゆる種（活性Ａβペプチド種を含む）の時点を容易に計算することができる。我々は、以下で、関連する速度定数を計算するのに必要なＡβの凝集を評価する数種の方法を説明する。
【実施例】
【００４５】
実施例１
自発的なＡβ凝集の測定
Ａβ１−４０を、ポリペプチド・ラボラトリーズ（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，トーランス，カリフォルニア州）、および、ベイケム・バイオケミカ（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，ハイデルベルグ，ドイツＡＧ）から購入した。配列中にシステイン残基を含み、そこにフルオレセイン成分が共有結合したＦｌｕｏ−β−アミロイド１−４０を、アドバンスト・バイオコンセプト社（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ｌｔｄ.，バッキンガムシア，イギリス）から購入した。分子ふるい（４Å）、および、１,１,１,３,３,３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ
Ａ）は、シグマ・ケミカル（セントルイス，ミズーリ州）製である。
【００４６】
単量体形態のＡβ1-40の調製
ＨＰＬＣ標準として用いられるＡβ１−４０を、ＨＦＩＰＡで処理し、これを分子ふるいタイプ４Ａ上で４℃で乾燥させ、続いて、１５,０００×ｇで１５分間遠心分離し、分子ふるいのダストを除去した。凝集分析のために、ペプチドをＨＦＩＰＡ中で８ｍｇ／ｍＬに溶解させ、溶媒中で１８〜２４時間保持し、予備形成された粒子全てを脱凝集させた。この工程の後、この溶液の２０μｌのアリコートを液体窒素中で瞬間冷凍し、−１９５℃で保存した。使用前に、ドライアイス下で、融解させずに、ＨＦＩＰＡを直接的な凍結乾燥で除去した。融解によるＨＦＩＰＡの除去は、凝集していない出発原料を得るのに必須であり、なぜなら、凍結乾燥前に、凍結したペレットを融解させると、しばしば数種のオリゴマーペプチドが製造されるためである。凍結乾燥したＡβ１−４０を無水ＤＭＳＯ（通常は２０μＬ）中で溶解させ、１５分間槽中で超音波破砕し、１００×ストック溶液を得た。この方法で製造されたペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムは、唯一のピークを示し（上記単量体の可能性が高い）、ＣＤ構造は主要なランダムコイルペプチドに一致した。我々は、２０×ストックを０.１％酢酸で製造する手法（Ｆｉｎｄｅｉｓ，Ｍ.Ａ.等（１９８９年））でも許容できるペプチド溶液が得られるを見出した。
【００４７】
Ａβ１−４０の自発的凝集
振盪凝集分析を実質的に以前に説明された通りに行った（Ｆｉｎｄｅｉｓ，Ｍ．Ａ．等（１９８９年））。５０μＭのＡβ１−４０を含む最終分析容量２５０μＬのダルベッコＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ++またはＭｇ++）を用いて、９６ウェルプレートで分析を行った。タイタープレート振盪器（ラボ−ライン（Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ）モデル４６２３）を速度８００ｒｐｍで用いてプレートを振盪した。反応混合物に抗体が含まれる場合は、それらは濃縮溶液から加えられた。抗体濃度を、分子量を１５０,０００と仮定して計算した。
【００４８】
濁度による凝集の測定
所定の時間で、反応混合物の濁度を、モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）Ｖｍａｘマイクロプレートリーダー（サニーベール，カリフォルニア州）で４０５ｎｍで読み取った。５０μＭのＡβ１−４０の凝集も、立て向きにセットされた両方の偏波器を備えたＩＳＳ Ｋ２スペクトル蛍光分光計（４９０ｎｍでの励起、および、５３０ｎｍでの発光）で垂直偏波光散乱強度を用いて連続的にモニターした。緩衝液と溶液（２ｍＬ）中にペプチドを含むキュベットを、撹拌棒で速度８０ｒｐｍで撹拌した。
【００４９】
低分子量のＡβ1-40の溶液濃度の間接凝集測定ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析のために、６０μｌのアリコートを、１５,０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。５０μＬの上清をにシラン化したマイクロオートサンプラーバイアルに移し、溶液中に残存し、続いて自発凝集したＡβ１−４０単量体を測定した。２回のＨＰＬＣ方法を行った。第一回目は、注入容量が２０μＬのウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）のデルタ−パック（Ｄｅｌｔａ−ｐａｋ）Ｃ１８カラム（１５０×４.６ｍｍ，５μｍの固定相，３００Åの孔サイズ）を用いた。この方法では、２１４ｎｍでのＵＶ検出（ウォーターズの９９６フォトダイオードアレイ検出器）を備えたウォーターズのアライアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）ＨＰＬＣシステムが用いられた。１０分にわたって直線状に、７０％水、３０％アセトニトリル（いずれも０.１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸を含む）から、６０％水、４０％アセトニトリル、および０.１％トリフルオロ酢酸ｖ／ｖ／ｖへの勾配を、室温で、流速１ｍｌ／分で適用した。次のサンプルを注入する前に、カラムを元の組成に６分間再平衡化した。第二の方法では、均一濃度の移動相（７３％水、２７％アセトニトリル、０.１％トリフルオロ酢酸ｖ／ｖ／ｖ）と、フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）Ｃ１８ルナ（Ｌｕｎａ）カラム（２５０×２.１ｍｍ，５μｍ）を用いた。この方法では、パーキン・エルマー・シリーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ）２００ポンプと、ウォーターズの９９６フォトダイオードアレイ検出器（２１４ｎｍ）を備えたオートサンプラーを用いた。カラムは４５℃、流速は０.４ｍＬ／分とした。サンプル（１５μＬ）を注入した；Ａβ１−４０単量体の保持時間は、第一の方法では約５分間とし、第二の方法では６分間とした。標準Ａβ１−４０溶液（ＤＭＳＯ中約１００μＭ）を用いてＡβ1-40単量体の定量を較正し、その濃度は、アミノ酸分析で測定された。この標準を液体窒素下で保存した。５点の標準曲線（１／ｘを量った）を用いて濃度を計算した。定量の下限は、約１.７μＭであった。
【００５０】
円二色性（ＣＤ）分光分析による凝集の測定
Ａβ１−４０溶液中で生じるコンフォメーション変化のカイネティクスを、ＣＤ分光分析で、２種の異なるペプチド濃度（５０および８０μＭ，ダルベッコＰＢＳ中）でモニターした。環状の振盪器で、９６ウェルプレートの連続したウェルから、１２０μＬのアリコートを設定した時間の間隔で取り出し、光路長０.５ｃｍの円柱状の石英ＣＤセルに移した。ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）（イーストン，メリーランド州）のＪ−７１５分光光度計を２３℃で用いてスペクトルを得た。緩衝液のＣＤスペクトルも２３℃で集めた。ＣＤ応答をアンモニウム−ｄ−カンフル−１０−スルホネートで較正した。遠紫外線ＣＤスペクトルを、１９３〜２６０ｎｍで、応答は０.２５秒、スキャン速度は１００ｎｍ／分、解像度および帯域は１.０ｎｍ、８回累積のスキャンで集めた。下限の波長はＣｌ-吸収により、１９５ｎｍ未満されたが、他の反応速度論実験との整合性を得るためにＮａＣｌが必要であった。
【００５１】
主成分の回帰分析（Ｂｌｏｗ，Ｄ.Ｍ.，（１９９４年））を用いたコンフォメーション分析のために、バックグラウンドを差し引いたＣＤスペクトルを、グラム／３２にインポートした。公共データベースから得られた二次構造が既知の１６種の異なるタンパク質に関するＣＤスペクトルの基底系を用いて、Ａβ１−４０の二次構造の推定を決定した。この方法を、ギャラクティック・インダストリーズ（Ｇａｌａｃｔｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，セーラム，ニューハンプシャー州）から入手された市販のソフトウェアパッケージ（ＰＬＳｐｌｕｓ／ＩＱバージョン３.０２）で稼動できるように適合させた。基底系は、１９５〜２６０ｎｍの範囲の、解像度２ｎｍの、単位Δε（リットル／モルｃｍ）の平均軸対称ＣＤデータと、αへリックス，パラレルおよびアンチパラレルβシート、βターンおよびその他のランダム構造に関するＸ線結晶学的二次構造パーセンテージからなる。各ライブラリー項目から平均スペクトルを差し引くことによって、基底系データを平均軸対称化した。５つのファクターにより、実験で得られた二次構造パーセンテージと既知の二次構造パーセンテージとの最適な一致を得た。Ａβ１−４０のコンフォメーションのパーセンテージを推定するために、実験で得られたＣＤスペクトルを２ｎｍ解像度に平均して、単位Δε（リットル／モルｃｍ）に変換し、５つの最も重要な主成分を用いて分析した。
【００５２】
蛍光偏光法によるＡβ凝集の測定
ペプチドが成長するフィブリルへ付着することによって、ペプチド上のあらゆる蛍光団の回転性の移動性が変化するはずであり、従って、標識されたアミロイドペプチドの蛍光の偏光は、凝集を検出および定量するための高感度プローブのはずである。従って、我々は、凝集検出のために、共有結合したフルオレセイン分子（アドバンスト・バイオコンセプト）を有するＡβ１−４０を、標識されていないＡβ1-40と混合して用いた。
【００５３】
適所に偏光光学ヘッドを備えたＢＭＧフルオスター・ギャラクシー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ
Ｇａｌａｘｙ）プレートリーダーを用いて、フルオレセインで標識されたＡβ１−４０の凝集を試験した。励起光学で４８０ｎｍフィルター（１２ｎｍ帯域）を用い、２つの発光光路で一対の整合５２０ｎｍフィルター（３５ｎｍ帯域）を用いた。３種の異なる濃度で５つ複製したＡβ１−４０のＰＢＳ溶液（１０、２５、および５０μＭ）を、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の黒色の不透明な９６ウェルプレート（パート＃３９１５）のウェルに付した。読み取り１回あたり平均して５０回のキセノンフラッシュランプのフラッシュを用いて、位置決めのディレイを１秒で、各ウェルを読み取るように装置の操作手順を確立した。器具のゲインをフルオスター・ソフトウェアのマニュアルに従って設定した。偏光強度の読み取りをゼロ時間で測定し、プレートを取り出し、環状の振盪器で撹拌した。外部装置による凝集分析のための正確な条件が予め確立されていたために、装置の振盪器の代わりに外部の環状の振盪器を用いた。プレートを７分間撹拌し、取り出し、プレートリーダーに戻して置き、各ウェルのさらなる偏光の読み取りを記録した。この方法で、２００分間にわたり凝集のカイネティクスを記録した。
【００５４】
結果
我々はまず、４０５ｎｍで濁度によりモニターした代表的なＡβ凝集の時間依存性分析した。Ａβの自発的凝集に関する曲線の形（図１に示す）は、タンパク質の直鎖状の凝集に関して提案されたものを暗示しているが（Ａｉｎｓｚｔｅｉｎ，Ａ.Ｍ．（１９９４年），Ｔｏｂａｃｍａｎ，Ｌ.Ｓ，（１９８３年），Ｖｏｔｅｒ Ｗ.Ａ.，（１９８４年），Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ.Ａ.，（１９８３年））、誘導期間は、アクチンまたはチューブリンのいずれかで観察されたものよりずっと長い。これは、開始ペプチド種それ自体はフィブリル形成を開始させることができないことと、活性単量体誘導体がゆっくりと形成されることにより凝集が生じなければならないことを示す。しかしながら、活性化工程が凝集よりずっと速く、独立した反応速度論プロセスとして扱うことができるアクチンおよびチューブリンの場合とは異なり、Ａβ凝集は、極めてゆっくりとした活性化、それに続く比較的迅速な凝集を経て進行するようである。様々な反応速度論モデルを用いて実験した後、我々は、上述されたモデルに到達した。
【００５５】
実験のポイントと、最も適合した定数を用いて計算された理論曲線との一致（図１）は、モデルの適合を示す。同図において、我々はまた、様々な反応速度論的に競合する種の計算された濃度も示す。どの時間においても、ＡＭは、総ペプチド濃度のほんの少量の分画を示すこと（この実験において、２.６μＭ対５０μＭ）、および、ＡＭは濃度が反応中に最大値を経過する唯一の種であることを特記する。
【００５６】
アクチンに関して直鎖状の重合における濁度と濃度との比例関係がすでに確立されているが（Ｔｏｂａｃｍａｎ，Ｌ.Ｓ.（１９８３年））、我々は、並行実験で、溶液からの低分子量の出発原料の消失に関して、Ａ405測定と、ＨＰＬＣで得られた測定とを比較することによって、我々のシステムのその妥当性を確認した。結果を図２に示す。両方のデータ群は、方程式１〜４で説明されたモデルと一致しており、分析により、相当する速度定数を得た（表１に示す）。
【００５７】
【表１】
【００５８】
濁度によって測定された振盪凝集のカイネティクスも、ＣＤ検出によって測定されたものと比較した。並行実験の結果を図３に示す。再度、両方のデータ群は我々の反応速度論
モデルと一致しており、上記分析より、表１に示された速度定数が得られた。
【００５９】
Ａβ1-40のＣＤスペクトルを、凝集時間の関数として記録し、その結果を図４に示す。Ａβ1-40凝集中に回収したＣＤスペクトルの主成分分析により、無秩序なコイル構造のわずかなロスと、付随するアンチパラレルβシート構造の増加が明らかになった。コンフォメーション分析によっても、βターン構造のわずかな増加が示された。βターン構造の出現時間は、凝集プロセスの開始に対応しており、これは、我々が検出にＩＲを用いても観察した（データは示さず）。
【００６０】
蛍光偏光検出
振盪で誘導されたフルオレセイン標識Ａβ１−４０の凝集の、ペプチド濃度依存性を決定した（図５の右のパネルで示す通り）。凝集により、強度の変化を起こすことなく最大の変化で安定状態の異方性が２倍に増加した。これらのデータも、実験データ点と、方程式１〜４と表１で示された最も適合したパラメーターを用いて計算された理論曲線との間の一致で証明された反応速度論モデルと一致していた。４種の異なる実験検出方法で観察された反応速度論の挙動の一致は、反応の全体の時間経過中に観察可能な主要な種は、低分子量の出発原料と凝集体のみであることを示している。その他のあらゆる中間体種は、実験上のエラーを生じることなく検出不可能な低い濃度でなければならない。
【００６１】
ペプチド濃度の凝集への効果
凝集のカイネティクスに対する開始ペプチド濃度の効果を、濁度および蛍光異方性を同時に測定することによって決定した。２種のペプチド濃度での濁度測定からの結果を図５の左のパネルに示す。方程式１〜４によるデータの非線形最小二乗法分析により、速度定数が得られ（表１に示す）、これらは、開始Ａβ１−４０濃度に非依存性である可能性が最も高い。速度定数の非依存性は、反応速度論モデルの妥当性の最大限の裏付けを構成する。
【００６２】
Ａβの活性種が最大になる時点を計算することが可能であるが、単に、自発的に凝集するＡβ溶液のアリコートを分取し、そのアリコートをａｐｏＥ４への結合に利用することもできる。我々の場合、これは、上述された緩衝液条件下で完全に脱凝集した単量体から開始させた場合、約６０分でみられた。
【００６３】
ａｐｏＥ４およびその他のＡｐｏＥアイソフォームの作成
本発明の分析を行うために、活性化Ａβポリペプチドに関するａｐｏＥ４結合パートナーを単離することが必要である。ａｐｏＥアイソフォームの組換え法による作成は記載されている（Ｍｏｒｒｏｗ ＪＡ等（１９９９年））。本発明において、我々は、結合パートナーとしてのａｐｏＥ４を作成する手段として適切な手法を説明する。当然のことながら、その他の手段も利便性に劣るとしても適切である。例えば、ヒト血清またはＣＳＦからのａｐｏＥ４を、原料源として精製、単離してもよい。Ｍｏｒｒｏｗ等はエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で生産した組換え材料を利用しているが、当然のことながら、実質的には、あらゆる組換えタンパク質生産システムが同様に適切である。我々はまた、その他のａｐｏＥアイソフォームの作成も説明する。我々が記載する分析法によって、その活性化Ａβとの複合体形成における脂質化ａｐｏＥ４の優先的な特異性が示されたことから、このようなその他のアイソフォームは、コントロールポリペプチドとして適切である。
【００６４】
下記の実施例２において、我々は、ヒトａｐｏＥアイソフォームの高レベルの作成方法を報告する。この方法は、実質的に近年、Ｍｏｒｒｏｗ等によって説明されているが、唯一の変更点は、超遠心分離工程において、リポタンパク質Ｅ分画中の不純物の量を減少させたことである。この方法を用いて、我々は、純度９０％超のマテリアルを日常的に得た
。超純粋なマテリアルが必要な場合、我々は、ａｐｏＥをセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）カラムに再度通過させることにより、純度約９９％のマテリアルが得られる（ただしわずかに回収率が減少する）ことを見出した。
【００６５】
実施例２
材料および方法
ａｐｏＥアイソフォームのクローニング、および、発現ベクターの構築
成熟ヒトａｐｏＥに対応する相補ＤＮＡを、脾臓ｃＤＮＡ（クロンテック・ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），パロアルト，カリフォルニア州）から増幅した。増幅反応液は、１０ｍＭのｄＮＴＰ、脾臓ｃＤＮＡ（２ｎｇ）、１×Ｑ溶液（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．），バレンシア，カリフォルニア州）、０.２μＭの各プライマー：
フォワード，５’−ＣＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号３）、
リバース，５’−ＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧＴＣＧＣＴＧＧＧＣＡＣ−３’（配列番号４）、
タックプラス（ＴａｑＰｌｕｓ）高精度ポリメラーゼ（５Ｕ）、および、１×緩衝液（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ラホヤ，カリフォルニア州）を最終容量５０μｌに含む。増幅のためのＰＣＲ条件は、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を３０サイクル、続いて最後の伸長を７２℃で１０分間である。増幅産物をｐｃＤＮＡ３.１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），カールスバッド，カリフォルニア州）にライゲートした。続いて、プラスミドミニプレップ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡサンプルを、ＤＮＡシーケンシング・コア・ラボラトリー（ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で配列解析した。配列解析の結果から、全長の成熟ａｐｏＥ２、および、ａｐｏＥ３のｃＤＮＡクローンが明らかになった。ＡｐｏＥ４のｃＤＮＡを製造するために、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン，ラホヤ，カリフォルニア州）を用いた部位特異的変異誘発をａｐｏＥ３のｃＤＮＡで行い、アミノ酸残基１１２個に対応するコドンをＴＧＣ（ｃｙｓ）からＣＧＣ（ａｒｇ）に変化させた。変異誘発反応液は、ｐｃＤＮＡ３.１−ａｐｏＥ３（５０ｎｇ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ、１×Ｑ溶液（キアゲン社，バレンシア，カリフォルニア州）、各プライマー（１２５ｎｇ）：
フォワード，５’−ＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＧＧＴＧＣ−３’（配列番号５）、
リバース，５’−ＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣ−３’（配列番号６）、
Ｐｆｕポリメラーゼ（２.５Ｕ）、および１×緩衝液を、総容量５０μｌに含む。サイクルパラメーターは９５℃で３０秒、続いて、９５℃で３０秒、５５℃で１分間、および６８℃で１２分間を１２サイクルである。この反応液を３７℃に冷却し、ＤＰＮ Ｉ（１０Ｕ）を加え、親ＤＮＡの消化を３７℃で１時間行った。変異させたＤＮＡ（１.５μｌ）で、ＤＨ５αＦＴ細胞（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ロックビル，メリーランド州）を形質転換した。それに続くミニプレッププラスミドＤＮＡの配列解析の結果によれば、成熟ａｐｏＥ４をコードするｃＤＮＡを含む数種のクローンが示された。
【００６６】
次に、成熟ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３、およびａｐｏＥ４に関するｃＤＮＡを、エシェリキア・コリ発現ベクターｐＥＴ３２ａ（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．），マジソン，ウィスコンシン州）にクローニングし、これを、ＢａｍＨＩ制限部位に対して５’側に隣接してトロンビン切断部位が導入されるように、以前に説明された通りに改変した（１７）。この改変は、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン，ラホヤ，カリフォルニア州）を用いた２段階工程で達成した。第一に、ヌクレオチドＣＣＡ ＣＧＣ（それぞれｐｒｏとａｒｇをコードする）を、ＢａｍＨＩ部位に対して５’側に隣接して挿入し、この挿入に用いられたプライマーは：
５’−ＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＡＴＣＣＣＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧ−３’（配列番号７）、
５’−ＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号８）、
であり、第二に、ヌクレオチドＣＴＧ ＧＴＡ（それぞれｌｅｕとａｒｇをコードする）を、挿入したヌクレオチドの第一群に対して５’側に隣接して挿入した。この挿入に用いられたプライマーは：
５’−ＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’（配列番号９）、
５’−ＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１０）、
であり、上記挿入それぞれのための変異誘発反応液は、ｐＥＴ３２ａプラスミド（１０ｎｇ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ、各プライマー（１２５ｎｇ）、Ｐｆｕポリメラーゼ（２．５Ｕ）、および、１×緩衝液を、総容量５０μｌに含む。サイクルパラメーターは、９５℃で３０秒、続いて、９５℃で３０秒、５５℃で１分間、および、６８℃で１２分間を１８サイクルである。各反応液を３７℃に冷却し、ＤＰＮ Ｉ（１０Ｕ）を加え、この反応液を３７℃で１時間インキュベートした。変異させたＤＮＡ（１.５μｌ）で、ＤＨ５αＦＴ細胞を形質転換した。続いて、コア・シーケンシングで、正しく挿入されたトロンビン認識配列を含む数種のクローンが同定された。次に、ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３、および、ａｐｏＥ４に関するｃＤＮＡを、改変されたｐＥＴ３２ａベクターのＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位でライゲートした。
【００６７】
ヒト組換えＡｐｏＥアイソフォームの発現
ＡｐｏＥ２、ａｐｏＥ３、およびａｐｏＥ４のＤＮＡで、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。大量発現と精製のために、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地（１００ｍｌ）に各クローンを播種し、ＯＤ600が０.６に達するまで振盪器で３７℃でインキュベートし、上記ＯＤに達した時点で細胞を氷上で冷却し、４℃で一晩保持した。翌朝に細胞を、ＳＬＡ−１５００ローターを用いて４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む新しいＬＢ培地（１００ｍｌ）中で再懸濁した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む新しいＬＢ培地（２リットル）に、再懸濁した細胞（３５ｍｌ）を播種し、ＯＤ600が０.６に達するまで振盪器で３７℃でインキュベートした。次に、細胞をＩＰＴＧ（最終濃度１００ｍｇ／ｍｌ）で２時間誘導した。細胞を再度遠心分離し、得られたペレットを必要になるまで−８０℃で保存した。
【００６８】
ＡｐｏＥアイソフォームの単離および精製
上述した通りに得られた細胞ペレットを再懸濁し（これを、以下、懸濁緩衝液という（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、および、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、ベスタチン、ロイペプチンおよび１Ｍベンズアミジンを含む０.５ＭのＮａＣｌ））、次に、フレンチプレスを用いて溶解させた。得られた溶解産物のｐＨを２Ｍトリスを用いて８.０に調節し、このサンプルを１１０００×ｇで５０分間で遠心分離した。上清を分離し、予め懸濁緩衝液で平衡化したＮｉ−ＩＭＡＣカラム（２０ｍｌ）にローディングした。次に、このカラムを、溶出液のＯＤ280が０.８未満に下がるまで懸濁緩衝液で洗浄した。その時点で、７５ｍＭイミダゾールを含む懸濁緩衝液を用いて、カラムを洗浄し、溶出液のＯＤ280が０.７未満に下がるまで洗浄を続けた。次に、このカラムを、カラム容量の２倍量のイミダゾール非含有懸濁緩衝液で洗浄し、その後、ＡｐｏＥ融合タンパク質を、３００ｍＭイミダゾールを含む懸濁緩衝液を用いて溶出させた。５０滴分の画分を回収し、ＯＤ280値が１.８超の画分をプールし、２０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3中で透析した。
プールのタンパク質濃度をＢＣＡ分析法で測定し、トロンビン切断用に準備するまでサンプルを−８０℃で保存した。
【００６９】
ａｐｏＥアイソフォームのトロンビンによる切断
融合タンパク質をトロンビンで切断する前に、ａｐｏＥ配列中に存在する天然に生じるトロンビン切断部位を保護する必要があった。これは、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）（シグマ，セントルイス，ミズーリ州）の小さい単一膜小胞と共に融合タンパク質をインキュベートすることによって達成された。ＤＭＰＣ（１２０ｍｇ）を、５０ｍｌガラス製コニカルチューブ中でクロロホルム（３ｍｌ）に溶解させた。窒素流下でチューブの壁で脂質を乾燥させた。脂質が乾燥したように見えたら、チューブを５０℃の水浴で交替で加熱し、溶媒が完全に蒸発するまでＮ2でフラッシングした。溶媒が除去された後、２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（１２ｍｌ）を加え、チューブを５０℃の水浴で１時間インキュベートし、超音波破砕水浴に１０分間置いた。これにより、リン脂質をチューブ壁から分散させ、極めて大きな多重膜小胞（ＭＬＶ）の乳状の懸濁液を調製した。ヒート・システムズ（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ソニケーター・モデルＸＬ−２０２０（ミソニックス（Ｍｉｓｏｎｉｘ），ファーミングデール，ニューヨーク州）を、パワー９０Ｗで４５分間、１.５分のインターバルで３分のバースト、プローブ浸漬４分で稼動させて用いてＭＬＶ分散液を超音波破砕することによって、小さい単一膜小胞（ＳＵＶ）を調製した。超音波破砕容器を氷水で冷却し、マテリアルの過熱を防いだ。超音波破砕後、金属断片（プローブから）を、４０,０００ｒｐｍで、１５℃で２０分間の遠心分離によって除去した。ＤＭＰＣ−ＳＵＶを、即座に、約３.８／１（脂質／タンパク質，ｗ／ｗ）の割合で上述の融合タンパク質調製物に加え、２４℃で一晩インキュベートした。次に、トロンビンを、脂質タンパク質複合体に、１／１０００（トロンビン／融合タンパク質，ｗ／ｗ）の割合で加え、切断反応を室温で３０分間進行させた。β−メルカプトエタノール（最終濃度０.１％）の添加によって反応を止め、この混合物を固体ＫＢｒで密度１.２２５に調節し、ＴＬＳ−５５ローター（ベックマンインスツルメンツ社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．），パロアルト，カリフォルニア州）を用いて、５５,０００ｒｐｍで４４時間遠心分離することによってリポタンパク質分画を単離した。チューブをスライスすることによって上部の０.３ｍｌを除去し、このようにして得られたリポタンパク質分画を、２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムに対して透析し、凍結乾燥した。
【００７０】
ＦＰＬＣによるａｐｏＥの精製
２：１のクロロホルム：メタノールを用いて凍結乾燥したリポタンパク質を脱脂化した。タンパク質ペレットを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０.１Ｍトリス（ｐＨ７.４）緩衝液（０.０１％ＥＤＴＡ、および、１％β−メルカプトエタノールを含む）に一晩可溶化し、このタンパク質溶液を０.４５ミクロンのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターでろ過し、４Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０.１Ｍトリス（ｐＨ７.４）緩衝液（０.０１％ＥＤＴＡ、および、０.１％β−メルカプトエタノールを含む）で平衡化した、直列に（底と底で）連結させた２つの２.６×６０ｃｍ ハイプレップ（ＨｉＰｒｅｐ）セファクリルＳ−３００カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ），ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にかけた。カラムクロマトグラフィーをＦＰＬＣシステム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）で行った。このカラムにサンプルを１２ｍｌ／時間で注入し、カラム流速を３０ｍｌ／時間とした。カラム溶出液の吸光度を２８０ｎｍでモニターした。所定の吸光度ピークを形成する分画を個々に１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムに対して透析し、タンパク質濃度をＢＣＡ方法（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ），ロックフォード，イリノイ州）で測定し、分画の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタン分析で測定した。
【００７１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＭＥＳ泳動緩衝液中でノヴェックス（Ｎｏｖｅｘ）ＮｕＰＡ
ＧＥ４−１２％ビス−トリスゲルを用いて行われた。ゲルを２００ボルトで３５分間泳動した。ゲルを固定し、ノヴェックスのコロイダルブルー染色キットを用いて染色した。ウェスタン分析のために、タンパク質を、ＮｕＰＡＧＥトランスファー緩衝液中でニトロセルロース（０.２μｍ孔サイズ；ノヴェックス，カールスバッド，カリフォルニア州）に移した。このトランスファーを３０ボルトで１時間泳動した。メンブレンを、振盪しながら、室温で１時間、ブロッキング緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ８.０），２ｍＭのＣａＣｌ2、８０ｍＭのＮａＣｌ、５％乾燥脱脂乳、０.２％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、および、０.０１％アンチフォームＡ）に置いた。メンブレンを、ヤギ抗カニクイザルａｐｏＥ（１２）（ブロッキング緩衝液で１：１０００に希釈）と共に、室温で１時間インキュベートした。メンブレンを、ブロッキング緩衝液で１５、５および５分間連続的に３回洗浄し、続いて、ＨＲＰ標識マウス抗ヤギＩｇＧ（ブロッキング緩衝液で１：５０００に希釈）の存在下で、５０分間インキュベートした。メンブレンを、ブロッキング緩衝液で１５、５、５および５分間連続的に４回洗浄し、続いて、ＥＣＬ検出試薬（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）の存在下で１分間浸し、その後、ハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）に露光した。
【００７２】
精製したＡｐｏＥの脂質化
精製したａｐｏＥアイソフォームを上述した通りに得た。１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）の小さな単一膜小胞（アバンティ・ポーラー・リピッド（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ），カタログ番号８５０４５７）と共に、精製したａｐｏＥアイソフォームをインキュベートすることによって、ａｐｏＥの脂質化を行った。４０ｍｌガラス製コニカルチューブ中でＰＯＰＣ（１２０ｍｇ）をクロロホルム３ｍｌに溶解させた。窒素流下で、チューブ壁上で脂質を乾燥させた。脂質が乾燥したように見えたら、チューブを５０℃の水浴で加熱し、溶媒が完全に蒸発するまでＮ2でフラッシングした。溶媒を除去した後、２０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3（１２ｍｌ）を加え、チューブを５０℃の水浴中で１時間インキュベートし、次に、超音波破砕の水浴に１０分間置いた。次に、このインキュベート手法を１回繰り返した。これにより、リン脂質をチューブ壁から分散させ、極めて大きな多層小胞（ＭＬＶ）の乳状の懸濁液を調製した。ヒート・システムズのソニケーターモデルＸＬ−２０２０（ミソニックス）を、パワー９０Ｗで４５分間、１.５分のインターバルで３分のバースト、プローブ浸漬４分間で稼動させて用いてＭＬＶ分散液を超音波破砕することにより、小さい単一膜小胞（ＳＵＶ）を調製した。超音波破砕の容器を氷水で冷却し、マテリアルの過熱を防いだ。超音波破砕後、金属断片（プローブから）を、４０,０００ｒｐｍで２０分間、１５℃の遠心分離によって除去した。即座に、ＰＯＰＣ−ＳＩＴＶを、ａｐｏＥ、または、コントロールとしてウシ血清アルブミン（シグマ，カタログ番号Ａ７０３０）に約３〜８／１（脂質／タンパク質，ｗ／ｗ）の割合で加え、２４℃で１７.５時間インキュベートした。サンプルを４℃で保存し、２４時間後にＡβ１−４０との相互作用研究に用いた。
【００７３】
実施例３
調整細胞培地からのＡｐｏＥの単離
ネオマイシン耐性下で選択した、ヒトａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３、またはａｐｏＥ４のｐｃＤＮＡで安定してトランスフェクトしたヒト星状細胞腫細胞からヒトａｐｏＥを含む培地を分離した。細胞が５０％および８０％密度になったら培地交換して、その３日間後に血清非含有培地を回収し、タンパク質分解を防ぐために培地にプロテアーゼ阻害剤（完全プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット，１タブレット／５０ｍｌ培地，ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を添加した。サンプルを−２０℃で保存した。ＭＷカットオフが１０ｋＤａのセントリコン・プラス（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ）−８０遠心分離フィルター（アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．））で、大量の培地の濃縮を行った。調整培地中でａｐｏＥ２が低レベルであったため、同様にＭＷカットオフが１０ｋＤａの小量用のセントリコンＹＭ−１０遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．）でａｐｏＥ２培地をさらに濃縮した。ＡｐｏＥ３およびａｐｏＥ４培地を３０〜５０倍に濃縮し、ａｐｏＥ２は約１００倍に濃縮した。トランスフェクトされていない星状細胞腫細胞調整培地も同じ方法で濃縮し、バックグラウンド決定に用いた。脂質フロテーション超遠心分離に必要になるまで培地を−２０℃で保存した。
【００７４】
超遠心による調整培地脂質フロテーション
調整培地中で脂質化されたａｐｏＥを得るための超遠心分離手法をＨａｖｅｌ（１９８７年）の改変プロトコールを用いて行った。濃縮調整培地を、固体ＫＢｒで密度１.２２５に調節した（固体ＫＢｒ０.７０６ｇを培地２ｍｌに加え、ＮａＣｌ塩溶液（１.２２５ｇ／ｍｌ）２.３ｍｌを加えて、液体の高さを高めた）。ＴＬＳ−５５ローター（ベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を用いて、２４時間、１５℃で、５５,０００ｒｐｍで遠心分離することによってリポタンパク質画分を単離した。チューブをセントリチューブ・スライサー（ベックマン・インスツルメンツ）でスライスすることによって、上部の０.３ｍｌを除去した。ＭＷカットオフが１０ｋＤａのスライド−Ａ−ライザー透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ）（ピアース）を用いて、脂質に結合したａｐｏＥ粒子を含む上層と、脂質化されていないａｐｏＥを含む底の層を、ＤＰＢＳに対して透析した。我々は、組織培養由来のａｐｏＥ４は、新鮮なもの用いることが好ましく、マテリアルを凍結すると活性が失われることを見出した。
【００７５】
活性化ベータアミロイドペプチド種と、脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドとの結合を評価する分析法
上述したように、ａｐｏＥは、直接的なタンパク質−タンパク質相互作用によってＡβの沈着またはクリアランスに関与すると考えられている。直接サンドイッチＥＬＩＳＡにより、３種の主要なａｐｏＥアイソフォーム（ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３、ａｐｏＥ４）と、自発的凝集の様々なフェーズで得られたＡβ１−４０との相互作用が検出された。しかしながら、精製した脱脂質化ａｐｏＥは、０分でＡβの中間凝集型とのみ結合する相互作用を示し、アイソフォーム特異的な差はみられなかった。しかしながら、ａｐｏＥが生物学的な脂質のパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（生物学的に活性な型のａｐｏＥ）と結合すると、ａｐｏＥ４は、ａｐｏＥ２およびａｐｏＥ３よりも高い結合活性で中間活性Ａβに結合した。この相互作用を、ａｐｏＥのＮ末端に対するエピトープを有するＥＬＩＳＡキャプチャーａｐｏＥ抗体で検出した。キャプチャーにＣ末端ａｐｏＥ抗体を用いたところ、検出可能な結合がないことを実証した。以下に述べるように、これらは（用いられた抗体の既知の結合特異性の観点で）、ａｐｏＥ４の、Ａβ活性型との相互作用は、ａｐｏＥ４のアミノ酸残基２４３〜２７２の周辺に属することを示す。
【００７６】
ａｐｏＥ遺伝子型に関して識別されるＡＤの危険性は、ａｐｏＥ４のＡβの中間活性型への結合能力が高められた結果という可能性がある。そのようなものとして、この相互作用の崩壊は、ＡＤに罹りやすいａｐｏＥ４キャリアーで蓄積された脳のＡβ斑を減少させる可能性がある。ａｐｏＥ４とＡβとの相互作用を止めさせることは、ＡＤ治療のための代替の治療的アプローチを提供することになり、薬物の介入またはａｐｏＥ４への免疫化によって達成することができる。
【００７７】
実施例４
Ａβ１−４０の凝集型とのＡｐｏＥ複合体形成
ＬａＤｕによって行われたペプチドの濃度比率と同様にして結合反応を行った。精製し、ＰＯＰＣ脂質化ａｐｏＥしたアイソフォームを１００ｎＭに希釈した ＤＰＢＳ（改変ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（０.０１５Ｍリン酸ナトリウム，０.００３Ｍリン酸カリウム，０.２９Ｍ塩化ナトリウム，０.０１Ｍ塩化カリウム，ｐＨ７.４）、および、各調製物５００μｌを別個の１４ｍｌ滅菌ポリスチレン丸底チューブ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））に入れた。コントロール条件は、精製したａｐｏＥ媒体（２０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3）、および、ＢＳＡ ＰＯＰＣ（いずれもＤＰＢＳで希釈）を利用した。凝集Ａβの１４〜１８ウェルの内容物をそれぞれ０分、６０分、８０分、および１１０分の凝集インターバルでプールした。Ａβ（５００μｌ）を、即座に、ａｐｏＥおよびコントロールに加え、インキュベート混合物中で最終濃度をＡβ１−４０は２５μＭ、ａｐｏＥは５０ｎＭにした。ニューテーター（Ｎｕｔａｔｏｒ）（クレイ・アダムス（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ））で、混合物を室温で２時間おだやかに揺すった。サンプルを、即座に、複合体形成を検出するための直接サンドイッチＥＬＩＳＡに加えた。
【００７８】
直接サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたＡβ１−４０の凝集型とのＡｐｏＥ複合体形成の検出
液相直接サンドイッチＥＬＩＳＡで、脂質化ａｐｏＥとＡβ１−４０との相互作用を評価した。この相互作用を様々な抗ａｐｏＥ抗体で特徴付けた。ａｐｏＥの２９９個のアミノ酸残基のＮ末端を認識する抗体は、残基１〜１５を認識するマウスモノクローナル抗体６Ｃ５（オタワ・ハート・インスティテュート・リサーチ社（Ｏｔｔａｗａ Ｈｅａｒｔ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．），オタワ，オンタリオ）、および、Ｎ末端ドメイン中の非特異化エピトープを認識するマウスモノクローナル抗体９Ｈ８−Ｇ５．Ｆ２（バイオデザイン・インターナショナル（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））である。Ｃ末端の認識のために、マウスモノクローナル抗体３Ｈ１（オタワ・ハート・インスティテュート・リサーチ社，オタワ，オンタリオ）は、残基２４３〜２７２内のエピトープと結合する。ａｐｏＥを５０μｌ／ウェルで捕獲するために、ＥＬＩＳＡの１／２ウェルの平底９６ウェルプレート（コーニング）を、３種のマウスモノクローナル抗体（６Ｃ５［２μｇ／ｍｌ］、９Ｈ８．Ｇ５．Ｒ２［２μｇ／ｍｌ］、および、３Ｈ１［１μｇ／ｍｌ］）のうち一種でコーティングした。全ての抗体を１００ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3で調整し、４℃で一晩インキュベートした。ＤＰＢＳ中；１００μｌ／ウェルで１％ＢＳＡを用いてプレートを４℃で一晩ブロックした。複合体反応が完了した後、Ａβ１−４０の凝集型を用いたＡｐｏＥおよび媒体コントロール反応液を、抗ａｐｏＥ抗体をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加え、プレートを４℃で一晩インキュベートした（５０μｌ／ウェル）。結合したＡβ１−４０を、ＤＰＢＳ中の１％ＢＳＡで希釈したビオチン化マウスモノクローナル抗Ａβ抗体４Ｇ８（０.５μｇ／ｍｌ，Ａβ１−４０の残基１７〜２４を認識，シグネット（Ｓｉｇｎｅｔ））で検出し、室温で２時間インキュベートした（５０μｌ／ウェル）。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ，［０.１μｇ／ｍｌ］，ピアース）に結合したニュートラビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）を、ビオチンと６０分間反応させた（５０μｌ／ウェル）。５０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（キルケゴール＆ペリー（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ））を２〜５分間添加して、ＨＲＰで変換されて着色した最終産物が生成され、１ＭのＨ3ＰＯ4（２５μｌ／ウェル）を用いて反応を止めた。着色した終点を、４５０ｎｍの吸光度で、モレキュラー・デバイスのＶｍａｘプレートリーダーを用いて検出した。ＥＬＩＳＡに新しい層を加える前に、スカトロン（Ｓｋａｔｒｏｎ）自動化プレートウォッシャーを用いてウェルをＢｕｐＨ改変ダルベッコＰＢＳ（ピアース）で洗浄した。各処理群を３重複のウェルで行い、非脂質化ａｐｏＥは３〜４回、脂質結合ａｐｏＥは４〜５回、実験を繰り返した。
【００７９】
様々なＡβ１−４０凝集型と、非脂質化、および、脂質結合ＡｐｏＥアイソフォームとの結合相互作用
凝集プロセス中の様々な時点で取られたＡβ１−４０のアリコートをａｐｏＥアイソフォームへの結合に関して評価した。これらのＡＳ形態のいずれか１つの濃度のみが、凝集の全時間経過中最大値を記録したことを示した。ａｐｏＥとＡβ１−４０との相互作用を、０分の開始時の形態と、６０分の凝集したＡβ１−４０を用いて観察した。ＡｐｏＥのＮ末端の抗体６Ｃ５、および、９Ｈ８．Ｇ５．Ｆ２により、脂質化ａｐｏＥの、６０分の凝集したＡβアリコートへの結合の、アイソフォーム特異的な差が検出された（図６Ａおよび６Ｃ）。これら抗体により、ａｐｏＥ２およびａｐｏＥ３に比べて２.２〜３.３倍高い親和性の、ａｐｏＥ４の６０分の混合物への結合が検出された（ｐ＜０.０５）。これらアイソフォーム特異的な差は、非脂質化ａｐｏＥアイソフォームが、６０分の凝集したＡβと相互作用した際は失われた（ｐ＞０.０５）（図６Ｂおよび６Ｄ）。それに比べて、ａｐｏＥのＣ末端の抗体３Ｈ１により、脂質に結合したａｐｏＥの、６０分の凝集したＡβ１−４０に結合する相互作用は、ごくわずかしか検出されなかった（図７Ａ）。これらの観察もまた、アイソフォーム非特異的な相互作用が観察された非脂質化ａｐｏＥでも実証された（図７Ｂ）。興味深いことに、非脂質化ａｐｏＥの、Ａβ１−４０の６０分の凝集した形態への結合は、６Ｃ５，９Ｈ８．Ｇ５．Ｆ２および３Ｈ１抗体を用いて、ａｐｏＥ３およびａｐｏＥ４よりもａｐｏＥ２の結合が高いという傾向を示した（図７Ｂ、７Ｄおよび７Ｂ）。しかしながら、これらの差異は有意ではなかった（ｐ＞０.０５）。また、注目すべきは、６Ｃ５により、脂質に結合したａｐｏＥ、および、非脂質化ａｐｏＥの両方と、０分のＡβ１−４０形態（図６Ａおよび６Ｂ）との相互作用が検出され、ａｐｏＥアイソフォーム特異的な差は観察されなかったことである。さらに、脂質化ａｐｏＥアイソフォームと、非脂質化ａｐｏＥアイソフォームとの結合の強さが類似していることを実証した（ｐ＞０.０５）。脂質化ａｐｏＥの、０分のＡβ１−４０形態への結合も３Ｈ１で検出されたが（図７Ａ）、６Ｃ５の検出よりもわずかに低い規模であった。３Ｈ１抗体を用いて、０分のＡβ１−４０の相互作用がわずかか、または、起こらないことを、非脂質化ａｐｏＥアイソフォームで検出した（図７Ｂ）。
【００８０】
脂質化ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ相互作用の阻害剤の同定
上記実施例でＥＬＩＳＡ分析システムを説明したが、その他の多数のシステムがこの相互作用の測定に適している。この目的のために、複合体中のパートナーの少なくとも１つに関して簡易検出システムが利用可能であるべきである；このような検出システムとしては、抗体に基づくもの、または、マーカー分子または放射活性で標識したタンパク質に基づくものが可能である。二択的なこの分析法の使用としては、ＡｐｏＥ４と活性化Ａβとの相互作用を調節し得る物質に関して化合物コレクションをスクリーニングことが可能である。
【００８１】
溶液分析において、本発明の方法は、（ａ）ＡｐｏＥ４またはＡβポリペプチドと、１またはそれ以上の候補阻害剤化合物とを接触させる工程、および、（ｂ）ＡｐｏＥ４−Ａβ複合体を減少させる化合物を同定する工程を含む。上記結合を減少させる物質。ＡｐｏＥ４−活性化Ａβの複合体を形成する性質を調節する化合物の選択性は、その他のタンパク質−タンパク質相互作用に対するその効果を比較することによって評価することができる。
【００８２】
ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体形成の阻害剤は、正常または異常なアミロイド沈着が関与する病気および生理学的な症状の治療において、治療上有用である可能性がある。
【００８３】
ＡｐｏＥ４−活性化Ａβの相互作用を測定するのに有用なことが証明できる分析法は当業界周知であり、例えば、ただしこれらに限定されないが、以下のものが挙げられる：平衡またはメンブレンフロー透析、抗体結合分析、ゲルシフト分析、インビトロの結合分析、フィルター結合分析、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、共免疫沈降反応、イムノゴールド共免疫沈降反応、共免疫定位、共結晶化、蛍光エネルギー移動、競合結合分析、化学的な架橋、および、親和性による精製。
【００８４】
ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ相互作用に作用する抗体などの化合物は、以下の病状：アルツハイマー病、パーキンソン病気、多発性硬化症，ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、
頭部の外傷によるダメージ、ピック病、前頭葉型痴呆、小脳の変質、虚血再潅流の障害、卒中、虚血性障害、および、統合失調症を含む病気の治療に有用な治療剤である。
【００８５】
実施例５
阻害剤を検出するためのインビトロの結合分析法
ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体形成をモニターする分析法は、その相互作用の阻害剤をスクリーニングするのに有用である。結合分析は、理論上、２つの形態の一方をとる：Ａβポリペプチドは、ＡｐｏＥ４ポリペプチドへの結合に用いることができ、また逆に、ＡｐｏＥ４ポリペプチドは、Ａβポリペプチドへの結合に用いることができる。いずれの場合においても、加えられる物質の非存在下でポリペプチドの特異的な結合により複合体を形成することができる条件下で、他方のポリペプチドが、固定化したポリペプチドと接触する。特定の水性条件は、従来の方法に従って専門家によって選択することができる。一般的な指示に従って、改変ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（０.０１５Ｍリン酸ナトリウム、０.００３Ｍリン酸カリウム、０.２９Ｍ塩化ナトリウム、０.０１Ｍ塩化カリウム、ｐＨ７.４）に、ニ価カチオン、および／または、金属キレート化剤、および／または、非イオン性界面活性剤、および／または、膜分画を必要に応じて添加した。付加、欠失、改変（例えばｐＨ）、および、変更（例えばＫＣｌのＮａＣｌへの変更、または、緩衝液の変更）を、これら基本条件に対して行ってもよい。コントロール反応でＡβのＡｐｏＥ４への特異的な結合が生じる範囲で、改変を基本的な結合反応条件に対して行ってもよい。このような反応において、典型的には、少なくとも１つのポリペプチド種が検出可能なマーカーで標識される。適切な標識としては、これらに限定されないが、放射標識されたアミノ酸（例えば、14Ｃで標識されたロイシン、3Ｈで標識されたグリシン、35Ｓで標識されたメチオニン）の取り込みによる放射標識、翻訳後の125Ｉもしくは131Ｉでの放射性ヨウ素化による放射標識（例えば、ボルトン−ハンター反応、および、クロラミンＴ）、32Ｐ（例えば、ホスホリラーゼおよび無機の放射標識されたリン酸）での翻訳後のリン酸化による標識、蛍光標識（例えば、フルオレセインまたはローダミン）取り込みによる蛍光標識、または、その他の当業界既知の従来の方法による標識が挙げられる。ポリペプチド種の１種が基質への連結により固定化されている実施形態において、一般的に、その他のポリペプチドは、検出可能なマーカーで標識される。
【００８６】
本発明で説明されたような水性条件下で、標識されたポリペプチドと、固定化ポリペプチドと接触させる。結合反応のインキュベートの時間と温度は、薬剤を存在させないコントロール反応で特異的な結合が生じるように選択された条件で、必要に応じて変化させる。好ましい実施形態では、反応温度は、少なくとも約１５℃、より好ましくは３０〜４２℃、インキュベート時間は、少なくとも約１５秒を用いるが、いくつかの実施形態においては、結合平衡が達成させるように、より長いインキュベート時間、３０秒〜１分〜数分間またはそれ以上も好ましい。結合したＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の結合カイネティクスおよび熱力学的な安定性によって、時間、温度、塩、ｐＨ、および、その他の反応条件の可変範囲が決定される。しかしながら、いずれの特定の実施形態においても、望ましい結合反応条件は、当業界の従来の方法を用いて専門家によって容易に較正することができ、例えば、スキャッチャード分析を用いた結合分析、ヒル分析、およびその他の標準的な分析方法が挙げられる（Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，（１９８４年）Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（編），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク）。
【００８７】
標識されたＡβまたはＡｐｏＥ４ポリペプチドの、それぞれ固定化されたＡβまたはＡｐｏＥ４への特異的な結合は、標識されていない競合タンパク質（例えば、アルブミン）を含ませることによって測定される。同様に、標識されたＡβまたはＡｐｏＥ４それぞれの特異的な結合は、標識されていない競合タンパク質（例えば、アルブミン）を含ませることによって測定される。結合反応が完了した後、固定化ポリペプチドに特異的に結合し
た標識したポリペプチドが検出される。例えば（ただし限定されない）、結合のための適切なインキュベート時間の後、固定化されていないタンパク質を含む水相が除去され、固定化ポリペプチド種を含む基質、および、それに結合したあらゆる標識されたタンパク質は、適切な緩衝液（必要に応じて非標識ブロッキング剤を含む）で洗浄され、洗浄緩衝液を除去する。洗浄後、残存した、特に固定化ポリペプチドに結合した検出可能な標識の量を測定する（例えば、光学的、酵素的、オートラジオグラフィーによる、または、その他の放射化学的方法によって）。
【００８８】
いくつかの実施形態において、非特異的な結合を阻害する非標識ブロッキング剤の添加が含まれ、このようなブロッキング剤の例としては、ただしこれらに限定されないが、以下のが挙げられる：子ウシ胸腺ＤＮＴＡ、サケ精子ＤＮＡ，酵母ＲＮＡ、様々な長さの混合型配列（ランダムまたは偽ランダム配列）オリゴヌクレオチド、ウシ血清アルブミン、非イオン性界面活性剤（ＮＰ−４０，トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００など）、乾燥脱脂乳タンパク質、デンハルト試薬、ポリビニルピロリドン、フィコール、および、その他のブロッキング剤。専門家は、それらの選択において、結合分析で用いるのに適切な濃度でブロッキング剤を選択することができる；しかしながら、反応条件は、コントロール結合反応でＡｐｏＥ４−活性化Ａβの特異的な結合が可能になるように選択される。ブロッキング剤は、標識されたタンパク質の固定化タンパク質への非特異的な結合を阻害し、および／または、標識されたポリペプチドの固定化基質への非特異的な結合を阻害するために含める。当然のことながら、反応の特異性を評価するために、コントロール反応でその他のａｐｏＥアイソフォームを用いてもよい。
【００８９】
ポリペプチドが固定化される実施形態において、基質への共有結合または非共有結合を用いてもよい。共有結合の化学としては、ただしこれらに限定されないが、よく特徴付けられた当業界既知の方法（ＫａｄｏｎａｇａおよびＴｊｉａｎ（１９８６年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ.Ｓ.Ａ.）８３：５８８９）が挙げられる。一例（ただし限定されない）としては、ブロモシアンで誘導体化された基質（例えばＣＮＢｒで誘導体化された セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ）への共有結合が挙げられる。基質による可能性のある立体障害を減少させるスペーサーを用いることも望ましい場合がある。基質へのタンパク質の非共有結合としては、ただしこれらに限定されないが、帯電した表面（例えばビーズ上）へのタンパク質の接着、および、特異的な抗体との結合が挙げられる。
【００９０】
実施形態の１つの分類において、並行した結合反応が行われ、この反応において、反応の１セットがコントロールとして作用し、少なくとも１つの他方の反応のセットに、ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の結合または形成を阻害する能力に関して試験しようとする様々な量の薬剤、薬剤の混合物または生物学的な抽出物を含む。それによって、結合反応に加えた場合に、ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体形成を阻害する物質が阻害剤として同定される。
【００９１】
好ましい実施形態において、数種の結合反応が、例えば、数種のサンプルの同時の分析を可能にする様式（マイクロタイタープレートなど）を用いて、同時にモニターされる。好ましい実施形態において、このような分析は、例えば、サンプルをマイクロタイタープレートにピペッティングするためのロボット技術を用いて、自動化される。
【００９２】
ＡｐｏＥ４またはＡβの、そのパートナーへの結合を検出するための１つの手段は、脂質化ＡｐｏＥ４で誘導されたポリペプチド、または、Ａβポリペプチドのいずれかを、例えば固体支持体への共有結合または非共有結合的な化学結合によって固定化すること、および、固定化脂質化ＡｐｏＥ４またはＡβポリペプチドのいずれかと、検出可能なマーカーで標識された（例えば、放射標識されたアミノ酸の取り込み、蛍光標識された抗−エピトープタグ抗体を用いたエピトープタギングおよびレポーティングなどによって）脂質化ＡｐｏＥ４またはＡβ（必要に応じて）と接触させることである。このようにして接触させることは、典型的には、ＡｐｏＥ４のＡβへの結合が可能な水性条件で行われる。標識された成分の固定化成分への結合は、標識された成分が、特異的な結合の相互作用の結果として固定化される程度を測定することによって測定される。このような特異的な結合は、可逆的でもよいし、または、場合よっては、架橋剤が適切な実験条件で加えられる場合は不可逆的でもよい。
【００９３】
それによって、結合した複合体の形成を阻害する物質は、物質を含まないコントロール結合反応と比較して阻害剤として同定され、これは治療剤候補である。
【００９４】
一実施形態において、結合した標識された複合体と表面との物理的な相互作用が、報告されており、例えば、表面が光体またはシンチラントであり、結合した標識された複合体中の標識が、表面の蛍光体またはシンチラントの活性化に適した放射線を放出する；表面から放出された光が、結合した標識された複合体の相対的な量をレポートする。適切なシステムは、シンチレーション近接分析（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））であり、これにおいて、標識されていない成分が蛍光体を含むビーズに結合する。その他のシステムとしては、「フラッシュプレート」システム（ＬＫＢ）が挙げられる。
【００９５】
変形法において、固定化は必要ではない；脂質化ＡｐｏＥ４−またはＡβのいずれかが、第一の蛍光体で標識され（その第一の蛍光体が放射線（粒子または波動）を吸収し第一の波長で発光または蛍光を放出する）、さらに、他方の成分が、第二の蛍光体で標識される（その第二の蛍光体が、前記第一の波長で放射線を吸収し、それによって第二の波長で蛍光または発光放射線を放出する）。標識された脂質化ＡｐｏＥ４またはＡβ、および、適切な結合パートナーは、適切な結合条件下で、適切な反応濃度でインキュベートされ（第二の波長の放射線の量は、ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の量にほぼ比例する）、第一の波長の放射線（または粒子タイプ）で励起され、および、第二の波長の放出された放射線量が検出される。第二の波長の相対的な放射線量は、脂質化ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の相対的な量を示す。適切なシステムの例は、色素−色素（ｄｙｅ−ｄｙｅ）トランスファーシステム（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ））である。
【００９６】
もちろん、これら分析は、単なる例として示されたものであり、これら方法は改変することが可能であり、また、ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ相互作用を分析するその他の方法も当業者には明白であることと認識されるべきである。
【００９７】
本発明はまた、脂質化ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ相互作用を阻害する化合物を同定するためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）分析を含む。ＨＴＳ分析により、多数の化合物を効率的な方法でスクリーニングすることができる。ａｐｏＥ４−活性化Ａβ相互作用を試験するために、細胞ベースのＨＴＳシステムが考慮される。ＨＴＳ分析は、望ましい特性を有する「ヒット」または「リード化合物」を同定するように設計され、それから望ましい特性が改善されるように修飾を設計することができる。
【００９８】
本発明の分析と本発明で説明された分析で発見された治療剤の代表的な例としては、ただしこれらに限定されないが、タンパク質複合体と結合するタンパク質の欠損型（人工的に加工した、または天然に存在するもののいずれか）、抗体、タンパク質の阻害フラグメント、結合を破壊するタンパク質をコードする野生型および改変遺伝子，小さい有機分子、アンチセンス核酸配列、トリプレックス機構により発現または活性を阻害するオリゴヌクレオチド、ペプチド、アプタマーオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。より特定には、人工的に加工したタンパク質の例としては、ただしこれらに限定されないが、保存された活性部位（例えば、ＡＴＰ結合モチーフ、ＤＮＡまたはタンパク質結合ドメイン、触媒部位など）が不活性化された突然変異、少なくとも１つの阻害ドメインを含む融合タンパク質などを含むタンパク質が挙げられる。
【００９９】
上記薬剤は、多種多様な源から得ることができる。例えば、有機合成の標準的な方法を用いて、特に関連するタンパク質−タンパク質相互作用破壊する小さい有機分子を製造することができる。加えて、莫大な数の化合物（有機、ペプチド、または、核酸であり、Ｇａｌｌｏｐ等，１９９４年，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（９）：１２３３〜１２５１；Ｇｏｒｄｏｎ等，１９９４年，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（１０）：１３８５〜１４０１；および、米国特許第５,４２４,１８６号で総説されており、これら全て、参照により本発明に加入させる）を含むコンビナトリアルライブラリーを、ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ結合に関与するタンパク質−タンパク質相互作用を結合および阻害する能力に関してスクリーニングしてもよい。
【０１００】
詳細な説明などの本願の全内容から、本発明のさらなる特徴および変形は、当業者には明白と思われ、このような特徴は全て、本発明の態様とみなされる。同様に、ここで説明された本発明の特徴は、さらなる実施形態に再構成することもでき、これらも、特徴の組み合わせが、本発明の態様または実施形態として特に上述されているかどうかに関係なく本発明の態様とみなされる。また、本発明で本発明にとって重要である説明された限定のみこのようにみなされるべきであり、本発明で重要と説明されていない限定を含まない本発明の変形は、本発明の態様とみなされる。当然ながら、本発明は、上述の説明および実施例で特に説明されたものとは別の方法で実施してもよい。
【０１０１】
上記の教示から本発明の多数の改変および 変形が可能であり、それゆえに、本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】濁度検出による代表的なＡβ１−４０振盪凝集実験である。
【図２】濁度およびペプチド濃度の時間依存性である。
【図３】ＣＤ検出による自発凝集のカイネティクスである。
【図４】凝集時間の関数としてのＡβ１−４０のＣＤスペクトルにおける変化である。
【図５】凝集に対するペプチド濃度の効果である。
【図６】抗ａｐｏＥのＮ末端キャプチャー抗体を用いたＥＬＩＳＡによる、様々な形態のＡβ１−４０への、脂質化した、および、脂質化されていないａｐｏＥの結合の検出である。
【図７】抗ａｐｏＥのＣ末端キャプチャー抗体３Ｈ１を用いたＥＬＩＳＡによる、様々な形態のＡβ１−４０への、脂質化した、および、脂質化されていないａｐｏＥの結合の検出である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポリポタンパク質Ｅ４（ａｐｏＥ４）と、アルツハイマーＡβペプチドの活性型との相互作用の阻害剤を見出すのに有用な分析方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、細胞外のタンパク質様アミロイド−βペプチド（Ａβ）が老人斑の形態で沈着することに関連する進行性の神経変性で特徴付けられる（Ｓｅｌｋｏｅ，１９９１年）。斑の沈着は、アミロイド形成というプロセスにより単量体Ａβペプチドが自己凝集した結果である。アミロイド形成は、インビトロでは、マイクロモル単位の量の単量体Ａβで開始される（Ｈａｒｐｅｒ，１９９７年）。アミロイド形成において、単量体サブユニットの凝集は、上記ペプチドがまず、直鎖状の凝集体の形成を開始させる唯一の種であり唯一のＡβの神経毒性型であるコンフォーマーをゆっくりと形成する反応速度論モデルと一致する。
【０００３】
アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）は、脂質とコレステロールの輸送、およびＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）を介した脳内でのクリアランスを調節するリガンドであり（Ｂｏｙｌｅｓ １９８９年，Ｃｏｒｄｅｒ １９９３年，Ｆａｇａｎ １９９６年．Ｐｏｉｒｉｅｒ，１９９４年）、これは、ＡＤの脳における斑の沈着に関与することが明らかにされている。ＡｐｏＥには、ヒト集団でみられる３種の優勢なアイソフォーム、Ｅ２（Ｃｙｓ112、Ｃｙｓ158）、Ｅ３（Ｃｙｓ112、Ａｒｇ158）、およびＥ４（Ａｒｇ112、Ａｒｇ158）がある（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ，１９９４年）。ＡＤに罹った患者において、ａｐｏＥ４キャリアーは、ａｐｏＥ３キャリアーに比べてより多い数の老人斑を示す（Ｇｅａｒｉｎｇ，１９９６年）。ＡｐｏＥ４／４遺伝子型を有する被験者は、ＡｐｏＥ２／３またはＡｐｏＥ３／３遺伝子型を有する被験者よりも、アルツハイマー病に８倍程度罹りやすいようである。さらに、アルツハイマー病発症の平均年齢と、平均生存年齢は、１つのＡｐｏＥ４対立遺伝子を有するヒトがより低く、２つのＡｐｏＥ４対立遺伝子を有するヒトは最も低い（米国特許第５,５０８,１６７号）。まれなａｐｏＥ２対立遺伝子の遺伝形質は、ＡＤ発病の危険率の減少に関連する（Ｃｏｒｄｅｒ，１９９４年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＡｐｏＥは、直接的なタンパク質−タンパク質相互作用によるＡβペプチドの沈着またはクリアランスに関与すると仮定されている。ＬａＤｕ（１９９４年，１９９７年）は、野生型の脂質化ａｐｏＥ分子を用いて、Ａβとの相互作用におけるａｐｏＥアイソフォーム特異的な差を実証したが、アイソフォーム特異性は、精製ａｐｏＥアイソフォームでは失われた。ＬａＤｕによる研究では、明らかに凝集によるＡβの様々な形態に対するａｐｏＥの作用を調査しておらず、それゆえに、ａｐｏＥ４との優先的な結合が示されていない。Ｔｏｋｕｄａ等は、ａｐｏＥ３およびＡβとのアイソフォーム特異的な相互作用を報告している。しかしながら、我々は、様々なＡβコンフォメーションが、様々な度合いの神経毒性を付与すること、および、Ａβの有毒型を再現可能に製造可能であることを確立した。それゆえに、その相互作用の生理学的な重要性を確認するためだけでなく、その相互作用の調節物質を発見するための分析法を開発する手段としても、ａｐｏＥ４とＡβとの相互作用に関するアイソフォーム特異的で／有毒な種に特異的な分析手法を開発することは極めて興味深かった。このような調節物質は、ａｐｏＥ４対立遺伝子を有する患者におけるアミロイド関連病の治療および予防に有用となり得る。
【０００５】
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【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記で確認されたニーズを扱うものであり、すなわち本発明は、脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体形成阻害剤化合物を同定する方法を提供し、本方法は、試験化合物の存在下で、脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドと、活性化Ａβポリペプチドとを接触させる工程；および、ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の形成を減少させる試験化合物を同定する工程を含み、ここで、脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体の形成を減少させる試験化合物が、複合体形成阻害剤化合物である。
【０００７】
上記に加えて、本発明は、さらなる局面として、特に上述された変形よりも多少なりとも狭い範囲の全ての本発明の実施形態を含む。出願人は添付された請求項の全ての範囲を発明しているが、添付された請求項には、他者の従来技術の仕事の範囲を含まないように意図している。それゆえに、請求項の範囲内の法定の従来技術が、特許庁または他の団体または個人により出願人に注意が与えられるということにおいて、出願人は、適用できる特許法に基づき補正する権利を行使する権利を有し、このような請求項の保護対象を、特にこのような法定の従来技術、または、このような請求項の範囲から法定の従来技術の自明な改変を排除するように、再定義できる。本発明の変形は、このようにして補正された請求項によって定義され、またそれらを本発明の局面とする。
【０００８】
図面の詳述
図１−濁度検出による代表的なＡβ1-40振盪凝集実験：Ａβ1-40の５０μＭ溶液を、方法の章で示された詳細に従って振盪することによって凝集するように誘導した。縦座標は、Ａ405×１０3の単位であり、１３８単位は、５０μＭに等しい。実線は、方程式１〜４と表１に示す速度定数を用いて計算された理論曲線である。左の縦座標は、開始ペプチド、および、凝集した種に関し、一方、右の縦座標は、活性化単量体、成長部位、および、四量体に関する。黒丸は、個々の実験データ点を示す。
【０００９】
図２−濁度およびペプチド濃度の時間依存性：濁度検出とペプチド質量との関係を並行
実験で決定した。方法で説明された通りに、遠心分離後に溶液中に残存したペプチドの質量を定量した。データを方程式１〜４で分析し、実線は、実験データ点に対する理論上の適合を示す。
【００１０】
図３−ＣＤ検出による自発的凝集のカイネティクス：凝集カイネティクス実験は、方法で説明されるようにＡ405での振盪法または２００〜２０５ｎｍにおけるＣＤ楕円率を用いて行った。実線は、最も適合した理論曲線を示す。
【００１１】
図４−凝集時間の関数としてのＡβ1-40のＣＤスペクトルにおける変化：凝集プロセス中の様々な時間でＣＤスペクトルを記録し、このスペクトルを方法で説明されるように分析した。
【００１２】
図５−凝集に対するペプチド濃度の効果；濁度および蛍光偏光法による検出：方法で説明されたようにペプチド濃度の関数として、濁度および蛍光偏光検出によって凝集実験を行った。黒丸：２５μＭペプチド；白丸：５０μＭペプチド。実線は、実験データ点に対する理論上の適合である。
【００１３】
図６−抗ａｐｏＥのＮ末端キャプチャー抗体を用いたＥＬＩＳＡによって、様々な形態のＡβ１−４０への、脂質化した、および脂質化されていないａｐｏＥの結合の検出である。記載したように、自発的凝集中に振盪して０、６０、８０、および、１１０分に、Ａβ１−４０を得た。パネルＡおよびＢ＝キャプチャー抗体６Ｃ５、パネルＣおよびＤ＝キャプチャー抗体９Ｈ８．Ｇ５．Ｆ２、パネルＡおよびＣ＝脂質化したａｐｏＥ、パネルＢおよびＤ＝脂質化されていないａｐｏＥ、●＝ａｐｏＥ２、○＝ａｐｏＥ３、▲＝ａｐｏＥ４、＊＝ａｐｏＥ２に対してｐ＜０.０５、＋＝ａｐｏＥ３に対してｐ＜０.０５のａｐｏＥ４。ｎ＝５（６Ｃ５、および、９Ｈ８．Ｇ５．Ｆ２脂質化ａｐｏＥの実験について）、およびｎ＝４（６Ｃ５、および９Ｈ８．Ｇ５．Ｆ２脂質化されていない実験について）。
【００１４】
図７−抗ａｐｏＥのＣ末端キャプチャー抗体３Ｈ１を用いたＥＬＩＳＡによる、様々な形態のＡβ１−４０への、脂質化した、および脂質化されていないａｐｏＥの結合の検出である。記載したように、自発的凝集中に振盪して０、６０、８０、および１１０分に、Ａβ１−４０を得た。パネルＡ＝脂質化ａｐｏＥ、パネルＢ＝脂質化されていないａｐｏＥ、●＝ａｐｏＥ２、○＝ａｐｏＥ３，▲＝ａｐｏＥ４。ｎ＝４（脂質化ａｐｏＥ実験について）、および、ｎ＝３（脂質化されていないａｐｏＥ実験について）。
【００１５】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、全長ＡｐｏＥ４のアミノ酸配列である。
配列番号２は、Ａβ１−４３のアミノ酸配列である。
配列番号３〜１０は、実施例２のプライマー配列である。
【００１６】
発明の詳細な説明
一般的な定義
アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）は、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）を介した脳における脂質とコレステロールの輸送およびクリアランスを調節するタンパク質種であり（Ｂｏｙｌｅｓ １９８９年，Ｃｏｒｄｅｒ １９９３年，Ｆａｇａｎ １９９６年，Ｐｏｉｒｉｅｒ １９９４年）、ＡＤ脳における斑の沈着に役割を果すことが明らかにされている。
【００１７】
ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、およびＡｐｏＥ４という３種の主要なＡｐｏＥのアイソフ
ォームがあり、これらは、単一の遺伝子座における３種の対立遺伝子の生成物である。３
種のホモ接合型の表現型（Ａｐｏ−Ｅ２／２，Ｅ３／３、およびＥ４／４）、および３種のヘテロ接合型の表現型（ＡｐｏＥ３／２，Ｅ４／３、およびＥ４／２）は、３種の対立遺伝子のいずれか２種の発現によって生じる。最も一般的な表現型はＡｐｏＥ３／３であり、最も一般的な対立遺伝子はＥ３である。Ｍａｈｌｅｙ.Ｒ.Ｗ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０；６２２〜６３０（１９８８年）を参照。３種のタイプのアミノ酸配列は、わずかしか違わない。ＡｐｏＥ４は、ＡｐｏＥ４のアミノ酸残基１１２で通常みられるシステインがアルギニンに置換されている点でＡｐｏＥ３と異なる。ＡｐｏＥ２の最も一般的な形態は、残基１５８で通常みられるアルギニンがシステインに置換されている点でＡｐｏＥ３と異なる。上記のＭａｈｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅを参照。それゆえに、３種のアイソフォームは、以下のそれらの配列の差の情報の短縮表記によって示すことができる：Ｅ２（Ｃｙｓ112，Ｃｙｓ158），Ｅ３（Ｃｙｓ112，Ａｒｇ158）、およびＥ４（Ａｒｇ112，Ａｒｇ158）（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９４年）。
【００１８】
ヒトａｐｏＥは、２９９個のアミノ酸残基からなる３４ｋＤａのタンパク質であり、３種の別個の機能的ドメイン：（１）Ｎ末端受容体結合領域、（２）プロテアーゼ切断に感受性を有するランダムコイル領域、および（３）Ｃ末端脂質結合領域を有する（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９４年）（Ｆｉｇ１）。Ｎ末端領域中の残基１３６〜１５８は、ａｐｏＥ関連受容体と相互作用し、残基１６５〜２１０は、タンパク質分解に高い感受性を有し、残基２２５〜２９９は、Ｃ末端部分を構成し、脂質結合に関与する残基２６８〜２８９を含む。我々は、残基２４３〜２７２がＡβへの結合に関与することを発見した。
【００１９】
本発明に記載される「ａｐｏＥ４由来ポリペプチド」は、Ｍａｈｌｅｙにより説明され、以下に引用して記載された成熟ヒトａｐｏＥ４ポリペプチド（配列番号１）、
【化１】
および、ヒトａｐｏＥ４の種の相同体を含む。多くの種のａｐｏＥの相同体は、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒにより記載されており、この定義は、ヒヒ、カニクイザル、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、イヌ、アシカ、およびその他の種の相同体、ならびに上記配列のポリペプチドのフラグメントを含み得る。
【００２０】
本発明で用いられる用語「Ａβポリペプチド」は、分子量が約４.０ｋＤの３８〜４３個のアミノ酸ペプチドを意味し、このペプチドは、Ｇｌｅｎｎｅｒ等（２２）により記載されたタンパク質の形態と実質的に相同であり、正常なベータアミロイドペプチドの突然変異、および翻訳後修飾を含む。どのような形態においても、ベータアミロイドペプチドは、ベータアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）という大きい膜貫通型糖タンパク質の約３８〜４１個のアミノ酸フラグメントである（フラグメントのカルボキシ末端が異なる）。その４３個のアミノ酸配列は以下の通り（配列番号２）、
【化２】
または、それらに相同な配列である。一例として、対応するラットおよびマウス配列は、上記配列に約９５％相同であり、この定義に含まれるものであり、それぞれＧｅｎｂａｎｋ受入番号Ｐ０８５９２およびＡＡＢ４１５０２から推測することができる。その他の相同体は、公開されたデータベースおよび私的なデータベースから、または、適切な種から対応するＡＰＰをクローニングおよび配列解析することによって容易に推測される。
【００２１】
Ａβポリペプチドは、可溶性、不溶性、または中間体型のいずれかで存在し得る。インビトロでインキュベートする際の濃度依存性のラグ期間の後、合成βＡＰの可溶性調製物は、活性化ベータアミロイド種をゆっくり形成し、最終的には、繊維性の凝集体を生じ、これは、天然アミロイドに類似し、沈降により水性媒体から分離可能である。本明細書において便宜上、Ａβポリペプチドは、場合により、Ａβ１−３８、Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４１、Ａβ１−４２、Ａβ１−４３、または単に「Ａβ」ともいう。
【００２２】
用語「凝集したＡβペプチド」は、不溶性状態のＡβペプチドを意味する。
【００２３】
用語「活性化Ａβポリペプチド」は、ａｐｏＥ４ポリペプチドと複合体を形成するというアイソフォームに特異的な性質を示す、自発的凝集中に生じるポリペプチド種を意味する。本明細書において、活性化Ａβポリペプチドを製造する手法は、下記で詳細に説明する。
【００２４】
「脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチド」は、ａｐｏＥ４由来ポリペプチドに加えて、極性または中性脂肪成分を含み、極性または中性脂肪成分は、活性化ベータアミロイドペプチドと複合体を特異的に形成することができ、その相互作用は、それらの結合の測定が可能なほど十分に強いａｐｏＥ４由来ポリペプチドである。ポリペプチドが他のポリペプチドと結合する性質を測定する方法は当業界周知であり、実証的な例が考察されている。
【００２５】
脂質成分としては、エステル化または非エステル化（遊離）コレステロール、トリグリセリド、およびリン脂質が挙げられる。一実施形態において、凝集体中の脂質成分は、脂質二重層を形成することができる。いくつかの実施形態は、ジラウロイルＰＣ（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルＰＣ（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルＰＣ（ＤＰＰＣ）、およびパルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ＰＣを含むホスファチジルコリン（ＰＣ）、または、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、セラミド、および、スフィンゴミエリン、セレブロシド、コール酸ナトリウム、コレステロール、およびコレステロールエステルで複合化したａｐｏＥ４を含む。再構成したリポタンパク質粒子を製造する方法は当業界周知であり、Ｊｏｎａｓにより詳細に記載された方法で、様々な割合の脂質混合物とタンパク質濃度で作製することができる。アポリポタンパク質を様々な脂質と結合させるための多くの方法があり、例えば、脂質およびタンパク質成分の共超音波処理（ｃｏｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、タンパク質と脂質小胞との自発的な相互作用、および様々な界面活性剤が介在する再構成方法が挙げられる。
【００２６】
本発明で用いられる用語「〜を接触させること」は、直接的または間接的のいずれかによって、化合物と本発明のポリペプチドとを共に物理的に近接させることを意味する。加えて、「〜を接触させること」は、本発明のポリペプチドと、他のポリペプチドとを物理的に近接させることを意味する場合もある。
【００２７】
本発明で用いられる用語「複合体」は、共に結合した分子の組み合わせを意味するものとし、特定のいかなる結合様式を意味するものではない。
【００２８】
本発明で用いられる用語「相同」は、所定のポリペプチドと、他のアミノ酸配列とのアミノ酸配列間の同一性の程度を説明するために用いられる。所定のポリペプチドのアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列は、例えば上で定義されたハイブリダイゼーションによって得られたＤＮＡ配列から推測してもよいし、または、従来のアミノ酸配列解析法で得てもよい。相同性の程度は、好ましくは、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列で決定される。好ましくは、相同性の程度は、比較されたアミノ酸配列間のアミノ酸配列において、少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、または、さらに９８％である。
【００２９】
相同なアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を包含する。相同性（％）は、例えば、ギャッププログラム（Ｇａｐ ｐｒｏｇｒａｍ）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，マディソン，ウィスコンシン州）によって決定することができ、これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ.Ａｐｐｌ.Ｍａｔｈ.，１９８１年，２，４８２〜４８９）のアルゴリズムを標準設定で用いている。
【００３０】
本発明で用いられ、かつ当業界で理解されている「単離（されている）」とは、ポリペプチドが正常に発見される元来の細胞の環境から分離されたことを意味するものとする。従って、単なる例として、本発明で用いられるように、それらが天然に存在しない細胞型で組換え手段によって発現されたタンパク質は、「単離されている」。一例として、天然に存在する細胞、またはそうではない細胞のどちらで発現されたとしても、ある程度まで精製された場合、そのタンパク質種は「単離されている」。
【００３１】
本発明で用いられる「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわちペプチド等価体（ｉｓｏｓｔｅｒｅｓ）で、互いに連結した２またはそれ以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、短鎖（一般的にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという）と、より長い鎖（一般的にタンパク質という）との両方を意味する。ポリペプチドは、遺伝子をコードする２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、自然のプロセス、例えば翻訳後プロセシング、または、当業界周知の化学修飾技術のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列を含む。ポリペプチドのグリコシル化および非グリコシル化型もこの定義に包含される。
【００３２】
本発明で用いられ、かつ当業界で理解されている「合成された」は、酵素による方法に対して、純粋に化学によって製造されたポリヌクレオチドを意味する。それゆえに、「完全に」合成されたＤＮＡまたはポリペプチド配列は、完全に化学的手段によって製造され、「部分的に」合成されたＤＮＡまたはポリペプチドは、得られたＤＮＡまたはポリペプチドの一部だけが化学的手段によって製造されたものを包含する。
【００３３】
用語「試験化合物」は、あらゆる手段、同定可能な天然または合成の化学物質または分子を意味し、例えば、これらに限定されないが、活性化Ａβポリペプチドが脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドと結合する性質を調節するその能力が評価される、低分子物質、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または、核酸が挙げられる。特に、抗体（例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性／二特異的な抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および相補決定領域（ＣＤＲ）移植抗体がこの定義に含まれ、ａｐｏＥ４誘導ポリペプチドまたは活性化Ａβに特異的に結合するＣＤＲ配列を含む化合物も含まれる。この定義は、１９９３年６月２０日に公開されたＷＯ９３／１１２３６に記載の方法に従って製造および同定されたヒト抗体を含む。この定義は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、および、Ｆvなどの抗体フラグメントを含み、これらも
本発明によって提供される。上記定義は、動物から単離した抗血清も含み、典型的な組成物としは、水、または、その他の希釈液、添加剤もしくはキャリアーに再懸濁された抗血清の抗体分画を含む組成物のようなものがある。
【００３４】
本発明で用いられる用語「脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチド−Ａβ複合体」または複合体は、ａｐｏＥ４タンパク質由来ポリペプチドとベータアミロイドペプチドとの複合体
を意味するものとする。
【００３５】
序論
アルツハイマー病（ＡＤ）の病理学的な特徴は、脳内における細胞外の斑の形態のアミロイドペプチド（Ａβ）の存在である。斑形成の前に、単量体Ａβフラグメントは、単一ユニットから凝集産物へトランスフォーメーションし、それによりフィブリル形成が起こり、最終的には斑沈着が起こる。アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）は、Ａβ斑形成に関与すると考えられてる。ａｐｏＥ４アイソフォームを有するＡＤに罹った患者は、ａｐｏＥ３キャリアーに比べてかなり多数のＡβ斑を示した。最も明白には、ａｐｏＥ２およびａｐｏＥ３キャリアーに比べて、ａｐｏＥ４対立遺伝子の遺伝は、ＡＤの危険性を高める。これまで、ＡＤの病因へのＡｐｏＥの関与の性質は、よく理解されていなかった。我々は、自発的凝集中に生成される、ＡｐｏＥ４アイソフォームと優先的に結合するＡβ活性種を再現可能的に作成する方法を発見した。我々はまず、下記で、活性ベータアミロイド種をどのように作成し、回収できるかを説明する。続いて我々は、どのように脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドを作成できるかを説明する。最後に、我々は、どのようにこれら２種の相互作用を評価する分析法を実施することができるかを説明する。
【００３６】
ＡｐｏＥのアイソフォーム特異的な結合を示す活性化Ａβポリペプチドの作成
下記で説明した分析は、単離したＡβポリペプチドを、その分子形態のいずれか一つ（代表的には、３８、３９、４０、４１、４２または４３個のアミノ酸変異体）で利用する。このようなポリペプチドは購入することができる（例えばシグマ・バイオケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）製の、フラグメント１−３８（カタログ番号Ａ０１８９）、フラグメント１−４０（カタログ番号Ａ１０７５）、フラグメント１−４２（カタログ番号Ａ９８１０）、フラグメント１−４３（カタログ番号Ａ−７７１２））。このようなポリペプチドはまた、当業界周知の手段で合成で製造されてもよい。固相ペプチド合成は当業者周知であり、一般的に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３年，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５６，ＦｉｅｌｄｓおよびＮｏｂｌｅ，１９９０年，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：１６１〜２１４、およびＳｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”ｂｙ ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｐａｒｄ（ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）出版，オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），１９８９年）で記載されている。従って、ここで開示されたペプチドおよびタンパク質は、これら比較的慣例的な技術を本発明の開示を考慮して用いて製造してもよい。固相ペプチド合成は提供された参考文献で説明されているように当業者周知であり、手動で行うこともでき、または自動化ペプチドシンセサイザー（例えばＡＢＳが販売しているもの）で行うこともできる。
【００３７】
一つの合成方法は、自動化ペプチドシンセサイザーによるＦｍｏｃ方法を用いた固相ペプチド合成によって達成される。この方法は、−ＣＯＯＨ末端からアミノ酸鎖を構築し、これを不溶性ポリマー支持体に付着させることを含む。塩基不安定性のＦｍｏｃ基が、各残基の−アミノ基を保護するのに用いられる。反応性を有する可能性のある側鎖を有する残基が、ｔ−ブチルのような酸不安定性基で保護される。各サイクル中にピペリジンでＦｍｏｃ基を除去した後、カップリング試薬または予め活性化したアミノ酸誘導体のいずれかを用いて、次の保護されたアミノ酸が付加される。合成の最後に、ペプチドを固体支持体から切断し、用いられるリンキング剤に応じてペプチド酸またはアミドが得られ、ペプチド−樹脂をトリフルオロ酢酸と様々なイオンスカベンジャーとの混合物で処理することによって側鎖保護基を除去する。メチルｔ−ブチルエーテルを加えて、切断混合物からペプチドを沈殿させる。粗ペプチドを溶解させ、凍結乾燥し、その後、高性能液体クロマトグラフィーで精製する。精製したペプチドを凍結乾燥し、−８０℃で保存する。
【００３８】
このようなポリペプチドは、ベータアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の正常なプロセシングとそれに続く精製によって作成することもできる。
【００３９】
本発明は、ＡｐｏＥ４-活性化Ａβ相互作用の阻害剤を同定するための数種の分析システムを含む。このような分析法の重要性を理解するために、Ａβの活性型が、神経毒性にも、またａｐｏＥ４結合にも関与する生理学的に関連する種であることを理解することがまず必要である。
【００４０】
このような活性種の生成は、我々が説明する４次反応速度論モデルに従うことを認識する必要もある。このモデルの使用により、活性種が最大に到達する時間の予想が可能になり、それゆえに、細胞毒性またはａｐｏＥ４相互作用を評価する分析法で使用するための活性種をいつ回収するかを決定するために予想ツールを供給することができる。
【００４１】
Ａβの自発的凝集の反応速度論研究は複雑であるが、これは、凝集形成速度の、高いペプチド濃度に対する依存性や、市販サンプルにしばしば存在するわずかなフィブリル、あらゆる微粒子状の物質、種、および、沈降しなかったオリゴマーの量に対してシステムが極度に高感度であるためである。また、凍結乾燥したペプチド中にわずかな量の湿気が存在することによっても、しばしば制御不能な未成熟な凝集形成が起こる。出発原料の純度と均一性を達成する最良の方法の一つは、ヘキサフルオロイソプロパノールまたは酢酸のような酸または溶媒で予備処理することである（Ｆｉｎｄｅｉｓ，１９９９年）。厳密なサンプル精製に加えて、一定速度で凝集混合物を振盪することが、毎日一定した速度を得るのに必要であるとみられていた。
【００４２】
我々は、凝集データが、始めに非活性化単量体（ＵＭ）がゆっくり活性種（ＡＳ）に変換される３段階反応速度論モデルに最も一致することを見出した。第二の遅い工程において、数種の単量体は、フィブリルの成長部位（ＧＳ）として役立つオリゴマーの核を協同して形成する。フィブリルの成長は、不活性単量体分子の連続付加により成長部位を破壊することなく凝集体を伸長させる第三の工程で起こる。
【数１】
【００４３】
上記モデルは、以下の方程式システムで示される：
【数２】
【００４４】
式中、Ｐは、凝集した単量体の濃度である。これら速度方程式は、独立した形態では積分不可能であるため、非線形最小二乗法プログラムを上記方程式の５次のルンゲ・クッタ数値積分と組み合わせて用いて、Ｐ対時間のデータを分析した。この分析により、ｘ＝４±１であることがわかり、速度定数を計算した。この分析を、初期推定値に関して選択された値に関わらず、ほぼ同様の最も適合するパラメーターに収束させた。速度定数が計算されれば、あらゆる種（活性Ａβペプチド種を含む）の時点を容易に計算することができる。我々は、以下で、関連する速度定数を計算するのに必要なＡβの凝集を評価する数種の方法を説明する。
【実施例】
【００４５】
実施例１
自発的なＡβ凝集の測定
Ａβ１−４０を、ポリペプチド・ラボラトリーズ（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，トーランス，カリフォルニア州）、および、ベイケム・バイオケミカ（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，ハイデルベルグ，ドイツＡＧ）から購入した。配列中にシステイン残基を含み、そこにフルオレセイン成分が共有結合したＦｌｕｏ−β−アミロイド１−４０を、アドバンスト・バイオコンセプト社（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ｌｔｄ.，バッキンガムシア，イギリス）から購入した。分子ふるい（４Å）、および、１,１,１,３,３,３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ
Ａ）は、シグマ・ケミカル（セントルイス，ミズーリ州）製である。
【００４６】
単量体形態のＡβ1-40の調製
ＨＰＬＣ標準として用いられるＡβ１−４０を、ＨＦＩＰＡで処理し、これを分子ふるいタイプ４Ａ上で４℃で乾燥させ、続いて、１５,０００×ｇで１５分間遠心分離し、分子ふるいのダストを除去した。凝集分析のために、ペプチドをＨＦＩＰＡ中で８ｍｇ／ｍＬに溶解させ、溶媒中で１８〜２４時間保持し、予備形成された粒子全てを脱凝集させた。この工程の後、この溶液の２０μｌのアリコートを液体窒素中で瞬間冷凍し、−１９５℃で保存した。使用前に、ドライアイス下で、融解させずに、ＨＦＩＰＡを直接的な凍結乾燥で除去した。融解によるＨＦＩＰＡの除去は、凝集していない出発原料を得るのに必須であり、なぜなら、凍結乾燥前に、凍結したペレットを融解させると、しばしば数種のオリゴマーペプチドが製造されるためである。凍結乾燥したＡβ１−４０を無水ＤＭＳＯ（通常は２０μＬ）中で溶解させ、１５分間槽中で超音波破砕し、１００×ストック溶液を得た。この方法で製造されたペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムは、唯一のピークを示し（上記単量体の可能性が高い）、ＣＤ構造は主要なランダムコイルペプチドに一致した。我々は、２０×ストックを０.１％酢酸で製造する手法（Ｆｉｎｄｅｉｓ，Ｍ.Ａ.等（１９８９年））でも許容できるペプチド溶液が得られるを見出した。
【００４７】
Ａβ１−４０の自発的凝集
振盪凝集分析を実質的に以前に説明された通りに行った（Ｆｉｎｄｅｉｓ，Ｍ．Ａ．等（１９８９年））。５０μＭのＡβ１−４０を含む最終分析容量２５０μＬのダルベッコＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ++またはＭｇ++）を用いて、９６ウェルプレートで分析を行った。タイタープレート振盪器（ラボ−ライン（Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ）モデル４６２３）を速度８００ｒｐｍで用いてプレートを振盪した。反応混合物に抗体が含まれる場合は、それらは濃縮溶液から加えられた。抗体濃度を、分子量を１５０,０００と仮定して計算した。
【００４８】
濁度による凝集の測定
所定の時間で、反応混合物の濁度を、モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）Ｖｍａｘマイクロプレートリーダー（サニーベール，カリフォルニア州）で４０５ｎｍで読み取った。５０μＭのＡβ１−４０の凝集も、立て向きにセットされた両方の偏波器を備えたＩＳＳ Ｋ２スペクトル蛍光分光計（４９０ｎｍでの励起、および、５３０ｎｍでの発光）で垂直偏波光散乱強度を用いて連続的にモニターした。緩衝液と溶液（２ｍＬ）中にペプチドを含むキュベットを、撹拌棒で速度８０ｒｐｍで撹拌した。
【００４９】
低分子量のＡβ1-40の溶液濃度の間接凝集測定ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析のために、６０μｌのアリコートを、１５,０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。５０μＬの上清をにシラン化したマイクロオートサンプラーバイアルに移し、溶液中に残存し、続いて自発凝集したＡβ１−４０単量体を測定した。２回のＨＰＬＣ方法を行った。第一回目は、注入容量が２０μＬのウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）のデルタ−パック（Ｄｅｌｔａ−ｐａｋ）Ｃ１８カラム（１５０×４.６ｍｍ，５μｍの固定相，３００Åの孔サイズ）を用いた。この方法では、２１４ｎｍでのＵＶ検出（ウォーターズの９９６フォトダイオードアレイ検出器）を備えたウォーターズのアライアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）ＨＰＬＣシステムが用いられた。１０分にわたって直線状に、７０％水、３０％アセトニトリル（いずれも０.１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸を含む）から、６０％水、４０％アセトニトリル、および０.１％トリフルオロ酢酸ｖ／ｖ／ｖへの勾配を、室温で、流速１ｍｌ／分で適用した。次のサンプルを注入する前に、カラムを元の組成に６分間再平衡化した。第二の方法では、均一濃度の移動相（７３％水、２７％アセトニトリル、０.１％トリフルオロ酢酸ｖ／ｖ／ｖ）と、フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）Ｃ１８ルナ（Ｌｕｎａ）カラム（２５０×２.１ｍｍ，５μｍ）を用いた。この方法では、パーキン・エルマー・シリーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ）２００ポンプと、ウォーターズの９９６フォトダイオードアレイ検出器（２１４ｎｍ）を備えたオートサンプラーを用いた。カラムは４５℃、流速は０.４ｍＬ／分とした。サンプル（１５μＬ）を注入した；Ａβ１−４０単量体の保持時間は、第一の方法では約５分間とし、第二の方法では６分間とした。標準Ａβ１−４０溶液（ＤＭＳＯ中約１００μＭ）を用いてＡβ1-40単量体の定量を較正し、その濃度は、アミノ酸分析で測定された。この標準を液体窒素下で保存した。５点の標準曲線（１／ｘを量った）を用いて濃度を計算した。定量の下限は、約１.７μＭであった。
【００５０】
円二色性（ＣＤ）分光分析による凝集の測定
Ａβ１−４０溶液中で生じるコンフォメーション変化のカイネティクスを、ＣＤ分光分析で、２種の異なるペプチド濃度（５０および８０μＭ，ダルベッコＰＢＳ中）でモニターした。環状の振盪器で、９６ウェルプレートの連続したウェルから、１２０μＬのアリコートを設定した時間の間隔で取り出し、光路長０.５ｃｍの円柱状の石英ＣＤセルに移した。ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）（イーストン，メリーランド州）のＪ−７１５分光光度計を２３℃で用いてスペクトルを得た。緩衝液のＣＤスペクトルも２３℃で集めた。ＣＤ応答をアンモニウム−ｄ−カンフル−１０−スルホネートで較正した。遠紫外線ＣＤスペクトルを、１９３〜２６０ｎｍで、応答は０.２５秒、スキャン速度は１００ｎｍ／分、解像度および帯域は１.０ｎｍ、８回累積のスキャンで集めた。下限の波長はＣｌ-吸収により、１９５ｎｍ未満されたが、他の反応速度論実験との整合性を得るためにＮａＣｌが必要であった。
【００５１】
主成分の回帰分析（Ｂｌｏｗ，Ｄ.Ｍ.，（１９９４年））を用いたコンフォメーション分析のために、バックグラウンドを差し引いたＣＤスペクトルを、グラム／３２にインポートした。公共データベースから得られた二次構造が既知の１６種の異なるタンパク質に関するＣＤスペクトルの基底系を用いて、Ａβ１−４０の二次構造の推定を決定した。この方法を、ギャラクティック・インダストリーズ（Ｇａｌａｃｔｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，セーラム，ニューハンプシャー州）から入手された市販のソフトウェアパッケージ（ＰＬＳｐｌｕｓ／ＩＱバージョン３.０２）で稼動できるように適合させた。基底系は、１９５〜２６０ｎｍの範囲の、解像度２ｎｍの、単位Δε（リットル／モルｃｍ）の平均軸対称ＣＤデータと、αへリックス，パラレルおよびアンチパラレルβシート、βターンおよびその他のランダム構造に関するＸ線結晶学的二次構造パーセンテージからなる。各ライブラリー項目から平均スペクトルを差し引くことによって、基底系データを平均軸対称化した。５つのファクターにより、実験で得られた二次構造パーセンテージと既知の二次構造パーセンテージとの最適な一致を得た。Ａβ１−４０のコンフォメーションのパーセンテージを推定するために、実験で得られたＣＤスペクトルを２ｎｍ解像度に平均して、単位Δε（リットル／モルｃｍ）に変換し、５つの最も重要な主成分を用いて分析した。
【００５２】
蛍光偏光法によるＡβ凝集の測定
ペプチドが成長するフィブリルへ付着することによって、ペプチド上のあらゆる蛍光団の回転性の移動性が変化するはずであり、従って、標識されたアミロイドペプチドの蛍光の偏光は、凝集を検出および定量するための高感度プローブのはずである。従って、我々は、凝集検出のために、共有結合したフルオレセイン分子（アドバンスト・バイオコンセプト）を有するＡβ１−４０を、標識されていないＡβ1-40と混合して用いた。
【００５３】
適所に偏光光学ヘッドを備えたＢＭＧフルオスター・ギャラクシー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ
Ｇａｌａｘｙ）プレートリーダーを用いて、フルオレセインで標識されたＡβ１−４０の凝集を試験した。励起光学で４８０ｎｍフィルター（１２ｎｍ帯域）を用い、２つの発光光路で一対の整合５２０ｎｍフィルター（３５ｎｍ帯域）を用いた。３種の異なる濃度で５つ複製したＡβ１−４０のＰＢＳ溶液（１０、２５、および５０μＭ）を、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の黒色の不透明な９６ウェルプレート（パート＃３９１５）のウェルに付した。読み取り１回あたり平均して５０回のキセノンフラッシュランプのフラッシュを用いて、位置決めのディレイを１秒で、各ウェルを読み取るように装置の操作手順を確立した。器具のゲインをフルオスター・ソフトウェアのマニュアルに従って設定した。偏光強度の読み取りをゼロ時間で測定し、プレートを取り出し、環状の振盪器で撹拌した。外部装置による凝集分析のための正確な条件が予め確立されていたために、装置の振盪器の代わりに外部の環状の振盪器を用いた。プレートを７分間撹拌し、取り出し、プレートリーダーに戻して置き、各ウェルのさらなる偏光の読み取りを記録した。この方法で、２００分間にわたり凝集のカイネティクスを記録した。
【００５４】
結果
我々はまず、４０５ｎｍで濁度によりモニターした代表的なＡβ凝集の時間依存性分析した。Ａβの自発的凝集に関する曲線の形（図１に示す）は、タンパク質の直鎖状の凝集に関して提案されたものを暗示しているが（Ａｉｎｓｚｔｅｉｎ，Ａ.Ｍ．（１９９４年），Ｔｏｂａｃｍａｎ，Ｌ.Ｓ，（１９８３年），Ｖｏｔｅｒ Ｗ.Ａ.，（１９８４年），Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ.Ａ.，（１９８３年））、誘導期間は、アクチンまたはチューブリンのいずれかで観察されたものよりずっと長い。これは、開始ペプチド種それ自体はフィブリル形成を開始させることができないことと、活性単量体誘導体がゆっくりと形成されることにより凝集が生じなければならないことを示す。しかしながら、活性化工程が凝集よりずっと速く、独立した反応速度論プロセスとして扱うことができるアクチンおよびチューブリンの場合とは異なり、Ａβ凝集は、極めてゆっくりとした活性化、それに続く比較的迅速な凝集を経て進行するようである。様々な反応速度論モデルを用いて実験した後、我々は、上述されたモデルに到達した。
【００５５】
実験のポイントと、最も適合した定数を用いて計算された理論曲線との一致（図１）は、モデルの適合を示す。同図において、我々はまた、様々な反応速度論的に競合する種の計算された濃度も示す。どの時間においても、ＡＭは、総ペプチド濃度のほんの少量の分画を示すこと（この実験において、２.６μＭ対５０μＭ）、および、ＡＭは濃度が反応中に最大値を経過する唯一の種であることを特記する。
【００５６】
アクチンに関して直鎖状の重合における濁度と濃度との比例関係がすでに確立されているが（Ｔｏｂａｃｍａｎ，Ｌ.Ｓ.（１９８３年））、我々は、並行実験で、溶液からの低分子量の出発原料の消失に関して、Ａ405測定と、ＨＰＬＣで得られた測定とを比較することによって、我々のシステムのその妥当性を確認した。結果を図２に示す。両方のデータ群は、方程式１〜４で説明されたモデルと一致しており、分析により、相当する速度定数を得た（表１に示す）。
【００５７】
【表１】
【００５８】
濁度によって測定された振盪凝集のカイネティクスも、ＣＤ検出によって測定されたものと比較した。並行実験の結果を図３に示す。再度、両方のデータ群は我々の反応速度論
モデルと一致しており、上記分析より、表１に示された速度定数が得られた。
【００５９】
Ａβ1-40のＣＤスペクトルを、凝集時間の関数として記録し、その結果を図４に示す。Ａβ1-40凝集中に回収したＣＤスペクトルの主成分分析により、無秩序なコイル構造のわずかなロスと、付随するアンチパラレルβシート構造の増加が明らかになった。コンフォメーション分析によっても、βターン構造のわずかな増加が示された。βターン構造の出現時間は、凝集プロセスの開始に対応しており、これは、我々が検出にＩＲを用いても観察した（データは示さず）。
【００６０】
蛍光偏光検出
振盪で誘導されたフルオレセイン標識Ａβ１−４０の凝集の、ペプチド濃度依存性を決定した（図５の右のパネルで示す通り）。凝集により、強度の変化を起こすことなく最大の変化で安定状態の異方性が２倍に増加した。これらのデータも、実験データ点と、方程式１〜４と表１で示された最も適合したパラメーターを用いて計算された理論曲線との間の一致で証明された反応速度論モデルと一致していた。４種の異なる実験検出方法で観察された反応速度論の挙動の一致は、反応の全体の時間経過中に観察可能な主要な種は、低分子量の出発原料と凝集体のみであることを示している。その他のあらゆる中間体種は、実験上のエラーを生じることなく検出不可能な低い濃度でなければならない。
【００６１】
ペプチド濃度の凝集への効果
凝集のカイネティクスに対する開始ペプチド濃度の効果を、濁度および蛍光異方性を同時に測定することによって決定した。２種のペプチド濃度での濁度測定からの結果を図５の左のパネルに示す。方程式１〜４によるデータの非線形最小二乗法分析により、速度定数が得られ（表１に示す）、これらは、開始Ａβ１−４０濃度に非依存性である可能性が最も高い。速度定数の非依存性は、反応速度論モデルの妥当性の最大限の裏付けを構成する。
【００６２】
Ａβの活性種が最大になる時点を計算することが可能であるが、単に、自発的に凝集するＡβ溶液のアリコートを分取し、そのアリコートをａｐｏＥ４への結合に利用することもできる。我々の場合、これは、上述された緩衝液条件下で完全に脱凝集した単量体から開始させた場合、約６０分でみられた。
【００６３】
ａｐｏＥ４およびその他のＡｐｏＥアイソフォームの作成
本発明の分析を行うために、活性化Ａβポリペプチドに関するａｐｏＥ４結合パートナーを単離することが必要である。ａｐｏＥアイソフォームの組換え法による作成は記載されている（Ｍｏｒｒｏｗ ＪＡ等（１９９９年））。本発明において、我々は、結合パートナーとしてのａｐｏＥ４を作成する手段として適切な手法を説明する。当然のことながら、その他の手段も利便性に劣るとしても適切である。例えば、ヒト血清またはＣＳＦからのａｐｏＥ４を、原料源として精製、単離してもよい。Ｍｏｒｒｏｗ等はエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で生産した組換え材料を利用しているが、当然のことながら、実質的には、あらゆる組換えタンパク質生産システムが同様に適切である。我々はまた、その他のａｐｏＥアイソフォームの作成も説明する。我々が記載する分析法によって、その活性化Ａβとの複合体形成における脂質化ａｐｏＥ４の優先的な特異性が示されたことから、このようなその他のアイソフォームは、コントロールポリペプチドとして適切である。
【００６４】
下記の実施例２において、我々は、ヒトａｐｏＥアイソフォームの高レベルの作成方法を報告する。この方法は、実質的に近年、Ｍｏｒｒｏｗ等によって説明されているが、唯一の変更点は、超遠心分離工程において、リポタンパク質Ｅ分画中の不純物の量を減少させたことである。この方法を用いて、我々は、純度９０％超のマテリアルを日常的に得た
。超純粋なマテリアルが必要な場合、我々は、ａｐｏＥをセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）カラムに再度通過させることにより、純度約９９％のマテリアルが得られる（ただしわずかに回収率が減少する）ことを見出した。
【００６５】
実施例２
材料および方法
ａｐｏＥアイソフォームのクローニング、および、発現ベクターの構築
成熟ヒトａｐｏＥに対応する相補ＤＮＡを、脾臓ｃＤＮＡ（クロンテック・ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），パロアルト，カリフォルニア州）から増幅した。増幅反応液は、１０ｍＭのｄＮＴＰ、脾臓ｃＤＮＡ（２ｎｇ）、１×Ｑ溶液（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．），バレンシア，カリフォルニア州）、０.２μＭの各プライマー：
フォワード，５’−ＣＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号３）、
リバース，５’−ＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧＴＣＧＣＴＧＧＧＣＡＣ−３’（配列番号４）、
タックプラス（ＴａｑＰｌｕｓ）高精度ポリメラーゼ（５Ｕ）、および、１×緩衝液（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ラホヤ，カリフォルニア州）を最終容量５０μｌに含む。増幅のためのＰＣＲ条件は、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を３０サイクル、続いて最後の伸長を７２℃で１０分間である。増幅産物をｐｃＤＮＡ３.１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），カールスバッド，カリフォルニア州）にライゲートした。続いて、プラスミドミニプレップ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡサンプルを、ＤＮＡシーケンシング・コア・ラボラトリー（ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で配列解析した。配列解析の結果から、全長の成熟ａｐｏＥ２、および、ａｐｏＥ３のｃＤＮＡクローンが明らかになった。ＡｐｏＥ４のｃＤＮＡを製造するために、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン，ラホヤ，カリフォルニア州）を用いた部位特異的変異誘発をａｐｏＥ３のｃＤＮＡで行い、アミノ酸残基１１２個に対応するコドンをＴＧＣ（ｃｙｓ）からＣＧＣ（ａｒｇ）に変化させた。変異誘発反応液は、ｐｃＤＮＡ３.１−ａｐｏＥ３（５０ｎｇ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ、１×Ｑ溶液（キアゲン社，バレンシア，カリフォルニア州）、各プライマー（１２５ｎｇ）：
フォワード，５’−ＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＧＧＴＧＣ−３’（配列番号５）、
リバース，５’−ＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣ−３’（配列番号６）、
Ｐｆｕポリメラーゼ（２.５Ｕ）、および１×緩衝液を、総容量５０μｌに含む。サイクルパラメーターは９５℃で３０秒、続いて、９５℃で３０秒、５５℃で１分間、および６８℃で１２分間を１２サイクルである。この反応液を３７℃に冷却し、ＤＰＮ Ｉ（１０Ｕ）を加え、親ＤＮＡの消化を３７℃で１時間行った。変異させたＤＮＡ（１.５μｌ）で、ＤＨ５αＦＴ細胞（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ロックビル，メリーランド州）を形質転換した。それに続くミニプレッププラスミドＤＮＡの配列解析の結果によれば、成熟ａｐｏＥ４をコードするｃＤＮＡを含む数種のクローンが示された。
【００６６】
次に、成熟ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３、およびａｐｏＥ４に関するｃＤＮＡを、エシェリキア・コリ発現ベクターｐＥＴ３２ａ（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．），マジソン，ウィスコンシン州）にクローニングし、これを、ＢａｍＨＩ制限部位に対して５’側に隣接してトロンビン切断部位が導入されるように、以前に説明された通りに改変した（１７）。この改変は、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン，ラホヤ，カリフォルニア州）を用いた２段階工程で達成した。第一に、ヌクレオチドＣＣＡ ＣＧＣ（それぞれｐｒｏとａｒｇをコードする）を、ＢａｍＨＩ部位に対して５’側に隣接して挿入し、この挿入に用いられたプライマーは：
５’−ＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＡＴＣＣＣＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧ−３’（配列番号７）、
５’−ＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号８）、
であり、第二に、ヌクレオチドＣＴＧ ＧＴＡ（それぞれｌｅｕとａｒｇをコードする）を、挿入したヌクレオチドの第一群に対して５’側に隣接して挿入した。この挿入に用いられたプライマーは：
５’−ＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’（配列番号９）、
５’−ＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１０）、
であり、上記挿入それぞれのための変異誘発反応液は、ｐＥＴ３２ａプラスミド（１０ｎｇ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ、各プライマー（１２５ｎｇ）、Ｐｆｕポリメラーゼ（２．５Ｕ）、および、１×緩衝液を、総容量５０μｌに含む。サイクルパラメーターは、９５℃で３０秒、続いて、９５℃で３０秒、５５℃で１分間、および、６８℃で１２分間を１８サイクルである。各反応液を３７℃に冷却し、ＤＰＮ Ｉ（１０Ｕ）を加え、この反応液を３７℃で１時間インキュベートした。変異させたＤＮＡ（１.５μｌ）で、ＤＨ５αＦＴ細胞を形質転換した。続いて、コア・シーケンシングで、正しく挿入されたトロンビン認識配列を含む数種のクローンが同定された。次に、ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３、および、ａｐｏＥ４に関するｃＤＮＡを、改変されたｐＥＴ３２ａベクターのＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位でライゲートした。
【００６７】
ヒト組換えＡｐｏＥアイソフォームの発現
ＡｐｏＥ２、ａｐｏＥ３、およびａｐｏＥ４のＤＮＡで、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。大量発現と精製のために、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地（１００ｍｌ）に各クローンを播種し、ＯＤ600が０.６に達するまで振盪器で３７℃でインキュベートし、上記ＯＤに達した時点で細胞を氷上で冷却し、４℃で一晩保持した。翌朝に細胞を、ＳＬＡ−１５００ローターを用いて４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む新しいＬＢ培地（１００ｍｌ）中で再懸濁した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む新しいＬＢ培地（２リットル）に、再懸濁した細胞（３５ｍｌ）を播種し、ＯＤ600が０.６に達するまで振盪器で３７℃でインキュベートした。次に、細胞をＩＰＴＧ（最終濃度１００ｍｇ／ｍｌ）で２時間誘導した。細胞を再度遠心分離し、得られたペレットを必要になるまで−８０℃で保存した。
【００６８】
ＡｐｏＥアイソフォームの単離および精製
上述した通りに得られた細胞ペレットを再懸濁し（これを、以下、懸濁緩衝液という（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、および、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、ベスタチン、ロイペプチンおよび１Ｍベンズアミジンを含む０.５ＭのＮａＣｌ））、次に、フレンチプレスを用いて溶解させた。得られた溶解産物のｐＨを２Ｍトリスを用いて８.０に調節し、このサンプルを１１０００×ｇで５０分間で遠心分離した。上清を分離し、予め懸濁緩衝液で平衡化したＮｉ−ＩＭＡＣカラム（２０ｍｌ）にローディングした。次に、このカラムを、溶出液のＯＤ280が０.８未満に下がるまで懸濁緩衝液で洗浄した。その時点で、７５ｍＭイミダゾールを含む懸濁緩衝液を用いて、カラムを洗浄し、溶出液のＯＤ280が０.７未満に下がるまで洗浄を続けた。次に、このカラムを、カラム容量の２倍量のイミダゾール非含有懸濁緩衝液で洗浄し、その後、ＡｐｏＥ融合タンパク質を、３００ｍＭイミダゾールを含む懸濁緩衝液を用いて溶出させた。５０滴分の画分を回収し、ＯＤ280値が１.８超の画分をプールし、２０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3中で透析した。
プールのタンパク質濃度をＢＣＡ分析法で測定し、トロンビン切断用に準備するまでサンプルを−８０℃で保存した。
【００６９】
ａｐｏＥアイソフォームのトロンビンによる切断
融合タンパク質をトロンビンで切断する前に、ａｐｏＥ配列中に存在する天然に生じるトロンビン切断部位を保護する必要があった。これは、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）（シグマ，セントルイス，ミズーリ州）の小さい単一膜小胞と共に融合タンパク質をインキュベートすることによって達成された。ＤＭＰＣ（１２０ｍｇ）を、５０ｍｌガラス製コニカルチューブ中でクロロホルム（３ｍｌ）に溶解させた。窒素流下でチューブの壁で脂質を乾燥させた。脂質が乾燥したように見えたら、チューブを５０℃の水浴で交替で加熱し、溶媒が完全に蒸発するまでＮ2でフラッシングした。溶媒が除去された後、２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（１２ｍｌ）を加え、チューブを５０℃の水浴で１時間インキュベートし、超音波破砕水浴に１０分間置いた。これにより、リン脂質をチューブ壁から分散させ、極めて大きな多重膜小胞（ＭＬＶ）の乳状の懸濁液を調製した。ヒート・システムズ（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ソニケーター・モデルＸＬ−２０２０（ミソニックス（Ｍｉｓｏｎｉｘ），ファーミングデール，ニューヨーク州）を、パワー９０Ｗで４５分間、１.５分のインターバルで３分のバースト、プローブ浸漬４分で稼動させて用いてＭＬＶ分散液を超音波破砕することによって、小さい単一膜小胞（ＳＵＶ）を調製した。超音波破砕容器を氷水で冷却し、マテリアルの過熱を防いだ。超音波破砕後、金属断片（プローブから）を、４０,０００ｒｐｍで、１５℃で２０分間の遠心分離によって除去した。ＤＭＰＣ−ＳＵＶを、即座に、約３.８／１（脂質／タンパク質，ｗ／ｗ）の割合で上述の融合タンパク質調製物に加え、２４℃で一晩インキュベートした。次に、トロンビンを、脂質タンパク質複合体に、１／１０００（トロンビン／融合タンパク質，ｗ／ｗ）の割合で加え、切断反応を室温で３０分間進行させた。β−メルカプトエタノール（最終濃度０.１％）の添加によって反応を止め、この混合物を固体ＫＢｒで密度１.２２５に調節し、ＴＬＳ−５５ローター（ベックマンインスツルメンツ社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．），パロアルト，カリフォルニア州）を用いて、５５,０００ｒｐｍで４４時間遠心分離することによってリポタンパク質分画を単離した。チューブをスライスすることによって上部の０.３ｍｌを除去し、このようにして得られたリポタンパク質分画を、２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムに対して透析し、凍結乾燥した。
【００７０】
ＦＰＬＣによるａｐｏＥの精製
２：１のクロロホルム：メタノールを用いて凍結乾燥したリポタンパク質を脱脂化した。タンパク質ペレットを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０.１Ｍトリス（ｐＨ７.４）緩衝液（０.０１％ＥＤＴＡ、および、１％β−メルカプトエタノールを含む）に一晩可溶化し、このタンパク質溶液を０.４５ミクロンのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターでろ過し、４Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０.１Ｍトリス（ｐＨ７.４）緩衝液（０.０１％ＥＤＴＡ、および、０.１％β−メルカプトエタノールを含む）で平衡化した、直列に（底と底で）連結させた２つの２.６×６０ｃｍ ハイプレップ（ＨｉＰｒｅｐ）セファクリルＳ−３００カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ），ピスカタウェイ，ニュージャージー州）にかけた。カラムクロマトグラフィーをＦＰＬＣシステム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）で行った。このカラムにサンプルを１２ｍｌ／時間で注入し、カラム流速を３０ｍｌ／時間とした。カラム溶出液の吸光度を２８０ｎｍでモニターした。所定の吸光度ピークを形成する分画を個々に１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムに対して透析し、タンパク質濃度をＢＣＡ方法（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ），ロックフォード，イリノイ州）で測定し、分画の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタン分析で測定した。
【００７１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＭＥＳ泳動緩衝液中でノヴェックス（Ｎｏｖｅｘ）ＮｕＰＡ
ＧＥ４−１２％ビス−トリスゲルを用いて行われた。ゲルを２００ボルトで３５分間泳動した。ゲルを固定し、ノヴェックスのコロイダルブルー染色キットを用いて染色した。ウェスタン分析のために、タンパク質を、ＮｕＰＡＧＥトランスファー緩衝液中でニトロセルロース（０.２μｍ孔サイズ；ノヴェックス，カールスバッド，カリフォルニア州）に移した。このトランスファーを３０ボルトで１時間泳動した。メンブレンを、振盪しながら、室温で１時間、ブロッキング緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ８.０），２ｍＭのＣａＣｌ2、８０ｍＭのＮａＣｌ、５％乾燥脱脂乳、０.２％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、および、０.０１％アンチフォームＡ）に置いた。メンブレンを、ヤギ抗カニクイザルａｐｏＥ（１２）（ブロッキング緩衝液で１：１０００に希釈）と共に、室温で１時間インキュベートした。メンブレンを、ブロッキング緩衝液で１５、５および５分間連続的に３回洗浄し、続いて、ＨＲＰ標識マウス抗ヤギＩｇＧ（ブロッキング緩衝液で１：５０００に希釈）の存在下で、５０分間インキュベートした。メンブレンを、ブロッキング緩衝液で１５、５、５および５分間連続的に４回洗浄し、続いて、ＥＣＬ検出試薬（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）の存在下で１分間浸し、その後、ハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）に露光した。
【００７２】
精製したＡｐｏＥの脂質化
精製したａｐｏＥアイソフォームを上述した通りに得た。１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）の小さな単一膜小胞（アバンティ・ポーラー・リピッド（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ），カタログ番号８５０４５７）と共に、精製したａｐｏＥアイソフォームをインキュベートすることによって、ａｐｏＥの脂質化を行った。４０ｍｌガラス製コニカルチューブ中でＰＯＰＣ（１２０ｍｇ）をクロロホルム３ｍｌに溶解させた。窒素流下で、チューブ壁上で脂質を乾燥させた。脂質が乾燥したように見えたら、チューブを５０℃の水浴で加熱し、溶媒が完全に蒸発するまでＮ2でフラッシングした。溶媒を除去した後、２０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3（１２ｍｌ）を加え、チューブを５０℃の水浴中で１時間インキュベートし、次に、超音波破砕の水浴に１０分間置いた。次に、このインキュベート手法を１回繰り返した。これにより、リン脂質をチューブ壁から分散させ、極めて大きな多層小胞（ＭＬＶ）の乳状の懸濁液を調製した。ヒート・システムズのソニケーターモデルＸＬ−２０２０（ミソニックス）を、パワー９０Ｗで４５分間、１.５分のインターバルで３分のバースト、プローブ浸漬４分間で稼動させて用いてＭＬＶ分散液を超音波破砕することにより、小さい単一膜小胞（ＳＵＶ）を調製した。超音波破砕の容器を氷水で冷却し、マテリアルの過熱を防いだ。超音波破砕後、金属断片（プローブから）を、４０,０００ｒｐｍで２０分間、１５℃の遠心分離によって除去した。即座に、ＰＯＰＣ−ＳＩＴＶを、ａｐｏＥ、または、コントロールとしてウシ血清アルブミン（シグマ，カタログ番号Ａ７０３０）に約３〜８／１（脂質／タンパク質，ｗ／ｗ）の割合で加え、２４℃で１７.５時間インキュベートした。サンプルを４℃で保存し、２４時間後にＡβ１−４０との相互作用研究に用いた。
【００７３】
実施例３
調整細胞培地からのＡｐｏＥの単離
ネオマイシン耐性下で選択した、ヒトａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３、またはａｐｏＥ４のｐｃＤＮＡで安定してトランスフェクトしたヒト星状細胞腫細胞からヒトａｐｏＥを含む培地を分離した。細胞が５０％および８０％密度になったら培地交換して、その３日間後に血清非含有培地を回収し、タンパク質分解を防ぐために培地にプロテアーゼ阻害剤（完全プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット，１タブレット／５０ｍｌ培地，ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を添加した。サンプルを−２０℃で保存した。ＭＷカットオフが１０ｋＤａのセントリコン・プラス（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ）−８０遠心分離フィルター（アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．））で、大量の培地の濃縮を行った。調整培地中でａｐｏＥ２が低レベルであったため、同様にＭＷカットオフが１０ｋＤａの小量用のセントリコンＹＭ−１０遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．）でａｐｏＥ２培地をさらに濃縮した。ＡｐｏＥ３およびａｐｏＥ４培地を３０〜５０倍に濃縮し、ａｐｏＥ２は約１００倍に濃縮した。トランスフェクトされていない星状細胞腫細胞調整培地も同じ方法で濃縮し、バックグラウンド決定に用いた。脂質フロテーション超遠心分離に必要になるまで培地を−２０℃で保存した。
【００７４】
超遠心による調整培地脂質フロテーション
調整培地中で脂質化されたａｐｏＥを得るための超遠心分離手法をＨａｖｅｌ（１９８７年）の改変プロトコールを用いて行った。濃縮調整培地を、固体ＫＢｒで密度１.２２５に調節した（固体ＫＢｒ０.７０６ｇを培地２ｍｌに加え、ＮａＣｌ塩溶液（１.２２５ｇ／ｍｌ）２.３ｍｌを加えて、液体の高さを高めた）。ＴＬＳ−５５ローター（ベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を用いて、２４時間、１５℃で、５５,０００ｒｐｍで遠心分離することによってリポタンパク質画分を単離した。チューブをセントリチューブ・スライサー（ベックマン・インスツルメンツ）でスライスすることによって、上部の０.３ｍｌを除去した。ＭＷカットオフが１０ｋＤａのスライド−Ａ−ライザー透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ）（ピアース）を用いて、脂質に結合したａｐｏＥ粒子を含む上層と、脂質化されていないａｐｏＥを含む底の層を、ＤＰＢＳに対して透析した。我々は、組織培養由来のａｐｏＥ４は、新鮮なもの用いることが好ましく、マテリアルを凍結すると活性が失われることを見出した。
【００７５】
活性化ベータアミロイドペプチド種と、脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドとの結合を評価する分析法
上述したように、ａｐｏＥは、直接的なタンパク質−タンパク質相互作用によってＡβの沈着またはクリアランスに関与すると考えられている。直接サンドイッチＥＬＩＳＡにより、３種の主要なａｐｏＥアイソフォーム（ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３、ａｐｏＥ４）と、自発的凝集の様々なフェーズで得られたＡβ１−４０との相互作用が検出された。しかしながら、精製した脱脂質化ａｐｏＥは、０分でＡβの中間凝集型とのみ結合する相互作用を示し、アイソフォーム特異的な差はみられなかった。しかしながら、ａｐｏＥが生物学的な脂質のパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（生物学的に活性な型のａｐｏＥ）と結合すると、ａｐｏＥ４は、ａｐｏＥ２およびａｐｏＥ３よりも高い結合活性で中間活性Ａβに結合した。この相互作用を、ａｐｏＥのＮ末端に対するエピトープを有するＥＬＩＳＡキャプチャーａｐｏＥ抗体で検出した。キャプチャーにＣ末端ａｐｏＥ抗体を用いたところ、検出可能な結合がないことを実証した。以下に述べるように、これらは（用いられた抗体の既知の結合特異性の観点で）、ａｐｏＥ４の、Ａβ活性型との相互作用は、ａｐｏＥ４のアミノ酸残基２４３〜２７２の周辺に属することを示す。
【００７６】
ａｐｏＥ遺伝子型に関して識別されるＡＤの危険性は、ａｐｏＥ４のＡβの中間活性型への結合能力が高められた結果という可能性がある。そのようなものとして、この相互作用の崩壊は、ＡＤに罹りやすいａｐｏＥ４キャリアーで蓄積された脳のＡβ斑を減少させる可能性がある。ａｐｏＥ４とＡβとの相互作用を止めさせることは、ＡＤ治療のための代替の治療的アプローチを提供することになり、薬物の介入またはａｐｏＥ４への免疫化によって達成することができる。
【００７７】
実施例４
Ａβ１−４０の凝集型とのＡｐｏＥ複合体形成
ＬａＤｕによって行われたペプチドの濃度比率と同様にして結合反応を行った。精製し、ＰＯＰＣ脂質化ａｐｏＥしたアイソフォームを１００ｎＭに希釈した ＤＰＢＳ（改変ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（０.０１５Ｍリン酸ナトリウム，０.００３Ｍリン酸カリウム，０.２９Ｍ塩化ナトリウム，０.０１Ｍ塩化カリウム，ｐＨ７.４）、および、各調製物５００μｌを別個の１４ｍｌ滅菌ポリスチレン丸底チューブ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））に入れた。コントロール条件は、精製したａｐｏＥ媒体（２０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3）、および、ＢＳＡ ＰＯＰＣ（いずれもＤＰＢＳで希釈）を利用した。凝集Ａβの１４〜１８ウェルの内容物をそれぞれ０分、６０分、８０分、および１１０分の凝集インターバルでプールした。Ａβ（５００μｌ）を、即座に、ａｐｏＥおよびコントロールに加え、インキュベート混合物中で最終濃度をＡβ１−４０は２５μＭ、ａｐｏＥは５０ｎＭにした。ニューテーター（Ｎｕｔａｔｏｒ）（クレイ・アダムス（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ））で、混合物を室温で２時間おだやかに揺すった。サンプルを、即座に、複合体形成を検出するための直接サンドイッチＥＬＩＳＡに加えた。
【００７８】
直接サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたＡβ１−４０の凝集型とのＡｐｏＥ複合体形成の検出
液相直接サンドイッチＥＬＩＳＡで、脂質化ａｐｏＥとＡβ１−４０との相互作用を評価した。この相互作用を様々な抗ａｐｏＥ抗体で特徴付けた。ａｐｏＥの２９９個のアミノ酸残基のＮ末端を認識する抗体は、残基１〜１５を認識するマウスモノクローナル抗体６Ｃ５（オタワ・ハート・インスティテュート・リサーチ社（Ｏｔｔａｗａ Ｈｅａｒｔ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．），オタワ，オンタリオ）、および、Ｎ末端ドメイン中の非特異化エピトープを認識するマウスモノクローナル抗体９Ｈ８−Ｇ５．Ｆ２（バイオデザイン・インターナショナル（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））である。Ｃ末端の認識のために、マウスモノクローナル抗体３Ｈ１（オタワ・ハート・インスティテュート・リサーチ社，オタワ，オンタリオ）は、残基２４３〜２７２内のエピトープと結合する。ａｐｏＥを５０μｌ／ウェルで捕獲するために、ＥＬＩＳＡの１／２ウェルの平底９６ウェルプレート（コーニング）を、３種のマウスモノクローナル抗体（６Ｃ５［２μｇ／ｍｌ］、９Ｈ８．Ｇ５．Ｒ２［２μｇ／ｍｌ］、および、３Ｈ１［１μｇ／ｍｌ］）のうち一種でコーティングした。全ての抗体を１００ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3で調整し、４℃で一晩インキュベートした。ＤＰＢＳ中；１００μｌ／ウェルで１％ＢＳＡを用いてプレートを４℃で一晩ブロックした。複合体反応が完了した後、Ａβ１−４０の凝集型を用いたＡｐｏＥおよび媒体コントロール反応液を、抗ａｐｏＥ抗体をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加え、プレートを４℃で一晩インキュベートした（５０μｌ／ウェル）。結合したＡβ１−４０を、ＤＰＢＳ中の１％ＢＳＡで希釈したビオチン化マウスモノクローナル抗Ａβ抗体４Ｇ８（０.５μｇ／ｍｌ，Ａβ１−４０の残基１７〜２４を認識，シグネット（Ｓｉｇｎｅｔ））で検出し、室温で２時間インキュベートした（５０μｌ／ウェル）。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ，［０.１μｇ／ｍｌ］，ピアース）に結合したニュートラビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）を、ビオチンと６０分間反応させた（５０μｌ／ウェル）。５０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（キルケゴール＆ペリー（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ））を２〜５分間添加して、ＨＲＰで変換されて着色した最終産物が生成され、１ＭのＨ3ＰＯ4（２５μｌ／ウェル）を用いて反応を止めた。着色した終点を、４５０ｎｍの吸光度で、モレキュラー・デバイスのＶｍａｘプレートリーダーを用いて検出した。ＥＬＩＳＡに新しい層を加える前に、スカトロン（Ｓｋａｔｒｏｎ）自動化プレートウォッシャーを用いてウェルをＢｕｐＨ改変ダルベッコＰＢＳ（ピアース）で洗浄した。各処理群を３重複のウェルで行い、非脂質化ａｐｏＥは３〜４回、脂質結合ａｐｏＥは４〜５回、実験を繰り返した。
【００７９】
様々なＡβ１−４０凝集型と、非脂質化、および、脂質結合ＡｐｏＥアイソフォームとの結合相互作用
凝集プロセス中の様々な時点で取られたＡβ１−４０のアリコートをａｐｏＥアイソフォームへの結合に関して評価した。これらのＡＳ形態のいずれか１つの濃度のみが、凝集の全時間経過中最大値を記録したことを示した。ａｐｏＥとＡβ１−４０との相互作用を、０分の開始時の形態と、６０分の凝集したＡβ１−４０を用いて観察した。ＡｐｏＥのＮ末端の抗体６Ｃ５、および、９Ｈ８．Ｇ５．Ｆ２により、脂質化ａｐｏＥの、６０分の凝集したＡβアリコートへの結合の、アイソフォーム特異的な差が検出された（図６Ａおよび６Ｃ）。これら抗体により、ａｐｏＥ２およびａｐｏＥ３に比べて２.２〜３.３倍高い親和性の、ａｐｏＥ４の６０分の混合物への結合が検出された（ｐ＜０.０５）。これらアイソフォーム特異的な差は、非脂質化ａｐｏＥアイソフォームが、６０分の凝集したＡβと相互作用した際は失われた（ｐ＞０.０５）（図６Ｂおよび６Ｄ）。それに比べて、ａｐｏＥのＣ末端の抗体３Ｈ１により、脂質に結合したａｐｏＥの、６０分の凝集したＡβ１−４０に結合する相互作用は、ごくわずかしか検出されなかった（図７Ａ）。これらの観察もまた、アイソフォーム非特異的な相互作用が観察された非脂質化ａｐｏＥでも実証された（図７Ｂ）。興味深いことに、非脂質化ａｐｏＥの、Ａβ１−４０の６０分の凝集した形態への結合は、６Ｃ５，９Ｈ８．Ｇ５．Ｆ２および３Ｈ１抗体を用いて、ａｐｏＥ３およびａｐｏＥ４よりもａｐｏＥ２の結合が高いという傾向を示した（図７Ｂ、７Ｄおよび７Ｂ）。しかしながら、これらの差異は有意ではなかった（ｐ＞０.０５）。また、注目すべきは、６Ｃ５により、脂質に結合したａｐｏＥ、および、非脂質化ａｐｏＥの両方と、０分のＡβ１−４０形態（図６Ａおよび６Ｂ）との相互作用が検出され、ａｐｏＥアイソフォーム特異的な差は観察されなかったことである。さらに、脂質化ａｐｏＥアイソフォームと、非脂質化ａｐｏＥアイソフォームとの結合の強さが類似していることを実証した（ｐ＞０.０５）。脂質化ａｐｏＥの、０分のＡβ１−４０形態への結合も３Ｈ１で検出されたが（図７Ａ）、６Ｃ５の検出よりもわずかに低い規模であった。３Ｈ１抗体を用いて、０分のＡβ１−４０の相互作用がわずかか、または、起こらないことを、非脂質化ａｐｏＥアイソフォームで検出した（図７Ｂ）。
【００８０】
脂質化ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ相互作用の阻害剤の同定
上記実施例でＥＬＩＳＡ分析システムを説明したが、その他の多数のシステムがこの相互作用の測定に適している。この目的のために、複合体中のパートナーの少なくとも１つに関して簡易検出システムが利用可能であるべきである；このような検出システムとしては、抗体に基づくもの、または、マーカー分子または放射活性で標識したタンパク質に基づくものが可能である。二択的なこの分析法の使用としては、ＡｐｏＥ４と活性化Ａβとの相互作用を調節し得る物質に関して化合物コレクションをスクリーニングことが可能である。
【００８１】
溶液分析において、本発明の方法は、（ａ）ＡｐｏＥ４またはＡβポリペプチドと、１またはそれ以上の候補阻害剤化合物とを接触させる工程、および、（ｂ）ＡｐｏＥ４−Ａβ複合体を減少させる化合物を同定する工程を含む。上記結合を減少させる物質。ＡｐｏＥ４−活性化Ａβの複合体を形成する性質を調節する化合物の選択性は、その他のタンパク質−タンパク質相互作用に対するその効果を比較することによって評価することができる。
【００８２】
ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体形成の阻害剤は、正常または異常なアミロイド沈着が関与する病気および生理学的な症状の治療において、治療上有用である可能性がある。
【００８３】
ＡｐｏＥ４−活性化Ａβの相互作用を測定するのに有用なことが証明できる分析法は当業界周知であり、例えば、ただしこれらに限定されないが、以下のものが挙げられる：平衡またはメンブレンフロー透析、抗体結合分析、ゲルシフト分析、インビトロの結合分析、フィルター結合分析、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、共免疫沈降反応、イムノゴールド共免疫沈降反応、共免疫定位、共結晶化、蛍光エネルギー移動、競合結合分析、化学的な架橋、および、親和性による精製。
【００８４】
ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ相互作用に作用する抗体などの化合物は、以下の病状：アルツハイマー病、パーキンソン病気、多発性硬化症，ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、
頭部の外傷によるダメージ、ピック病、前頭葉型痴呆、小脳の変質、虚血再潅流の障害、卒中、虚血性障害、および、統合失調症を含む病気の治療に有用な治療剤である。
【００８５】
実施例５
阻害剤を検出するためのインビトロの結合分析法
ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体形成をモニターする分析法は、その相互作用の阻害剤をスクリーニングするのに有用である。結合分析は、理論上、２つの形態の一方をとる：Ａβポリペプチドは、ＡｐｏＥ４ポリペプチドへの結合に用いることができ、また逆に、ＡｐｏＥ４ポリペプチドは、Ａβポリペプチドへの結合に用いることができる。いずれの場合においても、加えられる物質の非存在下でポリペプチドの特異的な結合により複合体を形成することができる条件下で、他方のポリペプチドが、固定化したポリペプチドと接触する。特定の水性条件は、従来の方法に従って専門家によって選択することができる。一般的な指示に従って、改変ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（０.０１５Ｍリン酸ナトリウム、０.００３Ｍリン酸カリウム、０.２９Ｍ塩化ナトリウム、０.０１Ｍ塩化カリウム、ｐＨ７.４）に、ニ価カチオン、および／または、金属キレート化剤、および／または、非イオン性界面活性剤、および／または、膜分画を必要に応じて添加した。付加、欠失、改変（例えばｐＨ）、および、変更（例えばＫＣｌのＮａＣｌへの変更、または、緩衝液の変更）を、これら基本条件に対して行ってもよい。コントロール反応でＡβのＡｐｏＥ４への特異的な結合が生じる範囲で、改変を基本的な結合反応条件に対して行ってもよい。このような反応において、典型的には、少なくとも１つのポリペプチド種が検出可能なマーカーで標識される。適切な標識としては、これらに限定されないが、放射標識されたアミノ酸（例えば、14Ｃで標識されたロイシン、3Ｈで標識されたグリシン、35Ｓで標識されたメチオニン）の取り込みによる放射標識、翻訳後の125Ｉもしくは131Ｉでの放射性ヨウ素化による放射標識（例えば、ボルトン−ハンター反応、および、クロラミンＴ）、32Ｐ（例えば、ホスホリラーゼおよび無機の放射標識されたリン酸）での翻訳後のリン酸化による標識、蛍光標識（例えば、フルオレセインまたはローダミン）取り込みによる蛍光標識、または、その他の当業界既知の従来の方法による標識が挙げられる。ポリペプチド種の１種が基質への連結により固定化されている実施形態において、一般的に、その他のポリペプチドは、検出可能なマーカーで標識される。
【００８６】
本発明で説明されたような水性条件下で、標識されたポリペプチドと、固定化ポリペプチドと接触させる。結合反応のインキュベートの時間と温度は、薬剤を存在させないコントロール反応で特異的な結合が生じるように選択された条件で、必要に応じて変化させる。好ましい実施形態では、反応温度は、少なくとも約１５℃、より好ましくは３０〜４２℃、インキュベート時間は、少なくとも約１５秒を用いるが、いくつかの実施形態においては、結合平衡が達成させるように、より長いインキュベート時間、３０秒〜１分〜数分間またはそれ以上も好ましい。結合したＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の結合カイネティクスおよび熱力学的な安定性によって、時間、温度、塩、ｐＨ、および、その他の反応条件の可変範囲が決定される。しかしながら、いずれの特定の実施形態においても、望ましい結合反応条件は、当業界の従来の方法を用いて専門家によって容易に較正することができ、例えば、スキャッチャード分析を用いた結合分析、ヒル分析、およびその他の標準的な分析方法が挙げられる（Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，（１９８４年）Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（編），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク）。
【００８７】
標識されたＡβまたはＡｐｏＥ４ポリペプチドの、それぞれ固定化されたＡβまたはＡｐｏＥ４への特異的な結合は、標識されていない競合タンパク質（例えば、アルブミン）を含ませることによって測定される。同様に、標識されたＡβまたはＡｐｏＥ４それぞれの特異的な結合は、標識されていない競合タンパク質（例えば、アルブミン）を含ませることによって測定される。結合反応が完了した後、固定化ポリペプチドに特異的に結合し
た標識したポリペプチドが検出される。例えば（ただし限定されない）、結合のための適切なインキュベート時間の後、固定化されていないタンパク質を含む水相が除去され、固定化ポリペプチド種を含む基質、および、それに結合したあらゆる標識されたタンパク質は、適切な緩衝液（必要に応じて非標識ブロッキング剤を含む）で洗浄され、洗浄緩衝液を除去する。洗浄後、残存した、特に固定化ポリペプチドに結合した検出可能な標識の量を測定する（例えば、光学的、酵素的、オートラジオグラフィーによる、または、その他の放射化学的方法によって）。
【００８８】
いくつかの実施形態において、非特異的な結合を阻害する非標識ブロッキング剤の添加が含まれ、このようなブロッキング剤の例としては、ただしこれらに限定されないが、以下のが挙げられる：子ウシ胸腺ＤＮＴＡ、サケ精子ＤＮＡ，酵母ＲＮＡ、様々な長さの混合型配列（ランダムまたは偽ランダム配列）オリゴヌクレオチド、ウシ血清アルブミン、非イオン性界面活性剤（ＮＰ−４０，トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００など）、乾燥脱脂乳タンパク質、デンハルト試薬、ポリビニルピロリドン、フィコール、および、その他のブロッキング剤。専門家は、それらの選択において、結合分析で用いるのに適切な濃度でブロッキング剤を選択することができる；しかしながら、反応条件は、コントロール結合反応でＡｐｏＥ４−活性化Ａβの特異的な結合が可能になるように選択される。ブロッキング剤は、標識されたタンパク質の固定化タンパク質への非特異的な結合を阻害し、および／または、標識されたポリペプチドの固定化基質への非特異的な結合を阻害するために含める。当然のことながら、反応の特異性を評価するために、コントロール反応でその他のａｐｏＥアイソフォームを用いてもよい。
【００８９】
ポリペプチドが固定化される実施形態において、基質への共有結合または非共有結合を用いてもよい。共有結合の化学としては、ただしこれらに限定されないが、よく特徴付けられた当業界既知の方法（ＫａｄｏｎａｇａおよびＴｊｉａｎ（１９８６年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ.Ｓ.Ａ.）８３：５８８９）が挙げられる。一例（ただし限定されない）としては、ブロモシアンで誘導体化された基質（例えばＣＮＢｒで誘導体化された セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ）への共有結合が挙げられる。基質による可能性のある立体障害を減少させるスペーサーを用いることも望ましい場合がある。基質へのタンパク質の非共有結合としては、ただしこれらに限定されないが、帯電した表面（例えばビーズ上）へのタンパク質の接着、および、特異的な抗体との結合が挙げられる。
【００９０】
実施形態の１つの分類において、並行した結合反応が行われ、この反応において、反応の１セットがコントロールとして作用し、少なくとも１つの他方の反応のセットに、ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の結合または形成を阻害する能力に関して試験しようとする様々な量の薬剤、薬剤の混合物または生物学的な抽出物を含む。それによって、結合反応に加えた場合に、ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体形成を阻害する物質が阻害剤として同定される。
【００９１】
好ましい実施形態において、数種の結合反応が、例えば、数種のサンプルの同時の分析を可能にする様式（マイクロタイタープレートなど）を用いて、同時にモニターされる。好ましい実施形態において、このような分析は、例えば、サンプルをマイクロタイタープレートにピペッティングするためのロボット技術を用いて、自動化される。
【００９２】
ＡｐｏＥ４またはＡβの、そのパートナーへの結合を検出するための１つの手段は、脂質化ＡｐｏＥ４で誘導されたポリペプチド、または、Ａβポリペプチドのいずれかを、例えば固体支持体への共有結合または非共有結合的な化学結合によって固定化すること、および、固定化脂質化ＡｐｏＥ４またはＡβポリペプチドのいずれかと、検出可能なマーカーで標識された（例えば、放射標識されたアミノ酸の取り込み、蛍光標識された抗−エピトープタグ抗体を用いたエピトープタギングおよびレポーティングなどによって）脂質化ＡｐｏＥ４またはＡβ（必要に応じて）と接触させることである。このようにして接触させることは、典型的には、ＡｐｏＥ４のＡβへの結合が可能な水性条件で行われる。標識された成分の固定化成分への結合は、標識された成分が、特異的な結合の相互作用の結果として固定化される程度を測定することによって測定される。このような特異的な結合は、可逆的でもよいし、または、場合よっては、架橋剤が適切な実験条件で加えられる場合は不可逆的でもよい。
【００９３】
それによって、結合した複合体の形成を阻害する物質は、物質を含まないコントロール結合反応と比較して阻害剤として同定され、これは治療剤候補である。
【００９４】
一実施形態において、結合した標識された複合体と表面との物理的な相互作用が、報告されており、例えば、表面が光体またはシンチラントであり、結合した標識された複合体中の標識が、表面の蛍光体またはシンチラントの活性化に適した放射線を放出する；表面から放出された光が、結合した標識された複合体の相対的な量をレポートする。適切なシステムは、シンチレーション近接分析（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））であり、これにおいて、標識されていない成分が蛍光体を含むビーズに結合する。その他のシステムとしては、「フラッシュプレート」システム（ＬＫＢ）が挙げられる。
【００９５】
変形法において、固定化は必要ではない；脂質化ＡｐｏＥ４−またはＡβのいずれかが、第一の蛍光体で標識され（その第一の蛍光体が放射線（粒子または波動）を吸収し第一の波長で発光または蛍光を放出する）、さらに、他方の成分が、第二の蛍光体で標識される（その第二の蛍光体が、前記第一の波長で放射線を吸収し、それによって第二の波長で蛍光または発光放射線を放出する）。標識された脂質化ＡｐｏＥ４またはＡβ、および、適切な結合パートナーは、適切な結合条件下で、適切な反応濃度でインキュベートされ（第二の波長の放射線の量は、ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の量にほぼ比例する）、第一の波長の放射線（または粒子タイプ）で励起され、および、第二の波長の放出された放射線量が検出される。第二の波長の相対的な放射線量は、脂質化ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の相対的な量を示す。適切なシステムの例は、色素−色素（ｄｙｅ−ｄｙｅ）トランスファーシステム（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ））である。
【００９６】
もちろん、これら分析は、単なる例として示されたものであり、これら方法は改変することが可能であり、また、ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ相互作用を分析するその他の方法も当業者には明白であることと認識されるべきである。
【００９７】
本発明はまた、脂質化ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ相互作用を阻害する化合物を同定するためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）分析を含む。ＨＴＳ分析により、多数の化合物を効率的な方法でスクリーニングすることができる。ａｐｏＥ４−活性化Ａβ相互作用を試験するために、細胞ベースのＨＴＳシステムが考慮される。ＨＴＳ分析は、望ましい特性を有する「ヒット」または「リード化合物」を同定するように設計され、それから望ましい特性が改善されるように修飾を設計することができる。
【００９８】
本発明の分析と本発明で説明された分析で発見された治療剤の代表的な例としては、ただしこれらに限定されないが、タンパク質複合体と結合するタンパク質の欠損型（人工的に加工した、または天然に存在するもののいずれか）、抗体、タンパク質の阻害フラグメント、結合を破壊するタンパク質をコードする野生型および改変遺伝子，小さい有機分子、アンチセンス核酸配列、トリプレックス機構により発現または活性を阻害するオリゴヌクレオチド、ペプチド、アプタマーオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。より特定には、人工的に加工したタンパク質の例としては、ただしこれらに限定されないが、保存された活性部位（例えば、ＡＴＰ結合モチーフ、ＤＮＡまたはタンパク質結合ドメイン、触媒部位など）が不活性化された突然変異、少なくとも１つの阻害ドメインを含む融合タンパク質などを含むタンパク質が挙げられる。
【００９９】
上記薬剤は、多種多様な源から得ることができる。例えば、有機合成の標準的な方法を用いて、特に関連するタンパク質−タンパク質相互作用破壊する小さい有機分子を製造することができる。加えて、莫大な数の化合物（有機、ペプチド、または、核酸であり、Ｇａｌｌｏｐ等，１９９４年，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（９）：１２３３〜１２５１；Ｇｏｒｄｏｎ等，１９９４年，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（１０）：１３８５〜１４０１；および、米国特許第５,４２４,１８６号で総説されており、これら全て、参照により本発明に加入させる）を含むコンビナトリアルライブラリーを、ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ結合に関与するタンパク質−タンパク質相互作用を結合および阻害する能力に関してスクリーニングしてもよい。
【０１００】
詳細な説明などの本願の全内容から、本発明のさらなる特徴および変形は、当業者には明白と思われ、このような特徴は全て、本発明の態様とみなされる。同様に、ここで説明された本発明の特徴は、さらなる実施形態に再構成することもでき、これらも、特徴の組み合わせが、本発明の態様または実施形態として特に上述されているかどうかに関係なく本発明の態様とみなされる。また、本発明で本発明にとって重要である説明された限定のみこのようにみなされるべきであり、本発明で重要と説明されていない限定を含まない本発明の変形は、本発明の態様とみなされる。当然ながら、本発明は、上述の説明および実施例で特に説明されたものとは別の方法で実施してもよい。
【０１０１】
上記の教示から本発明の多数の改変および 変形が可能であり、それゆえに、本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】濁度検出による代表的なＡβ１−４０振盪凝集実験である。
【図２】濁度およびペプチド濃度の時間依存性である。
【図３】ＣＤ検出による自発凝集のカイネティクスである。
【図４】凝集時間の関数としてのＡβ１−４０のＣＤスペクトルにおける変化である。
【図５】凝集に対するペプチド濃度の効果である。
【図６】抗ａｐｏＥのＮ末端キャプチャー抗体を用いたＥＬＩＳＡによる、様々な形態のＡβ１−４０への、脂質化した、および、脂質化されていないａｐｏＥの結合の検出である。
【図７】抗ａｐｏＥのＣ末端キャプチャー抗体３Ｈ１を用いたＥＬＩＳＡによる、様々な形態のＡβ１−４０への、脂質化した、および、脂質化されていないａｐｏＥの結合の検出である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体形成阻害剤化合物を同定する方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドと、活性化Ａβポリペプチドとを接触させる工程；および、
（ｂ）ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の形成を減少させる試験化合物を同定する工程
を含み、脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体の形成を減少させる試験化合物が、複合体形成阻害剤化合物である、上記方法。
【請求項２】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から単離した組換えポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞はエシェリキア・コリである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞はヒト星状細胞腫細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
活性化Ａβポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から精製および単離した組換えポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ａβポリペプチドは合成である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試験化合物は抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試験化合物はヒト化抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、配列番号１の残基１１２〜２７２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、配列番号１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体形成阻害剤化合物を同定する方法であって、
（ａ）活性化Ａβポリペプチドを製造する工程；および、
（ｂ）試験化合物の存在下で、該活性化Ａβポリペプチドと、脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドとを接触させる工程；および、
（ｃ）脂質化ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の形成を減少させる化合物を同定する工程を含み、脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体の形成を減少させる試験化合物が、複合体形成阻害剤化合物である、上記方法。
【請求項１２】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から単離した組換えポリペプチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞はエシェリキア・コリである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞はヒト星状細胞腫細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
活性化Ａβポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリ
ヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から精製および単離した組換えポリペプチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
Ａβポリペプチドは合成である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
試験化合物は抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
試験化合物はヒト化抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
脂質化ａｐｏＥ４で誘導されたポリペプチドは、配列番号１の残基１１２〜２７２を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
脂質化ａｐｏＥ４で誘導されたポリペプチドは、配列番号１を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体形成阻害剤化合物を同定する方法であって：
（ａ）（ｉ）試験物質の存在下で、および、
（ii）該試験物質の非存在下で、
試験化合物の存在下で、脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと、活性化Ａβポリペプチドとを接触させる工程；
（ｂ）（ｉ）試験物質の存在下で、および、
（ii）該試験物質の非存在下で
形成されたａｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の量を測定する工程；ならびに、
（ｃ）形成された脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体の量を、対応する時間で、該試験物質の存在下および非存在下で比較し、形成されたａｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の量を減少させる試験物質を選択する工程、
を含む、上記方法。
【請求項２２】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から単離した組換えポリペプチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞はエシェリキア・コリである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞は、ヒト星状細胞腫細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
活性化Ａβポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から精製および単離した組換えポリペプチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
Ａβポリペプチドは合成である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
試験化合物は抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
試験化合物はヒト化抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、配列番号１の残基１１２〜２７２を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、配列番号１を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項１】
脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体形成阻害剤化合物を同定する方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドと、活性化Ａβポリペプチドとを接触させる工程；および、
（ｂ）ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の形成を減少させる試験化合物を同定する工程
を含み、脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体の形成を減少させる試験化合物が、複合体形成阻害剤化合物である、上記方法。
【請求項２】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から単離した組換えポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞はエシェリキア・コリである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞はヒト星状細胞腫細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
活性化Ａβポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から精製および単離した組換えポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ａβポリペプチドは合成である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試験化合物は抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試験化合物はヒト化抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、配列番号１の残基１１２〜２７２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、配列番号１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体形成阻害剤化合物を同定する方法であって、
（ａ）活性化Ａβポリペプチドを製造する工程；および、
（ｂ）試験化合物の存在下で、該活性化Ａβポリペプチドと、脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドとを接触させる工程；および、
（ｃ）脂質化ＡｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の形成を減少させる化合物を同定する工程を含み、脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体の形成を減少させる試験化合物が、複合体形成阻害剤化合物である、上記方法。
【請求項１２】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から単離した組換えポリペプチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞はエシェリキア・コリである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞はヒト星状細胞腫細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
活性化Ａβポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリ
ヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から精製および単離した組換えポリペプチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
Ａβポリペプチドは合成である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
試験化合物は抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
試験化合物はヒト化抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
脂質化ａｐｏＥ４で誘導されたポリペプチドは、配列番号１の残基１１２〜２７２を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
脂質化ａｐｏＥ４で誘導されたポリペプチドは、配列番号１を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体形成阻害剤化合物を同定する方法であって：
（ａ）（ｉ）試験物質の存在下で、および、
（ii）該試験物質の非存在下で、
試験化合物の存在下で、脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと、活性化Ａβポリペプチドとを接触させる工程；
（ｂ）（ｉ）試験物質の存在下で、および、
（ii）該試験物質の非存在下で
形成されたａｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の量を測定する工程；ならびに、
（ｃ）形成された脂質化ＡｐｏＥ４由来ポリペプチドと活性化Ａβとの複合体の量を、対応する時間で、該試験物質の存在下および非存在下で比較し、形成されたａｐｏＥ４−活性化Ａβ複合体の量を減少させる試験物質を選択する工程、
を含む、上記方法。
【請求項２２】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から単離した組換えポリペプチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞はエシェリキア・コリである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞は、ヒト星状細胞腫細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
活性化Ａβポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞から精製および単離した組換えポリペプチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
Ａβポリペプチドは合成である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
試験化合物は抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
試験化合物はヒト化抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、配列番号１の残基１１２〜２７２を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
脂質化ａｐｏＥ４由来ポリペプチドは、配列番号１を含む、請求項２１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００６−５０７４８１（Ｐ２００６−５０７４８１Ａ）
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５２９１００（Ｐ２００４−５２９１００）
【出願日】平成１５年８月７日（２００３．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２２４９６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１６６４２
【国際公開日】平成１６年２月２６日（２００４．２．２６）
【出願人】（５０４３９６３７９）ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー・エルエルシー (130)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年８月７日（２００３．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２２４９６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１６６４２
【国際公開日】平成１６年２月２６日（２００４．２．２６）
【出願人】（５０４３９６３７９）ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー・エルエルシー (130)
【Ｆターム（参考）】
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