アルファ−ＭＳＨの拮抗複合ジペプチド
本発明は、鏡像異性体またはジアステレオ異性体ならびに、ラセミ混合物を含むそれらの混合物の形での、下記の一般式（Ｉ）Ａ−ＡＡ２−ＡＡ１−ＮＨ2の複合ジペプチドに関するものであり、この式においてＡは下記の一般式（ＩＩ）ＨＯＯＣ−Ｒのモノカルボン酸に対応する基を示し、この式においてＲは、一つまたは複数の不飽和を、有利には１から６の不飽和を含むことができ、ヒドロキシル基によって場合によっては置換された、および／またはフェニル基を含むことができるＣ1−Ｃ24の線形または分岐脂肪族基、あるいはリポ酸またはその還元形、ジヒドロリポ酸またはＮ−リポイル−リシンを表し、ＡＡ１とＡＡ２は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、対応するホモアミノ酸と対応するベータアミノ酸からなる群から選ばれた同一または異なるアミノ酸を表している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なアルファ−ＭＳＨの拮抗複合ジペプチドおよび医薬品として、あるいは色素除去剤としてのそれらの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
メラノコルチン受容体はＧ蛋白質に結合した７回膜貫通型受容体のスーパーファミリーに属し、ｃＡＭＰ信号の形質導入経路を刺激する（Ｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ． Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ． １９９６， ５１， ｐｐ．２８７−３１７）。メラノコルチン系は多数の生理学的な経路内に組み込まれ、それには色素沈着、炎症、勃起機能、栄養吸収挙動、エネルギー恒常性、体重恒常性および外分泌腺機能が含まれる。これらのメラノコルチン受容体の内因性アゴニストのリガンドはプロオピオメラノコルチン遺伝子の転写体の形質導入後修飾によって誘導され、示差処理の際にメラニン細胞を刺激するα、βおよびγホルモン（ＭＳＨ）およびコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）を発生する。メラノコルチン受容体のサブタイプは内因性メラノコルチンの全てのペプチドによって活性化されるが、コルチコトロピンによって刺激されるだけのメラノコルチンＭＣ2の受容体は除外される。メラノコルチン受容体族は、今日までに発見されたＧ蛋白質に結合したこれらの受容体の自然状態に存在することが知られているただ二つの拮抗体であるアグーチとアグーチ関連蛋白質（ＡＧＲＰ）の内因性拮抗体も有する（Ｌｕ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ １９９４， ３７１， ｐｐ．７９９−８０２， Ｏｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７， ｐｐ．１３５−１３８， Ｓｈｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９９７， １１， ｐｐ．５９３−６０２）。それらは、それぞれ、アミノ酸の１３２および４９残基のポリペプチドである。もっとも研究されているメラノコルチン受容体リガンドは動物の毛の色素沈着と着色に関与する皮膚メラノコルチン受容体ＭＣ1のものである（Ｈｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９３， ６８０， ｐｐ．５１−６３； Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ １９６１， ｐｐ．１８９， １７６； Ｍｏｕｎｔｊｏｙ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２， ２５７， ｐｐ．１２４８−１２５１）。
【０００３】
ノナペプチド１５３ Ｎ−６（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ２６９， ｐｐ．２９８４６−２９８５４）（Ｈ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2： Ｋｉ＝１１ｎＭ）は受容体ＭＣ1の合成拮抗体である。しかしながら、この化合物は高分子であり、したがって、その治療活性または美容活性はきわめて制限されている。実際、そのサイズのために、それを至適化することは困難であり、その生物利用可能性が制限される。くわえて、該化合物は高価であり、調製が困難である。
【０００４】
トリペプチドＤ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＮＨ2（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（１９９５）， ９２， ｐｐ．２８９４−２８９８）も拮抗活性を有する。しかしながら、それには不安定なアミノ酸であるトリプトファンが含まれ、したがって、貯蔵安定性の問題が起きることがある。
【特許文献１】欧州特許第１１７４４３７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
欧州特許第１１７４４３７号明細書はナフチル基またとくにナフチルアラニル基を含むジペプチドまたはトリペプチドを記載している。しかしながら、ナフチル基の存在は製品の製造価格を増加させる。他方で、日本をはじめとするいくつかの国では、非天然アミノ酸を主成分とするペプチドは化粧品用途に販売することができない。さらに、ジペプチドのどんな活性も示されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らはカルボキシル酸とＣ−末端部位で結合したジペプチドがアルファＭＳＨの拮抗活性を有することを意外にも発見した。これらの拮抗体は分子量がきわめて小さく、したがって、至適化が容易であり、生物利用可能性に優れ、調製がきわめて容易である。
【０００７】
本発明はしたがって、鏡像異性体またはジアステレオ異性体ならびに、ラセミ混合物を含むそれらの混合物の形での、下記の一般式Ｉの複合ジペプチドに関するものである：
Ａ−ＡＡ２−ＡＡ１−ＮＨ2 （Ｉ）
この式において、
Ａは下記の一般式ＩＩのモノカルボン酸に対応する基を示している：
ＨＯＯＣ−Ｒ （ＩＩ）
この式においてＲは、
・一つまたは複数の不飽和を、有利には１から６の不飽和を含むことができる、および／またはフェニル基を含むことができる、ヒドロキシル基によって場合によっては置換されたＣ1−Ｃ24の線形または分岐脂肪族基、
・あるいはリポ酸またはその還元形、ジヒドロリポ酸またはＮ−リポイル−リシン、
を表している。
ＡＡ１とＡＡ２は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、対応するホモアミノ酸と対応するベータアミノ酸からなる群から選ばれた同一または異なるアミノ酸を表している。
【０００８】
式（Ｉ）の複合ジペプチド内のアミノ酸は、特記事項なき限り、立体配置Ｄ、ＬまたはＤＬを有することができる。
【０００９】
このように、式（Ｉ）の複合ジペプチドは一つまたは複数の非対称炭素原子を有することができる。したがって、鏡像異性体またはジアステレオ異性体の形で存在することができる。これらの鏡像異性体、ジアステレオ異性体、ならびにラセミ混合物を含むそれらの混合物は本発明に属する。
【００１０】
本発明の枠内において、略語の意味は次の通りである。
・Ａｌａ：アラニン
・Ａｓｎ：アスパラギン
・Ｃｙｓ：システイン
・Ｇｌｎ：グルタミン
・Ｇｌｙ：グリシン
・Ｉｌｅ：イソロイシン
・Ｌｅｕ：ロイシン
・Ｍｅｔ：メチオニン
・Ｐｈｅ：フェニルアラニン、またはその類似物、とくにハロゲン化誘導体、とくにパラフルオロ−Ｐｈｅ、ホモ−Ｐｈｅ、パラ−ニトロ−Ｐｈｅあるいはフェニルグリシン、
・Ｐｒｏ：プロリン
・Ｓｅｒ：セリン
・Ｔｈｒ：トレオニン
・Ｔｒｐ：トリプトファン
・Ｔｙｒ：チロシン
・Ｖａｌ：バリン
・Ａｓｐ：アスパラギン酸
・Ｇｌｕ：グルタミン酸
・Ａｒｇ：アルギニン
・Ｈｉｓ：ヒスチジン
・Ｌｙｓ：リシン
・Ｏｒｎ：オルニチン
・Ｄａｐ：ジアミノプロピオン酸
・Ｄａｂ：ジアミノブチル酸
【００１１】
なお、上述の、本発明の対象である複合ジペプチドはＮＨ2末端の形で（言い換えればアミド基を有して）得られる。
【００１２】
本発明による複合ジペプチドは式ＩＩの酸に塩またはエステルの形で結合している。本発明による結合はアミノ酸の酸基と式ＩＩの酸の酸基を反応させて実施することができる、あるいは式ＩＩの酸の上のヒドロキシ基の存在を利用することさえ可能である。
【００１３】
本発明はこれらの結合全体ならびに非機能結合にも関するものである。結合は物理的または化学的である。
【００１４】
有利には、アミノ酸ＡＡ２またはＡＡ１の少なくとも一つ、有利には両者は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、ＯｒｎまたはＬｙｓから成る群から有利には選択された、塩基性アミノ酸を表し、有利にはＡｒｇである。
【００１５】
有利にはＡＡ２は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐまたはＤａｂから成る群から有利には選択された、塩基性アミノ酸を表し、有利にはＡｒｇである。
【００１６】
有利にはＡＡ１および／またはＡＡ２はＴｒｐを表さない。
【００１７】
有利にはＡＡ１および／またはＡＡ２はＣｙｓを表さない。
【００１８】
有利にはアミノ酸ＡＡ１またはＡＡ２の少なくとも一つはＳｅｒとＰｒｏとから成る群から選択される。
【００１９】
有利にはＡＡ１はＰｒｏを表す。
【００２０】
有利にはＡＡ２はＳｅｒを表す。
【００２１】
有利には式（ＩＩ）の酸は多不飽和、すなわち１から６の不飽和を含む脂肪酸である。さらに有利には、オメガ−３酸である。
【００２２】
これらのオメガ−３酸の中で、α−リノレン酸、セルボン酸、チムノドン酸およびピノレン酸をとくに挙げることができる。セルボン酸、チムノドン酸およびピノレン酸はそれぞれ４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および５，９，１２−オクトデカトリエン酸という名前でも知られている。
【００２３】
Ａが一般式（ＩＩ）のモノカルボン酸基を表しているとき、それは有利には酢酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ヒドロキシデセン酸およびデセン酸またとりわけトランス−１０−ヒドロキシ−Δ２−デセン酸およびトランス−オクソ−９−デセン−２−オイク酸の中から選択することができる。
【００２４】
有利には、式（ＩＩ）の酸はリポ酸（Ｌｉｐ）またはその還元形ジヒドロリポ酸、Ｎ−リポイル−リシンまたはフェニルブチル酸（Ｐｂｕ）の中から選択した酸である。
【００２５】
有利には、Ａはパルミチン酸（Ｐａｌｍ）に対応する基である。
【００２６】
本発明の複合ジペプチドの中で、下記からなる群の中で選択された複合ジペプチドを挙げることができる。
ａ）Ａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ＮＨ2、
ｂ）Ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
ｃ）Ａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
ｄ）Ａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ2、
ｅ）Ａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
ｆ）Ａ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
これらの式の中でＡは上述の定義を有する。
【００２７】
本発明の複合ジペプチドの中で、下記からなる群の中で選択された複合ジペプチドを挙げることができる。
３９）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ＮＨ2、
４１）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
４９）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
５０）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ2、
１２５）Ｐａｌｍ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
２６９）Ｐａｌｍ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
３６２）Ｐｂｕ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
３６３）Ｌｉｐ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2
【００２８】
本発明の対象である複合ジペプチドは、当業者に周知の任意の方法に従って、有利には従来の化学合成によって、あるいは酵素合成によって得ることができる。
【００２９】
本発明はさらに、本発明による複合ジペプチドと、場合によっては、許容の化粧品賦形剤または医薬品賦形剤とを含有する化粧品組成物、皮膚科組成物もしくは医薬品組成物または栄養補助剤に関するものである。
【００３０】
複合ジペプチドは局所的にそれらの化粧品または医薬品としての使用のために投与することができる。それらはまた栄養補助剤に、言い換えれば経口での栄養治療分野で使用することもできる。
【００３１】
本発明による複合ジペプチドは好適には局所的に投与される。
【００３２】
局所的に投与されるための本発明による化粧品組成物、医薬品組成物または皮膚科組成物は、このタイプの投与のために通常知られている形状で、すなわち、作用成分の特性と接近容易性を向上させるためにとりわけ皮膚浸透を可能にする賦形剤とともに、例えば、とりわけローション、発泡フォーム、ゲル、分散剤、噴霧剤、血清、パック、ボディミルク、軟膏、溶液、乳化液、ジェル、あるいはクリームの形を取ることができる。これらの組成物は一般的に本発明による複合ジペプチドの他に、一般的に水または溶剤を主成分にした生理学的に許容できる媒質、例えば、アルコール、エーテルまたはグリコールを含んでいる。これらの組成物は表面活性剤、保存剤、安定剤、乳化剤、粘稠剤、相補的あるいは場合によっては相乗的効果をもたらすその他の作用成分、オリゴ元素、精油、香料、着色剤、コラーゲン、化学的または無機フィルタ、保湿剤または温泉水も含有することができる。
【００３３】
本発明による組成物において、本発明による複合ジペプチドは１０-8Ｍと１０-3Ｍの間に含まれる、有利には１０-7Ｍと１０-5Ｍの間に含まれる濃度で存在する。
【００３４】
さらに本発明は、有利には免疫異常、免疫欠陥を予防、改善または治療する、食欲を抑えて体重を調節する、中枢神経系不全を治療する、飽満を調節する、無食欲または一部の皮膚ガンを治療するための医薬品として使用するための本発明による複合ジペプチドまたは本発明による医薬品組成物にも関するものである。
【００３５】
本発明はさらに、皮膚を明るくあるいは白くする、皮膚のシミとくに老化やそばかすのシミを除去する、または皮膚の色素沈着を予防するための色素除去剤としての本発明による化粧品組成物の使用にも関するものである。
【００３６】
最後に、本発明は、本発明による化粧品組成物を皮膚に塗布することを含む、皮膚を明るくする、色素除去させるあるいは白くする、皮膚のシミとくに老化やそばかすのシミを除去する、または皮膚の色素沈着を予防するための化粧処置法に関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下の実施例は非制限的な例として挙げられるものである。
【実施例】
【００３８】
実施例１：本発明による３６１のジペプチドの調製
【００３９】
３６１の構成要素のアシル化ジペプチドのバンクはＦｅｌｉｕらの論文（Ｊ． Ｃｏｍｂ． Ｃｈｅｍ．， ２００３， ５， ｐｐ．２５６−３６１）に記載のごとくＬａｎｔｅｒｎｅｓ ＳｙｎＰｈａｓｅ（登録商標）とカラーマーキングの「ｓｐｌｉｔ ａｎｄ ｐｏｏｌ」（分離とグループ化）戦略を用いて合成した。
【００４０】
したがって、これらの３６１の化合物は、配列方式Ｍｕｌｔｉｐｉｎ９６を用いる固体相において、合成標準戦略Ｆｍｏｃ（９−フルオレニル−メトキシカルボニル）を用いてＲｉｎｋアミドＰＳ樹脂とともにＤ系列のＬａｎｔｅｒｎｅｓ ＳｙｎＰｈａｓｅ（登録商標）上で合成された。構成ブロックＡＡ１とＡＡ２は１９×１９＝３６１の組み合わせを生み出すためにいくつものタイプの側鎖（アルキル、芳香族、酸、大きなもの、塩基性）を含む１９のアミノ酸ＤとＬの化学的集合の中から選択した。
【００４１】
使用した化学物質は次の通りである：α−Ｆｍｏｃ基によってＮ−末端が保護されたアミノ酸である、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ｔｒｔ）−ＯＨは、ＳＥＮＮ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社とＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ社で購入した。
【００４２】
カップリング剤、ＨＢＴＵ（２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムのヘキサフルオロホスフェート）はＳＥＮＮ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社で購入した。
【００４３】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、メタノール、アセトニトリル、エチルエーテル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピペリジンは、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ、Ｃａｒｌｏ ＥｒｂａまたはＡｃｒｏｓ ｏｒｇａｎｉｃｓ社から購入し精製せずに使用した。
【００４４】
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリイソプロピルシラン、パルミチン酸はＡｌｄｒｉｃｈ社またはＡｖｏｃａｄｏ社で購入した。全ての試薬と化学物質は分析品質のもので、別段精製せずに使用した。
【００４５】
Ｄ系列のＬａｎｔｅｒｎｅｓ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ＲｉｎｋアミドＳｙｎｐｈａｓｅはＭｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｐｔｙから提供された。
【００４６】
これらのジペプチドの標準製造法には次の過程が含まれる。
【００４７】
１−Ｆｍｏｃ脱保護標準手順
【００４８】
Ｆｍｏｃ脱保護過程は９６軸の支えの上に固定したランタンをジメチルスルホキシド（ＤＭＦ）／ピペリジン（８０／２０、ｖ／ｖ）の混合物内に３０分間浸漬して実現した。９６ウェル標準プレートと同じ大きさのポリプロピレン製の長方形の容器を使用した。余った脱保護溶液は軸の支えを激しく揺すって単純に除去した。
【００４９】
２−洗浄標準手順
【００５０】
カップリングまたは脱保護過程の後、連続して、洗浄過程を、Ｍｕｌｔｉｐｉｎ方式に従って配置されたランタンをＤＭＦ（３×５ｍｉｎ）、メタノール（２×５ｍｉｎ）とジクロロメタン（ＤＣＭ）（１×５ｍｉｎ）を含むポリプロピレン製容器内に連続して沈めて実現した。ランタンはＤＣＭで最後に洗浄した後に、蒸気フードの下で５分間空気乾燥した。
【００５１】
３−カップリング標準手順
【００５２】
それぞれのアミノ酸Ｆｍｏｃ、ＨＢＴＵとＤＩＥＡの０．４Ｍ溶液をＤＭＦ内で調製し、合成の間を通じて４℃に維持した。アミノ酸溶液２００μｌを９６ディープウェルプレート内に分配した。ＤＩＥＡ溶液２００μｌとＨＢＴＵ溶液２００μｌをつぎに添加し、最後に、ランタンを担持している軸の支えを２時間の間ディープウェルプレートに適合させた。
【００５３】
４−分割
【００５４】
ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ）を９６ウェルＭｉｃｒｏｎｉｃプレート内に配置されたポリプロピレン製の個別管内に分配した。分割は３時間実現した。分割カクテルはＪｏｕａｎ ＲＣ１０１０真空遠心分離器を用いてプレートから直接濃縮した。化合物は乾燥ジエチルエーテルで沈殿させ、遠心分離し、一つずつ傾瀉した。沈殿、遠心分離と傾瀉作業は二回反復した。０．１％のＴＦＡを含有する５００μｌのアセトニトリル／水（５０／５０、ｖ／ｖ）をそれぞれの管内に分配して、標本を可溶化した。つぎに標本を−８０℃で冷凍し、凍結乾燥した。この作業は二回反復して精製用のトリイソプロピルシラン基を完全に除去した。
【００５５】
５−標本の調製と分析
【００５６】
完全なバンクと再合成した単純ペプチドを逆相ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳによって分析した。０．１％のＴＦＡを含有するアセトニトリル／水（５０／５０、ｖ／ｖ）５００μｌを凍結乾燥した化合物上に分配した。それぞれの管から１０μｌをとってＨＰＬＣおよびＬＣ／ＥＳＩ＋ＭＳ分析にかけた。
【００５７】
ＨＰＬＣ分析は、ＨＰＬＣ Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９０システムおよび光ダイオードバー検出器９９６と５０×４．６ｍｍのＣ１８ Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｓｐｅｅｄ ＲＯＤカラム上で実現した。流量は５ｍｌ／分、勾配は３分間でＢの１００％からＣの１００％を使用した（Ｅｌｕａｎｔ Ｂ、水／０．１％のＴＦＡ；Ｅｌｕａｎｔ Ｃ、アセトニトリル／０．１％のＴＦＡ）。純度の推定は２１４ｎｍで検出されたピークの表面の百分率に基づいている。
【００５８】
ＬＣ／ＭＳシステムは分光器Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＩＩ（電気噴霧によるイオン化モード、ＥＳＩ＋）に接続したＨＰＬＣ Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９０で構成した。全ての分析はＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラム Ｃ１８、３．５μｍ、２．１×３０ｍｍを用いて実現した。流量は６００μｌ／分、勾配は３分間でＢの１００％からＣの１００％を使用した（Ｅｌｕａｎｔ Ｂ、水／０．１％のＴＦＡ；Ｅｌｕａｎｔ Ｃ、アセトニトリル／０．１％のＴＦＡ）。
【００５９】
正イオン電気噴霧による質量スペクトルは溶剤流量１００ｍｌ／分で得た。噴霧化気体および乾燥気体の両方に窒素を用いた。データは０．１-Sの間隔で４００から１４００ｍ／ｚの読取モードで獲得した；最終スペクトルを得るために１０回の読取を加算した。
【００６０】
全ての化合物の分子量は単一同位体質量を用いて計算した（Ｃ＝１２．０００、Ｈ＝１．００７，Ｎ＝１４．００３、Ｏ＝１５．９９４、Ｓ＝３１．９７２）。
【００６１】
分析結果は下の表１に示した。
【００６２】
【表１Ａ】
【表１Ｂ】
【表１Ｃ】
【表１Ｄ】
【表１Ｅ】
【表１Ｆ】
【表１Ｇ】
【表１Ｈ】
【表１Ｉ】
【００６３】
バンクの３５の要素（網掛け）をのぞいて、全ての化合物はＥＳ＋ＬＣ／ＭＳ分析で検出した。クロマトグラム上の２１４ｎｍで検出された所期のピークの表面の百分率を元にして決定した平均純度は８３％を超えた。
【００６４】
実施例２：本発明による５つの複合ジペプチドの生物特性
【００６５】
ｃＡＭＰ生成阻害実験はα−ＭＳＨの濃度５・１０-8Ｍでヒト細胞系列Ｍ４Ｂｅ上で実現した。本発明による５つのＰａｌｍ−ジペプチドをさまざまな濃度で導入し、それぞれの測定を三回行った。二または三系列の実験を実現した。
【００６６】
試験は次のように実現した。
【００６７】
ヒト細胞系列Ｍ４Ｂｅ（Ｊａｃｕｂｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． １９７９， ７， ５９−６４）、メラニン生成が可能なメラニン細胞系列をＩＣ50の値を決定するためにこの研究に使用した。
【００６８】
細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％、グルタミン１ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０-4ｇ／ｍｌでＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ媒質内に維持した。
【００６９】
全ての細胞系列はＣＯ2が５％の雰囲気内で３７℃に維持し、細胞培地は二日ごとに更新した。細胞は、本発明によるジペプチドと接触させる２４時間前に９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）に押しつけた。
【００７０】
ｃＡＭＰは次のように測定した。
【００７１】
前日に押しつけたウェルあたり８・１０4の細胞はα−ＭＳＨが５・１０-8Ｍで３７℃、１０分間の間さまざまな濃度で本発明による５つの複合ジペプチドのうちの一つと接触させた。この後、細胞溶解を実施し、ｃＡＭＰ含有率は競争による連結テストボックス（ＲＰＮ２２５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて測定した。それぞれの独立した実験は三回で少なくとも二セット実施した。
【００７２】
ペプチド活性は未処理細胞による合成ｃＡＭＰの率とα−ＭＳＨ単独で誘導されたｃＡＭＰ生成とを参照して決定した。グラフを調節し、ＩＣ50の値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， 米国）内の非線形後退によって決定した。
【００７３】
結果は下の表２に示した。
【００７４】
【表２】
【００７５】
このように、意外なことに、試験したＰａｌｍ−ジペプチドはメラーノーマ細胞系列Ｍ４Ｂｅを用いてメラノコルチンのヒトＭＣ1受容体の拮抗体であることがわかった。これらの複合ジペプチドはミクロモル段にＩＣ50を有する。これらのジペプチドはＭＣ1受容体に結合する短合成拮抗化合物の最初の例であり、α−ＭＳＨの非ペプチド小分子拮抗体の分野を開くものである。
【００７６】
とくに、これらの化合物はＡＡ２位置にアルギニン残基を含んでいる。興味深いことに、配列の中に塩基性残基を一切持たない化合物１２５（Ｐａｌｍ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2）はＩＣ50の値１７μＭを示す。この結果はＭＣ1受容体への結合が必ずしも正の電荷の基を必要としないことを示した。
【００７７】
アミノ酸の二つの残基だけで、これらのパルミトイル化化合物はα−ＭＳＨの非ペプチド拮抗体設計のために有効な筆頭化合物であると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なアルファ−ＭＳＨの拮抗複合ジペプチドおよび医薬品として、あるいは色素除去剤としてのそれらの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
メラノコルチン受容体はＧ蛋白質に結合した７回膜貫通型受容体のスーパーファミリーに属し、ｃＡＭＰ信号の形質導入経路を刺激する（Ｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ． Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ． １９９６， ５１， ｐｐ．２８７−３１７）。メラノコルチン系は多数の生理学的な経路内に組み込まれ、それには色素沈着、炎症、勃起機能、栄養吸収挙動、エネルギー恒常性、体重恒常性および外分泌腺機能が含まれる。これらのメラノコルチン受容体の内因性アゴニストのリガンドはプロオピオメラノコルチン遺伝子の転写体の形質導入後修飾によって誘導され、示差処理の際にメラニン細胞を刺激するα、βおよびγホルモン（ＭＳＨ）およびコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）を発生する。メラノコルチン受容体のサブタイプは内因性メラノコルチンの全てのペプチドによって活性化されるが、コルチコトロピンによって刺激されるだけのメラノコルチンＭＣ2の受容体は除外される。メラノコルチン受容体族は、今日までに発見されたＧ蛋白質に結合したこれらの受容体の自然状態に存在することが知られているただ二つの拮抗体であるアグーチとアグーチ関連蛋白質（ＡＧＲＰ）の内因性拮抗体も有する（Ｌｕ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ １９９４， ３７１， ｐｐ．７９９−８０２， Ｏｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７， ｐｐ．１３５−１３８， Ｓｈｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９９７， １１， ｐｐ．５９３−６０２）。それらは、それぞれ、アミノ酸の１３２および４９残基のポリペプチドである。もっとも研究されているメラノコルチン受容体リガンドは動物の毛の色素沈着と着色に関与する皮膚メラノコルチン受容体ＭＣ1のものである（Ｈｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９３， ６８０， ｐｐ．５１−６３； Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ １９６１， ｐｐ．１８９， １７６； Ｍｏｕｎｔｊｏｙ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２， ２５７， ｐｐ．１２４８−１２５１）。
【０００３】
ノナペプチド１５３ Ｎ−６（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ２６９， ｐｐ．２９８４６−２９８５４）（Ｈ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2： Ｋｉ＝１１ｎＭ）は受容体ＭＣ1の合成拮抗体である。しかしながら、この化合物は高分子であり、したがって、その治療活性または美容活性はきわめて制限されている。実際、そのサイズのために、それを至適化することは困難であり、その生物利用可能性が制限される。くわえて、該化合物は高価であり、調製が困難である。
【０００４】
トリペプチドＤ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＮＨ2（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（１９９５）， ９２， ｐｐ．２８９４−２８９８）も拮抗活性を有する。しかしながら、それには不安定なアミノ酸であるトリプトファンが含まれ、したがって、貯蔵安定性の問題が起きることがある。
【特許文献１】欧州特許第１１７４４３７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
欧州特許第１１７４４３７号明細書はナフチル基またとくにナフチルアラニル基を含むジペプチドまたはトリペプチドを記載している。しかしながら、ナフチル基の存在は製品の製造価格を増加させる。他方で、日本をはじめとするいくつかの国では、非天然アミノ酸を主成分とするペプチドは化粧品用途に販売することができない。さらに、ジペプチドのどんな活性も示されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らはカルボキシル酸とＣ−末端部位で結合したジペプチドがアルファＭＳＨの拮抗活性を有することを意外にも発見した。これらの拮抗体は分子量がきわめて小さく、したがって、至適化が容易であり、生物利用可能性に優れ、調製がきわめて容易である。
【０００７】
本発明はしたがって、鏡像異性体またはジアステレオ異性体ならびに、ラセミ混合物を含むそれらの混合物の形での、下記の一般式Ｉの複合ジペプチドに関するものである：
Ａ−ＡＡ２−ＡＡ１−ＮＨ2 （Ｉ）
この式において、
Ａは下記の一般式ＩＩのモノカルボン酸に対応する基を示している：
ＨＯＯＣ−Ｒ （ＩＩ）
この式においてＲは、
・一つまたは複数の不飽和を、有利には１から６の不飽和を含むことができる、および／またはフェニル基を含むことができる、ヒドロキシル基によって場合によっては置換されたＣ1−Ｃ24の線形または分岐脂肪族基、
・あるいはリポ酸またはその還元形、ジヒドロリポ酸またはＮ−リポイル−リシン、
を表している。
ＡＡ１とＡＡ２は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、対応するホモアミノ酸と対応するベータアミノ酸からなる群から選ばれた同一または異なるアミノ酸を表している。
【０００８】
式（Ｉ）の複合ジペプチド内のアミノ酸は、特記事項なき限り、立体配置Ｄ、ＬまたはＤＬを有することができる。
【０００９】
このように、式（Ｉ）の複合ジペプチドは一つまたは複数の非対称炭素原子を有することができる。したがって、鏡像異性体またはジアステレオ異性体の形で存在することができる。これらの鏡像異性体、ジアステレオ異性体、ならびにラセミ混合物を含むそれらの混合物は本発明に属する。
【００１０】
本発明の枠内において、略語の意味は次の通りである。
・Ａｌａ：アラニン
・Ａｓｎ：アスパラギン
・Ｃｙｓ：システイン
・Ｇｌｎ：グルタミン
・Ｇｌｙ：グリシン
・Ｉｌｅ：イソロイシン
・Ｌｅｕ：ロイシン
・Ｍｅｔ：メチオニン
・Ｐｈｅ：フェニルアラニン、またはその類似物、とくにハロゲン化誘導体、とくにパラフルオロ−Ｐｈｅ、ホモ−Ｐｈｅ、パラ−ニトロ−Ｐｈｅあるいはフェニルグリシン、
・Ｐｒｏ：プロリン
・Ｓｅｒ：セリン
・Ｔｈｒ：トレオニン
・Ｔｒｐ：トリプトファン
・Ｔｙｒ：チロシン
・Ｖａｌ：バリン
・Ａｓｐ：アスパラギン酸
・Ｇｌｕ：グルタミン酸
・Ａｒｇ：アルギニン
・Ｈｉｓ：ヒスチジン
・Ｌｙｓ：リシン
・Ｏｒｎ：オルニチン
・Ｄａｐ：ジアミノプロピオン酸
・Ｄａｂ：ジアミノブチル酸
【００１１】
なお、上述の、本発明の対象である複合ジペプチドはＮＨ2末端の形で（言い換えればアミド基を有して）得られる。
【００１２】
本発明による複合ジペプチドは式ＩＩの酸に塩またはエステルの形で結合している。本発明による結合はアミノ酸の酸基と式ＩＩの酸の酸基を反応させて実施することができる、あるいは式ＩＩの酸の上のヒドロキシ基の存在を利用することさえ可能である。
【００１３】
本発明はこれらの結合全体ならびに非機能結合にも関するものである。結合は物理的または化学的である。
【００１４】
有利には、アミノ酸ＡＡ２またはＡＡ１の少なくとも一つ、有利には両者は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、ＯｒｎまたはＬｙｓから成る群から有利には選択された、塩基性アミノ酸を表し、有利にはＡｒｇである。
【００１５】
有利にはＡＡ２は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐまたはＤａｂから成る群から有利には選択された、塩基性アミノ酸を表し、有利にはＡｒｇである。
【００１６】
有利にはＡＡ１および／またはＡＡ２はＴｒｐを表さない。
【００１７】
有利にはＡＡ１および／またはＡＡ２はＣｙｓを表さない。
【００１８】
有利にはアミノ酸ＡＡ１またはＡＡ２の少なくとも一つはＳｅｒとＰｒｏとから成る群から選択される。
【００１９】
有利にはＡＡ１はＰｒｏを表す。
【００２０】
有利にはＡＡ２はＳｅｒを表す。
【００２１】
有利には式（ＩＩ）の酸は多不飽和、すなわち１から６の不飽和を含む脂肪酸である。さらに有利には、オメガ−３酸である。
【００２２】
これらのオメガ−３酸の中で、α−リノレン酸、セルボン酸、チムノドン酸およびピノレン酸をとくに挙げることができる。セルボン酸、チムノドン酸およびピノレン酸はそれぞれ４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および５，９，１２−オクトデカトリエン酸という名前でも知られている。
【００２３】
Ａが一般式（ＩＩ）のモノカルボン酸基を表しているとき、それは有利には酢酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ヒドロキシデセン酸およびデセン酸またとりわけトランス−１０−ヒドロキシ−Δ２−デセン酸およびトランス−オクソ−９−デセン−２−オイク酸の中から選択することができる。
【００２４】
有利には、式（ＩＩ）の酸はリポ酸（Ｌｉｐ）またはその還元形ジヒドロリポ酸、Ｎ−リポイル−リシンまたはフェニルブチル酸（Ｐｂｕ）の中から選択した酸である。
【００２５】
有利には、Ａはパルミチン酸（Ｐａｌｍ）に対応する基である。
【００２６】
本発明の複合ジペプチドの中で、下記からなる群の中で選択された複合ジペプチドを挙げることができる。
ａ）Ａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ＮＨ2、
ｂ）Ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
ｃ）Ａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
ｄ）Ａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ2、
ｅ）Ａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
ｆ）Ａ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
これらの式の中でＡは上述の定義を有する。
【００２７】
本発明の複合ジペプチドの中で、下記からなる群の中で選択された複合ジペプチドを挙げることができる。
３９）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ＮＨ2、
４１）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
４９）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
５０）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ2、
１２５）Ｐａｌｍ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
２６９）Ｐａｌｍ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
３６２）Ｐｂｕ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
３６３）Ｌｉｐ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2
【００２８】
本発明の対象である複合ジペプチドは、当業者に周知の任意の方法に従って、有利には従来の化学合成によって、あるいは酵素合成によって得ることができる。
【００２９】
本発明はさらに、本発明による複合ジペプチドと、場合によっては、許容の化粧品賦形剤または医薬品賦形剤とを含有する化粧品組成物、皮膚科組成物もしくは医薬品組成物または栄養補助剤に関するものである。
【００３０】
複合ジペプチドは局所的にそれらの化粧品または医薬品としての使用のために投与することができる。それらはまた栄養補助剤に、言い換えれば経口での栄養治療分野で使用することもできる。
【００３１】
本発明による複合ジペプチドは好適には局所的に投与される。
【００３２】
局所的に投与されるための本発明による化粧品組成物、医薬品組成物または皮膚科組成物は、このタイプの投与のために通常知られている形状で、すなわち、作用成分の特性と接近容易性を向上させるためにとりわけ皮膚浸透を可能にする賦形剤とともに、例えば、とりわけローション、発泡フォーム、ゲル、分散剤、噴霧剤、血清、パック、ボディミルク、軟膏、溶液、乳化液、ジェル、あるいはクリームの形を取ることができる。これらの組成物は一般的に本発明による複合ジペプチドの他に、一般的に水または溶剤を主成分にした生理学的に許容できる媒質、例えば、アルコール、エーテルまたはグリコールを含んでいる。これらの組成物は表面活性剤、保存剤、安定剤、乳化剤、粘稠剤、相補的あるいは場合によっては相乗的効果をもたらすその他の作用成分、オリゴ元素、精油、香料、着色剤、コラーゲン、化学的または無機フィルタ、保湿剤または温泉水も含有することができる。
【００３３】
本発明による組成物において、本発明による複合ジペプチドは１０-8Ｍと１０-3Ｍの間に含まれる、有利には１０-7Ｍと１０-5Ｍの間に含まれる濃度で存在する。
【００３４】
さらに本発明は、有利には免疫異常、免疫欠陥を予防、改善または治療する、食欲を抑えて体重を調節する、中枢神経系不全を治療する、飽満を調節する、無食欲または一部の皮膚ガンを治療するための医薬品として使用するための本発明による複合ジペプチドまたは本発明による医薬品組成物にも関するものである。
【００３５】
本発明はさらに、皮膚を明るくあるいは白くする、皮膚のシミとくに老化やそばかすのシミを除去する、または皮膚の色素沈着を予防するための色素除去剤としての本発明による化粧品組成物の使用にも関するものである。
【００３６】
最後に、本発明は、本発明による化粧品組成物を皮膚に塗布することを含む、皮膚を明るくする、色素除去させるあるいは白くする、皮膚のシミとくに老化やそばかすのシミを除去する、または皮膚の色素沈着を予防するための化粧処置法に関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下の実施例は非制限的な例として挙げられるものである。
【実施例】
【００３８】
実施例１：本発明による３６１のジペプチドの調製
【００３９】
３６１の構成要素のアシル化ジペプチドのバンクはＦｅｌｉｕらの論文（Ｊ． Ｃｏｍｂ． Ｃｈｅｍ．， ２００３， ５， ｐｐ．２５６−３６１）に記載のごとくＬａｎｔｅｒｎｅｓ ＳｙｎＰｈａｓｅ（登録商標）とカラーマーキングの「ｓｐｌｉｔ ａｎｄ ｐｏｏｌ」（分離とグループ化）戦略を用いて合成した。
【００４０】
したがって、これらの３６１の化合物は、配列方式Ｍｕｌｔｉｐｉｎ９６を用いる固体相において、合成標準戦略Ｆｍｏｃ（９−フルオレニル−メトキシカルボニル）を用いてＲｉｎｋアミドＰＳ樹脂とともにＤ系列のＬａｎｔｅｒｎｅｓ ＳｙｎＰｈａｓｅ（登録商標）上で合成された。構成ブロックＡＡ１とＡＡ２は１９×１９＝３６１の組み合わせを生み出すためにいくつものタイプの側鎖（アルキル、芳香族、酸、大きなもの、塩基性）を含む１９のアミノ酸ＤとＬの化学的集合の中から選択した。
【００４１】
使用した化学物質は次の通りである：α−Ｆｍｏｃ基によってＮ−末端が保護されたアミノ酸である、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ｔｒｔ）−ＯＨは、ＳＥＮＮ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社とＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ社で購入した。
【００４２】
カップリング剤、ＨＢＴＵ（２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムのヘキサフルオロホスフェート）はＳＥＮＮ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社で購入した。
【００４３】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、メタノール、アセトニトリル、エチルエーテル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピペリジンは、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ、Ｃａｒｌｏ ＥｒｂａまたはＡｃｒｏｓ ｏｒｇａｎｉｃｓ社から購入し精製せずに使用した。
【００４４】
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリイソプロピルシラン、パルミチン酸はＡｌｄｒｉｃｈ社またはＡｖｏｃａｄｏ社で購入した。全ての試薬と化学物質は分析品質のもので、別段精製せずに使用した。
【００４５】
Ｄ系列のＬａｎｔｅｒｎｅｓ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ＲｉｎｋアミドＳｙｎｐｈａｓｅはＭｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｐｔｙから提供された。
【００４６】
これらのジペプチドの標準製造法には次の過程が含まれる。
【００４７】
１−Ｆｍｏｃ脱保護標準手順
【００４８】
Ｆｍｏｃ脱保護過程は９６軸の支えの上に固定したランタンをジメチルスルホキシド（ＤＭＦ）／ピペリジン（８０／２０、ｖ／ｖ）の混合物内に３０分間浸漬して実現した。９６ウェル標準プレートと同じ大きさのポリプロピレン製の長方形の容器を使用した。余った脱保護溶液は軸の支えを激しく揺すって単純に除去した。
【００４９】
２−洗浄標準手順
【００５０】
カップリングまたは脱保護過程の後、連続して、洗浄過程を、Ｍｕｌｔｉｐｉｎ方式に従って配置されたランタンをＤＭＦ（３×５ｍｉｎ）、メタノール（２×５ｍｉｎ）とジクロロメタン（ＤＣＭ）（１×５ｍｉｎ）を含むポリプロピレン製容器内に連続して沈めて実現した。ランタンはＤＣＭで最後に洗浄した後に、蒸気フードの下で５分間空気乾燥した。
【００５１】
３−カップリング標準手順
【００５２】
それぞれのアミノ酸Ｆｍｏｃ、ＨＢＴＵとＤＩＥＡの０．４Ｍ溶液をＤＭＦ内で調製し、合成の間を通じて４℃に維持した。アミノ酸溶液２００μｌを９６ディープウェルプレート内に分配した。ＤＩＥＡ溶液２００μｌとＨＢＴＵ溶液２００μｌをつぎに添加し、最後に、ランタンを担持している軸の支えを２時間の間ディープウェルプレートに適合させた。
【００５３】
４−分割
【００５４】
ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ）を９６ウェルＭｉｃｒｏｎｉｃプレート内に配置されたポリプロピレン製の個別管内に分配した。分割は３時間実現した。分割カクテルはＪｏｕａｎ ＲＣ１０１０真空遠心分離器を用いてプレートから直接濃縮した。化合物は乾燥ジエチルエーテルで沈殿させ、遠心分離し、一つずつ傾瀉した。沈殿、遠心分離と傾瀉作業は二回反復した。０．１％のＴＦＡを含有する５００μｌのアセトニトリル／水（５０／５０、ｖ／ｖ）をそれぞれの管内に分配して、標本を可溶化した。つぎに標本を−８０℃で冷凍し、凍結乾燥した。この作業は二回反復して精製用のトリイソプロピルシラン基を完全に除去した。
【００５５】
５−標本の調製と分析
【００５６】
完全なバンクと再合成した単純ペプチドを逆相ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳによって分析した。０．１％のＴＦＡを含有するアセトニトリル／水（５０／５０、ｖ／ｖ）５００μｌを凍結乾燥した化合物上に分配した。それぞれの管から１０μｌをとってＨＰＬＣおよびＬＣ／ＥＳＩ＋ＭＳ分析にかけた。
【００５７】
ＨＰＬＣ分析は、ＨＰＬＣ Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９０システムおよび光ダイオードバー検出器９９６と５０×４．６ｍｍのＣ１８ Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｓｐｅｅｄ ＲＯＤカラム上で実現した。流量は５ｍｌ／分、勾配は３分間でＢの１００％からＣの１００％を使用した（Ｅｌｕａｎｔ Ｂ、水／０．１％のＴＦＡ；Ｅｌｕａｎｔ Ｃ、アセトニトリル／０．１％のＴＦＡ）。純度の推定は２１４ｎｍで検出されたピークの表面の百分率に基づいている。
【００５８】
ＬＣ／ＭＳシステムは分光器Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＩＩ（電気噴霧によるイオン化モード、ＥＳＩ＋）に接続したＨＰＬＣ Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９０で構成した。全ての分析はＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラム Ｃ１８、３．５μｍ、２．１×３０ｍｍを用いて実現した。流量は６００μｌ／分、勾配は３分間でＢの１００％からＣの１００％を使用した（Ｅｌｕａｎｔ Ｂ、水／０．１％のＴＦＡ；Ｅｌｕａｎｔ Ｃ、アセトニトリル／０．１％のＴＦＡ）。
【００５９】
正イオン電気噴霧による質量スペクトルは溶剤流量１００ｍｌ／分で得た。噴霧化気体および乾燥気体の両方に窒素を用いた。データは０．１-Sの間隔で４００から１４００ｍ／ｚの読取モードで獲得した；最終スペクトルを得るために１０回の読取を加算した。
【００６０】
全ての化合物の分子量は単一同位体質量を用いて計算した（Ｃ＝１２．０００、Ｈ＝１．００７，Ｎ＝１４．００３、Ｏ＝１５．９９４、Ｓ＝３１．９７２）。
【００６１】
分析結果は下の表１に示した。
【００６２】
【表１Ａ】
【表１Ｂ】
【表１Ｃ】
【表１Ｄ】
【表１Ｅ】
【表１Ｆ】
【表１Ｇ】
【表１Ｈ】
【表１Ｉ】
【００６３】
バンクの３５の要素（網掛け）をのぞいて、全ての化合物はＥＳ＋ＬＣ／ＭＳ分析で検出した。クロマトグラム上の２１４ｎｍで検出された所期のピークの表面の百分率を元にして決定した平均純度は８３％を超えた。
【００６４】
実施例２：本発明による５つの複合ジペプチドの生物特性
【００６５】
ｃＡＭＰ生成阻害実験はα−ＭＳＨの濃度５・１０-8Ｍでヒト細胞系列Ｍ４Ｂｅ上で実現した。本発明による５つのＰａｌｍ−ジペプチドをさまざまな濃度で導入し、それぞれの測定を三回行った。二または三系列の実験を実現した。
【００６６】
試験は次のように実現した。
【００６７】
ヒト細胞系列Ｍ４Ｂｅ（Ｊａｃｕｂｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． １９７９， ７， ５９−６４）、メラニン生成が可能なメラニン細胞系列をＩＣ50の値を決定するためにこの研究に使用した。
【００６８】
細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％、グルタミン１ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０-4ｇ／ｍｌでＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ媒質内に維持した。
【００６９】
全ての細胞系列はＣＯ2が５％の雰囲気内で３７℃に維持し、細胞培地は二日ごとに更新した。細胞は、本発明によるジペプチドと接触させる２４時間前に９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）に押しつけた。
【００７０】
ｃＡＭＰは次のように測定した。
【００７１】
前日に押しつけたウェルあたり８・１０4の細胞はα−ＭＳＨが５・１０-8Ｍで３７℃、１０分間の間さまざまな濃度で本発明による５つの複合ジペプチドのうちの一つと接触させた。この後、細胞溶解を実施し、ｃＡＭＰ含有率は競争による連結テストボックス（ＲＰＮ２２５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて測定した。それぞれの独立した実験は三回で少なくとも二セット実施した。
【００７２】
ペプチド活性は未処理細胞による合成ｃＡＭＰの率とα−ＭＳＨ単独で誘導されたｃＡＭＰ生成とを参照して決定した。グラフを調節し、ＩＣ50の値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， 米国）内の非線形後退によって決定した。
【００７３】
結果は下の表２に示した。
【００７４】
【表２】
【００７５】
このように、意外なことに、試験したＰａｌｍ−ジペプチドはメラーノーマ細胞系列Ｍ４Ｂｅを用いてメラノコルチンのヒトＭＣ1受容体の拮抗体であることがわかった。これらの複合ジペプチドはミクロモル段にＩＣ50を有する。これらのジペプチドはＭＣ1受容体に結合する短合成拮抗化合物の最初の例であり、α−ＭＳＨの非ペプチド小分子拮抗体の分野を開くものである。
【００７６】
とくに、これらの化合物はＡＡ２位置にアルギニン残基を含んでいる。興味深いことに、配列の中に塩基性残基を一切持たない化合物１２５（Ｐａｌｍ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2）はＩＣ50の値１７μＭを示す。この結果はＭＣ1受容体への結合が必ずしも正の電荷の基を必要としないことを示した。
【００７７】
アミノ酸の二つの残基だけで、これらのパルミトイル化化合物はα−ＭＳＨの非ペプチド拮抗体設計のために有効な筆頭化合物であると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鏡像異性体またはジアステレオ異性体ならびに、ラセミ混合物を含むそれらの混合物の形での、下記の一般式Ｉの複合ジペプチド：
Ａ−ＡＡ２−ＡＡ１−ＮＨ2 （Ｉ）
この式において
Ａは下記の一般式ＩＩのモノカルボン酸に対応する基を示している：
ＨＯＯＣ−Ｒ （ＩＩ）
この式においてＲは、
・一つまたは複数の不飽和を、有利には１から６の不飽和を含むことができる、および／またはフェニル基を含むことができる、ヒドロキシル基によって場合によっては置換されたＣ1−Ｃ24の線形または分岐脂肪族基
・あるいはリポ酸またはその還元形、ジヒドロリポ酸またはＮ−リポイル−リシン、
を表し、
ＡＡ１とＡＡ２は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、対応するホモアミノ酸と対応するベータアミノ酸からなる群から選ばれた同一または異なるアミノ酸を表している。
【請求項２】
アミノ酸ＡＡ２またはＡＡ１の少なくとも一つが、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、ＤａｂまたはＬｙｓから成る群から有利には選択された、塩基性アミノ酸を表すことを特徴とする、請求項１に記載の複合ジペプチド。
【請求項３】
ＡＡ２が、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐまたはＤａｂから成る群から有利には選択された、塩基性アミノ酸を表し、有利にはＡｒｇであることを特徴とする、請求項２に記載の複合ジペプチド。
【請求項４】
Ａがパルミチン酸に対応する基を表すことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一つに記載の複合ジペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一つに記載の複合ジペプチドにおいて、下記からなる群の中で選択された複合ジペプチド：
ａ）Ａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ＮＨ2、
ｂ）Ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
ｃ）Ａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
ｄ）Ａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ2、
ｅ）Ａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
ｆ）Ａ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
これらの式の中でＡは請求項１または４に記載の定義を有する。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一つに記載の複合ジペプチドにおいて、下記からなる群の中で選択された複合ジペプチド。
３９）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ＮＨ2、
４１）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
４９）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
５０）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ2、
１２５）Ｐａｌｍ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
２６９）Ｐａｌｍ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
３６２）Ｐｂｕ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
３６３）Ｌｉｐ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一つに記載の複合ジペプチドと、場合によっては、許容の化粧品賦形剤または医薬品賦形剤を含有する化粧品組成物または医薬品組成物。
【請求項８】
有利には免疫異常、免疫欠陥を予防、改善または治療する、食欲を抑えて体重を調節する、中枢神経系不全を治療する、飽満を調節する、無食欲を治療する、または一部の皮膚ガンを治療するための医薬品としての請求項１から６のいずれか一つに記載の複合ジペプチドまたは請求項７に記載の医薬品組成物。
【請求項９】
皮膚を明るくあるいは白くする、皮膚のシミとくに老化やそばかすのシミを除去する、または皮膚の色素沈着を予防するための色素除去剤としての請求項７に記載の化粧品組成物の使用。
【請求項１０】
請求項７に記載の化粧品組成物を皮膚に塗布することを含む、皮膚を明るくする、色素除去させるあるいは白くする、皮膚のシミとくに老化やそばかすのシミを除去する、または皮膚の色素沈着を予防するための化粧処置法。
【請求項１】
鏡像異性体またはジアステレオ異性体ならびに、ラセミ混合物を含むそれらの混合物の形での、下記の一般式Ｉの複合ジペプチド：
Ａ−ＡＡ２−ＡＡ１−ＮＨ2 （Ｉ）
この式において
Ａは下記の一般式ＩＩのモノカルボン酸に対応する基を示している：
ＨＯＯＣ−Ｒ （ＩＩ）
この式においてＲは、
・一つまたは複数の不飽和を、有利には１から６の不飽和を含むことができる、および／またはフェニル基を含むことができる、ヒドロキシル基によって場合によっては置換されたＣ1−Ｃ24の線形または分岐脂肪族基
・あるいはリポ酸またはその還元形、ジヒドロリポ酸またはＮ−リポイル−リシン、
を表し、
ＡＡ１とＡＡ２は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、対応するホモアミノ酸と対応するベータアミノ酸からなる群から選ばれた同一または異なるアミノ酸を表している。
【請求項２】
アミノ酸ＡＡ２またはＡＡ１の少なくとも一つが、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、ＤａｂまたはＬｙｓから成る群から有利には選択された、塩基性アミノ酸を表すことを特徴とする、請求項１に記載の複合ジペプチド。
【請求項３】
ＡＡ２が、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐまたはＤａｂから成る群から有利には選択された、塩基性アミノ酸を表し、有利にはＡｒｇであることを特徴とする、請求項２に記載の複合ジペプチド。
【請求項４】
Ａがパルミチン酸に対応する基を表すことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一つに記載の複合ジペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一つに記載の複合ジペプチドにおいて、下記からなる群の中で選択された複合ジペプチド：
ａ）Ａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ＮＨ2、
ｂ）Ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
ｃ）Ａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
ｄ）Ａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ2、
ｅ）Ａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
ｆ）Ａ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
これらの式の中でＡは請求項１または４に記載の定義を有する。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一つに記載の複合ジペプチドにおいて、下記からなる群の中で選択された複合ジペプチド。
３９）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ＮＨ2、
４１）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
４９）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
５０）Ｐａｌｍ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ2、
１２５）Ｐａｌｍ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2、
２６９）Ｐａｌｍ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
３６２）Ｐｂｕ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
３６３）Ｌｉｐ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ2
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一つに記載の複合ジペプチドと、場合によっては、許容の化粧品賦形剤または医薬品賦形剤を含有する化粧品組成物または医薬品組成物。
【請求項８】
有利には免疫異常、免疫欠陥を予防、改善または治療する、食欲を抑えて体重を調節する、中枢神経系不全を治療する、飽満を調節する、無食欲を治療する、または一部の皮膚ガンを治療するための医薬品としての請求項１から６のいずれか一つに記載の複合ジペプチドまたは請求項７に記載の医薬品組成物。
【請求項９】
皮膚を明るくあるいは白くする、皮膚のシミとくに老化やそばかすのシミを除去する、または皮膚の色素沈着を予防するための色素除去剤としての請求項７に記載の化粧品組成物の使用。
【請求項１０】
請求項７に記載の化粧品組成物を皮膚に塗布することを含む、皮膚を明るくする、色素除去させるあるいは白くする、皮膚のシミとくに老化やそばかすのシミを除去する、または皮膚の色素沈着を予防するための化粧処置法。
【公表番号】特表２００７−５３７２１３（Ｐ２００７−５３７２１３Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１２２８０（Ｐ２００７−５１２２８０）
【出願日】平成１７年５月１０日（２００５．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００１１６４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１５１７４
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（５００４７０４８２）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック（セーエヌエールエス） (25)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ （ＣＮＲＳ）
【出願人】（５０６３７６９９７）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＥＵＲＯＰＥＥＮ ＤＥ ＢＩＯＬＯＧＩＥ ＣＥＬＬＵＬＡＩＲＥ
【出願人】（５０４４６２３１９）ユニヴェルシテ ドゥ モンぺリエ アン (9)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ １
【出願人】（５０６０７５２５２）ユニベルシテ モンペリエ ドゥー (7)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ ＩＩ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１０日（２００５．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００１１６４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１５１７４
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（５００４７０４８２）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック（セーエヌエールエス） (25)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ （ＣＮＲＳ）
【出願人】（５０６３７６９９７）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＥＵＲＯＰＥＥＮ ＤＥ ＢＩＯＬＯＧＩＥ ＣＥＬＬＵＬＡＩＲＥ
【出願人】（５０４４６２３１９）ユニヴェルシテ ドゥ モンぺリエ アン (9)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ １
【出願人】（５０６０７５２５２）ユニベルシテ モンペリエ ドゥー (7)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ ＩＩ
【Ｆターム（参考）】
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